Cellules normales du sang et de la moelle rouge des osmuller.ch.free.fr/bts-abm/images/documents/hematologie1tp/livret1.pdf · 0,3 % 0,04 % 6 à 40 % 2 à 4% ... • Transport dans

HématologieCellules normales du sang et de la moelle rouge des os

Livret 1 d'activités technologiques

Chantal Muller (Professeur - Lycée La Martinière Duchère - LYON )

Remerciements

Mes remerciements vont à tous ceux qui ont permis la réalisation de cet ouvrage, en particulier mes collègues, professeurs au lycée La Martinière Duchère de Lyon avec qui j'ai travaillé avec beaucoup

de plaisir en hématologie :

Marie Claude Peyrot, qui m'a énormément aidé à débuter cet enseignement,

Caroline Platroz et Stéphanie Darmochod, qui m'ont aidé efficacement à améliorer ces fiches techniques

et qui ont relu l'ensemble des livrets.

Un remerciement particulier à Christiane Robin, technicienne de laboratoire au lycée La Martinière Duchère de Lyon,

qui a contribué avec compétence et gentillesse à la mise au point de techniques.

Un remerciement aussi aux biologistes du laboratoire d'hématologie du Centre de Biologie Nord de Lyon, ainsi qu'à Madame Bizeul, technicienne cytologiste.

Des remerciements également pour Gilles et Sangeetha Muller qui m'ont aidé pour la mise en page.

La majorité des photographies des cellules sanguines et médullaires présentes dans les livrets 1 et 2 ont été reproduites avec l'aimable autorisation des responsables du site http://med2.univ-angers.fr .

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http://med2.univ-angers.fr/discipline/lab_hema/

Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Avant-propos

Ce livret 1 d'activités technologiques s'adresse aux étudiants de première année de section de technicien supérieur d'analyses de biologie médicale (B1ABM).

Il correspond au module 1 des activités technologiques d'hématologie du référentiel 2008 du brevet de technicien supérieur d'analyses de biologie médicale.

Ce livret 1 fait partie de quatre livrets relatifs aux enseignements technologiques d'hématologie de la section technicien supérieur d'analyses de biologie médicale.

Livret 1 – Cellules normales du sang et de la moelle rouge des os

Livret 2 – Hémopathies

Livret 3 – Hémostase

Livret 4 – Immuno-hématologie

AOÛTAOÛT 2015 2015

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SommaireSommairePréambulesPréambules

Risques biologiques et prévention au laboratoire d'hématologie et immunologie ..................................Utilisation du microscope..............................................................................................................................

512

Chapitre 1 – HémogrammeChapitre 1 – Hémogramme

Introduction...................................................................................................................................................Hémogramme méthodes manuelles

Fiche technique 1 – Hématocrite...........................................................................................Fiche technique 2 – Matériel pour numération manuelle des cellules..................................Fiche technique 3 – Numération des hématies.....................................................................Fiche technique 4 – Dosage de l'hémoglobine.....................................................................Fiche technique 5 – Indices érythrocytaires.........................................................................Fiche technique 6 – Numération des leucocytes..................................................................Fiche technique 7 – Frottis sanguin et coloration.................................................................Fiche technique 8 – Étude du frottis sanguin coloré............................................................Fiche technique 9 – Morphologie des leucocytes.................................................................Fiche technique 10 – Interprétation de la formule leucocytaire...........................................Fiche technique 11 – Numération des plaquettes.................................................................Fiche technique 12 – Anomalies érythrocytaires..................................................................Fiche technique 13 – Interprétation d'hémogrammes...........................................................

Examens complémentaires à l'hémogrammeFiche technique 1 – Vitesse de sédimentation......................................................................Fiche technique 2 – Numération des réticulocytes...............................................................

Hémogramme automatiséFiche technique 1 – Principes et résultats.............................................................................Fiche technique 2 – Pièges d'interprétation..........................................................................Fiche technique 3 – Analyses de résultats d'automates cellulaires.......................................

19

23273337394347556165677183

8591

97110113

Chapitre 2 – MyélogrammeChapitre 2 – Myélogramme

Introduction – Généralités.......................................................................................................................Fiche technique 1 – Étude cytologique d'un frottis médullaire.............................................Fiche technique 2 – Lignée érythoblastique - les précurseurs..............................................Fiche technique 3 – Lignée granuleuse neutrophile - les précurseurs..................................Fiche technique 4 – Lignée granuleuse éosinophiles et basophiles - les précurseurs...........Fiche technique 5 – Lignée mégacaryocytaire – les précurseurs..........................................Fiche technique 6 – Myélogramme et compte rendu............................................................

Annexe : Schéma de l'hématopoïèse...............................................................................................

121125127131135139143146

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- Préambules -- Préambules -

isques biologiques et prévention au laboratoireisques biologiques et prévention au laboratoire d'hématologie et d'immunologied'hématologie et d'immunologieRR

Le risque zéro n'existe pas, par conséquent tout le personnel de laboratoire doit savoir: repérer un risque l'évaluer le prévenir intervenir et réparer en cas d'accident.

1 - 1 - Identification du risque infectieux Identification du risque infectieux

1.1 - 1.1 - Agents infectieux transmissibles à l'homme par le sang ou les dérivésAgents infectieux transmissibles à l'homme par le sang ou les dérivés sanguins provenant de personnes contaminées.sanguins provenant de personnes contaminées.

Les agents infectieux majeurs sont des virus:virus des hépatites, principalement B (VHB) et C (VHC)virus de l'immunodéficience humaine (VIH)

VIH VHB VHCPrévention vaccinale non oui nonPrévalence de l'infection en France (2005)= nombre de personnes contaminées

110 000 300 000 700 à 800 000

Concentration virale (virions /mL) de sang chez une personne contaminée 101 à103 106 à1010 ?

Taux de transmission- par voie transcutanée- par projection cutanéomuqueuse

0,3 % 0,04 %

6 à 40 % 2 à 4%

Sources : INRS / GERES

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RISQUES BIOLOGIQUES

Risques biologiques et prévention

D'autres agents biologiques peuvent aussi être dangereux : -bactéries,-parasites sanguins,-champignons,-Agents à Transmission Non Conventionnelle (ATNC) ou prions. Ce sont des protéines infectieuses très résistantes aux procédés d'inactivation habituels (chaleur sèche, formol…). En l'état actuel de nos connaissances, ils ne semblent pas se transmettre par le sang mais peuvent se transmettre par contact de tissus contaminés (cf. sécurité au laboratoire de cytologie et d'histologie).

1.2 - 1.2 - Modes de transmission de ces agents infectieux Modes de transmission de ces agents infectieux

Il existe 4 modes de transmission des agents infectieux à l'homme: par voie transcutanée et cutanéomuqueuse

La plupart des agents infectieux ne traversent pas une peau saine, mais toute coupure ou micro-coupure est une porte d'entrée pour ces agents.Exemple de risque infectieux : piqûre par du matériel souillé (aiguille, pipette Pasteur en verre, bris de verre…)N.B. C'est le risque le plus grave de contamination.

par inhalation d'aérosolsC'est le mode de transmission le plus fréquent. Le risque est insidieux, car les aérosols ne sont pas visibles.Exemple de risques infectieux : inhalation d'aérosols lors de l'ouverture de tube de sang ou de plasma contaminé.

par voie oraleÉtant donné l'interdiction absolue de pipeter à la bouche, la contamination est souvent due au fait de porter à la bouche des objets souillés (stylo …) ou des mains souillées.

par projection vers la peau , les yeux ...Exemples de risques infectieux : projection de sang contaminé lors de la casse d'un tube, ou frottement de l'œil avec la main souillée.

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. l'eau de Javel à 12 ° Cl diluée au 1/10

. l'alcool à 70°

. le glutaraldéhyde à 2 %

. le formol

. la chaleur (30 min à 56 °C pour VIH)

Retenir que ces virus sont détruits par :

Mais ils ne sont pas détruits par:

Exception :

. les rayons U.V. , les rayons gamma

. la congélation

Virus de l’hépatite B qui resiste à de nombreux traitements, d’où la nécessité d’être vacciné

Temps de contact 5 à 10 min


1.3 - 1.3 - Procédures à risquesProcédures à risques

2 - 2 - Démarche de prévention Démarche de prévention Cette démarche doit être collective pour une protection de tous.

2.1 - 2.1 - Vaccinations obligatoires pour les professionnels de la santéVaccinations obligatoires pour les professionnels de la santéLoi 91-73 du 18 janvier 1991Toute personne qui dans un établissement ou organisme public ou privé de prévention ou de soins, exerce une activité professionnelle l'exposant à des risques de contamination, doit être immunisée contre:

- BGC- l'hépatite B (rappel en fonction du taux d'Anticorps)- la diphtérie, le tétanos, la poliomyélite (vaccin à 2-4 mois, 11 mois, 6 ans, 11-13 ans puis

rappel à 25 ans, 45 ans, 65 ans puis tous les 10 ans)- la fièvre typhoïde (rappel tous les 3 ans pour les personnels de laboratoire).

De même pour tout étudiant d'un établissement préparant à l'exercice des professions de santé.

Décret du 5 septembre 1996:Obligation vaccinale avec le BCG des élèves, personnels de laboratoire d'analyses médicales.

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Qui est concerné ?L'acheminement du prélèvement

Quels risques majeurs ?

Patient

Prélèvement

Transport

Réception au laboratoire

Analyse

Élimination des déchets

InfirmièresMédecinsTechniciens

Agents

Secrétaires

Techniciens

Agents d'entretienServices extérieurs

Piqûre avec une aiguille souillée

Coupure, contact

Coupure, piqûre, contamination orale, par projection

RamassagePiqûres, coupures, contamination orofécale..

Le risque existe à chaque étape

Il n'existe pas de vaccin contre le VIH et le VHC


2.2 - 2.2 - Origine des produits sanguins utilisés au lycéeOrigine des produits sanguins utilisés au lycée

Une convention cadre sur le sang a été élaborée entre le ministère de l'éducation nationale et l'agence française du sang (14-4-1994).Les échantillons de sang sont fournis par le centre de transfusions.– Ils proviennent de donneurs prélevés dans des conditions conformes aux bonnes pratiques de

prélèvement.– Ils ont été soumis aux tests de dépistages suivants :

• recherche des anticorps anti-VIH• recherche des anticorps anti-VHC• recherche des antigènes HBs et des anticorps anti-HBc correspondant au VHB• recherche des anticorps anti-HTLV I et II (virus des leucémies humaines à lymphocytes T)• recherche des anticorps anti-syphilitiques• dosage des transaminases (enzymes indiquant une lésion des cellules hépatiques)

– Les recherches d'anticorps et d'antigènes doivent être négatives, et l'activité des transaminases dans le sang doit être normale.

2.3 - 2.3 - Respect des bonnes pratiques du laboratoire Respect des bonnes pratiques du laboratoire

Tenue de travail

– Les vêtements de ville et les sacs sont déposés dans un vestiaire extérieur au laboratoire.– Le port d'une blouse propre, en coton (mélange polyester-coton 65%-25% - non inflammable) est

impératif. La blouse doit recouvrir les vêtements personnels. Elle est à retirer à chaque sortie du laboratoire.• Transport dans le cartable : repliée endroit contre endroit dans un sac plastique• Lavage à 60°C, avec des produits lessiviels adaptés (types produits du CHU) puis repassage.

– Les cheveux longs doivent être attachés et les ongles doivent être courts.– Le port de bagues et de bracelets est à éviter.

Comportement : avoir une attitude réfléchie

– Le poste de travail doit être organisé de façon rationnelle, un soin extrême doit être apporté aux manipulations afin de réduire au maximum les risques d'éclaboussures et de contamination par des aérosols.

– Il faut veiller à ne pas déranger la personne qui manipule.

– Rien ne doit être porté à la bouche• Ne pas manger, ne pas boire, ne pas fumer, ne pas se maquiller dans le laboratoire• Éviter les gestes machinaux:

Ne pas se ronger les onglesNe pas sucer ses doigts ou un crayonNe pas se frotter les yeux, porter la main au visage, passer la main dans les cheveux…

– Le matériel utilisé doit être adapté et conforme : de préférence du matériel plastique à usage unique

– Le port de gants (aux deux mains) en latex à usage unique est obligatoire mais limité aux gestes à risque. Ils doivent être utilisés avec discernement. cf. fiche n°2

– Il faut se laver les mains après la manipulation ou en cas d'incident. cf. fiche n°1

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– La prise de note pendant la manipulationUtiliser un cahier de laboratoire recouvert d'un protège-cahier en plastique et un stylo bille qui resteront au laboratoireProtéger le protocole de la manipulation par une pochette plastique transparenteRédiger le compte rendu de la manipulation à partir du cahier de laboratoire, après décontamination de la paillasse.

– Décontamination, élimination des déchets- En cas de renversement de sang au cours de la manipulation, verser immédiatement de

l'eau de Javel à 1,2° chlorométrique (ou surfanios), poser une feuille de papier filtre; laisser agir 10 min.

-- Après utilisation

Trier et traiter le matériel selon le tableau suivant :

*

*DASRI : Déchets d'Activités de Soins à Risques Infectieux

ATTENTION : Les déchets coupants et tranchants doivent être éliminer à part dans des récipients non perforables et inviolable.

- Après la manipulation :. Désinfecter le plan de travail avec de l'eau de Javel à 3° chlorométrique ou surfanios.. Se laver soigneusement les mains. Laver les sols tous les jours : balayage humide à l'eau de Javel à 3° chlorométrique.

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Sac plastique

DASRI mou

En bac avec désinfectant

Destruction obligatoire par un

organisme spécialiséet sur site autorisé

Décontamination par immersion dans un désinfectant (eau de Javel à 1.2°Cl ou par immersion dans

l’alcool 70 % pendant 10 min minimum

Déchets Nettoyage

Matériel à usage unique

Non contaminé Potentiellement contaminé= DASRI*

Matériel réutilisable

Non contaminé Potentiellement contaminé

DASRI piquant-coupant

Poubelle imperforable

inviolable


3 - 3 - Règles à appliquer en cas d'Accident d'Exposition au Sang Règles à appliquer en cas d'Accident d'Exposition au Sang

Définition : Un accident d'exposition au sang (AES) est une exposition accidentelle avec du sang (ou un liquide biologique) lors :− d'une effraction cutanée due à une piqûre avec une aiguille ou une coupure avec un objet tranchant − d'un contact avec du sang ou du liquide contaminé sur une plaie, une peau non intacte ou une

muqueuse, permettant la pénétration de l'agent infectieux.

Les consignes à appliquer d'urgence en cas d'accident doivent être affichées.

Immédiatement : réaliser les soins locaux :

Dans la première heure :

Cette évaluation du risque dépend de nombreux facteurs :

Exemples piqûre ou coupure profonde : risque maximum aiguille creuse : risque maximum sang : risque maximum, plasma ou sérum: risque moindre absence ou présence de moyens de protection : gants ou lunettes état clinique et sérologique du patient source

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Si piqûre ou blessure ou contact sur peau lésée :- Nettoyer : eau + savon antiseptique (betadineR

scrub)- Rincer- Désinfecter par contact ou immersion pendant au moins 5 min avec

. une solution pure de Dakin

. ou de l'alcool à 70°

. ou de la Bétadine dermique (jaune)

Si projection (muqueuses, yeux)

- Rincer abondamment à l'eau courante ou à l'eau physiologique pendant au moins 5 min

Si projection oculaire, contacter ensuite un ophtalmologiste

Contacter le service d'infectiologie ou le médecin référent AES pour évaluer le risque de contamination (au lycée, ce contact se fait par l'intermédiaire de l'infirmerie)

Recherche du statut sérologique du patient potentiellement contaminant : - retrouver son bilan sérologique dans son dossier - ou réaliser en urgence le bilan sérologique du patient source (avec son accord, sur prescription médical): Ac anti-HVC, Ac anti-HIV, Ag Hbs


Dans les 24 heures :

Dans les 24 h pour un établissement privé ou dans les 48 h pour un établissement public:

Suivi sérologique :– Recherche des Ac anti-VIH avant le 8ème jour qui a suivi l'accident. Si la sérologie VIH se

révèle négative, un suivi sérologique sera réalisé, au 3ème mois et avant la fin du 6ème mois après l'accident.

– Recherche des anticorps anti-VHC et la recherche de l'Ag HBS seront réalisées dès l'accident. Le suivi biologique sera engagé comme indiqué précédemment ; de plus une surveillance des ALAT et une recherche du génome du VHC (par PCR) seront effectuées en fonction du risque de contamination.

RéférencesDécret n°94-352 du 4 mai 1994 - Circulaire n°98/228 du 9 avril 1998- Circulaire n°98/249 du 20 avril 1998Circulaire DGS/DH/DRT N° 99/680 du 8 décembre 1999

Liens

Guide de gestion des risques biologiques :Le document comprend un plan d'action, une description des dangers, une démarche préventive, un outil pour se donner des moyens d'éliminer ou de contrôler les risques ainsi que des exemples d'utilisation de la fiche de prévention à partir de la grille d'évaluation Ce guide (format pdf) est à télécharger sur le lien suivant : http://www.csst.qc.ca/portail/fr/publications/DC_200_16086.htm

Guide des risques biologiques au laboratoire Ce document comprend trois parties : − L'analyse du risque biologique − La prévention du risque biologique − La prévention spécifique à certaines activités http://www.ubordeaux2.fr/servlet/com.univ.utils.LectureFichierJoint?CODE=1206438264697&LANGUE=0

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Faire établir un certificat médical initial mentionnant le risque biologique par le médecin du travail ou médecin du service ou du service d'accueil des urgences,

Consulter son médecin du travail pour organiser le suivi sérologique et clinique et analyser les circonstances de l'AES.

Déclarer l'accident du travail à l'employeur afin de bénéficier de l'accès aux soins et aux droits de protection sociale.

http://www.ubordeaux2.fr/servlet/com.univ.utils.LectureFichierJoint?CODE=1206438264697&LANGUE=0

http://www.ubordeaux2.fr/servlet/com.univ.utils.LectureFichierJoint?CODE=1206438264697&LANGUE=0

http://www.csst.qc.ca/portail/fr/publications/DC_200_16086.htm

Utilisation du microscope optique

UUtilisation dutilisation du microscope optique microscope optique De la bonne utilisation du microscope

dépend la qualité des résultats d’analyses médicales.

But :

–Connaître les principales parties du microscope optique (ou photonique)

–Être capable de choisir le bon objectif et les bons oculaires.

–Être capable de régler le microscope.

–Être capable d’entretenir le microscope.

1 - 1 - DescriptionDescription

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oculaires tube oculaire

statif

vis fixant le tube oculaire

régulateur de luminosité

interrupteur marche/arrêt

vis micrométriquevis macrométrique

diaphragme de champ

révolver porte-objectif

objectif

platine

vis de centrage du condensateur

condensateur

manette du diaphragme du condensateur

porte-condensateur

molette de déplacement de la platine


Les principaux éléments constitutifs sont :

– une partie mécanique avec son statif, sa platine porte objet, son tube porte oculaire et son revolver porte-objectifs;

– une partie optique avec une optique d'éclairage (source lumineuse, condensateur et diaphragmes de champ et d'ouverture) surmontée d'une optique de formation de l'image (objectifs, tube et oculaires). Les rayons lumineux issus de la source (lampe) traversent le condensateur, l'objet, l'objectif, le tube, les oculaires pour arriver aux yeux de l'observateur.

2 - 2 - Rôles des éléments de la partie optiqueRôles des éléments de la partie optique

2.1 - 2.1 - ObjectifObjectif

Les objectifs sont constitués de lentilles convergentes dont le nombre est d'autant plus important que l'objectif est puissant.

Ils donnent dans le tube une image intermédiaire (b) réelle, agrandie et inversée de l'objet (a).

Grandissement (G) de l'objectif

Le grandissement est gravé sur l'objectif.

En général le microscope dispose de 3 objectifs de grandissement différent :– deux objectifs à sec 10x, 40x (ou 50x),– un objectif à immersion 100x. Une goutte

d'huile à immersion est intercalée entre la préparation et l'objectif pour augmenter la luminosité et la netteté de l'image. (Cette huile a le même indice de réfraction que le verre).

La distance entre l’objectif et la préparation varie suivant le grandissement. Plus l’objectif a un fort grossissement, plus la distance de l'objectif à la préparation est faible.

2.2 - 2.2 - 0culaires0culairesIls jouent le rôle de loupes grossissant l'image intermédiaire donnée par l'objectif; ils donnent une image (c) virtuelle grossie mais toujours inversée.

Le grossissement (G') de l'oculaire : G'= dmf dm : distance minimale de vision distincte

f : distance focaleLe grossissement est gravé sur l'oculaire.

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Objectif

Oculaire

(a) Objet posé sur la platine de taille T1

(b) Image intermédiaire réelle, agrandie et inversée de taille T2

(c) Image finale virtuelle, grossie et toujours inversée

Oeil L'oeil observe l'image finale (c) virtuelle, grossie et inversée de l'objet

Axe optique Principe du microscope :L’image intermédiaire formée par l’objectif est grossie par l’oculaire

G=T1T2


2.3 - 2.3 - CondensateurCondensateurLe condensateur permet de concentrer la lumière sur l’objet. Le champ éclairé par le condensateur doit être uniforme.

2.3.1 - 2.3.1 - Position du condensateur:Position du condensateur:La position normale du condensateur est presque complètement en haut avec la lentille frontale du condensateur très près de la lame. Le réglage de Köhler permet d'optimiser cette position.

Certains condensateurs possèdent une lentille frontale escamotable. Cette particularité est utile pour l’examen à faible grossissement. Basculer la lentille frontale, permet un éclairage plus uniforme aux 2,5x et 10x.

2.3.2 - 2.3.2 - Diaphragme du condensateurDiaphragme du condensateurLe rôle de ce diaphragme est de sélectionner les rayons lumineux parfaitement verticaux à l'objet.

La fermeture du diaphragme augmente la profondeur de champ et le contraste mais diminue la résolution et la luminosité. Le diaphragme du condensateur ne sert pas pour ajuster la luminosité, on se sert du régulateur de luminosité (5) de la lampe pour cet ajustement.

2.4 - 2.4 - Diaphragme de champDiaphragme de champ Ce diaphragme (11) permet de régler le diamètre du faisceau lumineux qui arrive sur la préparation. Ainsi seul le champ objet est éclairé. On limite alors, l'entrée de faisceaux lumineux parasites provenant de la diffraction de la lumière.

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3 - 3 - Principales caractéristiques optiquesPrincipales caractéristiques optiques

3.1 - 3.1 - Grossissement du microscopeGrossissement du microscope

Grossissement de l'image = grandissement de l'objectif x grossissement de l'oculaire

Exemple:Numération des hématies/leucocytes/plaquettes :

• objectif 40x• oculaire 10x

Observation de frottis sanguins colorés– observation générale du frottis

• objectif 10x• oculaire 10x

– étude des cellules• objectif 100x• oculaire 10x

3.2 - 3.2 - Pouvoir séparateur du microscopePouvoir séparateur du microscope

Le pouvoir séparateur correspond à la plus petite distance au-delà de laquelle il n'est plus possible de percevoir l'écartement de deux points.Le pouvoir séparateur du microscope photonique est de 200 nm soit 0,2 µm.

