Calendrier des sporogeneses et gametogeneses femelles chez le diploi'de et le tetraplolde induit de Brachiaria ruziziensis (Graminee)

J. GOBBE, B~ATRICE LONGLY ET B.-P. LOUANT Universite' Catholique de Louvain, Laboratoire de Phytotechnie Tropicale et Subtropicale, Place Croix du Sud, 3 , Sc. 15 D ,

B.-1348-Louvain-la-Neuve (Belgique) R e ~ u le 8 janvier 1982

GOBBE, J. , B. LONGLY et B.-P. LOUANT. 1982. Calendrier des sporogCnkses et gamCtogCn&ses femelles chez le diplo'ide et le tCtraplo'ide induit de Brachiaria ruziziensis (GraminCe). Can. J . Bot. 60: 2032-2036.

Les processus aboutissant A la formation des gamktes sont dCcrits dans deux formes sexuCes de Brachiaria ruziziensis Germain et Evrard: le diplo'ide nature1 et un autotCtraplo'ide induit. Cette description s'inscrit dans le cadre d'un programme d'hybridations interspkifiques dans le genre Brachiaria visant au transfert des genes responsables de l'apomixie des espkces polyplo'ides apomictiques aux espkces diplo'ides sexuCes. Un "calendrier de la reproduction" est Ctabli en prenant la microsporogCn&se et la microgamCtogCnkse comme Cchelles de rCfCrence auxquelles sont rapportCs les CvCnements concomitants des mCgasporogCnkses et mCgagamCtogCnbes des deux formes. Ce calendrier devra Ctre comparC avec 1'Ctablissement des concomitances entre sporogCnkses et gamCtogCnbses mdles et femelles rCalisC chez B. decumbens Stapf. et B. brizantha (Hochst) Stapf., tCtraploi'des naturels apornictiques. Des diffkrences sont relevCes entre la forme diploi'de originelle et la forme tCtraplo'ide induite.

GOBBE, J., B. LONGLY, and B.-P. LOUANT. 1982. Calendrier des sporogCneses et gamCtogCnkses femelles chez le diplo'ide et le tktraplo'ide induit de dBrachiaria ruziziensis (GraminCe). Can. J. Bot. 60: 2032-2036.

The processes leading to the formation of the gametes are described in two sexual forms of Brachiaria ruziziensis Germain et Evrard: the natural diploid and an induced autotetraploid. This description comes within the framework of an interspecific hybridization program in the genus Brachiaria aiming at the transfer of the genes responsible for apomixis from polyploid apomictic to diploid sexual species. A "reproductive calendar" is established where microsporogenesis and microgametogenesis are used as reference scales for the concomitant events of megasporogenesis and megagametogenesis of the two forms. This calendar will be compared with similar ones which have to be established for B. decumbens Stapf. and B. brizantha (Hochst) Stapf:, natural tetraploid apomicts. Differences were noticed between the original diploid and the induced tetraploid form.

Introduction De nombreux auteurs, dont Swenne et al. (1981) pour

le genre Brachiaria, ont dkja justifik l'intkrCt des croisements qui permettraient le transfert de gknes responsables de l'apomixie des espkces naturellement polyploides et apomictiques aux espkces diploides sexukes.

Une bonne connaissance des gamktophytes mgles et femelles et des processus impliquCs dans leur forma- tion, chez Brachiaria ruziziensis Germain et Evrard, espsce diploide et sexuCe, constitue un prCalable utile a l'interprktation des rksultats des croisements interspB cifiques dans le genre.

On sait que, exception faite pour le genre Paspalurn, le dCveloppement du sac embryonnaire chez les Pani- coi'dCes CtudiCes, aboutit a la formation de sacs de type sexuC ou de type apomictique se distinguant les uns des autres par le nombre de noyaux qu'ils contiennent (Brown et Emery 1958). Le sac embryonnaire mfir de la forme sexuCe est octonuclCC tandis que celui de la forme apomictique est tCtranuclCC. Cette distinction n'est sans doute pas la seule et n'est certainement pas infaillible. En effet, les sacs sexuCs mfirs ne sorit pas toujours octonuclCCs; ils peuvent par exemple Ctre tCtranuclCCs par suite d'une dCgCntrescence prCcoce des

antipodes associCe a une fusion prkcoce des noyaux polaires (Gildenhuys et Brix 1959).

