1

Chantier 2 :

Du prélèvement à l’analyse, vers une approche

multicontaminants

Délivrables 2.1, 2.2, 2.3 et 2.4

Recueil des méthodes d’analyse, modalités de

prélèvement des échantillons végétaux,

protocoles de traitement et de conservation des

échantillons

2

1) Recueil de méthodes de prélèvement des végétaux

Une recherche bibliographique a permis de recenser différents protocoles de prélèvement de végétaux. Ces

protocoles ont été établis par des instituts et présentent les modalités de prélèvement des céréales (nombre de

plantes à prélever, localisation des placettes et sous placettes…) ainsi que la préparation des échantillons (séchage,

broyage). Cf. définitions en Annexe 1.

Ces protocoles ont été rassemblés sous forme de tableau comparatif donné en Annexe 2.

Certains protocoles proposent des paramètres de prélèvement basés sur des dimensions données de placettes,

indépendantes de la taille de la parcelle et donnant un nombre défini de sous placettes et de plantes identiques pour

chaque campagne de prélèvement. D’autres proposent au contraire des placettes de prélèvement de dimensions

non fixées et une répartition aléatoire des plantes à prélever.

A partir de ce recensement, il a été décidé de tester deux protocoles (voir ci-après).

2) Protocole d’échantillonnage de plantes Les protocoles retenus sont le protocole du RMQS et le protocole PGM.

Le protocole du RMQS (Réseau des Mesure de la Qualité du Sol) est initialement prévu pour un prélèvement de sol. Il

a été adapté au prélèvement de plante afin de réaliser des études de transfert des métaux du sol à la plante. Il

permet de quantifier et de visualiser les variations de contaminations en éléments traces métalliques (ETM) et de

mycotoxines à l’échelle d’une placette du RMQS. Un descriptif détaillé de ce protocole est joint en Annexe 3. La

placette de prélèvement de plante s’étend sur 20m x 20m et requiert le prélèvement de 25 plantes (1 par sous

placette).

Le protocole PGM (Protocole Générique Multi-contaminants) a été rédigé par le doctorant embauché dans le cadre

du projet CASDAR/Région, en collaboration entre le LCABIE, l’USRAVE de l’INRA de Bordeaux et l’ENITAB. Il a été

également élaboré en vue de l’étude du transfert-sol plante et afin d’être représentatif d’une contamination en ETM

et mycotoxines à l’échelle de la parcelle. Le protocole PGM est détaillé en Annexe 4.

Afin d’évaluer et in fine de disposer de protocoles d’échantillonnage validés (livrable du projet), les protocoles RMQS

et PGM ont été testés sur site. Pour cela, à partir du réseau de parcelles disponible dans le cadre de ce projet et à

l’issue d’une discussion entre les différents partenaires, il a été décidé d’effectuer ces tests sur le site d’Auzeville-

Tolosane (Région Midi-Pyrénées (31)). Ainsi, des plants de blé en phase récolte ont été prélevés une parcelle de ce

domaine le 27/06/2011.

Pour les deux protocoles, les plantes ont été prélevées manuellement en vue d’une analyse d’ETM et mycotoxines

(sans gants). Elles ont été coupées à environ 5 cm au-dessus du sol à l'aide d'un couteau en céramique. Elles ont

ensuite été placées dans des sacs en polyéthylène (un sac par échantillon).

La totalité des échantillons a ensuite été stockée dans une voiture climatisée puis transportée à l'USRAVE de L'INRA

de Bordeaux, Unité dans laquelle les plantes ont été analysées.

Deux éléments de la plante ont été étudiés : les grains et la paille (feuilles + tige). Le traitement des échantillons a

entièrement été mené au laboratoire.

3

3) Protocole de traitement des échantillons de plantes

Le protocole de traitement des échantillons de blé utilisé dans cette étude est un protocole validé et approuvé par

l’USRAVE pour le RMQS, et également retenu pour le PGM. Il est fourni en Annexe 5. Ce protocole décrit les

opérations à suivre en vue d’une étude de spatialisation (répartition de la contamination en ETM et mycotoxines au

sein de la placette RMQS) et d’une étude globale (contamination moyenne de la placette par la réalisation

d’échantillons composites).

