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Faculté des Sciences – Département de biologie, Ecologie et Evolution
Institut des Sciences Environnementales Section biologie de la conservation
Caractérisation génétique et conservation des
populations de coronelles lisses (Coronella austriaca,
Laurenti 1768) en Wallonie.
Mémoire présenté par Julie Cauwenbergh en vue de l’obtention du diplôme
de master en Sciences biologiques.
Promoteur : E. Sérusiaux
Superviseurs : E. Graitson et S. Ursenbacher
" Pour conserver la stabilité il faut conserver la variété "
Joël de Rosnay
Faculté des Sciences – Département de biologie, Ecologie et Evolution
Institut des Sciences Environnementales Section biologie de la conservation
Caractérisation génétique et conservation des
populations de coronelles lisses (Coronella austriaca,
Laurenti 1768) en Wallonie.
Membres du jury :
Professeur Jean‐Pierre Thomé, président,
Professeur Emmanuël Sérusiaux, promoteur,
Docteur Sylvain Ursenbacher,
Docteur Mathieu Denoël,
Docteur Johan Michaux.
Année académique 2011‐2012
Remerciements
Au terme de ce travail, Je tiens à remercier mon promoteur Mr Sérusiaux pour m’avoir guidée vers ce projet et pour son accueil au sein du département Biologie, Ecologie et Evolution (BEE).
Parce que ce mémoire est avant tout une association entre la Belgique et la Suisse, je tiens à remercier mes encadrants Eric Graiston et Sylvain Ursenbacher qui ont tous les deux partagé leurs compétences, leur savoir et leur pratiques dans leur domaine respectif. Mais aussi parce qu’ils ont fait preuve d’une grande patience, ce qui m’a permis d’évoluer en tant que scientifique.
Je ne remercierais jamais assez les membres du NLU (Institut für Natur, Landschafts und Umweltschutz ) qui m’ont accueilli comme un membre à part entière de l’équipe et qui m’ont apporté de nombreux conseils ou simplement pour les nombreuses discutions au bord du Rhin. Je pense plus particulièrement à Silvia Geser, Jean‐Pierre vache, Matthieu Raemy, Hans‐Peter, Ellen Häussler, Katharina Hesse, Eliane Riedener et Ruckli Regina, Denes Schmera et Mr Bruno Baur, le chef du département.
Pour sa gentillesse, ses bons conseils et sa disponibilité, je remercie Céline Geiser sans qui je n’aurais jamais réussi à dompter PATHMATRIX. Et merci à Nicolas Ray pour son aide.
Pour leur patience et leurs réponses à mes nombreuses questions concernant Arc Gis, je remercie les membres de l’aCREA (unité de recherche du département BEE) Claude Dopagne et Hendrickx Sébastien.
Je n’en serais peut‐être pas la aujourd’hui sans le soutien de mes collègues et amis, les futurs diplômés de BOE, grand cru 2012. Sans oublié mes « vrais » amis, qui malgré mes absences, ont toujours été derrière moi.
Un grand merci à mes photographes Charlotte Mathelart et Séverine Dalleur.
A Thiago Vynckier mon « frère d’armes » et à Aurore Seredynski, ma référence.
Enfin, je n’aurais jamais pu terminer mes études sans le soutien inconditionnel de mes parents, de mon frère et de ma sœur. Parce que sans vous, je ne serais pas moi.
Merci Miguel pour la patience dont tu as fait preuve, pour tes conseils, pour ton amour… pour être toi.
À vous tous, merci !
Résumé
La crise de la biodiversité actuelle est telle, que les scientifiques n’hésitent pas à parler de 6ème extinction. A ce jour, l’une des plus grande menaces pesant sur les espèces animales ou végétale, est la fragmentation de leur habitat. Qu’il soit totalement détruit ou partiellement morcelé, l’impact sur les espèces est généralement néfaste, allant d’une « simple » diminution de l’effectif de la population à l’extinction pure et simple de celle‐ci.
De plus, il existe un lien entre la diversité génétique d’une espèce et la taille de ses effectifs, lorsque les effectifs diminuent, la diversité diminue aussi. Hors cette diversité est nécessaire pour faire face aux divers changements environnementaux (climat, pollution, maladie, déforestation et autres). Cependant, cette diversité génétique peut se maintenir aux échanges de gènes entre les diverses populations d’une espèce. Ce qui n’est plus le cas lorsque les individus sont isolés suite à la fragmentation de leur habitat.
L’objectif de cette étude est de déterminer la structure populationnelle et la santé génétique des coronelles lisses (Coronella autriaca) en Wallonie afin d’identifier si la fragmentation d’habit à un impact sur cette espèce. Mais aussi, déterminer les variables paysagères qui auraient un impact sur la dispersion des individus.
Les analyses ADN sur 7 marqueurs satellites ont montré une faible différenciation entres les 40 sites échantillonnés et un flux génique suffisamment important pour maintenir une bonne diversité génétique. Les analyses statistiques ont permis de définir la structure comme étant une métapopulation ou les unités populationnelles interagissent entre‐elles.
L’étude de l’impact des variables paysagères laisse à penser que les voies ferrées auraient un impact positif sur la dispersion des individus. Cependant, les analyses ne sont pas suffisantes pour déterminer l’impact des rivières ou des routes sur la dispersion des coronelles lisses.
En conclusion, cette étude a permis d’apporter des informations sur la santé génétique de la coronelle lisse (Coronella austriaca) en Wallonie et sur la structure des populations ainsi que sur les éventuelles barrières de dispersions. Toutes ces données montrent qu’à ce jour, la fragmentation d’habitat à peu d’impact sur l’espèce et laisse penser que les voies ferrées seraient une voie de dispersion pour certains individus.
Table des matières I. Introduction ......................................................................................................................................... 1
1.1Espèces menacées ..................................................................................................................... 1
1.2 La fragmentation de l’habitat .................................................................................................... 2
1.3 La génétique comme outil pour évaluer la fragmentation .................................................... 3
1.4 La biologie et la génétique de la conservation ...................................................................... 5
II. Espèce étudiée ................................................................................................................................. 7
2.1 La coronelle lisse ....................................................................................................................... 7
2.2 Biologie ........................................................................................................................................ 7
2.3 Régime alimentaire .................................................................................................................... 8
2.4 Répartition ................................................................................................................................... 9
2.5 Type d’habitat ............................................................................................................................. 9
2.6 Statut de protection .................................................................................................................. 10
2.7 Objectif de l’étude .................................................................................................................... 11
III. Matériel et méthode ...................................................................................................................... 12
3.1 Echantillonnage ........................................................................................................................ 12
3.2 Analyse génétique ................................................................................................................... 14
3.2.1 Extraction d’ADN ............................................................................................................... 14
3.2.2 Amplification des séquences microsatellites ................................................................ 15
3.2.3 Génotypage des microsatellites ..................................................................................... 16
3.3 Analyse statistique ................................................................................................................... 17
3.3.1 Structure des populations ................................................................................................ 17
3.3.2 Isolation par la distance ................................................................................................... 18
3.4 Landscape genetics ................................................................................................................. 19
IV. Résultats ........................................................................................................................................ 21
4.1 Extraction ADN ......................................................................................................................... 21
4.2 Génotypage............................................................................................................................... 21
4.3 Allèles nuls ................................................................................................................................ 21
4.4 Traitement des données ......................................................................................................... 21
4.5 Analyse factorielle des correspondances (AFC) ................................................................. 22
4.6 Variation et diversité génétique ............................................................................................. 23
4.7 Indice de Consanguinité (Fis) ................................................................................................ 25
4.8 Indice de diversification (Fst) ................................................................................................. 25
4.9 Isolation par distance ............................................................................................................... 25
4.10 Distance maximum ................................................................................................................ 27
4.11 Analyse de la structure des populations ............................................................................ 30
4.12 Impact du paysage ................................................................................................................ 31
4.13 Least cost path ....................................................................................................................... 32
V. Discussion ....................................................................................................................................... 34
5.1 Echantillonnage ........................................................................................................................ 34
5.2 Santé génétique des populations : Structuration intra-populationnelle ........................... 34
5.2.1 Indice Ar et He ................................................................................................................... 34
5.2.2 Indice de consanguinité Fis ............................................................................................. 35
5.3 Structuration inter population : indice Fst ............................................................................. 36
5.4 Isolation par la distance (IBD) ................................................................................................ 38
5.5 Structure des populations ....................................................................................................... 39
5.6 Barrières aux flux de gènes .................................................................................................... 40
Scénario 1 : Les rivières, les cultures et les routes sont des barrières à la dispersion ....... 41
Scénario 2 Les voies ferrées et les zones d’habitats sont des barrières à la dispersion .... 41
5.7 Gestion de l’espèce ................................................................................................................. 42
VI. Conclusion ..................................................................................................................................... 44
VII. Bibliographie .................................................................................................................................... I
Introduction
1
I. Introduction
1.1Espèces menacées De nos jours, environ 7,7 millions d’espèces animales sont présentes sur terre (Mora et al., 2011) et
on estime entre 5 à 8 fois plus, le nombre d’espèces encore inconnues. Pourtant la Terre connait sa
6ème crise d’extinction massive. En effet, une grande partie de la diversité animale est menacée, avant
tout par la perte et la fragmentation de son habitat. Parmi les vertébrés, les amphibiens sont les plus
touchés (Wake & Vredenburg, 2008) suivis par les reptiles. Selon un rapport de L’IUCN (Union
Internationale pour la Conservation de la Nature) datant de 2009, sur 1678 espèces de reptiles pour
lesquels un statut de menace a été évalué, plus de la moitié des espèces de reptiles dans le monde
sont menacées (exemple tableau 1).
Catégorie IUCN
Pourcentage Famille (Espèce)
EX 1,31 Anguidae (Celestus occiduus), Teiidae (Ameiva major), … CR 5,6 Alligatoridae (Alligator sinensis), Geoemydidae (Batagur kachuga), …
EN 9,11 Anguidae (Abronia fuscolabialis), Colubridae (Alsophis rufiventris), …
VU 13,47 Viperidae(Atheris ceratophora), Gekkonidae (Ailuronyx trachygaster), …
NT 8,88 Lacertidae (Lacerta schreiberi), Elapidae (Sinomicrurus japonicus), …
LC 47,32 Anguidae (Abronia smithi), Xenodermatidae (Achalinus ater), …
DD 14,3 Emydidae (Emys orbicularis), Scincidae (Oligosoma gracilicorpus)
Au niveau Européen, cela représente 1/5 des espèces (Cox & Temple, 2009). Le déclin des reptiles
serait principalement dû à la perte ou la dégradation de leur habitat (Corbett,1989 ; Reading et al.,
2010); à l’introduction d’espèces invasives ou au maintien de celles‐ci ; à la pollution
environnementale, à l’utilisation des terres et aux changements climatiques globaux (Gibbons et al.,
2000 ; Monney, 2001 ; Davis, 2003 ; Lambert, 2004 ; Phillips & Shine, 2006 ; Araújo et al., 2006).
En Belgique, on retrouve 7 espèces de reptiles dont 4 sont reprises sur la liste rouge établie pour la
Wallonie, dont tous les serpents indigènes (Jacob et al., 2007). Ceci s’explique en partie par la
régression des habitats des reptiles. En général, les milieux rocheux sont plus appréciés, ainsi que les
zones de lisières, les landes ou les prairies thermophiles (Jacob & Graiston, 2007). Soumis à diverses
altérations telles que la pollution, le boisement naturel, l’enrésinement, l’intensification des
pratiques agricoles ou l’urbanisation, ces sites sont bien souvent détériorés au dépend des espèces.
Tableau 1: Statuts des espèces de reptiles provenant du rapport de L'IUCN (2009). Ex: éteint; Cr: critique; EN: en danger; VU: vulnérable; NT: Quasi menacée; LC: préoccupation mineure; DD: données insuffisantes; P: protégées.
2
De plus, la capacité de dispersion des reptiles est assez faible (Volkl & Kasewieter, 2003), ce qui parfois mène à l’isolement total de certaines populations.
