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BesnoitioseBesnoitiosebovinabovina

Helder Cortes

Hcec@uevora.pt

Primeiras descrições• Cadéac (1884) Identité de l'éléphantiasis et de l'anasarque du boeuf.

Description de cette maladie.Revue Vétérinaire521

• Besnoit, C. & Robin, V. (1912). Sarcosporidioses cutanée chez une vache.Rec. Vet.37, 649

• Marotel, M. (1912) Discussion of paper by Besnoit and Robin. Bull. etMém. de la Société de Sciences Veterinaires de Lyon et de la Société deMedicine Vetérinaire de Lyon et du Sud-Est.15, 196-217

• Henry (1912) Sarcosporidiose cutanée chez une Vache.Recueil deMédecine VétérinaireXC, 327

• Franco, E. E. & Borges, I. (1915) Nota sobre a sarcosporidiose bovina.Revista de Medicina VeterináriaAno XIV, 255-268, 287-298

ESTUDO DA BESNOITIOSE BOVINA EM PORTUGALESTUDO DA BESNOITIOSE BOVINA EM PORTUGAL

Prof. Caeiro

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2

original

original

Re-emergência (?)• Spain – Juste, R. A., Cuervo, L. A., Marco, J. C. & Oregui, L. M.,

(1990). La besnoitiosis bovina: desconocida en España? Medicina Veterinária 7, 613-618

• Portugal – Malta, M. & Silva, E. (1991). Besnoitiose no Alentejo. XIV Jornadas de Medicina Veterinária "Bovinos de Carne". Faculdade de Medicina Veterinária, Lisboa, Portugal

• France – Bourdeau, P. J., Cesbron, N., Alexandre, F., Marchand, A. M., Desvaux, J. P. & Douart, A., (2004). Outbreak of bovine besnoitiosis, Besnoitia besnoitiin the west of France and its diagnosis by immunofluorescence assay. IX European Multicolloquium of Parasitology. Valencia, Spain. pp 459-460

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HospedeiroDefinitivo?

Stomoxys calcitrans

Gently shared by Philippe Jacquier

estrume

Dairy cattle in zero-grazing(heifers in pastures)but with high incidence of besnoitiosis…

Gently shared by Philippe Jacquier

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Seasonal dynamics of S. calcitrans and Tabanids populations in the South

West of France and in South of Portugal

Stomoxys calcitrans Musca domestica

S. calcitranscosmopolite

(genus Stomoxys)

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Heads of…

Stomoxys calcitrans Haematobosca stimulans Haematobia irritans

Zumpt, 1973

Palpi

Proboscis

Tenter, A.M. e Johnson, A.M. (1997). Phylogeny of the tissue cyst-forming coccidia. Adv.Parasitol., 39, 69 -139.

Ciclo de vida

originaloriginal

• Cortes H., Ferreira,M.L., Silva,J.F., Vidal,R., Serra,P., e Caeiro,V. (2003). Contribuição para o estudo da besnoitiose bovina em Portugal. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, 98, nº 545, 43 -46.

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EtiologiaEtiologiaSubfamília Toxoplasmatinae, Biocca, 1956Género Besnoitia, Henry, 1913Espécie Besnoitia besnoiti, (Marotel , 1912)

–– Formações císticas ao nível da pele, tecido Formações císticas ao nível da pele, tecido conjuntivo subcutâneo, membranas mucosas, conjuntivo subcutâneo, membranas mucosas, aparelho digestivo, respiratório, circulatório e aparelho digestivo, respiratório, circulatório e génitogénito--urinário.urinário.

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7

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Conclusão

• Isolados de Portugal, País Basco e Catalunha obtidos são muito próximos do isolado de Israel

• Neste grupo encontram-se também os isolados de equinos e veado

• Um segundo grupo inclui espécies que infectam marsupiais e roedores na América latina

Sinais Clínicos e Sintomatologia

•• Fase febrilFase febril•• Anorexia, perda de peso, polipneia, fotofobiaAnorexia, perda de peso, polipneia, fotofobia

•• Fase de anasarcaFase de anasarca

•• Alopecia em zonas mais ou menos alargadasAlopecia em zonas mais ou menos alargadas

••Espessamento, endurecimento, perda de elasticidade Espessamento, endurecimento, perda de elasticidade e pregueamento evidente da pelee pregueamento evidente da pele

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•• Alopecia e friabilidade cutâneaAlopecia e friabilidade cutânea

•• Edemas nas extremidade dos membrosEdemas nas extremidade dos membros

––Infecções secundáriasInfecções secundárias

––MiíasesMiíases

Diagnóstico diferencialDiagnóstico diferencial

•• SarnaSarna•• TinhaTinha•• QueimadurasQueimaduras

•• Alergia/ fotossensibilidadeAlergia/ fotossensibilidade•• Deficiências mineraisDeficiências minerais