I1 faut en outre songer a 1'intCrCt que prksenteraient d'autres caractkres liks aux modes de reproduction et qui pourraient Ctre mis en Cvidence durant tout le dCroule- ment des gamktogCnkses et, plus tard, des embryogknk- ses. Les rkpertorier impose la mise au point d'un "calendrier" c'est-a-dire d'une chronologie reliant les diffirents stades de formation des deux gamCtophytes jusqu'a leur maturitC.

Certes, Schank et Sotomayor-Rios (1968) et Fergu- son (1974) ont dCja dCcrit le sac embryonnaire mfir de la forme diploi'de naturelle de B. ruziziensis et le rapportent trks justement au type Polygonurn. 11 parait cependant nCcessaire d'affiner leurs observations par une approche plus dynamique de l'ensemble des phCno- mknes aboutissant a la production des gamktes en les situant les uns par rapport aux autres.

L'Ctude est Clargie a B. ruziziensis tktraploi'de induit artificiellement et sexuk, celui-ci Ctant utilid dans les programmes d'hybridations intersptcifiques. La finalit6 agronomique d'une telle Ctude prend alors un aspect plus fondamental. Elle peut contribuer a mieux cemer apomixie, sexualit6 et niveaux de plo'idie chez les GraminCes. Elle engage a une demarche similaire pour

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B . decumbens Stapf. et B . brizantha (Hochst) Stapf., prolongement de l'archtspore, s'hypertrophient et se polyploi'des naturels apomictiques, tgalement utilists vacuolisent. Ces cellules finissent par atteindre la paroi dans les programmes d'hybridation. de l'ovaire, remplissant ainsi l'espace dClimitC par les

Materiel et methodes extremites des ttguments, qui constitue normalement le micro~vle.

1 d

Des formes autotCtraplofdes de B. ruziziensis, obtenues par Chez les ttmaploi'des, on constate que le dtveloppe- doublement de la garniture chromosomique i la colchicine, et merit de 19archtspore est ltgkrement en retard par rap- les formes diplo'ides originelles ont dCji CtC dtcrites par port celui des ttguments. Swenne et al. (1981) ainsi que par Gobbe et al. (1981). Ce La mtiose mile semble rapide et le stade "tttrades,, m&me materiel fait l'objet des prtsentes observations. Des inflorescences g divers stades sent prClevCes et au FAA est bientdt atteint. Ensuite, les microspores, dent le (formal 5%, acide ac~t ique 5% et alcool kthylique 90%) cytoplasme n'est pas encore vacuolise, s'individualisent vendant 24 h i 4°C. et vont s'appliquer contre l'assise interne de l'anthkre

I1 faut noter qu'il est important de disstquer les Cpillets avant avec leur pore unique orient6 vers cette assise. Noyau et I'emobage afin que glumes et glumelles, moins tendres, ne cytoplasme sont alors refoults en ptripherie par une gCnent pas la coupe au microtome. Une seule glumelle, celle vacuole grandissante. Ces phtnomknes paraissent se de la fleur fertile est conservCe, rassemblant gynCcCe et dtrouler lentement, androcCe.

Les coupes (14 pm) sont colorCes I'hCmatoxyline et au fast-green, I'hCmatoxyline donnant de meilleurs rksultats que la safranine sur ce matCrie1.

Une lame porte-objet suffit i llCtalement d'une fleur entikre; elle permet d'observer le gametophyte femelle i un moment donnC de sa formation ainsi que le stade de develop- pement correspondant du gamCtophyte mile. Les correspon- dances chronologiques entre 1'Ctat du gamCtophyte mile et 1'Ctat du gamktophyte femelle constituent le "calendrier" des gamCtogCnbses. Louant et Longly (1981) ont insist6 sur le fait que toute autre relation temporelle plus rigoureuse, oh l'on ferait intervenir les jours et les heures, serait caduque Ctant donnCe l'influence des conditions du milieu sur la vitesse de croissance et de dCveloppement. Le nombre de fleurs exami- nCes est de 140 pour la forme diploi'de et de 90 pour la forme t t traplolde.

Observations Le point de dtpart de l'observation de la sporogtnkse

mile est constitut ici par l'apparition de files de sporocytes aistment identifiables, ttroitement accolltes entre elles et i l'assise interne de l'anthkre; les loges sont alors entikrement combltes et les tapis ne prtsentent aucune trace de ntcrose ou de dtgtntrescence. Au fur et i mesure de la croissance des anthkres, les sporocytes s'individualisent, le tapis se ntcrose et une cavitt mCdiane se fonne dans chaque loge.