1.2 La fragmentation de l’habitat L’un des problèmes majeurs pour la majorité des espèces est le morcèlement et la réduction de son
habitat (Corbett, 1989 ; Cox & Temple, 2009 ; Reading et al., 2010). Hors, l’habitat fournit toutes les
ressources nécessaires à l’épanouissement des populations que ce soit pour l’alimentation, la
reproduction ou les déplacements.
An niveau du territoire, deux grands types de changements (Fahrig, 2003) sont observés (Fig. 1) :
La destruction totale de l’habitat qui engendre plusieurs situations possibles pour les populations
d’espèces qui l’occupent : migrer vers un milieu plus favorable, s’adapter au nouvel habitat créé qui
devient alors un habitat secondaire, ou disparaître.
La destruction partielle de l’habitat ou celui‐ci se retrouve divisé en plusieurs morceaux. On dit alors
qu’il est fragmenté.
Face aux différents changements du paysage, les espèces ne réagissent pas forcément toutes de la
même manière. Tout dépend de leurs besoins, de leur mode de dispersion mais aussi des milieux
environnants à leur disposition (Farina, 2006). Par exemple, une population dont l’effectif diminue
proportionnellement à une diminution de son habitat, verra sa survie à long termes peu affectée à
condition que la zone restante soit suffisante pour subvenir à ses besoins. Dans le cas d’une
fragmentation plus importante, des populations peuvent se retrouver divisées en plusieurs sous‐
populations, celles‐ci pouvant être en contact ou complètement isolées. L’isolation peut être causée
Figure 1: La photo de gauche représente une fragmentation de l’habitat. La photo de droite représente la destruction de l'habitat.
3
par un milieu non favorable aux déplacements des espèces, ou par des obstacles infranchissables
comme peuvent l’être certaines routes (Rodriguez et al., 1996), en particulier pour des animaux se
déplaçant au sol comme des serpents (Bonnet et al., 1999).
Pour remédier à ce phénomène d’isolation, il faut étudier les différents aspects du paysage qui
favorisent ou réduisent la dispersion et donc le flux génique, afin de mettre au point des plans de
gestion appropriés pour les populations menacées.
De nos jours, l’étude de la génétique des populations permet de détecter les ruptures de flux
géniques entre les différentes populations d’une même espèce aidant ainsi à déterminer les
populations à risque.
1.3 La génétique comme outil pour évaluer la fragmentation Au sein de leur aire de répartition, les individus d’une même espèce se répartissent en plusieurs
populations plus ou moins interconnectées. Ces groupes d’individus possèdent un niveau de
variabilité génétique (diversité génétique) propre représentant leur potentiel évolutif. Une
diminution de cette diversité génétique induit inévitablement une diminution du potentiel
d’adaptation à long terme (Allentoft & O’Brien, 2010). En d’autres termes, pour une meilleure
adaptation des espèces à un environnement changeant (changement climatique, augmentation des
polluants, apparition de maladies, perturbations anthropiques et autres), il faut maintenir cette
diversité génétique (Angelone, 2010 ; Allendorf & Luikart, 2007 ; Arens et al., 2006).
En général, plus une population possède un nombre élevé d’individus, plus sa diversité génétique à
des chances d’être importante et donc plus son potentiel adaptatif sera important. Les petites
populations qui se retrouvent souvent avec une diversité génétique faible ont potentiellement plus
de difficultés à s’adapter à un milieu changeant (Shaffer, 1981 ; Frankham, 2005). De plus si elles sont
complètement isolées des autres le risque de reproduction entre individus apparentés augmente de
manière inversement proportionnelle à leur taille. Ainsi la diversité génétique diminue et on observe
l’augmentation du nombre d’homozygotes pour certains caractères génétiques (Frankel & Soulé,
1981).
Pour maintenir une diversité génétique suffisante, il ne faut pas descendre en dessous d’un certain
nombre d’individus. D’après les simulations conduites par Franklin (1980), il faudrait plus de 50
individus pour éviter les risques de consanguinité au sein d’une population isolée et entre 500 et
5000 individus pour maintenir un potentiel évolutif suffisant (Franklin, 1980 ; Franklin & Frankham,
1998).
4
En effet, il a été démontré que la consanguinité (descendance d’individus apparentés) est un
facteur réduisant la fitness (capacité à survivre) des individus et des populations (Frankham, 1995,
2005 ; Lande, 1988). De nombreuses études ont montré un effet néfaste sur tous les aspects de la
reproduction (Frankham et al., 2002). Par exemple, chez le lapin sauvage Oryctolagus cuniculus, la
consanguinité est associée à une production anormale de spermes et à une diminution de la taille
des testicules (Gage et al., 2006). Une autre étude concernant le bruant chanteur, Melospiza melodia
montre un taux de survie des jeunes qui diminue lorsque les parents sont apparentés (Keller, 1998).
La mobilité des spermatozoïdes peut également être affectée ce qui est lié, dans le cas de la souris à
pattes blanche Peromyscus leucopus noveboracensis à une diminution de la descendance (Malo et
al., 2010). Dans le cas des Tilapia Oreochromis niloticus, une diminution de la fécondité des femelles
est observée mais également le succès reproducteur des mâles, qui est d’autant plus affecté si le
nombre de compétiteurs est grand (Fessehaye et al., 2009). Saccheri et al. (1998) ont remarqué que
le risque d’extinction des populations de Mélitée du plantain (Melitaea cinxia) augmentait fortement
lorsque l’hétérozygotie diminuait. De plus, en Finlande, la survie des larves, la longévité des adultes
et le taux de ponte était grandement affecté par la consanguinité dans les populations de ce papillon,
en Finlande. La reproduction entre individus apparentés est donc en général, associée à un taux
d’extinction élevé et une diminution de l’évolution au sein des espèces considérées (Eldridge et al.,
1999 ; Frankham et al., 1999)
Le flux génique constant entre les populations joue également un rôle capital puisque les individus
migrants permettent le mélange des gènes entre les populations. Cet échange permet d’éviter le
phénomène de dérive génétique. Celui‐ci implique un réassortiment des gènes de génération en
génération par le simple fait du hasard entraînant un changement des fréquences alléliques au cours
du temps et surtout une perte des allèles rares. Dans une grande population, la dérive génétique n’a
que peu d’effet mais dans une petite population, certains allèles peuvent se raréfier ou disparaître au
cours du temps (Frankham, 2005).
Toute une série de facteurs tels que la consanguinité, l’accouplement préférentiel ou la
fragmentation des populations peuvent avoir un impact sur les fréquences alléliques qui s’écartent
alors du modèle théorique de Hardy‐Weinberg. Ce modèle énonce qu’au sein d’une population (de
taille infinie) composée d’individus diploïdes se croisant aléatoirement (=panmictique) et en
l’absence de migration, de mutation (sur les allèles considérés) et de sélection d’individus, les
fréquences alléliques et génotypiques restent constantes au court du temps. Hors, le respect de la
théorie d’Hardy Weinberg est important pour beaucoup de méthodes statistiques mais aussi pour
déterminer des erreurs de manipulation (Frankham et al., 2010).
5
Cependant, il existe des contraintes qui imposent un isolement des populations, que la cause soit
anthropique ou naturelle. Suite aux changements globaux, il ressort que la fragmentation du paysage
est plus élevée que jamais, il est donc très intéressant d’en mesurer l’impact sur l’isolement des
populations. L’isolation d’une population peut être évaluée à partir de différent paramètres
génétiques. La différenciation génétique (différence de gènes entre plusieurs groupes) peut être
évalué avec les F‐statistiques (Wright, 1951) et quantifiée de manière indirecte entre les sites étudiés
(FST). De plus, la diversité génétique peut aussi être un indice de perte de diversité génétique. La
richesse allélique (Ar) renseigne sur la diversité des allèles présents et l’indice d’hétérozygotie (He)
donne des indications comparatives de la diversité génétique au sein d’une population. Finalement,
l’indice de structuration interne (FIS) peut être vu comme une mesure de la déviation par rapport à
l’équilibre de Hardy‐Weinberg, pouvant indiquer la présence de consanguinité. Ainsi, la combinaison
de ces indices nous renseigne sur la « santé » génétique des populations et des espèces étudiées. Ils
permettent également de détecter la présence ou l’absence d’un flux de gènes entre les différentes
populations.
Toutes ces informations sur la santé génétique des populations permettent d’améliorer la survie des
espèces menacées et une meilleure compréhension des phénomènes pouvant conduire à
l’extinction. Par exemple, les différents travaux de Madsen et al. (1996, 1999 et 2004) ont montré
qu’une diversité génétique réduite conduit inévitablement à la disparition d’une population de
vipère péliade (Vipera berus) isolée. Cependant, la réintroduction de mâles provenant d’une zone
proche a permis à cette population de se maintenir et de retrouver une dynamique et un nombre
d’individus suffisant pour une survie à moyen terme.
1.4 La biologie et la génétique de la conservation La biologie de la conservation applique les principes de la science aux problèmes de la conservation
dans le but de protéger la diversité biologique que ce soit à l’échelle de l’espèce, de la communauté
ou des écosystèmes. Pour ce faire, elle allie divers domaines tels que l’écologie, la biogéographie,
l’étude du paysage et la génétique des populations (Soulé, 1985).
La génétique des populations permet d’évaluer la « santé » génétique et donne des indications sur le
risque d’extinction en étudiant la distribution et les changements de fréquences alléliques sous
l’influence des pressions évolutives telles que la dérive génétique, les mutations, les migrations, les
recombinaisons ou la sélection. Cependant, elle est souvent considérée comme une discipline de
« gestion de crise » (Barbault, 2006) cherchant à identifier les populations en déclin ou relictuelles,
voir en danger d’extinction, afin de mettre en place des plans de gestion et de conservation
appropriés. Plusieurs marqueurs génétiques existent tels que les allozymes, les AFLP (amplified
6
fragment length polymorphism), les RAPD (randomly amplified polymorphic DNA), les RFLP
(restriction fragment length polymorphism) et les SSR (short sequence repeat) comprenant les
minisatellites et les microsatellites qui sont les marqueurs les plus utilisés aujourd’hui (Frankham et
al., 2002 ; Mullin et Seigel, 2009).
Les microsatellites (Fig. 2) sont des séquences d’ADN de l’ordre de 2 à 10 nucléotides caractérisées
par des répétitions en tandem (de 10 à 30 fois). Egalement appelé VNTR (Variable Number Tandem
Repeats) ou STR (Short Tandem Repeat), ils sont extrêmement variables entre les individus et sont
localisés dans les séquences non transcrites de l’ADN nucléaire, entourés par des séquences
appelées régions flanquantes. En général, la localisation des séquences microsatellites sur le génome
est conservée, il est donc possible de concevoir des amorces spécifiques à un locus donné,
permettant son amplification (Selkoe & Toonen, 2006).
Figure 2: Représentation (en rouge) d’une séquence d’un locus microsatellite di nucléotidique. Ici, l’unité de répétition (GC) est répétée 12 fois. Les régions flanquantes sont représentées en bleu et se retrouvent de chaque côté du microsatellite. Ce sont ces séquences qui serviront à la conception d’amorces spécifiques pour ce locus.
Ces caractéristiques les rendent très intéressants pour l’étude de population à l’échelle des individus,
donnant ainsi des informations sur les mutations apparues au sein d’une population, et donc des
informations sur l’histoire phylogénétique de celle‐ci. A plus grande échelle, il est également possible
d’observer un étranglement génétique en étudiant une espèce avec un échantillonnage assez
important (Selkoe & Toonen, 2006).
Allier la génétique avec l’étude du paysage permet également d’obtenir beaucoup d’informations
concernant les habitats préférentiels des espèces mais aussi concernant les voies de dispersion si
importantes lors d’une fragmentation d’habitat (Manel et al., 2003).
Pour maximiser les plans de gestion, il faut appréhender les menaces qui pèsent sur les espèces
étudiées. La phylogéographie, qui s’intéresse à l’histoire évolutive des populations, apporte souvent
des informations concernant l’historique des espèces qui peuvent être crucial pour leur conservation
(Avise,2000).
Espèce étudiée
7
II. Espèce étudiée
2.1 La coronelle lisse La coronelle lisse fait partie de la famille des Colubridés et appartient à la sous‐famille des
Collubrinae où on retrouve également la coronelle girondine Coronella girondica. Elles se
différencient par un ventre tacheté de noir pour la coronelle girondine, et un ventre de couleur
uniforme pour la coronelle lisse.