Dans l’étude réalisée afin d’évaluer les deux méthodes de prélèvement, 112 échantillons de plantes ont été ainsi

préparés.

De plus, une étude complémentaire a été réalisée. Elle a permis de déterminer quel était le nombre minimal de

plantes à sélectionner par lot afin d’obtenir des résultats statistiquement représentatifs de la teneur en

contaminants au niveau du point de prélèvement. Pour cela, un prélèvement correspondant à 30 échantillons

supplémentaires a été effectué au niveau d’un point de prélèvement. Les manipulations correspondantes sont

décrites en Annexe 6.

Parallèlement, la possibilité de contamination lors du battage des épis (par la batteuse) a également été soulevée. En

effet, la batteuse mécanique étant constituée de pièces métalliques susceptibles de contaminer les échantillons en

ETM, des contaminations peuvent s’ajouter pendant le traitement des échantillons et donc fausser les analyses.

C'est pourquoi il a été décidé de procéder à des essais simultanés, un dans lequel les épis seront battus par la

batteuse et l'autre dans lequel les épis seront égrainés manuellement. Ne disposant pas de batteuse mécanique

pour le moment, tous les échantillons ont été égrainés à la main. Cette étude sera cependant menée ultérieurement.

Au bilan 142 échantillons ont été analysés à l’USRAVE. Des tableaux répertoriant les différents échantillons et leurs

nomenclatures sont joints en Annexe 7.

- Le protocole PGM est amené à être ajusté afin d’être optimisé en fonction des résultats obtenus (nombre de

plantes à échantillonner par point de prélèvement et nombre de points de prélèvement à déterminer)

- de sa facilité à être mis en œuvre par un professionnel sur le terrain. Il a d’ores et déjà été prévu que cet

aspect opérationnel soit discuté avec les personnes impliquées sur les sites expérimentaux, des agriculteurs

et les personnels des instituts.

Ref:

Erwin E.J.M Temminghoff et Victor J.G. Houba, Plant Analysis Procedures, Second Edition, 2005; Handbook of Reference Methods for Plant Analysis, Yash P. Kalra, 1997

4) Le protocole de conservation des échantillons

Ce protocole a été défini selon l’expérience acquise par l’USRAVE. Il sera donc appliqué dans le cadre de ce projet.

Ainsi, pour réaliser l’analyse d’éléments minéraux (majeurs, oligoéléments et traces) ainsi que des mycotoxines, il est

nécessaire que l’échantillon soit conservé sec (moins de 10 % d’humidité). La température de séchage et de stockage

ne doit pas excéder 50°C (certains éléments ne seraient plus analysable : certains composés de l’azote ou du soufre,

le Hg, le Se). Les contenants doivent limiter au maximum les échanges gazeux avec l’extérieur afin d’éviter que

l’échantillon reprenne de l’humidité ou puisse être contaminé par des poussières (flacons à cape ou à bouchon à

lèvre, sacs soudés). Les flaconnages en verre, en matière métalliques, en PVC ou « en matières plastiques colorées »

doivent être évités (ou ne doivent pas être en contact direct avec les échantillons : bouchons par exemple).

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La protection contre la lumière est une précaution supplémentaire (aucune donnée ne permet d’affirmer qu’une

dégradation des minéraux ou mycotoxines d’un échantillon peut apparaître lorsque celui-ci était exposé à la

lumière).

Les échantillons conservés en entier ne subissent pas plus de dégradation que les échantillons broyés. La seule

difficulté dans ce cas est de trouver un contenant de volume adapté à l’échantillon (cas de tiges de blé par exemple).

Pour les échantillons végétaux, une difficulté peut être la présence de rongeurs dans les locaux (même les

flaconnages épais en matière plastique ne garantissent pas une bonne protection de l’échantillon).

Les échantillons de grains qui seront conservés sous forme de farine, doivent impérativement être placés, dès le

broyage fini, dans des flaconnages hermétiques (afin de prévenir la prolifération d’insectes).

5) Conservation des échantillons à long terme Test de différentes conditions de stockage.

Il peut être nécessaire de ré-analyser des échantillons de végétaux après plusieurs années de stockage et ce pour

diverses raisons :

- Vérification de la validité d’une nouvelle méthode d’analyse ;

- Nouveaux paramètres à analyser (les résultats obtenus seront-ils alors comparable aux résultats qui auraient

été obtenus si l’analyse avait été faite de suite ?)