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Grossissement = 40 x10 = 400

Grossissement = 10 x10 = 100

Grossissement = 100 x10 =1000

1 mm

100 µm

10 µm

1 µm

100 nm

10 nm

1 nm

0,1 nm ou 1 Å

Pouvoir séparateur de l'oeil humain

Cellules végétales

Hématies humaines

Bactéries

Virus

Protéines

Acides aminés

Atomes

Pouvoir séparateur du microscope photonique Pouvoir séparateur du

microscope photonique

Pouvoir séparateur du microscope électronique

Échelle logarithmique des grandeurs microscopiques


4 - 4 - Mise au point et réglage de l'éclairage selon les règles deMise au point et réglage de l'éclairage selon les règles de KöhlerKöhler– Poser et centrer la préparation sur la platine

– Allumer la source lumineuse (6) et choisir un niveau de luminosité moyen (5)

– Placer l'objectif 10x (faible grossissement) dans l'axe du trajet lumineux.Toujours choisir en 1ère intention l'objectif x10 pour avoir une vue d'ensemble de la préparation.

– Mettre au point l'image en respectant les consignes suivantes pour éviter d'endommager le microscope ou la préparation:

• Rapprocher sous contrôle de la vue la préparation de l'objectif 10x à une distance légèrement inférieure à la distance frontale (soit quelques millimètres pour l'objectif 10x) en remontant la platine à l'aide de la vis macrométrique

Attention : Le technicien regarde sur le coté du microscope, ses yeux ne sont pas sur les oculaires.

• Placer l'œil à l'oculaire fixe et descendre doucement la platine à l'aide de la vis macrométrique jusqu'à ce que l'image apparaisse; améliorer la netteté à l'aide de la vis micrométrique.

Si la mise au point n'est pas trouvée, il est préférable de remonter la platine en regardant sur le coté du microscope et reprendre à l'étape précédente.

– Régler l'écartement des oculaires pour obtenir une parfaite superposition des deux images vues par chaque œil. On observe alors une seule image circulaire.

– Affiner la mise au point en ne regardant qu'avec l'œil ne disposant pas d'oculaire réglable (l'autre œil étant fermé). Sans toucher à la mise au point (vis macro et micrométrique) jouer sur l'oculaire à réglage dioptrique pour obtenir une image nette avec l'œil précédemment fermé (l'œil ayant initialement servi à affiner la mise au point étant alors fermé).

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– Régler la position du condensateurFermer progressivement le diaphragme de champ. Un cercle lumineux flou apparaît dans le champ d'observation.Abaisser légèrement le condensateur jusqu'à obtenir un hexagone lumineux aux bords nets à l'aide de la molette du condensateurSi cet hexagone est centré (B), réouvrir le diaphragme de champ pour éclairer juste les limites du champ d'observation (C).

Si cet hexagone est excentré (A), il faut centrer cette image (B) en agissant sur les 2 vis (15) de centrage du condensateur. Puis réouvrir le diaphragme comme précédemment (C)

– Régler le diaphragme du condensateur Pour les objets très contrastés (= colorés) le meilleur pouvoir séparateur est obtenu lorsque le diaphragme du condensateur est " plutôt " ouvert.

Pour les objets peu contrastés, il faut fermer le diaphragme du condensateur jusqu'à environ 2/3 de la pleine ouverture d'éclairage. Cela permet d'augmenter le contraste et la profondeur de champ (malheureusement le pouvoir séparateur est alors moins bon).

– Régler la clartéElle se règle sur le régulateur (5) de l'intensité lumineuse.

Jouer sur le diaphragme du condensateur pour ajuster la clarté est une erreur car on touche alors systématiquement la qualité de l'image (contraste et pouvoir séparateur).– Pour observer à l'objectif 40x, tourner délicatement le révolver porte objectif et placer l'objectif

choisi sur le trajet du rayon lumineux. La mise au point est presque correcte, l'affiner en agissant sur la vis micrométrique ; régler aussi le diaphragme du condensateur.

– Pour passer en immersion, l'objectif x40 est dégagé de l'axe optique en tournant doucement le revolver porte objectif. Lorsque les objectifs x40 et x100 sont de part et d'autre de la préparation, on dépose une fine goutte d'huile à immersion puis l'objectif x100 est positionné au-dessus de la préparation.

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Réglage du fond clair selon Köhler

A CB


Causes d'insuccès dans la mise au point:– absence d'images

• l'objectif a été déplacé trop vite et trop loin. Recommencer l'opération

• la préparation a été placée du mauvais côté (face sans frottis) : cette faute grossière n'est pas rare

– absence de lumière• l'éclairage est détérioré (usure de la lampe) ou mal branché

• l'objectif n'est pas dans le cran du révolver

• un diaphragme est fermé (diaphragme du condensateur ou de champ)

• l'écartement des oculaires est mal réglé

– absence de netteté de l'image• Optique sale:

Les lentilles des oculaires sont grasses ou poussiéreuses : la présence de tâches gênantes suivent les mouvements de rotation de l'oculaire dans le tube. Nettoyer les oculaires.De l'huile à immersion est restée sur l'objectif et a séché. Nettoyer alors délicatement les objectifs avec un papier Joseph légèrement imbibé d'alcool.

• Lame ou lamelle sale. Nettoyer avec un papier filtre imbibé d'alcool.

• Vis micrométrique bloquée en fin de course. Ne pas forcer et agir sur la vis macrométrique.

5 - 5 - Après Après utilisationutilisation du du microscopemicroscope

– diminuer l'intensité lumineuse au maximum (potentiomètre) puis éteindre le microscope (interrupteur)

– éliminer toute trace d'huile à immersion sur la tête de l'objectif à immersion et sur la platine

– essuyer les lentilles externes des oculaires, des objectifs à sec et la tête du condensateur

– placer le microscope sous sa housse protectrice.

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- Chapitre 1 -- Chapitre 1 -

LL'hémogramme'hémogrammeGGénéralitésénéralités

L'hémogramme est un examen de base en hématologie : il correspond à l'étude qualitative et quantitative des cellules sanguines.

Le prélèvement du sang et sa conservation

Prélèvement et conservation doivent respecter la taille et la forme des cellules.

Deux types de prélèvements possibles:

- prélèvement de sang veineux recueilli sur un anticoagulant adapté permettant la meilleure conservation des cellules, l'EDTA ou Ethylen Diamine TetraAcetic acid, dont le nom déposé est le Complexon.

Le prélèvement peut être conservé quelques heures à température ambiante pour la technique denumération. Par contre, les étalements sur lame doivent être faits le plus rapidement possible après leprélèvement.

- prélèvement de sang capillaire , en général au bout du doigt, ou au talon des très jeunes enfants.

✎ L'hémogramme peut être réalisé manuellement , mais actuellement vu la fréquence de sa prescription, il est automatisé dans tous les laboratoires.

1 - 1 - Étude de la population érythrocytaireÉtude de la population érythrocytaireCette étude comprend:➢ la numération des hématies

➢ la détermination de la concentration d'hémoglobine dans le sang

➢ la détermination de l'hématocrite.Ces trois résultats permettent le calcul des trois indices érythrocytaires :

➔ volume globulaire moyen (VGM)

➔ teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine (TCMH)

➔ concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH)

B1ABM CM © 19

Chapitre 1 – Hémogramme – Généralités

Données complémentaires éventuelles :

➢ l'observation de la morphologie (taille, forme, couleur, inclusions) des hématies sur frottis sanguin coloré à la coloration de May Grünwald Giemsa

➢ l'étude de la capacité érythrocytaire à former des rouleaux.

➢ l'étude de précurseurs érythrocytaires (érythroblastes) anormalement présents.

Actuellement les automates cellulaires indiquent aussi :

➢ l'indice de distribution des volumes des érythrocytes (IDE ou IDR)

➢ l'histogramme des volumes érythrocytaires.Ces deux résultats détectent une éventuelle anisocytose.

2 - 2 - Étude de la population leucocytaire Étude de la population leucocytaire Cette étude comprend :➢ la numération des leucocytes➢ la formule leucocytaire exprimée en pourcentage (%) et en Giga par litre de sang (G/L)➢ l'aspect des leucocytes.

3 - 3 - Étude des thrombocytesÉtude des thrombocytesCette étude comprend :➢ la numération des thrombocytes➢ l'étude des thrombocytes sur frottis de sang coloré

➔ taille et aspect➔ répartition (isolées ou en amas)

– sur sang veineux recueilli sur EDTA, elles doivent être isolées– sur sang capillaire, les plaquettes sont en amas

➔ estimation du nombre en accord avec la numération.

Actuellement les automates indiquent aussi le thrombocrite (volume occupé par les plaquettes dans un litre de sang), l'indice de distribution des volumes plaquettaires, l'histogramme des volumes plaquettaires qui montre la présence éventuelle de plaquettes géantes.

Pour exploiter correctement les résultats d'un hémogramme, il faut donc :– connaître les intervalles de référence– savoir reconnaître et définir les anomalies.

Deux examens complémentaires à l'hémogramme sont parfois demandés:–Vitesse de sédimentation

–Numération des réticulocytes

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4 - 4 - Intervalles de référenceIntervalles de référence

4.1 - 4.1 - Numérations globulaires et constantes érythrocytaires Numérations globulaires et constantes érythrocytaires Enfants Adulte

Nouveau- né 3 mois 1 an 3-6 ans 10-12 ans Homme Femme

Hématies (T/L) 5,0 ± 1,04,0 à 6,0

4,0 ± 0,83,2 à 4,8

4,4 ± 0,83,6 à 5,2

4,8 ± 0,74,1 à 5,5

4,7 ± 0,74 à 5,4

5,2 ± 0,74,5 à 5,9

4,7 ± 0,74,0 à 5,4

Leucocytes (G/L) 18 ± 8 12 ± 6 11,5 ± 4,5 10 ± 5 9 ± 4,5 4 ,0à 10,0

Plaquettes (G/L) 150 à 500 150 à 500

Hémoglobine(g/L)

165 ± 30 110 ± 20 120 ± 15 130 ± 10 130 ± 15 160 ± 20 140 à 180

140 ± 20 120 à 160

Hématocrite (L/L)

0,54 ± 0,10 0,38 ± 0,06 0,44 ± 0,04 0,40 ± 0,04 0,41 ± 0,04 0,47± 0,070,4 à 0,54

0,42 ± 0,050.37 à 0.47

VGM (fL) 106 95 78 ± 8 81 ± 8 84 ± 7 80 à 100

TCMH (pg) 34 29 ± 5 27 ± 4 27 ± 3 27 ± 3 27 à 33

CCMH (g/L) 310 à 370 310 à 370

4.2 - 4.2 - Formule leucocytaire Formule leucocytaire Enfants Adulte

Nouveau-né(G/L)

1 an(G/L)

4 ans(G/L)

10 ans(G/L) (G/L)

Polynucléaires neutrophiles 6,0 à 26,0 1,5 à 8,5 1,5 à 8,5 1,8 à 8,0 1,8 à 7,0

Polynucléaires éosinophiles 0,02 à 0,085 0, 05 à 0,07 0,02 à 0,65 0 à 0,6 0,04 à 0,5

Polynucléaires basophiles 0 à 0,64 0 à 0,2 0 à 0,2 0 à 0,2 0 à 0,20

Lymphocytes 2 à 11 4 à 10,5 2,0 à 8,0 1,5 à 6,5 1,0 à 4,0

Monocytes 0,4 à 3,1 0,05 à 0,11 0 à 0,8 0 à 0,8 0,1 à 1,0

Nombre de leucocytes 15 à 30 6 à 15 5 à 15 4,5 à 13,5 4,0 à 10,0

4.3 - 4.3 - Examens complémentaires à l'hémogrammeExamens complémentaires à l'hémogrammeRéticulocytes 150 G/L 10 à 100 G/L (si >120 G/L : régénération médullaire)

VS (mm/h) ≤ 15 chez l'homme et ≤ 20 chez la femmeD'après « Aide mémoire d'hématologie – C Sultan (Auteur), M Gouault-Heilmann (Auteur), M Imbert (Auteur) »

B1ABM CM © 21

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Chapitre 1 – Hémogramme – Généralités

FFiches techniquesiches techniques

HHémogramme - Méthode manuelleémogramme - Méthode manuelle

Fiche 1 : Hématocrite

Fiche 2 : Matériels nécessaires aux numérations cellulaires

Fiche 3 : Numération des hématies

Fiche 4 : Dosage de l’hémoglobine du sang

Fiche 5 : Indices érythrocytaires

Fiche 6 : Numération des leucocytes

Fiche 7 : Réalisation et coloration de frottis sanguins

Fiche 8 : Ėtude de frottis sanguins

Fiche 9 : Morphologie des leucocytes colorés par MGG

Fiche 10 : Exercices - Interprétation de formules leucocytaires

Fiche 11 : Numération des plaquettes

Fiche 12 : Anomalies érythrocytaires

Fiche 13 : Exercices - Interprétation d’hémogrammes

EExamens complémentaires à l'hémogrammexamens complémentaires à l'hémogramme

Fiche 1 : Vitesse de sédimentation

Fiche 2 : Numération des réticulocytes

HHémogramme – Méthode automatiséeémogramme – Méthode automatisée

Fiche 1 : Principes et résultats de méthodes automatisées

Fiche 2 : Exercices : Interprétation d'hémogrammes automatisés

Fiche 3 : Quelques pièges d'interprétation

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Chapitre 1 – Hémogramme méthode manuelle – Fiche 1

Hématocrite (Ht)Hématocrite (Ht)

1 - 1 - DéfinitionDéfinition

L’hématocrite (Ht) est le volume occupé par les hématies dans un litre de sang total.

Il s’exprime en L/L ou L.L-1 , parfois en %.

La détermination s’effectue: - par microméthode directe avec des tubes capillaires : microhématocrite.- par méthode indirecte grâce aux compteurs automatiques de cellules.

2 - 2 - Détermination de l’hématocriteDétermination de l’hématocrite

2.1 - 2.1 - Principe Principe

Le sang total est centrifugé dans des tubes calibrés, dans des conditions standardisées de vitesse et de durée.

Après centrifugation, on mesure: - la hauteur de la colonne d’hématies : a- la hauteur totale de la colonne de sang : b

L’utilisation d’un abaque facilite cette lecture

2.2 - 2.2 - Technique Technique

2.2.1 - 2.2.1 - MatérielMatériel✔ des microtubes (tubes capillaires) calibrés (longueur 75 mm; diamètre intérieur1mm) ouverts

aux deux extrémités.• les microtubes héparinés (repère rouge) sont utilisés lors d’un prélèvement de sang

capillaire.• les microtubes secs sont utilisés pour le sang veineux recueilli sur anticoagulant.

✔ une plaque de pâte à sceller.

✔ une centrifugeuse à microhématocrite dont la couronne horizontale peut tourner à 12 000 tours/min.

✔ un abaque.

✔ une paire de gants à usage unique en latex.

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Ht=ab

fig. 1: Capillaire après centrifugation du sang

a

b

plasma

hématies

bouchon depâte à sceller

Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 1 – Hématocrite

2.2.2 - 2.2.2 - Prélèvement du sangPrélèvement du sangL’hématocrite peut être réalisé à partir de:

✔ sang veineux recueilli sur anticoagulant sec (EDTA) pour éviter sa dilution. Avant utilisation, le sang veineux doit être soigneusement homogénéisé (20 min sur l’agitateur rotatif).

✔ sang capillaire

2.2.3 - 2.2.3 - ManipulationManipulation

Préparer le matériel nécessaire à la manipulation puis mettre les gants

✔ Ouvrir avec précaution le tube de sang veineux soigneusement homogénéisé (entourer le bouchon d’un papier filtre pour limiter les risques d’éclaboussures et d’aérosols, éliminer ce bouchon dans de l’eau de Javel, le papier dans le récipient risques biologiques).

✔ Incliner le tube de sang et plonger (pas trop profondément) une extrémité du tube capillaire, maintenu presque à l’horizontale, dans le sang veineux. Le sang monte par capillarité.Remplir le tube sur une hauteur de 5 à 6,5 cm (< 6,5 cm)

✔ Essuyer soigneusement l’extérieur du tube capillaire souillé par le sang avec un papier filtre sec puis avec du papier Joseph imprégné d’alcool.

✔ En maintenant toujours le tube capillaire horizontal, boucher l’extrémité qui n’a pas été en contact avec le sang avec de la pâte à sceller, plaque tenue verticalement.

✔ Placer le tube sur le rotor de la microcentrifugeuse, extrémité obturée vers l’extérieur, contre le bord du plateau.Choisir une répartition symétrique pour les différents tubes et repérer le numéro de la rainure correspondante, l’inscrire sur le cahier de paillasse.

✔ Mettre en place le couvercle du rotor. Refermer le couvercle de la centrifugeuse puis afficher le temps de la centrifugation (10 min) ce qui entraîne simultanément le démarrage.

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fig. 3: Capillaire contenant le sang, posé sur le plateau de la centrifugeuse à hématocrite

pâte à sceller

fig. 2: Occlusion du capillaire avec la pâte à sceller


2.2.4 - 2.2.4 - Lecture de l’hématocriteLecture de l’hématocrite

• Manipuler toujours la centrifugeuse avec des gants;• Prélever le capillaire avec les gants et désinfecter à nouveau le tube avec un papier

imbibé d'alcool.

Remarque : Le tube capillaire ne doit pas rester longtemps en position horizontale; en cas de lecture différée, le placer dans un tube à hémolyse pour le conserver en position verticale.

Avant la lecture :– observer le plasma; il doit être de couleur jaune ambré. Si le plasma est rosé, des hématies ont été

hémolysées et l'hématocrite sera inexact (erreur par défaut). Un tel plasma est appelé « plasma hémolysé ».

– observer la hauteur de la couche de leucocytes; si cette hauteur est anormalement élevée, penser à le noter.

Lecture : Elle s'effectue à l'aide d'un abaque permettant de ramener la hauteur de sang total à 100%

✔ placer le tube capillaire sur l'abaque, bas de la colonne de sang au repère zéro.✔ rouler doucement le tube pour amener le haut de la colonne de sang face au repère 100.✔ repérer la ligne médiane coïncidant avec l'interface hématie/leucocytes-plasma.✔ la graduation correspondant à cette ligne indique la valeur de l’hématocrite.

exemple : la graduation 44 correspond à un hématocrite de 0,44 L/L

La précision de la manipulation est de l’ordre de 3 %Cette lecture peut être vérifiée par mesure des 2 valeurs a et b au double décimètre et du calcul du rapport a/b.

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fig 3: Abaque de lecture de l'hématocrite (Ht). Ici, Ht=42% ou 0,42L/L

100 90 80 70 60 50 403020100

%100 90 80

70

60

50 40

30

20

10

0

%

Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 1 – Hématocrite

Après lecture : jeter le tube capillaire dans la poubelle DASRI« déchets coupants contaminés ». L’abaque et la centrifugeuse doivent être régulièrement désinfectées.

Causes d'erreur:– sang mal homogénéisé– capillaire resté trop longtemps en position horizontale après centrifugation– toute manipulation provoquant une hémolyse

3 - 3 - Détermination indirecte au compteur cellulaireDétermination indirecte au compteur cellulairecf. techniques automatiséesLe compteur mesure:- le volume moyen des hématies- le nombre d’hématies par litre de sang.Il calcule à partir de ces mesures l’hématocrite, volume occupé par les hématies dans un litre de sang.

Le résultat obtenu est souvent légèrement inférieur au microhématocrite mesuré directement car le volume de plasma retenu entre les hématies du culot globulaire n’entre pas en jeu dans la méthode indirecte.

4 - 4 - Résultats et interprétationRésultats et interprétation

Intervalles de référence (ou valeurs normales ou valeurs physiologiques)

- Elles varient avec l’âge et le sexe

Adulte

Homme Femme

0,47 ± 0,07 L/L soit 0,40 à 0,54 L/L0,42 ± 0,05 L/L soit 0,37 à 0,47 L/L

Nouveau- né 0,54 ± 0,10 L/L soit 0,44 à 0,64 L/L

Enfant 1 an 0,40 ± 0,04 L/L soit 0,36 à 0,44 L/L

- L’hématocrite peut être modifié au cours de certaines pathologies (modification du nombre ou du volume des hématies), mais il ne permet pas à lui seul d’effectuer un diagnostic.

- Il est surtout utile au calcul de certains paramètres érythrocytaires :− volume globulaire moyen (VGM)− concentration globulaire moyenne en hémoglobine (TCMH).

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Chapitre 1 – Hémogramme méthode manuelle – Fiche 2

atériel pour numération manuelle atériel pour numération manuelle des cellules sanguinesdes cellules sanguinesMM

1 - 1 - Matériel de dilutionMatériel de dilutionLe sang doit être dilué pour permettre un numération des cellules.– Utilisation des pipettes automatiques classiques :

Le sang ou le plasma sont des liquides visqueux, il est donc indispensable de prémouiller le cône avant utilisation. Pour cela, avec la pipette muni de son cône, aspirer et refouler 3 fois le liquide visqueux.

– Utilisation des pipettes à déplacement positif et à piston :Ces pipettes sont spécialement adaptées à la mesure de liquide visqueux et le liquide prélevé est ainsi isolé du corps de la pipette éliminant tout risque de contamination par aérosols.

Description de la pipette:

Mise en place du capillaire-piston– Appuyer sur le bouton-poussoir jusqu'à la deuxième butée. La pince s'ouvre et dépasse l'embout.– Prendre le capillaire-piston et faire glisser l'extrémité supérieur du piston dans la pince de fixation.– Relâcher doucement le bouton-poussoir.– Pour contrôler le bon montage du capillaire-piston, appuyer et relâcher le bouton-poussoir tout en

vérifiant le déplacement du piston dans le capillaire.

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AT

V

B

S

H

P

C

A – Bouton-poussoirB – CorpsC-P – Capillaire -pistonH – Support de capillaire - PinceS – EmboutT – Molette pour régler le volumeV – Volumètre

Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 2 – Numération manuelle des cellules sanguines

Aspiration – Appuyer sur le bouton- poussoir jusqu’à la première butée,– Immerger le capillaire dans le liquide (ex: sang) (2 mm),– Relâcher le bouton- poussoir lentement pour aspirer le liquide (position haute), – Essuyer tout excès de liquide à l’extérieur du capillaire, à l'aide d'un papier filtre et veiller à ne pas

toucher l’orifice. Distribution – Positionner l'extrémité du capillaire à la surface du diluant, – Appuyer lentement sur le bouton-poussoir jusqu'à la première butée, – Immerger le capillaire dans le diluant (2mm), puis aspirer (relâcher le bouton-pressoir) et refouler,– recommencer 3 fois l'aspiration-refoulement.Éjection du capillaire-piston Appuyer sur le bouton-poussoir jusqu’à la première butée , puis continuez à appuyer jusqu’à la deuxième butée (le piston et le capillaire sont alors éjectés simultanément).

2 - 2 - HématimètresHématimètresIls permettent de compter les cellules dans un volume connu appelé chambre ou cellule de comptage.

2.1 - 2.1 - DescriptionDescriptionUn hématimètre est une épaisse lame de verre au centre de laquelle se trouve une ou deux plate-formes gravées d'un quadrillage différent selon les hématimètres.Deux rigoles encadrent cette plate-forme et la séparent de deux plateaux légèrement plus élevés sur lesquelles on fait adhérer une lamelle planée épaisse.Celle lamelle délimite avec la plate-forme la profondeur (h) de la chambre de comptage.