Ce petit serpent discret est inoffensif pour l’homme. Mesurant 12 à 14 cm à la naissance, il atteint 50
à 70 cm à l’âge adulte (voir 80 à 90 pour les plus grands spécimens) et pèse 30 à 60 grammes
(Günther & Volk, 1996 ; Frazer, 1983). De couleur brun à gris, parfois roussâtre, avec de petites
taches foncées formant deux lignes le long du dos (jamais de zig‐zag) et dessinant deux gouttes sur la
tête, ou une sorte de croissant. Ces dessins sont caractéristiques pour chaque individu et
permettent, à l’aide de photos, la différenciation individuelle. Sur le côté de la tête, une ligne
sombre, traverse l’œil en passant du museau au cou de celui‐ci (Fig. 4). A la différence des vipères, la
pupille de la coronelle est ronde avec un iris doré. Les plaques céphaliques sont larges
(caractéristiques des couleuvres) et les écailles sont lisses (pas de carène voir figue 3), ce qui lui a
valu le nom de « coronelle lisse » (Günther & Volk, 1996)
2.2 Biologie Plus tardif que les autres serpents de la faune belge, la coronelle sort de l’hibernation à la fin du
mois de mars et au début du mois d’avril. Les mâles sont les premiers à sortir. Les accouplements se
déroulent entre fin avril et début juin. Ce serpent est vivipare (Hofer, 2005) et les femelles donnent
naissance à 3 à 15 petits, 3 à 4 mois après l’accouplement. Cependant, la durée de la gestation peut
varier en fonction des conditions météorologiques. Il est possible d’observer une seconde période
d’accouplement fin août, début septembre, mais cela reste exceptionnel (Graiston & Jacob, 2007).
Figure 3: Gros plan sur les écailles "lisses" de Coronella austriaca.
Figure 4: Coronelle lisse avec ligne foncée sur le côté de la tête et les pupilles rondes.
8
Cependant, Il semblerait que toutes les femelles ne se reproduisent pas chaque année. En effet, la
fréquence de reproduction dépendrait de la taille de l’individu et de l’énergie accumulée au cours de
l’année précédant la reproduction (Reading, 2004).
Ce reptile aux mœurs discrètes se déplace très peu, de quelques dizaines à quelques centaines de
mètres par an (Völkl & Käsewieter, 2003 ; Vacher, 2010). Il arrive cependant que quelques individus
effectuent des déplacements plus importants (4 à 6 km dans le cas de l’étude effectuée par Völkl &
Käsewieter (2003)). Considéré comme sédentaire, son domaine printanier et estival est souvent
limité à une surface de maximum 3 hectares (Engelmann, 1993 ; Beebee & Griffiths 2000).
2.3 Régime alimentaire La coronelle se nourrit essentiellement de lézards (en Belgique : lézard vivipare Zootoca vivipara, lézard des murailles Podarcis muralis et orvet Anguis fragilis) (Beebee et Griffiths, 2000). La présence
de ces reptiles en grande densité semble donc favoriser celle de la coronelle. De plus, les adultes
peuvent consommer des micromammifères et des jeunes serpents (Spellerberg, 1977). Des cas de
cannibalisme sont observés lorsque la quantité d’autres proies est faible (Beebee et Griffiths, 2000 ;
Luiselli et al., 1996). Ce sont des serpents qui attrapent leur proie et les étouffent par constriction
avant de les avaler (Smith, 1964).
Figure 5: Coronelle lisse mangeant un orvet (source : http://www.arkive.org/)
9
2.4 Répartition Répandue sur toute l’Europe centrale (Fig. 6), la coronelle lisse se retrouve sur une partie de l’Europe
du Sud (en altitude) et du Nord (Santos et al., 2008).
Figure 6: Répartition de la coronelle lisse (Coronella austriaca) en Europe d’après l’atlas des amphibiens et reptiles en Europe (Gasc et al. 1997)
En Belgique, l’espèce est limitée à la Campine côté flamand, alors qu’en Wallonie, la coronelle lisse
est assez commune en Fagne et en Famenne, ainsi que dans les grandes vallées du Condroz. Elle est
cependant assez rare en Ardenne et en Lorraine, très rare dans la région du Pays de Herve et absente
au Nord du sillon Sambre et Meuse (Graitson & Jacob, 2007).
2.5 Type d’habitat La coronelle lisse est une espèce xéro‐thermophile, autrement dit, elle apprécie la sècheresse (du
grec « xēros » =sec) et les températures élevées (du grec « thermόs » = chaud). En Wallonie (Fig. 7),
les sites les plus fréquentés par la coronelle sont situés dans la vallée de la Meuse et ses principaux
affluents. On retrouve l’espèce également dans les régions calcaires ou à caractères thermophiles en
Fagne‐Famenne‐Calestienne et en Lorraine.
10
Figure 7: Répartition de la coronelle lisse (Coronella austriaca) en Wallonie. Les points correspondent aux observations récentes (1985‐2003). Les couleurs correspondent aux cinq régions biogéographiques de Belgique (du nord au sud : le nord du sillon Sambre‐et‐Meuse, Le Condroz et ces marges, la Fagne‐Famenne‐Calestienne, l’Ardenne et la Lorraine). La carte est tirée de : Amphibiens et Reptiles de Wallonie (Graitson et Jacob in jacob et al., 2007)
Les milieux fréquentés en Wallonie sont essentiellement les pelouses sèches (calcaires ou
schisteuses), les milieux rocheux artificiels (voies ferrées, anciennes carrières, talus en bord de
routes) ou naturels (affleurements rocheux). On peut également retrouver la coronelle lisse en
lisières de forêt, dans des cimetières ou le long des murs de pierres dans les villages (Graitson et al.,
2003). Bien qu’il soit souvent difficile d’évaluer la densité exacte des populations de coronelles
puisque seule une partie des individus est visible malgré des conditions météorologiques optimales
(Gent et al., 1996), les plus hautes densités de coronelles s’observent le long d’éléments linéaires
comme les voies ferrées ou une trentaine d’adultes peuvent être présents par km (Graitson et al.,
2012).
2.6 Statut de protection Considérée comme espèce peu menacée par l’IUCN, il n’en est pas de même au niveau de la
Wallonie. Elle y est considérée comme vulnérable (Jacob et al., 2007) et elle est intégralement
protégée par l’Annexe 2a du décret du 6/12/2001 (qui modifie la loi du 12/07/1973 de la
Conservation de la Nature). La coronelle est également strictement protégée par l’annexe Iva de la
Directive 92/43/CEE et l’annexe II de la Convention de Berne. Il est donc totalement interdit de
11
déranger l’animal, de l’attraper, de le tuer, de le mutiler, de le vendre, de le garder et ce, à chaque
étape de sa vie. Son habitat est protégé, il est donc strictement interdit de le détruire.
2.7 Objectif de l’étude Le but de ce travail est de déterminer la « santé génétique » des individus échantillonnés sur le
territoire wallon et d’identifier la structure populationnelle de ce reptile.
Ce projet se propose aussi d’étudier l’impact potentiel de la fragmentation de l’habitat en Wallonie
sur les populations de coronelles afin de déterminer les éléments qui, à l’échelle du paysage, isolent
ou au contraire, favorisent la dispersion et donc le flux génique entre les sites.
De plus, l’impact de certains éléments paysagers pouvant affecter la fragmentation des populations,
tels que les voies ferrées et les rivières, sera évalué à l’aide d’analyse de type « génétique du
paysage », méthode combinant l’analyse génétique des populations et les données
environnementales.
Matériel Et
Méthode
12
III. Matériel et méthode
3.1 Echantillonnage Dans le cadre de cette étude, 41 sites couvrant la Wallonie ont été préalablement échantillonnés sur
une durée de 3 ans par Eric Graitson (Fig.8). Ces sites sont répartis sur les 5 grandes régions
(Lorraine, Ardenne, Famenne, Condroz et sillon Sambre et Meuse) avec un nombre d’échantillon
allant de 3 à 34 selon les sites (tableau 2). De plus, 22 mues ont également été récoltées sur 8 sites
parmi les 41 stations échantillonnées.
La technique utilisée pour les prélèvements d’ADN à l’aide d’écouvillons est dite non invasive. Elle
consiste en un prélèvement de salive sur une coton tige dans la cavité buccale de l’animal, lequel est
ensuite relâché. Ces échantillons de salive contiennent suffisamment d’ADN pour une analyse.
Sur chaque écouvillon est noté le lieu d’échantillonnage, la date de prélèvement et le sexe de
l’individu lorsqu’il était possible de l’identifier. Les différentes recaptures possibles sont également
inscrites sur les écouvillons, après identification à l’aide de photo des différents animaux
échantillonnés prisent lors du prélèvement. Les recaptures ont été écartées des analyses.
Figure 8: Carte des 5 éco‐régions de Wallonie. Les sites d'échantillonnages sont représentés par un point violet.
13
Site Abréviation
Type d’habitat Code Coord. X Coord. Y Nombre d’ind.
Vodelée Vo 1 Friches/pelouse sèche 1 175025,223 95090,027 9 Daily Da 2 Pelouse calcaire 2 155397,591 83773,514 7 Wiesme Wi Friche/pelouse sèche 3 192808,563 93669,350 11 Barvaux Ba Talus rocheux 6 231799,840 115896,930 17 Vodelée Vo 8 Rocher 8 175064,554 95641,163 5 Biron Bi Friche 10 228666,538 112991,267 10 Anseremme As Voie ferrée 11 187215,502 103410,555 5 Nismes Ni Pelouse calcaire 12 163614,631 84261,109 5 Houyet Hy Friche/pelouse sèche 13 196863,726 97085,973 7 Vignée Vi Voie ferrée 17 201102,456 94868,920 15 Waulsort Ws Voie ferrée 18 186352,650 100869,978 17 Couvin Co Ancienne carrière 19 160143,640 84407,149 21 Dailly Da 20 Pelouse calcaire 20 154366,605 83476,221 6 Stoumont St Voie ferrée 22 253727,060 122447,026 9 Java Jv Voie ferrée 23 204384,514 133452,512 28 Theux Th Voie ferrée 24 253010,299 135248,676 13 Vonêche Vn 25 Voie ferrée 25 193283,470 82989,038 17 Vonêche Vn 26 Voie ferrée 26 193041,291 84731,334 3 Vonêche Vn 27 Voie ferrée 27 193694,652 85260,992 1 Vodelée Vo 29 Friche/ pelouse sèche 29 174514,407 94547,507 3 On On 34 Pelouse calcaire/ VF 34 214897,278 95906,976 7 On On 36 Pelouse calcaire/ VF 36 215622,697 96571,943 3 Aisne Ai Pelouse calcaire 39 235255,874 117008,214 3 Esneux Es Ancienne carrière / VF 46 235403,676 135631,248 10 Saint‐Remy SR Voie ferrée 47 240093,952 26999,931 9 Esneux Es Voie ferrée 48 234677,130 134043,962 2 Hogne Hg Voie ferrée 50 214217,770 104364,975 19 Herbeumont Hb Voie ferrée 52 216813,140 49757,128 6 Meix‐devant‐Virton
MDV Voie ferrée 54 230895,397
31478,311
24
Sommerain So Rocher 60 252850,464 94835,211 3 Mirwart Mw Voie ferrée 61 213582,178 83684,805 33 Mellier Me 64 Voie ferrée 64 233293,149 49537,525 20 Thanville Th Voie ferrée 65 194277,503 85818,113 7 Dolhain Do Voie ferrée 66 261110,136 147579,236 15 Limbourg Li 67 Voie ferrée 67 258888,805 145346,214 8 Limbourg Li 68 Voie ferrée 68 26005,316 145515,737 3 Bernimont Be Voie ferrée 69 230066,560 56402,147 8 Lommel Lo Lande à callune 70 216730,591 212411,954 2 Durnal Du Carrière/ VF 71 192055,970 112743,635 18 Mellier Me 72 Jardin 72 232824,380 50921,849 2
Tableau 2: Sites, habitats et nombre d'individus qui ont été échantillonnés. Le code correspond aux échantillons d'ADN après extraction. Les coordonnées géographiques correspondent au centre du site.
