CAN 407 Analyse instrumentale, Travaux pratiques · Sample mais plutôt continuer à utiliser Analyze Standard même si ce sont des échantillons inconnus. Noter pour ces échantillons

Protocoles Détaillés CAN 407 2017

© 2017 Département de Chimie Université de Sherbrooke Page 1 of 145

CAN 407 – Analyse instrumentale, Travaux pratiques

Protocoles

Date: Automne 2017

Département de Chimie – Division Analytique

Université de Sherbrooke



Table des Matières

Table des Matières ..........................................................................................................................2

Expérience 1 : Absorption/Émission Atomique ...........................................................................3

Expérience 2 : Chromatographie liquide 1 ................................................................................10

Expérience 3 : Chromatographie GC-MS ..................................................................................27

Expérience 4 : Voltampérométrie cyclique ................................................................................39

Expérience 5 : Chromatographie liquide 2 & Karl Fischer (KF) ............................................53

Expérience 6 : Analyse MALDI-MS ...........................................................................................65

Expérience 7 : Caractérisation des matériaux ...........................................................................83

Expérience 8: Chromatographie ionique ...................................................................................94

Expérience 9 : Fluorescence et Spectroscopie UV d’absorption ............................................116



Expérience 1 : Absorption/Émission Atomique



EXPÉRIENCE 1 : ABSORPTION/ÉMISSION ATOMIQUE

Théorie Cette section n’est qu’un bref résumé et la consultation d’ouvrages de référence

supplémentaire est nécessaire.

Pour la bonne compréhension de la technique de l’absorption et de l’émission

atomique, veuillez lire attentivement votre manuel Principe d’analyse instrumentale de

Skoog concernant ce sujet.

Protocole détaillé Pour l’utilisation de l’appareil, veuillez lire la procédure concernant

l’instrument décrite à la fin du protocole.

Absorption atomique – SAA (EN: AAS)

Analyse du zinc (flamme air/acétylène) – Étalonnage externe

Pour le zinc, la longueur d’onde à utiliser est de λ = 213,9 nm et la courbe est

linéaire jusqu’à 1ppm.

À partir d’une solution mère de 10 ppm, préparer des solutions d’étalonnage de

0 à 4 ppm dans le HCl 1 % dans des ballons volumétriques de 100 mL.

Diluer l’inconnu d’un facteur 100 et à l’aide de ces standards, évaluer la

concentration de zinc dans votre échantillon.

Analyse du sodium (flamme air/acétylène) – Étalonnage par ajouts dosés

La concentration de votre inconnu se situe entre 20 et 40 ppm. Préparer un

étalon dans un ballon de 100 mL contenant 4 ppm de Na pour évaluer votre inconnu.

Pour cette évaluation, diluez votre inconnu d’un facteur 10 dans l’eau déionisée.

Utilisez cette concentration approximative pour préparer une droite

d’étalonnage par additions connues (méthode des ajouts dosés, voir guide de

laboratoire et cours CAN-400) contenant 6 points avec des volumétriques de 100 mL.

Émission atomique SEA (EN: AES)

Analyse du potassium (flamme air/acétylène)

La raie d’émission du Potassium se situe à 𝜆é𝑚𝑖𝑠𝑠𝑖𝑜𝑛= 766,5nm. Préparez les

solutions d’étalonnage selon la table suivante :



Table 1. Étalons permettant la quantification du potassium par spectrométrie

d’émission atomique. (valeurs nominales)

Calculs Trouver la teneur en zinc, en sodium et en potassium (en ppm) de vos inconnus.

Effectuer les calculs d’erreur pour chacune des droites d’étalonnage.

- N’oubliez pas d’effectuer les tests supplémentaires nécessaires pour la détermination

des paramètres analytiques de la technique.

Notes supplémentaires pour la discussion

- Bien distinguer les deux différentes techniques, SEA vs SAA (forces, faiblesses,

applications…).

- Commentez les différentes méthodes d’étalonnage.

- Habituellement, les fournisseurs donnent des « recettes » avec l’appareil de

spectrométrie atomique à flamme, vous pouvez les consulter.

Instrument: Utilisation du AAnalyst 200

Ouvrir l’ordinateur en premier, ensuite ouvrir

l’appareil à l’aide du bouton ON/OFF NOTE : Les images dans ce protocole sont à titre indicatif, se

référer au texte pour tous les paramètres.

Choisir : Flame

Appuyer sur OK

Il est conseillé de débuter par l’absorption car

l’appareil a besoin d’un temps de stabilisation pour

ce mode. Ensuite l’émission pourra être aussitôt débutée.

Absorption atomique

S’assurer que la bonne lampe est installée, elle se situe dans le panneau en dessous de

Analyte: Potassium

Solvant: Eau déionisée

Solution: Préparées à partir d'une solution mère de K à 5ppm (Michel Trotier)

Aliquote (mL) Volumétrique (mL) Concentration (ppm)

1 50 0,1

2 50 0,2

3 50 0,3

6 50 0,6

7 50 0,7

9 50 0,9

10 50 1,0



l’écran tactile.

Entrez les paramètres suivants

sur l’écran tactile de

l’appareil.

Lamp /

Signal : Atomique absorption

Element : Zn.

Attendre quelques instants que

l’appareil ajuste la lampe.

Une fois les touches de droite

réactivées, appuyez sur Setup

Instrument pour optimiser le système de détection.

Attendre au moins 30 minutes

que la lampe se réchauffe.

Préparation des solutions

pendant ce temps.

Parameters/Spectrometer/

Integration time (sec): 3

Replicates : 3

Read Delay (sec) : 5

Décocher les deux cases dans

‘Print’

Cocher : Manual Data Display

Parameters/Calibration /

Equation : Linear through zero

Units : mg/L

Entrer les concentrations des

étalons en mg/L (ppm) dans

les cases numérotées

Flame/

Il y a un X rouge.

Ouvrir la bombonne

d’acétylène.

Un crochet vert devrait

apparaître quelques secondes

après.



Appuyer sur

l’interrupteur ON/OFF

à l’écran. La flamme

s’allume.

Quand le signal à

l’écran semble stable

(quelques secondes

seulement), appuyer

sur AutoZero Graph.

Analyse/

Mettre le tube

d’échantillonnage dans

le blanc (le solvant

dans laquelle

vos solutions sont

diluées)

Appuyer sur Analyse Blank. La prise de mesure est terminée lorsque le rond vert

redevient gris. Refaire ce test jusqu’à ce que le résultat soit zéro ou le plus près

possible. Trois fois devrait suffire en absorbance.

Mettre le tube

dans l’étalon de

concentration

indiqué à l’écran.

Appuyer sur

Analyse Standard

et noter les trois

valeurs en

absorbance et non

la moyenne.

Répéter pour

chaque étalon de

concentration

différente.

Pour l’analyse des

échantillons ne pas

utiliser Analyze

Sample mais plutôt continuer à utiliser Analyze Standard même si ce sont des

échantillons inconnus. Noter pour ces échantillons les trois valeurs en absorbance. On

utilise cette approche pour éviter que le logiciel fasse les calculs pour vous.



Émission atomique

Toutes les solutions doivent être prêtes avant de commencer.

Entrer les paramètres sur l’écran tactile de l’appareil.

Parameters/Spectrometer /

Integration time (sec): 3

Replicates : 3

Read Delay (sec) : 5

Décocher les deux cases dans Print

Cocher : Manual Data Display

Parameters/Calibration /Equation : Linear through zero

Units : mg/L

Entrer les concentrations des étalons en mg/L (ppm)

Si la flamme est fermée faire ce qui suit, si elle est ouverte passer au point Lamp.

Flame/

Il y a un X rouge, ouvrir la bombonne d’acétylène, un crochet vert devrait apparaître

quelques secondes après. Appuyer sur l’interrupteur ON/OFF à l’écran. La flamme

s’allume. Quand le signal à l’écran semble stable (quelques secondes seulement),

appuyer sur AutoZero Graph.

Lamp/

Appuyer sur Install lamp/

Décocher tout. En émission on

n’utilise pas de lampe.

Signal : Flame Emission

Element : K

Une fenêtre s’ouvre.

Mettre le tube dans l’étalon le plus concentré et appuyer sur OK

Lorsque les icones redeviennent en surbrillance, mettre le tube dans le blanc.

Analyse/

Appuyer sur Analyse Blank. La prise de mesure est terminée lorsque le rond vert

redevient gris. Refaire ce test jusqu’à ce que le résultat soit de zéro ou le plus près

possible. 6 fois devrait suffire en émission.

Mettre le tube dans l’étalon de concentration indiqué à l’écran.

Appuyer sur Analyse Standard et noter les trois valeurs.

Répéter pour tous les étalons.

Pour l’analyse des échantillons appuyer sur Analyze Standard même si ce sont des

échantillons inconnus. Noter les trois valeurs.



Fermeture de l’appareil

Flame/

Appuyer sur l’interrupteur ON/OFF pour éteindre la flamme.

Fermer la bombonne d’acétylène

Appuyer sur Bleede Gases, cela vide les lignes de gaz pendant quelques secondes.

Éteindre l’appareil avec le bouton d’alimentation par lequel il a été ouvert.


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Expérience 2 : Chromatographie liquide 1



EXPÉRIENCE 2 : CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE 1

Théorie (Cette section n’est qu’un bref résumé et la consultation d’ouvrages de référence

supplémentaire est nécessaire)

La chromatographie liquide est définie comme toute procédure

chromatographique où la phase mobile est un liquide. Elle est utilisée pour les produits

qui ne sont pas séparables en chromatographie en phase gazeuse parce qu’ils ne sont

pas volatils à basse température ou parce qu’ils se décomposent avec la température.

Dans la pratique, il y a environ 20 % des produits organiques qui sont analysables en

chromatographie en phase gazeuse.

À ses débuts, la chromatographie liquide impliquait des colonnes de

dimensions considérables que traversait la phase mobile par gravité, ce qui pouvait

prendre plusieurs heures. L’ajout d’une pompe pour faire circuler la phase mobile et

d’un détecteur pour détecter les produits à la sortie de la colonne accéléra beaucoup les

analyses. Finalement, le perfectionnement des pompes, la venue d’injecteur à haute

pression et l’immense progrès dans ce qui a trait au support sur les colonnes permet

maintenant de réaliser des séparations très difficiles dans un temps assez court. Ce

type de chromatographie est maintenant désigné sous le terme « chromatographie

liquide à haute performance », plus couramment appelée « HPLC ».

En chromatographie liquide, comme dans toutes les autres méthodes

chromatographiques, les séparations sont fondées sur la différence de distribution des

espèces entre deux phases non miscibles, l’une stationnaire (silice vierge ou greffée,

alumine, résine échangeuse d’ions,…), l’autre mobile (phase liquide constituée par un

solvant pur ou plus souvent par un mélange de solvants). Pour un système

chromatographique donné, on caractérise la distribution de chaque soluté par le

coefficient de distribution (ou coefficient de partage) K défini par la relation :

CS et CM désignant respectivement les concentrations du soluté à l’équilibre

dans les phases stationnaire et mobile.

De la différence d’affinité des divers constituants d’un mélange pour chacune

des deux phases, il résulte une différence de vitesse de migration de chaque composé,

d’où une possibilité de séparation. Expérimentalement, une faible quantité de

l’échantillon à analyser est introduite à l’entrée de la colonne puis, sous l’action de la

phase mobile (éluant), les divers constituants de l’échantillon migrent dans la colonne

d’autant plus lentement qu’ils ont plus d’affinité pour la phase stationnaire. Si les

quantités injectées sont suffisamment faibles, des pics symétriques, plus ou moins

séparés, sont détectés à la sortie de la colonne.

Une bonne séparation en chromatographie en phase liquide implique :



• Que les divers constituants du mélange soient retenus dans la colonne, donc

présentent une affinité pour la phase stationnaire suffisante pour qu’ils apparaissent

dans l’effluent après un volume supérieur au volume de la phase mobile contenue dans

la colonne.

• Que les différents pics soient bien séparés, ce qui, pour deux pics consécutifs,

dépend de deux facteurs : la distance séparant les sommets des deux pics et leur

largeur.

• Que l’analyse soit aussi rapide que possible.

Figure 1. Exemple de chromatogramme pour démontrer la notion de résolution en

chromatographie.

• Pour la séparation de deux pics : il faut noter l’influence de la distance entre

les pics et de leur largeur sur la résolution. Sur le chromatogramme (a), il y a

chevauchement des deux pics. Pour les séparer, il y a deux possibilités :

- Soit augmenter la distance entre les pics, en conservant leur largeur

constante (chromatogramme b). On augmente alors la sélectivité.

- Soit diminuer la largeur des pics, en conservant leur écartement

constant (chromatogramme c). On augmente l’efficacité.

Efficacité d’une colonne (nombre de plateaux théoriques)

L’efficacité d’une colonne chromatographique, dont dépend l’étalement des

pics, est mesurée, pour chaque composé, par le nombre de plateaux théoriques N

contenus dans la colonne. La théorie des plateaux établit que, après un certain parcours

dans la colonne, les pics d’élution peuvent être assimilés à des courbes de Gauss, dont

l’écart-type σ (exprimé en unité de temps) est lié au nombre de plateaux théoriques

parcourus par la relation :

Utilisant les caractéristiques géométriques de la courbe de Gauss, on peut

calculer le nombre de plateaux théoriques contenus dans une colonne, pour un soluté

donné, directement à partir du chromatogramme obtenu.



Ω = largeur du pic à la base, définie comme la distance entre les points

d’intersections des tangentes d’inflexion avec la ligne de base (ω=4σ), et δ = largeur

du pic à mi-hauteur (δ-σ√5.54 = 2.36 σ).

Figure 2. Calcul du nombre de plateaux théoriques contenu dans une colonne pour un

composé donné selon le profil gaussien

En pratique, on préfère souvent la seconde expression à la première, δ pouvant

être mesuré de façon plus précise que ω, en particulier dans le cas de pics non

parfaitement symétriques. En rapportant la largeur du pic ω à la distance de rétention

mesurée sur le chromatogramme, N constitue bien une mesure de l’élargissement

relatif du pic dans la colonne, ce qui permet, pour un composé donné, de comparer

entre elles les performances de colonnes variées. C’est pourquoi cette notion de

plateaux théoriques, bien qu’elle repose sur un modèle qui ne précise pas l’influence

des différents paramètres, reste d’un usage très général de par sa simplicité.

Pour pouvoir comparer entre elles des colonnes de différentes longueurs (L),

on définit la hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT ou H).

L’équipement en HPLC

L’appareil utilisé en chromatographie liquide haute performance est constitué

des différentes parties suivantes :



Figure 3. Schéma d’un chromatographe en phase liquide : (1) réservoir de phase

mobile (solvants); (2) pompe; (3) pré-colonne (filtre à solvant); (4) injecteur; (5)

manomètre (mesure de la pression); (6) colonne; (7) détecteur; (8) acquisition des

données.

La plupart des systèmes sont vendus de façon modulaire. Lorsque l’on monte

un tel système (instrument), on doit éviter le plus possible les volumes morts entre ses

unités, spécialement entre l’injecteur et la colonne ainsi qu’entre cette dernière et le

détecteur car plus le volume de connexion sera grand à ces endroits, plus

l’élargissement des pics sera considérable. Par contre, un volume mort avant

l’injecteur n’affectera pas la qualité de la séparation mais rendra moins pratique les

changements de solvant et occasionnera un délai dans l’application d’un gradient

d’élution. Pour ces raisons, on aura intérêt à utiliser des tuyaux de diamètre interne le

plus petit possible et des raccords ne possédant pas de volume mort; en pratique, on

utilise des tubes en acier inoxydable de diamètre interne de 0,25 à 0,50 mm.

Réservoir de phase mobile

L’extrémité du tuyau d’amené de la phase mobile doit toujours être munie d’un

filtre pour empêcher toute particule de venir boucher les conduits, la pompe ou la

colonne. Généralement, des filtres en acier inoxydable poreux de 20 à 30 µm sont

utilisés (exemple ci-dessous).

Figure 4. Filtre pour phase mobile type

Puisque les solvants utilisés en HPLC sont soumis à de fortes pressions, ils

doivent être exempts de tout gaz dissous. Pour les dégazer, il suffit d’appliquer un



vide sur le réservoir pendant 10 à 15 minutes en agitant occasionnellement.

Système de pompage

Le système de pompage doit pouvoir fournir la colonne en solvant de façon

constante et reproductible. Puisque les particules de faible dimension utilisées dans les

colonnes modernes offrent une forte résistance au passage du solvant, on doit pouvoir

disposer de pompes à haute pression.

Les pompes alternatives sont le plus souvent utilisées dans les

chromatographes modernes. Cette popularité est due à une performance globale très

satisfaisante et à ses avantages pratiques d’utilisation. Ces pompes possèdent une

chambre de pompage de faible volume (35-400 µL) et utilisent soit un piston ou un

diaphragme pour pousser le solvant contre la pression de la colonne. Pour varier le

débit, les pompes commerciales font varier soit la fréquence du piston ou le volume de

pompage.

Injecteur

La valve d’échantillonnage est l’injecteur le plus utilisé sur les HPLC. Elle

permet d’introduire de façon reproductible l’échantillon sur la colonne pressurisée

sans interrompre le débit de façon significative.

En position d’introduction, on injecte l’échantillon dans une boucle de volume

prédéterminé alors que la phase mobile s’écoule directement dans la colonne. En

position d’injection, la phase mobile passe dans la boucle et entraîne l’échantillon vers

la colonne. Ce type d’injecteur permet d’introduire de façon rapide, reproductible et

pratiquement indépendante de l’opérateur un large volume d’échantillon à des

pressions jusqu’à 7000 psi avec une erreur inférieure à 0,2 %.

Figure 5. Valve d’échantillonnage à 6 ports type



Détecteur

Un des détecteurs les plus utilisés est le spectromètre UV-visible (190-600

nm). Il possède une grande sensibilité pour plusieurs composés; ces derniers doivent

cependant absorber la lumière UV ou visible pour être détectés. Cette absorbance est

reliée à la concentration de l’espèce par la relation de Beer-Lambert :

Où A : absorbance; ε : coefficient d’extinction molaire (L cm-1 mol-1); l :

longueur de la cellule (cm) et c : concentration de l’espèce (mol L-1). Ce mode de

détection possède les avantages suivants :

• Relativement insensible aux changements de débit, de température ou de

composition de la phase mobile.

• Sensibilité absolue de l’ordre 0.002 unité d’absorbance avec un bruit de fond de ±1

%.

• Limite de détection est de l’ordre du nanogramme pour des composés qui absorbent

moyennent.

• Domaine de linéarité est très grand (105 d’ordre de grandeur).

• Très résistant.

• Faible volume mort (petite cellule).

• Très reproductible.

Les colonnes

Caractéristiques physiques

Les colonnes classiques sont des tubes en acier inoxydable dont l’intérieur doit

être le plus lisse possible pour éviter la présence de chemins préférentiels; les

extrémités sont fermées par un filtre en acier dont les pores doivent être plus petits que

les particules dans la colonne. Il en existe de différentes dimensions, le diamètre

intérieur typique allant de 0.2 à 0.8 cm et la longueur variant de 5 à 30 cm.

Différents types de supports solides

Le cœur de la colonne, et probablement le facteur le plus important de la

séparation, demeure le support solide qui s’y trouve et la façon dont il y est introduit.

Comme le remplissage d’une colonne avec des particules plus petites que 20 µm

demande une habileté et un équipement spécial, il est recommandable d’acheter ces

colonnes déjà préparées par le fabricant. Toutefois, pour des particules de dimension

supérieure, le remplissage peut être fait aisément par l’utilisateur. Quant aux

particules elles-mêmes, on peut les classer par les caractéristiques suivantes :

• Solide rigide, gel dur ou gel mou,



• Poreuse, superficiellement poreuse ou pelliculaire,

• Particule sphérique ou irrégulière

• Grosseur des particules

Les particules solides rigides sont basées sur une matrice en silice et peuvent

tolérer des pressions élevées (10 000 à 15 000 psi). Ces particules de silice peuvent

être obtenues dans une variété de grosseur, de forme et de porosité. Également, une

variété de groupements fonctionnels ou de couches polymériques peuvent être attachés

à la surface.

Les gels durs sont généralement constitués de particules poreuses de

polystyrène sur lesquelles est greffé du divinylbenzène. Bien que plusieurs de ces gels

puissent être utilisés à des pressions allant jusqu’à 5000 psi, l’usage de certaines de ces

particules est limité à moins de 2000 psi. Les gels durs sont principalement utilisés en

chromatographie d’exclusion ou d’échange d’ion.

Les gels mous sont pratiquement utilisés que pour la séparation de grosses

molécules solubles dans l’eau, comme les protéines. Cependant, ces gels ne peuvent

généralement pas résister aux fortes pressions et leur emploi est ainsi très limité.

Les particules de remplissage des colonnes peuvent également être décrites

comme soit poreuses ou pelliculaires. Ce dernier type de particules est fait à partir de

billes de verre qui sont recouvertes d’une mince couche de phase stationnaire. Dans

une version plus récente de ces particules, une couche poreuse de silice est d’abord

déposée sur la bille de verre, donnant des particules partiellement poreuses. Cette

couche de silice peut à son tour être enrobée avec une phase stationnaire liquide ou

peut réagir chimiquement pour former un lien covalent avec la phase stationnaire. On

peut ainsi greffer différentes phases stationnaires de polarité variée.

Même si en général les petites particules poreuses (5-10 µm) sont les plus

couramment utilisées à cause de leur efficacité élevée et de leur rapidité de séparation,

les colonnes de particules pelliculaires peuvent être adéquates pour des mélanges

simples qui ne requièrent que peu de résolution et lorsque le coût de la colonne est

important, comme pour des analyses de routine. Cependant, la quantité d’échantillon

qui peut être injectée est inférieure aux particules poreuses car il y a moins de phase

stationnaire disponible par unité de volume.

Les particules poreuses peuvent ensuite être décrites comme sphériques ou

irrégulières, de dimension variable (5 µm et plus). Ces deux types de particules

peuvent donner une efficacité (nombre de plateaux N) similaire lorsque les autres

paramètres de la colonne sont les mêmes. Bien qu’une controverse existe quant à la

perte de charge inhérente à ces deux types de particules, l’avantage des particules

sphériques est que l’entassement est plus stable; cela implique que l’efficacité de la

colonne est toujours constante alors des chemins préférentiels peuvent facilement

s’établir au travers de particules irrégulières, ce qui entraîne une perte d’efficacité dans

le temps.



Phase normale vs phase inversée

En phase normale, la phase stationnaire est polaire et l’éluant est un solvant pas

ou peu polaire; les composés peu polaires sont alors peu retenus sur la colonne et

sortent en premier. En phase inversée, la phase stationnaire est peu polaire

(généralement de longues chaînes aliphatiques) et l’éluant polaire; les composés

polaires sont peu retenus et sont les premiers détectés. Cette dernière façon de

procéder a très vite gagné en popularité car on a souvent à séparer des composés peu

ou moyennement polaires, séparations jusqu’alors difficile à réaliser en phase normale.

Utilisation des colonnes

Finalement, on doit porter une certaine attention à l’utilisation d’une colonne

particulière. Il peut y avoir une différence notable entre les propriétés

chromatographiques de deux colonnes similaires (même fournisseur, même numéro de

catalogue); on doit donc toujours optimiser les différents paramètres de la séparation

sur une colonne spécifique pour en tirer le maximum de performance.

Enfin, on doit faire très attention de ne pas surcharger la colonne par l’injection

d’une quantité trop grande d’échantillon, ainsi qu’à l’injection de composés pouvant

contaminer la phase stationnaire. Pour éviter de ruiner ainsi une colonne de haute

efficacité, on utilise souvent une précolonne, petite colonne contenant la même phase

stationnaire que la colonne; ces colonnes sont peu coûteuses et faciles à remplir, le cas

échéant.

Protocole détaillé

Objectifs

- Mesurer la quantité de caféine, d’acétaminophène et de benzoate de sodium

dans divers échantillons.

- Séparer un mélange complexe composé de différents HAPs

Appareillage

Un montage HPLC tel que décrit dans la théorie est utilisé. La colonne est du

type C18. Le détecteur est un spectromètre UV-visible; l’utilisation de ce détecteur

permet de sélectionner la longueur d’onde adéquate pour chacun des composés à

analyser.

Préparation

Préparation de la solution-mère

Dans un erlenmeyer de 1 L, préparer environ 800 mL d’un mélange 50/50



méthanol/eau. Agiter pour bien mélanger.

Dans un même volumétrique de 500 mL, préparer la solution mère suivante à

partir des composés solides :

• Acétaminophène : entre 500-550 ppm

• Caféine : entre 200-225 ppm

• Benzoate de sodium : entre 500-550 ppm

Utiliser un mélange environ 50/50 méthanol/eau comme solvant.

Optimisation de la méthode

L’optimisation d’une méthode chromatographique implique la variation de

plusieurs paramètres, par exemple : le volume d’injection, le débit et la composition de

l’éluant, etc. Cette optimisation peut prendre une journée, voire plus. Une période de

laboratoire ayant une durée limitée, vous allez déterminer l’effet d’un seul paramètre :

la composition de l’éluant

Conditions opératoires

• Colonne : PoreShell 120 EC-C18 (Agilent) 2.7µm 4,6 x 100 mm

• Éluant : méthanol, eau, acide acétique

• Débit : 1 mL/min

• Volume d’injection : 5 µL

• Détecteur : DAD à 275 nm

Un paramètre non spécifié dans les conditions ci-dessus est la proportion

relative de méthanol et d’acide acétique de l’éluant.

À partir de méthanol (bouteille B), de l’eau (bouteille A) et d’acide acétique

10% dans l’eau (bouteille D), programmer un mélange isocratique de ces trois solvants

pour constituer la phase mobile permettant de séparer les trois composés à doser

sachant que la proportion de la bouteille A devrait être entre 60 et 80%. Faites vos

essais de séparation en injectant de la solution-mère.

Indices : il faut un pourcentage de méthanol appréciable pour pouvoir faire

sortir de la colonne les trois composés mais pas trop pour éviter que les produits se

retrouvent dans le front de solvant. Il faut aussi de l’acide acétique pour aider à

protoner certaines espèces pour obtenir des pics symétriques reproductibles mais il ne

faut pas oublier que cet acide augmente la polarité générale de l’éluant diminuant ainsi

son pouvoir d’élution en phase inverse.

La figure 6 est un exemple de chromatogramme obtenu avec une colonne C18

mais de dimension différente; les temps de rétention sont à titre indicatif seulement.



Figure 6 : Chromatogramme type obtenu pour un mélange d’acétaminophène, de

caféine et de benzoate de sodium.

Préparation des étalons

À partir de la solution mère, préparer six standards pour la courbe de

d’étalonnage. Compléter chaque solution à 50 mL avec de l’eau déionisée.

Table 1. Préparation des solutions étalons pour quantifier l’acétaminophène, la caféine

et le benzoate de sodium dans une solution inconnue.

Filtrer chaque échantillon sur filtre PVDF 0,45 µm et transférer dans un vial

pour l’échantillonneur automatique. Utiliser la même seringue et le même filtre pour

chacun des échantillons en rinçant avec la solution suivante le filtre et la seringue entre

chaque point. Filtrer les échantillons du plus dilué au plus concentré.

Injecter une fois chaque standard dans le chromatographe. Construire, sur un

même graphique, la courbe d’étalonnage de chacun des composés en plaçant la

concentration en mg/L (ppm) en abscisse et la surface du pic en ordonnée.

Quantification de l’inconnu (à réaliser avant la fin du laboratoire - PRIORITÉ)

Filtrer sur PVDF 0,45 µm un certain volume de l’inconnu et introduire dans un

Standard Volume de solution mère

(mL)

Volume final

(mL)

1 5 50

2 10 50

3 20 50

4 30 50

5 40 50

6 50 50



vial pour injecteur automatique. Injecter deux fois l’inconnu. À l’aide de votre courbe

d’étalonnage, déterminer la quantité de chacun des produits en ppm.

Quantification du comprimé de Tylénol

• Peser le comprimé de Tylénol; puis le broyer à l’aide d’un mortier et d’un

pilon. Transférer environ 125 mg (pesés précisément) du comprimé dans un

volumétrique de 100 mL. Conserver le reste du comprimé pour l’expérience de GC-

MS. Ajouter environ 50 mL d’un mélange méthanol-eau 1:1, dissoudre (un bain

ultrason peut être utile) et compléter à la marque avec le mélange méthanol eau 1:1

• Diluer avec de l’eau déionisée une partie de l’échantillon 5X précisément.

Filtrer sur PVDF 0,45 µm et introduire dans un vial pour injecteur automatique.

Injecter une fois cet échantillon.

Déterminez la quantité de chacun des produits en milligrammes par comprimé.

Quantification du Diet-Pepsi

Filtrer sur PVDF 0,45 µm un petit volume de Diet-Pepsi® dégazé et introduire

dans un vial pour injecteur automatique. Injecter une fois cet échantillon. Déterminer

la quantité de chacun des produits en ppm.

Quantification du café instantané

Peser précisément entre 350-400 mg de café instantané. Placer dans un ballon

jaugé de 100 mL et diluer avec de l’eau déionisée. Placer dans un bain ultrasonique

durant une à deux minutes pour faciliter la solubilisation du café. Bien mélanger.

Filtrer sur PVDF 0,45 µm et introduire dans un vial pour injecteur automatique.

Injecter une fois cet échantillon. Déterminer la quantité de chacun des produits en

pourcentage poids.

Quantification de la boisson énergétique Red Bull

Pipeter 5 mL de la boisson Red Bull et placer dans un ballon jaugé de 10 mL.

Diluer avec de l’eau déionisée. Filtrer sur PVDF 0,45 µm et introduire dans un vial

pour injecteur automatique. Injecter une fois cet échantillon. Déterminer la quantité de

chacun des produits en milligrammes de composé par 250 mL de boisson.

Séparation d’un mélange contenant plusieurs composés de type HAP (Noter que

cette solution a déjà été préparée par le technicien)

Trouver les conditions expérimentales pour la séparation d’un mélange

contenant sept HAPs, sans toutefois les quantifier. Les solvants à utiliser sont de

l’acétonitrile et de l’eau (normalement bouteille C pour acétonitrile et A pour l’eau).