Les hématimètres les plus utilisés en hématologie sont:

✔ hématimètre de Malassez✔ hématimètre de Thoma✔ hématimètre de NeubauerVoir les caractéristiques des 3 types d'hématimères : figures 2, 4 et 6.

2.2 - 2.2 - Préparation de l'hématimètre : pose de la lamellePréparation de l'hématimètre : pose de la lamelle

S'effectue sans gantsPour faire adhérer la lamelle aux plateaux :– humecter les plateaux de l'hématimètre avec une goutte d'eau– poser une lamelle planée sur les 2 plateaux– placer les 2 pouces le long des plateaux et exercer un mouvement de va et vient en appuyant sur la

lamelle jusqu'à perception d'une résistance– contrôler la bonne adhérence par l'observation de franges irisées à la surface de contact ou par

retournement de l'hématimètre.

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fig 1: Hématimètre


2.3 - 2.3 - Remplissage de l'hématimètreRemplissage de l'hématimètre

S'effectue avec des gants. Tenir l'hématimètre avec un papier filtre, ne pas le toucher avec les gants.

– Homogénéiser le sang dilué– A l'aide une psipette en plastique à pointe effilée, aspirer un peu de sang dilué– Appliquer l'extrémité de la pointe de la psipette au contact de la lamelle, presser légèrement la

poire : la chambre de l'hématimètre doit se remplir par capillarité en 1 seule fois, il ne doit pas y avoir de bulles d'air. Un peu de liquide doit déborder dans les rigoles, mais sans les remplir.

– Laisser l'hématimètre sur un plan horizontal pour que les cellules sédimentent, le temps varie selon le type de cellules à dénombrer.

– Après sédimentation, les cellules seront comptées au microscope.

Après manipulation, l'hématimètre et sa lamelle sont immergés dans l'eau de Javel au moins 5 min, puis rincer abondamment à l'eau puis à l'alcool; ils sont séchés avec un papier.

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fig 2: Remplissage de l'hématimètre

fig 3: Photographie d'un hématimètre de Malassez avec deux lamelles planées


Caractéristiques de l'hématimètre de Malassez

Description du quadrillage:– un grand rectangle (2,5 x 2 mm) subdivisé en 10 bandes horizontales (0,25 x 2,5 mm) ou verticales

(0,2 x 2 mm)– chaque bande est subdivisée en 10 petits rectangle appelés « unités de comptage ».

Il y a 4 catégories d'unités de comptage :• unités quadrillées en 20 petits carrés égaux• unités subdivisées en bandes horizontales ou verticales• unités « vide »

La chambre de comptage correspond à un parallélépipède, dont la base est la surface du grand rectangle et la hauteur (0,2 mm) est délimitée par la lamelle planée.

UTILISATIONSNumération des hématies (fd = )– nombre d'unités de comptage : – volume utilisé pour le dénombrement : Numération des leucocytes (fd = )– nombre d'unités de comptage : – volume utilisé pour le dénombrement : Numération des plaquettes (fd = )– nombre d'unités de comptage : – volume utilisé pour le dénombrement :

30 CM © B1ABM

fig 4: Caractéristiques de l'hématimètre de Mallassez

h = 0,2 mm

0,25 mm

2,5 mm

0,20

mm

2 mm

fig 5: Dimensions de la chambre de comptage

2,5 mm

2 mm

0,2 mm

Volume total de la chambre de comptage : Vtotal =

Nombre (A) total d'unités de comptage :A =


Caractéristiques de l'hématimètre de Thoma

Description du quadrillage:– un grand carré de 1 mm de côté et subdivisé en 400 petits carrés.– certains petits carrés sont regroupés par 16 formant une

« unité de comptage »

La chambre de comptage correspond à un parallélépipède, dont la base est la surface du grand carré et la hauteur (0,1 mm) est délimitée par la lamelle planée.

UTILISATIONSNumération des hématies (fd = )– nombre d'unités de comptage : – volume utilisé pour le dénombrement :

Numération des plaquettes (fd = )– nombre d'unités de comptage : – volume utilisé pour le dénombrement :

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fig 6: Caractéristiques de l'hématimètre de Thoma

h = 0,1 mm

0,20 mm

1 mm

0,20

mm

1 mm

- Volume total de la chambre de comptage : Vtotal =

- 16 unités de comptage de 16 petits carrés

- Nombre total de petits carrés : n=

fig 7: dimensions de la chambre de comptage

0,1 mm

1 mm 1 mm


Caractéristiques de l'hématimètre de Neubauer

Cet hématimètre est aussi très utilisé.

Description du quadrillage:9 grands carrés :

– 4 grands carrés d'angle « L » – 1 carré central, lui même divisé en 25 carrés « E » groupés. Chaque carré « E »est encore

divisé en 16 plus petits carrés.

La chambre de comptage correspond à un parallélépipède, dont la base est la surface du grand carré et la hauteur (0,1 mm) est délimitée par la lamelle planée.

UTILISATIONS : Numération des hématies (fd = )– 5 carrés « E » appartenant au carré central – volume utilisé pour le dénombrement :

Numération des leucocytes (fd = )– 4 grands carrés d'angle « L »– volume utilisé pour le dénombrement :

Numération des plaquettes (fd = )– carré central (25 petits carrés « E »)– volume utilisé pour le dénombrement :

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- Volume total de la chambre de comptage : Vtotal =

- Volume du carré « L »V

L=

Volume des petits carrés « E »V

E=

fig 9: dimensions de la chambre de comptage

3 mm3 mm

0,1 mm

fig 8: Caractéristiques du quadrillage de l'hématimètre de Neubauer

mm


Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 3

NNumération des hématiesumération des hématiesDénombrement direct au microscope

1 - 1 - PrincipePrincipe

Le sang est dilué de façon précise dans un liquide isotonique (NaCl : 8,5 g/L ou eau physiologique) pour éviter la lyse des hématies.Les hématies sont comptées au microscope dans un volume connu de sang dilué, grâce à un hématimètre.

Le résultat est exprimé en nombre d’hématies par litre de sang.

2 - 2 - Réactifs et matérielRéactifs et matériel

2.1 - 2.1 - Sang à analyser Sang à analyserLe sang est prélevé chez un sujet à jeun et au repos.On peut utiliser:– du sang veineux, prélevé à la veine du pli du coude et recueilli sur EDTA. Cet anticoagulant

sec ne dilue pas le sang et respecte l’aspect des cellules.– du sang capillaire prélevé au bout du doigt chez l’adulte ou au talon chez le nouveau-né.

2.2 - 2.2 - Matériel Matérielο Pipette automatique P1000 et pipette à déplacement positif et à piston de 20 µL

ο Hématimètre de Thoma ou de Malassez et lamelle planée

ο Microscope avec objectif ( x 40) à sec

3 - 3 - Manipulation Manipulation

3.1 - 3.1 - Préparation de l’hématimètrePréparation de l’hématimètreFaire adhérer la lamelle aux plateaux (voir document « matériel »)

3.2 - 3.2 - Dilution du sang au 1/200Dilution du sang au 1/200Le sang doit être soigneusement homogénéisé (20 min sur l’agitateur rotatif ou nombreux

retournements lents du tube).Réaliser 2 dilutions successives : 1/10 puis 1/20

Préparer 2 tubes Eppendorf A et B, à l'aide d'une pipette automatique P 1000, verser dans le:• tube A (dilution au 1/10) : 180 µL d'eau physiologique• tube B (dilution au 1/20) : 380 µL d'eau physiologique

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 3 – Numération des hématies

Enfiler les gants,

Dilution au 1/10 dans le tube APrélever 20 µL de sang bien homogénéisé, puis essuyer l'extérieur du capillaire à l'aide d'un

papier filtre, sans toucher l'orifice, Rejeter les 20 µL de sang à la surface de l'eau physiologique, puis aspirer et refouler 3 fois.

Agiter le tube Eppendorf pour homogénéiser.

Dilution au 1/20 dans le tube B. Refaire la même manipulation. Volume de sang dilué au 1/20 à prélever : 20 µL

3.3 - 3.3 - Remplissage de l’hématimètreRemplissage de l’hématimètre - Lors de la numération des globules rouges, la mise en hématimètre peut être réalisée immédiatement après la dilution.

- Laisser l’hématimètre 3 à 5 min sur un plan horizontal pour que les hématies sédimentent.

3.4 - 3.4 - Comptage au microscopeComptage au microscope

Manipuler le microscope sans gant.

* Utiliser l’objectif à sec x 10 puis x 40 * Régler l’éclairage sur une faible intensité: - lentille du condenseur basculée

- diaphragme plus ou moins fermé.

- Vérifier à l’objectif x 10 qu’il n’y a pas de bulle d’air et que la répartition des hématies est homogène dans la chambre de comptage, sinon recommencer le remplissage.

- Utiliser l’objectif x 40 pour compter les hématiesο pour l’hématimètre de Malassez: dénombrer les hématies dans 4 unités de comptage, c’est à dire dans 4 rectangles quadrillés choisis aux quatre coins du quadrillage.ο pour l’hématimètre de Thoma: dénombrer les hématies dans 5 unités de comptage, soit 5 grands carrés dont 4 seront situés aux angles et un au centre du quadrillage.

Pour compter toutes les hématies et les compter une fois seulement, il faut opérer méthodiquement. * Dans chaque unité de comptage, compter les hématies carré après carré selon le schéma suivant :

dans le cas de l’hématimètre de Malassez: dans le cas de l’hématimètre de Thoma

* Les hématies à cheval sur les limites de chaque petit carré ne sont comptées que si elles sont sur la ligne horizontale supérieure ou sur la ligne verticale droite.

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Exemple : Quel est le nombre d’hématies comptées dans ces 4 carrés successifs ?

Résultats du comptage:

Attention: Le nombre de globules rouges comptés dans chaque unité de comptage ne doit pas trop varier.

3.5 - 3.5 - CalculCalculSoit:* (fd) la dilution de sang * (v) le volume de sang dilué dans lequel le comptage a été effectué

(n) le nombre total d’hématies comptées

(N) le nombre d’hématies par litre de sang

Établir les équations aux grandeurs : N = f (fd,v,n)

Etablir les équations aux unités :

Calcul du facteur de dilution appliqué : fd =

Numération avec l’hématimètre de Malassez:Déterminer les équations aux valeurs numériques simplifiées v = N =

Numération avec l’hématimètre de Thoma:Déterminer les équations aux valeurs numériques simplifiéesv =

N =

Le résultat est exprimé en Téra /L ou 1012/L Rappel : T ou Téra = 1012

Écart type de répétabilité Sr = 0,15 T/LIncertitude composée Uc = 0,35 T/LIncertitude élargie U = k.Uc (facteur d'élargissement k=2 pour un niveau de confiance de 95%)Exprimer le résultat correctement arrondi et accompagné de l'incertitude élargie

3.6 - 3.6 - Causes d’erreurCauses d’erreur

− Mauvaise homogénéisation du prélèvement.− Mauvaise dilution ou mauvaise homogénéisation du sang dilué.− Mauvaise répartition dans l’hématimètre.− Mauvaise numération.− Comptage simultané des hématies et des leucocytes.− Les leucocytes sont différenciables des hématies par leur réfringence.

En fait l’erreur commise étant en général inférieure à 0,2 %, elle est négligeable, sauf en cas d’hyperleucocytose importante.

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 3 – Numération des hématies

4 - 4 - Interprétation des résultatsInterprétation des résultats

4.1 - 4.1 - Intervalles de référence (ou valeurs physiologiques)Intervalles de référence (ou valeurs physiologiques)

Nombre d’hématies (T/L) Nombre d’hématies (T/L)Homme 5,2 ± 0,7 4,5 à 5,9Femme 4,7 ± 0,7 4,0 à 5,4Nouveau-né 5,0 ± 1,0 4,0 à 6,0Enfant 1 an 4,4 ± 0,8 3,6 à 5,2

Ces valeurs peuvent varier avec l’altitude, la grossesse.

4.2 - 4.2 - Résultats pathologiquesRésultats pathologiques

* Si le nombre des globules rouges est nettement inférieur aux valeurs normales, il y a érythropénie.* Un nombre de globules rouges supérieur aux valeurs normales, est appelé érythrocytémie. Une érythrocytémie accompagnée d’une augmentation de l’hématocrite et du taux d’hémoglobine, permet de diagnostiquer une polyglobulie.(cf. fiche 4 - page 38)

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DDosage de l'hémoglobineosage de l'hémoglobineMéthode photocolorimétrique de DRABKIN

Méthode internationale de référence : méthode à la cyanméthémoglobine

1 - 1 - Principe Principe

Le dosage de l’hémoglobine d’un échantillon de sang se déroule en trois étapes:

1ère étape : Lyse des hématies pour faire passer l’hémoglobine en solution.

2ème étape : Transformation de l’hémoglobine en cyanméthémoglobine, dérivé coloré et stable qui présente un pic d’absorption à 540 nm.

Hémoglobine (Fe 2+ )

Méthémoglobine (Fe 3+ )

Cyanméthémoglobine

Le réactif de DRABKIN permet de lyser les hématies et de transformer l’hémoglobine en cyanméthémoglobine.

3ème étape : Dosage de la cyanméthémoglobine par colorimétrie à 540 nm.On compare l’absorbance de la solution de cyanméthémoglobine obtenue à partir du sang à l’absorbance d’une solution étalon de cyanméthémoglobine.On en déduit la concentration en hémoglobine du sang.On l’exprime en g/L (unités usuelles) ou en mmol/L (système international).

Remarque: Par cette méthode, on dose l’hémoglobine présente sous toutes ses formes, oxyhémoglobine, carbhémoglobine, methémoglobine. Seule la sulfhémoglobine n’est pas dosée mais elle n’existe qu’à l’état de traces dans le sang.

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Ferricyanure de potassium (Fe 3+ ) [Fe (CN )6 ] 3-

Ferrocyanure de potassium (Fe 2+ ) [Fe (CN )6 ] 4-

Cyanure de potassium (KCN)

Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 4 – Dosage de l'hémoglobine

2 - 2 - Intervalles de référence Intervalles de référence

Concentration en hémoglobine:

Unités usuellesg/L

Unités internationalesmmol/L

Homme ( 160 ± 20 )140 à 180 8,7 à 11,2

Femme ( 140 ± 20 )120 à 160 7,5 à 9,9

Nouveau - né ( 165 ± 30 )135 à 195 8,4 à 12,1

Enfant 1 an ( 120 ± 15 )105 à 135 6,5 à 8,4

3 - 3 - Interprétation du résultatInterprétation du résultat

– Outre les variations du taux d’hémoglobine et du nombre de GR en fonction du sexe, on observe des variations physiologiques en fonction de l’âge.

– Une diminution de la concentration de l'hémoglobine sanguin indique une anémie.Chez l'adulte, on diagnostiquera une anémie si :

* Homme Hb < 130 g/L * Femme Hb < 115 g/L

– Une augmentation de la concentration en hémoglobine associée à l’augmentation du nombre d’hématies et de l’hématocrite définit une polyglobulie.Chez l'adulte, on diagnostiquera une polyglobulie si :

Hb > 180 g/L Nombre de GR/L > 6 T /L

Ht > 0,55 L/L

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IIndices érythrocytairesndices érythrocytaires

Ils sont au nombre de 3 ; – le volume globulaire moyen (VGM),– la teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine (TCMH), – la concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH)Ces indices sont indispensables pour orienter le diagnostic d'une anémie.En cas de valeurs non physiologiques, l'étude morphologique des hématies sur frottis coloré doit être réalisée.

1 - 1 - Volume globulaire moyen – VGM Volume globulaire moyen – VGM

Signification: Le VGM représente le volume (en fL) moyen d’une hématie.

Données utiles pour le calcul

Signification

Hématocrite: Ht L/L Ht (L) d’hématies sont contenues dans 1 L de sang total.

Nombre N/L d’hématies N hématies sont contenues dans 1 L de sang total.

Ht (L) d’hématies contiennent N hématies.

Ht (L) est le volume moyen d’1 hématie. N

Aspect des hématies sur frottis coloré au MGG

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VGM = HtN

x 1015 fL

VGM

normocytose macrocytose microcytose

Rappel: 1 L ⇔ 1015 fL

Interprétation:

80 100 (fL)

Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 5 – Indices érythrocytaires

2 - 2 - Teneur corpusculaire (ou globulaire) moyenne enTeneur corpusculaire (ou globulaire) moyenne en hémoglobine – TCMH (ou TGMH)hémoglobine – TCMH (ou TGMH)Le TCMH peut s’exprimer de deux manières:

• masse (en pg) moyenne en) hémoglobine d’une hématie (unité usuelle)• nombre (en fmol) moyen de sous unités de l’hémoglobine dans une hématie (unité

internationale).

➊ Calcul du TCMH en pg (unité usuelle)

Données utiles Signification

Concentration en hémoglobine: [Hb] g/L [Hb] g d’hémoglobine sont contenus dans 1 L de sang total.

Nombre N/L d’hématies N hématies sont contenues dans 1 L de sang total.

[Hb] g d’hémoglobine sont contenus dans N hématies.

[Hb] g est la masse moyenne en hémoglobine d’1 hématie. N

TCMH=[Hb ]N x 1012 pg

➋ Calcul du TCMH en fmol de sous unités d’hémoglobine

TCMH=[Hb]N

x 1012 fmol

Aspect des hématiessur frottis coloré au MGG

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Rappel: 1 g ⇔ 1012 pg Si [Hb] g/L

Si [Hb] mmol/L

la quantité d’Hb est insuffisante:

hypochromie normochromie

un taux >33 pg est lié à la macrocytose. (Le G.R. normal étant saturé en Hb)

normochromie 27 33 pg 1,7 2 fmol

Interprétation:

TCMH

310 370 g/L 20 23,5 mmol/L


3 - 3 - Concentration corpusculaire (ou globulaire) moyenne enConcentration corpusculaire (ou globulaire) moyenne en hémoglobine – CCMH (ou CGMH) hémoglobine – CCMH (ou CGMH) Le CCMH peut s’exprimer de deux manières:• masse (en g) moyenne en hémoglobine dans 1 L d’hématies (unité usuelle): g/L• nombre (en mmol) moyen de sous unités de l’hémoglobine dans 1 L d’hématies (unité internationale): mmol/L.

➊ Calcul de la CCMH en g/L (unité usuelle) Données utiles Signification

Concentration en hémoglobine: [Hb] g/L

[Hb] g d’hémoglobine sont contenus dans 1 L de sang total.

Hématocrite: Ht L/L Ht (L) d’hématies sont contenues dans 1 L de sang total.

[Hb] g d’hémoglobine sont contenus dans Ht (L) d’hématies.

[Hb] g est la masse moyenne en Hb dans 1 L d’hématies.

CCMH=[Hb ]Ht

g /L d ' hématies

➋ Calcul de la CCMH en mmol/L de sous unités d’hémoglobine

CCMH=[Hb ]Ht

mmol/L d ' hématies

La CCMH est considérée comme un indice moins sensible de l’hypochromie que la TCMH dans les anémies, en effet la TCMH diminue avant la CCMH dans l’installation d’un cas d'anémie.

Toute anomalie révélée par les calculs doit être confirmée par l’observation des hématies sur frottis colorée.

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Si [Hb] g/L (de sang)

Si [Hb] mmol/L (de sang)

CCMH

Les hématies sont saturées en

hémoglobine

Les hématies ne sont pas saturées en hémoglobine Interprétation:

Impossible (problème technique)

Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 5 – Indices érythrocytaires

4 - 4 - Exercices d'applicationExercices d'application

Compléter les résultats concernant le "système rouge" de l'hémogramme et interpréter ces résultats.

Homme de 56 ans

Hb : 140 g/LVGM: 89 fLTGMH: 30 pg

Femme de 45 ans

Hb : 133 g/LÉrythrocytes : 4,1.1012/LVGM: 89 µm3

Enfant de 12 mois

Ht : 0,40 L/LHb : 126 g/LÉrythrocytes : 4,9.1012/L

Nouveau-né

Érythrocytes : 5,6.1012/LHt : 0,57 L/LHb : 193 g/L

Femme de 52 ans

Érythrocytes: 3,4.1012/LHt : 0,26 L/LHb : 89 g/L

Homme de 62 ans

Hb : 97 g/LÉrythrocytes : 2,85.1012/LHt : 30 %

Femme de 37 ans

Hb : 87 g/LÉrythrocytes : 3,1.1012/LHt : 0,27 L/L

Homme de 56 ans

Hb : 18,7 g/dLÉrythrocytes : 6,2.1012/LHt : 56 %

Présenter les résultats sous forme d'un tableau de résultats :

N° Valeurs trouvées Intervalle de référence pour ……………………….

Conclusion

Hémoglobine en g/L

Hématies en T/L

Hématocrite en L/L

VGM en fL

TGMH en pg

CCMH en g/L

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NNumération des leucocytesumération des leucocytesDénombrement direct au microscope


Le sang recueilli sur anticoagulant sec, est dilué de façon précise dans un liquide qui lyse les hématies (trop nombreuses, elles gêneraient la numération).Les leucocytes sont comptés au microscope dans un volume connu de sang dilué, sur un hématimètre. Le résultat est exprimé en nombre de leucocytes par litre de sang.

Remarque: Lors de cette numération, on dénombre toutes les cellules nucléées du sang.Aussi, si le frottis sanguin révèle la présence d’érythroblastes (précurseurs des érythrocytes possédant un noyau), il faut corriger le résultat pour obtenir le nombre réel de leucocytes. (voir fiche 10: exercices - formules leucocytaires).


2.1 - 2.1 - Sang à analyser Sang à analyserLe sang est prélevé chez un sujet à jeun et au repos.On peut utiliser:• du sang veineux recueilli sur EDTA. Cet anticoagulant sec ne dilue pas le sang et respecte

l’aspect des cellules.• du sang capillaire prélevé au bout du doigt chez l’adulte ou au talon chez le nouveau-né.

2.2 - 2.2 - Matériel Matériel• Pipette automatique P 200 et pipette à déplacement positif et à piston de 20 µL

• Hématimètre et lamelle planée. L’hématimètre de Malassez est utilisé habituellement.L’hématimètre de Thoma ayant un volume trop faible (0,1 mm3) ne doit pas être utilisé.

• Microscope avec objectif à sec (x 10 et x 40)

2.3 - 2.3 - Diluant : liquide de HayemDiluant : liquide de Hayem• Acide acétique ..................1 mL• Bleu de méthylène (1%) ...5 mL• Eau distillée QSP .......,..200 mL

2.4 - 2.4 - ManipulationManipulation

2.4.1 - 2.4.1 - Préparation de l’hématimètre (cf. fiche 2)Préparation de l’hématimètre (cf. fiche 2) - Faire adhérer la lamelle aux plateaux.

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 6 – Numération des leucocytes

2.4.2 - 2.4.2 - Dilution du sang au 1/20Dilution du sang au 1/20 Le sang doit être soigneusement homogénéisé (20 min sur l’agitateur rotatif ou nombreux

retournements lents du tube) Préparer le matériel nécessaire à la manipulation avant d’enfiler les gants.

