This article was downloaded by: [University of Illinois Chicago]On: 27 November 2014, At: 19:38Publisher: Taylor & FrancisInforma Ltd Registered in England and Wales Registered Number: 1072954Registered office: Mortimer House, 37-41 Mortimer Street, London W1T 3JH,UK

Acta Botanica Gallica: BotanyLettersPublication details, including instructions for authorsand subscription information:http://www.tandfonline.com/loi/tabg20

Caractérisation d'ADNc dontl'expression est réguléelors du développement del'ectomycorhize d'EucalyptusDenis Tagu a & Francis Martin aa INRA Nancy, Équipe de Microbiologie Forestière ,F54280 , ChampenouxPublished online: 27 Apr 2013.

To cite this article: Denis Tagu & Francis Martin (1994) Caractérisation d'ADNcdont l'expression est régulée lors du développement de l'ectomycorhized'Eucalyptus, Acta Botanica Gallica: Botany Letters, 141:4, 421-427, DOI:10.1080/12538078.1994.10515178

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Acta bot. GaUica, 1994, 141 (4), 421~127.

Caracterisation d'ADNc dont !'expression est regulee lors du developpement de l'ectomycorhize d'Eucalyptus

par Denis Tagu et Francis Martin

INRA Nancy, Equipe de Microbiologie Forestwre, F5,t280 Champenoux

Resume.- Afin d'analyser les modifications molaculaires induites Iars de Ia diffarenciation de l'ectomycorhize d'Eucalyptus, l'accumulation de transcrits fongiques et racinaires est atudiee. Pour cela, una banque d'ADNc correspon­dant aux populations d'ARNm presents dans las cellules des mycorhizes en cours de formation a eta construite dans un vecteur phagique. Un criblage dif· farentiel a perm is d'isoler des ADNc differentiellement exprimes Iars de Ia for­mation de Ia mycorhize. La majorite de cas ADNc son! d'origine fongique at nous estimons que 50% des populations d'ARNm fongiques sont modifiees par !'installation de Ia symbiose. Six ADNc ont ate selectionnes at son! en cours de caracterisation par sequen<;:age. Pour 5 d'entre aux. aucune simili­tude de sequence significative avec las genes repertories dans les d~ferentes banques de donnees interrogees n'a ate mise en evidence. La sixieme clone possede una sequence voisins d'une proteins de defense vegetale, suggerant que Ia reaction de defense constitue l'un des programmes genetiques enclen­che par le developpement de l'ectomycorhize.

Summary.- Molecular analysis of the differentiation of mycorrhiza has been pertormed by developping a differential screening of a eDNA library from Eucalypt ectomycorrhiza. Fungal mRNA populations have been characterized and about 50 % of these populations are affected by the fomnation of the symbiotic organ. Six eDNA clones have been selected for further identification by DNA sequencing. For 5 of them, no significative homology have been found when comparing their sequences with those compiled in data bases. The sixth one is homologous with a PR protein, suggesting that (i) tt is enco­ded by the root genome and (ii) defence reaction is one of the genetic pro· gram which is changed during the development of the eucalypt ectomycorrhi­za.

Key words : Basidiomycete - differential screening - ectomycorrhiza - Euca­lyptus - PR proteins.

INTRODUCTION

La formation d'une ectomycorhizc pro­voque de nomhreuses modifications morphologiques, ultrastructuralcs ct

© Soci8t~ botanique de France 1994. JSSN 1253-8078.

biochimiqucs des cellules des deux par­tenaircs (cf. Martin et Hilbert, 1991). Ccci suggerc que le developpemcnt de I' organc symbiotique s' accompagne de