La colonne chromatographique utilisée est la même que pour les analyses précédentes,

c’est-à-dire une colonne C18. Vous devez changer la longueur d’onde d’analyse du



détecteur pour 254 nm. Injecter 1 µL du mélange de standards. La solution standard

de HAPs est relativement concentrée donc il faut en injecter moins afin de ne pas

saturer la colonne et le détecteur.

Calculs Déterminez l’inconnue ainsi que les produits commerciaux analysés. Comparez vos

résultats.




- Bien démontrer la compréhension de la technique chromatographique utilisée ainsi

que le choix des conditions expérimentales choisies. (colonne, éluant, température,

détecteur…)

- Assurez-vous de savoir ce qu’est un détecteur de type DAD. Quels sont les autres

détecteurs possibles? Quels sont leurs avantages?

- Comparez les résultats obtenus avec les valeurs de référence.

Information Supplémentaire: Utilisation de LC Agilent Series 1100 et

du logiciel HP-Chemstation

Appareil

Figure 7. Chromatographe Agilent Série 1100

Départ du système

Démarrer l’appareil (mettre en marche la pompe) avec la phase mobile

suggérée. Prenez note qu’il faut pomper la phase mobile quelques minutes dans la

colonne chromatographique afin que la pression de stabilise dans cette dernière

(conditionnement de la colonne).

Préparation des phases mobiles (déjà fait dans votre cas!)



S’assurer que les bouteilles contiennent assez de liquide porteur (au moins

500mL), sinon en préparer. Tout liquide utilisé en chromatographie liquide doit être

de qualité HPLC (grade). Normalement, il est préférable de filtrer les solvants sur un

filtre 0,45µm avant de les utiliser. Sur ce système, il est inutile de dégazer les solvants

car l’appareil est muni d’un dégazeur.

Démarrer l’appareil

Mettre les modules sous tension (si ce n’est pas déjà fait). S’assurer que la

valve noire est ouverte (légèrement dévissée d’environ 2 tours). Cette valve de purge

sert à diriger les phases mobiles soit vers la colonne (en position fermée) ou vers le «

waste » (en position ouverte). On ouvre cette valve au démarrage pour « purger » les

lignes des phases mobiles (éliminer l’air dans la tuyauterie).

Allumez l’ordinateur et démarrer HP Chemstation. Sur la figure suivante, on

voit l’écran d’ouverture du logiciel avec le diagramme de l’instrument.

Figure 8. Saisie d’écran d’une séance dans le logiciel de gestion d’instrumentation

graphique Chemstation

Vous pouvez corriger les volumes des contenants des phases mobiles en

cliquant sur une bouteille (sur le diagramme de l’instrument) et en choisissant «

Solvent bottles filling ». Entrer les nouveaux volumes.

Instrument/acquisition

Si vous cliquer sur l’icône de la pompe (sur le diagramme de l’instrument)

vous pouvez ajuster les paramètres de la pompe dans le menu « Setup pump ».



Figure 9. Menu de réglage de la pompe

• Flow : ajustement du débit de la pompe

• Stop time : Temps d’analyse

• Post time : temps d’attente avant le début de la prochaine analyse

• Solvents : Composition des phases mobiles

• Timetable : Table de programmation de la pompe lorsqu’en mode gradient

Entrez le % de composition que vous désirez et régler le débit désiré (1mL/min

pour le moment). S’assurer que la valve de « purge » est en position ouverte. Partir la

pompe en cliquant sur l’icône de la pompe, puis en sélectionnant « Pump ON ». La

pompe devient alors verte sur le diagramme de l’instrument, signe qu’elle est en

fonction. Augmenter le débit à 5mL/min (seulement si la purge est en position

ouverte). Laisser la pompe à ce débit pendant quelques minutes afin de s’assurer que

l’air présent dans les tubes soit évacué.

Remettre le débit dans la colonne à votre débit désiré (environ 1mL/min), puis

fermer la valve noire de purge (sans utiliser une force herculéenne!) pour diriger la

phase mobile dans la colonne. Laisser le temps au système de se stabiliser. Tout

changement de la composition des phases mobiles ou du débit doit être suivi d’une

période d’attente pour la stabilisation de la colonne. La colonne est stable et à

l’équilibre lorsque la pression dans le système est stable pendant 5 à 10 minutes.

Configuration des paramètres d’injection

Cliquer sur l’icône de l’injecteur sur le diagramme de l’instrument pour avoir

accès aux options qui permettent la programmation de l’injecteur.



Figure 10. Menu configuration de l’injecteur

Vous verrez 3 modes d’injections différents :

• Standard injection

• Injection with needle wash

• Use injector program

Aujourd’hui nous utiliserons le mode « standard injection ». Vous devez

également régler le volume d’injection à 10µL.

Détecteur de type DAD

Cliquer sur l’icône du détecteur DAD sur le diagramme de l’instrument vous

aurez alors accès aux paramètres du détecteur UV-visible.

Figure 11. Menu de configuration du détecteur.

• Signals : permet de définir les caractéristiques des 5 signaux possibles

d’enregistrer simultanément.

• Spectrum : permet de définir pour quelle partie du signal, le spectre sera

sauvegardé.

Voyons maintenant plus en détails les sections de signals et spectrum.

• Signals :

- Store : en cochant cette case, ce signal sera sauvegardé

- Sample : longueur d’onde de l’échantillon à laquelle l’absorbance sera

mesurée en fonction du temps. L’absorbance de la référence est soustrait de

l’absorbance de l’échantillon.

- Bw (bandwidth) : largeur de la bande (en nm) de la longueur d’onde de

l’échantillon.

- Reference : longueur d’onde de référence à laquelle l’absorbance sera

mesurée en fonction du temps.

- Bw (bandwidth) : largeur de la bande (en nm) de la longueur d’onde de



référence.

• Spectrum

- Store : l’option All in peak permet d’acquérir les spectres entre les pics

- Range : permet de spécifier les limites des longueurs d’onde à être

sauvegardées pour le spectre

Analyses

Préparation de l’échantillon

Filtrer toutes les solutions sur un filtre de 0.45µm. Les vials spécialement

conçues pour aller dans le HPLC doivent être remplis au 2/3.

Injection

Insérer vos vials dans l’échantillonneur de l’injecteur automatique.

Cliquer sur l’icône montrant 3 vials sur le diagramme de l’instrument. Vous

pourrez ainsi accéder aux paramètres vous permettant de créer votre séquence

d’injection.

Cliquer sur start lorsque votre séquence est créée, pour démarrer les injections.

Sur la droite de l’écran, vous verrez le schéma de l’échantillonneur. Vous

pourrez ainsi suivre la progression de votre séquence.

Si vous voulez faire des injections ponctuelles afin de déterminer votre

composition de phase mobile idéale pour la séparation de vos composés d’intérêts,

vous pouvez cliquer sur l’icône du vial seul. Vous pouvez ainsi entrer les paramètres,

puis faire l’injection.

Consulter votre démonstrateur afin de faire approuver votre composition

de phase mobile, avant de débuter vos injections.



Expérience 3 : Chromatographie GC-MS



EXPÉRIENCE 3 : CHROMATOGRAPHIE GC-MS



Dilution isotopique

La dilution isotopique consiste à comparer l’intensité d’un ion moléculaire

spécifique (fragment obtenu par MS) du composé d’intérêt à celui d’un autre ion

moléculaire analogue de même structure, marqué par un isotope et ajouté (dopé, EN:

spike) à la matrice (l’échantillon) en quantité connue. Cette méthode est très utilisée

dans l’analyse environnementale, médicale et médicolégale (ex : analyse d’urine dans

le dopage).

Malgré l’élégance de cette méthode, des problèmes pratiques empêche souvent

son utilisation (ex : coûts des standards isotopiques) dans les laboratoires sous-

gradués. Cependant il est possible de synthétiser facilement une forme trideutérée de la

molécule de caféine (7,7,7 caféine-d3) en utilisant deux produits peu dispendieux,

c’est à dire la théophylline (1,3-dimethylxanthine) et l’iodométhane-d3. Le produit de

cette réaction élue comme un seul pic par HPLC et démontre le même temps de

rétention et le même spectre UV que la caféine.

Extraction sur phase solide

L’autre intérêt de cette analyse réside dans la méthode d’extraction de la

caféine des breuvages. Cette extraction se fera par extraction en phase solide (EN :

solid phase extraction, SPE).

L’extraction en phase solide permettra d’extraire la caféine d’un breuvage dont

le composant principal est l’eau, pour la dissoudre dans un solvant organique plus

approprié à l’utilisation d’une colonne capillaire de GC.

L’extraction se fera à l’aide de cartouche contenant une petite quantité de

copolymère. Ce copolymère se comporte comme la phase stationnaire C18. Le C18 est

la phase stationnaire non polaire contenu dans la majorité des colonnes HPLC utilisées

pour la chromatographie liquide en phase inverse. Cette cartouche est en fait une mini-

colonne HPLC. Ces cartouches sont très utiles dans la préparation d’une analyse soit

pour nettoyer un échantillon et/ou pour concentrer un composé d’intérêt. La

préparation de l’échantillon est toujours une des étapes les plus importantes d’une

analyse. Cette étape améliore l’analyse parce que le chromatogramme est plus simple

et la durée de vie des colonnes est augmentée.

Quatre étapes sont nécessaires dans la procédure d’extraction par phase solide :

• le conditionnement de la phase stationnaire

• le chargement de l’échantillon sur la phase stationnaire



• l’élution de produits indésirables

• l’isolement du composé d’intérêt

Conditionnement de la cartouche

Cette étape est analogue à celle de conditionnement d’une colonne HPLC.

Premièrement toutes contaminations présentes dues à la fabrication de la cartouche et

à sa manutention lors de la mise en marché sont éliminées. L’élimination de ces

impuretés est essentiel parce qu’ils peuvent éluer et contaminer l’échantillon. Le

conditionnement « mouille » la phase stationnaire et la laisse dans un état compatible

avec la phase mobile initiale et l’échantillon.

Le premier solvant à utiliser pour le conditionnement doit posséder une force

d’élution aussi forte ou plus forte que le solvant qui servira à l’élution du composé

d’intérêt. Ceci assure que toute contamination qui peut éluer avec le composé est

éliminée de la cartouche avant l’introduction de l’échantillon. Le deuxième solvant de

conditionnement doit être un solvant plus faible que le premier, mais qui sera miscible

avec le solvant contenant le composé d’intérêt. Ordinairement, H2O est utilisée avec

les cartouches non polaires comme la C18. Ceci permet d’éliminer les impuretés plus

polaires contenues sur la C18.

Introduction de l’échantillon

L’échantillon est introduit sur la colonne dans un solvant faible (l’eau pour une

cartouche de C18) ce qui assure que le composé d’intérêt, moins polaire que le solvant

dans lequel il est contenu, soit retenu sur la cartouche.

Rinçage ou élution de produits indésirables

Après l’introduction de l’échantillon, une phase mobile légèrement plus forte

ou d’égale force d’élution que la phase initiale (celle qui a servi à l’introduction du

composé) est utilisée pour éliminer des produits qui éluent plus facilement (plus

polaires) que le composé d’intérêt. Un mélange eau/solvant organique peut aussi être

utilisé.

Isolement du composé d’intérêt

Après avoir éliminé les composés faiblement retenus sur la colonne, on élue les

composés d’intérêt. Si un solvant trop fort est utilisé, il y aura co-élution de composés

qui sont retenus plus fortement que le composé d’intérêt. La phase mobile optimale

sera celle qui retiendra sur la colonne ces composés plus fortement retenus au lieu de

co-éluer avec le composé d’intérêt.

L’utilisation d’un solvant trop faible nécessitera un plus grand volume de

solvant et engendrera une dilution du composé d’intérêt, ce qui représente la perte

d’un avantage de la SPE qui est de concentrer le composé d’intérêt. Une fois élué, le



composé peut être injecté directement dans un chromatographe ou concentré par

évaporation du solvant et redissout dans un autre solvant plus approprié pour fin

d’analyse. Le volume de solvant d’élution nécessaire est déterminé

expérimentalement. Par exemple pour une cartouche de C18 ayant une masse de 200

mg, le volume est d’environ de 1 à 2 mL.

Chromatographie en phase gazeuse avec couplage d’un spectromètre de masse

Le GC-MS combine le pouvoir séparateur de haute résolution d’un

chromatographe capillaire à la détection sensible et sélective de la spectrométrie de

masse. La spectrométrie de masse est grandement utilisée dans tous les domaines de

la science à cause de l’information spectrale des masses que l’on en retire, de sa

sélectivité, de sa sensibilité et de sa versatilité. D’un instrument de recherche qu’il

était, le spectromètre de masse est vite devenu un instrument de routine indispensable

lorsque couplé à un GC.

Instrumentation d’un GC-MS

À l’exception du système d’acquisition (ordinateur), les parties importantes

d’un GC-MS sont :

• Un chromatographe

• Une interface GC-MS

• Une chambre d’ionisation

• Un analyseur de masse

• Un détecteur

• Un système pour faire le vide dans l’interface GC-MS (située entre

l’extrémité de la colonne capillaire et la chambre d’ionisation)

Dans le spectromètre de masse proprement dit, des ions sont formés (à partir

des molécules qui proviennent de la colonne) dans la chambre d’ionisation, ils sont

séparés dans l’analyseur de masse et mesurés par le détecteur. Le type d’ionisation,

soit l’ionisation par impact d’électrons (I.E) ou par ionisation chimique (I.C),

détermine le type d’ions produits et leur abondance.

Les ions produits peuvent posséder :

• un poids moléculaire égal au poids moléculaire de la molécule parente;

on l’appelle dans ce cas l’ion moléculaire

• un poids moléculaire inférieur à la molécule originale; dans ce cas on

l’appelle fragment

• un poids moléculaire supérieur à la molécule parente dû à des réactions

chimiques entre la molécule parente et la matrice de l’échantillon ou à des réactions

entre un gaz servant dans l’ionisation chimique et la molécule originale.

Le spectre de masse est une présentation du ratio masse/charge des fragments



de charge positive (incluant l’ion moléculaire) versus leur concentration relative.

Habituellement, les ions produits ont une charge de 1 et le ratio masse/charge est donc

égal à la masse de l’ion. Le pic le plus intense dans le spectre est appelé le pic de base

et on lui assigne une intensité de 100. Tous les autres pics, incluant l’ion moléculaire,

ont des intensités (hauteur du pic X facteur de sensibilité) qui sont des pourcentages

par rapport à l’intensité du pic de base. Parfois l’ion moléculaire est aussi le pic de

base.

Interface GC-Ms

Étant donné que le GC qui est jumelé avec le MS est de type capillaire et que le

débit du gaz porteur est habituellement entre 1 et 2 mL/min à 1 atm, l’interface entre le

GC et le MS est assez simple. Il est facile pour des pompes à vide communes de

maintenir un vide de 10-5 torr à 500 L/s et d’évacuer ce 1 à 2 mL/min de gaz porteur.

L’interface consiste essentiellement en une pièce cylindrique dans laquelle sont

introduits les derniers 20 cm de la colonne capillaire.

Figure 1. Interface GC-MS

Cette interface sert à chauffer les 20 derniers centimètres de la colonne avant

qu’elle ne soit introduite dans la chambre d’ionisation pour prévenir toutes traces de

condensation. La température de l’interface est maintenue entre 250 et 320°C. Cet

interfaçage direct procure au MS un maximum de sensibilité.

L’ionisation

Par impact d’électrons

L’échantillon est introduit dans la chambre d’ionisation sous forme de gaz. La

température de la chambre d’ionisation est maintenue entre 150-250°C et à une

pression plus basse que 7.5 x 10-4 torr avec une pompe à diffusion pour éviter des

collisions entre les ions et d’autres molécules. Afin de maintenir une pression basse et

constante dans la chambre il faut que l’échantillon introduit dans la chambre soit petit.



Le mode d’ionisation du GC-MS utilisé est par impact d’électrons (I.E.). Le

gaz sortant de la colonne est introduit perpendiculairement par rapport au faisceau

d’électrons qui ionisera le gaz sortant de la colonne. Les électrons sont produits par un

filament de tungstène ou de rhénium et sont accélérés vers une anode par une

différence de potentiel de 70 volts. Les ions positifs produits par la collision avec le

faisceau d’électrons sont entrainés dans l’analyseur de masse par une différence de

potentiel de 5 à 15 volts.

Figure 2. Spectromètre de masse type

L’efficacité de l’ionisation est faible, une molécule sur 1 million sera ionisée.

Un voltage de 70 volts pour accélérer les électrons est standard mais un voltage plus

bas produira plus d’ions moléculaires et moins de fragments, ce qui permet de

connaître plus facilement la masse moléculaire.

Selon la nature des molécules neutres qui entrent en collisions avec le faisceau

d’électrons (e-) différents ions sont produits tels des ions radicalaires ( , l’ion

moléculaire) accompagné de la perte d’un électron.

ou des ions négatifs par la capture d’un électron,

ou la formation d’un ion à double charge

Notez que le symbole +• à la droite de M signifie qu’il y a un électron non

pairé dans la molécule et ne signifie pas qu’il y a un électron de plus dans la molécule.

Si c’était le cas, ce serait un anion.

M

2M e M e

M e M

2 3M e M e



Un spectromètre de masse peut donner des renseignements autant pour les

cations que pour les anions mais ordinairement on favorise la détection des cations par

le choix de la polarité du voltage entre les différentes plaques de la chambre

d’ionisation. La nature du radical formé ainsi que la localisation de la charge positive

sur l’ion moléculaire dépend de l’énergie d’ionisation des électrons formant la

molécule neutre. L’énergie nécessaire pour enlever un électron dans une liaison sigma

σ est plus élevée que pour un électron dans une liaison pi π. Cette dernière nécessitant

une plus grande énergie que des électrons non liants. (Insertion page 48 dans Mc

Lafferty).

L’énergie requise pour ioniser une molécule organique neutre est généralement

en deçà de 20 eV, ce qui fait que l’énergie excessive du faisceau d’électrons

communique beaucoup d’énergie à la molécule, si bien qu’elle reste dans un état

d’excitation très élevé. Après relaxation, il y a production d’ions de fragmentation,

dont le rapport m/z est inférieur à celui de l’ion moléculaire. Cependant, dans le cas

de certaines molécules, la fragmentation est si grande que l’ion moléculaire ne se

retrouve pas dans le spectre. N’ayant pas la masse moléculaire, il est plus difficile

d’identifier le composé d’intérêt. Toutefois, la fragmentation importante et le nombre

élevé de pics agissent comme une empreinte digitale de la molécule et constituent

souvent un avantage pour l’identification.

Par ionisation chimique

La substance à analyser est injectée dans la source avec un large excès de

méthane ou autre hydrocarbure de faible masse molaire. L’hydrocarbure, ionisé en

premier, ionise la substance par transfert de charge.

Figure 3. Exemple d’ionisation chimique

Analyseur de masse du GC-MS : quadripôle

Aujourd’hui le quadripôle produit plus de spectre de masse que tout autre type

d’analyseur de masse. Il excelle surtout dans des applications qui ne requièrent pas une

haute résolution et une mesure exacte de la masse. Dans ce domaine il surpasse

avantageusement les analyseurs de masse traditionnels.



Le quadripôle, avec sa courte distance entre la chambre d’ionisation et le

détecteur (habituellement moins de 15 cm), combiné avec de très bonnes propriétés de

focalisation (court temps de balayage), est très bien adapté à des applications requérant

des pressions relativement élevées (5 x 10-5 torr) comme dans le cas de la GC-MS et

de la chromatographie liquide couplée avec la spectrométrie de masse (LC-MS). Un

autre avantage du quadripôle est sa simplicité mécanique. Il ne requiert pas de champs

magnétique, ni de fentes de focalisation qui doivent être ajustées mécaniquement.

Dans un appareil à quadripôle, la focalisation se fait électroniquement. En n’ayant pas

recours à des électro-aimants, on réduit considérablement l’espace, le coût, le poids et

le balayage lent des appareils magnétiques.

Les spécifications du spectromètre de masse que nous utiliserons sont les

suivantes :

• Domaine : balayage possible des masses entre 1.6 et 800 uma.

• Résolution : unitaire

• Vitesse de balayage : 8000 amu/sec

• Sensibilité : 1 pg d’octafluoronaphathalene (m/z 272) donne un rapport signal

sur bruit de 60 :1 lorsque balayé de 50 à 300 amu

Détecteur

Dans notre GC-MS le détecteur est un multiplicateur d’électrons à dynode

continue qui se présente comme un dispositif en forme de trompe, façonnée en verre,

fortement dopé en plomb. Une tension de 0 à 3000 volts est appliquée sur toute la

longueur du traducteur. Les ions qui frappent la surface près de l’entrée éjectent des

électrons qui, rebondissant le long de la surface, en éjectent de plus en plus à chaque

impact. Un gain d’au moins 100 000 fois peut être obtenu.


Objectifs

- Les teneurs en caféine dans un breuvage, dans un comprimé d’analgésique et

dans un inconnu seront quantifiées. Pour cette quantification, une méthode appelée «

dilution isotopique » sera utilisé.

- Les résultats de ces dosages seront comparés à ceux obtenus par HPLC.

- Cette expérience est une introduction à l’interprétation des spectres de masse.

Pour l’utilisation de l’appareil, veuillez lire la procédure d’utilisation des

spectrophotomètres dans les sections suivantes.

Préparation des standards de caféine/caféine-d3

Des solutions de 1000 ppm de caféine et de caféine-d3 dans le méthanol sont

fournies.

• Préparer d’abord des solutions de 200 ppm de chacun des deux produits dans



des volumétriques de 50 mL. Compléter à la marque avec du méthanol.

• Préparez les autres solutions tel qu’indiqué dans le tableau ci-dessous. Ces

solutions sont ensuite transférées dans des vials adaptés pour le carrousel du GC-MS.

Table 1. Préparation des solutions pour la quantification de la caféine

Préparation des échantillons de Tylénol, de Pepsi et de l’inconnu

Peser le comprimé de Tylénol; le comprimé est ensuite broyé à l’aide d’un

mortier et d’un pilon. Transférer environ 125 mg (pesés précisément) du comprimé

dans un volumétrique de 100 mL. Conserver le reste du comprimé pour l’expérience

de HPLC. Ajouter à ce volumétrique 8 mL de caféine-d3 1000 ppm. Diluer

partiellement avec de l’eau puis soniquer dans un bain ultrason pendant 15 minutes.

Après dissolution, compléter à la marque avec de l’eau.

Le Pepsi et l’inconnu sont utilisés tels quels sans dilution. À un volumétrique

de 100 mL, ajouter 5 mL de caféine-d3 1000 ppm et compléter à la marque avec du

Pepsi dégazé. Pour l’inconnu, ajouter à un volumétrique de 10 mL, 1 mL de caféine-

d3 200 ppm et amener à la marque avec la solution inconnue de caféine qui sera la

même que celle utilisée à l’expérience de HPLC #1.

De ces trois solutions, il faut extraire la caféine de l’eau pour la diluer dans le

méthanol.

Procédure SPE

Les cartouches utilisées sont vendues par Waters sous le nom Oasis HLB. Elles

contiennent 225 mg de phase polymérique.

Conditionnement de la cartouche

• à l’aide d’une seringue faire passer 2 mL de méthanol à travers la cartouche

en poussant le piston lentement

• faire passer ensuite 2 mL d’eau dans la même cartouche

• la cartouche est prête à être utiliser pour l’extraction

Introduction de l’échantillon sur la cartouche

• Enlever le piston au bout d’une seringue de 2 mL.

Ratio

Caf/Caféine-d3

Volume de

Caféine 200 ppm

(mL)

Volume de

caféine-d3

200 ppm (mL)

Concentration

caf/caf-d3

(ppm)

1 :1 5 5 100/100

1.5 :1 6 4 120/80

2.33 :1 7 3 140/60

4 :1 8 2 160/40



• Placer une cartouche au bout de la seringue.

• Transférer ~ l mL du Pepsi dans le réservoir de la seringue.

• Remettre le piston sur la seringue en prenant garde de ne pas introduire

subitement le Pepsi sur la cartouche.

• Avec une pression constante et un débit d’environ 1 à 3 mL/min, introduire le

liquide dans la cartouche.

• Enlever la cartouche et ensuite retirer le piston de la seringue.

• Remettre la cartouche au bout de la seringue.

Lavage de la cartouche (élimination des produits polaires)

• Remplir le réservoir de la seringue avec 2 mL d’eau déionisée.

• Replacer avec précautions le piston au bout du réservoir de la seringue.

• Éluer les produits polaires avec un débit de 1 à 3 mL/min.

• Enlever la cartouche, retirer le piston puis replacer la cartouche.

• Remettre le piston et enlever l’excédent d’eau sur la cartouche pour assécher

complètement la cartouche.

Élution de la caféine et des produits moins polaires

• Retirer la cartouche, retirer le piston du réservoir puis replacer la cartouche.

• Remplir le réservoir avec 2 mL de méthanol.

• Avec précautions remettre le piston sur le réservoir

• Placer la cartouche au-dessus d’un vial pour GC-MS et éluer la caféine avec

une pression constante et un débit de 1 mL/min maximum.

Refaire les mêmes étapes avec l’inconnu et le Tylénol.

Analyse par GC-MS et création d’une méthode

Il faut d’abord éditer une méthode d’analyse, c’est-à-dire spécifier les

différents paramètres qui contrôleront le GC-MS. Chaque appareil a ses particularités

de programmation. Votre démonstrateur vous assistera pour la création de la méthode.

Il faut spécifier à la fois les paramètres qui contrôlent la séparation (GC) et ceux qui

contrôlent la détection (MS). Typiquement, pour votre expérience :

• Température de l’injecteur : 275°C

• Volume d’injection : 1 μL

• Programmation de la température du four : de 150°C à 230°C

• Vitesse de balayage : 30°C/min

• Temps du début du balayage : 2 min

• Temps de l’analyse : 13 min

• Mode d’injection (split ou splitless) : split

• Split ratio : 20:1

• Solvent delay : 3 min



Temps pendant lequel le détecteur de masse sera fermé en attente de l’élution

du solvant. Ceci rallonge la durée de vie des filaments de la source,

• Mode d’utilisation du spectromètre de masse (SCAN ou SIM) : SIM

Dans ce mode, les ions à quantifier sont spécifiés, ce qui procure une

sensibilité accrue comparativement au mode SCAN où un domaine de balayage des

masses (m/z) (ex : de 50 à 250 m/z) est spécifié. Pour l’analyse de la caféine, ce seront

exclusivement les ions de m/z 194 et 197 qui seront balayés.

• Temps d’échantillonnage d’un ion : 100 ms

Injection des échantillons avec l’injecteur automatique

Placer les vials contenant les standards et les échantillons sur le carrousel de

l’injecteur automatique. Les vials doivent être remplis au tiers (minimum) pour que

l’aiguille puisse atteindre l’échantillon. Quel que soit l’appareil utilisé, il faut bien

noter leur position sur le carrousel et fournir à l’appareil les détails concernant chaque

échantillon.

Traitement des données, résultats et discussion

Tracer un graphique du rapport des surfaces des ions 194/197 en fonction du

rapport des masses de la caféine/caféine-d3. Connaissant la masse de caféine-d3

introduite dans l’inconnu et le rapport des surfaces de l’inconnu, trouver la quantité de

caféine naturelle dans votre échantillon.

Prendre un spectre de masse en mode SCAN pour observer tous les ions et

discuter du spectre de masse de la caféine dans votre discussion. Commenter le spectre

de masse de la caféine. Où est l’ion moléculaire?

Séparation d’un mélange contenant plusieurs composés

Trouver les conditions expérimentales pour la séparation d’un mélange

contenant sept HAPs sans toutefois les quantifier.

Calculs - Déterminez les diverses concentrations d’analytes dans des différentes matrices.

- Quantifiez vos écarts avec vos résultats obtenus pour le laboratoire de

chromatographie liquide 1.




- La spectrométrie de masse, dans ces conditions, est-elle une méthode analytique,

quantitatif, semi-quantitative ou qualitative?

- Quelles sont les propriétés d’un bon étalon interne?



- Quel sont les caractéristiques et avantages/désavantages d’une méthode reposant sur

un étalonnage interne.

- Bien démontrer votre compréhension de l’extraction sur phase solide.


© 2016 Département de Chimie, Université Sherbrooke Page 39 of 145

Expérience 4 : Voltampérométrie cyclique



EXPÉRIENCE 4 : VOLTAMPÉROMÉTRIE CYCLIQUE



Introduction à la voltampérométrie

La voltampérométrie est la mesure du courant circulant entre deux électrodes

(électrode de travail et contre-électrode) lorsqu’on applique une différence de potentiel

(relative à une électrode de référence). Cette technique représente donc un système à

trois électrodes. Le passage d’un courant faradique est possible lorsqu’il se produit un

échange d’électron par une réaction d’oxydoréduction des espèces en solution.

L’échange d’électron requière un potentiel minimal caractéristique à chaque espèce

électrochimique.

En voltampérométrie cyclique, la différence de potentiel est augmentée

graduellement jusqu’à un maximum, puis réduite jusqu’à une valeur minimum. Le

nombre de cycle effectué dépend de l’analyse. La mesure effectuée est celle du courant

qui passe dans le circuit extérieur en fonction de la différence de potentiel appliquée. La

figure 1. Représente une généralisation du principe.

Figure 1. Graphiques représentants le principe de la voltampérométrie cyclique 1

Il y a deux sortent de courant observables dans cette méthode. D’abord, le

courant faradique est celui correspondant au transfert d’électron des espèces

électrochimique, c’est celui qu’on utilise pour étudier la réaction d’oxydoréduction.

Ensuite, le courant non-faradique, aussi appelé courant capacitif, est associé aux

phénomènes du système comme l’adsorption/désorption, la polarisation de l’électrode

etc.



Figure 2. Paramètres déterminés à partir du graphique.

Sur la Figure 2, on peut observer les courants faradiques représentés par les traits

verticaux cathodique (ipc) et anodique (ipa). Les traits pointillés plutôt horizontaux

permettent de faire la soustraction du courant capacitif.

La voltampérométrie cyclique peut permettre l’étude de réversibilité d’un système. Pour

qu’une réaction soit considérée comme réversible, plusieurs aspects peuvent être

vérifiés dont les suivants :

1. Un pic d’oxydation et un pic de réduction doivent être présents.

2. Le ratio des courants doit être égal à 1. 𝑖𝑝𝑐

𝑖𝑝𝑎= 1

3. La différence entre les potentiels doit être de 59mV par électron échangé.

∆𝐸 = 𝐸𝑝𝑐 − 𝐸𝑝𝑎 =59𝑚𝑉

𝑛

4. La variation du courant en fonction de la racine carré de la vitesse de

balayage doit être linéaire.