- Réaliser la dilution: prélever 20 µL de sang et les diluer dans 380 µL de diluant. - Homogénéiser le mélange sang-diluant. - Laisser en attente 10 min pour permettre la lyse des hématies. - Homogénéiser à nouveau avant utilisation.

2.4.3 - 2.4.3 - Remplissage de l’hématimètreRemplissage de l’hématimètre - Laisser l’hématimètre 5 min sur un plan horizontal pour que les cellules sédimentent.

2.4.4 - 2.4.4 - Comptage au microscopeComptage au microscope Manipuler le microscope sans gant .

* Utiliser l’objectif à sec x 10 pour la mise au point, puis x 40 pour le comptage

* Régler l’éclairage sur une faible intensité: - lentille du condenseur basculée - diaphragme plus ou moins fermé.

- Vérifier à l’objectif x 10 l’absence de bulles d’air et l’homogénéité de la répartition des

leucocytes, dans la chambre de comptage, sinon recommencer le remplissage. - Utiliser l’objectif x 40 pour compter les cellules Dénombrer les cellules dans la totalité de la chambre de l’hématimètre de Malassez (10

bandes), en procédant par bande (1 bande = 10 rectangles).

2.4.5 - 2.4.5 - Calcul Calcul Soit: * (fd) le facteur de dilution de sang * (v) le volume de comptage en L * (n) le nombre total de leucocytes

comptés (N) le nombre de leucocytes par litre

de sang

Établir les equations aux grandeurs : N = f ( fd,v, n )

N = n *fd/v

Établir les equations aux unités :

Calcul du volume utilisé : Hématimètre de Malassez v =

Numération après dilution , déterminer les équations aux grandeurs simplifiées fd = 20 N = f(n) N = n*20*10 6

Écart type de répétabilité Sr = 0,15 G/L Rappel : G ou Giga = 109

Incertitude composée Uc = 0,30 G/L Incertitude élargie U = k.Uc (facteur d'élargissement k=2 pour un niveau de confiance de 95%) Exprimer le résultat correctement arrondi et accompagné de l'incertitude élargie

✎Attention : si le nombre de leucocytes est très important, il est alors nécessaire de diluer le

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sang au 1/100. Dans le cas ou fd =100, établir les equations aux grandeurs simplifiée N = f(n).

N= n *100 *10 6

2.4.6 - 2.4.6 - Causes d’erreursCauses d’erreurs - Mauvaise homogénéisation du sang - Mauvaise dilution ou mauvaise homogénéisation du sang dilué. - Mauvaise répartition dans l’hématimètre - Mauvais dénombrement.

2.5 - 2.5 - Interprétation des résultatsInterprétation des résultats

2.5.1 - 2.5.1 - Intervalles de référence (sujets à jeun et au repos)Intervalles de référence (sujets à jeun et au repos)

Nombre de leucocytes (G/L) Adulte 4,0 à 10,0 Nouveau-né 15,0 à 30,0 Enfant 1 an 6,0 à 15,0

Il existe des variations liées à : l’état physiologique du sujet : état de veille ou de sommeil, activité physique, digestion, grossesse l’âge du sujet (voir tableau ci-dessus) ; il n’y a pas de différence liée au sexe. C’est entre 5 et 12 ans que les valeurs deviennent celles de l’adulte.

Remarque : La numération des leucocytes ne concerne que les leucocytes circulants. 50 % des leucocytes totaux

du sang sont marginés, c’est à dire accolés à la paroi des vaisseaux sanguins. En cas de stress (décharge d’adrénaline), ils passent dans la circulation, ce qui augmente le nombre

de leucocytes circulants.

2.5.2 - 2.5.2 - Résultats pathologiquesRésultats pathologiques

* Il y a leucopénie si le nombre de leucocytes est inférieur aux intervalles de référence. * Il y a hyperleucocytose si le nombre de leucocytes est supérieur aux intervalles de

référence. Il est important dans la discussion de préciser l’intensité de l’anomalie (faible, modérée, forte…).

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 6 – Numération des leucocytes

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fig 10: Numération des cellules au microscope optique



onfection d'un frottis sanguinonfection d'un frottis sanguinoloration de May-Grünwald Giemsaoloration de May-Grünwald GiemsaCC

1 - 1 - GénéralitésGénéralités

1.1 - 1.1 - PrincipePrincipeLe frottis sanguin consiste en la réalisation d'un étalement monocellulaire des cellules sanguines sur une lame de verre à partir d’une goutte de sang.Les cellules ainsi déposées sur la lame sont fixées, colorées (méthode de May-Grünwald Giemsa-MGG) puis observées au microscope optique.

1.2 - 1.2 - IntérêtsIntérêtsL’observation d’un tel frottis au microscope photonique permet :

L’identification et le comptage des différents types de leucocytes . Le calcul du pourcentage des différents leucocytes et le calcul de leur nombre par litre de sang permettent l’établissement de la formule leucocytaire.

L’étude de la morphologie des érythrocytes (taille, forme, couleur et éventuelles inclusions). L’étude de la morphologie des plaquettes , de leur mode de groupement et l’estimation de leur

nombre approximatif L’observation éventuelle de cellules anormales, de parasites sanguins …

2 - 2 - Confection des frottisConfection des frottis

2.1 - 2.1 - PrélèvementPrélèvement sang veineux recueilli sur anticoagulant (EDTA) depuis moins de 3 heures sang capillaire

2.2 - 2.2 - MatérielMatériel lames de verre :Elles doivent être très propres, parfaitement dégraissées (à l’éthanol) et sèches. L’utilisation de lames munies d’un bord dépoli permettant le marquage du frottis non plus sur le sang (problème de sécurité) mais sur la lame est préférable.

lamelles d’étirement.Ce sont des lamelles (en plastique ou en verre) dont la largeur est plus petite que celle de la lame.

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 7 – Frottis sanguin et coloration May Grünwald Giemsa

2.3 - 2.3 - TechniqueTechniquePréparer le matériel (champ opératoire, lames dégraissées et référencées, pipette plastique à pointe effilée à usage unique, lamelles d’étirement, récipient de Javel).Si la lame possède un bord dépoli, inscrire les références du sang au crayon de papier sur la partie dépoli.

Mettre les gants

Poser la lame de verre horizontalement sur le champ opératoire.

Déposer une goutte de sang (de 2 mm environ de diamètre) à l’aide d’une pipette à pointe effilée à 1 cm du bord de la lame de verre (A).

Placer le bord biseautée (et à coin coupés) de la lamelle à étirement, en contact avec la lame, en avant de la goutte de sang. Faire glisser la lamelle inclinée à 45° vers la goutte de sang, jusqu’à la toucher. (A) et (B).

Laisser le sang s’étendre par capillarité le long de l’arête de la lamelle (B).

Pousser la lamelle d’un mouvement continu et régulier vers l’autre extrémité de la lame, sans trop appuyer. Tout le sang doit être étalé avant qu’on atteigne l’extrémité de la lame (C)

Sécher immédiatement le frottis par agitation à l’air

Si la lame ne possède par de bord dépoli, marquer le frottis avec un crayon de papier (réservé à cet effet) en tête du frottis.

En fin de manipulation : - Désinfecter à la Javel :

• l’extrémité du crayon (éventuellement utilisé) à la Javel• les frottis non-conformes• la lamelle (ou la jeter dans la poubelle contenant le sac autoclavable)

- Dans la poubelle contenant le sac autoclavable, jeter la pipette plastique, le champ opératoire….

- Désinfecter la paillasse à la Javel.

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2.4 - 2.4 - RésultatsRésultats

Critères d’un bon frottis :

de bonne taille (1/2 ou 3/4 de la lame) de bonne densité (ni trop mince, ni trop épais) goutte étalée en entier distant des bords de la lame donc accessible en tout point à l’observation microscopique se termine si possible par une extrémité arrondie.

Causes d’erreurs :

trous .lames mal dégraissées traînées lames sales, poussiéreuses

stries .irrégularité du mouvement stries et franges importantes appui sur la spatule

frottis trop fin et/ou trop long avec franges lamelle avec angle trop aigu ou mouvement d’étirement trop lent.

frottis trop épais et/ou trop court lamelle avec angle trop obtus ou mouvement d’étirement trop rapide.

goutte non étalée en entier (frottis non représentatif du sang) bien attendre l’étalement du sang contre l’arête de la lamelle.

barre épaisse en bout de frottis arrêt du mouvement avant épuisement du sang.

Frottis Conséquences trop épais cellules rétractées, les unes sur les autres, non identifiables trop mince cellules trop dispersées, pas assez nombreuses irrégulier, troué... mauvaise distribution des cellules mal séché hématies altérées, lymphocytes à noyau rétractés

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3 - 3 - Fixation et coloration de May-Grünwald Giemsa Fixation et coloration de May-Grünwald Giemsa

3.1 - 3.1 - PrincipePrincipe

3.1.1 - 3.1.1 - Fixation du frottis Fixation du frottis ♥♥Elle s’effectue au contact du méthanol dans lequel est dissout le colorant de May-Grünwald (MGG)

3.1.2 - 3.1.2 - Principe de la coloration Principe de la coloration ♥♥♥♥♥♥Il repose sur l’action complémentaire de deux colorants neutres (colorant de May-Grünwald et colorant de Giemsa) et sur l’affinité des éléments cellulaires pour les colorants acides (éléments acidophiles) et pour les colorants basiques (éléments basophiles).

➢ Composition qualitative des colorants : • Colorant de May-Grünwald : éosinate de bleu de méthylène en solution dans du méthanol

- Colorant acide : éosine- Colorant basique : bleu de méthylène

• Colorant de Giemsa : éosinate d’azur de méthylène en solution dans du méthanol- Colorant acide : éosine- Colorant basique : azurs de méthylène

Acquisition du pouvoir colorant : Ces deux colorants en solution dans le méthanol n’ont aucun pouvoir colorant, c’est l’addition d’eau qui leur donne leur pouvoir colorant en dissociant (ionisant) les sels en colorant acide (éosine) et colorant basique (bleu de méthylène ou azurs de méthylène).

Importance du pH : – Des variations trop importantes de pH modifient l'aspect des cellules et en particulier celle des

hématies.– Les colorants changent plus ou moins de couleur en fonction du pHPar conséquent, le pH choisi est neutre (pH = 7).

Les colorants ne colorent que les éléments cellulaires « complémentaires » avec lesquels ils ont une affinité.

Si en se fixant sur l’élément cellulaire complémentaire, le colorant (éosine et bleu de méthylène) ne change pas de conformation, la coloration est dite

orthochromatique. le colorant (azurs de éthylène) change de conformation et donc de couleur, la coloration est

dite métachromatique.

L’ éosine , colorant acide rouge rosé, se fixe sur :• les éléments cellulaires basiques (ou acidophiles ou éosinophiles) et les colorent en rose-

orangé. Exemples : les cytoplasmes des hématies chargées en hémoglobine, les granulations des polynucléaires éosinophiles, et les histones basiques du noyau.

• les éléments cellulaires neutrophiles.

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Le bleu de méthylène, colorant basique bleu, se fixe sur : • les éléments cellulaires acides (ou basophiles) et les colorent en bleu.

Exemples : les noyaux contenant de l’ADN, les cytoplasmes chargés en ARN (traduction).

• les éléments cellulaires neutrophiles.

L’action combinée des 2 colorants, éosine et bleu de méthylène, sur les éléments neutrophiles donne une coloration violacée (lilas). Exemples : les granulations des polynucléaires neutrophiles.Ces colorations sont orthochromatiques.

Les azurs de méthylène, colorant basique bleu, colorent les éléments cellulaires acides (ou basophiles) en rouge.Exemples :

. les noyaux (déjà colorés en bleu par le bleu de méthylène) sont surcolorés en violet,

. les granulations azurophiles des monocytes, des lymphocytes granuleux et des plaquettes sont colorées en rouge.

Il s’agit d’une coloration métachromatique.

3.2 - 3.2 - RéactifsRéactifs

3.2.1 - 3.2.1 - Colorant de May-GrünwaldColorant de May-Grünwald- Colorant de May Grünwald (poudre) : 5 g- Méthanol (CH3OH) ……………… : qsp 1000 mL

3.2.2 - 3.2.2 - Colorant de GiemsaColorant de Giemsa- Colorant de Giemsa (poudre) : 0,75 g- Méthanol (CH3OH) .....……..: 65 mL- Glycérol …………………….. : 65 mL

Dans certains pays, surtout anglophones, la poudre de Giemsa est remplacée par le colorant de Wright.

Indication sur la prévention de risques chimiques

3.2.3 - 3.2.3 - Eau neutre (pH = 7)Eau neutre (pH = 7)- Hydrogénophosphate de sodium (Na2HPO4)….. : 5 g- Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) : 1 g- Eau distillée …………………………………… : qsp 1 L

Vérifier le pH au pH-mètre et ajuster si nécessaire.

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3.3 - 3.3 - TechniqueTechnique

3.3.1 - 3.3.1 - Fixation Fixation Avec les gants

Placer la lame du frottis sur un support horizontal au-dessus d’un bac de coloration

Verser sur la lame 15 à 18 gouttes de colorant de May-Grünwald pur de façon à recouvrir complètement le frottis

Laisser agir 3 min.

3.3.2 - 3.3.2 - Coloration au May-GrünwaldColoration au May-GrünwaldSans les gants :

Ajouter autant de gouttes d’eau neutre que de gouttes de colorant, le mélange est quasi spontané. (Éventuellement, terminer le mélange en inclinant légèrement la lame.)

Laisser agir 2 min

Rincer le frottis par un jet d’eau neutre projeté délicatement sur la lame au-dessus du frottis.

3.3.3 - 3.3.3 - Coloration au GiemsaColoration au Giemsa Préparation extemporanée de la solution de Giemsa pendant les 2

min précédentes : dans une boite de Laveran, verser 30 mL d’eau neutre (mesurée à l’aide d’une éprouvette graduée) et 40 gouttes de colorant de telle manière que celui-ci reste à la surface de l’eau neutre et dans un angle de la boite.

Dès que la lame est prête, poser le couvercle sur la boite et mélanger en agitant doucement (le pouvoir colorant est maximun au moment du mélange).

Déposer la lame (frottis en dessous pour éviter les dépôts de précipité de colorant) dans la boite et laisser agir 10 min (Giemsa rapide)

Rincer délicatement sous un jet d’eau neutre.

3.3.4 - 3.3.4 - SéchageSéchage Essuyer la face inférieure (opposée au frottis) avec du papier filtre

Laisser sécher la lame à l’air en position inclinée

Attendre au moins 5 min avant l’observation microscopique du frottis.

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fig. 4: Boite de Laveran


3.4 - 3.4 - RésultatsRésultats

Le frottis est observé à l’objectif x 100 à l’immersion.La préparation est réussie si les cellules sont séparées, ne comporte ni dépôts de précipité, ni artéfacts (hématies toutes crénelées…) et :

• les noyaux sont rouge-violet (basichromatine) ou rouges (oxychromatine)• les cytoplasmes acidophiles sont rose-orangés (hématies)• les cytoplasmes basophiles sont bleus (lymphocytes…)• les cytoplasmes polychromatophiles sont gris-bleuté (monocytes….)• les granulations neutrophiles sont violet lilas• les granulations éosinophiles sont orangées• les granulations basophiles sont violet foncé• les granulations azurophiles sont rouges (monocytes, lymphocytes granuleux, plaquettes).

Si la préparation est –mal séchée avant coloration les hématies sont crénelées et sont alors appelées échinocytes–mal fixée les leucocytes sont rétractés, sans contraste, non identifiables–mal colorée les temps de coloration ne sont pas respectés, le pH de l’eau n’est pas neutre.

Si le pH de l’eau est légèrement acide, les hématies présentent une teinte rose vif.Si le pH de l’eau est légèrement basique, les hématies présentent une teinte gris verdâtre.

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En savoir plus

Laveran est le nom du médecin militaire, prix Nobel 1907, pour avoir découvert l’agent du paludisme dans les hématies en 1880.

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ÉÉtude cytologique du frottis sanguin colorétude cytologique du frottis sanguin coloré

1 - 1 - Examen global du frottis sanguinExamen global du frottis sanguin

Dans un premier temps : Examen de l’ensemble du frottis à faible grossissement (Obj.x10)

Si le frottis est trop épais, les leucocytes et les érythrocytes sont rétractés les détails morphologiques sont peu visibles, ce qui entraîne des erreurs d’identification.

Si le frottis est trop mince, les érythrocytes sont étirés, ils apparaissent plus grands et sans dépression centrale.

Dans un deuxième temps : Examen du frottis à fort grossissement (Obj.x 100 ; à immersion).

Choisir une zone où les érythrocytes sont voisins sans se toucher (corps du frottis).

L’étude cytologique du frottis comprend l’étude des :− leucocytes : formule leucocytaire, anomalies éventuelles− hématies : aspect morphologique, groupement− plaquettes : aspect morphologique, estimation du nombre moyen par champ microscopique, mode de groupement.

2 - 2 - Formule leucocytaire (FL)Formule leucocytaire (FL)

2.1 - 2.1 - DéfinitionDéfinition

La formule leucocytaire (FL) représente la proportion des différents leucocytes dans le sang : établie au microscope en pourcentage (%) pour 100 leucocytes exprimée en nombre par litre de sang (G/L), à l’aide de la leucocytose.

Seules la FL exprimée en nombre par litre de sang doit être prise en compte pour l’interprétation des résultats.

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Cet examen permet de juger :►de la qualité de l’étalement et de la coloration ►de la densité et de la répartition des cellules►de la présence éventuelle de cellules anormales de grande taille (ex : certains parasites)

Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 8 – Étude cytologique du frottis sanguin coloré

2.2 - 2.2 - Établissement de la formule leucocytaire au microscopeÉtablissement de la formule leucocytaire au microscope Établir la FL sur 200 leucocytes en général.

Parcourir le frottis dans différentes zones réparties au centre et vers les bordsLa répartition des leucocytes sur le frottis n’est pas homogène :

- les cellules les plus petites (petits lymphocytes) se trouvent surtout au centre- les cellules les plus grosses (monocytes ou polynucléaires neutrophiles) se trouvent plutôt sur les bords.

Pour que le résultat obtenu soit bien représentatif des populations leucocytaires étudiées, il faut parcourir le frottis d’une manière égale au bord et au centre.Plusieurs méthodes sont acceptées.- Une méthode consiste à parcourir le frottis sur 4 lignes d’égales longueurs, en évitant la tête et la queue du frottis.

- Une autre méthode consiste à parcourir le frottis comme suit :

Identifier et compter chaque cellule nucléée rencontrée.

♦ les leucocytes matures : – polynucléaires neutrophiles– polynucléaires éosinophiles– polynucléaires basophiles– lymphocytes (sans distinguer les petits et grands lymphocytes)–monocytes

Noter les anomalies éventuelles (PN hypersegmenté, lymphocyte à cytoplasme hyperbasophile….).

♦ les précurseurs des leucocytes présents dans le sang lors de certaines pathologies. Ce sont des leucocytes immatures, précurseurs surtout granuleux, ils font partie de la FL.

Identifier précisément chaque stadeLes compter dans les 100% de la FL

La présence dans le sang de précurseurs granuleux, définit la myélémie.

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2 bandes près des bords du frottis2 bandes au centre du frottis

Identifier environ 50 leucocytes par bande.


♦ les précurseurs des érythrocytes (érythroblastes) présents dans le sang lors de certaines pathologies.

Ils ne font pas partie de la formule leucocytaire.La présence dans le sang d'érythroblastes, définit l'érythroblastose.Problème : Les érythroblastes sont des cellules nucléées, elles ont donc été comptées comme des leucocytes lors de la numération de ces derniers.Par conséquent, si le nombre N de leucocytes comptées est faux (erreur par excès), il faudra donc corriger ce nombre.

– Identifier précisément chaque stade des érythroblastes rencontrés lors de la réalisation de la FL.

– Les compter EN DEHORS des 100 % de la FL en indiquant leur pourcentage (%) pour 100 leucocytes.

– CORRIGER la numération des leucocytes : le nombre N de leucocytes comptées est faux (erreur par excès).N = ensembles des cellules nucléées = leucocytes + érythroblastes

Lors de la réalisation de la FL, pour 100 leucocytes (matures ou non) comptées, X érythroblastes ont été rencontrés.Correction de la leucocytose : soit N’ la leucocytose réelle :

Pour (100+ X) cellules nucléées, il y a 100 leucocytesdonc pour N cellules nucléées, il y a N’ = pppppp leucocytes

100 + XCalculer ensuite le nombre de chaque catégorie de leucocytes par litre de sang à partir de la leucocytose réelle (corrigée).

Voir exercices n° 4 et 5 fiche 10

N.B. : Il existe des claviers qui facilitent le comptage de chaque catégorie de cellules.

2.3 - 2.3 - IncertitudeIncertitudePlus le nombre de cellules comptées est grand, plus l’incertitude due au hasard de la répartition des cellules sur le frottis diminue.L’incertitude est estimée à 10 % pour 100 cellules comptées

à 7 % pour 200 cellules comptées.

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2.4 - 2.4 - Interprétation des résultatsInterprétation des résultats

2.4.1 - 2.4.1 - Chez l’adulteChez l’adulteRappel : intervalles de référence du nombre de leucocytes dans le sang : 4,0 à 10,0 G/L♥

Intervalles de référence% G. L-1

Variations pathologiquesG. L-1

Polynucléaires neutrophiles (PN)

45 à 70

1,8 à 7 < 1,5 neutropénie< 0,5 agranulocytose> 8,0 neutrophilie ou polynucléose neutrophile

Polynucléaires éosinophiles (PE) 1 à 5 0,04 à 0,5 > 0,7 hyperéosinophilie

Polynucléaires basophiles (PB) 0 à 2 0 à 0,2 > 0,2 basophilie

Lymphocytes (L)20 à 40

0,8 à 4 < 1,0 lymphopénie> 4,0 lymphocytose

Monocytes (M) 3 à 10 0,12 à 1 > 1,0 monocytose

Précurseurs des granuleux 0 0 Présence myélémie

✍A noter qu’on n’objective pas de baisse des éosinophiles, ni des basophiles, ni des

monocytes, qui sont tous à l’état normal en faible proportion.

2.4.2 - 2.4.2 - Chez l’enfantChez l’enfantCf. tableau page 21Retenir que :

La FL est très variable selon l’âge de l’enfant : A la naissance et dans les premiers jours de la vie : Polynucléose neutrophile et monocytose

physiologique Puis jusqu’à au moins 4 ans, parfois jusqu’à 10-12 ans : Lymphocytose physiologique . Cette

lymphocytose physiologique est responsable de l’inversion de la fL : % polynucléaires < % lymphocytes + % monocytes.

Elle est liée aux nombreuses viroses entrainant l’activité intense des mécanismes immunologiques à cette période de la vie.L’interprétation précise des résultats nécessite l’utilisation du tableau page 21.

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3 - 3 - Étude des hématiesÉtude des hématiesObserver la taille, la forme, la couleur des hématies ainsi que la présence éventuelle d’inclusion anormale.

La population érythrocytaire normale est assez homogène :− hématies de 7 à 8 µm− avec une petite zone centrale plus claire due à la forme biconcave− une teinte beige rosée

Les anomalies de taille, de forme, de couleur, la présence d’inclusions intra-érythrocytaires doivent être identifiées et plus ou moins quantifiées car elles jouent un rôle important dans le diagnostic des anémies.