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changements dans !'expression des ge­nes des deux partenaires (Martin et Tagu, 1995). L'etude de Ia biosynthcse des proteines a eonfirme cette hypothese (Hilbert et Martin 1988 ; Hilbert et al., 1991 ; Simoneau et al., 1993) en mon­trant que Ia synthese protcique dans l'organe mycorhizien est differente de celle active dans les eellules des parte­naires non assocics. Dans le cas de !'as­sociation ectomycorhizienne entre !'Eu­calyptus et le Gasteromycete Pisolithus tinctorius, les changements dans Ia bio­synthese proteique sont nomhreux et des protcines regulees par la symhiose (pro­teines SR) ont ete mises en evidence. Parmi ces proteines SR, se trouve un groupe particulier constitue de polypep­tides qui ne sont detectes que dans l' or­gane symhiotique en formation. Ces protcines ont ete appelees "ectomy­corhizines". La structure et la func­tion des differentes protcines SR - et plus particulicrement des ectomyco­rhizines - restent pour le moment in­connues. Plusieurs approches methodo­logiques devraient permettre de carac­teriser certaines de ces proteines. L'une d'entre elle consiste a identifier les ge­nes ou les ARNm codant pour ces poly­peptides. Dans cet article, nous presen­tons le clonage par crihlage differentiel d' ADNc correspond ant a des genes rc­primcs ou stimules lors de Ia diffcren­eiation de l'eetomycorhize d 'Eucalyp­tus globulus- Pisolithus tinctorius. Cer­tains de ces ADNc sont ensuite caractc­rises par sequenc;age.

MATERIEL ET METHODES

Materiel blologlque Eucalyptus g/obulus, sous-espece bicostata, a eta

utilisee comma plante-hOte, les graines provenant de Sylica Seeds (Australia). Le champignon (Pisolithus tinc­torius isola! 44 t) est conserve dans Ia mycotheque de I'Equipe de Microbiologie Forestiere (INRA de Nancy). La germination des graines, Ia culture du champignon et !'obtention d'ectomycorhizes ont eta decrites par Hilbert eta/. (1991).

Construction de Ia banque et crlblage dlfferantlel La banque d' ADNc a eta construite dans le vecteur

phagique AZAP en suivant les recommandations du fa­bricant (Stratagene) a partir de 3 ~g d'ARNm de raci­nes d'Eucalyptus mises au contact du mycelium de P. tinctorius pendant 4 jours (fagu eta/., 1993).

La methode de criblage differential assists par PCR est decrite en detail par Tagu eta/. (1993). La figure 1 donne une representation schematique de Ia methode. Brievement, des plages de lyses de Ia banque d'ADNc sent prelevees individuellement et les inserts d'ADNc contenus dans les phases amplifies par PCR a l'aide d'amorces nucleotidiques utilisees pour le sequen«age en plasmide Bluescript (Stratagene). Les produ~s d'am­plification sent ensuite separes par electrophorese en gel d'agarose, chaque gel etant realise en double exem­plaire. Les deux gels identiques sent transferes sur des membranes de Nylon (Hybond-N Amersham). Pa­rallelement, des sondes radioactives sent synthetisees a partir d'ARNm so it de mycorhizes de 4 jours, soil de mycelium en culture pure. Les deux lots de membra­nes sent alors hybrides separement avec l'une ou I' au­tre sonde : c'est le criblage differential sensu stricto. Les autoradiogrammes obtenus sent numerises en uti­lisant le scanner Microtek 600ZS connects a un ordi­nateur Apple Macintosch llfx. Les donnees sent sauve­gardees sous un fichier TIFF et sent ensuite quantl­fiees par le programme Image v.1.44 developpe par le Dr. W. Rasban (NIH, Bethesda, USA).

Sequenc;:age des ADNc Les plasmides recombinants et selectionnes apres

criblage differential sent excises de I'ADN du phage A..ZAP en suivant le protocols du fournisseur (Strata­gene). Pour le sequenc;age, les molecules plasmidi· ques sent purifiees sur colonnes Oiagen (Dusseldorf). La sequence se fait salon Ia technique des dideoxyri­bonucleotides en utilisant I'ADN T7 polymerase du kit de sequenc;age Pharmacia. Les sequences nucleotidi­ques sent editees a I' aide de !'application SeqApp mise au point par le Dr. G. Gilbert. Les sequences sent comparees aux sequences repertoriees dans les ban­ques de donnees Genbank et EMBL par l'intermediaire du programme Blast (NCB I).