14
3.2 Analyse génétique
3.2.1 Extraction d’ADN
L’extraction de l’ADN a été effectuée selon le protocole QIAGEN (DNeasy Blood & Tissue) légèrement
modifié pour les écouvillons, au laboratoire du NLU à Bâle. Pour les mues, une fraction d’environ 10 à
15 cm³ de mue (de préférence, les écailles de la tête) a été préalablement broyée à l’aide de
colonnes spéciales contenant des éclats de grenat et une sphère en céramique (Lysis Matrix A, MP
biomedicals, Solon, OH, USA) en utilisant la machine FastPrep®‐24 Instrument (MP biomedicals). Lors
de l’extraction de l’ADN des mues, le protocole est similaire à l’extraction des écouvillons mais les
concentrations des différents produits utilisés sont doublés jusqu’à ce que le coton tige soit retiré.
Première étape:
Le bout en ouate du coton‐tige ou la mue broyée, a été placé à l’aide de pinces stérilisées dans un
tube Eppendorf de 1,5 ml auquel est ajouté 180µl de Buffer (tampon) ATL et 20 µl de Protéinase K. Le
tout est vortexé pendant 15 secondes avant d’être placé dans une plaque chauffante à une
température de 56°C pendant toute une nuit.
Deuxième étape :
Après la digestion, les échantillons ont été vortexés (15 sec). Après, 200µl de tampon AL a été ajouté,
suivi de 15 secondes de vortex, puis 200µl d’éthanol, le tout étant à nouveau vortexé pendant 15
secondes. Le liquide ainsi que les cotons tiges, sont récoltés et placés sur des colonnes (DNeasy mini
spin collumn, Qiagen, ORIGINE). Les colonnes sont centrifugées (6000g ou 8000rpm) pendant 1
minute puis placées sur de nouveau tubes collecteurs ; une centrifugation avec le coton tige est
effectuée, avant que celui‐ci soit retiré avec des brucelles stériles. Cinq cents microlitres de tampon
AW1 ont ensuite été ajoutés à chaque colonne, celles‐ci ont ensuite été centrifugées pendant 1
minute (6000g ou 8000rpm) afin de réaliser un premier nettoyage des colonnes. Un second
nettoyage a été réalisé avec cinq cents microlitres d’AW2, suivi d’un nouveau passage dans la
centrifugeuse pendant 3 min à 20 000g (14 000rpm). Les colonnes ont ensuite été centrifugées
pendant 1 minute (à vitesse maximale) afin de bien sécher les membranes des colonnes et d’éviter
les résidus d’alcool avant l’élution.
Pour obtenir l’ADN, 100µl de tampon AE est ajouté aux colonnes préalablement placées dans de
nouveaux Eppendorf 1,5 ml, laisser incuber 5 minutes à température ambiante avant de centrifuger
le tout pendant 1 minute à 6000g (ou 8000rpm). Cette dernière opération est répétée une seconde
fois afin d’augmenter la quantité d’ADN extraite.
15
Par la suite, quelques contrôles de la quantité d’ADN ont été effectués à l’aide de NanoDrop™1000.
Tous les échantillons contrôlés avaient en moyenne entre 3 et 15 ng/µl d’ADN.
3.2.2 Amplification des séquences microsatellites
En ce qui concerne la coronelle, différents microsatellites ont été mis en évidence par Bond et al.
(2005) :
Code GeneBank
Locus ID
Séquences des primers T (°C) T (°C) PCR
Taille (bp)
AY652704 Ca16 GAAGCAGCTGAGAACAGCCTATCCTTAAGTAAGCGAAATTGAAC
62 55 250
AY652706 Ca19 CTTGCGGAGATTAGTTGCAGCGTATGCAGGATTTCACAAGAA
60 55 151
AY652711 Ca30 CAGCTATTTAGTGCTCATCATCATTTGAGGCAGGCTGACAGTTACA
53 58 176
AY652712 Ca40 TTGTATAACAACTGCATCATCTCACCTTGGCTCTCATTCATATCA
55 50 297
AY652713 Ca43 GGCATAATGATAGTCACGAGGATTCAATGTGATCTGGAATCTGG
62 55 379
AY652714 Ca45 ATAGCAGCATCCCCATCATCCAGATGAATATTTCGTGTTTTCTCA
51 40 361
AY652721 Ca612 GACCCCACTTGGTCTTCAAAGCTTAAGCAAGGGTCAAACTT
55 55 297
AY652722 Ca63 TCATCCTACTGCAATCTTTGGAACTGAATTCCAACTTTAAACA
60 55 154
AY652723 Ca66 CACTTCTCTGCCACTGTTCCACATACAAAGGGCCAGGTTG
64 55 229
Dans le cadre de cette étude, neuf loci développés par Bond et al. (2005), à savoir Ca19, Ca16, Ca30,
Ca40, Ca43, Ca45, Ca612, Ca63, Ca66 ont été amplifiés par PCR (Polymerase Chaine Reaction) avec
un ajustement des conditions PCR établie par J‐P Vacher (2010).
Protocol PCR
Le protocole PCR pour l’amplification des marqueurs microsatellites est le suivant : 15 minutes de
dénaturation à 95°C, ensuite 37 cycles composés de : 30 secondes de dénaturation à 94°C, ensuite
30 minutes d’hybridation à la température de PCR (tableau 3) suivi de 45 minutes d’élongation à
72°C, et il se termine, à la fin de tous les cycles, par 10 minutes d’élongation à 72°C.
Tableau 3: Microsatellites de Coronella austriaca isolés par Bont et al. 2005
16
3.2.3 Génotypage des microsatellites
Les produits PCR ont été regroupés en multiplexes de 3 primers (tableau 4) de différentes couleurs
dont 1µl était prélevé pour y ajouter 10µl d’Hi‐Di™ Formamide et 0,25µl de GeneScan™‐500 LIZ® qui
est un marqueur de taille développé par Applied Biosystems(Foster city, CA) pour les
électrophorèses avec des marqueurs fluorescents.
Multiplexe 1 Multiplexe 2 Multiplexe 3 2 µl Ca 19 (vert) 3 µl Ca 40 (vert) 1 µl Ca 66 (vert) 4 µl Ca 43 (vert) 4 µl Ca 45 (bleu) 4 µl Ca 63 (rouge) 4 µl Ca 30 (bleu) 2 µl Ca 16 (rouge) 2 µl Ca 612 (noir)
Le multiplexe 1 est composé de deux primers de couleur vert faciles à différencier par leur taille
allélique.
Après un traitement de 4 minutes à 94°C suivit de 4 minutes sur glace afin de dénaturer l’ADN, les
échantillons ont été génotypé à l’aide d’un séquenceur AB3130xl Genetic Analyzer (Applied
Biosystems, Foster city, CA).
La taille des allèles a été évaluée à l’aide du logiciel Peak Scanner™ v1.0 (Applied Biosystem, Foster
city, CA).
Figure 9: Représentation d'un allèle hétérozygote (ici le Ca 30) ou les tailles sont représentées dans l'encadré bleu (S= size). Résultat de l'analyse d'un microsatellite à l'aide de Peak Scanner™ v1.0 (Applied biosystem).
Tous les microsatellites ayant une forme particulière et une couleur déterminée (Fig. 9), il suffit de
repérer les microsatellites et de noter la taille des allèles (une seule taille dans le cas d’homozygote,
Tableau 4: Résumé des 3 groupements de primers en fonction de leur couleur et la quantité de produit utilisée.
17
et deux tailles dans le cas d’hétérozygote) sous forme de tableau Excell. Ce tableau sera converti en
différents formats en fonction des programmes utilisés lors des analyses ultérieures.
3.3 Analyse statistique Pour éviter la présence d’allèles nuls dans le jeu de données, lesquelles pourraient biaiser les
analyses statistiques, le logiciel MICROCHECKER v.2.2.3 (Van Oosterhout et al., 2004) a été utilisé
pour évaluer la fréquence de potentiels allèles nuls et les erreurs de lecture des microsatellites pour
chaque locus et chaque population.
Afin de bien visualiser les différences entre individus et populations, une analyse factorielle de
correspondance a été effectuée à l’aide du logiciel GENETIX v.4.0.2 (Bellhkhir et al., 2004). Cette
première analyse permet également de détecter certaines erreurs dans le jeu de données,
notamment des erreurs de lecture des tailles alléliques.
La diversité génétique et la différenciation statistique entre les marqueurs génétiques est testée et
estimée à l’aide de FSTAT v.2.9.3.2 (Goudet, 1995) soit, les valeurs de la richesse alléliques (Ar),
d’hétérozygotie attendue (HE), d’hétérozygotie observée (Ho) ainsi que le coefficient de
consanguinité (Fis) et l’indice de fixation (Fst). Ce logiciel permet également de tester les résultats par
paire et indique les valeurs significatives de Fst et Fis entre les populations à l’aide de simulations. Ces
deux indices ont été calculés entre les différentes populations pour déterminer le coefficient de
consanguinité et pour obtenir le degré de différenciation entre ces populations.
Pour déterminer si les valeurs moyennes de Ar et de He entre les différentes populations étaient
significativement différentes entre elles, une ANOVA a été réalisée sur les valeurs moyennes de Ar,
car les données de départ présentait en une distribution normale par contre, les valeurs initiales de
He ne présentaient pas de distribution normale, c’est donc un test non paramétrique de Kruskal‐
Wallis qui a été effectué. Ces deux tests ont été réalisés à l’aide du programme STATISTICA v.10
(Statsoft, Tulsa, Okla)
3.3.1 Structure des populations
La structure génétique des populations de coronelle lisse à l’échelle spatiale, a été testée à l’aide du
logiciel STRUCTURE V2.3.3 (Pritchard et al., 2000) sans aucun a priori sur le nombre de population
potentiel. Ce programme utilise une approche dite de clustering bayésien, autrement dit, il regroupe
les individus dans des « clusters » en fonction de leur génotype et en assumant que les populations
soient à l’équilibre de Hardy‐Weinberg et détermine ainsi le meilleur nombre K de clusters. Les
paramètres de la simulation effectuées pour K= 1‐30 sont des réplicas de 200 000 puis 400 000
18
CMCM (Monte Carlo Markov Chain) avec 10 répétitions par K. Les chaînes de Markov permettent de
minimiser le déséquilibre de Hardy‐Weinberg et le déséquilibre de liaisons entre les loci.
Pour déterminer le nombre correct de groupe, la probabilité logarithmique des données [Ln P (D)]
pour chaque K a été estimée. En complément, la valeur de delta K selon Evanno et al. (2005), a aussi
été calculée.
3.3.2 Isolation par la distance
L’isolation par la distance (IBD, Wright, 1943) a été évaluée à l’aide d’un test de Mantel entre les
distances Euclidiennes et les valeurs de Fst sur le programme FSTATv.2.9.3.2. Pour vérifier si les
valeurs corrigées de Fst, soit Fst/(1‐Fst) sont plus réalistes (Rousset, 1997), elles ont également été
incorporées dans le test de Mantel.
Pour déterminer la distance maximum déterminant un groupe d’individus comme génétiquement
semblable, un test d’autocorrélation spatiale ou coefficient de Moran (Hardy and Vekemans, 1999) ;
a été effectué à l’aide du programme SPAGeDI v 1∙2 (Hardy & Vekemans, 2002). Le coefficient de
parenté entre les individus ou coefficient kinship (Loiselle et al., 1995), a également été testé à titre
de comparaison.
Les catégories de distances ont été définies par le programme afin d’avoir un nombre équivalent
d’individus dans chacune d’elles.
19
3.4 Landscape genetics Pour étudier l’impact du paysage sur la dispersion de la coronelle lisse, une des méthodes utilisées
(Adriaensen et al., 2003) consiste à créer une carte de friction qui va permettre de définir les
chemins les plus réalistes empruntés par l’espèce en fonction du paysage et de ses caractéristiques
(méthode dite du « Least cost path » ou « voie du moindre coût »). La première chose à faire est de
regrouper sur une même carte, les différentes variables qui peuvent influencer la mobilité de la
coronelle, à l’aide du programme Arcview 3.2 (ESRI, Redlands, USA). Ici, 16 variables d’occupation du
sol ont été rassemblées sur une même carte convertie en format GRID (ESRI).
