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Calorimétrie isotherme appliquée à l’hydrolyse enzymatique de substrats solides pour la détermination de constantes cinétiques.
D. TAFOUKT1, A. SORIC1, J-C. SIGOILLOT2, J-H. FERRASSE1
Mail to: [email protected]
1 Aix Marseille Univ, CNRS, Cent Marseille, M2P2, Marseille, France
2 Aix Marseille Univ, INRA, BBF, Marseille, France
Les Biocarburants
19
puisqu’ils comprennent aussi bien les sous-produits de l’agriculture telle que la paille de blé
mais aussi les déchets des industries agro-alimentaire et ceux des papeteries [13][14] [15].
Cette biomasse présente plusieurs avantages, elle est abondante, renouvelable et bon marché.
La matière lignocellulosique est constituée principalement de trois polymères, la
lignine, la cellulose, l’hémicellulose ainsi que de plusieurs autres composés inorganiques (K +,
Mg2+, Ca2
+…) [16].
La cellulose et l’hémicellulose représentent plus de 70% de la biomasse totale et sont
étroitement liées à la lignine par des liaisons covalentes et hydrogènes [16]. Cela confère à la
matière lignocellulosique une grande résistance à la dégradation.
Fondamentalement, la cellulose forme un squelette qui est entouré par l'hémicellulose
et la lignine (Figure I. 1).
Figure I. 1. Représentation de la structure de la biomasse lignocellulosique [18]
La composition des fibres lignocellulosiques diffère d’une provenance à l’autre. Le
Tableau 1 résume la composition des principales biomasses lignocellulosiques utilisées pour
la production des biocarburants de 2ème génération.
Tableau 1 : Proportion massique en cellulose, hémicellulose et lignine de différentes biomasses lignocellulosique.
Endoglucanase
Exoglucanase
β-glucosidase
Rôle de l’Hydrolyse enzymatique:
Mise en contact différée: Cellule de mélange
Moteur
Agitateur
Tampon + enzymeS (15 µL de SP188, 30 µL de GC220, 15µL de CDH)
Membrane
Paille
• Substrat hétérogéne• Réaction lente• Chaleur faible
q Mesure de cinétiques par des techniques calorimétriques
-0,1 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 20 40 60 80 100
Flux
de
chal
eur(
mW
)
Temps (min)
Etalonnage avec de la cellobioseSoustraction d’un blanc
-
=
q Valeur de la littérature (1): Qth = -2,34� 0,12 kJ/mol;q Pas d’influence de la température (2);
(1) Y. B. Tewari,(1989), (2) L. Murphy, (2010)
m (mg) 50 85 100
Chaleur (J) 0,339 0,589 0,697
Chaleur molaire(kJ/mol)
2.323 2.373 2.386
T (�C) 25 33 45
Chaleur (J) 0,594 0,589 0,591
Chaleur molaire(kJ/mol)
2.396 2.373 2.381
Etalonnage avec de la cellobiose
q Effet de la température sur les chaleurs mesurées
Q45�C > Q50�C> Q55�C> Q40�C
-0,1 -0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 0,5 1 1,5
Hea
t flo
w (m
W)
Time (h)
40°C
45°C
50°C
55°C
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
40 45 50 55
Cha
leur
(J)
Température
Résultat pour l’hydrolyse de la paille micronisée
q Effet de la température sur la teneur en sucres réducteurs
22
23
24
25
26
27
28
29
30
40 45 50 55
Sucr
es (m
g)
Temperatures (°C)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
40°C 45°C 50°C 55°C
Cha
leur
/g s
ucre
Temperature
C45�C > C50�C> C55�C> C40�C Q/g45�C ~ Q/g50�C ~ Q/g55�C ~ Q/g40�C
Q45�C > Q50�C> Q55�C> Q40�C
q Exploitation de la mesure calorimétrique ?