RESULTATS ET DISCUSSION

Criblagc differcnticl Le criblage differentiel a ete effectue

sur une banque d'ADNc de mycorhize d'Eucalyptus en cours de differencia­tion ( 4 jours a pres contact avec le my­celium de Pisolithus tinctorius). A ce stade de devcloppement, le champignon a colonise Ia racine. Le manteau et le rcseau de Hartig sont en formation. Sur ce mcme materiel, il a ett demontre pre-

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Fig. 1.- Representation scMmatique du criblage diff9rentiel assists par PCR utilise pour l'isolement d'ADNc fongi­ques regules lors du developpement de l'ectomycorhize.

Fig. 1.- Flow diagram for isolation of regulated fungal genes by PCR-assisted differential screening.

cedemment qu 'a ce stade de dcvcloppe­ment, Ia grande majorite des polypepti­des synthetises etaient d 'origine fongi­que (Hilbert et al., 1991). L'hypothcse

qui j ustifie le criblage differentiel sup­pose que les populations des ARNm codant pour ces proteines seraient ega­lcment modifiees par }'installation de Ia

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symhiose. Les rcsultats du criblage sont dccrits en detail par Tagu et al. (1993). En resume, une centaine d'ADNc a etc analysce et 2/3 d'entre eux correspon­dent a des transcrits codes par le ge­nome fongique. Parmi ces ADNc, envi­ron 60 % correspondent a des popula­tions d'ARNm dont la concentration est modifice par !'installation de la sym­biose. Cette proportion est comparable a Ia distribution des polypeptides affec­tcs lors de Ia formation de l'ectomyco­rhize (Hilbert et al., 1991), validant !'hypothese de depart sur le criblage dif­ferentiel. La figure 2 represente les con­centrations relatives determinees apres criblage differentiel de quelques ARNm fongiques sClectionnes pour unc carac­terisation plus precise. Le clone Mycfl02' (Myc pour "banque de myco­rhize" et f pour "clone fongique" sui vi du numcro du clone) correspond a des ARNm dont !'accumulation diminue fortement dans l'ectomycorhize en for­mation. La concentration des ARNm du clone Mycf34 ne semble pas affcctee par le developpement de la symbiose. Par contre, les clones Mycf20', Mycf39,

MycflO' et Mycf7 correspondent a des populations d'ARNm qui augmentent dans Ia mycorhize. Le niveau d'hybri­dation obtenu avec la sonde fongique sur les clones Mycf20' et Mycf39 est a la limite de la detection.

Ces 6 clones ont etc purifies et sont en cours de sequen .. age. Les sequences partielles des clones Mycfl02', Mycf34, Mycf39, MycflO' et Mycf7 sont presen­tees sur Ia figure 3. La comparaison de ces sequences avec les quelques 200000 sequences repertoriees dans les banques de donnees GenBank ou EMBL n, a pas permis de mettre en evidence des similitudes. Ce resultat ne permet done pas pour le moment ·:!'assigner un nom ou une fonction aux proteines co­dces par ces clones. Il faudra attendre l' obtention de Ia sequence entiere de ces ADNc afm de conclure sur une even­tuelle fonction des proteines. L' analyse fine de !'expression de ces genes per­mettra egalement de preciser la regula­tion spatio-temporelle de chacun de ces genes au cours de Ia differenciation de l 'ectomycorhize.

La sequence du clone Mycf20' pre-

!2l Mycelium

• Ectomycorhize

0 Mycfl02' Mycf 34 Mycf 20' Mycf 39 Mycf 10' Mycf 7

Fig. 2.- Concentrations relatives de­terminees par criblage differen­tial de 6 ARNm fongiques dans le mycelium en culture pure et dans l'ectomycorhize en forma­tion.

Fig. 2.-Relative concentration of 6 fungal transcripts in free-living mycelium and in ectomycorrhi­zas, determined by PCR-assis­ted cDNAs screening.