D’autres paramètres du système peuvent aussi être déterminés. Si une réaction

est réversible, la relation de Randels-Sevcik est utilisée :

CvADnip

2/12/12/351069.2 (1)

où i est le courant (Amp), 2.69x105 est une constante (C/molV½), n le nombre

stœchiométrique d’électron échangé, A l’aire de l’électrode (cm2), D le coefficient de



diffusion des espèces (cm2/sec), v la vitesse de balayage (V/s) et C la concentration

(mol/cm3).

Si une réaction est irréversible, la relation suivante est utilisée :

i p 2.99105(na )

1/2nAD

1/2v1/2C (2)

où na est une constante pour chaque réaction.

Pour arriver à déterminer certain paramètre, on utilise une substance dont le couple

réversible d’oxydoréduction bien étudié, le ferrocène.

Figure 3. Couple d’oxydoréduction du ferrocène. 3

Un paramètre intéressant à évaluer est l’aire réelle (A) de l’électrode de travail. Comme

le ferrocène possède un coefficient de diffusion connu, il est possible d’utiliser la

relation de Randels-Sevcik pour déterminer celle-ci après avoir pris des lectures à

différentes vitesses de balayage.

Principes importants

Analyte

L’acide L-ascorbique, de nom commun vitamine C, se retrouve naturellement

dans les agrumes et les légumes. C’est un nutriment nécessaire à l’alimentation. Il est

utile au maintien des tissus conjonctifs et des os, ainsi que dans plusieurs voies

métaboliques grâce à son rôle de coenzyme4. Une carence en vitamine C conduit à

plusieurs problèmes de santé. Cette vitamine s’utilise maintenant partout dans

l’industrie. En majeure partie elle est présente en alimentation (antioxydant dans les

aliments préparés, pour prévenir la décoloration, en remplacement des sulfites, dans la

farine pour améliorer la cuisson, comme ajout dans la nourriture pour poisson), mais

aussi en métallurgie, dans les encres, les explosifs, les cosmétiques, ainsi que comme

catalyseur pour les polymères 5. L’acide L-ascorbique est un agent réducteur et donc, un

bon antioxydant. La figure 4 montre la réaction d’oxydoréduction qui se produit.



Figure 4. Oxydoréduction de l’acide L-ascorbique 1

Électrodes

L’électrode d’or

Elle agit comme électrode de travail, c’est dont à cette électrode que se produit la

réaction principale. C’est cette électrode qui sera fonctionnalisé pour voir l’effet de

différents composés.

L’électrode de platine

C’est la contre-électrode, elle permet le transfert des électrons sans directement interagir

avec le processus électrochimique.

Ag/AgCl

L’électrode de référence a un potentiel théorique fixe et connu. En mesurant la

différence de potentiel entre notre système et cette électrode, on obtient le potentiel de

notre système.

Fonctionnalisation

Les composés contenant du soufre ont la capacité de se lier fortement sur les

surfaces d’or. Grâce à cette forte interaction, les molécules forment une couche

uniforme lorsqu’on immerge la surface d’or. L’immobilisation de molécules soufrées

permet de modifier l’interaction avec l’espèce électroactive. Les deux substances

servant à la fonctionnalisation sont représentées à la figure 5 ; à gauche l’hydrochlorure

de cystéamine, à droite l’acide α-lipoïque.

Figure 5. Composés utilisés pour la fonctionnalisation1


Objectifs

A. Comparer l’aire théorique et expérimentale d’une électrode d’or.

B. Étudier l’effet de la fonctionnalisation d’une surface d’or sur la détection en

voltampérométrie cyclique.

C. Déterminer la quantité d’acide L-ascorbique dans un comprimé commercial.



Matériel

Équipement - Électrodes d’or (3)

- Référence Ag/AgCl (1)

- Contre-électrode de platine (1)

- Potentiostat (1)

- Plaque agitatrice (1)

- Barreau magnétique 8mm et 6cm

- Papiers polissage (2)

- Cellule électrochimique (1)

- pH-mètre (1) et solutions étalons

- Tubes de plastique 15mL (2)

- Seringues 5 mL (1)

- Filtres 0,2 µm (1)

- Erlenmeyer 500 mL

- Pipettes de verre 4,8,10 mL

- Volumétrique 25(6), 50, 100 mL

Produits - Ferrocène (1g)

- Poire d’acétone

- Tampon Bu4NPF6 (100mL)

- Tampon phosphate (500mL)

- NaOH 1N (10mL)

- HCl 1M (10mL)

- Acide L-ascorbique (1g)

- Comprimé de vitamine C (1)

- Hydrochlorure de cystéamine (1g)

- Acide alpha-lipoïque (1g)

- Éthanol (50mL)

- Eau déionisée

- Azote

Expérimentation

Préparation des solutions de la PARTIE B

Solution d’hydrochlorure de cystéamine 10mM

- Pesez 0,012 g d’hydrochlorure de cystéamine.

- Transférez le produit dans un tube de plastique de 15 mL.

- Jaugez à 10 mL d’eau déionisée,

Solution d’acide alpha-lipoïque 10mM

- Pesez 0,021 g d’acide alpha-lipoïque.

- Transférez le produit dans un tube de plastique.

- Jaugez à 10 mL d’éthanol 99%.

Préparation des électrodes d’or

Polissage

Demander une démonstration pour effectuer ces étapes.

Faites cette procédure pour les 3 électrodes d’or.

- ATTENTION : Les électrodes sont FRAGILES et DISPENDIEUSES !!!! - Déposez une petite quantité d’eau sur la feuille à polir la moins fine (1µm, rose).

- Polissez l’électrode délicatement en faisant des « 8 » sur la surface pendant 45 à 60

secondes.

- Rincez l’électrode avec de l’eau déionisée.

- Déposez une petite quantité d’eau sur la feuille à polir plus fine (0.3µm, bleu).

- Polissez l’électrode 45 à 60 secondes.

- Rincez l’électrode avec de l’eau déionisée.



Or - Non fonctionnalisée

Mettre une (1) électrode d’or polie de côté pour les mesures de la PARTIE A et B.

Or - Hydrochlorure de cystéamine

- Ajoutez 1 mL de la solution dans un tube de plastique 1,5 mL identifié.

- Déposez ce tube dans un petit bécher.

- Immergez une électrode d’or polie dans la solution.

- Laissez dans la solution pendant 1h30.

Or - Acide α-lipoïque

- Ajoutez 1 mL de la solution dans un tube de plastique 1,5 mL identifié.

- Déposez ce tube dans un petit bécher.

- Immergez une électrode d’or polie dans la solution.

- Laissez dans la solution pendant 1h30.

Préparation des solutions de la PARTIE A

Solution de ferrocène 1mM

- Pesez 0,0093 g de ferrocène.

- Déposer dans une fiole jaugée de 50 mL et compléter avec le tampon Bu4NPF6

dissout dans l’acétonitrile (fourni par le technicien).

Mesures PARTIE A

Tableau 1. Paramètres des mesures de la partie A. Solution Init E

(V)

High E

(V)

Low E

(V)

Final E

(V)

Scan

Rate

Sweep

Segments

Enable

Final E

Blanc Bu4NPF6 0 1.2 -1.5 0 0.1 3 X

Ferrocène 1mM

0 0.7 0 0 0.02 2 -

0 0.7 0 0 0.05 2 -

0 0.7 0 0 0.10 2 -

0 0.7 0 0 0.25 2 -

0 0.7 0 0 0.50 2 -

1) Ouvrez le module électrochimique.

2) Ouvrez l’ordinateur.

3) Ouvrez le logiciel CHI600D.

4) Set up / Technique / Cyclic voltammetry

5) Installez l’électrode d’or polie comme électrode de travail ainsi que celle de platine

et de référence (enlevez le bouchon bleu).

6) Remplissez le bas de la cellule de mesure avec la solution de blanc de façon à ce

que toutes les électrodes soient dans la solution.

7) Set up / parameters (Voir tableau 1.)



Potentiel initial

Potentiel le plus haut

Potentiel le plus bas

Potentiel final

Direction du potentiel

Vitesse de balayage

Nombre de segments

Intervalle des enregistrements

Temps d’attente

Sensibilité

Aller jusqu’au potentiel final

8) Vérifiez que les pinces ne se touchent pas et ne soient pas en contact avec du

métal.

9) Démarrez la mesure : Control / Run experiment

o Si « Link failed » apparaît, rouvrez le logiciel et ajustez les paramètres de

nouveau.

o C’est normal si l’affichage n’est pas complet à l’écran durant la mesure.

o L’ordinateur émet un « bip » lorsque la mesure est finie ou lorsque le

maximum de courant est atteint.

10) File / Save as / Donnez un nom clair, laissez la mesure en .bin.

o Si le graphique ne s’ajuste pas en fonction des échelles: Graphics / Graph

options / cochez Freeze x et y / entrer les valeurs / Ok.

11) Notez les résultats de potentiel et de courant pour les deux segments.

o S’il y a un problème d’identification des pics : Cliquez sur « Data Plot »,

ensuite cliquez sur « Manual Results ». Avec la souris, tracer la tangente de

la base du pic en tenant le clic gauche enfoncé et étirez la droite sous le pic.

De nouveaux résultats devraient s’afficher.

o Si rien n’est affiché après avoir enregistré une mesure, cliquez sur

«Datalist».

12) Videz la cellule.

13) Conditionnez (rinçage) la cellule et les électrodes avec la solution de ferrocène à

analyser.

14) Refaites les étapes 7) à 11) selon le Tableau 1, en agitant légèrement (15 secs) entre

chaque mesure.

15) Lorsque toutes les mesures sont complétées, videz la cellule. Nettoyez la cellule et

les électrodes avec une petite quantité d’acétone (poire).

Enregistrement des graphiques PARTIE A - File / New / Graphics / Overlay Plots / Sélectionner les 6 mesures du Tableau 1.

- Ajustez les axes du graphique.

- Faites une capture d’écran et enregistrez celle-ci dans le logiciel Paint ou Word.



Préparation des solutions PARTIE B ET C

Ajustement du pH du tampon phosphate

- Étalonner le pH-mètre avec les solutions de pH 4, 7 et 10. - Mettre 500 mL de tampon dans un erlenmeyer assez grand avec un barreau

magnétique. - Prendre la lecture du pH sous agitation. - Ajuster le pH à 7,4 avec le NaOH 1M ou le HCl 1M.

Bullage du tampon phosphate

- Dans une hotte avec une sortie d’azote, installez une pipette pasteur au bout du tube de la sortie d’azote.

- Mettez la pipette pasteur au fond de l’erlenmeyer et recouvrez partiellement celui-ci de paraffine.

- Assurez-vous que le cylindre d’azote est ouvert. - Ouvrez graduellement le robinet de la hotte jusqu’à ce que de gros bouillons se

forment, mais sans déborder. - Laissez buller pendant 10 minutes. - Assurez-vous de bien refermer l’azote ensuite et de recouvrir votre erlenmeyer

avec la paraffine.

Solution acide L-ascorbique 1mM

- Pesez 0,018 g d’acide L-ascorbique.

- Ajoutez à la solution tampon bullée dans une fiole jaugée de 100 mL.

- Préparer les solutions diluées du tableau ci-dessous.

*NOTE IMPORTANTE !!! Toutes les solutions d’acide L-ascorbique doivent être

utilisées aussi rapidement que possible avant que celles-ci ne soit oxydées par l’oxygène

de l’air.

Solutions d’étalonnage d’acide L -ascorbique

Tableau 2. Dilution de la solution d’acide L-ascorbique pour l’étalonnage.

Concentration en

acide

L-ascorbique (mM)

Aliquote de la solution

d’acide L-ascorbique 1mM

(mL)

Volume final à atteindre

avec la solution tampon (mL)

0,16 4 25

0,32 8 25

0,64 16 25

0,80 20 25



Solution de vitamine C - Pesez un comprimé de vitamine C commercial.

- Pulvérisez-le à l’aide d’un pilon et d’un mortier.

- Pesez 0,01 g de la poudre formée.

- Dans un bécher de 50 mL, ajoutez à la poudre 10 mL de la solution tampon afin de

la dissoudre.

- Mettez la solution dans le haut d’une seringue munie d’un filtre.

- Filtrez la solution dans un volumétrique de 25 mL.

- Ajoutez 5 mL de la solution tampon dans le haut de la seringue et filtrez trois fois de

plus celle-ci en récupérant la solution dans le même volumétrique.

- Complétez le volumétrique à 25 mL avec la solution tampon.

- Prélevez 6 mL de la solution de vitamine C concentrée.

- Ajoutez dans un volumétrique de 25 mL et complétez avec la solution tampon.

C’est cette solution de vitamine C diluée qui est utilisée pour l’analyse.

Mesures PARTIE B

Tableau 3. Paramètres des mesures de la partie B.

Solution Électrode de travail Init E

(V)

High

E (V)

Low

E (V)

Final

E (V)

Scan

Rate

Sweep

Segments

Enable

Final E

Acide L-

ascorbique

1mM

Or -0.2 0.8 -0.2 0 0.1 2 -

Hydrochlorure de

cystéamine

-0.2 0.2 -0.2 0 0.1 2 -

Acide α-lipoïque -0.2 0.8 -0.2 0 0.1 2 -

1) Sélectionnez la bonne électrode de travail (Voir tableau 3). Rincez celle-ci avec de

l’eau (ou de l’éthanol pour l’α-lipoïque).

2) Installez l’électrode.

3) Conditionnez la cellule et les électrodes avec la solution à analyser.

4) Remplissez la cellule avec la solution d’acide L-ascorbique 1mM.



métal.




10) Faites 3 mesures pour chaque électrode de travail, sans changer la solution, mais en

agitant légèrement entre chaque mesure.

11) Refaites les étapes 1) à 10) selon le Tableau 3. Remettre l’électrode

fonctionnalisée avec l’hydrochlorure de cystéamine dans sa solution après

utilisation.

12) Videz la cellule.



Enregistrement des graphiques PARTIE B - File / New / Graphics / Overlay Plots / Choisir les 3 mesures de l’électrode d’or.


- Faites une capture d’écran et enregistrez celle-ci.

- New / Graphics / Overlay Plots / Choisir les 3 mesures de l’électrode

d’hydrochlorure de cystéamine.



- New / Graphics / Overlay Plots / Choisir les 3 mesures de l’électrode d’acide α-

lipoïque.



- New / Graphics / Overlay Plots / Choisir les 3 premières mesures de chaque

électrode.


- Réfléchissez à qu’elle électrode serait la meilleure pour quantifier la vitamine C…


Mesures PARTIE C

Tableau 4. Paramètres des mesures de la partie C.

Solution Électrode de

travail

Init

E

(V)

High

E

(V)

Low

E

(V)

Final

E

(V)

Scan

Rate

Sweep

Segments

Enable

Final

E

Tampon phosphate

Hydrochlorure

de cystéamine -0.2 0.2 -0.2 0 0.1 2 -

Acide L-asc. 0.16 mM




Acide L-asc. 1 mM

Vitamine C diluée

Procédure 1) Rincez l’électrode de travail avec de l’eau.

2) Installez l’électrode.


4) Conditionnez la cellule et les électrodes avec la solution à analyser.

5) Remplissez la cellule avec la solution à analyser.


métal.




10) Faites 5 mesures pour le tampon et 3 mesure pour chaque autre solution, sans

changer la solution, mais en agitant légèrement enter chaque mesure.

11) Videz la cellule. 12) Refaites les étapes 4) à 11) selon le Tableau 4.



Enregistrement des graphiques PARTIE C - File / New / Graphics / Overlay Plots / Choisir la première mesure de chaque

solution du Tableau 4.



FIN DU LABORATOIRE - Repolissez, rincez et séchez toutes les électrodes d’or. Rangez-les correctement. - Séchez et récupérez les feuilles de polissage. - Disposez des solutions dans les bons contenants : Organique non-halogéné

(acétonitrile, acétone, éthanol, …) ou aqueux (tampon phosphate, eau, …).

Analyse des résultats Insérez les graphiques enregistrés lors de l’expérience pour votre rapport. Ceux -ci doivent être présentés convenablement, bien identifiés et avec une légende adéquate.

PARTIE A - Déterminez la fenêtre d’analyse électrochimique possible pour le système d’après la

mesure avec le blanc pour le ferrocène.

- Déterminez la réversibilité de la réaction en fonction des 4 conditions présentés

dans la théorie. Vous devez discuter de votre choix entre ipa ou ipc. Vous devez

ajouter les tableaux et les graphiques à l’appui.

- Déterminez l’aire de l’électrode à l’aide de la bonne relation et comparez ce résultat

avec la valeur attendue.

PARTIE B - Pour chaque électrode, discutez de l’effet observé après 3 analyses consécutives.

- En vous basant sur le graphique de la première mesure de chaque électrode, discutez

des différences observées.

- Déterminez qu’elle serait la meilleure électrode à utiliser pour la quantification de la

vitamine C et expliquez pourquoi (principe de fonctionnalisation, nature des

composés à la surface de l’électrode, interaction avec la solution, …).

PARTIE C - Faites une droite d’étalonnage du courant (ip) en fonction de la concentration des

étalons d’acide L-ascorbique. - Déterminez la concentration en acide L-ascorbique dans le comprimé de vitamine

C et comparez avec la valeur attendue. Discutez du résultat. - Effectuez les tests supplémentaires nécessaires pour la détermination des

paramètres analytiques de la technique (LOD, LOQ, domaine linéaire, …).

Notes supplémentaires pour la discussion - Démontrez votre compréhension du fonctionnement et de la raison de l’utilisation

de la voltampérométrie cyclique. - Discutez des causes d’erreurs possibles, des améliorations possibles et des autres

techniques adéquates pouvant être utilisées pour répondre aux objectifs de cet



expérience.

Information Supplémentaire

Références

1. Ito, T.; Perera, D. M. N. T.; Nagasaka, S., Lab Documentation. Gold Electrodes

Modified with Self-Assembled Monolayers for Measuring L-Ascorbic

Acid: An Undergraduate Analytical Chemistry Laboratory Experiment. Journal of

Chemical Education 2008, 85 (8), 1112-1115.

2. Ito, T.; Perera, D. M. N. T.; Nagasaka, S., Gold Electrodes Modified with Self-

Assembled Monolayers

for Measuring l-Ascorbic Acid. Journal of Chemical Education 2008, 85 (8), 1112-

1115.

3. Neuse, E. W., Synthetic polymers as drug-delivery vehicles in medicine. Metal-

based drugs 2008, 2008, 469531.

4. Medicine, U. S. N. L. o., Ascorbic acid, [En ligne]

http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/rn/50-81-7. Consulté le 2014-12-12.

5. John Wiley & Sons, I., ASCORBIC ACID. Kirk-Othmer Encyclopedia of

Chemical Technology.

6. Chem 371, A. I. C. L., Cyclic Voltammetry of Ferrocene, [Ru(bpy)3]2+,

[Co(bpy)3]2+ and Iodide. UMass Boston.

Informations diverses – électrochimie analytique

Le potentiostat

Le potentiostat sert à la fois à mesurer et à contrôler la différence de potentiel

entre l’électrode de travail et l’électrode de référence et aussi à mesurer le courant qui

circule entre l’électrode de travail et l’électrode auxiliaire. Le potentiostat permet aussi,

par l’entremise d’un générateur de signaux, d’imposer à l’électrode de travail un signal

variable en fonction du temps (rampe, créneaux, sinusoïde, etc.).

Différentes techniques voltampérométriques

En voltampérométrie, le potentiel E appliqué à l’électrode de travail est varié en

fonction du temps et le courant est mesuré en fonction du potentiel. La variation du

potentiel, linéaire ou modulée, imposée à l’électrode de travail, et la manière dont on

mesure le courant, en continue ou à des temps précis, distinguent les différentes

techniques voltampérométriques. Le courant mesuré est principalement la somme de

deux courants distincts : le courant faradique if et le courant capacitif ic.

Courant capacitif (ic)

Le courant capacitif est dû au chargement du condensateur représenté par

l’interface entre la surface de l’électrode et la couche de la solution adjacente. Le

http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/rn/50-81-7



courant capacitif dépend :

• De la surface de l’électrode.

• De la vitesse du changement de potentiel avec le temps.

• De la composition du milieu mais non de la concentration du composé analysé.

Mode de transport de masse et utilisation d’un électrolyte support

Les espèces électroactives disposent de plusieurs modes de transport pour se

rendre sur le lieu du transfert d’électrons, à savoir l’interface électrode-électrolyte. Il en

existe trois principaux :

• Le transport par convection est le déplacement de matière sous l’effet d’un

gradient de température, de pression ou d’agitation mécanique.

• Le transport par diffusion est le déplacement des ions sous l’effet d’un

gradient de potentiel chimique, c’est-à-dire du milieu le plus concentré vers le milieu le

moins concentré.

• Le transport par migration est le déplacement des ions sous l’influence d’un

gradient de potentiel électrique, c’est-à-dire sous l’effet d’un champ électrique.

En analyse électrochimique quantitative, le mode de transport privilégié est le

transport par diffusion. Lorsque le transfert de charges est rapide et que le transport de

matière est uniquement régi par la diffusion, le courant mesuré est directement relié à la

concentration des espèces électroactives en solution.

Expérimentalement, pour s’approcher d’un régime pur de diffusion, il faut

ajouter, à la solution contenant les espèces électroactives, un électrolyte de support

formé d’ions non électroactifs en grande concentration. Les ions de l’électrolyte

subissent entièrement l’effet du gradient électrique (migration), et les ions électroactifs

(les composés d’intérêts), de concentration plus faible, ne sont soumis qu’au gradient de

concentration (diffusion). Par exemple, à une solution d’ions Cu2+ électroactifs, on

ajoute une solution de sulfate de sodium. Parfois, on utilise un tampon comme

électrolyte de support pour fixer le pH et empêcher la précipitation de métaux sous

forme d’hydroxydes. La concentration de l’électrolyte doit être au moins 100 fois plus

élevée que celle du composé d’intérêt. C’est en général la réduction de l’électrolyte de

support qui limite le domaine d’électroactivité du côté des potentiels négatifs (ex. :

réduction du cation K+ ou de l’ion hydronium).

En plus de supprimer la contribution des éléments électroactifs au courant de

migration, ce qui simplifie les relations (équations) entre courant et concentration, cet

ajout :

• Augmente la conductivité de la solution, ce qui a pour effet de diminuer la

chute ohmique et de permettre ainsi de mieux contrôler le potentiel de l’électrode de

travail dans des montages nécessitant trois électrodes.

• Fixe la force ionique du milieu à une valeur élevée, ce qui limite les

phénomènes capacitifs à une zone de très faible épaisseur au voisinage de l’interface

électrode/solution.



Expérience 5 : Chromatographie liquide 2 & Karl Fischer (KF)



EXPÉRIENCE 5 : CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE 2 & KARL FISCHER (KF)



Pour une bonne compréhension de la technique de chromatographie liquide,

consultez votre manuel Principes d’analyse instrumentale de Skoog au chapitre 28,

intitulé « Chromatographie liquide haute performance ». Vous devez absolument

consulter la section de la théorie de l’expérience de chromatographie liquide #1 de ces

notes de cours.

Théorie HPLC-RID

Type de colonne (phase stationnaire)

La séparation des composés en chromatographie liquide est basée sur la différence

d’affinité des composés entre deux phases non miscibles, l’une stationnaire et l’autre

mobile. Il existe plusieurs types de colonnes en HPLC et il faut choisir celle-ci selon le

type de composés à analyser. Le bon type de phase stationnaire permet d’obtenir une

séparation avec résolution et sensibilité adéquates. En chromatographie liquide, on utilise

souvent les termes « chromatographie en phase normale », où la colonne est constituée de

gel de silice (un matériau très polaire) ou « chromatographie en phase inverse » où la

colonne est constituée de silice greffée par des chaînes hydrocarbonées de 8 ou 18

carbones, C8 ou C18 (un matériau très peu polaire).

Il existe aussi des colonnes de types échangeuses d’ions, constituées de

polystyrène / divinylbenzène, qui peuvent s’apparenter à les colonnes en

chromatographie ionique. Ces colonnes permettent de séparer une vaste gamme de

composés organiques plus solubles dans l’eau que dans certains solvants organiques.

Pour l’analyse des sucres par chromatographie liquide avec détection par indice

de réfraction, la colonne (AMINEX ou semblable) utilisée possède quelques avantages.

• Elle permet d’utiliser une méthode isocratique simple (la phase mobile est

composée d’eau uniquement) ce qui permet de faire la détection par indice de réfraction

(voir la théorie sur le détecteur à indice de réfraction un peu plus loin)

• De plus, comparativement à certaines autres méthodes, l’analyse des sucres par

chromatographie liquide ne nécessite pas de procédure de dérivation afin de favoriser une

bonne séparation et la méthode demande un minimum de préparation des échantillons.

Effet de la température sur la séparation

Le contrôle de la température est souvent critique en chromatographie liquide. Les

temps de rétention et la hauteur des pics peuvent être grandement influencés par la

température. C’est pourquoi sur le système HPLC que nous utiliserons, il y a un chauffe-



colonne afin de contrôler précisément la température.

L’avantage d’utiliser de hautes températures en chromatographie liquide est

d’obtenir de meilleures séparations et plus rapidement. L’augmentation de la température

fait en sorte de diminuer la viscosité de la phase mobile, ce qui permet aux sucres une

meilleure pénétration dans les pores de la phase stationnaire (favorise de meilleurs

échanges entre la phase stationnaire et mobile), favorisant ainsi une meilleure résolution

des pics chromatographiques.

Détecteur à indice de réfraction

L’indice de réfraction d’une matière est un nombre qui caractérise le pouvoir que

possède cette matière à ralentir et dévier la lumière. Le détecteur à indice de réfraction

mesure en continu la différence d’indice de réfraction entre la phase mobile pure

(référence) et l’effluent qui sort de la colonne HPLC. Lorsque la phase mobile et

l’effluent sont identiques, les intensités lumineuses de la référence et de l’échantillon sont

identiques et aucun signal n’est détecté. Par contre, lorsque la cellule échantillon contient

une solution avec un indice de réfraction différent, le faisceau lumineux est dévié suivant

la loi de Snell-Descartes.

Le changement de l’intensité lumineuse est proportionnel à la concentration et à

l’indice de réfraction de la solution de l’échantillon.

Le détecteur à indice de réfraction est un détecteur universel car il permet de

détecter quasiment tous les composés. Par contre, il est très sensible aux variations de

température. De plus, ce détecteur ne peut être utilisé qu’en mode isocratique (la

composition de l’éluant ne varie pas au cours du temps). En effet, la cellule de référence

qui contient la phase mobile est remplie avec cette dernière au début de l’expérience mais

c’est la cellule échantillon qui est alimentée par l’effluent de la colonne tout au long des

analyses.

Le détecteur à indice de réfraction possède un désavantage majeur, c’est d’être

moins sensible que la plupart des autres détecteurs.

Théorie Titrimétrie-Karl-Fischer

La réaction de Karl Fischer (voir Skoog … Chimie analytique, traduction de la

8ième édition, pages 580-582

La détermination de la teneur en eau est basée sur la réaction de Bunsen :

42222 22 SOHHIOHSOI



Karl Fischer a découvert que cette réaction pouvait être utilisée pour le dosage de

l’eau dans un système non-aqueux contenant un excès de SO2. Le solvant utilisé était du

méthanol. Pour diriger la réaction vers la droite, il est nécessaire de neutraliser les acides

formés (HI et H2SO4); Karl Fischer a utilisé la pyridine, C5H5N à cet effet. Le réactif Karl

Fischer est composé d’iode, de dioxyde de soufre, de pyridine et de méthanol. La

réaction, se fait en deux étapes :

En présence d’une grande quantité de pyridine, tous les réactifs et les produits

existent sous forme de complexes, comme l’indiquent les équations. Notez que seule la

première étape consomme de l’eau lors de l’oxydation du dioxyde de soufre par l’iode

pour donner du trioxyde de soufre et de l’iodure d’hydrogène. La deuxième étape, qui se

produit en présence d’un excès de méthanol, est cruciale pour la réussite du titrage, parce

que le complexe pyridine-trioxyde de soufre est également capable de consommer de

l’eau.

Cette réaction indésirable peut être complètement évitée en présence d’un grand

excès de méthanol. Contrairement à la réaction de Bunsen, la stœchiométrie du titrage

Karl Fischer implique la consommation d’une mole d’iode, d’une mole de SO2, et de trois

moles de pyridine par mole d’eau. En pratique, on emploie un excès de SO2 et de

pyridine pour que la capacité du réactif à se combiner avec l’eau ne soit déterminée que

par sa teneur en iode. Pour les dosages habituels, de 2 à 5 mg d’eau réagissent avec 1 mL

de réactif en présence d’un excès en SO2 d’un facteur 2 et d’un excès en pyridine d’un

facteur 3 à 4.

D’autres études ont démontrées

• que la pyridine ne participait pas directement à la réaction mais servait plutôt

comme un tampon et pouvait être remplacée par une autre base.

• que la vitesse de la réaction dépendait du pH.

La vitesse de réaction est optimale dans le domaine de pH entre 5,5 et 8. La

vitesse augmente encore au-dessus de pH 8,5 mais à ce pH le point de fin de titrage est

moins bon et il y a une plus grande consommation d’iode.

Modification du milieu réactionnel

En 1984 E. Sholtz a développé un réactif Karl Fischer sans pyridine en utilisant

l’imidazole comme base. Ceci a permis non seulement de remplacer la pyridine, un

produit toxique, mais aussi de rendre la réaction de titrage plus rapide et plus précise en

3222 2 SOPyIHPyOHPySOPyIPy

4333 SOCHHPyOHCHSOPy

4333 SOCHHPyOHCHSOPy



tamponnant dans un domaine de pH plus favorable. Sholtz a aussi trouvé que d’autres

alcools pouvaient améliorer la stabilité du réactif. Le méthanol peut être remplacé par

l’éthanol, le 2-propanol ou le méthoxyéthanol.