Dans la fonne tttraploi'de induite, les noyaux des sporocytes sont souvent binucltolts alors que dans la fonne diploi'de, ils sont gCnCralement mononuclColts.

Au cours de cette partie de la microsporogCnbse, on observe, dans l'ovule encore dress6 de la m&me fleur, une cellule sous-Cpidennique qui se difftrencie en archtspore. Cette archespore s'allonge ensuite tandis que se dtveloppent un, puis deux primordia ttgumen- taires (fig. 1).

L'epiderme nucellaire subit entre-temps plusieurs divisions periclines. Trois i six des cellules de l'assise marginale, situCes au sornmet du nucelle dans le

Pendant ce temps, dans la m&me fleur, l'archtspore subit la mtiose qui aboutit i l'apparition d'une tttrade lintaire de mtgaspores. Exception faite pour la rtgion micropylaire, les cellules entourant la tttrade ont une forme plus rtgulikre que celle de leurs voisines im- mtdiates. Ces dernikres sont fortement vacuolistes. L'ovule a maintenant sa position anatrope dtfinitive. La tttrade ne subsiste pas longtemps; les trois mtgaspores situtes du cdtt du micropyle dtgenerent aprks s'&tre allongtes et laissent une trainte noire bien visible (fig. 2). Seule la mtgaspore chalazienne subsiste. Elle se vacuolise puis subit une premikre division mitotique qui donne naissance i un sac embryonnaire i deux noyaux (fig. 4). Ce sac posskde en outre deux vacuoles, l'une entre les deux noyaux, l'autre prks de la chalaze. Avant la deuxikme division mitotique un ttranglement apparait entre les deux noyaux, au niveau de la vacuole qui les stpare.

Les noyaux des cellules du nucelle sont souvent binucltolts dans la fonne diploi'de, tandis que, chez les tttraplo'ides, il peut y avoir trois ou quatre nucltoles par noyau.

Les cellules hypertrophites du sommet du nucelle se divisent (fig. 3) et on peut en compter i ce stade jusqu'i 12. Leurs nuclColes sont devenus aussi importants que ceux des noyaux du sac embryonnaire. Ces cellules hypertrophites contiennent gtntralement une seule grande vacuole, plus rarement un ensemble de petites (fig. 7). Elles sont stpartes du gamktophyte par environ quatre assises de cellules.

Chez les plants tCtraplo'ides, le nombre de cellules hypertrophites est 1Cgbrement superieur et leurs noyaux sont plus gineralement multinucltolts (fig. 8).

Dans les anthbres, aprbs un certain temps, les noyaux des microspores vacuolistes subissent une premibre mitose. Une paroi rkfringente courbe apparait entre les deux noyaux nCoformCs. Le noyau de la cellule vegCta- tive va se placer au-delh de la vacuole, au point

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diamktralement opposC par rapport au noyau gCnCratif. Les noyaux spermatiques issus de la deuxikme mitose pollinique sont arrondis tandis que le noyau vCgCtatif s'allonge.

Le gamitophyte femelle posskde maintenant quatre noyaux; il est toujours allongC et apparait CtranglC en son milieu comme au stade prCcCdent (fig. 5). Les mCgaspores dCgCnCrCes sont encore prCsentes mais tendent h disparaitre. Les cellules de forme assez rCgulikre qui entouraient la tCtrade sont devenues effi- lies et dCgCnkrent progressivement de la rCgion du micropyle h la chalaze. Aprks la troisikme division, le sac embryonnaire comporte deux groupes de quatre noyaux situCs l'un du c6tC du micropyle, l'autre du c6tC de la chalaze; la vacuole qui sCpare les deux groupes de noyaux a fortement grandi contrairement h l'autre. Les noyaux du sac se distinguent eux aussi par leur taille. Du c6tC de la chalaze, ils sont plus grands que du c6tC du micropyle. Par la suite, chaque noyau va prendre sa position dCfinitive. Le gamCtophyte femelle acquiert alors la configuration des sacs du type Polygonurn.

Les antipodes vont cependant encore subir une division et les sacs embryonnaires contiendront finale- ment 11 noyaux (fig. 6). La vacuole chalazienne disparait; la vacuole centrale continue de s'accroitre, rejetant ainsi les noyaux h la pCriphCrie. Autour du gamktophyte, les cellules effilCes du nucelle sont main- tenant toutes dCgCnCrCes. Au sommet du nucelle, on compte h prCsent jusqu'h 20 noyaux au niveau des cellules hypertrophiCes; certaines de celles-ci ont en effet subi h ce stade plusieurs divisions successives. Les cellules qui en rCsultent ont des parois transversales souvent trbs minces et il est de ce fait plus aisC de compter le nombre des noyaux que celui des cellules (fig. 9).