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Mycf/02'

GAGATCAGTGGGCGCATGTCTGAAAATGATCCAGGACCGATTCTTGGGTCTGTG TACGTGAACAAGCTCATAGAACGCTTCACAAATGCCACCGGTGATGCAANAGAA CTCTACCTGGAATTCGGTCAcGACACGAGCATTCTACTTGTGCTATCTGAATTG GGGTTGAACAAAGACCGGACGCTACTTCCTGAAGACCACATTCGTACCCACCGC AAGTTCCGGACTTCGGAACAAACCCCCTTTGCCGCGAGGATGGTCTGGGAGAAG TTCTCTTGCGAAAATCTTTCCGTGGGCCCTCAGATTCGGCTGCTTCTGAATTTC AGCCACATA

Mycf34

CGAGCTGACCACTGTGGAAGAACAACGGTAGTTGCATACCTCACACCCAGAAAC CGCACGATCGGTTCCGTGGGACCTCGTTCGTTCGCCGCAAGTGCCCTCTTGTTC TCGGACTGGCTCGTCAGCGAGCAGAAAGCGTCCAATTCGACTGGACTGAGTATG CGCGAGGCGAGCTTGGACAGGCCACGTCGTTCGATGAGGGCTGCCAAACGAGGG ACGTGGAGAATGTCAATGCCTATGCCATGGATGGGCATGGCGTCGTAGTAGTCA AGTTAATTAGTAGTTCTACCGAGAACTCGATGTACAGATGATGCGTGCTACGGG CAAAATAACACGAAAGTACTTTTTTTTCTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAA.AAAAAAAAA

Mycf39 GATTTATTTCTTATTCACGACCCATTTTTCTTGGAGCAGAGCGACGTTTGGAT ACGTATAGAGCATTATTAGATGCTCAGAGAGCCGGCAAGATCAGGACAGTGGA GTCTCGAACTACGGCATTAAACACCTCGACGAAATAAAAACGGCTGGTTTGCC CATGCCTGCTGTCAACCAAATAGAGGTTCATCCCCTGTGCCAGCAGCACCCAA TTGTGAGTACTGCCGTGCCATGCATTGTGTCAGCCTACTGTCCTATCATCCGG GGCGCA

MycflO'

CGGCACGAGGTTCTTTCGGATCTTCGGAGGCTGCGCGATCTGCACGAGTACGAC CGATTCGACTCAGAAGTTAGCGGCTGTTGGAGAAATGGCATCGAATGGACCAGC ACCACCCAGAGGCAGTCGCAGCAGACAGCTGCTAGCATGCGTAGGCGGAGGACA ACTGGTGGTGGTGCCTCAGGAGGAGCAACTGGGACGATGCTGCAGTTCTACACT GATGATGCCCAGGACTGAAGATCTCTCCAAGTGTGTTCTTGTTATGAGCATGGC TTCATTGCTTTTGTTGCCATCCTTCATGTCATGGTAGCTCTACTTGGTC

Mycf7 CAAGTGAAAGCGGAAGGATCTTGCCCGTATCCCGAAGACATGATAACAATTAA AGCTACAGCAACTATCCGCGCGCGTTAGTACCAGGAGTGTGAGAGGTTCTAAT CCAGGTTGACTTTTGTTTGTTTGTTTTTTGTTCAGTTAGCAAAACGTTCATCC GCTGCAATTTCACTAATACCTCTTGCAATCGTTTTCCCACTTGTTTGTTCTCC TGTAGTTTACCACC

Fig. 3.- sequences nucleotidiques partie lies de 5 ADNc fongiques clones par criblage differential Fig. 3.- Partial nucleotidic sequences of 5 fungal cDNAs cloned by differential screening

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sente une similitude significative avec une proteine PR (Pathogenesis Rela­ted) : la PRP-1. La figure 4 compare la sequence en acides amines d 'une PR-1

d' orge (Bryngelsson et collahorateurs, rcsultats non puhlies, n° d'accession X74939) avec Ia sequence en acides ami­nes deduite de Ia sequence en nucleoti-