Considérations pratiques

Dépendance de la réaction Karl Fischer sur du pH

Étant donné que la vitesse maximale est atteinte à un pH entre 5,5 et 8, il faut

éviter un pH au-dessus de 8 et inférieur à 4 en pratique. Avec des échantillons acides ou

basiques, on doit ajuster le pH de la solution par l’addition d’imadazole comme tampon

basique et d’acide salicylique comme tampon acide.

Effet du solvant sur la réaction

La stœchiométrie (ratio molaire H2O/I2) dépend du type de solvant. Le méthanol

devrait être toujours présent dans une proportion de 20 % ou plus pour que la réaction

entre l’iode et l’eau ait une stœchiométrie 1:1. Cependant, les cétones et les aldéhydes

forment des acétals avec les alcools en produisant aussi du H2O ce qui fausse les

résultats. Dans ces cas, il faut utiliser un réactif Karl Fischer modifié (voir la section «

réactifs ».

Réactifs

Le réactif de Karl Fischer n’est pas stable à long terme. Pour cette raison, il est

souvent commercialisé sous forme de deux solutions qu’il faut mélanger avant usage. Il y

a sur le marché des réactifs à un seul composant formulés pour être plus stables dans le

temps ainsi que des réactifs spéciaux pour le dosage de l’eau dans les aldéhydes et

cétones.

Réactifs à deux composants

Le titrant contient de l’iode et du méthanol. Le solvant contient le SO2,

l’imidazole (ou la pyridine) et le méthanol. Les composants séparés sont très stables en

entreposage. Par contre, lorsque le réactif et le solvant sont mélangés pour effectuer les

titrages, il y a dégradation et il faut étalonner le titrant régulièrement.

Réactif à un seul composant

Le titrant contient de l’iode, du SO2 et de l’imidazole dissous dans un alcool. Le

solvant est le méthanol. On peut utiliser un mélange à base de méthanol, comme solvant,

spécialement adapté à l’échantillon. Le réactif peut être entreposé pendant deux ans. La

baisse du titre est d’environ 0,5 mg/mL par année dans une bouteille scellée. Avec ce

type de réactif, la vitesse de réaction est de 2 à 3 fois moins rapide qu’avec les réactifs à

deux composants.



Réactifs spéciaux pour aldéhydes et cétones

La compagnie Riedel-de Haën fabrique un réactif à un composant sans méthanol

pour le titrage en présence des aldéhydes et des cétones :Hydranal® Composite 5K

comme titrant et l’Hydranal® Working medium K comme solvant.

Réactifs avec éthanol

Étant donné que l’éthanol est moins toxique que le méthanol Riedel-de Haën a

mis sur le marché des réactifs à base d’éthanol. Ces réactifs permettent le titrage de

plusieurs cétones qui forment des acétals mais à une vitesse beaucoup moins grande

qu’en présence de méthanol. Un solvant spécial à base d’éthanol est disponible pour le

réactif à un composant.

Contrôle du titrage

L’ajout du titrant durant le titrage doit être contrôlé comme pour tout autre titrage.

Le titrant doit être ajouté aussi rapidement que possible et arrêté exactement au point

d’équivalence. La vitesse du titrage dépend de quatre facteurs :

• La vitesse de réaction entre le titrant et l’échantillon

• Le mélange du titrant avec l’échantillon qui dépend de la vitesse d’agitation

• Des paramètres de contrôle

• La détection du point d’équivalence

Indication du point d’équivalence

Le point d’équivalence peut être détecté visuellement par le changement de

couleur car lorsque toute l’eau a été titrée, un excès d’iode apparait en solution, la

coloration devient alors plus foncée. Pour les appareils automatisés, la détection du point

d’équivalence se fait toujours de façon électronique, soit par mesure potentiométrique ou

ampérométrique.

Détection potentiométrique

Dans le cas d’une détection potentiométrique, le circuit de détection maintient un

courant constant (5 à 10 µA) entre deux électrodes de platine et mesure en même temps

le voltage nécessaire pour maintenir ce courant constant. En absence d’iode en solution,

le potentiel est élevé, mais au point de fin du titrage, il y a apparition d’iode en solution,

ce qui fait chuter le potentiel pour maintenir le courant constant. Cette chute du potentiel

indique le point de fin du titrage.

Détection ampérométrique

Dans le cas d’une détection ampérométrique, une différence de potentiel

constante, suffisante pour réduire l’iode (I2) en iodure (I-), est maintenue entre deux



électrodes de platine. Lorsqu’un excès d’iode apparaît en solution, le courant augmente

de façon importante, ce qui signale la fin du titrage.

Vitesse de réaction

La vitesse de réaction dépend : de la concentration d’eau; de la concentration de

SO2; de la concentration d’iode et du pH de la solution. Initialement, lorsque la

concentration de l’eau est élevée, le titrant peut être ajouté rapidement étant donné que

l’iode réagit avec l’eau immédiatement. Vers la fin du titrage, lorsque la concentration

d’eau est plus faible, la vitesse de réaction étant plus lente, le titrant doit être ajouté plus

lentement.

Vitesse d’agitation et dispersion du titrant

Pour un titrage précis il faut un bon mélange des réactifs. Le mélange des réactifs

est influencé par : la vitesse d’agitation; le point d’entrée du titrant et par la forme du

contenant de titrage

La vitesse d’agitation optimale est obtenue lorsqu’il y a apparition d’un petit

vortex. Si la vitesse d’agitation est trop basse le titrage est lent et irrégulier et un

dépassement du point de fin de titrage est possible. Si des bulles se forment en solution,

l’agitation est trop rapide.

Point d’entrée du titrant. Le titrant doit être ajouté à l’endroit où la turbulence est

maximale. L’ajout doit se faire assez loin des électrodes pour laisser assez de temps à

l’iode pour réagir. Si le titrant est ajouté trop près des électrodes le circuit de détection

détecte de l’iode qui n’a pas réagi et le titrant est automatiquement ajouté plus lentement

ce qui entraîne un titrage prolongé.

Figure 1. Considérations expérimentales agitation/point d’entrée

Paramètres de contrôle du titrage

Comme l’appareil que nous utiliserons est un appareil automatique, la précision

du titrage dépend aussi de différents paramètres de contrôle que l’on peut modifier selon

le type d’échantillon à analyser. Voici les différents paramètres suggérés par le

manufacturier pour le type de titrage que nous effectuerons.



Sources :1. Mode d’emploi du 784 KFP Titrino de Metrohm

2. Publication Metler Toledo pour DL31/DL38 Titrator




Objectif

- Mesurer la quantité de sucrose, de fructose et de glucose dans divers échantillons

alimentaires par HPLC-RID.

- Apprendre à utiliser un titrimètre de Karl-Fischer

Expérimentation HPLC-RID

Appareillage

Un montage HPLC, tel que décrit dans la théorie de l’expérience HPLC #1, est

utilisé avec en plus un module de chauffe-colonne afin de contrôler la température. La

colonne utilisée est une colonne Phenomenex RPM-Monosaccharide 300 x 7,8 mm. Le

détecteur est un réfractomètre.

Préparation de la droite d’étalonnage

À partir des trois sucres (solides) fournis, préparer 250 mL de solution-mère

contenant entre 950 et 1050 ppm (précisément) (les 3 sucres dans le même ballon

jaugée); utiliser de l’eau désionisée comme solvant.

À partir de cette solution mère, préparer cinq standards pour la courbe

d’étalonnage: Compléter chaque solution à 50 mL avec de l’eau désionisée.

Table 1. Préparation des solutions d’étalonnage pour la quantification de sucres

Filtrer chaque échantillon sur nylon 0,45 µm et transférer dans un vial pour

échantillonneur automatique. Utiliser la même seringue et le même filtre pour chacun des

échantillons en rinçant avec la solution suivante le filtre et la seringue entre chaque point.

Filtrer les standards du plus dilué au plus concentré.

Injecter chaque standard dans le chromatographe. Construire, sur un même

graphique, la courbe d’étalonnage de chacun des composés en plaçant la concentration en

mg/L (ppm) en abscisse et la surface du pic en ordonnée. Déterminer la limite de

détection de chacun des produits en utilisant les courbes d’étalonnage.

Quantification de l’inconnu

Standard Volume de solution mère

(mL)

Volume final

(mL)

1 10 50

2 20 50

3 30 50

4 40 50

5 50 50



Utiliser l’inconnu tel quel, sans dilution. Filtrer sur nylon 0,45 µm et placer dans

un vial pour échantillonneur automatique. Injecter deux fois cet échantillon. À l’aide de

votre courbe d’étalonnage, déterminer la quantité de chacun des sucres présents en mg/L

(ppm).

Quantification du jus de fruit Oasis

Diluer d’un facteur 100X un échantillon de jus de fruit avec de l’eau désionisée.

Filtrer sur nylon 0,45 µm et placer dans un vial pour échantillonneur automatique.

Injecter l’échantillon. Déterminer la quantité de chacun des sucres en g/250 mL et en

sucres totaux en g/250 mL. Comparer vos résultats avec les valeurs de l’étiquette.

Quantification du miel

Peser précisément environ 1 g de miel et diluer dans un volumétrique de 500 mL

avec de l’eau désionisée. Filtrer sur nylon 0,45µm et placer dans un vial HPLC. Injecter

l’échantillon. Déterminer la quantité de chacun des sucres présents en % (poids/poids).

Comparer vos résultats avec les valeurs trouvées sur Internet.

Quantification du sirop d’érable

Peser précisément environ 0,5 g de sirop d’érable et diluer dans un volumétrique

de 500 mL avec de l’eau désionisée. Filtrer sur nylon 0,45µm et placer dans un vial pour

échantillonneur automatique. Injecter l’échantillon. À l’aide de la courbe d’étalonnage,

déterminer la quantité de chacun des sucres présents en % (poids/poids). Comparer vos

résultats avec les valeurs trouvées sur Internet.

Conditions expérimentales

Colonne : Bio-Rad Aminex HPX-87P 300 x 7.8 mm

Instrument : Agilent 1100 HPLC system

Phase mobile : Eau

Débit : 0,60 mL/min

Volume d’injection : 25 µL

Détecteur : Indice de réfraction

Température de la colonne : 80°C

Expérimentation Karl-Fischer

Utilisation du titrimètre Karl Fischer

Peser sur le bouton avec une icône rouge situé à gauche et au bas de l’écran. Le système

devrait afficher sur l’écran : KFT I (pol) H2O Titer

Si l’écran n’affiche pas cette méthode, il faut la charger en pesant sur le clavier « USER

METHOD » et « ENTER » pour se retrouver à « charger méthode ». On pèse sur «



ENTER » et on sélectionne la méthode à charger en pesant sur les flèches <←> et <→>

et en pesant encore sur « ENTER » pour confirmer. La méthode H2OTiter est maintenant

chargée.

Le dosage

Conditionnement

Introduire 20 mL de méthanol dans la cellule, c’est-à-dire jusqu’à la ligne noire. Toute

présence d’eau doit être éliminée de ce méthanol avant de commencer le dosage

proprement dit. On commence ce conditionnement en appuyant sur le bouton « START

». Le conditionnement est terminé lorsque l’écran affiche « dérive OK » et que la lumière

verte située en dessous de « cond » cesse de clignoter.

Titrage (concentration du titrant)

D’abord on veut connaître le titre de la solution Karl Fischer

• Appuyez sur « START » et ajouter 9 μL d’eau avec une seringue en perçant le septum

situé à l’avant de la cellule. L’afficheur vous demandera la quantité d’eau que vous avez

ajoutée et vous confirmerez avec « ENTER ». Dans ce cas, ce sera 0,009 g. Par la suite,

l’appareil titrera l’eau introduite pour ainsi déterminer le titre du titrant Karl Fisher.

• Répétez la même opération lorsque « dérive OK » est affiché en retournant à l’étape a).

Pour bien connaître le titre de la solution Karl Fischer, il faut effectuer au moins trois

dosages de l’eau.

Dosage de l’inconnu

• Appuyez sur « STOP ». Charger la méthode appelée « MIEL » en répétant les mêmes

opérations que lors du chargement de la méthode « H2O Titer ». Peser sur « USER

METH » et « ENTER » etc. Pesez sur « START » l’appareil s’assurera que la dérive est

stable. Pendant ce temps, prendre une seringue de 1 mL et la remplir jusqu’à 0,2 mL de

miel. Peser le miel et la seringue. Lorsque l’afficheur indiquera « Dérive OK » on amorce

le dosage en pesant sur « START ».

• Introduire une goutte de miel (100 mg environ) dans la cellule et on repeser la seringue

pour connaître la quantité introduite. Lorsque l’appareil affichera « prise d’essai », entrer

la quantité pesée par différence et confirmer par « ENTER »et un autre « ENTER » pour

confirmer les unités.

Calculs Déterminez la teneur en différents sucres dans chaque mélange (commerciaux et

inconnu)






- Démontrez votre compréhension du détecteur RID (détecteur à indice de réfraction)

- Quels sont les possibilités pour identifier l’espèce chimique correspondant à un pic?

- Dans votre discussion, faire une comparaison des deux techniques d’analyse des sucres

utilisées au sujet de :

• La préparation des échantillons;

• Les types de séparation (colonnes chromatographiques, phase mobile, etc.);

• Le type de détection

• La sensibilité de la méthode (limites de détection, limites de quantification, …).

- Laquelle des deux techniques utiliseriez-vous pour l’analyse de sucres présents à très

faibles concentrations dans votre échantillon? Laquelle des deux techniques utiliseriez-

vous pour l’analyse de sucres présents à très fortes concentrations dans votre échantillon?




Expérience 6 : Analyse MALDI-MS



EXPÉRIENCE 6 : ANALYSE MALDI-MS



Introduction

Les cellules des organismes vivants contiennent des milliers de types différents

de protéines. Ces molécules ont une multitude de fonctions dans les organismes vivants

tels que la catalyse de réactions chimiques (p. ex. l’enzyme lactase, protéine

responsable de l’hydrolyse du lactose), la communication cellulaire (p. ex. le récepteur

aux œstrogènes, protéine qui se lie à l’hormone sexuelle estradiol) ou la formation de

structures ou de fibres (p. ex. la kératine, protéine fibreuse qui est le constituant

principal des cheveux et des ongles). Une protéine est un polymère d’acides aminés

(Figure A1, dans l’annexe). Il existe vingt acides aminés naturels qui composent la

plupart des protéines. Les acides aminés sont représentés par des codes à trois ou à une

lettre (p. ex.: alanine = Ala ou A; cystéine= Cys ou C). La séquence peptidique, c’est-à-

dire l’ordre dont les acides aminés sont liés dans une protéine, détermine la structure

tridimensionnelle de celle-ci et donc sa fonction dans les organismes (Figure 1 et

Figure 2).

Figure 1. Composition de l’insuline du porc. Les lignes liant les cystéines sont des

ponts disulfures (liens S-S). Source: Baker E. N., et al. (1988) Philos T Roy Soc B

319(1195):369-456.



NOTE : Cette expérience est basée sur l’article "Identifying a protein by MALDI-TOF

mass spectrometry: An experiment for the undergraduate laboratory" publiée par

Couterman et al. en 2003 dans le Journal of Chemical Education, 80(2): 177-180.

Figure 2. Structure tridimensionnelle de l’insuline du porc. Source : RSCP Protein

Databank (2001). Molecule of the Month: Insulin. Available at

http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=14 (accessed on 2015-07-06).

La spectrométrie de masse

D’après l’IUPAC, la spectrométrie de masse (MS) est la science qui « étudie la

matière à travers la formation des ions en phase gazeuse qui sont caractérisés au moyen

des spectromètres de masse par leurs masses, leur charge, leurs structures et leurs

propriétés physico-chimiques ». Le principe de base de la MS est de générer des ions à

partir des composés organiques ou inorganiques et de les séparer par leurs ratios masse

sur charge (m/z). Pour ce faire, les composants de l'échantillon doivent être convertis

en ions et introduits dans un analyseur de masse qui va les séparer en fonction de leurs

m/z. Les analyseurs de masse ont besoin de fonctionner dans un vide élevé (pressions

typiques ~ 109 fois inférieures à la pression atmosphérique) pour éviter les collisions

intermoléculaires. Une fois que les ions sont séparés, un signal est généré à l’aide d’un

système de transduction et d’amplification du courant.

Dans cette expérience, les données seront acquises en utilisant un instrument de

type désorption-ionisation laser assistée par matrice couplée à un spectromètre de type

quadripôle-temps d’envol (MALDI-QTOF). MALDI est la source d’ions, c.-à-d., un

appareil capable de générer des ions à partir de l’échantillon et le QTOF est l’analyseur

de masse qui va séparer les ions en fonction de leurs m/z.



Pour réaliser une expérience MALDI-QTOF, l'échantillon à analyser est

combiné avec une matrice, souvent constituée d’un acide organique capable d’absorber

la lumière UV. Le ratio molaire entre la matrice et l’analyte est souvent entre 1000 : 1

et 100000 : 1. Ensuite, un volume entre 0.5 et 2 μL du mélange est déposé sur le porte-

échantillons, une plaque de métal (cible MALDI), et on laisse sécher l’échantillon.

Après, la cible est introduite dans l’instrument où elle est frappée par une très courte

impulsion laser (Figure 3). Les molécules de la matrice absorbent l'énergie du laser et

cette énergie est utilisée pour volatiliser l’échantillon et transférer des protons à partir

de la matrice à des molécules de l'échantillon, formant instantanément un panache

d'ions. Quoique des ions de type M•+ ou [M+2H]2+ sont souvent observés, dans les

conditions expérimentales que nous utiliserons, cette méthode d'ionisation favorise la

production d'ions de type [M+H]+.

Figure 3. Schéma de la source MALDI. Source: Gross J. H. (2011) Mass

Spectrometry: A Textbook. 2nd ed. Berlin, Germany: Springer, 716 p.

Ces ions sont ensuite accélérés par une différence de potentiel et sont introduits

dans l’analyseur de masse. Dans ce cas-ci, l’analyseur de masse est un composé d’un

quadripôle (Q) et d’un temps de vol (TOF). Entre les deux, il se trouve une cellule à

collision (q) qui est utilisée pour la fragmentation des ions sélectionnés par le

quadripôle lorsque l’instrument est utilisé dans le mode spectrométrie de masse en

tandem. Dans le cadre de cette expérience, l’instrument sera utilisé en mode « TOF »,

c.-à-d., le quadripôle servira seulement comme guide ionique et la cellule de collision

n’est pas activée. Par conséquent, tous les ions générés par la source MALDI et ayant

un ratio m/z dans la gamme spécifiée par l’expérimentateur seront transmis vers le

TOF.



Figure 4. Schéma de l’instrument QTOF de la compagnie Waters. Dans cette

expérience la source electrospray est remplacée par la source MALDI. Source : Waters

Corp. (2008) Synapt Mass Spectrometry System : Operators Guide,

71500153502/Revision A.

Avant d’entrer dans le TOF, les ions transmis par le quadripôle sont déviés et

accélérés en direction perpendiculaire à leur trajectoire par le voltage pulsé de 5-10 kV

de l’accélérateur orthogonal (« Pusher » dans la Figure 4). Une fois dans le temps de

vol, les ions sont séparés en fonction du temps qu’ils prennent pour traverser un trajet

de dérive (Figure 4). Puisque la vitesse des ions dépend de leur masse, les ions de

faible masse arriveront plus rapidement au détecteur que les ions de masse élevée.

L’énergie cinétique Ek transféré aux ions par le voltage d’accélération est

exprimée par : 𝐸𝑘 = 𝑒𝑧𝑈

Où z= nombre de charges de l’ion et e=charge de l’électron (1.602x10-19 C). Si l’on

suppose que le voltage d’accélération U est de 20 kV et z=1, alors Ek des ions qui

entrent dans le TOF est de 20 keV (1 électronvolt est l’énergie acquise par une seule

charge électrique accélérée par une différence de potentiel de 1 V, aussi égal à 1.602

x10-19 J).

Cette énergie cinétique dépend de la masse m (en kilogrammes) et la vitesse des

ions v (en mètres par second) selon l’équation :

𝐸𝑘 = 𝑚𝑣2

2⁄

Ces deux équations nous permettent alors de déterminer que le temps t (en

seconds) qu’un ion prend pour se rendre au détecteur placé à une distance s (en mètres)

dans le TOF est déterminé par :

𝑡 =𝑠

√2𝑒𝑈√

𝑚

𝑧

Où U est voltage d’accélération en volts.



Alors dans un TOF ayant un voltage d’accélération U= 20000 V, une distance s

de 1 m est parcourue par un ion de fullerène (C60+) en :

𝑡 =1𝑚

√2(1.6022 × 10−19 𝐶)(20000 𝑉)

√(

720 𝑔 𝑚𝑜𝑙−1

1000 𝑔 𝑘𝑔−1⁄ )

6.022 × 1023 𝑚𝑜𝑙−1

1

𝑡 = 13.66 𝜇𝑠

Identification des protéines

La protéomique est la science qui s’occupe de la caractérisation globale du

protéome, c.-à-d. l’ensemble des protéines qui peuvent être synthétisées par un

organisme vivant. Elle s’intéresse aussi à l'abondance relative des protéines, leurs

fonctions et aux changements du protéome en fonction des stimuli environnementaux.

Alors, la protéomique nous permet, entre autres, de mieux comprendre les mécanismes

responsables des maladies, du vieillissement et les effets de l’environnement sur le

fonctionnement des organismes vivants.

Une technique largement utilisée pour l’identification des protéines par

spectrométrie de masse est celle de l’empreinte des masses peptidiques (peptide mass

fingerprinting). Cette technique consiste à mesurer les m/z des peptides générés par

digestion enzymatique des protéines d’intérêt. L’enzyme trypsine est couramment

employée pour cette technique. À l’échelle moléculaire, la trypsine agit comme de

« ciseaux » très sélectifs : elle coupe les liens carbonyle-amine entre les acides aminés

liés à la lysine (Lys ou K) ou à l’arginine (Arg ou R) sauf s’ils sont suivis par proline

(Pro ou P). Ceci est illustré à l'aide de la séquence ci-dessous :

AFDEKAWSVARVVAGVANALAHKPEKFVIEI…

Trypsine

AFDEK + AWSVAR + VVAGVANALAHKPEK + FVIEI…Les peptides générés par cette

technique représentent un ensemble unique de m/z (essentiellement une empreinte

digitale) qui est caractéristique de la protéine à partir de laquelle ils proviennent. Les

m/z affichés dans le spectre de masse sont par la suite entrés dans les bases de données

d’empreintes de masses peptidiques pour identifier la protéine d’origine.

Pour calculer la masse en kg d’un

seul ion, nous calculons sa masse

molaire et nous divisons par le

nombre d’Avogadro.

Les unités sont des seconds puisque :

1V=1kgm2

Cs2



Figure 5. Spectre de masse obtenu par MALDI-TOF d’un échantillon d’anhydrase

carbonique digéré avec la trypsine. Source de l’image : Protea (2011) Standards for

Protein Mass Spectrometry. Available at :

https://proteabio.com/media/document/Protea_Mass_Spec_Standards_Brochure.pdf

[Accessed on 2015-08-12].

Quoique certaines protéines peuvent avoir un certain degré de similarité entre

leurs séquences peptidiques, des expériences ont démontré qu’une grande partie des

séquences d’une protéine sont uniques et elles peuvent être utilisées pour identifier une

protéine parmi des millions (Pappin et al. 1993; Henzel et al. 2003). En effet, avec

seulement un nombre très petit de peptides (3 à 5), il est possible d’identifier

correctement une protéine.


Objectifs

Identifier une protéine inconnue à l’aide de l’empreinte peptidique déterminée

par MALDI-QTOF et une base de données sur Internet. Cette expérience est divisée en

trois sections :

I. Détermination de l’empreinte de masses peptidiques de la protéine inconnue

par MALDI-QTOF

II. Recherche d’empreintes de masses peptidiques avec une plateforme Web

utilisant des données de la littérature

III. Identification de la protéine inconnue avec une plateforme Web utilisant les

valeurs obtenues expérimentalement.



Section I : Détermination de l’empreinte de masses peptidiques de la

protéine inconnue par MALDI-QTOF

Matériel et instruments

Solvants et réactifs

• Acétonitrile :Eau (1 :1) 0.1% d’acide trifluoroacétique

• Acide α-cyano-4-hydroxycinnamique : matrice qui devra être mélangée avec

la protéine digérée avant de faire l’analyse par MALDI-QTOF.

• Bicarbonate d’ammonium

• Eau déionisée

• Mélange de calibration du TOF : solution de PEG

• Protéine inconnue

• Trypsine

Pour l’utilisation de l’appareil, veuillez lire la procédure d’utilisation des

spectromètres dans les sections suivantes.

Digestion de la protéine inconnue

(LA PROTÉINE ET LA TRYPSINE DOIVENT ÊTRE CONSERVÉ À -20°C,

ELLES DOIVENT RETOURNER À CETTE TEMPÉRATURE LE PLUS

RAPIDEMENT POSSIBLE)

1- Remplir d’eau et allumer le bain thermostaté puis ajuter la température à 37C.

2- Préparer dans un tube Falcon de 15 mL, 10 mL d’une solution de bicarbonate

d’ammonium 100 mM dans l’eau déionisée.

3- Préparer 10 mL d’une solution de trypsine 0.1 mg/mL dans la solution de

bicarbonate d’ammonium 100 mM.

4- Peser environ 1 mg de la protéine inconnue dans un microtube de 1.5 mL et y

ajouter 500 µL de la solution de trypsine.

5- Placer le tube dans le bain thermostaté maintenu à 37°C pendant environ 3h. Il faut

immerger le tube, mais pas jusqu’au bouchon.

Appareillage

L’instrument utilisé durant l’expérience sera le MALDI-QTOF Synapt de la

compagnie Waters. Cet instrument est équipé d’un quadripôle avec une large gamme

de transmission (environ m/z 200 à 5000), d’un accélérateur orthogonal (« pusher ») et

d’un réflectron (Figure 4). La résolution de cet instrument mesurée à m/z 1400 par la

largeur du pic à la mi-hauteur est de l’ordre de 8000.



Préparation de la cible MALDI

1- Préparer 1 mL d’une solution de matrice 3.6 mg mL-1 d’acide -cyano-4-

hydroxycinnamique dans 1:1 eau : acétonitrile contenant 0.1 % (v/v) d’acide

trifluoroacétique dans un microtube à centrifugeuse.

2- Mélangez 5 L de solution digérée de la protéine inconnue avec 45 L de la solution

de matrice dans un microtube à centrifugeuse.

3- Déposez 1 L du mélange protéine-matrice sur un des puits de la plaque (cible)

MALDI. Noter sur votre cahier de laboratoire la rangée et colonne des puits utilisés

pour déposer vos échantillons. Répéter cette opération dans deux autres puits.

4- Déposez 1 du mélange de calibration dans un des puits de la plaque (cible) MALDI.

Noter sur votre cahier de laboratoire la rangée et colonne des puits utilisés pour déposer

vos échantillons. Répéter cette opération dans cinq autres puits.

5- Laisser sécher la cible pendant 15-20 minutes à l’air ambiant ou jusqu’à ce que le

puit soit complétement sec.

6- Consulter votre démonstrateur afin de faire approuver votre cible MALDI.

Préparation de la liste d’échantillons et analyse

1- S’il n’est pas déjà ouvert, ouvrez le logiciel « MassLynx V4.1 » en cliquant

sur l’icône suivant dans le Bureau de l’ordinateur :

Sur la fenêtre principale du logiciel Mass Lynx, vous allez voir un menu à

gauche, un menu en haut et la liste d’échantillons au centre. La préparation de votre

liste d’échantillon se fait dans cette dernière. Dans une ligne vide de la liste, taper la

date, le numéro de l’équipe et le code de l’inconnu (p.ex. : AAAAMMJJ-Equipe1-

Inconnu1) dans la colonne « File Name ». Cette information vous aidera à identifier le

fichier de votre échantillon.

2- Dans la colonne « File Text » indiquez la composition de votre échantillon

(p.ex. 10uL-Inconnu1-90uL-matrice). Cette information apparaîtra sur l’entête du

spectre de masse de l’échantillon.

3- Dans la colonne « MS Tune File » tapez « Tune_MALDI_2015 ». Ce fichier

contient l’information sur les paramètres de fonctionnement de la source MALDI

(voltages, gaz de refroidissement, etc.).

4- Dans la colonne « MS Method » tapez « MS-method-Maldi_Highmass ». Ce

fichier contient les paramètres d’acquisition tels que l’intervalle de m/z transmis, le



temps et la façon dont le laser frappe la cible ainsi que l’énergie du laser.

5- Dans la colonne « Well location » tapez la position du puit de la cible dont

votre échantillon se trouve. Par exemple pour un échantillon dans la rangée A, colonne

1 de la cible, entrer « A,1 ».

6- Une fois que la cible est sèche, cliquez dans la barre de tâches Windows de

l’ordinateur sur l’icône de la fenêtre de réglage du spectromètre de masse (« MS Tune

») :

7- Dans la fenêtre MS Tune, cliquez sur LOAD dans la section « Sample

Plate » :

8- Introduire la cible MALDI dans l’instrument en suivant les instructions de

votre démonstrateur.

9- Dans la fenêtre MS Tune, cliquez sur l’icône de la caméra pour suivre le

déplacement de la cible MALDI à l’intérieur de l’appareil :

10- Une fois que la cible est visible avec la caméra, tapez la position (p. ex.

« A1 », sans virgule) dans un des puits contenant votre échantillon dans la boîte

« Sample » de la section « Sample Plate ».

11- Minimisez la fenêtre MS Tune (NE JAMAIS FERMER CETTE

FENÊTRE) et retourner à la page principale de Mass Lynx.

12- Sélectionnez les lignes avec vos échantillons et cliquer sur « Start Run »

13- Retournez sur la fenêtre MS Tune et cliquer sur la caméra pour visualiser le

passage du laser sur les échantillons.

Analyse des résultats

1- Une fois que l’acquisition des résultats est finie, sélectionner la ligne d’un de

vos échantillons et cliquer sur « Chromatogram » dans le menu en haut de la

fenêtre principale de Mass Lynx:



2- L’image que vous allez voir représente la variation du signal généré par tous

les ions en fonction du temps ; ce n’est pas un vrai chromatogramme, puisqu’il n’y a

pas de séparation chromatographique.

3- Cliquez dois fois sur un des « pics » observés pour visualiser le spectre de

masse au temps donné. Vous allez observer différents pics de m/z 300 à 3000. Fermer

cette fenêtre.