Chez les tktraploi'des, ces noyaux sont moins nom- breux. 11s diminuent encore par la suite et il arrive m&me qu'il n'y ait plus aucune cellule hypertrophike.

Dans les cas oh le sac embryonnaire complktement form6 dCgCnhe, la vacuole centrale et le sac gonflent; le cytoplasme pCriphCrique est rCduit 2 une mince pelli- cule. Les synergides sont alors les premikres h se nCcroser. Elles sont suivies dans l'ordre par l'oosphkre

et les antipodes. Les noyaux polaires quant h eux dCgCnkrent les deniers sans avoir fusionnk.

Chez les tCtraploi'des induits, les noyaux du sac persistent plus longtemps dans les cas de dCgCnCres- cence et sont encore intacts 2 des stades de vacuolisation trks avancCe.

Discussion et conclusions "Les Cvaluations en valeurs absolues de durCes des

oogCnkses angiospermiennes sont rarissimes" (Favre- Duchartre et al. 1979). En fait, la succession des CvCnements de la sporogCnkse et de la gamCtogCnkse femelles peut &tre CtudiCe non en fonction du temps mais des 2ges physiologiques correspondant h des degrCs de dCveloppement global du bourgeon. Les principaux stades de la sporogCnkse et de la gamCtogCnkse m2les reflktent avec suffisamment de rigueur ces 2ges physio- logiques; ils peuvent dbs lors servir de support h llCtablissement d'un calendrier de la mCgagamCto- gCnkse dCcrivant simplement les correspondances chro- nologiques entre sporogCnkses et gamCtogCnkses m2les et femelles (Louant et Longly 198 1).

Les calendriers "relatifs" mettant en correspondance le dCveloppement des gamitophytes miles et femelles chez B. ruziziensis diplo'ide d'une part et chez sa forme tCtraplo'ide induite d'autre part sont schCmatisCs h la figure 10. Toutes les phases de dCveloppement des microgamCtogCnkses Ctant semblables chez le diploi'de et le tCtraploi'de, les microgamCtogCnkses ont CtC con- fondues en une Cchelle de rCfCrence unique. Le schCma de la figure 1 ambne donc h la constatation suivante: le niveau h e ploi'die parait avoir une certaine importance puisque la concomitance des sporogCnkses et des gamC- togCn2ses miles et femelles est plus l2che chez les tCtraplo'ides. Dans ce sens, la persistance de 1'archC- spore titraplo'ide comme celle de la mCgaspore fonction- nelle sont symptomatiques. Les diffkrences s'estompent h partir de la premikre mitose de la mCgaspore. Plus tard, lorsque les noyaux des sacs embryonnaires non fonc- tionnels dCgCnbrent chez les diploi'des, les noyaux Cquivalents chez les tCtraploi'des sont encore intacts.

D'autres caractCristiques diffkrencient encore le tCtra- ploi'de du diplo'ide chez B . ruziziensis . Par exemple, les

FIG. 1. Ovule contenant une archtspore dtjh allongte. Des cellules hypertrophiCes de l'assise marginale du nucelle sont dijh visibles dans le prolongement de llarchCspore. X300. FIG. 2. Tttrade IgCe. La mtgaspore situte du cBtC de la chalaze est fonctionnelle. On reconnait aisCment les cellules hypertrophites du nucelle. x500. FIG. 3. Deux cellules hypertrophites du sommet du nucelle, dont l'une est en cours de division, dans un plant diploide. X 1500. FIG. 4. Sac embryonnaire h deux noyaux; les deux vacuoles sont bien visibles, ainsi qu'une des cellules hypertrophites. ~ 5 0 0 . FIG. 5. Sac embryonnaire a quatre noyaux Ctranglt en son milieu. X 750. FIG. 6 . Sac embryonnaire a 1 1 noyaux; une synergide et deux antipodes manquent sur cette coupe. X500. FIG. 7. Cellule hypertrophiie du somrnet du nucelle contenant un ensemble de petites vacuoles (plant diploi'de). x 1500. FIG. 8. Noyau multinuclColt d'une cellule hypertrophite du nucelle, dans un plant tCtraploi'de. x 1500. FIG. 9. RCsultat des divisions ptriclines d'une cellule hypertrophike du nucelle dans un ovule I g t (plant tttraploide). X 1500.