Toujours bien vérifier que les anomalies de taille et de couleur soient bien cohérentes avec les indices érythrocytaires (VGM, TCMH et IDR).

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fig. 5: Hématies de taille, de forme et de couleur anormales


4 - 4 - Étude des thrombocytes Étude des thrombocytesApprécier le nombre de plaquettes de façon approximative :

nombre moyen par champs = environ 10 plaquettes.

✎Toujours bien vérifier que ce nombre estimé est bien cohérent avec la numération plaquettaire.

Apprécier la morphologie (taille, forme) et le groupement des plaquettes.Si le sang a été recueilli sans anticoagulant • noter la taille des plaquettes : normalement 3 à 5 µm• noter leur aspect : normalement présence de granules azurophiles• noter leur groupement : isolé ou en amas (aptitude à s’agréger)

Si le sang a été recueilli sans anticoagulant, il est normal d’observer des amas plaquettaires.

Si le sang a été recueilli sur EDTA• noter la taille des plaquettes : normalement 3 à 5 µm.

(parfois la présence d’EDTA provoque une augmentation de leur taille)• noter leur aspect : normalement présence de granules azurophiles• noter leur groupement : isolé ou en amas

L’EDTA inhibe l’agrégation des plaquettes, par conséquent les plaquettes doivent être isolées.Si les plaquettes sont en amas, cela signifie que la numération des plaquettes réalisée avec le sang recueilli sur EDTA est sous estimée. Il faut absolument signaler que la numération des plaquettes doit être refaite sur du sang recueilli sur du citrate de sodium (0,108 mol/L – 9V sang /1 V de citrate).

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orphologie des leucocytes sanguinsorphologie des leucocytes sanguins - C - Coloration MGGoloration MGG - - MM

1 - 1 - Granulocytes ou polynucléairesGranulocytes ou polynucléaires

1.1 - 1.1 - Polynucléaires neutrophiles (PN) Polynucléaires neutrophiles (PN)

Pourcentage : 45 à 70% - Nombre par litre de sang : 1,8 à 7 GAspect général de la

celluleÉtude du noyau Étude du cytoplasme

– Taille 12 à 16 µm– Forme arrondie.

– Rapport N/C = 0,5– Forme : lobée (souvent 3

lobes); parfois hyposegmenté (PN jeune)

– Chromatine condensée, en motte ; violet foncé.

– Couleur : incolore – Granulations : nombreuses, fines

( 0,2 à 0,9 µm), violettes.

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Variante

Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 9 – Morphologie des leucocytes

1.2 - 1.2 - Polynucléaires éosinophiles (PE)Polynucléaires éosinophiles (PE)

Pourcentage : 1 à 5% - Nombre par litre de sang : 0,04 à 0,5 GAspect général de la



– Rapport N/C = 0,5– Forme : lobée (souvent 2

lobes)– Chromatine assez

condensée : violet .

– Couleur : incolore ou légèrement bleuté

– Granulations : assez nombreuses, plus grosses, régulières, aspect de billes ( 0,5 à 1,5 µm), beige rosé à orangé

1.3 - 1.3 - Polynucléaires basophiles Polynucléaires basophiles

Pourcentage : 0 à 2% - Nombre par litre de sang : 0 à 0,2 GAspect général de la



– Rapport N/C = 0,7– Forme : difficile à observer,

souvent en trèfle– Chromatine plus lâche;

rougeâtre.

– Couleur : incolore – Granulations : assez nombreuses,

grosses, irrégulières, aspect de billes ( 0,2 à 2 µm), violet noir; recouvrant parfois le noyau.

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Variante

Variante


2 - 2 - Agranulocytes ou mononucléairesAgranulocytes ou mononucléaires

2.1 - 2.1 - LymphocytesLymphocytes

Pourcentage : 20 à 40 % - Nombre par litre de sang : 1 à 4 G

2.1.1 - 2.1.1 - Petit lymphocytePetit lymphocyteAspect général de la



– Rapport N/C = 0,9– Forme : volumineux, bien

rond, quelquefois encoché– Chromatine très

condensée, pâteuse; violet noir.

– Couleur : basophile (bleu vif)– Aspect : croissant ou mince couronne– Granulations : aucune en général

2.1.2 - 2.1.2 - Grand lymphocyteGrand lymphocyteAspect général de la


– Taille 10 à 15 µm– Forme arrondie mais

déformable.

– Rapport N/C = 0,7– Forme : rond, ovalaire ou

en « drapeau »– Chromatine moins

condensée que celle du P.L.; violet.

– Couleur : bleu pâle ,– Aspect : quantitativement plus

important que chez le P.L.– Granulations : pas de granulation

ou quelques granulations azurophiles, (rouge vif), assez grosses, souvent regroupées dans une vacuole incolore.

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Petit lymphocyte Grand lymphocyteGrand lymphocyte à grains

ou granuleux

Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 9 – Morphologie des leucocytes

2.2 - 2.2 - MonocytesMonocytes

Pourcentage : 3 à 10 % - Nombre par litre de sang : 0,12 à 1 GAspect général de la


– Taille 16 à 30 µm– Forme arrondie mais

très déformable

– Rapport N/C = 0,7– Forme : forme irrégulière,

en S, en E, en U en fer à cheval, en nuage ...

– Chromatine peu dense, d’aspect spongieux, non condensée, rougeâtre assez claire.

– Couleur : gris bleu « ciel d'orage »– Aspect : présence de zones incolores;

contours flous, irréguliers – Granulations : pas de granulation ou

le plus souvent nombreuses granulations azurophiles (rouges); très fines, poussiéreuses, à la limite de la visibilité.

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EExercices : Interprétation de formules leucocytairesxercices : Interprétation de formules leucocytaires

Interpréter les 5 formules leucocytaires (FL) suivantes.Exercice 1 : Homme adulte – M. MorenoHomme adulte – M. Moreno

Numération des leucocytes : 7,1 G/LFormule leucocytaire (%)

PN 62

PE 1

PB 0

L 31

M 6

Exercice 2 : Enfant de 4 ans – Éric BlancEnfant de 4 ans – Éric Blanc

Numération des leucocytes : 12 G/L Formule leucocytaire (%)

PN 37

PE 1

PB 1

L 57

M 4

Exercice 3 : Homme adulte – M. BrunHomme adulte – M. Brun

Numération des leucocytes : 19,6 G/L Formule leucocytaire (%)

PN 72

PE 2

PB 0

L 20

M 3

Métamyélocytes neutrophiles 1

Myélocytes neutrophiles 2

Exercice 4 : FFemme adulte – Mme Greenemme adulte – Mme Green


PN 55

PE 1

PB 1

L 34

M 9

Érythroblastes polychromatophiles

1 pour (en plus des) 100 GB

Érythroblastes acidophiles

8 pour (en plus des) 100 GB

Exercice 5 : Femme adulte – Mme PurpleFemme adulte – Mme Purple


PN 75 Métamyélocytes neutrophiles 4

PE 3 Myélocytes neutrophiles 3

PB 1 Promyélocytes neutrophiles 1

L 11 Érythroblastes acidophiles 9 pour (en plus des)100 GB

M 2

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 10 – Interprétation de formules leucocytaires

Rédiger selon le modèle suivant : FL Pourcentage

(%) trouvéIntervalles de références (%)

Nombre de leucocytes (G/L)

Intervalles de références (G/L)

Conclusion

PNPEPBLM

Total

Conclusion générale:

Quelques conseils :

1 – Vérifier si la somme des pourcentages des différentes catégories de leucocytes est de 100 %.On tolère 99%, 101% mais pas au-delà.

2 – Vérifier si la somme des nombres/L des différentes catégories de leucocytes correspond au nombre total (éventuellement corrigé) par litre de sang de leucocytes.

3 – Les métamyélocytes et myélocytes (s’ils sont présents), sont des précurseurs des granuleux, ils entrent dans la formule leucocytaire. Il faut conclure à une myélémie.

4 – Les érythroblastes sont les précurseurs des rouges, ils n’entrent pas dans la formule leucocytaire. Si des érythroblastes sont observés sur le frottis sanguin, cela signifie qu'ils ont été comptés en tant que leucocytes lors de la numération des leucocytes.« X érythroblastes pour 100 GB » signifie qu’il y a X érythroblastes en plus des 100 GB.Il est donc important de corriger la numération des globules blancs. (cf. fiche 8) : exercice 4 et 5.

5 – Expression des résultats:Ajuster les pourcentages à 0,5 près. Calculer la somme des pourcentages des blancs et vérifier qu’il y a bien 100 %

6 – Pour interpréter la FL, il faut utiliser les nombres de GB/L et non les pourcentages.

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NNumération des thrombocytesumération des thrombocytesDénombrement direct au microscope


Le sang est dilué de façon précise dans un liquide hypotonique qui lyse les hématies et respecte les thrombocytes (ou plaquettes); ce liquide évite également l'agrégation des plaquettes au verre et entre elles.Les plaquettes sont comptées au microscope dans un volume connu de sang dilué, grâce à un hématimètre.

Le résultat est exprimé en nombre de plaquettes par litre de sang.


2.1 - 2.1 - Sang à analyserSang à analyserLe sang est prélevé chez un sujet à jeun et au repos.On peut utiliser :• du sang veineux recueilli

– sur EDTA : cet anticoagulant sec ne dilue pas le sang et inhibe l’agrégation plaquettaire.– sur citrate trisodique (0,11 mol/L) : cet anticoagulant liquide dilue le sang (1V de

citrate/9Vde sang) n'est utilisé qu'en deuxième intention, uniquement si les plaquettes du patient s'agrègent sous EDTA.

– en tube à paroi non mouillable (plastique ou verre siliconé) pour empêcher l’adhésion des plaquettes aux parois.

• du sang capillaire, prélevé au bout du doigt chez l’adulte ou au talon chez le nouveau-né.Il est impératif de prélever la 1ère goutte de sang pour réaliser la numération des plaquettes, car celles-ci adhèrent très vite à la plaie.

2.2 - 2.2 - MatérielMatériel• Pipette automatique P 200 et pipette à déplacement positif et à piston de 10 µL ou de 20 µL

• Hématimètre et lamelle planée. On peut utiliser l’hématimètre de Thoma ou celui de Malassez.

• Microscope avec objectif ( x 40) à sec . parfaitement nettoyé.

2.3 - 2.3 - Diluant : liquide de Piette Diluant : liquide de Piette• Solution A

Chlorhydrate de procaïne .. 24,3 gEau distillée QSP ...............100 mL

• Solution B NaCl ....................................0,22 gEau distillée QSP ...............100 mL Les solutions A et B sont conservées à +4°C.

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Mélanger extemporanément :solution A ...........1 mLsolution B .......... 9 mLFiltrer.

Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 11 – Numération des plaquettes

3 - 3 - ManipulationManipulation

3.1 - 3.1 - Préparation de l’hématimètre (voir matériel numération)Préparation de l’hématimètre (voir matériel numération)

– Faire adhérer la lamelle aux plateaux.

3.2 - 3.2 - Dilution du sang au 1/100Dilution du sang au 1/100

– Réaliser deux dilutions successives au 1/10– Homogénéiser le mélange sang-diluant.(Le liquide perd son opacité)– Laisser en attente 10 min pour permettre la lyse des hématies– Agiter énergiquement avant utilisation.

3.3 - 3.3 - Remplissage de l’hématimètreRemplissage de l’hématimètre

Les plaquettes, peu volumineuses, sédimentent lentement. Il est donc préférable de placer l’hématimètre dans une atmosphère humide pour éviter la déshydratation de la préparation.– Remplir l’hématimètre, le placer dans une boite de Pétri fermée et contenant un papier

filtre imbibé d’eau.– Laisser sédimenter 30 minutes.

3.4 - 3.4 - Numération au microscopeNumération au microscopeManipuler le microscope sans gant. * Vérifier à l’objectif x 10 la netteté de la préparation. * Utiliser l’objectif x 40 pour compter les cellules.

Les plaquettes sont de petites cellules réfringentes de 1 à 3 µm de diamètre, pour les observer et les compter il faut:FAIRE VARIER CONSTAMMENT LA MISE AU POINT LORS DU COMPTAGE

☑Avec l’hématimètre de Thoma : compter les plaquettes dans la totalité du quadrillage( la sédimentation est plus rapide car la chambre est moins profonde)

☑Avec l’hématimètre de Malassez : compter les plaquettes dans 20 rectangles quadrillés pris au hasard.

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3.5 - 3.5 - CalculCalcul

Soit:* (fd) le facteur de dilution de sang * (v) le volume de sang dilué dans lequel on a effectué le comptage * (n) le nombre total de plaquettes comptées

(N) le nombre de plaquettes par litre de sang

Établir les equations aux grandeurs : N = f ( fd,v,n )

Établir les equations aux unités :

Applications: fd = 100

Numération avec l’hématimètre de Malassez:v = 0,20 µL

Etablir les équations aux grandeurs simplifiéesN = n *100/0,2.10-6

N = ½ * n * 109 /L

Numération avec l’hématimètre de Thoma:v = 0,1 µL

Etablir les équations aux grandeurs simplifiéesN = n *100/0,1.10-6

N = n * 109 /L

Écart type de répétabilité Sr = 15 G/L Rappel : G ou Giga = 109

Incertitude composée Uc = 30 G/L Incertitude élargie U = k.Uc (facteur d'élargissement k=2 pour un niveau de confiance de 95%)

3.6 - 3.6 - Causes d’erreursCauses d’erreurs

– Mauvaise homogénéisation du prélèvement– Mauvaise dilution ou mauvaise homogénéisation du sang dilué– Mauvaise répartition dans l’hématimètre– Mauvaise numération– La présence d’agrégats plaquettaires qui rend la numération difficile.

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 11 – Numération des plaquettes

4 - 4 - Interprétation des résultatsInterprétation des résultats

4.1 - 4.1 - Intervalle de référence Intervalle de référence

Les intervalles de référence sont les mêmes quel que soit l’âge et le sexe.

4.2 - 4.2 - Résultats pathologiquesRésultats pathologiques* Si le nombre de thrombocytes est inférieur aux intervalles de référence, il y a thrombocytopénie ou thrombopénie.

* Si le nombre de thrombocytes est supérieur aux intervalles de référence, il y a hyperthrombocytose.

L’observation des plaquettes sur frottis sanguin coloré par la méthode de MGG (May Grünwald Giemsa) complète la numération de plaquettes. Ce frottis doit être réalisé si possible, à partir de sang capillaire ( la présence de l’anticoagulant fait gonfler les plaquettes, et empêche d’observer leur agrégation).

L’observation des plaquettes doit concerner:− leur taille : au cours de certaines pathologies, on peut observer des plaquettes géantes ou

macrothrombocytes (jusqu’à 10-12 µm de diamètre).− leur aspect : présence de granulations azurophiles− leur groupement :

✗ sur sang capillaire, le frottis doit montrer des d’agrégats plaquettaires. Ils sont nombreux surtout en fin de frottis, ce qui témoigne du bon fonctionnement plaquettaire.

✗ sur du sang prélevé sous EDTA, le frottis sanguin montre généralement des plaquettes isolés. S'il est observé des agrégats plaquettaires, une nouvelle numération de plaquettes doit être réalisé sous citrate trisodique.

Avant de conclure à une thrombopénie, toujours vérifier:− l'absence de microcaillot dans le tube de sang− l'absence d'agrégat plaquettaire sur frottis sanguin.

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Thrombocytes : 150 à 500 G/L



AAnomalies érythrocytaires nomalies érythrocytaires

Dans certains états pathologiques (anémies), l'observation des hématies sur frottis sanguin coloré au MGG montre :

– des variations de la taille, de la forme, de la couleur– et même parfois la présence anormale d’inclusions intracytoplasmiques.

Parfois les hématies qui normalement sont généralement isolées sur un frottis sanguin, peuvent s’associer et pour former des rouleaux ou des amas : groupement anormal.Ces anomalies doivent être signalées lors de l’étude du frottis sanguin coloré au MGG.

L’observation des anomalies érythrocytaires s’effectue sur la zone sub-distale du frottis. Les hématies sont en monocouche et bien séparées les unes des autres. La queue du frottis est à éviter, car les hématies sont à cet endroit souvent écrasées et déformées.

Attention : Comme les anomalies érythrocytaires touchent une population cellulaire, elles sont toujours retrouvées dans plusieurs champs microscopiques.

Rappel de la morphologie normale sur frottis sanguin coloré au MGG :

Normocyte, normochrome

Cellule anuclééeForme : discocyte, biconcaveDiamètre : 7 à 8 µm (VGM = 80 à 100 fL)Couleur : Sur frottis coloré au MGG : forme ronde, beige rosé avec une zone centrale plus claire.

Cependant une légère différence de taille existe et certaines hématies peuvent être étirées ou écrasées par le frottis.

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 12 – Anomalies érythrocytaires

1 - 1 - Anomalie de taille = AnisocytoseAnomalie de taille = Anisocytose

Anisocytose : définie par une grande variabilité des diamètres des hématies sur un même frottis.

L’anisocytose peut être due à la présence de :Microcytes Forme : biconcave, normale,

Diamètre : < 6 µm (VGM < 80 fL)Couleur : beige rosé avec une zone plus claire au centre

Pathologie : microcytose rencontrés au cours des anémies dues a un trouble de synthèse de Hb.(ex : anémie ferriprive, inflammatoires, thalassémie).

Macrocytes Forme : biconcave, normale ou parfois ovalaireDiamètre : > 9 µm (VGM > 100 fL)Couleur : beige rosé avec une zone plus claire au centre plus ou moins visible

Pathologie : macrocytoseIls peuvent correspondre à des réticulocytes qui seront mis en évidence après coloration au bleu de Crésyl brillant.

Ils s'observent au cours de différentes dysérythropoïèses (anomalie de synthèse des hématies au niveau de la moelle, avec érythropoïèse inefficace) : carences en folates et/ou vitamine B12, alcoolisme, traitement par AZT. Si leur diamètre est supérieur à 12 µm, ils sont alors parfois appelés « mégalocytes ».

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2 - 2 - Anomalie de forme = Poïkilocytose Anomalie de forme = Poïkilocytose

Poïklocyte : définie par la présence dans le sang d’hématies de forme anormale, abérrante.

Attention : il ne faut pas les confondre avec des artéfacts dus à l’étalement ou au séchage

La poïkilocytose peut être due à la présence de :

Drépanocytes Forme : allongée, classiquement en forme de faucille ou de croissant, avec deux extrémités pointues, plus ou moins effilées ; ( hématies falciformes)Couleur : beige rosé

Pathologie : drépanocytose (maladie due à la présence dans les hématies d’une hémoglobine anormale : HbS qui se polymérise si la pression partielle en O2 est faible).

Codocytes ou cellules cibles

Forme : « chapeau mexicain » vu de profil, aspect de cible ou de cocarde vu de dessusCouleur : beige rosé

Leur présence est souvent associée à une anomalie de synthèse de l’hémoglobine.Ex : thalassémie, parfois au cours des anémies ferriprives.

Dacryocytes Forme : de larme, de poireCouleur : beige rosé

Cet aspect, évocateur de fibrose médullaire, est rencontré au cours de la splénomégalie myéloïde, des dysérythropoïèses acquises, et de pathologies tumorales s'accompagnant de fibrose médullaire.

Échinocytes Forme : crénelées, en oursin disque ou de sphère, hérissée de spicules fins, régulièrement répartis sur toute la surface de la cellule.Couleur : beige rosé Attention : il faut s’assurer qu’il ne s’agit pas d’artéfacts dus à un frottis mal séché ou du sang trop longtemps conservé.

s’observe au cours de - Dyslipidémies, sujets non " à jeun "- Déficit en pyruvate kinase- Insuffisance rénale aiguë.

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Acanthocytes Forme : possèdent en surface quelques spicules épais de longueur variables disposés irrégulièrement.Couleur : beige rosé

s’observe au cours de cirrhoses éthyliques sévères.

Ovalocytes Forme : ovalaire ou en bâtonnet, les extrémités sont toujours arrondies, sans spicules, ce qui les différencie des drépanocytes;Couleur : beige rosé

présents en petite quantité dans certaines anémies acquises, présents en grande quantité dans l’elliptocytose héréditaire, pathologie congénitale de la membrane du globule rouge.

Stomatocytes Forme : uniconcave Zone centrale en forme de fente (évoquant une bouche)Couleur : beige rosé

Peu spécifique (anémies hémolytiques acquises, sphérocytose héréditaire).

Schizocytes Forme : diverses (coquilles d’œufs) fragments d’hématies.Couleur : beige rosé VGM < 80 fL - cf. fig. 7

Cet aspect est observé au cours : * d'anémies hémolytiques d'origine mécanique (ex : dues à des prothèses valvulaires cardiaques...) * des brûlures sévères.

Sphérocytes Forme : sphériqueCouleur : plus foncé (avec disparition du centre clair)Diamètre : < 6 µm mais VGM compris entre 80 et 100 fL

Pathologie : sphérocytoses’observe observe au cours de la maladie de Minkowski Chauffard ou sphérocytose héréditaire (anomalies congénitale de la membrane des hématies), mais également au cours d'autres anémies hémolytiques

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3 - 3 - Anomalie de couleur = AnisochromieAnomalie de couleur = Anisochromie

Anisochromie : définie par la variabilité de l'intensité de coloration des hématies sur un même frottis.

Annulocytes ou leptocytes

Seul un mince anneau périphérique est coloré. Il y a hypochromie

Cause : teneur faible en hémoglobine dans l’hématie (TCMH<27 pg)

Ils caractérisent une hypochromie

retrouvés dans les anémies hypochromes correspondant à des anomalies de synthèse de l’Hb (Ex : anémies ferriprives sévères).

Hématies polychromatophiles

Couleur plus grise ou plus violacée

Cause : immaturité du cytoplasme : Hb incomplètement synthétisée et persistance de ribosomes (ces hématies correspondent à des réticulocytes)

témoignent d’une régénération médullaire importante.

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4 - 4 - Anomalies d'inclusions intra-érythrocytairesAnomalies d'inclusions intra-érythrocytaires

Attention : ne pas confondre précipité de colorant et inclusion intra érythrocytaire.

Hématies ponctuées ou à granulations basophiles

Très fines granulations bleu violacé réparties sur toute la surface de la cellule. Ce sont les témoins d'une anomalie de synthèse de l'hémoglobine.Cause : Elles proviennent de l’agrégation anormale de ribosomes.

observées au cours des anémies hémolytiques, mais le plus souvent, elles témoignent d'une dysérythropoïèse: hémoglobinopathie, anémie mégaloblastique, intoxication par le plomb (saturnisme)…(La recherche d'hématies ponctuées reste un examen fiable et peu onéreux dans la surveillance du saturnisme).

Sidérocytes avec corps de Pappenheimer

Fins granules en grappes d'hémosidérine (riches en fer)- 1 à 3 par hématie.

rencontrés au cours de toutes dysérythropoïèses avec sidéroblastose (nombre augmenté si splénectomie ou asplénie fonctionnelle).

Anneau de Cabot Fin filament rouge violacé, en anneau ou en 8.Cause : Il correspond à un reste de fuseau mitotique. cf. fig. 5

s'observe au cours des dysérythropoïèses.