Numéro Type de variable Nombre de pixels 1 Bois et forêts de feuillus 5413973 2 Bois et forêts de résineux 3467458 3 Bois et forêts mixtes 169659 4 Terrains et aérodromes militaires + terrains en friche 398088 5 Prairies permanentes 8182994 6 Cultures 6876342 7 Espace vert urbain 46250 8 Habitat dense 172270 9 Habitat discontinu 1185910 10 Habitat et services 13218 11 Industries et services 151007 12 Carrières, sablières, terrils 104369 13 Réseau hydrographique 113274 14 Gares 11667 15 Routes 653372 16 Voies ferrées 67830
Dans le format grid ou raster, chaque pixel représente une cellule de 25m x 25m. Afin de déterminer
le chemin le plus réaliste entre chaque station d’échantillonnages qui serait emprunté par une
coronelle, chaque pixel va recevoir, en fonction de la variable du paysage qu’il représente, une
valeur de « coût » énergétique. Pour déterminer la valeur de coût représentant au mieux le paysage,
il faut essayer plusieurs variables pour chaque scénario testé puis effectuer une corrélation entre les
distances génétiques (Fst) et les distances de coût obtenues à l’aide du programme PATHMATRIX
(Ray, 2005) pour déterminer les valeurs les plus représentatives. Pour utiliser le programme, il faut
ajouter une carte en format shape, avec les coordonnées géographiques des sites échantillonnés en
plus de la carte « grid » avec les caractéristiques du paysage. Au final, on obtient le chemin de
moindre coût énergétique pour la coronelle, le coût métrique qui représente la distance réellement
effectuée par l’individu lors de son déplacement et la distance euclidienne entre chaque station
étudiée. Ces résultats sont ensuite traités à l’aide d’un test de Mantel sur XLSTAT v 5 (Addinsoft,
Tableau 5: Les différentes variables d'occupation du sol et le nombre de pixels associés
20
2012) comparant ces différents coûts (métrique et énergétique) à la distance génétique (Fst)
obtenue lors des précédentes analyses. Les tests de Mantel indiquent les corrélations entre les
distances analysées ce qui permet de déterminer les variables représentant au mieux le paysage pour
une coronelle lisse.
Puisque la plupart des échantillons proviennent de vallées ou de sites ferroviaires (voies ferrées
essentiellement), cette étude se base sur deux types d’éléments paysagers, les voies ferrées et les
rivières, comme étant des facteurs affectant potentiellement la dispersion des individus. Les
scénarios testés sont :
‐ Les rivières, les cultures et les routes sont des barrières à la dispersion (Scénario 1)
‐ Les voies ferrées et les zones d’habitats sont des barrières à la dispersion (Scénario 2)
D’autres variables comme les zones urbaines ou les cultures, ont également été utilisées pour
information, puisqu’il était possible de tester plusieurs variables en même temps.
Pour chacun des scénarios, différents cas ont été testés, avec des valeurs de coût différentes. Les
meilleures corrélations obtenues à l’aide des tests de Mantel permettent de déterminer le cas qui
définit au mieux les variables ayant un impact sur la dispersion de la coronelle lisse.
Les coûts énergétiques donnés aux variables culture (CU), route (RO) et rivière (Riv) pour le scénario
1 sont les suivants :
Test 1 : CU, RO et Riv = 70 ; autres = 1 Test 2 : CU, RO et Riv = 1 ; autres = 70 Test 3 : CU = 5 ; RO = 10 ; Riv = 15 ; autres = 1 Test 4 : CU et Riv = 10 ; RO = 5 ; autres = 1 Test 5 : CU et Riv = 5 ; RO = 10 ; autres = 1
Les coûts énergétiques donnés aux variables Zones urbaines (ZU) et Voie ferrée (VF) pour le scénario 2 sont les suivants :
Test 1 : ZU et VF = 70 ; autres = 1 Test 2 : ZU et autres = 1 ; VF = 70 Test 3 : Toutes les variables = 1 Test 4 : ZU et VF = 10 ; autres = 1 Test 5 : ZU = 20 ; VF = 10 ; autres = 1 Test 6 : ZU = 10 ; VF = 20 ; autres = 1
Résultats
21
IV. Résultats
4.1 Extraction ADN Toutes les extractions d’ADN provenant des échantillons de salive ont été effectuées sur un total de
397 écouvillons. Une partie des échantillons (1/3) ont été quantifiés donnant en moyenne 7,79ng
d’ADN par µl et un écart‐type (SD) de 4,30. L’ADN des 22 mues a été extrait avec succès, avec en
moyenne 40 ng d’ADN par µl et un écart‐type (SD) de 26,7 ; soit +/‐ 5 fois plus d’ADN qu’en utilisant
la technique des échantillons de salive. Les 419 échantillons ont donc pu être utilisés pour le
génotypage sur base des 9 microsatellites sélectionnés.
4.2 Génotypage Sur les 419 échantillons d’ADN, douze d’entre eux n’ont pas donnés suffisamment de résultats pour
être pris en compte lors des prochaines analyses. De plus, certains échantillons ont fait l’objet de
deux, voire trois répétitions afin d’obtenir 90% de données sur les 9 marqueurs et les 407 individus,
concernant les microsatellites.
4.3 Allèles nuls Les microsatellites Ca 40 et Ca 45 présentaient une proportion d’homozygotes plus élevée
qu’attendue lors des analyses effectuées à l’aide du logiciel MICROCHECKER v.2.2.3 (Van Oosterhout
et al., 2004), parmi toutes les populations reflétant la présence probable d’allèles nuls. Ils ont donc
été retirés du jeu de données pour éviter des problèmes lors des analyses statistiques ultérieures.
Au final, les microsatellites Ca19, Ca30, Ca43, Ca16, Ca63, Ca66, Ca612 ont été analysés pour 407
individus.
Microsatellites Résultats (en %) Tailles (pb)
Ca16 94,6 275 – 307 Ca19 96,3 140 – 160 Ca30 91,9 164 – 188 Ca43 94,4 355 – 407 Ca63 92,9 140 – 156 Ca66 92,9 220 – 244 Ca612 94,1 279 – 307
4.4 Traitement des données Sur les 40 stations d’échantillonnage, certains sites ne comptent que 3 prélèvements. Afin de pouvoir
traiter statistiquement ces données, les échantillons provenant de stations suffisamment proches
Tableau 6: Pourcentage d'allèles disponibles pour les statistiques et les extrêmes de taille détectés dans les populations de coronelles lisses de Wallonie.
22
géographiquement, soit moins de 2Km, et ayant un Fst peu élevé entre elles, ont été rassemblés pour
former une même unité. Les différents tests ont donc été effectués avec les 41 populations de
départ, puis avec les unités rassemblées (n=30).
Unités rassemblées Nom Coord. X Coord. Y
Vo 1 + Vo 8 + Vo 29 Vo 174946,647 95156,3867
Da 2 + Da 20 Da 154921,752 83636,302
Vn 25 + Vn 26 + Vn 27 + Th 65 Vn 193520,716 83964,1225
On 34 + On 36 On 215114,904 96106,4658
Es 46 + Es 48 Es 235282,585 135366,7
Li 67 + Li 68 Li 259193,308 145392,447
4.5 Analyse factorielle des correspondances (AFC) L’analyse factorielle des correspondances, effectuée à l’aide du programme GENETIX, ne montre pas
de différenciation génétique entre les populations de coronelles lisses de Wallonie, exception faite
pour un petit groupe (voir ovale figure 10) composé de 6 individus de la population de Mirwart (61S,
61HX, 61J, 61IX, 61BX et 61P) auquels s’ajoute un individu provenant de la station Vodelée (1I) et un
individu provenant de la station Meix‐Devant‐Virton (54D).
Figure 10: AFC à deux dimensions représentant la distance génétique entre 30 populations de Coronelle lisse en Wallonie, effectuée à l'aide du logiciel GENETIX 4.02. Chaque population est représentée par une couleur. L’ovale et l’étoile représentent les individus qui se différencient de tous les autres.
On observe également un individu (3A) échantillonné à Wiesme qui se différencie des autres (voir
étoile figure 10).
Tableau 7: Population rassemblée et coordonnées géographiques recalculées.
23
4.6 Variation et diversité génétique Il n'y a pas de différence significative dans les valeurs de Ar et He (Ar : ANOVA, F = 1,22, p=0.3 ; He :
test de Kruskal‐Wallis = 12,6 p=0,0001). Les valeurs moyennes de la richesse allélique de toutes les
populations se situent entre 2,14 (minimum) et 2,78 (maximum) tandis que les valeurs
d’hétérozygotie moyennes vont de 0,55 (minimum) à 0,78 (maximum).
Pop n Na Ar He SD He H0 SD Ho FIS p‐value du FIS
Bi 10 29 2,55 0,69 ±0,12 0,57 ±0,14 0,17 0,018 As 5 29 2,60 0,70 ±0,15 0,60 ±0,16 0,14 0,117 Ni 6 28 2,75 0,74 ±0,12 0,77 ±0,18 ‐0,04 0,723 Hy 7 28 2,42 0,62 ±0,25 0,52 ±0,21 0,16 0,052 Vi 15 28 2,36 0,63 ±0,11 0,59 ±0,06 0,06 0,165 Ws 17 38 2,60 0,69 ±0,14 0,70 ±0,08 0,00 0,504 Co 21 33 2,45 0,65 ±0,12 0,65 ±0,14 ‐0,01 0,532 Vo 17 35 2,52 0,67 ±0,17 0,58 ±0,28 0,16 0,003 Da 14 30 2,30 0,60 ±0,18 0,53 ±0,20 0,13 0,045 St 9 28 2,30 0,60 ±0,18 0,45 ±0,10 0,25 0,001 Jv 28 32 2,27 0,57 ±0,20 0,49 ±0,25 0,14 0,003 Th 13 28 2,40 0,63 ±0,17 0,66 ±0,26 ‐0,06 0,776 Vn 21 42 2,62 0,70 ±0,13 0,56 ±0,16 0,11 0,006 On 10 29 2,50 0,67 ±0,11 0,69 ±0,18 ‐0,03 0,656 Ai 3 24 2,78 0,71 ±0,15 0,81 ±0,26 ‐0,13 0,911 Wi 11 28 2,35 0,62 ±0,14 0,48 ±0,26 0,23 0,003 Es 12 28 2,36 0,62 ±0,18 0,62 ±0,22 0,04 0,299 SR 9 22 2,15 0,56 ±0,14 0,43 ±0,23 0,24 0,018 Hg 20 34 2,46 0,66 ±0,10 0,53 ±0,13 0,19 0,002 Hb 6 23 2,45 0,68 ±0,13 0,54 ±0,31 0,20 0,053 MDV 24 38 2,48 0,65 ±0,13 0,54 ±0,14 0,17 0,001 So 3 21 2,54 0,64 ±0,18 0,74 ±0,27 ‐0,15 0,932 Mw 33 43 2,54 0,67 ±0,10 0,56 ±0,11 0,16 0,000 Me 22 34 2,34 0,61 ±0,15 0,55 ±0,17 0,09 0,071 Do 15 28 2,14 0,55 ±0,14 0,39 ±0,21 0,30 0,000 Li 11 24 2,23 0,58 ±0,15 0,55 ±0,21 0,06 0,251 Be 8 32 2,59 0,69 ±0,14 0,64 ±0,28 0,08 0,169 Ba 17 31 2,55 0,67 ±0,16 0,72 ±0,14 ‐0,07 0,895 Du 18 35 2,52 0,66 ±0,17 0,65 ±0,14 0,02 0,325 Lo 2 16 2,29 0,79 ±0,10 0,43 ±0,34 0,46 0,062
Tableau 8 : Résumé des résultats concernant la diversité génétique intra et inter‐population. (n : nombre d’individu, Na : nombre d’allèle, Ar : richesse allélique, He : hétérozygotie attendu, Ho : hétérozygotie observée, SD : écart‐type, Fis : coefficient de consanguinité).