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 10 20 30 40
Cha
leur
(J)
Sucres (mg)
(125mg, 40°C) (125mg, 45°C) (125mg, 50°C) (125mg, 55°C) (75mg, 45°C) (100mg, 45°C) (137.5mg, 45°C) (150mg, 45°C)
La chaleur mesurée est proportionnelle aux sucres produits
Valeur moyenne pour l’hydrolyse de 32,18 � 3,18 J/g [5.78 kJ.mol-1 ]
Un modèle simple: Michaelis-Menten
1K
1K-E + S ES E +P2K
Avec la linéarisation de Lineweaver and Burk :Mm
m
VSVK
v1)
][1(1
+=
q Mesure de la cinétique d’hydrolyse
[ ]app
t
HV
dtSS
D
W-=ò.0
0
ò=
=
=Df
i
tt
ttapp dt
dQn
H 1
dtdQ
HVv
app
..1
0 D=
q Hypothèse: Proportionnalité de la chaleur et de l’avancement de la réaction (1,2)
(1) P. E. Morin et E. Freire, Biochemistry (Mosc.), 1991
(2) S N Olsen, Thermochimica Acta, 2006
Résultats de la mesure calorimétrique
0
1
2
3
4
5
6
0 20 40 60 80
Rat
e(m
M/m
in)
[Cellobiose] mM
Essai 3 ( 80 mg/L) Essai 4 (80 mg/L) Run 1Run 2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
1/V
(min
/mM
)
1/S (mM-1)
Constantes de Michaelis-Menten :Km=35,15 � 0,95 mM
Vmax= 7,36 � 0,62 mM/min
q Retour à la cellobiose (1/2)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60 80 100 120
Rat
e (m
M/m
in)
[cellobiose] (mM)
Essai 1
Essai 2
Run 1
Run 2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
1/V
(min
/mM
)
1/S (mM)
Méthode du « point par point »
Michaelis-Menten constant: Km=34,01� 0,55 mMMaximal rate: Vmax= 8,42� 0,38 mM/min
Michaelis-Menten constant Km=35,15 � 0,95 mMVmax= 7,36 � 0,62 mM/min
q Retour à la cellobiose (2/2)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,04 0,06 0,08
v (m
M/m
in)
[S]
40°C
45°C
50°C
55°C
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
13 18 23
1/V
1/S
45°C
50°C
55°C
40°C
q Courbe sigmoide
q Valeurs négatives
La méthode ne s’applique pas directement
q Application à la paille de blé (1/3)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 0,002 0,004 0,006 0,008
V M
m/m
in
[S]
40°C
45°C
50°C
55°C
-0,1 -0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 0,5 1 1,5
Hea
t flo
w (
mW
)
Time (h)
40°C
45°C
50°C
55°C
Le plateau est choisi comme ligne de base
ü Allure conforme
ü Valeurs positives ET …
q Application à la paille de blé (2/3)
0
5
10
15
20
25
0 1000 2000 3000 4000
1/V
(mM
-1.m
in)
1/S ( mM-1)
40°C
45°C
50°C
55°C
ü Corrélation température optimale / valeur de vitesse maximale (à 45�C)
ü La constante de Michaelis varie peu avec la température
V (mM/min) Km mM
40�C 0,216 1,231
45�C 0,291 1,22
50�C 0.268 1.26
55�C 0.23 1.26
q Application à la paille de blé (3/3)
q Impact de la CDH (1/2)
ü Qcellulases + CDH > Qcellulases
ü Ccellulase + CDH ~ Ccellulases
-0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 10 20 30 40 50 60
Flux
de
chal
eur (
mW
)
Temps (min)
Cellulase+CDH
Cellulase
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Cellulases+CDH Cellulases
Suc
res
rédu
cteu
res
(mg)
Cha
leur
dég
agée
( J)
q Impact de la CDH (2/2)
ü Le cocktail cellulases + CDH produit +18,7 % de xylose et +81,8 % d’acide gluconique
üLa chaleur d'oxydation du glucose en acide gluconique calculée est de 69,14 kJ/mol (80-120 kJ/mol)
0
2
4
6
8
10
12
Glucose Xylose Cellobiose Acide gluconique
Car
bohy
drat
e(m
g)
Cellulases+CDH
Cellulases
q Conclusions
ü Méthode complémentaire à des analyses destructivesü Application en milieu homogèneü Mesure d’une chaleur d’hydrolyseü Cinétiques
ü Mécanismes à compléter (rhéologie, sels, plateaux…)
q Perspectives
ü Amélioration des cellules et amplification du signalü Amélioration des lois cinétiques et prédictivitéü Changement d’échelle pour études procédés (hydrolyse
+fermentation) en SSF SHF