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Ends…•• Stabilization of the body lesions with some Stabilization of the body lesions with some

body condition recoverybody condition recovery

•• Progress ofProgress of thethe disease that disease that leads leads to deadto dead

Ends…Ends…

ConclusãoConclusão

• O transporte de animais infectados, mesmo que subclinicamente, para outras áreas ou explorações deverá ser evitado

• Realçar a necessidade do diagnóstico sistemático da infecção e a aplicação de medidas adequadas de controlo

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Isolamento de Besnoitia besnoitiÁfrica do SulIsrael

Neuman M. (1974). Cultivation of Besnoitia besnoiti Marotel, 1912, in cell culture. Tropenmed.Parasitol., 25, 243 -249.

Shkap, V., Pipano, E., e Greenblatt,C. (1987). Cultivation of Besnoitia besnoiti and evaluation of susceptibility of laboratory animals to cultured parasites. Vet.Parasitol., 23, 169 -178.

original Prof. Victor Caeiro

Geographic distribution Africa

• Sudan

• Uganda

• Zaire

• Nigeria

• Angola

• Kenya

• Tanzania

• Zimbabwe

• Botswana

• Namibia

• Mozambique

• South Africa

• Swaziland

Geographic distribution Asia

• Kazaquistão,

• Irão,

• Coreia,

• Índia,

• Mongólia,

• Israel,

• União Soviética.

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Geographic distribution America

• Venezuela

• USA

• Alasca

Diagnóstico diferencialDiagnóstico diferencial

•• SarnaSarna•• TinhaTinha•• QueimadurasQueimaduras

•• Alergia/ fotossensibilidadeAlergia/ fotossensibilidade•• Deficiências mineraisDeficiências minerais

Evolução da infecção por Besnoitia besnoiti entre 2003 e 2005 numa exploração de

bovinos de carne no Alentejo

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Acompanhamento de um efectivo infectado

• 1º caso clínico em Setembro de 2001

• Animais mortos devido à besnoitiose: 5 em 2002, 12 em 2003, 7em 2004, 2 em 2005

• 1ª colheita em Outubro de 2003 – 326 Animais, 36% IFI +; 4%HP +; 16% PCR +

• 2ª Colheita em Abril de 2005 – 316 animais, 70% IFI +

• Dos 230 animais que se encontravam na população nos dois momentos de colheita, a proporção de positivos evoluiu de 40% para 66%

• Entre os 86 novos animais 76% eram seropositivos

Não presentes –> Positivo (65)

Não presente –> Negativo (21)

Negativo –> Negativo (69)

Positivo –> Negativo (4)

Positivo –> Positivo (88)

Negativo –> Positivo (69)

Idade na segunda colheita (meses)

Total 316 animais; 96 foram removidos (26 positivos); Animal mais novo com 10 meses de idade ; sem relação significativa entre o estado da mãe e da descendência

(18 meses de intervalo)

• Todos os casos relatados estão no Alentejo– Alcácer do Sal– Montemor-o-Novo– Redondo – Alcáçovas– Arraiolos– Odivelas (Viana do

Alentejo)– Portel– Évora

Portugal Portugal

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De que meios dispomos para o diagnóstico da infecção por Besnoitia

besnoiti em bovinos?

Sinais Clínicos

•• Alopecia Alopecia

•• Espessamento cutâneo; Espessamento cutâneo;

•• perda de elasticidadeperda de elasticidade

••Estado crónicoEstado crónico

Diagnóstico

• Histopatológico

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• HISTOPATOLOGIA– Pols, J. W. (1960). Studies on Bovine besnoitiosis with special

reference to the aetiology. Onderstepoort J. Vet. Res. 28, 265-356.

• QUISTOS SUB-CONJUNTIVAIS– Bigalke, R. D. (1968). New concepts on the epidemiological features

of bovine besnoitiosis as determined by laboratory and field investigations. Onderstepoort J. Vet. Res. 35, 3-138.

– Sannusi, A. (1991). A simple field diagnostic smear test for bovine besnoitiosis. Vet. Parasitol. 39, 185-188.