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t l a u e s d e l a s p o r o j k n E s e e l t l a p e s d e l a s u o r o j C n 5 s e e l d e l a [ t a p e s d e l a s p o r o j e n i s e e t d e l a g a m 6 l o j ' e n i s e l e m e l l e s d e j a m t 5 l o g $ n $ s e m i l e s I l o r m e s d i p l o ' i d e d e l a j a m 6 l o j b n i s e l e m e l l e s d e l a l o r m e d ip lo i 'de o r i j i n e l l e e l I E l r a p l o ' i d e c o n f o n d u e s I l a l o r m e t l t r a p l o ' i d e i n d u i t e

noyaux des microsporocytes sont souvent binuclColCs chez le tktraploi'de alors qu'ils sont mononucl~olks chez le diploi'de. Parallklement, les cellules du nucelle sont souvent multinuclColkes chez le tetraploi'de et binucleo- lees chez le diploi'de. Enfin, les cellules hypertrophiCes du nucelle, observees lors des premikres divisions somatiques de la mkgaspore fonctionnelle, sont en nombre supCrieur chez le tktraploi'de bien qu'elles se retrouvent en nombre infkrieur lors de l'aboutissement de la gamktogCnbse. Ces cellules sont en outre plus sou- vent multinuclColCes que chez le diploi'de.

I1 faut ajouter qu'aucun indice de dCveloppement de cellules aposporiques n'est observC, ni dans le tCtra- ploi'de induit, ni dans le diploi'de originel. Les "dCvia- tions" des processus chez le tCtraploi'de par rapport au diploi'de sont donc bien i lier en premikre instance au seul Ctat de polyploi'die. I1 sera intkressant de les revoir en fonction des caractkres habituellement liCs i l'apo- sporie qui seront observCs chez les tCtraploi'des naturels du genre Brachiaria, tels que B . brizantha et B. decumbens.

Remerciements

a r c h i s p o r e -

BROWN, W. V., et W. H. P. EMERY. 1958. Apomixis in the Gramineae: Panicoideae. Am. J. Bot. 45(4): 253-263.

FAVRE-DUCHARTRE, M., B.-P. LOUANT et J.-P. TILQUIN. 1979. DurCe de vie et organisation du sac embryonnaire au sein de l'ovule de Cichorium infybus L. (Compositae) et thCorie taxalienne. C.R. Hebd. Seances Acad. Sci. Paris, 288: 33 1-334.

FERGUSON, J. 1974. Method of reproduction in Brachiaria ruziziensis Germain et Evrard. Ph.D. thesis, Cornell Uni- versity, Ithaca, NY.

GILDENHUYS, P. J., et K. BRIX. 1959. Apomixis in Pennise- rum dubium. S. Afr. J . Agric. Sci. 2(2): 231-245.

GOBBE, J. , A. SWENNE et B.-P. LOUANT. 1981. Diploides naturels et autotCtraploi'des induits chez Brachiaria ruzi- ziensis Germain et Evrard: critkres d'identification. Agron. Trop. (Paris), 36(4): 339-346.

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SCHANK, S. C., et A. SOTOMAYOR-RIOS. 1968. Cytological studies on Brachiaria species. Soil Crop Sci. Soc. Fla. Proc. 28: 156-162.

r n l c r o s p o r o c y t e

d l a d e ou t 6 t r a d e

rn lc rospore non vacuo l tsbe

rn lc rospore v a c u o l 1 s 6 e

g r a l n de po l l en

d t a d e cu t e t r a d e -

SWENNE, A., B.-P. LOUANT et M. DUJARDIN. 1981. Induc- tion ~ a r la colchicine de formes autotCtraploides chez

garnbtophyte a 1 1 noyaux btnucle'6

garn i tophy te rnur issan t g r a l n de p o l l e n ou d 6 g b n C r a n t

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NOUS tenons i remercier M. B. De Keyser, pour la Brachiaria ruziziensis Germain et Evrard (Gramineel. realisation des prkparations microscopiques. Agron. Trop. (Paris), 36(2): 134- 141.

garnblophyte 8 noyaux garnetophyte 2 1 1 noyaux

garnbtophyte rnur tssan t

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FIG. 10. SchCma des concomitances entre sporogCnkses et gamCtogCneses miles et femelles chez Brachiaria ruzzziensis diploi'de originel et tCtraploi'de induit. Une Cchelle de rCfCrence unique est constituCe par les gamCtogCnkses miles.

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