Corps de Jolly Granule violacé souvent unique et excentre (diamètre 1 µm)Cause : Il correspond à un reliquat nucléaire (ADN) cf. fig. 5

s'observe de façon constante après splénectomie ou lors d’asplénie. Ils sont aussi présents au cours des dysérythropoïèses.

Attention : Une plaquette de petite taille peut parfois se superposer sur une hématie et ne doit pas être confondue avec une inclusion intra-érythrocytaire.

Remarque : Les parasites inta-érythrocytaires ne sont pas évoqués dans ce cours. (cf. cours de parasitologie B2ABM)

N.B. La présence d’érythroblastes (précurseurs nucléés d’hématies) est à signaler.

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Attention : certaines anomalies ne sont pas visibles sur frottis coloré par la méthode de May-Grünwald Giemsa (MGG), elles nécessitent des colorations particulières :

Corps de Heinz Ils sont mis en évidence après la coloration post-vitale au bleu de crésyl brillant.Ils apparaissent sous formes d’une ou plusieurs grosses granulations bleu foncé. situées à la périphérie de l'hématie contre sa membrane.

Cause : Ils proviennent de la dénaturation de l’hémoglobine en méthémoglobine.Ils sont dus à des précipités d'hémoglobine dénaturée (methémoglobine…), toxiques pour la cellule.

caractéristiques de certaines anémies hémolytiques, soit congénitales par hémoglobinopathies (hémoglobines instables) ou enzymopathies (surtout déficit en G6PD).

Sidérocytes Après coloration de Perls , les corps de Papenheimer forment de petites granulations bleutées, irrégulièrement réparties dans une hématie le plus souvent hypochrome et macrocytaire.

Les sidérocytes sont des hématies contenant des grains d’hémosidérine une forme de stockage du fer.

caractéristiques d'un défaut de synthèse de l'hémoglobine et d'une mauvaise incorporation du fer dans celle-ci, les sidérocytes s'observent dans les thalassémies, et autres dysérythropoïèses. Ils vont généralement de pair avec un excès de sidéroblastes dans la moelle osseuse.N.B. Ces grains bleutés peuvent aussi s’observer dans les macrophages.

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5 - 5 - Anomalie de groupementAnomalie de groupement

Hématies en rouleaux

Les hématies s'empilent l'une sur l'autre par modification de leur potentiel membranaire (qui normalement les repousse) : en général lié à une ou des protéines adsorbées modifiant la charge électrique de surface

s'observent souvent en cas gammapathie monoclonale et d'hyperfibrinogénémie (liée à un syndrome inflammatoire).

Les nombreux rouleaux présents dans le sang vont entraîner une augmentation de la VS.Il peut y avoir alors une sous estimation du nombre d'hématies.

Agglutinats d'hématies

Les hématies sont regroupées en paquets

Dans ce cas, la numération des hématies est entachée d'une erreur par défaut.

Principalement associés à des agglutinines froides ; l'anomalie est visible à température ordinaire; elle disparaît après incubation 1h à 37°C

Conséquence : il faut refaire la numération des hématies après une incubation du sang 1h à 37°C

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1h - 37°C


fig. 7: Formation d'un schizocyte par coupure sur un filament de fibrine

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fig. 6: Formation des corps de Jolly et de Cabot


Hématies normales

Anisocytose : présence de microcytes et de macrocytes

Poïkilocytose : hématies de forme très différente

Anisochromie : hématies normochromes et hypochromes

Hypochromie : présence d’annulocytes

Polychromatophilie et hypochromie

Sphérocytes Codocytes Dacryocytes

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ANOMALIES ÉRYTHROCYTAIRES(Frottis sanguins colorés au MGG)


Echinocytes Acanthocytes Stomatocytes

Schizocytes Drépanocytes Ovalocytes

Corps de Jolly Anneau de Cabot

Ponctuations basophiles Sidérocytes avec corps de Pappenheimer

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Exercice : Pour chaque photographie, rédigez un commentaire sur l’aspect des hématies.

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EExercices :xercices : Interprétation d'hémogrammes Interprétation d'hémogrammesInterpréter les trois hémogrammes.

Premier Premier exempleexemplePatient : M. TERIEUR Alex Age : 68 ans (sang prélevé sur EDTA)

Unités Valeurs du patient

Intervalles de référence

Conclusion

Hb g.L-1 195Erythrocytes T. L-1 6.3Ht L. L-1 0.59VGM fLTCMH pgCCMH g. L-1

IDR % 12

Thrombocytes G. L-1 490

Leucocytes G. L-1 16

PN G. L-1

PE G. L-1

PB G. L-1

L G. L-1

M G. L-1

Autres cellules G. L-1

Total

PN % 69PE % 2PB % 1L % 22M % 6Autres cellules % -

Total

Éryhtroblastes- Acidophiles- Polychromatophiles

-

Observations des hématies sur frottis sanguin coloré au MGG : pas d’anomalie de taille, de forme, de couleur, d'inclusion

Observations des plaquettes sur frottis sanguin coloré au MGG : le nombre de plaquettes par champs est en moyenne de 20. Quelques plaquettes géantes. Leur aspect semble normal. Elles sont isolées.

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 13 - Exercices

DDeuxième exempleeuxième exempleRéaliser le tableau de l'exemple 1 et interpréter.

Patiente : Mme ATASTROPHE Monique Age : 47 ans (sang prélevé sur EDTA)Unités Valeurs du

patientFormule leucocytaire

Hb g.L-1 75 PN 53 %Erythrocytes T. L-1 3.3 PE 3 %Ht L. L-1 0.36 PB 1 %VGM fL L 34 %TCMH pg M 9 %CCMH g. L-1

IDR % 17

Thrombocytes G. L-1 203 Eryhtroblastes- Acidophiles- Polychromatophiles

6 pour 100 GB2 2 pour 100 GLeucocytes G. L-1 8

Observations des hématies sur frottis sanguin coloré au MGG - anomalie de taille : anisocytose nette – de nombreux macrocytes - pas d’anomalie de forme : - anomalie de couleur : anisochromie assez importante – hypochromie (nombreux annulocytes) - pas d’anomalie d’inclusion

Observations des plaquettes sur frottis sanguin coloré au MGGNombre de plaquettes par champs : en moyenne de 11 . Taille et aspect normaux, isolées.

TroisièmeTroisième exemple exemplePatiente : Mme VERSAIRE Annie Age : 29 ans (sang prélevé sur EDTA)

Unités Valeurs du patient

Formule leucocytaire

Hb g.L-1 75 PN 63 %Erythrocytes T. L-1 3.0 PE 2 %Ht L. L-1 PB 0 %VGM fL 73 L 27 %TCMH pg M 8 %CCMH g. L-1

IDR % 16

Thrombocytes G. L-1 120

Leucocytes G. L-1 5.5Observations des hématies sur frottis sanguin coloré au MGG

anomalie de taille : anisocytose nette – de nombreux microcytes pas d’anomalie de forme pas d’anomalie de couleur pas d’anomalie d’inclusion

Observations des plaquettes sur frottis sanguin coloré au MGGNombre de plaquettes par champs difficile à apprécier car elles sont souvent en amas.Taille et aspect normaux.

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Chapitre 1 – Examens complémentaires à l'hémogramme – Fiche 1

itesse de sédimentationitesse de sédimentation(Méthode de Westergren)(Méthode de Westergren)VV

1 - 1 - DéfinitionDéfinitionLa méthode standart de Westergren est définie par le Comité International de Normalisation en hématologie.C’est la vitesse à laquelle sédimentent les hématies d’un sang :

- recueilli sur citrate, à raison d’un volume de citrate pour 4 volumes de sang.- déposé dans des tubes calibrés et verticaux, maintenus à température ambiante

(20 à 27°C).

On mesure la hauteur de plasma surnageant 1 h après le dépôt, grâce aux graduations du tube.Le résultat s’exprime en mm de plasma surnageant après 1h de sédimentation.

2 - 2 - Facteurs influençant la VSFacteurs influençant la VS

2.1 - 2.1 - Composition du plasma en protéinesComposition du plasma en protéinesLes protéines plasmatiques, chargées pour la plupart positivement, neutralisent les forces de répulsion des GR chargés négativement (acide sialique). Elles favorisent la formation des rouleaux de GR.

Ainsi l’accélération de la VS est le plus souvent causée par l’augmentation du taux de protéines plasmatiques telles que :

- le fibrinogène (migre au niveau des β globulines)

- l’haptoglobine (migre au niveau des α2 globulines)

- la CPR= protéine C réactive : « protéine d’origine hépatique qui précipite en présence de la protéine C du pneumocoque » (migre au niveau des γ globulines)

- les anticorps (γ globulines).

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La vitesse de sédimentation est d’autant plus rapide que la formation de rouleaux d’hématies est importante.

fig 11: Rouleaux d'hématies (MEB)

Chapitre 1 – Examen complémentaire à l'hémogramme – fiche1 – Vitesse de sédimentation

2.2 - 2.2 - Certaines pathologies érythrocytairesCertaines pathologies érythrocytaires

- Variation du nombre de GRUne augmentation du nombre de GR ralentit la VSUne diminution du nombre de GR accélère la VS

- Taille des GRles macrocytes sédimentent plus viteles microcytes sédimentent moins vite

- Formes anormales gênant la mise en rouleaux Sphérocytes (forme sphérique)Drépanocytes (forme de croissant)…

3 - 3 - Matériel et réactifsMatériel et réactifs

- Tubes de Westergreen Tubes en matière plastique, à usage unique, calibrés, gradués en mm, le “zéro” étant la graduation supérieure.

- Un support Permettant de maintenir les tubes rigoureusement verticaux.

- Citrate trisodique à 0,11mol/L Solution anticoagulante liquide servant à diluer le sang.

- Sang Le sang est prélevé sur un sujet à jeun et au repos (les lipides modifient la VS). En pratique courante le prélèvement se fait sur EDTA, le même échantillon servant à l’hémogramme et à la VS. Parfois le sang est prélevé directement sur citrate 0,11 mol/L à raison d’un volume de citrate pour 4 volumes de sang.

Remarque : Des techniques récentes permettent de mesurer directement la VS dans le tube qui a servi au prélèvement (tube spécial), ce qui évite des manipulations de sang pouvant être source de contamination.

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4 - 4 - Mode opératoireMode opératoireLes conditions expérimentales doivent être rigoureusement respectées, car elles influencent la VS (verticalité du tube, calibre du tube…).

- Mettre la VS le plus tôt possible après le prélèvement :Avant 2h si le sang est conservé à température ambiante.Avant 6h si le sang est conservé à 4°C.

4.1 - 4.1 - Dilution du sang prélevé sur EDTA dans un tube à hémolyseDilution du sang prélevé sur EDTA dans un tube à hémolyse

- Dans un tube à hémolyse sec, mettre un volume de citrate : 0,3 mL.- Préparer le matériel nécessaire à la réalisation du test.

Mettre les gants.- Homogénéiser le sang manuellement par retournements lents, puis retirer le

bouchon en évitant les aérosols- Ajouter 4 volumes de sang : 4 x 0,3 = 1,2 mL

(pipette automatique à désinfecter en fin de manipulation).- Mettre un parafilm.- Homogénéiser le mélange par 2 à 3 retournements.

4.2 - 4.2 - Montage de la VSMontage de la VS- Placer, en le maintenant bien, le tube à

hémolyse contenant le sang dilué dans le godet.- Introduire le tube de Westergren jusqu’au fond

du tube de sang dilué.- Tirer la tige intérieure jusqu’à ce que le sang

atteigne exactement la graduation « zéro » en évitant les bulles d’air.

- Casser la tige qui dépasse du tube.- Noter le temps « zéro »

Jeter les gants puis ranger le matériel non contaminé- Laisser sédimenter 1h, en évitant tout choc au

portoir.- Lire la hauteur de plasma surnageant après 1h

de sédimentation.

Si la lecture après 2h est difficile, une nouvelle lecture après 2h de sédimentation peut être effectuée.

Mettre les gants pour éliminer le tube à VS dans le sac plastique en vue de l’autoclavage et le tube à hémolyse dans l’eau de Javel.

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fig 12: Système pour VS


5 - 5 - Résultats et interprétationRésultats et interprétation

5.1 - 5.1 - Intervalles de référenceIntervalles de référence

Homme : 15 mm après 1h de sédimentationFemme : 20 mm après 1h de sédimentationEnfant : 10 mm après 1h de sédimentation

Causes d’erreur favorisant un augmentation de la VS : Température de la pièce > 23°CTube inclinéVibrations, chocsQuantité d’anticoagulants non respectée

5.2 - 5.2 - Variations physiologiquesVariations physiologiques

- VS accélérée chez la femme enceinteCeci est dû à l’hémodilution et au taux élevé de fibrinogène.

- VS souvent accélérée chez les sujets de plus de 50 ansAprès 1h jusqu’à 20 mm chez l’homme

jusqu’à 30 mm chez la femme et même jusqu’à 50 mm chez le vieillard

5.3 - 5.3 - Variations pathologiquesVariations pathologiques

5.3.1 - 5.3.1 - Ralentissement de la VSRalentissement de la VSIl est difficile à apprécier. Il se rencontre lors :

- d’une diminution du taux de fibrinogène.- de certaines pathologies des érythrocytes :

§anomalies érythrocytaires : drépanocytose, sphérocytose….§polyglobulie

- d'une hyperleucocytose >50 G/L.

5.3.2 - 5.3.2 - Accélération de la VSAccélération de la VS

5.3.2.1 - Lors d’une diminution du nombre d’érythrocytesÉrythropénie provoquant une anémie profonde VS = 30 à 40mm/hEn particulier : les anémies hémolytiques (accompagnées généralement d’une baisse de l’haptoglobine).

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5.3.2.2 - Essentiellement lors de l’augmentation du taux de protéines plasmatiques

Syndrome inflammatoire, caractérisé par un taux augmenté en fibrinogène (β globulines), en haptoglobine (α2 globuline) et protéine C réactive (CPR).Exemple : Rhumatisme inflammatoire, Cancers avec métastases …

Hyperstimulation du système immunitaire, caractérisé par un taux de fibrinogène normal et une augmentation du taux d’anticorps sériques (γ globulines) de spécificités variées (anticorps polyclonaux).

Maladies entraînant la production d’anticorps monoclonaux.Maladie de Waldenström et myélome de Kahler, deux maladies caractérisées par un taux de fibrinogène normal et une augmentation du taux d’anticorps sériques d’une seule spécificité (anticorps monoclonal). Dans ce cas là, la VS est considérablement augmentée (supérieure à 100 mm après 1h) et sur le frottis sanguin, on peut même observer la présence de rouleaux.

6 - 6 - Automatisation de la VSAutomatisation de la VSDes techniques automatisées de mesure de la VS ont été mises au point.Le principe permettant la lecture est fondé sur la propriété des globules rouges à bloquer les rayons infrarouges, alors que le plasma laisse passer les rayons.Chaque canal de l'appareil est équipé d'une diode émettrice de rayons d'infrarouges et d'un capteur. Lorsque la pipette est mise en place entre l'émetteur et le capteur dans l'appareil, la section contenant des globules rouges bloque les rayons infrarouges qui ne sont plus détectés par le capteur. En fin de test, l'appareil recherche le niveau pour lequel les rayons infrarouges ne sont plus détectés, il indique la vitesse de sédimentation.

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Conduite à tenir devant une VS accéléré

La VS est un test non spécifique à interpréter avec prudence, en fonction du contexte clinique.

En l’absence d'anémie sévère et d’un contexte clinique évocateur

Au cours d’une pathologie connue, la VS constitue un élément de surveillance d’un état infectieux, inflammatoire ou cancéreux, par une méthode simple et efficace.

o Accélération de la VS laisse supposer une poussée évolutive.o Ralentissement de la VS laisse supposer une évolution favorable.

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Électrophorèse des protéines plasmatiques

VS accélérée

Dosage du fibrinogène plasmatique et protéine C réactive (CRP)

Normal Augmenté

des γ globulines polyclonales

hyperstimulation du système immunitaire

Pic monoclonal de γ globulines

maladie de Kahler, maladie de Waldenström

syndrome inflammatoire

α2 globulines

Gammapathie polyclonale

Gammapathie monoclonale

Syndrome inflammatoire

NormalPathologique


Chapitre 1 – Examens complémentaires à l'hémogramme – Fiche 2

NNumération des réticulocytesumération des réticulocytes

1 - 1 - Caractéristiques des réticulocytesCaractéristiques des réticulocytes

Les réticulocytes (ou proérythrocytes) appartiennent à la lignée érythrocytaire. Ils sont issus des érythoblastes acidophiles ayant éjecté leur noyau. Ce sont les hématies les plus jeunes :

- ils sont anucléés comme les hématies maturesmais : -

- ils possèdent encore des organites cellulaires (mitochondries et ribosomes, RER) et de la protoporphyrine leur permettant d’achever la synthèse d’hémoglobine, alors que les hématies matures en sont dépourvues. Ces organites diminuent au fur et à mesure que le réticulocyte mûrit.

- ils sont déformables et de forme plus ou moins sphérique- ils sont mobiles.

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fig. 8: Ultrastructure du réticulocyte

Sidérosome

MitochondriePolysome

Mitochondrie altéréeSidérosome

Agrégats de ribosomes

Mitochondrie altérée

Après coloration post-vitale, le réticulocyte mort devient sphérique.

Le réticulocyte observé au microscope électronique à transmission présente des contours irréguliers dus à ses mouvements.

Chapitre 1 – Examen complémentaire à l'hémogramme – fiche 2 – Numération des réticulocytes

Sur un frottis sanguin coloré par la méthode de May-Grünwald Giemsa, il se différencie d’une hématie mature par un diamètre légèrement plus grand (aspect de macrocyte), un cytoplasme pouvant apparaître polychromatophile (car non saturé en hémoglobine et contenant de l’ARN).

Pour le distinguer parfaitement d’une hématie mature, et pour pouvoir le compter, on utilise des techniques permettant de colorer ou de marquer l’ARN contenu dans les réticulocytes:➔ colorant utilisé pour la numération manuelle des réticulocytes :le bleu de crésyl brillant ➔ marqueur fluorescent ou colorant (bleu de méthylène) utilisé pour la numération

automatique des réticulocytes.

2 - 2 - Numération manuelle des réticulocytesNumération manuelle des réticulocytes

2.1 - 2.1 - PrincipePrincipe

2.1.1 - 2.1.1 - Coloration post-vitale au bleu de crésyl brillant (BCB)Coloration post-vitale au bleu de crésyl brillant (BCB)

Le bleu de crésyl brillant, colorant vitale basique, va fixer, précipiter et colorer l’ARN contenu dans les réticulocytes les ribosomes se regroupent sous forme de petite granulations.Le colorant ne pénètre que dans des cellules vivantes, mais la concentration utilisée entraîne la mort cellulaire : on parle de coloration post-vitale. Cette coloration est donc réalisée sans fixation préalable.

2.1.2 - 2.1.2 - Numération des réticulocytesNumération des réticulocytes

C’est une numération indirecte : Sur frottis sanguin coloré au bleu de crésyl brillant, on dénombre réticulocytes et hématies et

on calcul le pourcentage de réticulocytes par rapport aux hématies. Connaissant le nombre d’hématies par litre de sang, on déduit le nombre de réticulocytes par

litre de sang.

Attention : Nombre d’hématies totales= nombre d’hématies matures + nombre de réticulocytes.

2.1.3 - 2.1.3 - IntérêtIntérêtLe nombre de réticulocytes dans 1L de sang est un excellent témoin de l’activité érythropoïétique de la moelle osseuse.

2.2 - 2.2 - Matériel et réactifsMatériel et réactifs

2.2.1 - 2.2.1 - MatérielMatérielBain marie thermostaté à 37°CLames de verreLamelles à étalementPipettes Pasteur en plastique à usage uniqueGants en latex à usage unique

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2.2.2 - 2.2.2 - RéactifsRéactifsSang capillaire ou sang veineux recueilli sur EDTASolution de bleu de crésyl brillant filtrée

.Bleu de crésyl brillant (10g) : colorant de l’ARN

.Citrate de sodium (4g) : anticoagulant (nécessaire pour le sang capillaire)

.Chlorure de sodium à 8,5g/L (qsp. 1L) : solution isotonique pour ne lyser les hématies.

2.3 - 2.3 - ManipulationManipulation

2.3.1 - 2.3.1 - ColorationColoration

2.3.1.1 - TechniqueDans un tube à hémolyse, introduire sans grande précision :

Boucher le tube avec du parafilm.Homogénéiser soigneusement le mélange en le faisant rouler entre les doigts.Placer le tube à 37°C pendant environ 20 minutes.Homogénéiser à nouveau pour bien remettre les cellules en suspension. Réaliser quelques frottis réguliers et minces qui seront séchés au fur et à mesure.

2.3.1.2 - Observation au microscope optique La coloration est observée à immersion, grossissement X 1000.

Les hématies matures sont colorées en bleu-verdâtre.

Les réticulocytes sont également colorés en bleu-verdâtre mais ils se distinguent des hématies matures par la présence d’un fin réseau de granulations bleu violacées (ARN) : ce réseau est d’autant plus abondant que le réticulocyte est jeune. Les réticulocytes n’ont pas de dépression centrale et sont parfois un peu plus gros que les hématies matures.

Les réticulocytes plus âgés possèdent très peu de granulations bleu-violacées. Seule une parfaite mise au point permet de les repérer.

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- 5 à 10 gouttes de colorant (pipette pasteur en plastique)- une quantité égale de sang homogénéisé


Ne pas confondre les réticulocytes avec des artefacts (scissures dans l'hématie)

REMARQUE : les corps de Heinz (précipités anormaux d’hémoglobine instable) sont également colorés par le bleu de crésyl brillant sous forme d’un gros grain périphérique en général.

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fig. 10: Frottis sanguin coloré au bleu de crésyl brillant

fig. 9: Hématies matures comportant des scissures

Corps de Heinz

Réticulocyte âgé

Réticulocyte jeune

Hématie mature


2.3.2 - 2.3.2 - NumérationNumération

2.3.2.1 - TechniqueRepérer à l’objectif x 40 un champ où les hématies sont bien isolées et réparties de façon régulière.Compter à immersion les hématies (n) en distinguant les réticulocytes (R) et les hématies matures (Hm)1ère méthode :

• Compter les réticulocytes dans 9 champs disposés comme ci-dessous : soit R1, R2… R9 • Compter les hématies matures, dans le champ central, soit Hm cette valeur.• Si le nombre total de réticulocytes est inférieur à 50, recommencer la même opération dans

d’autres zones du frottis

2ème méthode :• Compter n = 1000 hématies (hématies matures et réticulocytes) sur différents champs et noter

le nombre (r) de réticulocytes rencontrés dans ces champs.

2.3.2.2 - Calcul du pourcentage de réticulocytes1ère méthode : Calcul pour une numération réalisée sur 9 champs microscopiques :

- Calcul du nombre (R) total de réticulocytes R = R1+R2+R3 + ……+ R9- Calcul du nombre (n) d’hématies totales n = 9Hm + R- Calcul du pourcentage (P) de réticulocytes P = R x100/n

2ème méthode :- Calcul du pourcentage (P) de réticulocytes : P = R x 100/n

Les résultats normaux sont compris entre 0,5 et 2%.