• Doença sem tratamento

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PCR para Besnoitia besnoiti

•Specific primers for B. besnoiti

Result analysisResult analysis

Histo IIF PCR3 0 0 04 0 0 05 0 0 06 0 0 07 0 0 08 0 0 09 0 0 0

10 0 0 011 0 0 012 0 0 013 0 0 014 0 0 015 0 0 016 0 0 018 0 0 0

Histo IIF PCR1 1 1 1

19 1 1 122 1 1 123 1 1 124 1 1 126 1 1 127 1 1 130 1 1 133 1 1 134 1 1 135 1 1 142 1 1 143 1 1 144 1 1 145 1 1 1

Histo IIF PCR2 0 1 0

17 0 1 120 0 1 121 0 1 125 0 1 028 0 1 129 0 1 031 0 1 032 0 1 036 0 1 037 0 1 038 0 1 039 0 1 040 0 1 041 0 1 0

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ITS1F1 5'TGACATTTAATAACAATCAACCCTT3‘, ITS1R1 5'GGTTTGTATTAACCAATCCGTGA3‘.

Sem amplificação com DNA de: Neospora caninum, Toxoplasma gondii, Sarcocystis neurona, S. cruzi, S. tenella, S. muris, S. spellei, S. miescheriana, S. zamari, S. singapurencei, S. gigantea, S. moulei, S. capracanis, S. arieticanis, S. peeri.

PCR convencional e PCR em tempo real baseados na se quência do ITS1

Conclusion• Histopathology is a valuable method for

disease diagnosisdisease diagnosis

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Conclusion• Histopathology is not a useful method for detection ofdetection of

Besnoitia infectioninfection

Conclusion

• In the diagnose of Besnoitia infection:

– Method used for DNA extraction is critical for the PCR applicability on diagnosis of infection

Diagnóstico

• Clínico

• Histopatológico

• PCR

• IFI

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All sera were tested at two fold serial dilutions from 1/128 to 1/1024 considering 1:256 the cutoff for positivity.

• Scale bar 10 µm

ELISA e western blot: dois métodos úteis no diagnóstico de infecção por Besnoitia

besnoiti

Padrão de soros utilizados

– Animais positivos:• Presença de quistos de Besnoitia na pele (coloração

com hematoxilina e eosina)

– Animais negativos:• Negativos em IFAT e Histopatologia

• Provenientes de uma área não endémica

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Animais em estudo• 104 soros de bovinos• Animais infectados

– 23 bovinos Portugueses infectados com B. besnoiti• 13 com sinais clínicos de besnoitiose• 10 sem quaisquer sinais clínicos de doença

– 12 soros de bovinos infectados com (N. caninum-PCR) – 5 soros provenientes de vacas/novilhas com PCR positivo para T.

gondiie SAG1-ELISA ou de tecidos cerebrais de fetos

• Animais não infectados (Besnoitia besnoiti)– 39 saudáveis e com resultado negativo quer por histopatologia

quer por IFAT obtidos de uma área endémica de Portugal – 25 bovinos saudáveis de uma região não endémica da Suiça

•

• Sensiblilização de placas de poliestireno Dynatech® (concentração de 0.4 µg proteína/ml tampão carbonato (pH 9.6) )

• Soros diluidos a 1: 200 em PBS-Tween + 1% soro de cavalo

• Incubação dos soros (90 min at 37°C)

• Segundo anticorpo (coelho anti-bovino conjugado com fosfatase alcalina) diluido a 1:5000 em PBS-Tween (60mm/37°C)

• substrato (4-nitrophenylphosphate)

• Paragem da reacção após 15 min (3N NaOH)

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Antigene para o western blot

108 taquizoitos de B. besnoiti :

• Solubilizados durante 10 min a 94ºC em tampão de lise (2%[w/v] sodium dodecyl sulfate (SDS), 7%[v/v] glicerol, 0,05% azul de bromofenol, 0,75% tris(hydroxymethyl)aminomethane, pH 6.8)

• Electroforese por SDS-PAGE (12.5%[w/v]) e transferência electroforética

para membranas de PVDF (Immobilon-P, Millipore) (Schareset al., 1998)

• Bloquear com PBS+T+G(PBS, 0.05% [v/v] Tween 20, 2%[w/v] gelatina de peixe 1%)

Results

( UA padronização)

• UA%= (UA soro a testar/UA controlo negativo) x 100

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Figure 2. Gráfico com a distribuição dos soros nos estudo de validação do ELISA

ELISA

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Número de amostras

Besnoitia

ToxoplasmaNeospora

Negativos

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1-Specificity

Sen

sitiv

ity

58.65

117.31175.96

234.61

293.27351.92leitura = 394.100

Model: status ~ leitura

Variable est. (s.e.) (Intercept) -4.604 (0.766)

leitura 0.011 (0.002)

Area under the curve: 0.931

Sens: 87.0%Spec: 97.5%PV+: 90.9%PV-: 96.3%

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

Besnoitia Toxoplasma Neospora NegativosPortugal

NegativosSuiça

ELI

SA

(AU

%)