- Confirmer un résultat ancien.

Nous proposons de tester le protocole de conservation à long terme sur plusieurs échantillons représentant les

matrices ciblées dans le RMT Quasaprove : blé, maïs, tournesol (tiges et grains) soit 6 échantillons différents.

Le mode de conservation de référence est celui décrit dans le protocole de conservation : température ambiante,

flacons en polyéthylène hermétiques, à l’abri de la lumière directe, échantillon séché et broyé.

Les deux modes de conservation alternatifs concernent :

- la conservation à froid avec deux températures cible (-18°C, -80°C)

- la conservation en sachet sous vide d’air.

Les contaminants ciblés sont prioritairement les minéraux et les mycotoxines, mais l’étude pourra être étendue aux

composés organiques si des financements complémentaires sont acquis.

Tous les échantillons utilisés pour le test seront séchés et broyés (ce protocole ne pourra être appliqué aux tests de

conservation des échantillons pour l’analyse des composés organiques volatils qui seront faits sur de la matière

fraiche broyée ou entière). Chaque échantillon sera homogénéisé puis divisé en utilisant les normes en vigueur.

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4 x 10 sous échantillons seront préparés. « 4 » correspond au nombre de conditions testées (TA, -18°C, -80°C et

sous vide à TA) ; et « 10 » correspond au nombre de fois où les échantillons seront ré analysés. Les nouvelles

analyses sont prévues avec une fréquence de :

- deux fois par an l’année 1 à 6 mois d’intervalle

- tous les ans de l’année 2 à l’année 5

- tous les deux ans de l’année 5 à l’année 11

- l’année 20

Ref: F. Mutsch et al, Experimental design to detect chemical changes of forests soils during long term storage, 2011.

6) Résultats

Les échantillons de pailles et de grains ont été analysés à l’USRAVE au début du mois de décembre. Une page de

résultats bruts est fournie en Annexe 8. Ces résultats correspondent aux éléments analysés sur l’échantillon de paille

A1 prélevé selon le protocole RMQS (cf. Annexe 3). L’Annexe 8 présente en particulier les quantités d’éléments

traces métalliques retenus dans le cadre du volet de ce projet à savoir l’arsenic, le cadmium, le cuivre, le plomb et le

zinc. Des travaux de traitements des données et de calculs statistiques seront effectués dès le début du mois de

janvier 2012 afin d’évaluer le nombre de plantes à prélever par point de prélèvement et le nombre de points de

prélèvement à sélectionner afin d’être représentatif de la placette et de la parcelle.

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Annexe 1 : Accord au niveau du vocabulaire

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Protocoles Dimensions

de la placette Sous placettes

Surface des sous placettes

Localisation des sous placettes

Prélèvement par sous placette

Échantillon par placette

Opérations à suivre Précautions particulières

Maïs INRA

Colmar

9 m x 10 m 12 rangs sur la

largeur

3 sous placettes : 1 rang sur

7 m de longueur

15,75 m2

17,5 %

Rang 3, rang 7 et rang 10

Épis : 1 sac Grains : 2 kg

Rafles : 5 Tiges : 5

Grains : 6 kg Rafles : 15 Tiges : 15

Pesée, comptage, battage des épis

Pesée, homogénéisation des grains puis séchage à 50 °C. Pesée des tiges et rafles puis

séchage et broyage au SM 2000

/

Maïs Feucherolles

2005

10,4 m x 48,5 m

5 sous placettes sur

les 6 rangs centraux : 2 rangs sur 2,5 m de longueur

20 m2

4 %

1ère placette à 10 m des limites de la sous placette

dans le sens de la longueur et 3,2 m dans le sens de la

largeur.

Distance entre sous placettes :

4 m sur la longueur et un rang sur la largeur.