2.3.2.3 - Expression par litre de sangConnaissant le nombre (Nery) d’hématies par litre de sang, on déduit le nombre (Nret) de réticulocytes par litre de sang Nret = P x N/100Ce résultat est exprimé en G/L (109/L)

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R1 R2 R3

R6 R5H R4

R7 R8 R9

R1, R2, R3 …R9 : nombre de réticulocytes comptés dans chaque champ.

H : nombre d’hématies totales (hématies matures et réticulocytes) comptées dans le champ n°5

Si le frottis est régulier, on considère que le nombre d’hématies est le même dans les champs voisins :

nombre total d’hématies matures dans les 9 champs n= 9 H

Champ microscopique


2.4 - 2.4 - InterprétationInterprétationSeules les valeurs exprimées en nombre de réticulocytes par litre de sang doivent être interprétées.Du fait de la technique de comptage, le nombre de réticulocytes n’est connu que de façon approximative (à 20 % près).

Intervalle de référence chez l’adulte et chez l’enfant : 20 à 100 G/L

Ce taux est plus élevé chez le nouveau-né (100 à 300 G/L)

En pratique cette numération n’est réalisée qu’en cas d’anémie normocytaire ou macrocytaire.(Les anémies microcytaires sont généralement arégénératives : cf. module 2 - Hémopathies)

Réticulocytes > 120 G/L : la moelle a une intense activité érythropoiétique qui tend à compenser l’anémie : l’anémie est régénérative (anémie d’origine périphérique).

Réticulocytes < 120 G/L : la moelle ne peut pas augmenter son activité érythropoiétique pour compenser l’anémie : l’anémie est arégénérative (anémie d’origine centrale).

3 - 3 - Numération automatique des réticulocytesNumération automatique des réticulocytesActuellement il est possible de compter automatiquement ces cellules en cytométrie de flux, après les avoir marquées sélectivement, grâce à leur ARN. Cf. cours « automatisation de l’hémogramme ».Exemple : sur automate Pentra 120Rétic Horiba ABXLes ARN résiduels des réticulocytes sont marqués par un fluorochrome, le thiazole orange.

L'automate mesure la fluorescence (350 nm) déclenchée par une excitation transitoire et les volumes réticulocytaires par variation d'impédance.

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Hématies matures

fig. 11: Scattergramme réticulocytaire

Fluo

resc

ence

Volume

Réticulocytes à faible concentration en ARN

Réticulocytes à concentration moyenne en ARN

Réticulocytes à forte concentration en ARN


Chapitre 1 – Hémogramme automatisé - Fiche 1

Automatisation de l'hémogrammeAutomatisation de l'hémogrammeActuellement, l’hémogramme est entièrement automatisé, ce qui permet un comptage fiable est rapide des cellules sanguines.

1 - 1 - Principes des systèmes d’analyse des cellulesPrincipes des systèmes d’analyse des cellules

Les différents systèmes d’analyse des cellules étudient de nombreux paramètres cellulaires.Exemples :− la taille et le volume des cellules− la taille et l’aspect du noyau (segmentation, densité chromatinienne)− le contenu granulaire intracytoplasmique− l’activité peroxydasique du cytoplasme.− la concentration en hémoglobine

2 principes sont utilisés :

− détection électrique

− détection optique

A ces deux méthodes de détection, un système de traitement du signal et d’analyse des données permet l’analyse des cellules.

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Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 1 - Principes

1.1 - 1.1 - Principe de la détection électriquePrincipe de la détection électrique

1.1.1 - 1.1.1 - Détection volumétrique par différence de conductivité (variation d’impédance)Détection volumétrique par différence de conductivité (variation d’impédance)◊ Principe « Coulter » du nom de son inventeur. Méthode de référence .

Ce principe est basé sur la différence de conductivité entre les cellules mauvaises conductrices et le milieu salin, électroconducteur dans lequel baignent les cellules.

: Un volume constant de suspension cellulaire est aspiré à travers un micro orifice de part et d’autre duquel sont situées des électrodes. Entre ces électrodes passe un courant d’intensité constante.

Chaque fois qu’une cellule passe dans le micro orifice, la résistance augmente ainsi que la différence de potentiel (ddp) entre ces électrodes : il y a impulsion de tension.

: L’amplitude de cette impulsion (amplifiée) de tension est proportionnelle au volume de la cellule qui a traversé le micro orifice : ce volume cellulaire est appelé « volume Coulter ».

et: Un dispositif de seuil permet d’éliminer du comptage toutes les cellules ou particules de volume inférieur aux cellules à compter.

Remarque: le diamètre du micro orifice (ou opercule) utilisé pour la numération des cellules sanguines est de 100 µm, plusieurs cellules peuvent passer en même temps et donner naissance à une seule impulsion.

C’est le passage de coïncidence. La fréquence de la coïncidence obéit à une loi statistique qui est fonction de la concentration cellulaire. Une correction est automatiquement effectuée par l’analyseur, ce qui permet d’obtenir des numérations fiables.

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Manomètre

0,5 mL

tension

temps

tension

temps

seuil

001256

Vers la pompe robinet

électrodesTube à micro orifice

Cellules (GR…) dans une solution saline

Aspiration des particules dans la sonde

Amplification de l’impulsion électrique

Discrimination des impulsions

Comptage


1.1.2 - 1.1.2 - Mesure de la conductivité à l'aide d'un courant à haute fréquenceMesure de la conductivité à l'aide d'un courant à haute fréquenceCette technique est généralement associé à une cytométrie de flux.(cf. § 1.2)Un courant haute fréquence traverse le leucocyte ; ce dernier va modifier le courant en fonction de la structure de son noyau (forme, densité chromatinienne, nucléoles) et de la composition chimique de son cytoplasme ; plus le noyau est lobé et le cytoplasme riche, plus le passage du courant est freiné. Cette mesure permet de différencier des leucocytes de même volume mais de contenus différents par leur rapport nucléo-cytoplasmique.

1.2 - 1.2 - Principe des détections généralement optique après focalisationPrincipe des détections généralement optique après focalisation hydrodynamiquehydrodynamique

Ce principe associe les principes de bases de la Cytométrie en Flux (1977):• Focalisation hydrodynamique: les cellules passent en file indienne devant un système de

détection ou chambre de mesure.• Détection des signaux optiques ou physiques émis par les cellules natives ou ayant subi un

traitement préalable et coupant le faisceaux d'un laser ou d'une lampe à mercureLes signaux mesurés sont essentiellement relatifs : - aux propriétés optique par étude de la diffusion lumineuse liés à la taille de la cellule, à sa structure interne (estimation de la granulométrie du cytoplasme, de la forme du noyau ...)- aux propriétés des enzymes cytoplasmique (ex: recherche d'activité peroxydasique)- aux propriétés du noyau (densité) par mesure de la conductivité à l'aide d'un courant haute fréquence.

• Ces signaux séparés par des filtres optiques sont collectés par des photomultiplicateurs, amplifiés, numérisés, traités et stockés par un ordinateur.

1.2.1 - 1.2.1 - Focalisation hydrodynamiqueFocalisation hydrodynamiqueLes cellules sont soumises à une accélération considérable et défilent dans la chambre de mesure à raison de plusieurs milliers par seconde.

La suspension cellulaire exposée à une surpression est injectée au centre d'une veine liquide d'entraînement (liquide de gainage de densité > à la densité de la suspension cellulaire) circulant à une vitesse différente.

Cette suspension cellulaire passe dans la chambre de mesure par un rétrécissement d'un micro-orifice 50 µm à 300 µm puis est éliminé dans la Javel.

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Flux de gainagede densité > densité de la suspension

Flux échantillon

Flux échantillon

Flux de gainage

Flux de gainage

Chambre de mesure


1.2.2 - 1.2.2 - Détection optiqueDétection optique

1.2.2.1 - Étude de la diffusion de la lumièreLa diffusion de la lumière est la résultante de plusieurs phénomènes : diffraction, réflexion, réfraction et absorption.

Lorsqu’une cellule traverse un faisceau lumineux (laser ou lampe) excitateur, le faisceau lumineux incident va subir une diffusion dépendant des propriétés physiques de la cellule (diamètre, forme du noyau, contenu cytoplasmique).

La lumière laser (monochromatique, unidirectionnelle) diffusée par une cellule est détectable par un photodétecteur sous des angles différents.

La lumière diffusée est recueillie par des détecteurs (= photodiodes) qui transforment les signaux optiques en signaux électriques, ces derniers sont ensuite amplifiés.

Remarque : Ces mesures appliquées : à la numération des hématies ou des plaquettes nécessitent une sphérisation préalable des

cellules pour que la taille mesurée soit bien proportionnelle au volume cellulaire. à l’étude des leucocytes, permettent de séparer 3 sous populations : lymphocytes, monocytes,

granulocytes.

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La lumière diffusée aux grands angles (40 à 90°) résulte de deux phénomènes physiques : la réflexion et la réfraction. Cette mesure donne une information qui dépend de la forme, du contenu granulaire cytoplasmique et du noyau.

La lumière diffusée aux petits angles(1 à 12°) est proportionnelle à la taille (et non au volume) de la cellule.

CelluleLASER

La lumière absorbée permet l'estimation du volume de la cellule (supposée sphérique)


1.2.2.2 - Étude de la fluorescence

Les cellules peuvent émettre une fluorescence spontanée, mais le plus souvent, la fluorescence est apportée aux cellules par un fluorochrome. Le fluorochrome absorbe l’énergie du LASER et réemet l’énergie absorbée par vibration et dissipation de chaleur, émission de photons d’une longueur d’onde plus élevée

1.2.3 - 1.2.3 - Éventuels traitements préalables des cellulesÉventuels traitements préalables des cellules

La détection optique s'effectue parfois après un traitement préalable des cellules: Sphérisation

Cytolyse ménagée des cellules

La membrane devient semi-perméable. Le contenu cytoplasmique est libéré. La membrane cytoplasmique se rétracte autour du noyau et des granulationsLe volume final dépend de la taille du noyau, de sa lobularité et des granulations.

Réaction cytochimique Après addition d’un substrat, on peut révéler une activité enzymatique (ex : peroxydase) cellulaire par colorimétrie. On étudie alors les cellules ayant une activité peroxydasique.

Coloration spécifique Une coloration des granulations éosinophiles permet la détection des PEUne coloration au noir de chlorazol permet la coloration des noyaux, granulations et membrane des GB

Marquage par une molécule fluorescente (numération des réticulocytes, des lymphocytes CD4, CD8 ...).

1.3 - 1.3 - Traitement du signal Traitement du signalLes signaux optiques émis sont séparés par des filtres, collectés par des photomultiplicateurs capables de détectés des longueurs d'onde d'émission différentes. Ces signaux sont ensuite amplifiés, convertit en signaux électriques, numérisés, traités et stockés.Des analyses multiparamétriques sont alors possibles.

Le système informatique après avoir enregistré les données produites par le cytomètre affiche les résultats sous forme d’histogramme monodimentionnel ou bidimentionnel.

Exemple d’histogramme monodimentionnelAprès lyse des cytoplasmes cellulaires, les noyaux des lymphocytes apparaissent plus petits que les monocytes, eux-mêmes plus petits que les granulocytes.

L’application du principe du « Volume Coulter » aux leucocytes ainsi traités permet d’obtenir des histogrammes : nombre de leucocytes en fonction du volume nucléaire.

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Exemple d'histogramme bidimentionnel

L’automate utilise dans ce cas les propriétés de diffusion de la lumière (cf.§1-2-2-a).

Chaque point des nuages représente une cellule, l’ordinateur réalise le comptage de chaque cellule à l’intérieur de chaque nuage. On obtient ainsi l’histogramme de la figure 2.

1.4 - 1.4 - Analyse des donnéesAnalyse des données

A partir des histogrammes, l’automate :

- indique le nombre de cellules analysées- calcule différents paramètres (ex: les paramètres caractérisant la dispersion d’une distribution).

Remarque: Des « alarmes » sont générées par l’automate après comparaison de la distribution cellulaire étudiée avec une distribution théorique considérée comme physiologique.

En fonction des pathologies rencontrées, le biologiste valide ou non ces alarmes après étude au microscope des échantillons cellulaires analysés.

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fig 13: Exemple d'histogramme monodimentionnel

(fL)

fig 14: Exemple d'histogramme bidimentionnel transformé en histogramme monodimentionnel

Fig.1


1.5 - 1.5 - Contrôle de la qualité des résultatsContrôle de la qualité des résultats

Ce contrôle s’effectue dans les conditions définies par le GBEA (Guide de bonne exécution des analyses).Le biologiste doit vérifier quotidiennement la bonne calibration des automates pour détecter d’éventuelles dérives des résultats. Des cartes de contrôle sont établies.

Résumé: la cytométrie de fluxPrincipe : Dénombrement et identification de chaque cellule au sein d'une population de cellules en suspension, en fonction de leur taille, de son rapport nucléocytoplasmique, de sa granulométrie cytoplasmique (éventuellement en fonction des enzymes ou de marqueurs cellulaires).

Suspension cytoplasmique ( cellules monodispersées par un flux laminaire à vitesse constante)

Système de défilement cellule par cellule(1)

Système d'illumination (2) faisceau laser + filtes+ Système de détection (3-4-5)

– optique : diffusion, absorption, émission de fluorescence– électrique : mesure de la conductivité à l'aide d'un courant de haute

fréquenceSystème d'analyse des données (informatique)

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Tri des cellules


2 - 2 - Application à l’automatisation de l’hémogrammeApplication à l’automatisation de l’hémogramme

A partir de sang total recueilli sur EDTA potassique (conservation 2 à 4h à température du laboratoire), les automates effectuent tous :

- le dosage de l’hémoglobine- la reconnaissance et la numération des différentes cellules sanguines.

Certains automates effectuent même la numération des réticulocytes.

Dans l’appareil, le prélévement est séparé en plusieurs fractions (au moins 2) qui sont diluées : l’une hémolysée : détermination des leucocytes et de l’hémoglobine l’autre non hémolysée : comptage des hématies et des plaquettes.

2.1 - 2.1 - Analyse des érythrocytes, des plaquettes et des leucocytesAnalyse des érythrocytes, des plaquettes et des leucocytes

2.1.1 - 2.1.1 - Numération des erythrocytes et des plaquettesNumération des erythrocytes et des plaquettesTous les automates effectuent cette numération sur un même canal, distinct du canal de numération des leucocytes.

Ils comptent les cellules et mesure leur volume

soit par détection électrique (volume « Coulter »). Les hématies ou les plaquettes ne subissent aucun traitement préalable.

soit par détection optique (diffraction aux petits angles)Dans ce cas, les hématies et les plaquettes doivent être rendues sphériques pour que la taille mesurée soit proportionnelle au volume cellulaire.

Les étapes essentielles :

Résultat : on obtient un histogramme monoparamétrique (ou monodimentionnel) des hématies et des plaquettes.

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GR en suspension

Traitement chimique éventuel

Focalisation hydrodynamique

Système de mesure : -volume Coulter-diffusion lumineuse.....

Représentation graphique


Exemples :

Analyse des résultats

➔ Pour les érythrocytes :Après analyse des histogrammes, le système informatique de l’automate calcule :

– le nombre d’érythrocytes/L de sang : Erc, GB, RBC– le volume globulaire moyen : VGM, VMC, MCV. La distribution des volumes des hématies obéit

à une courbe de Gauss, dont le pic correspond au VGM.– l’indice de distribution des « rouges » : IDR, IDE, IDC ou CV GR. Il correspond au coefficient de

variation des globules rouges autour de la moyenne.Cet indice apprécie l’étalement autour de la valeur moyenne : c’est un bon indice du degré d’anisocytose.

Si IDE < 15 %, la population érythrocytaire est homogène

Si IDE > 15 %, il y a anisocytose

➔ Pour les plaquettes

Après analyse des histogrammes, le système informatique de l’automate calcule :

– le nombre de plaquettes/L de sang : Plt– le volume plaquettaire moyen : VPM (la courbe de distribution des volumes plaquettaires doit être

log-normale).– l’indice de distribution des plaquettes : IDP

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Nombre d’érythrocytes Nombre de plaquettes

Seuils de mesure : 36 à 360 fL (en général) Seuils de mesure : 2 à 20 fL


2.1.2 - 2.1.2 - Dosage de l'hémoglobineDosage de l'hémoglobine

Tous les automates dosent l’hémoglobine plasmatique après lyse des hématies (utilisation du canal des leucocytes) selon la méthode de Drabkin.

Certains automates peuvent déterminer la concentration en hémoglobine en fonction du volume de chaque globule rouge pris individuellement.

Une nouvelle constante érythrocytaire peut être alors calculée : l’indice de Distribution de la Concentration en Hémoglobine HDW, E.T.Hgb (en %) information sur le degré d’anisochromie.

2.1.3 - 2.1.3 - Indices érythrocytaires ou plaquettaires calculés à partir des valeursIndices érythrocytaires ou plaquettaires calculés à partir des valeurs expérimentalesexpérimentales

A partir des 3 valeurs expérimentales mesurées par l’automate telles :

- Nombre d’érythrocytes/ L de sang (GR)

- Volume globulaire moyen (VGM)

- Concentration en hémoglobine du sang [Hb]

- Nombre de plaquettes/ L de sang (Plq)

- Volume plaquettaire moyen (VPM),

Le système informatique calcule :

- Teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine (TCMH)

- Concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH)

- Hématocrite (Ht)

- Thrombocrite (THT)

Remarque: la CCMH n’est plus utilisée pour détecter une hypochromie:

- c’est un indice du bon fonctionnement de l’automate car la CCMH est calculée à partir des 3 paramètres expérimentaux mesurés par l’automate:

CCMH g /L= [Hb ]g/L x 1015

GR ery/L x VGM fL

Si CCMH > 360 g/L, et si le résultat de la numération des érythrocytes est inférieure aux valeurs de référence; il faut alors penser à la présence d'agglutinines froides.Ces agglutinines provoquent l'agglutination des érythrocytes à température du laboratoire, la numération des érythrocytes est alors faussée (erreur par défaut).

L'observation d'amas érythrocytaires sur frottis doit confirmer cette hypothèse.Dans ce cas, il faut refaire la numération après incubation du sang 1h à 37°C.

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Cet indice doit être compris entre 310 et 360 g/L


2.1.4 - 2.1.4 - Numération de leucocytes et établissement de la formule leucocytaireNumération de leucocytes et établissement de la formule leucocytaire

Les étapes essentiellesLes étapes essentielles ::Ces analyses concernant les leucocytes nécessitent la lyse des globules rouges.

Un dosage de Hb est aussi réalisé en présence de réactif de Drabkin.

− Les automates les plus simples permettent d’effectuer une formule leucocytaire 3 populations ou formule approchée, (GRA / Lympho / Mono): pour la majorité des automates, elle est réalisée par analyse par variation d’impédance des volumes cellulaires des globules blancs, après lyse des GR, et action différentielle d’une lyse ménagée sur les GB, lyse qui modifie leur volume.

Cette FL approchée n’a pas de valeur légale, et très peu de valeur fonctionnelle, un automate de ce type décharge l’automate principal du passage de sangs de patients sans anomalie.Cf histogramme monodimentionnelle §1-3,

θ Les automates plus perfectionnés permettent d’effectuer une numération et d’établir une formule leucocytaire complète .

Les différentes technologies des principaux appareils commercialisésLes différentes technologies des principaux appareils commercialisés ::

Chaque société combine, sur ces automates, plusieurs technologies et donc plusieurs critères de reconnaissance.Exemples de quelques automates (Cf Fiche 3 : exploitation et interprétation )

Impédance + Conductivité Haute Fréquence + Diffusion lumineuse

BeckmanCoulter Automates MAXM, HmX, GenS, LH500, LH750Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Actvité peroxydasique)

BayerDiagnostics Automates Advia120, Technicon H2, H3Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Coloration des granulationsEo.)

HoribaAbx Automates Pentra60, Pentra80, Pentra120Diffusion lumineuse + Cytochimie (coloration des granulations éosinophiles) + Cytolyse

Sysmex SF3000, XE2100

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GB en suspension

Traitementchimique éventuel

Focalisation hydrodynamique

Système de mesure : -volume Coulter-diffusion lumineuse-courant haute fréquence-absorbance .....

ReprésentationgraphiqueHistogramme mono et biparamétrique

Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 2 – Pièges d'interprétation

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes automatisées – Fiche 2

Quelques pièges d'interprétationQuelques pièges d'interprétationAttention aux numérations très élevées : vérifier sur un prélèvement dilué.

Les alarmes affichées par l’automate ne correspondent pas toujours à une anomalie précise :en cas de doute l’examen du frottis s’impose.

1 - 1 - Erreurs sur la numération des leucocytesErreurs sur la numération des leucocytes Erreur par excès, due à la présence d’érythroblastes

Les cellules nucléées ne sont pas détruites par l’agent d’hémolyse, donc comptées avec les leucocytes par la plupart des appareils (sauf l’ADVIA qui repère les cellules qui contiennent de l’hémoglobine dans leur cytoplasme).Donc, il faut déterminer le nombre d’érythroblastes pour 100 leucocytes sur un frottis sanguin lu au microscope et l corriger le résultat de la numération automatique des leucocytes .On observe des érythroblastoses notamment chez le nouveau né ou en cas d'anémie régénérative.

Erreur par excès, due à des agrégats plaquettaires (comptés comme leucocytes) :

o sur les appareils à mesure par impédance

o mais pas sur les appareils à mesure par diffraction laser

Dans ce cas il faut recompter les leucocytes en cellule de Malassez.

2 - 2 - Erreur sur la concentration en hémoglobineErreur sur la concentration en hémoglobine Présence d’une opalescence du plasma (présence de chylomicrons) qui majore le taux

d’hémoglobine et la CCMH

Présence d’un taux très élevé de leucocytes (par exemple plus de 100 G/L en cas de LMC ) peut élever faussement hémoglobine et CCMH de certains automates.

3 - 3 - Erreurs sur la numération des hématies, sur le VGM et/ou leErreurs sur la numération des hématies, sur le VGM et/ou le CCMHCCMH

Présence d’agglutinines froides : présence d’agrégats d’hématies que les compteurs considèrent comme des hématies de grande taille , d'où :

o Une sous estimation du nombre des hématies

o Un VGM surévalué

o Une CCMH calculée excessive.

Dans ces cas mettre le tube de prélèvement une demi heure à 37 °C puis le repasser .

Remarque : Dans ce cas l’ADVIA 120 donne une CCMH mesurée directement (CHCM) qui se trouve alors nettement plus basse que la CCMH calculée .

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4 - 4 - Erreurs sur la numération des plaquettesErreurs sur la numération des plaquettes Par excès en cas de microcytose ou de présence d’hématies fragmentées (schizocytes) que

les compteurs par impédance prennent pour des plaquettes :

Dans ces cas il faut recompter les plaquettes en cellule de Malassez.

Remarque :L’ADVIA avec son comptage par diffraction laser donne généralement des résultats exacts dans ces cas.