4- Afin de visualiser le spectre de masse combiné, laisser le bouton de droit de

la souris pressé et tracer une ligne du début à la fin du « chromatogramme ». Une

nouvelle fenêtre apparaîtra sur l’écran.

5- Ensuite, vous allez procéder au traitement de votre chromatogramme.

D’abord, aller sur le menu en haut et cliquer sur « Process » et ensuite sélectionner

l’option « Smooth » pour lisser le spectre de masse. Entrer les paramètres suivants :

Smooth windows (channels) = 1

Number of smooths = 2

Smoothing method = Savitzky-Golay

Cliquez sur « OK ». Un nouveau spectre de masse lissée apparaîtra au-dessus de

votre spectre de masse initial.

6- Ensuite, vous allez transformer vos données du mode profile au mode

centroïde (des barres plutôt que des pics) qui sont plus faciles à traiter dans les bases de

données des peptides. Pour faire cela, vous devez d’abord connaître la résolution de

vos pics. Pour mesurer la résolution, lorsque la fenêtre de votre spectre de masse lissé

est active, cliquer sur l’icône de démarrage de Windows et cliquer sur l’icône du

logiciel « Res Cal » :

7- Une fenêtre similaire à celle-ci devra apparaître après quelques secondes :



8- Notez la valeur de résolution dans votre cahier de laboratoire. Dans

l’exemple ci-dessous, la valeur de la résolution pour le pic à m/z 342.7302 est de 7418

et la largeur du pic est de 0.0462 u.

9- Allez sur le menu en haut et cliquer sur « Process » et ensuite sélectionner

l’option « Center ». Utiliser les paramètres suivants :

10- Ensuite, cliquez sur le bouton « TOF » de la fenêtre « TOF Spectrum

Center » et tapez la valeur de la résolution donnée par le logiciel Res Cal dans la boîte

« Resolution ». Ne pas changer le reste des paramètres. Cliquer sur « OK ». Un

nouveau spectre de masse en mode centroïde devra apparaître au-dessus du spectre de

masse lissée.



11- Imprimez les trois spectres de masse (original, lissé et centroïde) sur la

même feuille. Pour faire ceci, aller sur le menu en haut et cliquer sur « File » et ensuite

choisir l’option « Print ». Dans la fenêtre qui apparaîtra, choisir l’option « All

Windows ». Assurez-vous que vous allez imprimer dans le format paysage (landscape)

en cliquant sur « Setup ». Cette page devra être ajoutée au rapport de laboratoire

en annexe.

12- Afin de sauvegarder sur un fichier Excel les valeurs de m/z et l’intensité des

centroïdes, aller sur le menu en haut et cliquer sur « Edit » ensuite choisir l’option

« Copy Spectrum List ». Ensuite, ouvrir un fichier vierge (blank workbook) sur

Microsoft Excel et coller vos données. Sauvegarder le fichier Excel sur le Bureau avec

le format suivant (Année-Équipe-Inconnu).

13- Ensuite, vous allez transformer vos données pour en retirer les pics

d’isotopes minoritaires pour conserver seulement le pic monoisotopique majoritaire.

Pour ce faire vous allez copier le spectre sauvegardé (m/z et intensité) en entier dans le

logiciel de traitement de données gratuit mMass (http://www.mmass.org/) Pour faire

ceci, aller sur le menu File et ensuite choisir l’option New from Clipboard. Vous

devriez voir apparaitre votre spectre de masse dans la fenêtre du logiciel.

14-Vous devez ensuite identifier les pics dans le logiciel. Dans le menu

Processing choisir l’option Peak Picking. Utiliser un critère de signal sur bruit de 3

pour éviter d’inclure trop du bruit de l’appareil dans votre spectre et cocher l’option

Apply deisotoping. Vous devriez obtenir une liste des pics et leur intensité et les pics

seront annotés sur votre spectre. mMass retirera alors les pic dont le signal au bruit est

inférieur à 3 et les pics présentant une différence avec un autre pic de 1.00287.

http://www.mmass.org/



15-Exporter les données : File, Export, Export peak list.

Section II. Recherche d’empreintes de masses peptidiques avec une

plateforme Web utilisant des données de la littérature NOTE: Afin de mieux comprendre l’importance des paramètres lors de la

recherche d’empreintes de masses de peptidiques et faciliter la compréhension des

résultats qui vous seront fournis par la plateforme Web, utilisez les valeurs de m/z des

peptides de l’anhydrase carbonique apparaissant dans la Figure 5.

1- Aller sur le site de ProteinProspector, un site internet intégrant divers outils

de protéomique et développé par l’Université de Californie à San Francisco :

http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm

2- Sur la page principale, dans la section « Database Seach Programs » cliquer

sur « MS-Fit ». MS-Fit est la plateforme Web de recherche de bases de données que

vous allez utiliser pour cette partie de l’expérience.

3- Dans la page de MS-FIT, choisir les paramètres suivants pour effectuer la

recherche d’empreinte de masses peptidiques :

a) Database : SwissProt.2016.9.6

b) Taxonomy : ALL

c) Digest : Trypsin

d) Max. Missed Cleavages : 2

e) Maximum reported hits : 10

f) Tol : 10 mmu

g) Possible modifications : Peptide N-terminal Gln to pyroGlu, Oxidation of M,

http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm



Protein N-terminus Acetylated

h) Instrument : MALDI-Q-TOF

g) Data Format : PP M/Z Intensity Charge

NOTE : L’identification de protéines peut être très sensible aux paramètres

utilisés pour la recherche, surtout le nombre minimum de peptides requis pour

l’identification (Min. # peptides required to match), le nombre maximal de clivages

ratés (Max. Missed Cleavages) et la tolérance de l’erreur sur la masse (Tol).

4- Une fois que les paramètres sont entrés, copier les valeurs des m/z affichées

dans la Figure 5 (utiliser seulement les pics d’intensité supérieure ou égale à celle de

m/z 1255.5) dans la boîte « Data Paste Area » et cliquer sur « Start Search ».

5- Après quelques seconds, un sommaire des résultats sera affiché à l’écran

contenant l’information suivante :

Protein Hit Number Classement des protéines qui correspondent

potentiellement à la protéine dans l’échantillon en

fonction du pointage MOWSE obtenu.

MOWSE Score Pointage calculé par un algorithme. Cet algorithme est

basé sur la comparaison des m/z des ions obtenus

expérimentalement et les valeurs calculées des m/z des



peptides de la protéine identifiée en fonction de la

tolérance de l’erreur sur la masse.

# pep

Nombre de peptides identifiés.

# mat

Nombre d’ions identifiés.

% mat

Pourcentage d’ions identifiés sur le nombre total d’ions

soumis.

# pks Nombre total d’ions soumis.

% Cov Recouvrement de la séquence, c.-à-d. le pourcentage des

acides aminés identifiés sur le nombre total composant la

protéine.

% TIC Pourcentage de la somme des intensités des ions

identifiés sur les la somme des intensités de tous les ions

soumis (cette valeur est identique au % mat si les

intensités des ions ne sont pas soumises).

MeanErr ppm Erreur moyenne sur la masse des ions identifiés en ppm.

L’erreur relative sur la masse d’un ion se calcule de la

façon suivante :

δ𝑚/𝑚(𝑝𝑝𝑚) =𝑚/𝑧𝑒𝑥𝑝 − 𝑚/𝑧𝑐𝑎𝑙

𝑚/𝑧𝑐𝑎𝑙× 106𝑝𝑝𝑚

DataTol ppm 2 écart-type de l’erreur sur les m/z des ions identifiés

en ppm.

# Hom Prot Nombre de protéines homologues (c.-à-d. ayant au

moins un peptide en commun)

MS-Digest Index # Code de la protéine dans la base de données MS-Digest

(digestion simulée par ordinateur).

Protein MW(Da)/pI Poids moléculaire de la protéine en Da/ point

isoélectrique.

Accession # Code d’identification de la protéine dans la base de

données UniProt.

Species Code à cinq lettres de l’organisme vivant (espèce) où la

protéine a été trouvée.

Protein Name : Nom de la protéine.

6- Cliquer sur le symbole « + » de la section « Detailed Results » qui se trouve

en bas de la page. Une série de données apparaîtra pour chaque identité possible de la

protéine dans l’échantillon. Dans cette section, la composition des peptides

correspondante aux valeurs m/z soumises est affichée (« Sequence »). En cliquant sur la

carte peptidique de la protéine (« Coverage Map for This Hit ») vous pouvez observer

dans quel endroit précis de la protéine les peptides identifiés se trouvent.



Section III. Identification de la protéine inconnue avec une plateforme

Web utilisant les valeurs obtenues expérimentalement.

1- Ouvrez les fichiers Excel contenant vos données expérimentales.

2- Répétez les étapes 1-4 de la section II, mais cette fois-ci en utilisant les

données expérimentales sélectionnées. Faites cette même opération pour les deux

autres échantillons de protéine inconnue.

Références

Counterman A. E., Thompson M. S., Clemmer D. E. 2003 Identifying a protein by

MALDI-TOF mass spectrometry: An experiment for the undergraduate laboratory.

Journal of Chemical Education 80(2), 177-180.

Henzel W. J., Watanabe C., Stults J. T. 2003 Protein identification: the origins of

peptide mass fingerprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry

14(9), 931-942.

Pappin D. J., Hojrup P., Bleasby A. J. 1993 Rapid identification of proteins by peptide-

mass fingerprinting. Current Biology 3(6), 327-332.

Calculs a. Calculez le temps qui prend les ions m/z 927.50 et 927.85 à se rendre au

détecteur si le voltage d’accélération utilisé dans le QTOF est de 15 kV et le trajet de

dérive est de 1 m. Quel serait le temps de vol de ces ions si le trajet de dérive est

doublé ?

b. Quel est l’avantage d’un trajet de dérive plus grand ?


- Discussion des résultats (spectres de masse, tableaux) en intégrant les réponses

aux questions suivantes :

a. Pourquoi utilise-t-on l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique comme matrice

en MALDI ?

b. Pourquoi l’identification des protéines par la méthode d’empreinte de masses

peptidiques est sensible au minimum de peptides requis pour l’identification, au

nombre maximal de clivages ratés et à la tolérance de l’erreur sur la masse ?

c. Selon les résultats du tableau sommaire, est-ce que vous pouvez être certain

que la protéine inconnue a été identifiée correctement ? Expliquez.

- Conclusion

- En Annexe :

a. Le spectre de masse de la protéine inconnue (section II, numéro 12).

b. Le tableau sommaire des résultats obtenus avec la plateforme Web MS-FIT

pour la protéine inconnue.

c. Le tableau des résultats détaillés pour la protéine ayant le pointage le plus

élevé.



Information Supplémentaire 1 : Acides aminés

Table A1. Structures et notation des acides aminés. Le pH physiologique est de

7,4±0,5

Information Supplémentaire 2 : Masses des acides aminés

Table A2. Masses des différents acides aminés

Code

à 1 lettre

Code à 3

lettres

Formule Masse

monoisotopique

(u)

Masse

moyenne

(u) A Ala C3H5ON 71.03711 71.0788 R Arg C6H12ON4 156.10111 156.1875 N Asn C4H6O2N2 114.04293 114.1038 D Asp C4H5O3N 115.02694 115.0886 C Cys C3H5ONS 103.00919 103.1388 E Glu C5H7O3N 129.04259 129.1155 Q Gln C5H8O2N2 128.05858 128.1307 G Gly C2H3ON 57.02146 57.0519 H His C6H7ON3 137.05891 137.1411 I Ile C6H11ON 113.08406 113.1594 L Leu C6H11ON 113.08406 113.1594 K Lys C6H12ON2 128.09496 128.1741 M Met C5H9ONS 131.04049 131.1926 F Phe C9H9ON 147.06841 147.1766 P Pro C5H7ON 97.05276 97.1167 S Ser C3H5O2N 87.03203 87.0782 T Thr C4H7O2N 101.04768 101.1051 W Trp C11H10ON2 186.07931 186.2132 Y Tyr C9H9O2N 163.06333 163.1760 V Val C5H9ON 99.06841 99.1326



Expérience 7 : Caractérisation des matériaux



EXPÉRIENCE 7 : CARACTÉRISATION DES MATÉRIAUX



Introduction

La pierre à chaux (souvent simplement appelée « chaux ») est composée de

carbonate de calcium (CaCO3) avec une teneur plus ou moins élevée en carbonate de

magnésium (MgCO3). Elle peut contenir plusieurs composés mineurs, par exemple de

la silice, des oxydes de fer, etc. Elle est classée en trois variétés :

- La chaux calcique

- La chaux magnésienne

- La chaux dolomitique

Après broyage, la pierre à chaux est utilisée pour neutraliser l’acidité des sols.

Pour cette application, le pouvoir neutralisant de la chaux est une caractéristique

importante. Le choix du type de chaux à appliquer dépend des besoins du sol en

calcium et en magnésium.

Avant d’utiliser la chaux dans l’industrie chimique, on lui fait souvent subir un

traitement :

Soit par chauffage, on la transforme en oxyde puis en hydroxyde de calcium :

CaCO3 → CaO + CO2 et CaO + H2O → Ca(OH)2

L’hydroxyde de calcium est une base forte mais peu soluble utilisée pour

ajuster le pH, neutraliser les acides, capter le SO2, etc.

Soit on la purifie par précipitation : mêmes étapes que ci-dessus, puis :

Ca(OH)2 + CO2 → CaCO3 + H2O

Le carbonate de calcium précipité est utilisé à grande échelle comme agent de

remplissage dans les industries du plastique, du papier, de la peinture, etc.

Note concernant les normes

Les composés d’importance industrielle sont régis par des normes. En

Amérique du Nord, ce sont généralement les normes ASTM qui s’appliquent. La

caractérisation de la chaux et des composés semblables est décrite dans la norme

ASTM C25, « C25-11 Standard Test Methods for Chemical Analysis of Limestone,

Quicklime, and Hydrated Lime » que vous trouverez à la bibliothèque, à la section

« Normes », dans le volume ASTM 04.01. Notez que :



- les normes contiennent des procédures d’analyse très détaillées. Ce sont de

bonnes sources de renseignements pour les chimistes analystes.

- S’il y a un différend entre deux sociétés concernant la qualité d’un produit,

les analyses doivent être faites conformément aux normes, et souvent, par les

méthodes les moins instrumentales.

Les normes ASTM couvrent plus de 80 volumes répartis en 15 sections. Vous

pouvez consulter ces sections à partir de la bibliothèque, BANQUES de données,

ASTM.

http://libguides.biblio.usherbrooke.ca/az.php?a=a

Pour vous familiariser avec les normes ASTM,

- consultez l’index du volume 04.01 :

(Recherchez : ASTM C25-11)

- Vous devriez pouvoir répondre aux deux questions suivantes :

- Dans la norme ASTM C25-11 (note : 11 signifie l’année de la dernière

révision), par quelle méthode est analysé le phosphate dans la chaux?

- Comment le résultat de l’analyse du phosphate est-il exprimé?


Objectifs

Le but de cette expérience est de caractériser un échantillon de pierre à chaux

ou autre échantillon de carbonate de calcium. Cette caractérisation se déroulera en

deux parties.

La première partie se déroulera dans les laboratoires du Département de

chimie :

- Préparation de l’échantillon

- Tamisage, séchage

- Perte au feu

- Détermination des phases et de la composition chimique approximative par

diffraction des rayons-X (DRX).

- Détermination du pouvoir neutralisant par titrage potentiométrique.

La deuxième partie se déroulera au Centre de caractérisation des matériaux de

l’Université :

- Analyse thermique différentielle (ATD) et analyse thermogravimétrique

http://libguides.biblio.usherbrooke.ca/az.php?a=a



couplée à la spectroscopie de masse (ATG-MS).

- Analyse élémentaire par fluorescence des rayons-X (FRF).

- Observation de la composition chimique en surface par microscopie

électronique à balayage (MEB) couplée à une microsonde.

Par cette caractérisation, les étudiants seront mis en contact avec une variété de

méthodes d’analyse modernes.

PREMIÈRE PARTIE : Préparation, DRX et Détermination du

pouvoir neutralisant (Au département de chimie)

Préparation de l’échantillon

Séchage

Normalement, les résultats d’analyses chimiques d’un solide sont exprimés sur

la base de la masse sèche de l’échantillon.

- Dans un pèse-tare en aluminium, peser précisément environ 30 g de chaux.

(Fait par le technicien avant le jour du laboratoire)

- Mettre à l’étuve à 120°C pendant trois heures et laisser refroidir dans un

dessiccateur. (Fait par le technicien avant le jour du laboratoire)

- Peser de nouveau puis remettre l’échantillon dans le dessiccateur. (Vous

devrez faire cette étape vous-même, votre échantillon de chaux vous attendra au

dessiccateur accompagné de la masse initiale)

- Exprimer le résultat en termes de pourcentage d’humidité de votre échantillon

de départ.

Note : Normalement, il faudrait remettre l’échantillon à l’étuve pendant une

autre période de trois heures pour vérifier si la masse est constante (dans le cadre d’un

laboratoire, nous n’avons pas le temps).

Tamisage

La granulométrie d’une chaux est une caractéristique importante directement

reliée à sa réactivité : plus elle est fine, plus elle est réactive.

Le but du tamisage dans cette expérience n’est pas de déterminer la

granulométrie de l’échantillon de chaux mais plutôt d’obtenir un échantillon le plus

homogène possible en y retirant les particules grossières. On peut noter que cette

opération peut modifier légèrement la composition chimique globale de l’échantillon.

En effet, le carbonate de calcium est un matériau relativement facile à broyer; des

impuretés difficiles à broyer, tel le quartz, un matériau dur, sont susceptibles de se



retrouver plus concentrées dans la fraction grossière de l’échantillon.

NOTE : Dès que vous aurez suffisamment de poudre tamisée, débutez le

titrage!

- Pesez le tamis micrométrique et le contenant récepteur. (Notez bien toutes les

informations)

- Transférez l’échantillon séché sur le tamis et peser de nouveau.

- Secouez (vigoureusement) le tamis pour que l’échantillon passe au-travers.

- Si nécessaire, utilisez mortier et pilon pour re-broyer votre chaux.

- Retirer le tamis du contenant récepteur. Frappez légèrement le tamis pour en

retirer toutes les particules fines. Pesez

- Enlevez les particules grossières et peser de nouveau.

- Exprimez votre résultat en termes du pourcentage de l’échantillon passant le

tamis micrométrique que vous avez utilisé.

Transférez l’échantillon tamisé dans un vial de 20 mL avec bouchon

hermétique. Cet échantillon sera utilisé pour toutes les autres expériences. Conservez

la partie de l’échantillon retenue sur le tamis pour un titrage acido-basique.

Perte au feu (PAF)

La perte au feu (PAF) (en anglais « loss on ignition » (LOI)) consiste à

chauffer à haute température un échantillon qui a normalement été séché auparavant.

Selon le type d’échantillon, la perte au feu peut comprendre :

- L’eau d’hydratation (ex. : CaSO4.2H2O → CaSO4 + 2 H2O)

- L’eau de structure (ex. : Ca(OH)2 → CaO + H2O)

- La matière organique qui se transforme en CO2 lors de la combustion

- La décomposition des carbonates (ex. : CaCO3 → CaO + CO2). Etc.

Pour un échantillon de chaux, la perte au feu est principalement due à la

décomposition des carbonates.

- Préchauffez le four à 400°C. (Utilisez le four avec délicatesse puisque ce type

de four est très dispendieux).

- Mettez deux creusets de porcelaine propres au four pendant ~15 minutes; les

laisser refroidir dans un dessiccateur.



- Pesez les creusets et transférer environ 4 g (pesés précisément) de

l’échantillon dans chacun.

- Couvrir (en laissant un espace pour laisser s’échapper les gaz de

décomposition) et insérer dans le four à 400°C pendant 30 minutes.

- Une fois la période de 30 minutes écoulée, augmentez la température du four

à 1000°C.

- Chauffez pendant 20 minutes à 1000°C puis retirer du four et transférer dans

un dessiccateur.

- Pesez. Transférez l’échantillon dans un vial de 5 mL avec bouchon

hermétique (il servira à l’analyse par fluorescence X)

- Exprimer le résultat en termes de pourcentage de perte au feu.

- En supposant que la perte au feu soit due uniquement à la décomposition des

carbonates, exprimer le résultat en termes de pourcentage de CaCO3 équivalent dans

l’échantillon.

Note : Normalement, on remettrait l’échantillon au four pour une autre période

de 20 minutes pour s’assurer que la masse est constante.

Diffraction des rayons-X

Remettre à Daniel Fortin environ 200 mg de votre échantillon original (avant la

perte au feu). Il va enregistrer le DRX et vous remettre les résultats. Dans le cadre du

cours CAN 400, Daniel vous présentera en détail les principes de l’analyse par rayon-

X, mais ces concepts seront aussi expliqué au cours de la séance s’information se

tenant à la première rencontre du cours CAN407.

Le diffractomètre est couplé à une banque de données qui permet d’identifier

directement les composés présents dans l’échantillon ou encore leurs formes

cristallines. Par exemple, le carbonate de calcium existe sous deux formes cristallines :

la calcite et l’aragonite. La DRX permet de distinguer ces deux formes.

Pouvoir neutralisant

Pour déterminer le pouvoir neutralisant de la chaux, une quantité connue est

dissoute dans un excès de HCl, puis l’excès est titré par NaOH. Vous avez déjà fait

beaucoup de titrages de HCl par NaOH. Cette fois, vous allez utiliser la technique

suivante:

• Titrage à l’aide d’un titrateur automatique



Titrateur automatique

Un titrateur automatique est extrêmement utile pour effectuer des titrages en

série, surtout s’il est couplé à un module échantillonneur. Le fonctionnement du

titrateur vous sera expliqué au laboratoire; vous pouvez consulter la documentation sur

le titrateur « Titrino751 GPD » sur le site de Metrohm :

http://www.metrohm.com/en/support-and-service/

Recherchez : Titrino751 GPD

--> Vous pouvez consulter « Short Instructions for Use 751 GPD Titrino » ou

« Quick References 751 GPD Titrino ». Le mode DET sera utilisé.

Vous devez d’abord vous familiariser avec le fonctionnement du titrateur

automatique en effectuant quelques titrages de HCl par NaOH.

*** Pour l’échantillon de chaux tamisé dans le tamis micrométrique ***

- Dans un bécher de 250 mL. pesez précisément environ 2,1 g de chaux.

- Ajoutez 50 mL de HCl 1 M et bouillir légèrement pendant 5 minutes pour

accélérer la dissolution et permettre l’expulsion du CO2 de la solution.

- Titrez l’excès de HCl par NaOH 1 M en utilisant le titrateur automatique.

- Exprimez le pouvoir neutralisant de la chaux en termes de pourcentage de

CaCO3 équivalent dans l’échantillon.

- Une fois le point d’équivalence de HCl atteint, poursuivre le titrage jusqu’à

pH ~ 11. S’il y a une quantité appréciable d’ions Mg2+ dans l’échantillon, un deuxième

point d’équivalence sera observé. Il devrait correspondre à la fin de la précipitation de

Mg(OH)2 en présence de NaOH.

- Calculez la concentration en magnésium dans votre échantillon; exprimer le

résultat en termes de pourcentage de MgO.

Pour déterminer si le tamisage a modifié la composition chimique de

l’échantillon, effectuez la même procédure de titrage, mais cette fois pour la partie

retenue sur le tamis. (Inclure à votre discussion)

SECONDE PARTIE : ATG/ATD, Fluorescence-X, MEB (Au CCM)

Note : Cette deuxième partie de la caractérisation d’un échantillon de chaux

sera effectuée au Centre de caractérisation des matériaux (CCM) situé à la faculté de

Génie. Le personnel du CCM vous expliquera en détail le fonctionnement des

instruments et les procédures d’analyse. LA PONCTUALITÉ EST OBLIGATOIRE!!!

Tout retard sera considéré comme injustifié et entrainera des manquements au niveau



de la formation offerte sa traduisant par des faiblesses aux rapports. RAPPEL :

Toutes les règles décrites au plan de cours CAN407 s’appliquent dans les locaux du

CCM.

Analyse thermogravimétrique (ATG) et analyse thermique différentielle (ATD)

Le document suivant a été préparé par un professionnel du Centre de

caractérisation des matériaux. En prendre connaissance avant d’effectuer les

expériences.

http://www.ccm.usherbrooke.ca/fr/services/ccm/LCG/pdf/analyse_thermique.pdf

Contrairement à la perte au feu, qui fournit un résultat global de la perte (ou

gain) de masse à une température donnée (ex. 1000°C), l’analyse thermogravimétrique

mesure la perte (ou le gain) de masse en fonction de la température. Connaissant la

température de décomposition de composés purs, ces données peuvent permettre

d’identifier des composés présents dans un échantillon, ou encore d’en exclure la

présence. Par exemple, l’hydroxyde de calcium, Ca(OH)2, se décompose en CaO et

H2O à 580°C. Une perte de masse d’un échantillon aux environs de cette température

indique la possibilité de présence de Ca(OH)2 dans l’échantillon, alors que l’absence

de perte de masse à cette température exclut la présence de Ca(OH)2 dans

l’échantillon.

L’analyse thermique différentielle mesure la différence de température entre

une cellule contenant l’échantillon et une cellule de référence, en fonction de la

température. Par exemple, la décomposition de l’hydroxyde de calcium est une

réaction endothermique; pendant la décomposition de ce composé, la température de la

cellule échantillon va être plus basse que celle de la cellule de référence. Dans ce cas,

l’ATG indique une perte de masse, et l’ATD un refroidissement de la cellule.

Autour de 580°C, le quartz β se transforme en quartz α. Cette transition

endothermique n’implique pas de perte de masse, donc aucun signal ne serait détecté

en ATG. Par contre, l’ATD indiquerait un refroidissement de la cellule échantillon.

• Avec l’appareil ATG couplé à l’ATD, enregistrer le thermogramme de votre

échantillon à partir de la température de la pièce jusqu’à 1000°C.

• S’il y a plusieurs plages de pertes de masse en fonction de la température,

essayer d’identifier et de quantifier les produits responsables de ces pertes de masse

(en vous aidant des résultats de l’analyse chimique par fluorescence X).

• Exprimer la perte de masse totale en termes du pourcentage de CaCO3

équivalent de votre échantillon.

• En comparant les signaux ATG et ATD, vérifier s’il y a des transitions

thermiques qui n’impliquent pas de perte de masse. Pour ce faire, vous devez amplifier



le signal ATD, car les transitions d’une forme cristalline à une autre sont en général

beaucoup moins endothermiques que les décompositions.

Analyse élémentaire par fluorescence - X

Le document suivant présente les bases de la fluorescence X. L’appareil que

vous allez utiliser est un spectromètre à dispersion de longueur d’onde.

https://www.youtube.com/watch?v=bPNV3jZW0ds --> Anxios Advanced

Fusion de l’échantillon

L’analyse par fluorescence X peut être effectuée directement sur un échantillon

solide, sans traitements préalables. Par contre, la précision des résultats est de

beaucoup supérieure si l’échantillon est d’abord solubilisé dans un fondant, ce qui

rend la matrice très homogène. Une fois l’échantillon solubilisé dans le fondant, il peut

être transféré dans un petit moule pour former un verre solide. Ce verre s’appelle une «

perle ». L’échantillon peut aussi être transféré dans une solution acide pour le

solubiliser et être ensuite analysé par absorption atomique, ICP, etc.

Le tétraborate de lithium est souvent utilisé comme fondant. Les masses

molaires très faibles du lithium et du bore font qu’ils émettent peu de fluorescence X.

Vous pouvez visualiser la vidéo suivante qui illustre le processus de fusion. (Note : le

fondant utilisé pour l’expérience est composé de 66.67 % de tétraborate de lithium

(Li2B4O7), 32,83 % de métaborate de lithium (Li3BO3) et de 0,5 % de bromure de

lithium (LiBr) comme agent pour aider au démoulage).

http://www.katanax.com/cgi/show.cgi?video.l=fr

L’étalonnage et mesure

L’appareil de fluorescence X est étalonné avec des standards préparés dans le

même fondant que l’échantillon de façon à minimiser les effets de matrice. Les

courbes d’étalonnage pour les différents éléments sont déjà intégrées dans la méthode

d’analyse.

Les résultats d’analyse sont souvent exprimés en termes de pourcentage

d’oxyde des différents éléments. Lors du traitement d’un l’échantillon à haute

température (perte au feu) dans une atmosphère oxydante (l’air), les composés volatils

(H2O; CO2; etc.) sont éliminés, et les métaux, si présents, sont transformés en leur

oxyde (stable à 1000°C). Pour cette raison, la somme des pourcentages de tous les

éléments présents dans un échantillon, exprimés sous la forme de leur oxyde stable à

1000°C, devrait égaler 100 % ou s’en approcher.

Microscopie électronique à balayage

https://www.youtube.com/watch?v=bPNV3jZW0ds



Vous allez observer un échantillon de chaux (pas nécessairement le vôtre) par

microscopie électronique à balayage (MEB). Le fort grossissement de ce microscope

permet d’observer la taille des grains, leur structure, etc. De plus, une microsonde

couplée au MEB permet de connaitre la composition chimique de surface d’un grain

(ou une partie d’un grain) de l’échantillon par rapport à un autre.

Calculs

- Déterminez le % d’eau dans la chaux avant le séchage

- Déterminez le pouvoir neutralisant de votre échantillon de chaux




- Mettez bien en évidence l’apport de chaque technique dans le cadre de cette

caractérisation.

- Aurait-on pu utiliser d’autres techniques analytiques pour obtenir les mêmes ou

davantage d’information sur l’échantillon étudié?

- Mettez TOUJOURS vos résultats en contexte!

- Vous devrez répondre aux deux questions suivantes :

* Dans la norme ASTM C25-11 (note : 11 signifie l’année de la dernière

révision), par quelle méthode est analysé le phosphate dans la chaux?

* Comment le résultat de l’analyse du phosphate est-il exprimé?

Voici quelques pistes supplémentaires pour votre discussion :

Les suggestions ci-dessous ne sont pas exclusives :

• Comparer les résultats des différentes analyses, leur niveau de précision, etc.

• D’après les résultats de fluorescence X, de perte au feu, de titrages et d’ATG,

est-ce que d’autres composés que CaCO3 et MgCO3 contribuent au pouvoir

neutralisant de la chaux?

• Définissez clairement ce qu’on entend par « pouvoir neutralisant », quels

sont les applications, ces applications sont-elles exclusives à la chaux?