24
Tableau 9 : Fst par paire de po
pulatio
n. Pou
r une
lecture plus aisé
e, les v
aleu
rs entre 0,15 et 0 ,20 sont indiqu
ées e
n orange ; les v
aleu
rs au‐de
là de 0,20
sont indiqu
ées e
n rouge et les v
aleu
rs significatives so
nt en caractères gras.
25
4.7 Indice de Consanguinité (Fis) L’indice de consanguinité, appelé indice de fixation, représente la réduction de l’hétérozygotie dans
les sous‐populations. Il est lié aux différences de fréquences alléliques moyennes.
Lorsque les populations sont à l’équilibre d’Hardy‐Weinberg, le Fis est égal à zéro. Hors, le tableau 7
indique que les populations sont soit en déficit d’hétérozygote, soit en excédant cependant, les
valeurs de Fis ne sont pas significatives (p<0,05) on ne peut donc pas en tirer de conclusion.
4.8 Indice de diversification (Fst) Les valeurs Fst par paire de populations obtenues à l’aide du programme FSTAT v.2.9.3.2 (Goudet,
1995) informent sur la différenciation génétique entre ces populations.
En observant la moyenne des Fst pour chaque population, on remarque que sur les 30 stations, 14
d’entre elles ont un indice Fst supérieur à 0,10. C’est le cas des stations Daily, Stoumont, Theux,
Houyet, Vignée, Wiesme, St Remy, Dolhain, Limbourg, Mellier, Mirwart, Barvaux et Sommerain.
L’indice le plus élevée atteint 0,16 dans le cas du site de Java. Il semble que cette station soit la plus
différenciée. Lorsqu’on observe la position géographique des sites d’échantillonnages, on remarque
que le site de Java est le seul à être situé au nord du sillon Sambre et Meuse (avec le site de Lommel
qui est situé en Flandre). Cependant, ces valeurs de Fst sont relativement plus faibles que l’indice de
diversification attendu pour les reptiles qui est de 0,26 (Frankham et al., 2010).
4.9 Isolation par distance La comparaison des coordonnées géographiques et des distances génétiques (Fst) renseignent sur
une éventuelle isolation par distance. Un Mantel test effectué à l’aide de FSTAT v.2.9.3.2 (Goudet,
1995) indique que les valeurs (distance géo et Fst ou Fst corrigé) sont corrélées (R²=0 .465 et
R²=0.452), voir graphique de la figure11.
Variable expliquée par la distance géo.
Corrélation (partielle) Beta R²
Fst 0.682 0.000001 0.465
Fst/1‐Fst 0.672 0.000002 0.452
La distance géographique expliquerait donc la différenciation génétique entre les populations.
Tableau 10: Résultat du Mantel test entre les distances géographiques et les distances génétiques (corrigées ou non). Beta représente la pente de la droite
26
Figure 11: Corrélation entre les matrices de distances géographiques et les matrices de distances génétiques (Fst et Fst corrigés) obtenues par Excell.
Un autre graphique (Fig. 12) obtenu à l’aide du programme FSTAT v.2.9.3.2 (Goudet, 1995) montre
que les valeurs de Fst corrigées donnent des résultats similaires aux valeurs de Fst non corrigées.
Figure 12: Corrélation entre les matrices de distances géographiques et les matrices de distances génétiques (Fst et Fst corrigés) obtenue par le programme FSTAT v.2.9.3.2 (Goudet 1995).
‐0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 20000 40000 60000 80000 100000 120000
dist génét, Linéaire (dist génét,)
R²= 0.465 Y=0.000001X+0.1087
Droite de corrélation
Distance géo
.
27
4.10 Distance maximum La première analyse du coefficient de Moran (Hardy and Vekemans, 1999) et du coefficient kinship
(Loiselle et al., 1995) indique que la distance à partir de laquelle les individus sont génétiquement
parentés se trouve entre 0 et 18,4 Km. Afin d’obtenir une distance plus précise, une deuxième
analyse a été effectuée à l’aide de SPAGeDI v 1∙2 (Hardy & Vekemans, 2002 ) sur des classes de
distances plus étroites indiquant que la distance d’isolation entre les espèces est de 2 à 3Km, soit 2,5
km qui correspond au centre de la classe de distance n°3. Les catégories de distances (Tab. 11) ont
été définies par le programme afin d’avoir un nombre équivalent d’individus dans chacune d’elles.
catégorie de distance (Km)
Catégories Analyse 1 Analyse 2
1 <0 <0
2 0‐18,4 0‐2
3 18,4‐26,2 2‐3
4 26,2‐34,6 3‐3,9
5 34,6‐42,3 3,9‐4,9
6 42,3‐50,7 4,9‐6,5
7 50,7‐60,5 6,5‐11
8 60,5‐70,2 11‐12,3
9 70,2‐81,6 12,3‐15,5
10 81,6‐92,8 15,5‐19,9
11 92,8‐186,9 19,9‐36,4
Tableau 11: Catégories de distances utilisées lors des analyses1 et 2 avec SPAGeDI
28
Figure 13: Coefficient de Moran (vert) et Kinship obtenu à l’aide de SPAGeDI V.1.3. Intervalles de confiance à 95 % (supérieur en mauve et inférieur en brun) déterminés par SPAGeDI V.1.3.
L’autocorrélation spatiale entre la distance géographique et la ressemblance génétique entre les
sites est significative pour les groupes des deux premières catégories de distances, à savoir jusqu’à
18,4 km. On obtient des résultats similaires avec le coefficient Kinship qui indique donc qu’il y a
isolement des populations par la distance.
Figure 14: Coefficient de Kinship en fonction des catégories de distances de l'analyse 1 (voir tableau 11),représenté en rouge avec les coefficient d'incertitude supérieur (mauve) et inférieur (brun). Les valeurs significatives sont indiquées par des astérisques.
Afin de déterminer une distance plus précise, une seconde analyse ç été effectuée avec des classe de
distances plus petites. On obtient alors une distance de 2,5Km (soit entre 2 et 3Km) voir figure 16.
‐0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Moran
95% inf
95% sup
catégorie de distance
*
Moran
‐0,04
‐0,02
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Kinship
95% inf
95% sup
*
Kinship
29
Figure 15: Représentation du coefficient de Moran (en vert) en fonction des classes de distances de l’analyse 2 avec les coefficients d'incertitudes inférieur (brun) et supérieur (mauve). Les astérisques indiquent les valeurs significatives.
Figure 16: Coefficient Kinship (Loiselle et al. 1995), en fonction des classes de distances de l’analyse 2, représenté en rouge avec les coefficient d'incertitude supérieur (mauve) et inférieur (brun). Les valeurs significatives sont indiquées par des astérisques.
Le coefficient Kinship montre les mêmes résultats que le coefficient de Moran, à savoir, une distance
de 2,5 km au‐delà de laquelle, les individus sont génétiquement différenciés.
‐0,1
‐0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Moran
95% inf
95% sup
*
* * Moran
‐0,04
‐0,02
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Kinship
95% inf
95% sup
*
* *
Kinship
30
4.11 Analyse de la structure des populations Le programme STUCTURE indique que le nombre le plus probable de cluster est de 8 (Fig. 17).
Figure 17: Probabilité logarithmique des données [Ln P(D)] obtenue à partir du programme STRUCTURE 2.3.3 pour 10 simulations de K
Figure 18: Valeur de Delta K (soit K‐1) obtenue par STRUCTURE 2.3.3. pour les 24 clusters testés
Ce graphique (Fig. 18) indique que la population des coronelles lisses est divisée en K‐1 = 2 donc K=3
clusters. Une autre valeur semble également intéressante, K‐1=6 soit K=7.
Le programme structure détermine donc 3 valeurs différentes qui pourraient représenter la
structure populationnelle des coronelles lisses en Wallonie.
‐8600
‐8500
‐8400
‐8300
‐8200
‐8100
‐8000
‐7900
‐7800
‐7700
‐76000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
log values
K
Moyenne sur Name
Max sur Name
Min sur Name
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Delta K
31
Figure 19: représentation graphique de l'appartenance (en %) des différentes populations aux 8 clusters défini par Structure
La plupart des populations sont bien différenciées, à part les groupes 8, 21, 22, 28 et 30 qui
correspondent respectivement à Vodelée, Stoumont, Meix‐Devant‐Virton, Barvaux et Lommel. La
population de Flandres appartient pour 80% à un seul cluster.
4.12 Impact du paysage Le test t‐student effectué à l’aide du tableur Excell (degré d’incertitude α=0,05) détermine la variable
« rivière » comme étant un facteur défavorable (t = 0,06), et la variable « voies ferrées » comme
étant un facteur favorable (t=0,7). Ce test a été réalisé sur les distances génétiques (Fst) des cas
particuliers ou les sites d’échantillonnages distants de moins de 5km, étaient séparés par une rivière
ou, dans l’autre cas, se trouvaient le long d’une voie ferrée. Les résultats sont utilisés à titre indicatif
pour donner une valeur de coût énergétique à ces variables.
Tableau 12: Résultats du t‐de student
Variable Présence (moyenne/ecart‐type) Absence (moyenne/ecart‐type) t‐ de student
Rivière 0,22 ± 0,10 0,04 ± 0,03 T=0,06
Voie ferrée 0,03 ± 0,02 0,09 ± 0,1 T=0,7
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Série8
Série7
Série6
Série5
Série4
Série3
Série2
Série1
32
4.13 Least cost path Pour définir les variables qui ont un impact sur la dispersion des coronelles, les deux scénarios ont
été testés plusieurs fois avec des valeurs de coût différentes. Les résultats obtenus ont été comparés
aux distances génétiques (Fst) non corrigées. Un seul des tests effectués montre une corrélation
négative de ‐0,04 pour le coût énergétique et une corrélation faible de 0,124 pour la distance
métrique (test 7 figure 20). Ce test correspond à la variable « voie ferrée » comme étant négative
pour la dispersion des individus.
Figure 20: graphique représentant les valeurs de corrélations (r) pour chaque scénario [Mauve= scénario 1, Brun = scénario 2]. Les distances métriques sont représentées par un losange vert (R Apd) et les coûts énergétiques sont représentés par un carré vert (R lcd).
Dans la figure 20, le premier scénario est représenté par les tests de 1 à 5. La corrélation la plus
élevée entre les distances métriques et les distances génétiques apparait au test 1 (pour la distance
métrique r = 0,283 ; pour le coût énergétique r=0,247) mais c’est pour les tests 3 et 5 que le coût
énergétique est le plus élevée avec une corrélation de 0,267. Il n’y a cependant pas de grandes
différences entre les divers tests du premier scénario.
Le scénario 2, représenté par les tests 6 à 11, montre une corrélation faible pour les coûts métriques
et négatives pour les coûts énergétiques lors du test 7 avec une p‐value = 0,0256. Seule la variable
« voies ferrées » était considérée comme ayant un impact négatif (coût=70) sur la dispersion alors
que les variables « zones urbaines » (habitats, services, industries) étaient considérées comme
positives avec un coût énergétique de 1 comme toutes les autres variables. Il semblerait donc que la
variable « voies ferrées » n’aie pas d’impact négatif sur la dispersion des coronelles.
‐0,1
‐0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
R Apd
R lcd
Test sur les scénarios
corrélation
33
Figure 22: Carte représentant les différentes variables d'occupation du sol ( voir tableau 5), utilisée pour le calcul du "least cost path"
Figure 213: Légende de figure 22 représentant les variables d'occupation du sol pour la Wallonie.
Discussion
34
V. Discussion
5.1 Echantillonnage La quantité d’ADN extraite à partir des écouvillons (entre 3 et 15 ng d’ADN par µl) a donné des
résultats similaires à ceux observés sur les deux autres études génétiques des populations menées
sur la coronelle lisse (Pernetta 2009 (±20 ng/µl) et Vacher 2010 (±15ng/µl)). La plupart des
échantillons avaient une quantité d’ADN suffisante pour permettre des analyses génétiques (entre 3
et 15 ng/µl d’ADN). Cependant, l’extraction d’ADN à partir des mues a donné de meilleurs résultats
puisqu’on obtient 5 fois plus d’ADN à l’aide de cette technique, ce qui n’était pas le cas lors de
l’étude sur la coronelle lisse de Vacher (2010) ou seule 50% des mues ont donné des quantités d’ADN
suffisantes pour les analyses. Le protocole d’extraction utilisé dans le cas de cette étude semble donc
être indiqué pour les mues de reptiles.