Épis : /

Grains : /

Rafles : /

Tiges : 6

Grains : 1 kg

Rafles : /

Tiges : 5

Pesée des épis puis battage et pesée des grains

Séchage à 50°C des grains puis récupération et séchage des

rafles. Récolte des tiges puis pesée

puis séchage à 50 °C

/

Céréales ARVALIS Institut

du végétal

Pas de taille fixe de

placette

16 sous placettes réparties

aléatoirement

/ Aléatoire

Épis : 100 Grains : / Rafles : / Tiges : /

Épis : 1600 Tiges : /

Prélèvement des épis puis séchage à l'étuve 60 °C ou

conditionneur puis conditionnement dans sacs

plastiques Battage, pesée des grains puis

broyage

Palier à la variabilité verticale

Éviter les tournières et passage de roues

Tiges coupées au ciseau sous le rachis

RMQS RMT

Quasaprove 20 m x 20 m

25 sous placettes de 2 m sur 2 m

100 m2

25 %

Une sous placette sur deux et un rang sur deux

1 individu 25 individus / Gants, couteaux

céramiques, glacière, poches plastiques

Blé et orge INRA

Colmar

9 m x 10 m 18 rangs sur la

largeur

4 sous placettes :

3 rangs sur 1,5 m de longueur

2,7 m2

3%

Première et quatrième sous placettes situées à 1 m de chaque limite de la

placette.

Épis : / Grains : / Tiges : /

Grains : / Tiges : /

Coupe du blé, pesée des gerbes Battage, pesée et

homogénéisation des grains. Récupération des résidus de récolte, séchage à 50 °C et

Assembler le blé par gerbe pour chaque

sous placette

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broyage au SM 2000 puis homogénéisation

Blé Feucherolles

2009

10 m x 45 m 80 rangs de

blé sur la largeur

10 sous placettes :

4 rangs sur 0,5 m

2,5 m2

0,6 %

Les sous placettes 1 et 10 se situent à 10 m de la

limite de la placette selon le sens de la longueur et la placette 6 se situe à 25 m

de cette limite.

Les sous placettes 1, 5, 6 et 10 sont à 2,5 m du bord de

la placette.

L’écartement entre les sous placettes est de

1 m et la distance entre deux sous placettes dans le sens de la longueur est de

3 m.

Épis : /

Grains : /

Tiges : /

Grains : /

Tiges : /

Comptage des épis et séparation des tiges.

Pesée des épis et des tiges après séchage à 50 °C pendant

5 jours Battage des épis, séchage des grains à 50 °C pendant 3 jours.

Blé coupé à 5 cm du sol

Tournière* = Espace réservé pour faire tourner la charrue au bout du sillon / = Non Renseigné

Annexe 2 : Recueil des méthodes d’analyse (du prélèvement au champ à la préparation des échantillons)

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Annexe 3 : Protocole d’échantillonnage du RMQS

Théorie : Une placette a été définie dans la parcelle. Son géo-référencement a été localisé et enregistré par GPS. Cette placette a une dimension fixe de 20m x 20m quelle que soit la surface de la parcelle. Elle a ensuite été découpée en 100 sous placettes (2m x 2m). Les prélèvements ont eu lieu sur 25 sous placettes, chacune d’entre elles étant séparée d’un inter rang. La figure 1 ci dessous est un modèle d’illustration :

A9 C9 E9 G9 I9

A7 C7 E7 G7 I7

A5 C5 E5 G5 I5

A3 C3 E3 I5 I3

A1 C1 E1 G1 I1

Figure 1 : Placette du RMQS

A la parcelle : Au total, quatre plantes ont été prélevées au centre de chaque sous placette retenue (25) et ont été placées dans un sac poubelle (un lot). Une des quatre plantes de chaque lot a été analysée individuellement en vue d’une étude de spatialisation de la

placette du RMQS (spatialisation en termes d’ETM et de mycotoxine).

Le reste des plantes a servi à préparer trois échantillons composites. Pour cela, une plante de chaque lot

correspondant aux différents points de prélèvements du RMQS a été sélectionnée. La totalité des plantes (25

plantes) a été regroupée. Ceci a été reproduit deux fois supplémentaires pour obtenir trois échantillons composites.

Idéalement, il aurait été préférable d'un point de vue pratique de ne prélever qu'une plante par lot puis procéder à la

spatialisation et à la réalisation de l'échantillon composite par la suite. Cela dit, la matière prélevée dans cette

optique ne suffit pas, d’où le prélèvement de quatre plantes par lot.

Au total, 100 plantes de blé ont alors été prélevées sur la placette pour ce protocole.