• La sommation des pourcentages de tous les composés présents dans

l’échantillon, déterminés par fluorescence X se rapproche-t-elle de 100 %?

Commenter.

• Commenter l’utilité des différentes méthodes d’analyse que vous avez mises

en œuvre.

• Après la relâche, le module ATD sera remplacé par un module DSC, qui

permettra de déterminer la variation d’enthalpie des transitions de phase et des



réactions de décomposition lors de l’analyse thermique. À partir des enthalpies de

formation, calculer la variation d’enthalpie de la décomposition des carbonates de

votre échantillon, de façon à pouvoir comparer cette enthalpie à la valeur obtenue par

DSC.

Information Supplémentaire Plusieurs ouvrages sont disponibles à la bibliothèque de la Faculté des Sciences

sur la caractérisation des matériaux ainsi que sur chacune des techniques employées.

Faites en bon usage.



Expérience 8: Chromatographie ionique



EXPÉRIENCE 8 : CHROMATOGRAPHIE IONIQUE



La chromatographie ionique (CI en français et IC en anglais) est une version haute

performance de la chromatographie par échange d’ions. Elle trouve beaucoup

d’applications pour l’analyse des ions (ou des composés pouvant être ionisés) dans des

domaines tels que de l’eau, l’alimentation, les cosmétiques, le pharmaceutique, les semi-

conducteurs (pour suivre les traces d’anions ou de cations dans l’eau désionisée), etc.

Chromatographie par échange d’ions

Dans la chromatographie par échange d’ions, la rétention est basée sur l’attraction

électrostatique entre les ions du soluté et des sites chargés attachés à une phase

stationnaire. Sur une colonne échangeuse d’anions, des groupements chargés

positivement sont liés par un lien covalent à la phase stationnaire et attirent les anions du

soluté. A l’inverse, une colonne échangeuse de cations contient des groupements négatifs

fixes qui attirent les cations.

Les colonnes échangeuses d’ions

Les colonnes échangeuses d’ions consistent en un support (polymère, particules

de silice, etc.) sur lequel on peut greffer sur un noyau aromatique, par exemple, des

groupements fonctionnels acides ou basiques qui attirent soit les cations soit les anions.

Les groupements les plus fréquents sont les groupements ammonium NR3+ pour les

colonnes échangeuses d’anions (anex est une abréviation pour colonne échangeuse

d’anions) et le groupement sulfonate –SO3- pour les colonnes échangeuses de cations

(catex).

Figure 1. Illustration de la constitution de la résine ou support



Figure 2. (gauche) Phase stationnaire échangeuse de cation avec des groupements

sulfonates. (droite) Phase stationnaire échangeuse d’anions avec des groupements

ammonium.

Si on utilise l’acide méthacrylique au lieu du styrène, on fabrique un polymère

avec un groupement carboxylique

Une très grande variété de substrats peut être utilisée pour la fabrication de

colonnes échangeuses d’ions incluant les polymères d’esters, d’amides et des halogénures

d’alkyl. Les résines basées sur un copolymère de polystyrène et de divinylbenzène sont

les plus utilisées. Tel qu’illustré plus haut, la résine est essentiellement constituée de

polystyrène auquel on ajoute une quantité de divinylbenzène (DVB) pour la réticulation.

Cette réticulation confère à la résine sa stabilité mécanique et réduit considérablement sa

solubilité en augmentant le poids moléculaire de la chaîne du polymère. Dans bien des

cas, le nom de la résine indique le pourcentage de réticulation. Par exemple une colonne

Dowex 50X4 contient 4% de divinylbenzène.

Résines microporeuses et résines macroporeuses

Il y a deux types de résine utilisés pour la fabrication de colonnes échangeuses

d’ions : les résines microporeuses et les résines macroporeuses. Leurs propriétés

différentes proviennent du degré de réticulation et de leur procédé de fabrication. Pour les

résines microporeuses, on utilise de 2 à 25 % (typiquement 8 %) en poids de composé

réticulaire (ex : divinylbenzène) tandis que pour les résines macroporeuses, on utilise

jusqu’à 55 % de composé réticulaire.

Résine microporeuse

Après sa fabrication, la résine microporeuse est sous forme de billes uniformes et

solides mais microporeuses. La grosseur des billes dépend de la vitesse d’agitation lors de

la fabrication; une agitation plus rapide produit des billes plus petites. Après introduction

des groupements fonctionnels sur la résine, ces billes deviendront plus polaires. Un

désavantage de ce type de résine est que des solvants polaires comme l’eau la feront



gonfler alors que des solvants non polaires déshydrateront la résine et la feront rétrécir.

Ces résines microporeuses, souvent appelés « gels » lorsqu’elles ont un degré de

réticulation élevé, ont tendance à exclure les gros ions et la diffusion des ions de

dimensions ordinaires à travers le gel laisse à désirer. Les résines microporeuses sont

surtout utilisées comme support pour des colonnes constituées d’une pellicule de

gouttelettes de latex. Ce type de colonne est efficace et versatile. Nous verrons ces

colonnes plus loin.

Résine macroporeuse

La structure des billes de résine macroporeuse est formée d’une multitude de

microsphères interconnectées par des pores et des canaux. Parce que chaque sphère de

résine est constituée de milliers d'autres petites sphères (comme du maïs soufflé), la

surface des résines macroporeuses est beaucoup plus importante que la surface des

résines microporeuses. La surface spécifique d’un gel est de l’ordre de 1 m2/g tandis que

celle d’une résine macroporeuse peut être entre 25 et 800 m2/g.

Les résines macroporeuses sont remarquablement rigides à cause du haut degré de

réticulation. Elles sont particulièrement avantageuses lorsqu’on les utilise avec des

solvants organiques car elles ne gonfleront ni ne rétréciront avec la polarité du solvant.

Aussi elles ne font pas obstruction à la diffusion ou au procédé d’échange ionique comme

le font les gels car les ions peuvent pénétrer facilement leurs pores.

Le tableau ci-dessous présente un certain nombre de colonnes avec leur groupe

fonctionnel, la constitution de la résine, leurs noms commerciaux et la sélectivité de

différents ions

Les colonnes de résine de polystyrène possèdent une densité de charges tellement

importante que des macromolécules hautement chargées comme les protéines peuvent

être irréversiblement liées à la résine. Pour cela on a créé des colonnes dont les polymères

sont la cellulose ou le dextran, deux polymères du glucose. Le dextran réticulé avec la

glycérine (illustré ci-dessous) est vendu sous le nom commercial Sephadex. Parce que les

polymères de dextran et leurs proches parents sont beaucoup moins rigides que des

résines de polystyrène, on les appelle aussi des gels.



Figure 3. Colonne de type Sephadex

D’autres échangeurs d’ions macro poreux sont basés sur des polysaccharides

d’agarose et des polyacrylamide. Des groupements fonctionnels sont liés au groupement

hydroxyle du polysaccharide. Pour les échangeurs de cations sur gel on utilise les

groupements acides suivants :

Sulfopropyl (SP) --OCH2CH2CH2SO3H acide fort

Sulfoéthyl (SE) --OCH2CH2SO3H

Phosphate (P) --OPO3H2 acide moy. fort

Carboxyméthyle (CM) --OCH2CO2H acide faible

Pour les échangeurs d’anions sur gel, on utilise les bases suivantes :

Triéthylaminoéthyl (TEAE) --OCH2CH2N+(CH2CH3)3 base forte

Diethylaminoethyl (DEAE) --OCH2CH2N(CH2CH3)2 moyennement forte

p-aminobenzyl (PAB) --OCH2—Benzyl—NH2 base faible

Ex : DEAE-Sephadex réfère à un échangeur d’anions Sephadex avec des

groupements diéthylaminoéthyl

Colonnes utilisées pour la séparation des sucres

Les groupements –OH des sucres se dissocient partiellement en anions O- en

milieu basique; on peut les considérer comme des acides faibles. Le pKa de plusieurs

sucres est de l’ordre de 12 à 12,5. Comme ces sucres sont ionisés à pH élevé, on peut les



séparer par un mécanisme d’échange d’anions. La compagnie Dionex a développé une

colonne dont la résine sulfonée consiste en des billes de 10 µm de diamètre

(éthylvinylbenzène réticulé avec 55 % de divinylbenzène) sur lesquelles on a associé une

couche de particules de latex de 460 nm qui contiennent plusieurs groupements

ammonium quaternaire. Ces dernières particules sont réticulées à 5 %. Pour une particule

de résine de 5 µm on a estimé qu’il y avait ~28 000 particules ou billes de latex. La

structure de cette résine est illustrée ci-dessous.

Figure 4. Schéma d’une colonne de type Dionex

Cette résine agglomérée de latex est très stable chimiquement. Même une solution

de NaOH 4 M ne parvient pas à scinder le lien entre la résine et la pellicule de latex. De

plus, le support donne une stabilité mécanique et une pression de retour (backpressure)

modérée. Le grand nombre de billes de latex et leur location sur le substrat permettent un

processus d’échange rapide et ainsi une bonne efficacité. La compressibilité est réduite au

minimum.

La sélectivité des colonnes échangeuses d’ions

Si on considère la compétition des ions Na+ et Li+ pour les sites sur une colonne

échangeuse de cations de résine R-, le coefficient de sélectivité est donné par :

La sélectivité de la résine de polystyrène tend à augmenter avec l’augmentation du

degré de réticulation, comme l’indique le tableau ci-dessous, parce que le diamètre des

pores de la résine diminue. Les ions comme Li+, avec un rayon hydraté assez large, n’ont

pas un accès aussi facile sur la résine que des ions hydratés ayant un plus petit rayon.

Table 1. Sélectivité selon la nature de la colonne et des ions

R-Na+ + Li+ → R-Li+ + Na+

LiNaR

NaLiRK



En général les colonnes échangeuses d’ions favorisent les ions ayant une plus

grande charge, un rayon hydraté plus petit et une polarisabilité plus grande. La

polarisabilité c’est la propriété pour un nuage d’électrons autour d’un ion à être déformé

par une charge situé près de lui. La déformation du nuage d’électrons induit un dipôle sur

l’ion et l’attraction entre le dipôle induit et la charge sur la colonne raffermit le lien entre

l’ion et la résine. Un ordre de grandeur assez juste de la sélectivité de différents cations

est donné ci-dessous :

La rétention d’un ion sur une colonne échangeuse dépend de deux facteurs : le

coefficient de sélectivité de la résine pour cet ion et sa concentration. Même si Na+ est

plus retenu sur la colonne que Li+, le fait de laver une colonne sous forme Na+ avec un

excès substantiel de Li+ convertira la colonne Na+ sous forme Li+.

Les détecteurs en chromatographie ionique

La méthode la plus utilisée pour la détection en chromatographie ionique est de

choisir un éluant dont les ions ne seront pas détectables et de rendre les ions de

l’échantillon le plus détectable possible. Un détecteur à conductivité répondra à tous les

ions; les détecteurs UV-VIS, d'absorption atomique ou électrochimique, quant à eux,

peuvent être considérer sélectifs car ils ne répondent qu'à certains ions. Les détecteurs à

conductivité, UV-VIS et électrochimique sont les plus utilisés en CI.

Détecteur à conductivité

Un des détecteurs les plus employés est le détecteur à conductivité. Puisque

l’éluant est normalement un acide ou une base, de conductivité électrique très élevée, on

utilise ce détecteur le plus souvent avec un neutralisateur (en anglais on utilise le mot

suppressor) d’ions de l’éluant. Le neutralisateur confère au détecteur à conductivité une

grande sensibilité et un faible bruit de fond. Le neutralisateur est constitué de membranes

échangeuses d'ions et de filtres échangeurs d'ions. Il est intercalé entre la sortie de la



colonne et l'entrée du détecteur. Soit l’illustration suivante :

Figure 5. Illustration du fonctionnement du détecteur à conductivité

L'effluent sortant de la colonne (le composé KNO3, K2SO4 et l'éluant NaOH)

circulant dans le neutralisateur échange des cations pour des ions H+. D’un coté de la

membrane, où ils sont concentrés, les ions H+ diffusent de l’autre coté de la membrane

où ils sont peu nombreux. De la même façon, les ions K+ diffusent de l’autre coté de la

membrane. Ainsi les composés sont transformés en espèces H2SO4 et HNO3 ionisantes

et l'éluant, KOH, est transformé en H2O peu dissociée. Un acide minéral dilué, tel H2SO4,

circule à contre courant de l'effluent à travers les parties extérieures du neutralisateur

pour une régénération continuelle. Le débit du régénérant est de 3 à 10 fois le débit de la

colonne.

Ici nous avons expliqué le mécanisme d'un neutralisateur pour la chromatographie

ionique d'anions mais il existe la contrepartie pour la CI de cations où l’anion du

composé est remplacé par un anion venant de la membrane échangeuse d’anions du

neutralisateur. Dans ce cas le liquide qui circule dans le neutralisateur est une base.

(NaOH).

En 1992 la compagnie Dionex a introduit sur le marché un neutralisateur

électrochimique appelé un Self Regenerator Suppressor ou SRS. Dans le SRS l’ion

régénérant (H+ pour la CI d’anions) est produit par l’électrolyse de l’eau. Ceci a pour

avantage d’utiliser un petit débit pour l’eau qui sert de régénérant et d’éviter d’utiliser



d’autres sources chimiques comme les anciens systèmes. C’est ce système que nous

utiliserons dans nos expériences.

L’illustration ci-dessous décrit le mécanisme SRS en mode d’analyse des anions.

Les ions H+ générés par l’anode traversent la membrane échangeuse de cations pour

neutraliser l’éluant basique. Les contre ions Na+ sont attirés par la charge négative de la

cathode et traversent la membrane, pour maintenir l’électro-neutralité de la chambre

cathodique, en se pairant aux ions hydroxydes. L’oxygène du côté de l’anode et

l’hydrogène du côté de la cathode sont éliminés avec une solution aqueuse de NaOH.

Figure 6. Mécanisme SRS en mode d’analyse des ions

La chromatographie ionique sans neutralisation de l'anion ou du cation de l'éluent

(non-suppressed ion chromatography; abréviation NSIC) est possible à trois conditions :

1. L’utilisation d’une colonne échangeuse de cations ou d’anions à faible capacité

est obligatoire (0.007 à 0.04méq/g).

2. L’utilisation d’un éluant à faible concentration ionique et par le fait même de

faible conductivité.

3. les ions de l’éluant ont, d’une façon significative, une conductivité équivalente

plus faible que celle des ions analysés.

Les anions d’acide forts peuvent être séparés en solution acide ou basique. Les

anions d’acide faible, quant à eux, ne peuvent exister sous forme anionique qu’en

solution basique. La séparation des anions borate, silicate, sulfite ne peut se faire avec un

suppresseur car ces anions sont convertis en espèces faiblement conductrices. Cependant

ces anions peuvent être séparés par NSIC.

Même si un grand nombre d’anions organiques peuvent être séparé par « NSIC »,

cette méthode n’est pas toujours viable. Les anions d’acides organiques de petite taille

peuvent être détectés par conductivité mais il en est autrement lorsque la taille devient

plus grande. Dans ce cas, la conductivité approche celle de l’éluant et la sensibilité à la

détection disparaît.



Détecteur UV-Visible

Le détecteur spectrophotométrique est très utile en chromatographie ionique. C'est

un détecteur sélectif et sa sélectivité peut être facilement changée en sélectionnant la

longueur d'onde. Les métaux alcalins ne sont pas détectés en UV. Cependant beaucoup

d'anions absorbent à de basses longueurs d'onde; en voici une liste.

Table 2. Solutés par détection spectrophotométrique directe après une séparation

par chromatographie ionique

Les composés aromatiques ont une bonne absorption dans l'UV et des méthodes

très puissantes existent pour détecter leurs ions.

L'utilité de la détection UV directe peut paraître limitée si on considère que les

sulfates ne sont pas détectés par UV et que les chlorures, phosphates et autres sont

difficiles à détecter (ces anions, par contre, peuvent facilement être détectés avec un

détecteur à conductivité). D'autre part les anions qui sont difficiles à détecter peuvent être

d'excellentes phases mobiles anioniques.

Détection spectrophotométrique indirecte

Dans cette méthode, on utilise une phase mobile qui absorbe dans l’UV et on

mesure la diminution de l’absorbance lorsque les ions transparents à l’UV de

l’échantillon éluent de la colonne et remplacent dans le détecteur les anions de l’éluant.

Cette méthode permet d’analyser les anions difficiles à détecter par spectrophotométrie

directe (chlorure, phosphate, sulfate, etc.). La figure ci-contre illustre la détection

spectrophotométrique d’anions transparents à l’UV (phase mobile le phtalate de sodium



2,0 mM à pH 6 et une détection indirecte à 280nm.

Dans la détection spectrophotométrique indirecte, la concentration de l’anion de

l’éluant doit être assez élevé pour éluer le composé d’intérêt, et doit excéder la

concentration de ce dernier au maximum du pic sans pour cela être trop élevé pour

augmenter considérablement le bruit de fond. En fait l’anion choisi pour la détection

indirecte doit avoir une grande affinité pour la colonne échangeuse d’ions pour pouvoir

l’utiliser à une concentration relativement basse.

L'absorbance des complexes métalliques de chlorure est utilisée pour détecter des

ions métalliques en CI. Les longueurs d'onde maximum d'absorption de ces complexes

métalliques de chlorure sont données ci-dessous :

Table 3. Formation de complexes d'anions inorganiques avec un réactif colorant

de perchlorate ferrique (0,8 M HClO4, 0,05 M Fe(ClO4)3

Ces anions sont détectés par une méthode post-colonne. Le réactif de perchlorate

ferrique est ajouté avec l’effluent, dans un réacteur, à la sortie de la colonne. Le complexe

de perchlorate ferrique est incolore mais beaucoup d'anions forment des complexes avec

le fer et forment des espèces colorées qui sont détectées.

Les détecteurs électrochimiques

Les détecteurs électrochimiques comprennent les détecteurs potentiométriques,

ampérométriques et conductométriques. Les détecteurs potentiométriques mesurent le

voltage, les détecteurs ampérométriques, le courant, et les détecteurs conductométriques,

la résistance (vus plus haut).

Les détecteurs potentiométriques opèrent sur le même principe que les électrodes

sélectives d’ions. Une électrode indicatrice mesure un changement de potentiel en

présence de certains ions. Une électrode d’argent recouverte d’un sel (ex. : AgCl,) peut

utiliser pour l’analyse des halogénures et les pseudos halogénures (CN-, SCN-, S2O3-,

etc.). Une électrode d’argent répond rapidement et d’une façon reproductible à l’activité

d’ions Ag+ en solution. À 25°C :



Si l’électrode d’argent est recouverte d’un solide légèrement soluble (AgX), aAg+

est déterminé par le produit de solubilité de AgX :

Ks = aAg+ . aX- aAg+ = Ks/aX-

E = E° + 0,0592 log Ks/aX-

Les détecteurs ampérométriques sont des détecteurs très sélectifs et très sensibles

utilisés dans la séparation par CI. Ils sont sélectifs parce qu’ils opèrent sur les principes

de l’oxydation et de la réduction des substances à l’électrode. Le potentiel nécessaire est

différent pour chaque ion, la sélectivité est contrôlée aussi par la grandeur du potentiel

appliquée à la cellule, le matériel utilisé pour l’électrode (ex. : or, platine) et le pH de la

solution

Ces détecteurs peuvent mesurer des nano ampères ce qui peut correspondre à des

concentrations de pico-équivalents. Ils ont un large domaine de réponse (3 à 4 ordre de

grandeur), un petit volume mort (aussi bas que 1 µL), ils sont simples, peu dispendieux et

fiables. Ils ont cependant certains désavantages : Ils sont sensibles au débit d’éluant et au

pH. Des traces de substances, tel l’oxygène, peuvent réagir dépendant du type d’électrode

et du potentiel appliqué. Les électrodes d’or sont moins sensibles que les électrodes de

platine à l’oxygène.

En principe n’importe laquelle espèce chimique peut être détecté avec le voltage

approprié. En pratique, le domaine de potentiel utilisable est limité entre –1,5V à +1,5V.

Dans la partie négative du domaine, le potentiel est limité par la réduction de l’oxygène

dissous dans la phase mobile et dans l’échantillon. Si l’oxygène a été retiré, on est quand

même limité par la réduction de l’eau en hydrogène. Dans la région positive du domaine

on est limité par l’hydrolyse de l’eau et la production d’oxygène.

Le détecteur à indice de réfraction

Ce détecteur peut être considéré comme un détecteur universel parce que

n’importe laquelle substance ajoutée à l’eau provoquera un changement de l’indice de

réfraction. Il a été utilisé autant pour la séparation des anions que pour les cations. Le

détecteur à indice de réfraction permet un grand éventail dans la sélection de l’éluant, du

pH, et de la force ionique. En principe ce détecteur peut remplacer un détecteur à

conductivité ou un détecteur UV dans plusieurs séparations. On a rapporté un seuil de

détection de 20 à 50 ng pour des anions communs comme les nitrates, les chlorures et les

sulfates, comparativement à un seuil de 1 à 5 ng avec un détecteur à conductivité.

Conditions opératoires pour la chromatographie ionique d’anions

Plusieurs paramètres peuvent être variés pour obtenir une bonne séparation dans

E = E° + 0,0592 log aAg+



un temps minimum.

Le choix de la résine Des changements dans la composition chimique peuvent

altérer la sélectivité. Par exemple un groupement éthanolamine au lieu d’un groupe

méthyl dans la fonction d’ammonium quaternaire augmente l’affinité de OH- pour la

colonne et fait en sorte que NaOH et KOH sont des phases mobiles plus fortes.

La capacité de la colonne Une capacité de colonne plus petite donnera une élution

plus rapide et permettra un éluant de plus faible concentration. Les ions divalents sont

plus affectés que les ions monovalents par ce changement. La capacité d’une résine peut

être définie comme étant le nombre de milliéquivalents de sites chargés par gramme de

résine sèche.

Le diamètre de la colonne Pour un même débit, l’utilisation d’une colonne de

diamètre plus petit donnera une élution plus rapide.

Force de la phase mobile

Les phases mobiles anioniques varient beaucoup dans leur habilité à éluer les

anions. Un anion avec une charge plus élevé tel que le carbonate possède un plus grand

pouvoir éluant qu’un ion monovalent. Voici une liste d’éluant utilisé avec la CI à

neutralisation d’anions.

Table 4. Liste d’éluant utilisé avec la CI à neutralisation d’anions

Un mélange de bicarbonate de sodium et de carbonate de sodium est souvent

utilisé. Le carbonate, avec une charge de –2, est un éluant plus fort que le bicarbonate.

En variant la proportion des deux on peut ajuster la force de l’éluant. Avec l’apparition de

colonne ayant une grande affinité pour l’anion OH- et des neutralisateurs tolérant une

plus grande concentration de l’éluant, l’utilisation de KOH ou NaOH devient plus

populaire.

La concentration de la phase mobile Une plus grande concentration de la phase

mobile anionique amène des temps de rétention plus courts.

L’utilisation de solvants organiques (ex. : méthanol, acétonitrile) dans la phase

mobile à un pourcentage de 10 à 20% peut assurer une plus grande solubilisation de

certains composants de l’échantillon. Une autre fonction des solvants organiques est

d’assurer la compatibilité entre les ions de l’échantillon et la colonne constituée souvent



de composés hydrophobiques. Le « tailing » des pics des anions polarisables est réduit

par l’emploi de solvants organiques.

Choix d’une colonne

On trouve sur le marché un grand choix de colonnes. Il devient même difficile de

faire un choix judicieux. Dans le tableau suivant vous trouverez les colonnes échangeuses

d’anions de la compagnie Dionex avec certaines de leurs caractéristiques et leurs

recommandations d’utilisation. Vous pouvez trouver d’autres informations comme la

phase mobile à utiliser et des chromatogrammes pour ces colonnes sur leur site Internet.

Toutes les colonnes de ce tableau sont des colonnes avec un film de latex comme

expliqué plus haut. Le groupement fonctionnel de la colonne responsable de l’échange

anionique est un groupement d’ammonium quaternaire fixé sur le latex. Ces colonnes ont

été spécifiquement construites pour l’utilisation avec un détecteur conductimétrique en

mode de neutralisation d’anion de l’éluant, mais elles peuvent convenir pour d’autres

modes de détection.

Table 5. Colonnes échangeuses d’anions de la compagnie Dionex

(H = High, M = medium, L = low)

Conditions opératoires pour la chromatographie ionique de cations

Les colonnes utilisées en chromatographie ionique de cations sont presque toutes

de faible capacité; alors, une phase mobile de faible concentration peut être utilisée. Ces

colonnes sont obtenues par la sulfonation superficielle de petites sphères de copolymère

de styrène-DVB. Ces petites sphères sont traitées avec l’acide sulfurique concentré pour



former une mince couche de groupements d’acide sulfonique à la surface. La capacité

finale de la résine dépend de l’épaisseur de la couche, du type de résine, du diamètre des

sphères, de la température et du temps de contact avec l’acide sulfurique.

Table 6. Liste des différentes colonnes disponibles commercialement est présentée ici.

Depuis peu, la tendance dans la chromatographie de cations est d’utiliser des

résines avec des fonctions d’acides faibles. Un groupement carboxylique sera

complètement sous la forme anionique à des valeurs de pH plus élevés que son pKa. En

travaillant à des pH plus acides, l’ionisation du groupement carboxylique est diminuée et

l’affinité de la colonne pour l’échange d’ions est diminuée. Ainsi le contrôle du pH de

l’éluant ainsi que sa force ionique permet d’obtenir le degré de séparation voulu. La

colonne de Alltech « universal cation » contient de petites sphères enrobées d’un

copolymère de butadiène et d’acide maléique qui lui donne sa fonction d’échangeuse d

‘ions. L’acide maléique possède deux groupements carboxyliques par molécule pK1 =

2.0, pK2 = 6.3 et retient son caractère anionique à un des valeurs de pH plus acides qu’un

simple acide carboxylique.

Dans le tableau précédant il y a des colonnes avec des groupements fonctionnels

mixtes. Un groupement d’acide phosphorique possède un pKa intermédiaire entre un

acide carboxylique faible (pKa 4 à 5) et un groupement fortement acide tel l’acide

sulfonique. En incorporant un groupement carboxylate et un groupe phosphate, cela

permet de moduler l’efficacité de la colonne échangeuse d’ions en variant le pH sur un

plus grand domaine. En commençant à un pH de 5, une réduction du pH de l’éluant

permet de protonner d’abord l’acide carboxylique mais le groupement phosphate

demeure sous la forme anionique. En diminuant encore le pH le groupe phosphate se

protonne graduellement et l’efficacité de la colonne échangeuse d’ions est réduite.

Séparation des cations avec des phases mobiles ioniques

Dans ce type de séparation, les différents cations des composés compétitionnent

avec le cation de la phase mobile pour les sites de la colonne échangeuse d’ions et

avancent dans la colonne à différentes vitesses. L’éluant choisi dépend des cations à

séparer, du type de colonne et du détecteur. Dans plusieurs cas, l’emploi d’une solution

d’un acide fort tel l’acide chlorhydrique, sulfurique ou méthanesulfonique est satisfaisant.



Les cations communément séparés sont les ions des métaux alcalins, alcalino-terreux,

l’ion ammonium, des ions d’amines organiques et des ions d’alcanol-amines. La plupart

des autres métaux sont séparés avec un éluant contenant un complexant faible.

Figure 7. Séparation rapide d’ions alcalins, alcalino-terreux et ammonium avec une

colonne Dionex CS12A à double fonction. Phase mobile : 15 .5 mM H2SO4. Détection :

conductivité avec neutralisation. Pics : 1=lithium (0,05 ppm); 2=sodium (2 ppm);

3=ammonium (2,5 ppm); 4=potassium (5 ppm); 5=magnésium (2,5 ppm); 6=calcium (5

ppm).

L’analyse des cations peut s’effectuer autant en mode de neutralisation de la

conductivité (le cation de la phase mobile est neutralisé et le contre anion du métal

associé au composé est échangé pour un ion hydroxyde plus conducteur) qu’en mode de

conductivité directe. Cependant la limite de détection des métaux alcalins en mode de

neutralisation de conductivité est 12 à 20 fois plus faible. On obtient quand même avec le

mode de détection directe une bonne sensibilité et un avantage : c’est que la phase mobile

demeure acide et que l’ion métallique ne peut précipiter aussi facilement que s’il était

dans un milieu basique comme c’est le cas en mode de conductivité avec neutralisation.

Avec une colonne contenant des groupes carboxyles et des groupements

phosphates il est possible de séparer des ions monovalents et divalents dans la même

analyse. On utilise généralement un acide fort comme l’acide méthanesulfonique.

Un avantage certain du mode de détection avec neutralisation c’est qu’on peut

employer un gradient de concentration de l’éluant. L’augmentation de l’acidité sert à

réduire l’efficacité de la colonne dans sa capacité comme échangeuse d’ions et d’éluer

plus rapidement les ions qui ont un temps de rétention plus long. Voici un

chromatogramme avec gradient.



Figure 8. Exemple d’élution impliquant l’utilisation d’un gradient de concentration

Phases mobiles ioniques et détection spectrophotométrique

D’autres phases mobiles ioniques comme des bases aromatiques protonnées ont

été utilisées mais cette fois-ci avec un détecteur spectrophotométrique en mode indirect,

c’est-à-dire que le détecteur est fixé à la longueur d’onde d’absorption (ou près de) de la

phase mobile ce qui donne une ligne de base avec une haute absorbance, et lorsque le

composé qui n’absorbe pas à cette longueur d’onde élue, on observe un pic négatif. La

conductivité équivalente de ces bases est assez faible pour en permettre l’utilisation en

mode NSIC, mais la détection et la séparation est meilleure en mode de

spectrophotométrique indirecte. Voici une liste partielle de bases aromatiques pouvant

être utilisées comme éluant.

Table 7. Liste de composés aromatiques pouvant servir d’éluants

Ces amines forment des cations de charge +1 à l’exception des amino-pyridines

lesquelles forment des cations de charge +2. Une séparation des métaux alcalins requiert

par exemple ~0,1 mM de phénylethylamine ou 4-méthylbenzylamine.

Les chromatogrammes suivants de métaux alcalins comparent la détection par

conductivité directe avec la détection spectrophotométrique indirecte dans l’UV.