Cut off 394.10

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Resultados

Soros negativos• Portugal

• Média:179,63

• Desvio padrão: 95,3

• Suiça

• Média: 116,15

• Desvio padrão: 73,6

Diferenças estatisticamente significativas entre os grupos p< 0,005

0.8

1.0

175.96

234.61

293.27351.92leitura = 394.100

Sens: 87.0%Spec: 97.5%PV+: 90.9%PV-: 96.3%

0.8 1.0

Model: status ~ leitura

Variable est. (s.e.) (Intercept) -4.604 (0.766)

leitura 0.011 (0.002)

Area under the curve: 0.931

• Sensibilidade 87% (a/(a+c))x100 • Especificidade 97.5% (d/(b+d))x100 • Valor preditivo positivo 90.9% (a/(a+b))x100 • Valor preditivo negativo 96.3% (d/(c+d))x100 • Precisão do teste 95.2% ((a+d)/(a+b+c+d))x100

Histopatologia e/ou IFAT ELISA anti-B.

besnoitiPositivos Negativos Total

Positivos 20(a) 2(b) 22Negativos 3(c) 79(d) 82

Total 23 81 104 (n)

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Figure 5. Analise comparativa dos perfíes de western blot 1) controlo do conjugado ; 2) controlo negativo; 3) controlo Positivo; 4 a 7) animais não infectados; 8 a 16) quistos na pele sem qualquer outro sinal de doença

28

3739

7275

Fig 4: Analise comparativa dos perfíes de western blot 1) controlo do conjugado; 2) controlo negativo; 3) controlo positivo; 4 e 5) quistos na pele sem qualquer outro sinal de doença; 6 e 7) com doença há e meses; 8, 9 e 10) apresenta doença, mas melhorou; 11 a 16) animal doente

28

3739

7275

Western blot

• Sensibilidade 91,3%

• Specificidade 97,5%

• Valor preditivo positivo 91,3%

• Valor preditivo negativo 97,5%

• Precisão do western blot 96,1%

Histopathology and/or IFAT Wester blot

anti-B. besnoiti Positive Negative Total

Positive 21(a) 2(b) 23 Negative 2(c) 79(d) 81

Total 23 81 104

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KappaK= (Po-Pe)/(1-Pe)Po = a/n+d/nPe= ((a+c)/n) ((a+b)/n) ((b+d)/n) ((c+d)/n)

Kappa ELISA : 0,97 Western blot: 0,97

Excelente concordância

ELISA Western blotSensibilidade((a/(a+c))x100) 87% 91,3%Specificidade ((d/(b+d))x100) 97.5% 97,5%Valor preditivo Positivo(((a/(a+b))x100)

90.9% 91,3%

Valor preditivo Negativo(((d/(c+d))x100

96.3% 97,5%

Precisão (Percentagem totalde concordância)(((a+d)/(a+b+c+d))x100)

95.2% 96,1%

• Concordância entre o ELISA e o western blot nos animais infectados 95.7% ((20+2)/23)

• Concordância entre o ELISA e o western blot nos animais não doentes 97,5% ((79+0)/81)

• Percentagem total de concordância, combinando animais doentes e não doentes foi de 97.1% ((20+2+79)/104).

Doentes + Doentes- Total ELISA + WB+

20 0 20

ELISA + WB-

0 0 0

ELISA –WB+

1 2 3

ELISA- WB- 2 79 81Total 23 81 104

Conclusões

• ELISA e western blot na detecção de anticorpos específicos para Besnoitia

• Antigénios totais usados no desenvolvimento dos testes, provenientes de B. besnoiti

• Dois testes disponíveis para o diagnóstico e para estudos epidemiológicos

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• 17 severe clinical besnoitiosis were identified (5 in 2002; 12 during 2003)

• In IIF 118 (36%) serologically positive animals were identified

• Among those animals, 14 (4.3%) revealed the presence of B. besnoiti cysts in the skin by histopathology

• Using PCR, specific amplification was observed in 52 (16%) samples. These included 14 animals positive by histopathology and 22 that showed no cysts by histopathology and were positive by IIF– 17 of these animals, however, were negative by IIF

IIF + IIF - Total PCR + PCR - Total IIF + IIF - TotalHist + 14 0 14 Hist + 14 0 14 PCR+ 36 17 53Hist - 104 208 312 Hist - 39 273 312 PCR - 82 191 273Total 118 208 326 Total 53 273 326 Total 118 208 326

Tratamento

?

Profilaxia e Controlo

• Vacinação?

• Eliminação de animais doentes e portadores

• Rastreio no exame de acto de compra