20 m

Inter - rang

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Figure 2 : Grille de prélèvement du RMQS

La grille de prélèvement du protocole RMQS fournie en figure 2 a été préalablement positionnée à l’aide d’un GPS. Les points A, B, C, D représentés sur la figure 2 sont des repères qui permettent de localiser la grille sur la parcelle. Ils ne correspondent pas à des points de prélèvements. Cette grille a été positionnée au centre de la parcelle. La figure 3 permet de situer la grille de prélèvement dans la parcelle.

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Figure 3 : Localisation de la grille de prélèvement du RMQS dans la parcelle

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Annexe 4 : Protocole d’échantillonnage du PGM

Théorie :

Le nombre de placettes de prélèvement est fixé à 25 (identique au protocole du RMQS). Afin d’être applicable pour toutes parcelles quelles que soient leurs dimensions, les 25 placettes sont positionnées sur la parcelle selon la méthodologie suivante :

- Les bordures de la parcelle sont redéfinies afin de ne pas avoir de placette de prélèvement située trop près des bords (la bordure est redéfinie à 4 mètres à l’intérieur de la bordure réelle de la parcelle) ;

- La parcelle (corrigée de la bordure) est ensuite découpée en 20 placettes (division par 5 sur la longueur et par 4 sur la largeur) ;

- Pour les placettes situées à chaque coin de la parcelle, les points de prélèvement doivent être situées à chaque coin de la bordure redéfinie* ;

- Pour les autres placettes, les points de prélèvement sont définis aléatoirement (type A) ; - La parcelle entière (corrigée de la bordure) est ensuite découpée en 4 « grandes placettes » - 4 points de prélèvement sont placées aléatoirement (1 dans chaque « grande placette ») (type B) ; - Enfin, un dernier point est sélectionné aléatoirement dans toute la parcelle (corrigée de la bordure). Il

convient de choisir un point suffisamment éloigné de tous les autres points de prélèvement (type C). Un plan résumant cette méthodologie et indiquant le positionnement des 25 points de prélèvement sur la parcelle d’Auzeville-Tolosane est fourni en Figure 4. *Bordure redéfinie : permet de retracer la parcelle en retirant les bordures (située à 4 mètres à l’intérieur de la bordure réelle de la parcelle). Ce protocole mêle ainsi à la fois des paramètres définis mais également de l’aléatoire.

A la parcelle : Au total, environ vingt plantes ont été prélevées au niveau de chaque point de prélèvement (25). Ce qui représente une quantité totale de 500 plantes. Des tests ont été effectués afin d’étudier s’il est possible de réduire ce nombre de plantes prélevées par point de prélèvement (cf. paragraphe 3))

L’idée initiale est de déterminer le nombre de plantes à sélectionner dans chacun des lots afin que l’échantillon constitué soit représentatif de la teneur en ETM et mycotoxines contenue dans les plantes situées au niveau du point de prélèvement.

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Figure 4 : Points de prélèvements du PGM

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Annexe 5 : Protocole de traitement des échantillons de blé

A) Etude de spatialisation :

Chacun des 25 échantillons a été préparé et analysé de façon individuelle. Le protocole suivi fut le suivant :

(1) Prélever aléatoirement une des quatre plantes de chaque lot. Le prélèvement se fait à la main (sans gants).

(2) Séparer l’épi de la paille à l'aide d'un couteau en céramique.

(3) A) 1/ Placer la paille dans un sac/flacon plastique étiqueté.

2/ Sécher les 25 sous échantillons de paille à l’étuve à 50°C. Veiller à l’homogénéité de la température

dans l’étuve.

3/ Broyer les 25 sous échantillons de pailles individuellement et les homogénéiser. Utiliser un broyeur à

lame de type SK1.

4/ Minéraliser les 25 sous - échantillons de paille individuellement (Minéralisation voie sèche, HNO3)

B) 1/ Égrainer chaque épi individuellement à la main. Pour ce faire, retirer les barbes de chaque épi (si les

épis en sont pourvus) puis broyer grossièrement les épis à la main de sorte à ce que les grains se séparent des

épillets (enveloppes des grains). Ensuite, se munir d’un aspirateur et fixer un grillage à fines mailles

(dimensions de la maille << dimensions du grain) sur son embout. Mettre l’aspirateur en marche et

l’approcher des sous échantillons. Ainsi, seules les parties légères des épis sont aspirées et se fixent sur le

grillage, les grains restant dans le flacon contenant initialement les épis. Se débarrasser des enveloppes fixées

sur l’embout et renouveler l’opération jusqu'à ce que le flacon ne contienne que les grains.