Figure 9. Comparaison entre les modes de détection par conductivité et en mode

spectrophotométrique UV indirect.

Voici la limite de détection (LOD/(ppb)) calculée pour certaines phases mobiles

avec une détection par UV indirecte :

Table 8. LOD en ppb pour certaines phases mobiles pour détection UV indirecte.

Les solvants organiques comme phase mobile

En chromatographie ionique, il n’y a pas seulement un simple mécanisme

d’échange d’ions. Il y a aussi des interactions hydrophobes entre les cations de

l’échantillon et la résine qui entrent en jeu. Une bonne séparation dépend aussi bien des

différences dans l’attraction hydrophobes entre les ions du soluté et la colonne

échangeuse que des différences dans l’attraction électrostatique.

L’utilisation d’une phase organique permet à l’ion inorganique d’être solvaté par

des molécules organiques au lieu d’être solvaté par des molécules d’eau, ce qui rendrait

la colonne et le soluté plus compatible. En incorporant des solvants organiques dans

l’éluant, ceci a pour effet aussi d’augmenter la solubilité des solutés organiques. Il est

préférable de d’utiliser un mélange eau solvant organique comme éluant que d’utiliser

seulement un solvant organique. L’utilisation de solvants organiques tels le méthanol,

l’éthanol, le 2-propanol, et l’acétonitrile avec des résines macroporeuses permet des

séparations qui sont très difficiles à effectuer avec des solvants aqueux.

Séparation de cations avec des phases mobiles complexantes



Les séparations discutées jusqu’ici étaient possibles parce qu’il les cations avaient

des affinités différentes pour la colonne échangeuse de cations. Cependant les métaux de

transition divalents tels les lanthanides et un certain nombre d’autres métaux sont très

difficiles à séparer parce que leurs affinités pour la colonne sont trop semblables. En

ajoutant un agent complexant faible comme le tartrate, le citrate ou l’oxalate à l’éluant,

les ions métalliques à séparer sont complexés partiellement et convertis en complexes

possédant une charge plus basse ou pas de charge du tout. Une certaine portion de chaque

métal demeure avec la charge originale du cation. Le résultat net est que la séparation

s’effectue plus rapidement et qu’elle est meilleure.

Le ligand, la concentration et le pH de l’éluant doivent être choisis pour que la

complexation des ions métalliques soit partielle. Si les ions métalliques sont trop

complexés, ils seront élués trop rapidement et il n’y aura aucune séparation. Pour une

élution efficace de métaux divalents, un éluant cationique tel le cation

éthylènediammonium (H3NCH2CH2NH3) est nécessaire. Les cations divalents sont élués

facilement avec de l’éthylènediammonium tartrate 2.0 x 10-3 M à pH entre 4 et 5 mais pas

avec un éluant contenant du sodium ou de l’ammonium tartrate. Les ions Mg(II) Zn(II),

Co(II), Mn(II), Cd(II), Ca(II), Cs(II), Sr(II), Pb(II) peuvent être séparés.

Figure 10. Séparation de Zn(II) (10,3 ppm), cobalt (II) (9,1 ppm), Mn(II) (160 ppm),

Cd(II) (16,1 ppm), calcium (II) (17,1 ppm), Pb et Sr (20,3 ppm). Phase mobile 1.5 mM

cation éthylènediammonium et 2,0 mM de tartrate à pH 4.

Références

- James S. Fritz, Douglas T.Gjerde Ion chromatography Third Ed . QD 79 C453F75 2000

S



- Daniel C. Harris Quantitative Chemical Analysis Sixth Ed.


Conditions opératoires

• Colonne analytique : Methrohm Metrosep A Supp 250 mm x 4.0 mm ID

• Température : ambiante

• Volume d’injection : 20 µL

• Phase mobile : 1,8 mM Na2CO3 + 1,7 mM NaHCO3

• Débit : 1,1 mL/min

• Détecteur : Methrohm IC Conductivity Detector

Figure 11. Exemple de séparation chromatographique pour les anions.

Les temps de rétention que vous obtiendrez peuvent différer de ceux qui sont

représentés dans cette figure.

Préparation des échantillons

Dans toutes les manipulations, utiliser seulement l’eau désionisée 18 MΏ

(bouteille de 4 litres fournie à cette fin).

Étalonnage

• Solution-mère 100,0 ppm (mg/L) contenant les anions suivants : fluorure (F),

chlorure (Cl), bromure (Br), nitrate (NO3), phosphate (PO4) et sulfate (SO4).

• À partir de la solution stock 100 ppm, préparez dans des ballons jaugés de 100

mL des solutions 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 et 10,0 ppm pour l’établissement de la courbe

d’étalonnage en 6 points (incluant 0 ppm). Diluer avec de l’eau désionisée 18 MΏ

• Filtrez ~ 15 mL de chaque échantillon sur nylon 0,45 µm et placer dans un

flacon Nalgene.



Échantillon inconnu (PRIORITÉ)

• Filtrez ~ 15 mL de l’inconnu sur nylon 0,45 µm et placer dans un flacon

Nalgene.

• Exprimez vos résultats en ppm pour chaque anion présent.

Eau potable de la ville de Sherbrooke

• Laissez couler l’eau froide du robinet environ 2 minutes avant d’en recueillir un

peu dans un bécher de 100 mL.

• Filtrez ~ 15 mL sur nylon 0,45 µm et placer dans un flacon Nalgene.


Eau provenant d’un lac ou d’une rivière (2 échantillons)

• Filtrez environ ~ 15 mL de chaque échantillon sur nylon 0,45 µm et placer dans

un flacon Nalgene.


Eau minérale embouteillée

• À partir des concentrations en anions indiquées sur l’étiquette, choisir les

dilutions pour que chaque anion à doser soit dans les mêmes concentrations que votre

courbe d’étalonnage. Si nécessaire, diluer avec l’eau désionisée 18 MΩ.

• Filtrer ~ 15 mL de chaque solution sur nylon 0,45 µm dans un flacon Nalgene.

• Exprimer vos résultats en ppm pour chaque cation présent.

Rince-bouche Listerine

• Bien agiter la bouteille avant les dilutions.

• Dans un ballon jaugé, préparer une dilution de 20X avec de l’eau désionisée 18

MΩ pour le dosage du fluorure et 2000X pour le dosage du nitrate.

• Filtrez ~ 15 mL de chaque solution sur nylon 0,45 µm et placer dans un flacon

Nalgene.

• Exprimez vos résultats en pourcentage (% p/v) de fluorure de sodium (NaF) et

de nitrate de potassium (KNO3). Comparer vos résultats avec les valeurs de l’étiquette.

Note : Le mode opératoire de l’instrument vous sera fourni par le démonstrateur

Calculs - Déterminez la teneur en ion de chaque solution. Assurez-vous au minimum d’avoir le

résultat en triplicatas pour l’inconnue, afin de faire une étude statistique.






- Démontrez que vous comprenez bien le principe de la chromatographie ionique.

- Proposez d’autres approches analytiques pour déterminer ou contrevérifier les valeurs

déterminées.

- Comparez vos valeurs avec la littérature disponible.




Expérience 9 : Fluorescence et Spectroscopie UV d’absorption



EXPÉRIENCE 9 : FLUORESCENCE ET SPECTROSCOPIE UV D’ABSORPTION



La fluorescence est l’émission d’un rayonnement à une longueur d’onde plus

élevée, donc moins énergétique que celle du rayon incident absorbé par une molécule. La

majorité des molécules possèdent un nombre pair d’électrons et à l’état fondamental, ils

sont regroupés par paires et chaque paire se retrouve sur une orbitale moléculaire. Deux

électrons ne peuvent occuper une même orbitale que s’ils sont pairés, c’est-à-dire que

leurs champs magnétiques, associés à leur rotation, sont de sens inverse. Lorsque dans

une molécule les spins des électrons sont pairés, ils sont dans un état singulet dénommé

S0, S1, etc.; alors que si les électrons ne sont pas pairés, on dit qu’ils sont dans un état

triplet. Ces états sont appelés triplets parce que lorsqu’ils sont soumis à un champ

magnétique, ils se séparent en 3 sous-états d’énergie légèrement différente. Le plus bas

état triplet s’appelle T1. Pour chaque état singulet, il y a un état triplet.

La figure suivante (Skoog), appelé diagramme de Jablonski, illustre des

transitions de niveaux d’énergie électroniques et de vibration lorsqu’il y a absorption

d’un photon. Les lignes foncées représentent les niveaux vibrationnels fondamentaux des

niveaux électroniques, alors que les lignes plus fines représentent les niveaux d’énergie

vibrationnelle.



Figure 1. Diagramme de Jablonski résumant les différents processus en spectroscopie

moléculaire. (NOTE : Comprendre et assimiler cette figure est essentiel à votre

apprentissage en chimie)

À la température de la pièce, la grande majorité des molécules se trouvent sur le

plus bas niveau d’énergie électronique et vibrationnel, habituellement un état singulet S0

(note : l’état fondamental de O2 est un état triplet). Lorsqu’une molécule absorbe un

photon, un électron d’une de ses orbitales moléculaires est promu à un niveau

électronique et vibrationnel supérieur, tel qu’illustré sur la figure ci-haut, où la longueur

des flèches est proportionnelle à l’énergie. On dit alors que la molécule est dans un état

excité. L’électron promu peut posséder un spin opposé (comme sur le niveau d’où il est

parti) ou un spin parallèle (dans le même sens) dans lequel cas nous avons un état triplet.

L’excitation de molécules, à partir du niveau fondamental, qui implique des

transitions S0→S1, S0→S2, S0→S3 ne peut s’effectuer que par l’absorption de radiation de

longueur d’onde progressivement plus courte (plus énergétique). La transition d’un

niveau électronique fondamental à un état excité triplet est très peu probable; c’est la

raison pour laquelle cette transition n’est pas représentée sur le diagramme. Les

molécules ne peuvent accéder à un état triplet, à partir d’un état singulet, qu’en passant

par un procédé qu’on appelle conversion externe (inter-system crossing) ou dans certains

cas, en passant par un autre processus telle une réaction chimique. Une transition triplet



→ singulet, même si elle est beaucoup moins probable qu’une transition singulet →

singulet, va quand même se produire pour abaisser l’énergie de la molécule. C’est ce

qu’on appelle de la phosphorescence. Les temps caractéristiques des phénomènes sont

intéressants : transition par absorption d’un photon ~ 10-15 s; émission par fluorescence ~

10-8 s et émission par phosphorescence, beaucoup moins probable, de 10-4 s à plusieurs

heures.

Illustrons les différences entre les niveaux d’états électroniques à l’aide de

diagrammes représentant les orbitales moléculaires et la molécule d’acétone. La

molécule d’acétone possède un système π dû à la présence d’un lien double C=O et d’une

paire d’électrons libres sur l’atome d’oxygène. Le premier diagramme illustre la

configuration pour le niveau fondamental S0. Les orbitales occupées (2 électrons) sont

l’orbitale σ (liante), l’orbitale π (liante) et l’orbitale n (non-liante) en ordre croissant

d’énergie. Les orbitales inoccupées sont les orbitales π* et σ* (deux orbitales anti-

liantes).

Figure 2. Illustration des orbitales moléculaires pour la molécule d’acétone

À l’état excité, les deux électrons occupant des orbitales différentes peuvent

posséder des spins parallèles, c’est-à-dire s’aligner dans la même direction.

Figure 3. Illustration de l’état excité avec des spins parallèles

Les configurations des états triplets T1 et T2 correspondant aux états S1 et S2 sont

les suivantes :



Figure 4. Configurations triplet, T1 etT2 correspondant à S1 et S2

Chez les molécules organiques, il y a deux types de transitions importantes. Ce

sont les transitions n→π* et π→π*. Pour l’acétone, la transition n→π* implique une des

paires d’électrons libres sur l’atome d’oxygène situé sur une orbitale non-liante. La

transition π→π* implique une des paires d’électrons de l’orbitale π du groupement C=O.

Pour les molécules simples, comme l’acétone, la transition n→π* est de plus

basse énergie mais pour les molécules plus complexes comme dans les cétones

aromatiques, qui possèdent plusieurs orbitales π liantes et anti-liantes, ce n’est pas

toujours le cas.

D’habitude, dans l’ultraviolet, le mode d’absorption, nous observons pour les

liquides une bande large avec un contour régulier. La perte de la structure fine du spectre

est causée surtout par les interactions entre les molécules de la phase liquide. Ceci cause

un petit décalage dans les niveaux d’énergie des molécules individuelles, tout

particulièrement si la molécule est polaire et qu’elle est dissoute dans un solvant polaire.

Cependant, avec certaines molécules, il est possible d’observer les bandes

d’absorption pour chacune des transitions comme l’illustre le spectre du benzène sur la

figure ci-dessous. L’intensité des pics est directement proportionnelle à la probabilité de

la transition.



Figure 5. Spectre d’absorption du benzène illustrant les différentes transitions possibles

L’énergie vibrationnelle des molécules excitées est rapidement dissipée par des

collisions avec d’autres molécules et par d’autres processus qui sont plus rapides que

l’émission directe d’un photon à partir d’une molécule excitée. En effet, le temps que

passe une molécule dans l’état excité est de l’ordre de 10-8 s. Cette durée de vie

apparemment très courte est très longue si on la compare à d’autres phénomènes à

l’échelle moléculaire.

Concept ESSENTIEL à la compréhension de plusieurs phénomènes :

• Le temps d’une transition entre deux états électroniques : 10-15 s

• Le temps d’une vibration moléculaire : 10-14 s

• Le temps d’une rotation moléculaire : 10-11 s

• Le temps moyen entre deux collisions pour une molécule à l’état liquide à la

température ambiante : 10-12 s

Ceci signifie que pendant la durée de vie d’un état excité d’une molécule, il peut

se produire (10-8/10-14) 1 000 000 de vibrations, 1000 rotations et 10000 collisions avant

que cette molécule ne retourne à l’état fondamental par l’émission de fluorescence.

Conséquemment, en moins de 10-10 seconde, une molécule retombe au niveau

vibrationnel fondamental. Ce processus s’appelle la relaxation vibrationnelle représentée

sur la première figure. Lorsque la fluorescence se produit, elle a comme origine le niveau

S1 mais peut se terminer sur n’importe lequel niveau vibrationnel du niveau fondamental

S0 comme indiqué sur la première figure. Dû à cette perte d’énergie avant l’émission de

la fluorescence, les bandes d’émission se retrouvent à une longueur d’onde plus longue

que les bandes du spectre d’absorption.

La seule transition qui peut se retrouver autant sur le spectre d’absorption et le

spectre d’émission est la transition 0,0 La transition 0,0 s’observe sur le spectre de

l’anthracène à la longueur d’onde de 375nm. En traçant, côte à côte les spectres

d’émission et le spectre d’adsorption, on remarque que ces différents spectres sont



presque des images miroirs l’une de l’autre si l’on trace une vertical à 375nm.

Figure 6. Superposition des spectres d’absorption et d’émission de l’anthracène

Les instruments les plus sophistiqués utilisés en fluorescence sont capables

d’enregistrer les deux spectres. Le spectre d’émission est obtenu en irradiant l’échantillon

au maximum d’absorption et en observant la fluorescence émise à l’aide d’un

monochromateur en mode balayage. Le spectre d’absorption est obtenu en mesurant la

fluorescence émise à une longueur d’onde donnée pendant que l’on varie la longueur

d’onde de la source d’excitation. Ces instruments possèdent donc deux

monochromateurs.

Le spectre d’adsorption obtenu par la dernière méthode s’appelle un spectre

d’excitation et s’apparente le plus à un spectre d’absorption conventionnel à la différence

qu’il est récolté à 90° à l’axe de la source. La plus grande intensité de fluorescence, et

par le fait même la plus grande sensibilité de l’analyse, est obtenue lorsque λex (longueur

d’onde d’excitation) et λém(longueur d’onde d’émission) sont respectivement au

maximum de leur intensité. La différence de longueur d’onde entre les deux maxima se

nomme le déplacement de Stokes et est une propriété importante du composé fluorescent.

Influence du solvant sur la fluorescence

Même si la transition 0,0 donne lieu à une bande dans le spectre d’excitation et

une bande dans le spectre d’émission, sa longueur d’onde peut varier d’un spectre à

l’autre. Un léger déplacement vers les longueurs d’onde plus grandes est généralement

observé sur le spectre d’émission dû aux interactions entre les molécules de solvant et

celles du soluté. Il est toujours important en spectroscopie analytique de tenir compte des

solvants utilisés lorsque l’on compare les spectres.

En solution, les molécules de solvant se distribuent autour des molécules du

composé d’intérêt de façon à donner une plus grande stabilité au système, c’est-à-dire une

énergie plus basse. L’énergie d’un système solvant/soluté est déterminée en grande partie

par les forces électrostatiques et l’interaction est plus grande pour un solvant polaire et un



composé polaire. Ceci conduit à une plus grande différence entre la configuration la plus

stable et la moins stable.

Lorsqu’une molécule subit un changement de niveau électronique suite à une

excitation, elle subit aussi un changement significatif dans sa polarité. Conséquemment,

la distribution des molécules du solvant, qui donne la configuration la plus stable lorsque

la molécule est au niveau fondamental S0, n’est pas nécessairement celle qui minimise

l’énergie de la molécule lorsqu’elle est dans un état excité. Le processus d’absorption est

virtuellement instantané si on le compare au mouvement moléculaire et les molécules de

solvant s’ajustent par la suite pour fournir la configuration la plus stable à l’état excité,

avec une légère réduction de l’énergie. C’est à partir de ce niveau électronique que la

molécule retourne à l’état fondamental et où l’énergie du système est au-dessus du

minimum car la distribution des molécules du solvant correspond à la situation d’un état

excité. Par la suite, un ajustement dans la distribution des molécules permet de réduire

l’énergie à la valeur à laquelle l’excitation originale s’est produite, ce qui fait que le

photon émis est de plus basse énergie que le photon excitant et que la transition apparaît à

une longueur d’onde supérieure sur le spectre d’émission. Le diagramme suivant illustre

ce phénomène.

Figure 7. Illustration de l’effet du solvant

Fluorescence et structure moléculaire

Avant qu’une molécule puisse émettre une radiation par fluorescence, elle doit

être capable d’absorber la radiation. Par contre, ce ne sont pas toutes les molécules qui

absorbent la radiation qui peuvent émettre de la fluorescence. Dans un premier temps,

établissons une méthode qui quantifiera jusqu’à quel point une molécule sera

fluorescente. On définit Φf, le rendement quantique de fluorescence comme étant :

Les valeurs de Φf sont comprises entre 0 et 1; Φf est largement déterminée par la



structure de la molécule. Une valeur élevée de Φf est généralement associée à des

molécules possédant un système délocalisé de liens doubles conjugués, ce qui confère

une rigidité à la molécule. Exemple : fluorescéine ou anthracène.

Si une molécule absorbe de la radiation et n’émet pas de fluorescence, c’est

qu’elle a disposée de l’excès d’énergie d’une autre façon en retournant à l’état

fondamental. Elle peut se décomposer en brisant ses liens chimiques parce qu’elle a reçu

trop de radiation ou elle a disposé de cette énergie par un autre mécanisme sans émission

de radiation.

Transfert d’énergie sans émission de rayonnement

La fluorescence et la relaxation vibrationnelle sont deux mécanismes de

désactivation de l’état excité. L’un est rayonnant et l’autre non. Le chemin de retour à

l’état fondamental le plus favorable est celui qui minimise la durée de vie de l’état excité.

Le mécanisme de relaxation vibrationnelle (par collision entre les molécules excitées et

celle du solvant) est si efficace que la durée de vie d’un état vibrationnel excité est de 10-

12 seconde. C’est une durée nettement plus courte que celle d’un état électronique excité.

L’efficacité de la relaxation vibrationnelle est telle que la bande de fluorescence

correspondant à une transition électronique donnée est déplacée vers des longueurs

d’ondes plus élevées.

Il y a d’autres mécanismes non rayonnants de désactivation de l’état excité

comme la conversion interne, la conversion externe et le changement de multiplicité. Ces

mécanismes sont illustrés sur la première figure. Ces processus de désactivation ne sont

encore bien compris et bien définis mais ils expliquent certains phénomènes observés en

fluorescence.

La conversion interne

La conversion interne, comme mécanisme de désactivation, semble

particulièrement efficace quand deux niveaux énergétiques électroniques sont

suffisamment voisins pour que les niveaux d’énergie vibrationnelle se recouvrent comme

illustré sur la première figure. Sur cette figure, les niveaux vibrationnels de S1 sont

voisins de l’autre état singulet S2 ce qui permet une transition efficace.

Un exemple de cette conversion interne est celle de la quinine où deux longueurs

d’onde d’excitation, celle de 250 nm et celle de 350 nm résultent en une seule longueur

d’onde d’émission, celle de 450 nm. C’est comme si après l’absorption du rayonnement

à 250 nm, le plus énergétique des deux rayonnements d’excitation, la molécule se

retrouvant au niveau S2 (comme sur la figure) empruntait le chemin de la conversion

interne (indiqué par la flèche ondulée) et par la suite, après relaxation vibrationnelle, se

retrouvait au niveau S1 pour enfin émettre la fluorescence. Cette absorption à 250 nm se

termine par la même émission à 450 nm qu’une absorption à 350 nm qui exciterait la

molécule à un niveau vibrationnel excité de S1 et qu’après relaxation vibrationnelle se

retrouve au premier niveau de S1.



Le mécanisme de la conversion interne peut aussi se produire dans le sens inverse,

c’est-à-dire de S1 à S0 (de la première figure). Une illustration est donnée sur la figure

suivante :

Figure 8. Principe de la conversion interne

Ce dernier processus est encore mal compris mais expliquerait le fait que les

composés aliphatiques sont rarement fluorescents.

La conversion externe

La conversion externe, ou désactivation par collision, résulterait d’une interaction

et d’un transfert d’énergie entre la molécule excitée et le solvant ou autres molécules. Ce

mécanisme est appuyé par l’effet marqué du solvant sur l’intensité de la fluorescence

ainsi que par des changements dans les conditions physico-chimiques, telles la baisse de

température ou l’augmentation de la viscosité du solvant, qui tendent à renforcer la

fluorescence en diminuant le nombre de collisions. Les détails sont encore ici mal

compris.

Changement de multiplicité

« Le changement de multiplicité est un processus par lequel le spin d’un électron

excité est inversé. Comme pour la conversion interne, la probabilité de cette transition est

renforcée par le recouvrement des niveaux de vibration des deux états », tel qu’illustré

sur le dernier diagramme. « Dans ce cas, le niveau vibrationnel le plus bas de l’état

singulet recouvre l’un des niveaux vibrationnels supérieurs de l’état triplet, et un

changement de spin est donc plus probable. Le changement de multiplicité se rencontre

surtout dans les molécules qui contiennent des atomes lourds, l’iode ou le brome (effet

d’atome lourd). En présence de tels atomes, les interactions spin-orbitale deviennent

importantes ce qui favorise un changement de spin. La présence d’espèces

paramagnétiques en solution, telles que l’oxygène moléculaire, favorise aussi le

changement de multiplicité et diminue donc la fluorescence. » (Skoog p.360)



Lire le manuel de Skoog à la page 360-361-362 les paragraphes dont les titres

sont :

« Fluorescence et structure » et « Effet de la rigidité structurale ».

Effets de la température et du solvant (important!!!)

Voir Skoog, Principes d’analyse instrumentale, page 363 (traduction 5e édition)

Effet du pH sur la fluorescence (important!!!)

Voir Skoog, Principes d’analyse instrumentale, page 363 (traduction 5e édition).

Relation entre la fluorescence et la concentration

On peut démontrer que l’intensité de la fluorescence pour des solutions diluées est

donnée par :

où If réfère à l’intensité totale dans toutes les directions ce qui signifie que la

partie de droite doit être multipliée par un facteur pour tenir compte qu’il n’y a qu’une

fraction du rayonnement fluorescent qui est détectée. Si la concentration est élevée, cette

relation ne tient plus et on arrive plutôt à une équation qui inclut un terme quadratique et

un terme cubique :

Le terme au carré possède un signe négatif et va réduire If à mesure que la

concentration augmente. Le terme au cube a un signe positif et réduira alors la courbure

mais seulement à des concentrations beaucoup plus élevées. À condition que 2,303 ε cd =

A soit inférieur à 0,05, on peut négliger les termes de puissance supérieure à 1. Dans ce

cas, l’erreur relative ne dépasse pas 0,13 %.

Si on prend un produit fluorescent dont l’absorptivité molaire ε est de 10000 L

mol-1cm-1 (ex :anthracène) et que l’on utilise une cellule dont le chemin optique est de 1

cm et que l’on met en graphique la fluorescence relative If/I0 avec I0 et Φf = 1 (permis

pour un produit donné, mesuré sur le même instrument et à une longueur d’onde fixe) en

fonction de la concentration, en utilisant la dernière équation, nous obtenons pour des

concentrations de 0 à 30 µmol/L le graphique ci-dessous. Nous constatons que la droite

s’éloigne de la linéarité à partir de~3 µmol/L et que le terme cubique devient significatif

à partir de 14 µmol/L. Si le poids moléculaire de ce produit est de 300 nous obtenons

0,720 mg/L comme concentration limite pour la linéarité. Donc, si on veut effectuer une

droite d’étalonnage pour un tel produit, nous devons travailler avec des solutions très

diluées et en-deçà de 3 µmol/L.



Figure 9. Déviation de la linéarité à fortes concentrations

Peut-on observer la fluorescence à ces concentrations? Ceci dépend de la

sensibilité de notre instrument qui en retour dépend de I0, de l’efficacité optique

d’émission et du détecteur. Heureusement, pour des composés ayant des efficacités

raisonnables de fluorescence cette concentration est de plusieurs ordres au-dessus de la

limite de détection.

Comparaison de la sensibilité et du domaine dynamique entre spectroscopie

d’absorption et la fluorescence

Sensibilité

En spectroscopie d’absorption, la limite de détection est souvent définie comme

étant la concentration qui donne une valeur d’absorbance égale au double du bruit de

fond. La limite supérieure de linéarité, pour une courbe d’étalonnage en fluorescence, est

d’environ 10 fois supérieure à la limite de détection dans l’UV/visible mais la limite de

détection en fluorescence est de 1000 plus basse.

Le domaine dynamique

Le domaine dynamique d’une technique analytique est la concentration la plus

élevée que nous pouvons mesurer, divisée par la concentration la plus basse, sous des

conditions de routine (10 fois la limite de détection est une valeur raisonnable). En

général, pour les techniques d’absorption, ce ratio se limite à 100. La fluorescence, en

commun avec d’autres techniques d’émission, a un domaine dynamique de l’ordre de 10

000.

L’auto-désactivation et l’auto-absorption



Nous avons vu qu’à mesure que la concentration augmente, la graphique de

l’intensité de fluorescence en fonction de la concentration a tendance à courber parce que

l’intensité dépend d’un terme quadratique et non pas de la concentration directe. Ce n’est

pas le seul facteur responsable de la non linéarité à forte concentration. Il y a aussi

l’auto-désactivation et l’auto-absorption.

• L’auto-désactivation résulte de collisions entre les molécules excitées, ce qui

provoque une perte d’énergie non rayonnante probablement analogue au transfert

d’énergie aux molécules de solvant qui se produit dans une conversion externe.

• L’auto-absorption se manifeste lorsqu’il y a perte de radiation émise par

absorption, avant que cette radiation ne puisse sortir de la cellule. Elle se produit lorsque

le déplacement de Stokes est petit et que la bande d’absorption recouvre la bande

d’émission de façon significative.

En plus de causer une courbure dans le graphe de la fluorescence en fonction de la

concentration, ces facteurs causent des distorsions dans le spectre d’émission lui-même.

Si nous examinons les spectres suivants de l’anthracène à des concentrations différentes,

dans le 2-propanol, nous remarquons les anomalies suivantes :

Figure 10. Anomalies apparaissant à haute concentration pour l’absorption et émission

de l’anthracène

Instrumentation

L'instrumentation utilisée en fluorescence diffère de l'instrumentation utilisée en

absorption principalement par la géométrie. Pour la mesure de l'absorbance, le faisceau

incident traverse l'échantillon en ligne directe avec le détecteur et c’est la réduction

d'intensité qui est mesurée. En fluorescence, on observe la fluorescence émise en

présence d'un faisceau excitant beaucoup plus puissant. Même si cela est possible avec

une géométrie à 180° (en ligne droite) parce que le rayonnement émis est à une longueur



d'onde différente du faisceau incident, la partie non absorbée du faisceau incident passe

dans le monochromateur et donne lieu à un rayonnement parasite important.

La configuration la plus utilisée en fluorescence est la configuration à 90° (angle

droit entre la source et le détecteur) illustrée sur la figure ci-contre. Cette géométrie

permet d’amplifier le signal de fluorescence sans pour autant amplifier le signal du

faisceau incident. On peut également augmenter la puissance Po du rayon incident et ainsi

augmenter le signal de fluorescence. Cette possibilité n’existe pas en spectrophotométrie

d’absorption étant donné que le résultat de la mesure est l’absorbance (log Po/P). Une

augmentation de Po conduit à une augmentation proportionnelle de P et n’a aucun effet

sur A, l’absorbance.

L’instrument le plus versatile est sans contredit le spectrofluorimètre qui donne le

choix de sélectionner et la longueur d’onde d’excitation et la longueur d’onde d’émission

avec ses deux monochromateurs.

Fluorimètres avec filtres et monochromateur

Une économie considérable peut-être effectuée si l’un des monochromateurs est

remplacé par un filtre passe-bande. Les filtres interférentiels modernes ont une

transmission de 60 % et ont une largeur de bande comparable à un petit monochromateur

(5 nm). Ils ont même un avantage considérable en termes de pouvoir de collection de la

lumière et peuvent dans certains cas surclasser des instruments plus dispendieux pour

détecter de bas niveaux de fluorescence.

Une source au mercure peut être utilisée en remplacement d’un monochromateur

d’excitation. La source au mercure émet un rayonnement intense à certaines longueurs

d’onde et des filtres interférentiels peuvent être fabriqués pour isoler les principales

bandes du mercure. Avec ce type d’appareil, on peut obtenir un spectre d’émission mais

le spectre d’excitation se limite aux six bandes du mercure. En pratique, ceci permet

d’exciter la plupart des composés parce que les bandes sont assez larges mais dans

certains cas l’efficacité serait faible. En utilisant une source au xénon, il n’y aurait aucune

restriction quant à la longueur d’onde, en autant que l’on puisse trouver sur le marché le

filtre interférentiel qui corresponde à nos besoins.