Les mues sont connues pour être une source importante d’ADN de qualité (Clark, 1998 ; Pernetta,
2009). Ce type de prélèvement est beaucoup moins invasif que le prélèvement de salive puisqu’il n’y
a pas de contact avec l’animal. De plus, l’individu peut être identifié à l’aide des dessins de la tête
(Sauer, 1994 et 1997). Il serait donc préférable de collecter la mue face à un individu entrain de
muer. Il est toutefois plus facile de trouver l’animal plutôt qu’une mue qui reste très fragile et peut
s’altérer assez rapidement. Celle‐ci devant être conservée au sec.
Seul le bien être de l’animal est discuté ici, le coût des analyses n’est pas pris en compte.
5.2 Santé génétique des populations : Structuration intra‐
populationnelle
5.2.1 Indice Ar et He
Les analyses des marqueurs microsatellites montrent une richesse allélique assez similaire entre les
différentes populations, allant de 2,14 à 2,78. Rappelons que la richesse allélique correspond au
nombre d’allèles présents à 1 locus donné et dépend de la taille de l’échantillon. Ces résultats sont
donc informatifs puisque le nombre d’échantillons n’est pas similaire pour chaque population et qu’il
suffit d’un seul individu pour augmenter cette richesse allélique.
L’indice d’hétérozygotie He (hétérozygotie attendue) est relativement peu différent de Ho
(hétérozygotie observée) ce qui laisse à penser que les populations de coronelles ne sont pas isolées
les unes des autres. Ces résultats sont similaires à ceux observés lors de l’étude sur les coronelles
lisses en Alsace (Vacher, 2010) ou les valeurs d’He sont comprises entre 0,48 et 0,73 pour des valeurs
35
hétérozygoties attendues Ho allant de 0,46 à 041. Il en est de même pour la population d’orvet
(Anguis fragilis) du canton de Vaud en Suisse, ou He varie de 0,22 à 0,65 pour un Ho de 0,24 à 0,66.
Cependant, les résultats obtenus par Pernetta (2009) montrent une différence plus importante entre
He (0,42 à 0,60) et Ho (0,36 à 0,48) concernant les Coronelles du Dorset en Angleterre.
5.2.2 Indice de consanguinité Fis
L’indice d’hétérozygotie observé est la mesure de l’écart entre le taux d’hétérozygote observé (Ho) et
le taux d’hétérozygote attendu (He) par rapport à l’équilibre de Hardy‐Weinberg. Il est légèrement
plus élevé que dans le cas des populations de Coronelle lisse dans le sud de l’Angleterre (Pernetta,
2009) ou les populations sont différenciées les unes des autres (Fis varie de 0,19 à 0,34 selon les
populations). Dans le cas du scinque de Cunningham (Egernia cunninghamile) (Stow, 2001) on
remarque que l’indice Fis est également plus élevé (0,253 à 0,263) hors, la structure de ces
différentes populations montre une dispersion limité. Une fois de plus, les résultats de cette étude
(Fis de ‐0,15 à 0,3) sont comparables avec l’étude de Vacher (2010) menée en Alsace (Fis de ‐0,14 à
0,40). Cependant, quelques résultats sont parfois légèrement plus élevés. Ces petites différences
pourraient être dues au nombre d’échantillons testés qui sont beaucoup plus nombreux pour la
Wallonie que pour l’Alsace ou le Dorset.
Les populations de Nismes, Couvin, Theux, On, Aisne, Sommerain et Barvaux présentent un
coefficient de consanguinité (Fis) négatif (respectivement ‐0 ,04 ; ‐0,01 ; ‐0,06 ;‐0,03 ;‐0,13 ; ‐0,15 ;‐
0,07) tandis que les autres sites montrent un indice Fis allant de 0,02 (Durnal) à 0,45 (Lommel). Dans
le cas du site de Lommel (0,45), il n’y avait que 2 individus analysés. Sachant que l’indice de fixation
varie en fonction du nombre d’individus, la valeur du site de Lommel n’est peut‐être pas
représentative. De plus, 5 sites montrent un Fis significatif légèrement élevé (Stoumont, Hogne, Meix‐
Devant‐Virton, Dolhain et Mirwart) néanmoins, ces valeurs restent relativement faibles. Ces données
laissent à penser que les différentes populations ne souffrent pas (ou peu) de la consanguinité.
D’après les résultats obtenus sur la diversité intra‐populationnelle, il semblerait que les différentes
populations de coronelle lisse se rapprochent du type de populations observées en Alsace (Vacher,
2010). Dans ce cas‐ci, l’auteur parle de métapopulation ou les individus seraient assez mobiles.
Contrairement aux coronelles lisses en Angleterre où les résultats tendent à montrer que l’espèce est
répartie en plusieurs unités génétiquement différenciées avec peu de transfert de gènes.
36
5.3 Structuration inter population : indice Fst L’indice de diversification Fst renseigne sur la présence ou l’absence d’un flux de gènes entre les
différentes populations. Il est possible de déterminer si des populations sont isolées car dans ce cas,
elles ne reçoivent pas de gènes provenant d’une autre population et le Fst sera égale à 1.
Dans cette étude, les sites d’échantillonnages sont répartis sur toute l’aire de répartition wallonne de
l’espèce et sont séparés par des distances pouvant aller jusqu’à 180 km, comme c’est le cas pour les
stations de Lommel (en Flandres) et de Meix‐Devant‐Virton. Cependant, malgré les distances
géographiques qui peuvent être élevées pour un reptile (Völkl & Käsewieter, 2003 ; Vacher, 2010), on
observe un Fst moyen de 0,094 (Tableau 9). Cette valeur peu élevée suggère qu’il n’y a pas de
structure au sein des populations de coronelle en Wallonie, on pourrait alors parler de
métapopulation comme pour les coronelles en Alsace (Vacher, 2010) ou le Fst moyen est de 0,06.
Les stations ayant les valeurs moyennes de Fst les plus basses sont Lommel (0,028) et Aisne (0,054) et
comptent respectivement 2 et 3 individus analysés. Ce faible échantillonnage pourrait expliquer que
ces valeurs ne soient pas significatives et qu’elles soient peu élevées. Le site de Lommel n’est pris en
compte dans cette étude que pour information puisque cette population provient de la région
flamande. Et bien que les faibles valeurs de Fst puissent être dues à un faible échantillonnage, il est
étonnant de voir qu’en comparaison par paire, les Fst entre Lommel et les autres sites ne sont guère
élevés. Un échantillonnage plus important permettrait d’en savoir plus sur la parenté entre les
coronelles de Wallonie et de Flandres. Peut‐être sont‐elles une seule et même métapopulation ?
D’un autre côté, certaines stations montrent un Fst par paire significatif parfois supérieur à 0,15 qui
indiquerait une légère différenciation avec d’autres populations (voir tableau 9) mais ces valeurs
restent inférieures à la valeur de Fst attendue lors d’une différenciation chez les reptiles qui est de
0,26 (Frankham et al., 2010). C’est le cas de la station de Java ou le Fst moyen est le plus élevé avec
0,15 et où l’on observe le plus grand nombre de Fst significatifs avec des valeurs allant jusqu’à 0,228
entre Java et Theux mais aussi entre Java et Houyet, Stoumont, Wiesme, Mirwart, Mellier et St‐
Remy. Une valeur de Fst élevée pourrait venir d’un échantillonnage insuffisant, hors la population de
java compte 28 individus analysés, ce qui est plus élevé que d’autres populations dans cette étude.
Par contre, c’est le seul site échantillonné à se trouver au Nord du sillon Sambre et Meuse. Cette
différenciation pourrait peut‐être s’expliquer par une barrière géographique.
37
Figure 23: Représentations des Fst entre le site de JAVA et tous les autres sites d'échantillonnages. Les Fst orange sont compris entre 0,15 et 0,20 tandis que les Fst en Rouge sont supérieur à 0,20.
La station de Theux est un autre exemple où l’on rencontre des valeurs significatives de Fst élevées
(0.21 avec Daily qui sont séparés par 110km et 0.23 avec Java séparé par 70Km). Le cas de Java avec
les autres stations vient d’être discuté mais dans le cas de Daily et Theux, il semblerait que la
distance jouerait un rôle dans la différenciation entre ces deux populations. En effet, la distance à
parcourir entre ces deux stations est très élevée. Hors les coronelles sont connues pour se déplacer
peu. Même les plus grandes distances effectuées par certains individus restent peu élevées (Völkl &
Käsewieter, 2003 ; Vacher, 2010).
L’indice de consanguinité (Fis) et l’indice de diversification (FST) sont deux mesures liées à la variance
de fréquence allélique, puisqu’ils reflètent une possible réduction d’hétérozygotie quand ils sont
comparés à l’équilibre d’ Hardy‐Weinberg (Holsinger & Weir, 2009).
Cependant, dans cette étude, il ne semble pas y avoir de consanguinité, et le flux de gènes serait
présent, permettant une diversité suffisante au sein des populations.
38
5.4 Isolation par la distance (IBD) Afin de déterminer l’impact éventuel de la distance sur la diversité génétique des populations de
coronelles lisses en Wallonie, un test de Mantel entre cette distance géographique et la distance
génétique a été effectué.
Les résultats montrent qu’il y aurait un effet de cette distance géographique sur la différenciation
entre les populations. Les valeurs corrigées de Fst (Rousset, 1997) ont également été testées mais
elles n’apportent pas de meilleurs résultats. Les populations de Coronella austriaca se trouvant au‐
delà de 2,5 km de distances seraient génétiquement différenciées.
Dans le cas des coronelles lisse d’Alsace, les individus sont apparentés jusqu’à une distance de 2,8
Km (Vacher, 2010). En Suisse, d’autres populations de Colubridae, à savoir les couleuvres à collier
(Natrix natrix) montrent également un isolement par la distance dès 1 Km (Meister et al., 2010). Ces
deux dernières études ont utilisé le coefficient de Moran pour déterminer la distance d’isolation
génétique et donnent des résultats similaires par rapport aux populations Wallonnes. De plus, des
résultats similaires (bien que légèrement supérieurs) ont été observés dans le cas de la couleuvre
fauve de l’Est (Mintoinus gloydi) où les populations d’Amérique du Nord sont génétiquement
différenciées au – delà de 18,5 km ; distance obtenue à l’aide du Coefficient de Kinship (Row, 2010).
D’autres espèces montrent également des résultats similaires comme c’est le cas de la vipère (Vipera
berus) du massif du Jura, en France, où les populations sont génétiquement différenciées à partir de
3 km (Ursenbacher et al., 2009). C’est aussi le cas de la salamandre tigrée (Ambystoma tigrium
melanosticum) dans le parc national de Yellowstone où les différents sites d’échantillonnages
montrent un Fst élevé dès 1km de distance (Spear et al., 2005).
En Wallonie, Il y aurait donc une différenciation génétique entre les populations de coronelles lisse
en fonction de la distance qui les séparent, ce qui pourrait être le cas de Couvin et Dolhain dont la
valeur Fst vaut 0,165 et la distance géographique est de 120 km. Mais dans certains cas, des
barrières géographiques pourraient empêcher le flux de gènes entre les populations. Dans le cas de
Java, il serait possible que le fleuve joue un rôle de barrière infranchissable.
La distance géographique pourrait donc expliquer en partie les différences génétiques entre les
différents sites d’échantillonnages.
39
5.5 Structure des populations Identifier la structure des populations de coronelles lisse en Wallonie permettrait une meilleure
compréhension concernant l’impact éventuel de la fragmentation de l’habitat sur cette espèce. En
analysant le flux génique, il est possible d’observer, si elle existe, l’isolation des populations.
D’après les indices Fst, bien que la moyenne ne soit pas élevée et suggère un bon flux de gènes inter‐
population, les résultats suggèrent tout de même que quelques populations seraient légèrement
différenciées génétiquement des autres. Afin de déterminer le type de structure des populations de
coronelles lisses, les données ont été analysées à l’aide du programme STRUCTURE.