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3/ 40 50 58 PR-J Hordeum vulgare Tyr Leu Ser Pro His Asn Ala Ala Arg Ala Ala Val Gly Val Gly Ala Val Ser Trp Ser Thr Lys Leu Gin Ala Tyr AlaGin

I • I I I I I I • I I I I I I I • Myc/20' Tyr Met Ser Ser His Asn Ala Val Arg Ala Lys H•sAsnLeu ProPro LeuSer Trp Ser Thr Ser Leu Thr Asn Tyr AlaArg

63 70 80 90

Fig. 4.- Comparaison de Ia sequence an acides amines de Ia proteina PR-1 d'orga avec Ia sequence an acidas amines deduita de Ia sequence an nucleotidas du clone Mycf20'. La barre verticals montra una idant~e parfa~a des acidas amines. La signa "+" indiqua una idantite soupla entre deux acides amines de mama charge. Las chiffras an italiquas places au-dessus ou en dessous des sequences correspondent aux numeros des acides amines dans las sequences proteiques.

Fig. 4.- Comparison of the amino acid sequence of the PR-1 protein of barley with the deduced amino acid se­quence of the clone Mycf20'. The vertical bar indicate a perfect identity between two amino acids. "+" indicates a light homology between two amino acids of the same electric charge. The ~alic numbers over or under the sequences correspond to the place of the amino acids in the protein.

des du clone Mycf20'. Cette homologie est de 50 o/o d 'identite stricte et de 64 o/o d'identite souple (un acide amine est substitue par un autre de charge equi­valente). Les proteines PR sont des po­lypeptides synthetises par les plantes lors d'attaques microbiennes ou de stress. Le clone Mycf20' est done cer­tainement code par le genome de Ia plante, meme s'il a ete initialement iden­tifie lors du criblage differentiel comme etant un ADNc fongique. Des experien­ces d'hybridations moleculaires ADN/ ARN (de type Northern) devront con­firmer que Mycf20' est d'origine vege­tale.

Le role des PR-1 est pour le moment inconnu ; leur seule caracteristique est qu'elles sont synthetisees lors d'attaques par des pathogenes (Linthorst, 1991) et so us I' action de stress (Eyal et al., 1992). Nous montrons ici que les raci­nes d'Eucalyptus colonisees par un champignon ectomycorhizien accumu­lent des ARNm de proteines PR. Ceci confirme des resultats obtenus sur le meme materiel biologique montrant que des activites chitinasiques sont stimu­lees lors de Ia formation des mycorhi­zes (voir !'article de Lapeyrie et Al­brecht dans ce meme numero). II sem­ble done que l'un des programmes ge-

netiques modifie lors de l'ontogenese de l'ectomycorhize soit celui correspondant a une reaction de defense. Ceci suggere que la plante pourrait confmer ou re­guler son infection mycorhizienne de Ia meme fac;on que les legumineuses inter­viennent sur le nombre de nodules for­mes sur leurs racines (Vasse et al., 1993). Dans un ecosysteme, la plante doit faire face a de nombreux microor­ganismes presents dans le sol. De re­centes experiences de transgenese ont permis !'obtention de plantes sur-expri­mant des proteines de defense (Lamb et al., 1992). Elles resistent ainsi plus for­tement a des attaques fongiques. Cepen­dant, cette modification du phenotype semble intervenir egalement sur leur capacite a contracter des symbioses my­corhiziennes (Miller, 1993). Ces dernie­res donnees montrent que la plante doit reguler et closer ses reactions de defense en fonction de Ia nature des micro­organismes presents dans Ia rhizos­phere.

Remerciements.- Ce travail est soutenu par I'AIP INRA "Biologie du Developpement" et par le programme european "EUREKA- EUROSILVA" intitule "Changes in gene expression during ectomycorrhiza differencia­tion and function". Nous aimerlons ramercier Stepha­nie Blanchard pour son aida au sequen~tage et Ia Dr. Pelletier de I'INRA de Versailles pour l'utilisation du se­quenceur d'ADN Applied BioSystem.

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