Instrument exclusivement avec filtres

Étant donné que dans les analyses de routine on connaît les conditions

d’excitation et d’émission, on peut utiliser un appareil avec filtres exclusivement.

• Désavantages : différents filtres à chaque analyse et on ne peut prendre un

spectre d’excitation ou d’émission.

• Avantages : peu coûteux, simple et facile à transporter.

Entre l’échantillon et le détecteur, on introduit un filtre passe-haut qui transmet le

rayonnement au-dessus d’une certaine longueur d’onde mais qui absorbe complètement



au-dessous de cette valeur. Ces filtres sont nécessaires pour enrayer les rayonnements

parasites.

Note : C’est ce type d’appareil qui sera utilisé pour l’expérience et vous trouverez,

à la dernière page de votre protocole, les spectres des différents filtres interférentiels

passe-bande (partie supérieure de la page) servant à l’excitation et les filtres passe-haut

(cut off, partie inférieure de la page) utilisés pour isoler la longueur d’onde d’émission.

Pour des informations supplémentaires concernant ces appareils, consulter aussi votre

livre de chimie instrumentale Skoog.

Interférences dues à la diffusion de la lumière

La lumière directe ne peut atteindre le monochromateur car la source et le

monochromateur sont à 90° par rapport à l’échantillon. Une partie du rayonnement

incident atteint quand même le monochromateur à cause du phénomène de diffusion de la

lumière : Dans un faisceau lumineux, les petites particules (ex. : fumée) sont visibles

parce que chaque particule agit comme un émetteur; cette émission de lumière se fait

dans toute les directions. De la même manière, les molécules dans un faisceau lumineux

agissent comme des émetteurs, mais avec une intensité beaucoup plus faible que les

particules. Ce phénomène est appelé « diffusion de Raleigh » et est dû principalement

aux molécules du solvant. L’intensité de cette diffusion peut être comparable à la

fluorescence du composé d’intérêt mais la longueur d’onde de cette lumière diffusée est

la même que celle du faisceau incident, donc plus courte que l’émission par fluorescence.

Un autre type de diffusion, qui peut interférer avec la fluorescence, est la diffusion

Raman Stokes, diffusion plus faible se produisant à une longueur d’onde plus élevée que

le faisceau incident et qui peut interférer avec la bande d’émission de fluorescence du

composé d’intérêt.

Il y a aussi la diffusion Raman anti-Stokes, plus difficile à détecter parce que plus

faible que la diffusion Raman Stokes, dont la longueur d’onde est plus faible que le

faisceau incident. Si l’échantillon contient des particules en suspension, il faut ajouter, à

la diffusion déjà existante, la diffusion de Tyndall; cette dernière est beaucoup plus

intense que la diffusion de Raleigh.

La diffusion de Raleigh se produisant à la même longueur d’onde que le faisceau

incident, même si elle est plus intense que la diffusion Raman, est plus facile à éliminer et

n’atteint pas le détecteur directement car le monochromateur d’émission est réglé à une

longueur d’onde plus élevée. Il en est autrement de la diffusion Raman car se produisant

à une longueur d’onde plus élevée, elle peut être associée à la fluorescence d’une

impureté fluorescente.

La figure suivante montre le spectre d’émission d’une solution aqueuse de

dichloro-fluorescéine (tracé supérieur) et le spectre d’émission de l’eau pure (tracé

inférieur).



Figure 11. Émission de la dichloro-fluorescéine

La longueur d’onde d’excitation est de 400 nm. La seule différence entre les deux

spectres est le large pic de fluorescence à 522 nm. Quelle est l’origine des autres pics?

Le pic le plus intense à 400 nm, soit la même longueur d’onde que le faisceau

incident, est dû à la diffusion de Raleigh. Cette bande est toujours présente mais

n’apparaît pas dans le spectre d’émission parce qu’elle est habituellement filtrée. Le

deuxième pic le plus intense est à 800 nm, ce qui est exactement le double de la longueur

d’onde d’excitation. Ceci est un artéfact du monochromateur. Le monochromateur à

réseau laissant passer λ laisse aussi passer 2λ, 3λ et ainsi de suite avec une efficacité

décroissante. Lorsque le monochromateur d’émission est réglé à 800 nm, il transmet donc

le faisceau incident de 400 nm. Si un filtre de 400 nm est inséré entre l’échantillon et le

monochromateur d’émission, il n’y aura aucun pic à 800 nm.

Le petit pic à 462 nm, présent à la fois sur le spectre de l’eau et sur le spectre de la

solution aqueuse de dichlorofluorescéine, est dû à la diffusion Raman. La différence

d’énergie entre le faisceau incident à 400 nm et le pic à 462 nm correspond à un niveau

vibrationnel de H2O. Le nombre d’onde du faisceau incident est égal à 1/λ et :

1/400 nm = 1/(400*10-7 cm) = 25 000 cm-1

1/462 nm = 21645 cm-1

25 000-21 645=3355 cm-1

La bande de 3355 cm-1 se retrouve à l’intérieur d’une large bande d’absorption de

H2O (2900-3800) dans l’infrarouge. Voici un spectre infrarouge de H2O dans cette

région :



Figure 12. Spectre IR de l’eau

Les bandes Raman dans les spectres d’émission se déplacent avec la longueur

d’onde du faisceau incident et l’écart avec le faisceau incident est constant. Les pics dus

à la fluorescence ne changent pas avec la longueur d’onde du faisceau incident. On peut

confirmer le pic de diffusion Raman en prenant plusieurs spectres avec un faisceau

incident différent pour chaque spectre, ensuite on trouve la moyenne des écarts en cm-1

et cet écart devrait être compris à l’intérieur de la large bande d’absorption de l’eau. Un

exemple est donné dans le tableau ci-dessous :

Table 1. Confirmation du pic de diffusion Raman

Bibliographie

• Fluorescence and Phosphorescence; Analytical chemistry by open learning,

David Redell

• Chemistry Experiments for Instrumental Methods : Ed. Wiley, Sawyer,

Heineman, Beebe

• Quantitative Chemical Analysis; Ed. W.H.Freeman; 8ième édition, D.C. Harris

• Skoog


Objectifs

• Utiliser la fluorescence pour quantifier la quinine, un composé fluorescent, dans

λex (nm) λdiffusé (nm) Différence de nombre d’onde (cm-1)

400 462 3352

410 478 3472

420 491 3445

430 503 3374

440 515 3312

450 532 3423



un « tonic water » et dans un inconnu.

• Utiliser la spectroscopie UV pour quantifier la quinine dans le même « tonic

water » et dans le même inconnu.

• Étudier l’effet du pH sur la fluorescence de la quinine.

• Étudier de l’extinction (quenching) de la fluorescence de la quinine causée par

les halogénures.

• Doser le bromure dans un inconnu par extinction de la fluorescence.

Étalonnage et mesure par fluorescence

Préparation d’une solution de quinine 200 ppm dans H2SO4 0,05 M :

Dissoudre environ 0,1207 g de sulfate de quinine (Fisher Cat. No. Q39-25

((C20H24N2O2)2.H2SO4 • 2H2O; M = 782,96 g/mol) pesé précisément) dans un

volumétrique de 500 mL contenant environ 250 mL d’eau et 12,5 mL de H2SO4 2M

(ajouté avec un cylindre gradué); compléter au trait de jauge avec de l’eau désionisée.

(Note : Assurez-vous que la quinine soit bien dissoute).

Préparation de la solution mère de quinine 10 ppm dans H2SO4 0,05 M :

Pipeter 5 mL de quinine 200 ppm dans un volumétrique de 100 mL et compléter

avec la solution de H2SO4 0,05 M. Note : Une solution de H2SO4 0,05 M a déjà été

préparée.

Préparation des solutions d’étalonnage dans H2SO4 0,05 M

(Note : Calculez les concentrations réelles de quinine à partir de la masse pesée).

Table 2. Préparation des solutions d’étalonnage

Manipulations et analyse des données

Une cellule carrée en quartz est utilisée pour mesurer la fluorescence. Il est

important de toujours mettre cette cellule avec la même orientation dans le porte

échantillon.

• Ajuster la sensibilité du fluorimètre en utilisant le mode « mutli optionnel

fluorescence brute » (voir la notice d’utilisation de l’appareil en annexe).

- Entrer la valeur de 800 FSU (fluorescence unit) pour le standard le plus

Concentration

(ppb)

Volume de solution

de quinine 10 ppm

Volume final

(mL)

50 500 µL 100

100 1 mL 100

200 1 mL 50

400 1 mL 25

500 5 mL 100



concentré (500 ppb).

- Pour faire le zéro (blank), couper totalement les faisceaux d’excitation et

d’émission à l’aide de l’adapteur pour cellules rondes, mais installé à l’envers (vous ferez

régulièrement le 0 à l’aide de cet adapteur).

• Mesurer la fluorescence des solutions standard et de la solution de H2SO4 0,05

M (blanc).

• Mesurer la fluorescence de l’inconnu après dilution 5 dans 100 avec H2SO4

0,05 M.

• Dégazer 100 mL de Tonic Water et en pipeter 5 mL dans un volumétrique de

100 mL et compléter avec H2SO4 0,05 M.

• Après agitation, pipeter 5 mL de cette dernière solution et la diluer dans un

ballon volumétrique de 50 mL avec H2SO4 0,05 M.

• Mesurer la fluorescence de cette solution de Tonic Water.

• Tracer la droite d’étalonnage de l’intensité de la fluorescence en fonction de la

concentration de quinine.

• Dans un tableau, mettre en évidence les résultats et l’incertitude obtenus pour la

concentration en ppm de l’inconnu et celle du Tonic Water.

• Pour le Tonic Water, comparer la valeur obtenue à celle publiée.

Influence du pH sur la fluorescence de la quinine

• À partir de la solution de 200 ppm de quinine dans H2SO4 0,05 M, préparez 100

mL de solution de quinine 10 ppm, mais cette fois en diluant avec de l’eau désionisée.

• À partir de cette solution 10 ppm, préparez six solutions de 50 mL contenant 500

ppb de quinine dans les tampons suivants : 2.0; 2.9; 4.1; 5.0; 5.5 et 6.2. (Note : les

différents tampons ont déjà été préparés).

• Mesurez d’abord la fluorescence de la solution 500 ppb de quinine à pH 2 en

mode « mutli optionnel fluorescence brute »; attribuer une valeur de 800 FSU à cette

solution. Faire le 0 de l’appareil comme dans la première partie.

• Mesurez la fluorescence de chacun des tampons et de chacune des solutions

tampons + 500 ppb de quinine. Pour s’assurer d’obtenir un graphique valable de la

fluorescence de la quinine en fonction du pH (parce que les tampons proviennent de

plusieurs sources différentes : tampons phosphate et acétate), il faut soustraire la

fluorescence du tampon de la valeur de fluorescence obtenue pour chacune des solutions

quinine + tampon.



• Portez en graphique la fluorescence de la quinine en fonction du pH.

Étude de l’extinction de la fluorescence de la quinine causée par les halogénures et

l’équation de Stern-Volmer

Note : Voir note explicative de l’équation de Stern-Volmer en annexe.

Préparation des solutions pour obtenir la droite de Stern-Volmer

À partir de la solution mère de 10 ppm (10 000 ppb) de quinine dans H2SO4 0,05

M préparée dans la première partie, préparez six volumétriques de 50 mL dans lesquels

vous ajouterez des volumes de la solution mère de quinine et des volumes d’une solution

déjà préparée de NaBr 0,05 M dans H2SO4 0,05 M. Complétez avec H2SO4 0,05 M. La

concentration de quinine de ces solution sera de 400 ppb.

Table 3. Solutions à préparer pour obtenir la droite de Stern-Volmer

Préparation de la solution inconnue

Préparez trois autres volumétriques de 50 mL, mais cette fois ajoutez des volumes

de la solution inconnue de NaBr.

Table 4. Préparation des solutions inconnues

Mesure et analyse des données

• Mesurez d’abord la fluorescence de la solution 1 sans ajout de NaBr en mode «

mutli optionnel fluorescence brute »; attribuer une valeur de 800 FSU à cette solution.

Faire le 0 de l’appareil comme dans la première partie.

• Mesurez la fluorescence de toutes les solutions standard.

Solution Solution de quinine 10 000

ppb dans H2SO4 0,05 M (mL)

Solution de NaBr 0,05 M

dans H2SO4 0,05 M (mL)

1 2 0

2 2 2

3 2 4

4 2 8

5 2 16

6 2 32

Solution Solution de quinine 10 000

ppb dans H2SO4 0,05 M (mL)

Solution de NaBr

inconnue (mL)

7 2 2

8 2 4

9 2 8



• Mesurez la fluorescence des trois solutions de l’inconnu. Assurez-vous qu’au

moins deux valeurs de fluorescence pour votre inconnu de NaBr soient comprises dans le

domaine des valeurs de fluorescence des solutions standard.

• Tracez le graphique de l’intensité de la fluorescence en fonction de la

concentration de NaBr.

• Tracez une droite en vous servant la relation de Stern-Volmer

𝜙0

𝜙𝑓= 𝐾𝑐 + 1

Φ°est le rendement quantique de l’espèce fluorescente en absence de l’extincteur,

Φf est le rendement quantique de l’espèce fluorescente lorsque la concentration de

l’extincteur est c. K étant connu comme la constante de Stern-Volmer. La pente K de la

droite est différente pour chacun des halogénures, augmentant de Cl- jusqu’à I-.

• Déterminez la concentration millimolaire de NaBr dans votre inconnu en

utilisant comme courbe standard la droite tracée avec l’équation de Stern-Volmer.

Calculer une moyenne des valeurs de concentration obtenues pour votre inconnu de

NaBr.

Spectroscopie UV d’absorption

Les dosages par fluorimétrie sont très sensibles mais limités aux molécules, peu

nombreuses, qui ont un rendement quantique de fluorescence acceptable. Par contre, un

grand nombre de molécules absorbent dans l’UV, et la spectroscopie UV est souvent la

méthode la plus simple et la plus précise de les doser.

Dosage de la quinine par spectroscopie UV d’absorption

La cellule de quartz utilisée pour les mesures de fluorescence ne convient pas

pour les mesures d’absorption UV (voir section suivante). Vous devez utiliser une cellule

de quartz.

• À partir de la solution de quinine 200 ppm dans H2SO4 0,05 M, préparez des

solutions standard entre 2 et 10 ppm en quinine dans H2SO4 0,05 M.

• Enregistrez le spectre d’absorption UV de H2SO4 0,05 M comme blanc, puis

enregistrez le spectre d’absorption de chaque standard.

• Enregistrez le spectre d’absorption de l’inconnu; diluez si nécessaire.

• Tracez la droite d’étalonnage de l’absorbance en fonction de la concentration et

déterminer la concentration de l’inconnu. (Note : choisissez la longueur d’onde la plus

appropriée pour effectuer vos lectures…. Quelle est-elle et pourquoi???).



Absorbance UV des filtres et de la cellule du fluorimètre

Afin de bien comprendre le fonctionnement du fluorimètre et le choix des filtres

pour la mesure de la fluorescence de la quinine :

• Enregistrez le spectre d’absorption UV de la cellule de quartz (remplie de H2SO4

0,05 M).

• Enregistrez les spectres d’absorption UV des filtres d’excitation et d’émission

que vous avez utilisés pour les expériences de fluorescence.

Références supplémentaires

Voir les articles suivants, disponibles en ligne:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022231302002946

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jps.2600630615/pdf

Calculs Trouver la teneur en zinc, en sodium et en potassium (en ppm) de vos inconnus. Effectuer

les calculs d’erreur pour chacune des droites d’étalonnage.

- Comparez la teneur en zinc de l’inconnue avec celle obtenue en voltampérométrie

(expérience 4, si vous l’avez fait, sinon, vous comparerez ce résultat dans votre

discussion de l’expérience 4)




- Démontrez que vous distinguez bien la spectroscopie d’absorbance et de fluorescence

en termes de fonctionnement, d’instrumentation, de performances analytiques…

- La quelle des technique permet généralement d’obtenir la plus faible limite de

détection? Expliquez pourquoi en vos mots.

- Aussi à inclure à votre discussion :

• Est-ce que l’on aurait pu utiliser HCl pour diluer la solution standard de quinine au lieu

de H2SO4 0,05 M? Expliquer

• En étudiant la courbe obtenue lors de l’étude de la fluorescence en fonction du pH,

discuter de l’importance du pH dans les mesures de fluorescence.

• Pourquoi l’augmentation du pH fait-elle diminuer la fluorescence observée à 450 nm?

Sous quelle forme retrouve-t-on la quinine à pH 2?

• Comparer la méthode de dosage de la quinine par fluorescence à celle par absorption

UV.

• Commenter les spectres d’absorption UV des filtres d’excitation et d’émission du



fluorimètre et de la cellule utilisée pour mesurer la fluorescence

Information Supplémentaire 1: Mécanismes d’extinction et l’équation

de Stern-Volmer (Il peut y avoir plusieurs types de mécanismes ou processus

d’extinction (quenching))

L’extinction (raccourcissement de la durée de vie de l’état excité) de la quinine à

l’état singulet en présence d’halogénures est de type dynamique, c’est-à-dire qu’il y a

collisions entre les molécules de quinine excitées et l’halogénure. Ces collisions se

produisent en parallèle avec les autres mécanismes expliqués dans le diagramme de

Jablonski. Ces collisions conduisent à une perte d’énergie du fluorophore et par le fait

même à une diminution du temps de vie de l’état excité fluorescent.

On peut parler aussi d’extinction statique où le mécanisme est la formation, à

l’état fondamental, d’un complexe fluorophore-agent d’extinction non fluorescent.

Lorsque ce complexe absorbe la lumière, il retourne à l’état fondamental sans émission

de photons. Un autre type de mécanisme statique peut se produire lorsque la

concentration de l’agent d’extinction est assez élevée ce qui entraîne la formation d’un

complexe fluorophore-agent d’extinction qui stoppe instantanément sont état excité. Ce

dernier type d’extinction statique ne produit pas de changement dans le spectre

d’absorption du fluorophore tandis que dans le premier, il y a déplacements dans le

spectre d’absorption du fluorophore avec l’addition de l’agent d’extinction.

L’équation de Stern-Volmer modélise le mécanisme d’extinction dynamique

suivant : Supposons qu’une molécule A, à l’état fondamental, absorbe un photon hν et est

excité à l’état singulet A*

Absorption

La vitesse à laquelle A* est formée d[A*]/dt est proportionnelle à la concentration

de A. La constante ka dépend de l’intensité du faisceau incident et de l’absorptivité de A.

À la suite de l’absorption d’énergie, la molécule A* peut émettre un photon et retourner à

l’état fondamental. Ce processus est représenté par :

Émission

ke étant la constante de vitesse du processus de désactivation par voir radiative.

Aussi la molécule excitée A* peut perdre de l’énergie sous forme de chaleur ou par un

processus non rayonnant tel que la conversion interne.

Désactivation



Lorsque l’extincteur (quencher) (Q) est ajouté, un autre mode ou mécanisme de

désactivation est maintenant possible, où la molécule excitée (A*) transfère son énergie à

l’extinction (Q) qui est promu à un état excité (Q*) et qui perdra cette énergie par une

multitude de processus. kq est la constante de vitesse de second ordre pour le processus

d’extinction.

Extinction (quenching)

L’extincteur excité pouvant perdre son énergie par une multitude de processus.

Sous une intensité constante d’un faisceau lumineux, le système atteint l’état

stationnaire où les concentrations de A* et de A restent constantes. À ce stade, la vitesse

de formation de A* est égale à sa vitesse de destruction, de sorte que :

Le rendement quantique pour un processus chimique est la fraction de photons

absorbés produisant un certain résultat. Si ce résultat se produit à chaque fois qu’un

photon est absorbé alors le rendement quantique est l’unité. Le rendement est un nombre

entre 0 et 1. Le rendement quantique pour l’émission de A* est la vitesse d’émission

divisée par la vitesse d’absorption.

En l’absence de l’extincteur Q nous désignons le rendement quantique de

fluorescence :

𝜙0 =𝑝ℎ𝑜𝑡𝑜𝑛𝑠 é𝑚𝑖𝑠 𝑝𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑐𝑜𝑛𝑑𝑒

𝑝ℎ𝑜𝑡𝑜𝑛𝑠 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏é𝑠 𝑝𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑐𝑜𝑛𝑑𝑒=

𝑣𝑖𝑡𝑒𝑠𝑠𝑒 𝑑′é𝑚𝑖𝑠𝑠𝑖𝑜𝑛

𝑣𝑖𝑡𝑒𝑠𝑠𝑒 𝑑′𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑝𝑡𝑖𝑜𝑛=

𝑘𝑒[𝐴∗]

𝑘𝑎[𝐴]

En substituant ka[A] dans l’avant dernière équation et en mettant [Q] = 0 nous

obtenons une expression pour le rendement quantique de fluorescence à l’état

stationnaire :

𝜙0 =𝑘𝑒[𝐴∗]

𝑘𝑒[𝐴∗] + 𝑘𝑑[𝐴∗] + 𝑘𝑞[𝐴∗][0]=

𝑘𝑒

𝑘𝑒 + 𝑘𝑑

Si [Q] ≠ 0 le rendement quantique de fluorescence (ΦQ) est :


𝑘𝑒[𝐴∗] + 𝑘𝑑[𝐴∗] + 𝑘𝑞[𝐴∗][𝑄]=

𝑘𝑒

𝑘𝑒 + 𝑘𝑑 + 𝑘𝑞[𝑄]

En faisant le rapport Φo/ΦQ, nous obtenons l’équation de Stern-Volmer :


𝑘𝑒[𝐴∗] + 𝑘𝑑[𝐴∗] + 𝑘𝑞[𝐴∗][𝑄]=

𝑘𝑒

𝑘𝑒 + 𝑘𝑑 + 𝑘𝑞[𝑄]



L’équation de Stern-Volmer stipule que si nous mesurons l’émission relative

Φo/ΦQ en fonction de la concentration de l’extincteur (Q) nous obtiendrons une droite de

pente (kq

ke+kd).

La quantité Φo/ΦQ est équivalente à I0/Iq où I0 est l’intensité de fluorescence en

l’absence d’extincteur et IQ est l’intensité de fluorescence en présence d’extincteur. KSV

étant la constante de Stern-Volmer.

Références

Principles and applications of fluorescence spectroscopy, J.R. Albany;

BlackwellPublishing; QP 519 F56AR42 2007

Méthodes instrumentales d’analyse chimique et applications; Gwenola Burgot, Jean-

Louis Burgot; QD 79 15B87 2006

Lee K. Fraiji, David M. Hayes, T.C. Werner., J. Chem. Educ, 1992, 69, 424-428.

Information Supplémentaire 2 : Fonctionnement du fluorimètre à

cuvette

Opération de l’appareil (TURNER TD-700)

Cet appareil peut être relié à un ordinateur pour faire l’acquisition de données.

Figure A1. Fluorimètre à cuvette TURNER TD-700



Figure A2. Illustration du support à cuvette du TURNER TD-700

Figure A3. Fonctionnement du porte cuvette du TURNER TD-700

Utilisation de l’interface du TURNER TD-700

Note : Une procédure en format papier sera disponible avec l’instrument au

laboratoire. Les documents qui suivent sont toutefois plus complets.

Fluorimètre TD-700 Manuel d’utilisation

Page 7

Fluorimètre TD-700

Cylindre porte-filtre et adaptateur

pour tube 13 mm

Adaptateur pour tube 25 mm Adaptateur pour cuve carrée

10 mm

Repère d’alignement Repère d’alignement

Adaptateur échantillon

Cylindre porte-filtre

Repère d’alignement argent

Affichage

Clavier

Compartiment échantillon


Page 7

Fluorimètre TD-700

Cylindre porte-filtre et adaptateurpour tube 13 mm

Adaptateur pour tube 25 mm Adaptateur pour cuve carrée10 mm

Repère d’alignement Repère d’alignement

Adaptateur échantillon

Cylindre porte-filtre

Repère d’alignement argent

Affichage

Clavier

Compartiment échantillon




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Calibrage: mode multi-

optionnel - fluorescence brute

1. Setup2. Calibration

1. Mode2. Cal Procedure

Simple

<Multi-Optional>

1. Mode2. Cal Procedure

<Raw Fluor.>Direct Conc.

1. Mode

2. Cal Procedure

1. Setup2. Calibration

Insert TypicalSample <ENT>

SETTING SensSens Factor: XX

Sensitivity Set Sens Factor: XX

Set Sample = XXX1. OK 9. Change

Sample = XXX

<ENT>

Read & Subtract

Blank? 1=Yes 9=No

1.

2.

3.

4.

5.

VIII. Calibrage : mode multi-optionnel -

fluorescence brute

La procédure de calibrage en mode multi-optionnel - fluorescence brute consiste

en un point de calibrage unique dans lequel un standard et un blanc optionnelsont lus afin de fixer la gamme et la sensibilité maximales de l’appareil.

L’échantillon choisi sera fixé à 80% de la valeur maximale lisible avec précisionpar cet appareil, sauf en cas de changement de la valeur de cet échantillon. La

gamme et la sensibilité de l’appareil peuvent être ajustées en changeant la valeurde l’échantillon.

1. Pour choisir le mode multi-optionnel - fluorescence brute, appuyer sur

<ENT> à partir de l’écran de départ, appuyer sur <1> pour le réglage,puis sur <1> à nouveau pour le mode. Utiliser <> pour choisir le mode

multi-optionnel. Appuyer sur <ESC> pour revenir à l’écran précédent,puis sur <2> pour choisir la procédure de calibrage. Utiliser la touche <>

pour choisir «Raw Fluor.» (fluorescence brute) pour la procédure decalibrage en fluorescence brute. Appuyer sur <ESC> pour revenir à

l’écran Setup/Cal (réglage/calibrage).

2. Pour accéder à la séquence de calibrage, appuyer sur <2> à partir del’écran Setup/Cal (réglage/calibrage). La séquence de calibrage multi-

optionnel - fluorescence brute apparaît.

3. Remplir un tube à essai ou une cuve propre avec un échantillon ayantenviron 80% de la concentration maximum qui doit être lue. Il n’est pas

nécessaire de connaître la concentration exacte; elle est utilisée pourfixée la gamme et la sensibilité optimales de l’appareil. Essuyer et sécher

l’extérieur du tube à essai ou de la cuve, et l’insérer dans l’adaptateurd’échantillon dans le compartiment échantillon. Appuyer sur <ENT> pour

accéder à l’écran suivant.

4. Si l’échantillon a 80% de la concentration maximum qui doit être lue,accepter la valeur prédéfinie de 800 en appuyant sur <1>. Le TD-700 fixe

la sensibilité de façon à ce que le standard soit lu à environ 80% de lagamme maximale. Si une lecture égale à 800 n’est pas acceptable,

appuyer sur <9> pour changer la valeur. Si une valeur plus élevée estattribuée à l’échantillon, la concentration maximale des échantillons

pouvant être lue diminue, et la sensibilité et la résolution de l’appareilaugmentent. Si une valeur inférieure à 500 est attribuée à l’échantillon

choisi, la concentration maximale des échantillons pouvant être lueaugmente, et la sensibilité et la résolution de l’appareil diminuent. Saisir

le nombre désiré et appuyer sur <ENT>, puis sur <1>.

5. Le TD-700 fixe maintenant la sensibilité, comme indiqué par le SENSFACTOR (facteur de sensibilité), basée sur la valeur de l’échantillon final

accepté. Lorsque l’échantillon est fixé, le TD-700 demande s’il faut lire unblanc. Pour qu’un blanc soit soustrait, appuyer sur <1>. Sinon, appuyer

sur <9> et la séquence de calibrage s’arrête là, et l’écran de départapparaît. A ce stade, la valeur du calibrage est envoyée directement vers

une imprimante ou un ordinateur. Voir l’annexe 2 pour plus de détailsconcernant la sortie du calibrage sur imprimante.



Performance du TURNER TD-700


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Blank: X.X

Cal Std: XXX.X

Reading BlankWAIT

Insert Blankand press <ENT>

Press <0> when

value stable XXX

Blank = XXX

8.

6.

<1> - Abort Cal<ESC> - Resume

10.

6. Pour lire un blanc, remplir un tube à essai ou une cuve propre avec lasolution de blanc, essuyer et sécher l’extérieur du tube à essai ou de la

cuve, l’insérer dans l’adaptateur d’échantillon dans le compartimentéchantillon, et appuyer sur <ENT>. Laisser la lecture se stabiliser et

appuyer sur <0>. L’appareil lit le blanc, puis retourne automatiquement àl’écran de départ. A ce stade, la valeur du calibrage est envoyée

directement vers une imprimante ou un ordinateur. Voir l’annexe 2 pourplus de détails concernant la sortie du calibrage sur imprimante.

7. Erreurs: Après la lecture de l’échantillon, le TD-700 s’ajuste

automatiquement sur la gamme optimale pour la mesure de l’échantillon.Si l’échantillon utilisé est trop concentré ou trop dilué, l’appareil ne sera

pas capable d’atteindre la sensibilité voulue. Dans ces cas-là, unmessage apparaît indiquant que, en se basant sur le calibrage, l’appareil

a atteint son maximum ou son minimum de sensibilité. Appuyer sur<ENT> pour dire à l’appareil d’accepter la valeur de sensibilité maximale

ou minimale. Il est cependant conseillé d’ajuster la concentration del’échantillon de façon à tomber dans la gamme, puis de recalibrer.

8. Pour visualiser le dernier calibrage fixé, appuyer sur <ENT> à partir de

l’écran de départ, puis sur <9> pour voir la valeur du blanc et du standardde calibrage. Appuyer sur <H> pour retourner à l’écran de départ.

9. Pour imprimer le dernier calibrage fixé, appuyer sur <ENT> à partir de

l’écran de départ, puis sur <D>. Appuyer sur <H> pour retourner à l’écrande départ.

10. Pour annuler le calibrage, appuyer sur <ESC> n’importe quand pendant

la séquence de calibrage. Appuyer sur <1> pour annuler ou sur <ESC>pour reprendre.





Documents

CAN 407 Analyse instrumentale, Travaux pratiques · Sample mais plutôt continuer à utiliser Analyze Standard même si ce sont des échantillons inconnus. Noter pour ces échantillons