La valeur (K) représentant au mieux la structure populationnelle d’après la méthode d’Evanno et al.
(2005), obtenue lors des analyses, montre que la Wallonie compterait 8 populations de coronelles
lisses.
Pourtant, ces résultats montrent également un delta K‐1=2, soit une population divisée en K=3
clusters. Cependant, le graphique représentant les 8 clusters pour les 30 unités populationnelles
montre un bon mélange entre les diverses unités bien que les populations de Vodelée, Stoumont,
Meix‐Devant‐Virton, Barvaux et Lommel appartiennent à plus de 50% à un seul cluster. Ce graphique
montre également que le rassemblement des unités comme dans le cas de Vodelée (Vo 1 + Vo 29
+Vo 8) à un sens puisque ce groupe appartient à 55% à un seul cluster.
Les résultats sur la variabilité génétique intra et inter‐populations, ajoutés aux résultats obtenus par
structure laissent à penser que les populations ne formeraient qu’une seule métapopulation au sein
de laquelle certaines sous‐unités se seraient différenciées par la distance.
Une autre hypothèse serait que les populations seraient isolées, ce qui impliquerait des effectifs
importants pour obtenir une variabilité génétique suffisante et beaucoup de temps écoulé depuis
l’isolation. Hors, avec le temps, les populations auraient subis la dérive génétique et les valeurs de
FST devraient être beaucoup plus élevées impliquant une différenciation entre les populations,
comme dans le cas de la population de sphénodon ponctué (Sphénodon punctatus) sur l’île Stephens
en Nouvelle‐Zélande. En effet, cette population est très grande et possède une diversité génétique
importante (richesse allélique moyenne = 8,9 ; He entre 0,73 et 0,78). Cependant, il existe une légère
différenciation significative entre les sous‐populations (Moore et al., 2008). Cette différenciation
génétique apparait au sein de la même population dont les sous‐unités ne sont pas isolées les unes
des autres. Donc, le Fst entre deux populations de coronelles devrait être plus élevé que ceux
observés ici.
40
L’hypothèse de la métapopulation dont certaines sous‐unités seraient en train de se différencier des
autres, semble la plus probable dans le cas de la coronelle lisse de Wallonie.
5.6 Barrières aux flux de gènes L’identification des variables ayant un impact sur la dispersion des individus et donc sur le flux de
gènes entre les populations d’une même espèce permettrait d’améliorer sa survie à l’aide de plan de
gestion ou de conservation en améliorant l’habitat où les voies de dispersions ou simplement en
protégeant les milieux qui lui sont favorables. A l’aide du Système d’Intégration Géographique (SIG),
il est possible de combiner les variables du paysage et les facteurs de diversifications génétiques (Fst)
pour déterminer au mieux l’impact du paysage sur une espèce.
Le choix des variables paysagères à tester s’est porté sur les voies ferrées au vue du nombre de sites
d’échantillonnages situés le long des voies ferrées et la fréquence des individus présents (jusqu’à 10
individus présents par km (Graitson, 2006), mais également sur les rivières car quelques sites
d’échantillonnages sont retrouvés dans les vallées mais pas forcément de chaque côté de l’eau.
De plus, dans plusieurs cas comme pour Barvaux, Biron et Aisne (Fig. 24), l’analyse des distances
génétiques en fonction des distances géographiques montraient un Fst supérieur entre deux stations
entre lesquelles s’écoule une rivière, alors des stations à une distance géographique égale mais sans
rivière entre‐elles avait un Fst moins élevé. Cependant, les valeurs de Fst n’étaient pas significatives à
chaque fois mais laisse néanmoins penser que les rivières pourraient‐être des barrières à la
dispersion. Pour ce qui est des voies ferrées, le résultat inverse était observé. Encore une fois, il n’y a
pas assez de Fst significatif pour en tirer des conclusions.
Figure 24: Gros plan sur les stations de Biron, Barvaux et Aisne avec les voies ferrées et les rivières représentées ainsi que les distances géographiques (noir) et génétiques (rouge)
41
Dans cette étude, la méthode du « least cost path » à l’aide du logiciel PATHMATRIX a été utilisée en
testant 2 scénarios, et en y variant les coûts énergétiques des variables (Ray 2005).
Les résultats montrent que les différents tests des deux scénarios sont assez similaires malgré les
différents coûts alloués aux variables.
Scénario 1 : Les rivières, les cultures et les routes sont des barrières à la
dispersion Dans ce scénario, le test 1 considère les variables « culture », « route » et « rivière » comme étant
défavorable (coût = 70) par rapport aux autres variables du paysage (coût = 1). Ce test présente la
meilleure corrélation entre la distance génétique (Fst) et la distance métrique calculée par le
programme mais ce n’est pas le cas de la corrélation entre les distances génétiques et les valeurs de
coût énergétique qui est plus faible que pour les autres tests. Tous les autres tests montrent des
corrélations similaires et aucune des trois variables ne semble avoir un impact plus important les
unes par rapport aux autres.
Les différents tests de ce scénario ne donnent pas d’information sur l’impact de ces trois variables.
Scénario 2 Les voies ferrées et les zones d’habitats sont des barrières à la
dispersion Le test 7 comparant la variable « voies ferrées » comme étant une barrière à la dispersion avec un
coût énergétique élevé de 70 par rapport aux autres variables, considéré dans ce cas comme étant
de faible coût (=1), montrent une corrélation négative. Ce résultat laisse à penser que la variable voie
ferrée n’a pas d’effet négatif sur la dispersion. Par contre, lorsque cette variable est associée aux
« zones urbaines » la corrélation est positive. L’association des deux variables aurait un impact sur la
dispersion mais puisque les voies ferrées n’ont, semble‐t‐il, pas d’impact négatif, il se pourrait que ce
soit les zones urbaines qui aient un impact négatif. Cependant, il n’est pas possible à ce stade de
déterminer la ou lesquelles des variables « zones urbaine » auraient un impact. C’est résultats sont
assez différents de ceux obtenu lors d’une étude sur l’orvet (Anguis fragilis) qui montre que les zones
urbaine n’ont aucun impact contrairement au voies ferrées, aux routes et aux vignoble qui sont les
variables les plus négatives pour cette espèce (Geiser2011).
Les différents effets des variables du paysage ont peut‐être été sous‐estimé lors de l’analyse avec
PATHMATRIX puisque les coûts énergétiques choisis étaient peut‐être trop faible (1, 5, 10, 15 ou 70)
pour montrer un impact réel sur la dispersion de l’animal. De plus, les différents tests ayant une
corrélation similaires pourraient être une seconde indication d’un mauvais choix pour les valeurs
42
énergétiques. Il faudrait plus d’analyses avec des valeurs plus importantes pour déterminer s’il existe
effectivement un impact des variables paysagères sur la coronelle lisse.
Ces résultats ne sont pas suffisants pour déterminer quelle variable du paysage aurait un impact sur
la dispersion des coronelles. Cependant, le nombre important de sites d’échantillonnages se trouvant
le long des voies ferrées ou dans les vallées laisse penser que ces « variables » ont un impact. De
plus, les résultats du test t‐student indiquerait également un effet sur les populations de coronelle et
leur dispersion. Un échantillonnage plus important pourrait peut‐être répondre à cette question.
Pour finir, la variable « voie ferrée » n’apparait pas comme ayant un impact négatif. Ces différentes
observations laissent à penser que les voies ferrées seraient favorables à la dispersion de Coronella
austriaca.
5.7 Gestion de l’espèce La convention de Berne et le décret de Wallonie sur la conservation de la nature, offre un statut de
protection à la coronelle lisse. Il est interdit de déranger l’animal, de l’attraper, de le garder en
captivité, de le vendre ou de le tuer. Son habitat est également protégé mais elle est considérée
comme espèce vulnérable dans la région Wallonne. D’après les données génétiques de cette étude,
la population de coronelles semble en bonne « santé ». Ce qui signifie que la protection de l’espèce
permet aux populations de « survivre » malgré la fragmentation de son habitat. Cependant, quelques
unités populationnelles semblent différenciées génétiquement. Pour éviter cette différenciation il
faut favoriser les chemins de dispersion entre les individus, c’est‐à‐dire qu’il faut identifier les voies
de passages des individus afin de les protéger ou de les remettre en état.
Les résultats de cette étude tendent à montrer que les voies ferrées joueraient un rôle positif dans la
dispersion des individus. La répartition des coronelles le long des voies ferrées (Fig. 25) montre que
certaines voies sont fortement fréquentées par ce reptile. Hors, de nombreuses voies ferrées en
Belgique sont abandonnées, démontées ou transformées en RAVeL (par exemple) (Graitson, 2006). Il
faudrait peut‐être éviter de transformer radicalement ces milieux qui pourraient devenir des milieux
hostiles pour l’espèce, une barrière à la dispersion des individus, et donc favoriserait l’isolation des
populations de coronelles, la perte de diversité génétique et l’extinction de l’espèce en Wallonie.
Toutes les voies ferrées ne sont pas « habitées » par les espèces. Seules certaines voies sont très
fréquentées, dès lors, il suffirait de favoriser ces quelques voies ferrées de manière à garantir
certains chemins de dispersion.
43
Figure 25 : Répartition de Coronella austriaca sur le réseau ferroviaire en Wallonie ou les voies ferrées sont représentées par des lignes et les stations d’échantillonnages par des gros points noir (Bulletin de la société herpétologique de France, Graitson 2006).
Puisque toutes les populations de coronelles lisses ne se trouvent pas forcément le long d’une voie
ferrée, une étude plus approfondie concernant les variables paysagères serait utile pour identifier les
voies de dispersion naturelle de l’espèce. En effet, d’autres variables pourraient être favorables ou
défavorables à la dispersion. Par exemple, les routes et autoroutes ont été plusieurs fois identifiées
comme ayant un effet sur la dispersion des individus. Dans le cas du crotale des bois (Crotalus
horridus), 2 populations séparées par une route étaient génétiquement différentes et le taux de
mortalité pour les crotales traversant cette route est de 80% (Clarck, 2010). Lors de l’étude sur les
couleuvres fauves de l’Est, des individus ont également été écrasés sur les routes (Row, 2010). Une
troisième étude, concernant la traversée des lynx (Lynx rufus) et des coyotes (Canis latrans) à travers
l’autoroute Venture près de Los Angeles indique un rôle de « filtre » du flux génétique. Enfin, une
étude effectuée sur les chevreuils (Capreolus capreolus) suggère qu’il n’y a pas de barrière absolue au
flux génique pour cette population, mais qu’une association de variables paysagères défavorables
(rivières, routes, canaux) peut conduire à une différenciation des populations (Coulon, 2006).
Conclusion
44
VI. Conclusion
Cette étude a permis d’apporter de nouvelles informations concernant la coronelle lisse (Coronella
austriaca) en Wallonie notamment sur la santé génétique, la structure et l’isolement (ou dispersion)
de(s) la population(s).
Bien que les deux techniques d’échantillonnages (écouvillons et mues) offrent une quantité d’ADN
suffisante pour les extractions, celle provenant des mues était plus élevée. Il serait donc préférable
de récolter les mues des individus qui sont identifiables d’après les écailles et serait une méthode
moins invasive.
Les résultats des analyses ADN ont apportés des informations sur la diversité génétique des
différents sites. En général, la richesse allélique et l’hétérozygotie est relativement similaire pour
chacun d’entre eux. De plus, l’indice de consanguinité n’est pas significatif et l’indice Fst entre les
différentes unités populationnelles indique qu’il y a un échange de gènes entre les individus des
différents sites.
Les analyses statistiques ont montré une isolation des populations par la distance pour celles étant
séparées par plus de 18,4Km. Pourtant, les différentes unités semblent être structurées en
métapopulation avec quelques sites qui seraient légèrement différenciés mais pas de manière
suffisante pour être considérés comme une seule population.
L’étude de la génétique du paysage a apporté des informations quant à l’impact des voies ferrées sur
la dispersion des individus.
En conclusion, pour garantir la survie de l’espèce Coronella austriaca en Wallonie, il faut identifier
correctement les voies de dispersion afin de favoriser les déplacements entre les différents sites à
coronelle.
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