2/ Placer les grains dans un sac/flacon plastique étiqueté.

3/ Sécher, broyer et minéraliser les 25 sous - échantillons de grains individuellement selon les même

méthodes que précédemment. Utiliser dans ce cas un broyeur de type M20 ou ZM100.

Les broyeurs utilisés doivent être non contaminants et ne doivent pas engendrer de pertes de sous échantillons.

Ce protocole est illustré par le schéma présenté en figure 5 relatif au lot RMQS A1 (cf. Annexe 7 pour la

nomenclature des échantillons) et à appliquer pour les 25 lots :

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Figure 5 : Schéma du protocole opératoire mené pour une analyse ETM, mycotoxines

Au total, pour l’analyse de spatialisation, 50 sous - échantillons différents ont été analysés (25 de pailles et 25 de

grains pour une analyse d’ETM et de mycotoxines).

B) Échantillons composites :

(1) Prélever aléatoirement à la main une des trois plantes restantes dans chaque lot.

(2) Regrouper chacune des plantes prélevées dans chaque lot (25 plantes).

(3) Séparer les épis des pailles pour les 25 plantes à l’aide d’un couteau en céramique.

A) 1/ Placer toutes les pailles dans un même sac/flacon plastique étiqueté.

2/ Sécher, broyer et minéraliser l’échantillon composite de pailles.

B) 1/ Égrainer la totalité des épis

2/ Placer l’ensemble des grains dans un sac/flacon plastique étiqueté.

3/ Sécher, broyer et minéraliser l’échantillon composite de grains.

Renouveler ces opérations deux fois de sorte à obtenir 3 échantillons composites de pailles et 3 échantillons

composites de grains.

Annexe 6 : Détermination du nombre de plantes minimal représentatif du point de prélèvement

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L'étude a été menée sur des plantes prélevées au niveau d’un point de prélèvement parmi les 25 : Le lot PGM 19 (cf.

Annexe 7 pour la nomenclature des échantillons).

Procéder à des sélections successives de plantes issues du lot PGM 19. Les nombres de plantes à prélever simultanément sont : 1 ; 2 ; 5 ; 10 et 20. Cela représente 5 sous-lots à partir du lot initial PGM 19. Cette étape est à répliquer trois fois. Le nombre de sous-lots total est donc de 15. Pour chaque sous - lot, procéder aux opérations suivantes :

(1) Séparer l’épi de la paille à l'aide d'un couteau en céramique.

(2) A) 1/ Placer la paille dans un sac/flacon plastique étiqueté.

2/ Sécher, broyer et minéraliser les 15 échantillons de paille individuellement.

B) 1/ Égrainer chaque épi individuellement.

2/ Placer les grains dans un sac/flacon plastique étiqueté.

3/ Sécher, broyer et minéraliser les 15 sous - échantillons de grains individuellement.

Les échantillons étant préparés, procéder aux analyses ETM et mycotoxines puis tracer un graphe

[ETM, mycotoxines] = f(nombre de plantes formant le sous - lot) et déterminer le nombre minimal à prélever pour lequel la concentration en contaminant ETM et mycotoxines ( [ETM, mycotoxines] ) devient constante pour les ETM et pour les mycotoxines (prendre le nombre le plus élevé des deux) à la fois pour les pailles et pour les grains.

Ce nombre est noté X étant donné qu’il est encore inconnu à ce niveau de l’étude

Voici présenté en figure 6 ci-après un exemple de ce qui peut être obtenu :

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Figure 6 : Exemple de résultats pouvant être obtenus pour la

détermination du nombre significatif de plantes à prélever X (PGM)

Dans l’exemple de la figure 6, le

nombre minimal de plantes à

sélectionner pour procéder aux

analyses d’ETM et de mycotoxines

dans les grains et dans la paille est de

X = 10 plantes.

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Annexe 8 : Résultats bruts : Point de prélèvement A1 du protocole RMQS