Par défaut lorsqu’il y a des agrégats plaquettaireso En cas de thrombopénie il faut toujours rechercher la présence d’agrégats sur un

frottis sanguin et recompter sur un prélèvement citraté.

o La présence d’agrégats peut être évoquée :

• sur une alarme agrégats affichée par l’automate (bien que celle ci puisse avoir d’autres origines )

• sur l’apparition d’éléments de taille anormalement élevée sur les diagrammes de répartition des plaquettes.

5 - 5 - Autres anomalies des hématies et /ou de l’hémoglobineAutres anomalies des hématies et /ou de l’hémoglobine Fausses anémies :

o Prélèvement de sang au voisinage d’une perfusion

o Perfusion massive entraînant une hémodilution

Anémie masquée :

o Par une déshydratation (exemple du sujet âgé anémié et déshydraté)

Anémie faussement arégénérative :

o La régénération d’une anémie n’est pas immédiate.

o Chez le sujet âgé cette régénération, peut être encore retardée

Régénération sans anémieo Il peut simplement s’agir d’une hémolyse chronique modérée que le malade compense

en accroissant sa production d’hématies

Anémies complexes o Normocytose due à la présence de 2 anomalies d’effet opposé su le VGM :

Carences combinées en fer et folates (ou vitamine B12)

o Microcytoses de causes combinées :Carence en fer, inflammation, thalassémie hétérozygote

Anémies ayant subi un début de traitemento Carence en fer traitéeo Carence en folates traitée

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Dans la plus part de ces cas on note :• un indice de distribution des hématies (IDR) > 15 %

• des graphes de distribution des hématies par taille montrant 2 pics ou 2 nuages.

• parfois une élévation des réticulocytes.

Élévation de la TGMHElle peut être liée à une augmentation du VGM du :

• à une carence en B12 ou folates.

• à une forte élévation des réticulocytes ( de VGM plus élevé)

• à la présence d’agglutinines froides

• à une macrocytose d’origine thérapeutique : traitements par des chimiothérapies anticancéreuses ( notamment par des anti-foliques tels que l’Hydrea) ou d’une infection VIH.

6 - 6 - Difficultés au niveau de la formule sanguineDifficultés au niveau de la formule sanguine(variables selon les appareils)

• absence de détection de blastes présents a taux modéré (et/ou peu différents de cellules normales).

• absence de détection d’anomalies discrètes des lymphocytes observés dans : certains lymphomes, leucémies à Tricholeucocytes, syndromes de Sézary, MNI.

• défauts de détection des granuleux : déficits en peroxydase congénitaux (rares) ou acquis (secondaires à des traitements).

Il est des circonstances ou il faut effectuer une formule au microscope :• nouveaux nés• premier examen d’un malade avec nettes anomalies de numération

• variations brutales et inexpliquées par rapport aux NFS antérieures

• incohérences avec le contexte clinique ou thérapeutique

• alarmes de l’automate pour lesquelles il n’y a pas d’explication évidente au vu du dossier et/ou des examens antérieurs.

• distributions de cellules inhabituelles sur les graphes.

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Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes automatisées – Fiche 3

Analyses de résultats d'automates cellulaires Analyses de résultats d'automates cellulaires

1 - 1 - Automate : «Automate : « Coulter HmX»Coulter HmX»

1.1 - 1.1 - Principe Principe Combinaison de 3 mesures physiques simultanées :

➔ Impédance + Conductivité Haute Fréquence + Diffusion lumineuse

La visualisation des données s’effectue sur des histogrammes biparamétriques et/ou monoparamétriques où des fenêtres de formes variables délimitent les sous-populations cellulaires.

1.2 - 1.2 - RésultatRésultat N° Identification ................................. Age du patient : 45 ans Sexe : masculin

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Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 3 – Exercices

1.3 - 1.3 - Étude des histogrammes mono et biparamétriquesÉtude des histogrammes mono et biparamétriques– Histogramme des hématies : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogramme des plaquettes : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogrammes biparamétriques ou scattergrammes des leucocytes :

Données: Les sous populations leucocytaires sont réparties dans un espace cubique dont les coordonnées sont le volume, la diffraction et la conductivité. – La projection de la face DF1 donne un histogramme biparamétrique (Volume

Coulter/Diffraction).– La projection de la face DF2 donne un autre histogramme (Volume Coulter/Conductivité) où

sont visibles les PB.

Indiquer précisément les grandeurs des abscisses de DF1, DF2 et DF3

Attribuer à chaque nuage de points une catégorie de leucocytes. Justifier votre réponse.

L’analyse des histogrammes permet de connaître les pourcentages et le nombre absolu des différents types de leucocytes.

1.4 - 1.4 - InterprétationInterprétation des résultats des résultatsCompléter le tableau ci-dessous et interpréter :

Unités Valeurs du patient Intervalles de référence

Interprétation

Erythrocytes T/LHb g/LHt L/LVGM fLTGMH pgCGMH g/LIDR %Leucocytes G/LPNPEPBLM

G/LG/LG/LG/LG/L

Thrombocytes G/L

Rq. Des « alarmes » signalent la présence éventuelle de cellules anormales, nécessitant l’établissement de la formule leucocytaire au microscope

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2 - 2 - Automate : «Automate : « Technicon ou Advia»Technicon ou Advia»

2.1 - 2.1 - Principe Principe Combinaison d’analyses chimiques et physiques dont certaines nécessitent des traitements préalables :

– Analyses cytochimiques : Etude des cellules par diffraction laser (petits angles) et étude de l’activité peroxydasique des cellules.

– Analyse morphométrique : Etude de la diffraction aux grands angles après lyse sélective des membranes des Mo, Ly, Ne et Eo.

→ Diffusion lumineuse + Cytolyse + Cytochimie (activité peroxydasique)

2.2 - 2.2 - RésultatRésultat N° Identification........................ Age du patient :23 ans Sexe : femme

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2.3 - 2.3 - Étude des histogrammes mono et biparamétriquesÉtude des histogrammes mono et biparamétriques– Histogramme des hématies : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogramme des plaquettes : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogramme concentration de Hb dans les hématies : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogrammes biparamétriques ou scattergrammes des leucocytes :

Indiquer précisément les grandeurs des grandeurs sur les axes

Attribuer à chaque nuage de points une catégorie de leucocytes. Justifier votre réponse.

Données : – analyse cytochimique : scattergramme biparamétrique : Diffusion aux petits angles/Activité

peroxydasique– Analyse morphométrique : Histogramme biparamétrique (Diffusion aux petits angles/Diffusion

aux grands angles).

2.4 - 2.4 - Interprétation des résultatsInterprétation des résultatsCompléter le tableau ci-dessous et interpréter.


Interprétation

Érythrocytes T/LHb g/LHt L/LVGM fLTGMH pgCGMH g/LIDR %Leucocytes G/LPNPEPBLM

G/LG/LG/LG/LG/L

Thrombocytes G/L

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3 - 3 - Automate : «Automate : « Sysmex»Sysmex»


➔ Diffusion lumineuse + fluorescence des acides ribonucléiques cellulaires) + Cytolyse des cellules matures (pour l'analyse des cellules immatures) + impédance

3.2 - 3.2 - RésultatRésultat cas 1cas 1

3.2.1 - 3.2.1 - Contexte cliniqueContexte clinique N° Identification.................................. Age du patient : 39 ans

Sexe : femininConsultation pour asthénie chronique (depuis plusieurs mois, voire une année)

Signes non spécifiques d’anémie : pleur, essoufflement, tachycardie, polypnée.

Le scattergramme correspond à l'étude de la fluorescence (noyau) en fonction de la diffraction SSC)

Histogramme GR (à droite) et histogramme PLT par impédance (à gauche)

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3.2.2 - 3.2.2 - Étude des histogrammes mono et biparamétriquesÉtude des histogrammes mono et biparamétriques

– Histogramme des hématies : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.– Histogramme des plaquettes : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogrammes biparamétriques ou scattergrammes des leucocytes:Indiquer précisément les grandeurs des grandeurs sur les axesAttribuer à chaque nuage de points une catégorie de leucocytes. Justifier votre réponse.

– Etude du frottis coloré au MGG

La formule leucocytaire retrouve un nombre de neutrophiles bas (45 % ) et un nombre de lymphocytes également diminué (46 % ) ; absence de cellules anormales

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3.2.3 - 3.2.3 - Interprétation des résultatsInterprétation des résultats

Compléter le tableau ci-dessous à l'aide des données précédantes et interpréter.


Interprétation


G/LG/LG/LG/LG/L

Thrombocytes G/L

3.3 - 3.3 - RésultatRésultat cas 2cas 2

3.3.1 - 3.3.1 - Contexte clinique Contexte clinique N° Identification.................................. Age du patient : 5 ans

Sexe : masculin

Consultation au service des urgences : toux, hyperthermie (infection bronchopulmonaire)

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3.3.2 - 3.3.2 - Étude des histogrammes mono et biparamétriquesÉtude des histogrammes mono et biparamétriques

– Histogramme des hématies : à l'aide des valeurs du tableau ci-dessus, tracer l'allure de l'histogramme et l'interpréter.

– Histogrammes biparamétriques ou scattergrammes des leucocytes:Indiquer précisément les grandeurs des grandeurs sur les axesAttribuer à chaque nuage de points une catégorie de leucocytes. Justifier votre réponse.

3.3.3 - 3.3.3 - interprétation des résultatsinterprétation des résultatsCompléter le tableau ci-dessous à l'aide des données précédantes et interpréter.


Interprétation


G/LG/LG/LG/LG/L

Thrombocytes G/L

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4 - 4 - Automate : «Automate : « Horiba ABX»Horiba ABX»


➔ Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Coloration des granulations éosinophiles.)

4.2 - 4.2 - RésultatRésultat N° Identification 521432 Age du patient : 40 ans Sexe : femme

4.3 - 4.3 - Étude des histogrammes mono et biparamétriquesÉtude des histogrammes mono et biparamétriques– Histogramme des hématies : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.– Histogramme des plaquettes : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogrammes biparamétriques ou scattergrammes des leucocytes:Indiquer précisément les grandeurs des grandeurs sur les axesAttribuer à chaque nuage de points une catégorie de leucocytes. Justifier votre réponse

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4.4 - 4.4 - Interprétation des résultatsInterprétation des résultatsCompléter le tableau de résultats suivant, et interpréter


Interprétation

Érythrocytes T/LHb g/LHt L/LVGM fLTGMH pgCGMH g/LIDR %Leucocytes G/LPNPEPBLM

G/LG/LG/LG/LG/L

Thrombocytes G/L

4.5 - 4.5 - Étude de 2 scattergrammesÉtude de 2 scattergrammes

Les figures 1a et 1b sont des scattergrammes correspondant à deux patients adultes M. A et M.B.

Comparer ces deux figures au scattergramme précédent. Interpréter.

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5 - 5 - AbréviationsAbréviations

Indiquer les abréviations rencontrées pour :

Érythrocytes

Hémoglobine

Hématocrite

Volume globulaire moyen

Teneur globulaire moyenne en hémoglobine

Concentration globulaire moyenne en hémoglobineIndice de distribution des volumes érythrocytairesLeucocytes

Polynucléaires neutrophiles

Polynucléaires éosinophiles

Polynucléaires basophiles

Lymphocytes

Monocytes

Plaquettes

Thrombocrite

Volume plaquettaire moyen

Indice de distribution des volumes plaquettaires

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- Chapitre 2 -- Chapitre 2 -

LLe myélogrammee myélogrammeGGénéralitésénéralités

Réaliser un myélogramme consiste à une étudier les cellules d'un frottis médullaire obtenu par aspiration ou par ponction.

1 - 1 - PrélèvementPrélèvementLa moelle osseuse est obtenue par ponction ou aspiration (sternale ou iliaque) chez l'adulte à l'aide d'un trocard. (Cf. module 1 - enseignement théorique- Étude de la moelle osseuse).Réalisation de frottis médullaire :Le prélèvement obtenu est ensuite étalé sur une lame de verre, :

– soit en écrasant les grains médullaires. Ce type d'étalement permet d'avoir une bonne idée de la richesse cellulaire

– soit en étalant le sang médullaire comme le sang périphérique.Les cellules médullaires sont ensuite fixées, colorées (MGG) puis observées au microscope.

Remarque : l'étude de biopsie ostéomédullaire nécessite la réalisation de coupe histologique : (cf livret 5 – anatomopathologie).La « carotte » ostéo-médullaire prélevée est décalcifiée, puis incluse dans la paraffine. Les coupes très fines réalisées par un microtome sont déposées sur une lame de verre, déparaffinées puis colorées.

2 - 2 - IndicationIndicationL'indication de cet examen , se pose toujours au vu des résultats d'un hémogramme préalable anormal :- anémie normo-macrocytaire arégénérative

- d'une thrombopénie inexpliquée- de signes d'insuffisance médullaire (neutropénie, érythropénie, thrombopénie)- d'une suspicion d'hémopathie maligne...

3 - 3 - But et lectureBut et lecture

But : étude cytologique quantitative et qualitative des frottis médullaires . A la différence d'une formule leucocytaire, les résultats quantitatifs d'un myélogramme ne peuvent être donnés qu'en pourcentage des populations cellulaires.

La lecture du myélogramme comporte trois temps successifs, tous trois indispensables:

À faible grossissement:

1) appréciation générale des À fort grossissement:

2) appréciation cytologique générale (aspect qualitatif)

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Chapitre 2 – Myélogramme – Généralités

frottis 3) décompte des éléments cellulaires (aspect quantitatif)

3.1 - 3.1 - Appréciation générale du frottis (grossissement x 100)Appréciation générale du frottis (grossissement x 100)Toujours débuter par un examen au petit objectif,.

3.1.1 - 3.1.1 - Richesse en cellules médullairesRichesse en cellules médullairesL'appréciation de la densité cellulaire est indispensable.Ainsi, un taux anormal de 50 % de lymphocytes peut être interprété différemment :– si la moelle est riche, ce pourcentage élevé suggère une infiltration lymphocytaire (ex: leucémie lymphoïde

chronique)– si la moelle est pauvre, ce même pourcentage reflète une diminution des autres lignées et signe une aplasie

médullaire.

3.1.2 - 3.1.2 - Aspect du frottis Aspect du frottisDans une moelle normale, toutes les cellules sont morphologiquement différentes, leur aspect est donc hétérogène.Dans une moelle envahie (par exemple leucémie aiguë), les cellules peuvent être toutes identiques, l'aspect des cellules est homogène, monotone.

3.1.3 - 3.1.3 - Richesse et aspect des mégacaryocytes Richesse et aspect des mégacaryocytes Les mégacaryocytes, sont faciles à repérer grâce à leur grande taille. Leur nombre est apprécié sur l'ensemble du frottis.

3.1.4 - 3.1.4 - Recherche de cellules normales ou non autres que les mégacaryocytesRecherche de cellules normales ou non autres que les mégacaryocytesExemples :

• Ostéoblastes (surtout pour les moelles des petits enfants), ostéoclastes, macrophages et mastocytes.

• Cellules tumorales

3.1.5 - 3.1.5 - Recherche de zones favorables à observation à fort grossissementRecherche de zones favorables à observation à fort grossissementBien rechercher les régions du frottis où les cellules sont convenablement étalées, avec peu de cellules éclatées (dans les régions trop épaisses les hématies sont superposées et les cellules rétractées sont méconnaissables ou difficiles à identifier).

3.2 - 3.2 - Appréciation cytologique générale (aspect qualitatif) Appréciation cytologique générale (aspect qualitatif) Cette étude s'effectue à fort grossissement (x1000)

➢ En premier lieu, on recherche les cellules matures, que l'on connaît bien : les polynucléaires neutrophiles et les lymphocytes.

➢ Puis on regarde les éléments immatures de la lignée granulocytaire, en recherchant les critères qui identifient chaque stade (noyau, cytoplasme, granulations...).

➢ On étudie ensuite la lignée érythroblastique (noyaux ronds à l'état normal). ➢ Enfin on regarde les cellules moins fréquentes (monocytes, blastes).

Ceci permet de constater s'il existe ou non des anomalies morphologiques (défaut de granulations, mégaloblastose...), appelées "anomalies qualitatives". Ce n'est qu'après cette étape que commence le décompte: par comparaison aux valeurs normales, on définit les variations "quantitatives".

3.3 - 3.3 - Étude quantitative Étude quantitative On réalise autant que possible le décompte des cellules dans des régions bien étalées, repérées lors de l'examen au faible grossissement: idéalement derrière les grumeaux de moelle.

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3.3.1 - 3.3.1 - Cellules à compterCellules à compterOn compte habituellement tous les éléments nucléés du frottis que l'on observe, sauf:

• les mégacaryocytes (appréciation au faible grossissement)• les quelques cellules en mitoses (si nombre élevé : le mentionner en commentaire). • les cellules éclatées et les éléments suffisamment altérés pour que leur identification en soit

rendue incertaine. • les cellules rares, qu'elles soient normales (fibrocytes, cellules adipeuses, ostéoblastes,

ostéoclastes), ou pathologiques (métastases).

3.3.2 - 3.3.2 - Nombre de cellules à compterNombre de cellules à compterIdéalement, il faudrait compter au moins 500 cellules, en plusieurs régions de la lame, et si possible sur plusieurs lames (100 cellules par lame).

Par contre, il est important de compter beaucoup plus d'éléments et de répéter les comptes (plusieurs régions différentes, plusieurs frottis) lorsqu'une augmentation du pourcentage d'une catégorie de cellules est constatée avec des conséquences diagnostiques importantes: par exemple excès de blastes, de plasmocytes, de lymphocytes...

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Chapitre 2 – Myélogramme – Généralités

FFiches techniquesiches techniques

MMyélogrammeyélogramme

Fiche 1 : Étude cytologique – Caractéristiques des cellules jeunes et des cellules sénescentes.

Fiche 2 : Morphologie des précurseurs érythocytaires

Fiche 3 : Morphologie des précurseurs granulocytaires neutrophiles

Fiche 4 : Morphologie des précurseurs granulocytaires éosinophiles et basophiles

Fiche 5 : Morphologie des précurseurs mégacaryocytaires

Fiche 6 : Exemple d'une fiche de résultats et intervalles de références

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Chapitre 2 – Myélogramme – Fiche 1

ÉÉtude cytologique d'un frottis médullairetude cytologique d'un frottis médullaire

1 - 1 - Observation à l’objectif x 10Observation à l’objectif x 10Cette observation permet d'apprécier la qualité de la coloration, d'avoir une idée générale du frottis....et permet , lors d'une étude d'un frottis médullaire, de choisir des zones où les cellules sont bien étalées.

2 - 2 - Observation à l’objectif x 100 (immersion)Observation à l’objectif x 100 (immersion)

Les questions à toujours se poser :

Aspect général de la cellule :

• Taille (estimation par rapport aux hématies)• Forme (ronde, ovalaire ou déformée) • Contour (bien délimité, flou)

Étude du noyau :

• Taille (évaluation du rapport N/C)• Forme (lobée ou non, arrondie, ovalaire, encochée, en drapeau…)• Aspect de la chromatine (densité et texture : condensée, pâteuse, lâche, fine, nuageuse….) • Présence ou non de nucléoles

Étude du cytoplasme :

• Affinité (acidophile, basophilie ou polychromatophilie)• Granulations (nombre, taille, répartition, aspect et affinité éosinophile, basophile, azuro-

phile, neutrophile) • Présence ou non de vacuoles……..

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Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 1 – Étude cytologique d'un frottis médullaire

CCaractéristiques des cellules jeunesaractéristiques des cellules jeunes

Aspect général de la cellule :• taille : assez grande (> 15 µm)• forme arrondie ou ovalaire ou ...• rapport N/C élevé

Étude du noyau :• noyau arrondi ou ovalaire (jamais lobé)• chromatine lâche, fine, violacée avec des nucléoles

Étude du cytoplasme :• cytoplasme basophile – bleu- (pas ou très peu de granulations)

MMort cellulaireort cellulaire

Les cellules peuvent :– se nécroser.

La nécrose est une mort cellulaire accidentelle qui survient généralement lors d'un dommage tissulaire. La cellule enfle, la membrane cellulaire éclate déversant le contenu cytoplasmique dans le milieu environnant et provoquant l'inflammation. Il reste un noyau nu, dont la chromatine s'étale.Les mitochondries et le noyau restent intacts tout au long de ce processus.

– se lyser par apoptose.L'apoptose ou mort cellulaire programmée est une forme physiologique de mort cellulaire hautement régulée, elle est nécessaire à la survie des organismes multicellulaires. Les cellules d'organismes multicellulaires s'autodétruisent lorsque celles-ci ne sont plus utiles, lorsqu'elles sont endommagées ou lorsqu'elles sont dysfonctionnelles. L'apoptose implique habituellement des cellules individuelles dans un tissu et ne provoque pas d'inflammation. Le noyau devient picnotique, se casse en plusieurs fragments.

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fig 16: Nécrose cellulaire (coloration MGG)

fig 17: Apoptose d'un lymphocyte(coloration MGG)

fig 15: Cellule médullaire jeune, non différenciée (coloration MGG)



ignée érythrocytaire normaleignée érythrocytaire normaleLes précurseursLes précurseursLL

Ces précurseurs proviennent de la différenciation des progéniteurs CFU-E et BFU-E.

Cette lignée se caractérise par l'absence de toute granulations, les cellules sont généralement arrondies, le noyau rond et en position centrale, sauf pour l'érythroblaste acidophile.

1 - 1 - ProérythroblasteProérythroblasteGrosse cellule arrondie de 20 à 25 µm

Noyau :- volumineux (N/C : 8/10), - rond et en position centrale- chromatine en fin réseau (non condensée), rouge violacée- 1 ou 2 nucléoles, pas toujours visibles (zone plus claire, arrondie ou ovalaire)Cytoplasme- mince couronne très basophile (bleu foncé) car très riche en ribosomes- présence fréquente d'une zone plus claire autour du noyau-coloration non homogène du cytoplasme-parfois une ou deux petites expansion cytoplasmique.

2 - 2 - Érythroblastes basophiles I et IIÉrythroblastes basophiles I et II

Cellules arrondies : 16 à 20 µm pour le type I 12 à 14 µm pour le type IINoyau :- assez volumineux - rond et en position centrale- chromatine légèrement condensée: petites mottes violacées (1 à 2 µm) donnant au noyau un aspect de mûre ou de rayons de roue - les nucléoles ne sont plus visibles.Cytoplasme- plus étendu que le proérythroblaste- plus ou moins fortement basophile selon le degré de maturation de la cellule : bleu foncé pour le type I, bleu cendré pour le type II- présence fréquente d'une zone plus claire autour du noyau.

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Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 2 – Lignée érythroblastique

3 - 3 - Érythroblaste polychromatophileÉrythroblaste polychromatophile

Cellule arrondie : 8 à 12 µm 1Noyau :- rond, en position centrale et occupant la moitié de la cellule- chromatine bien condensée en assez grosses mottes violet foncé (1 à 2 µm) (en rayons de roue)

Cytoplasme- il contient des ribosomes qui fixent le colorant basique bleu, mais aussi de l'hémoglobine qui fixe l'éosine orange : le cytoplasme prend alors une teinte polychromatophile, mauve, plus ou moins bleue ou rose selon le degré de maturation de la cellule.

4 - 4 - Érythroblaste acidophileÉrythroblaste acidophile

Petite cellule arrondie : 8 à 10 µm 1Noyau :- rond, peu volumineux- très souvent excentré car prêt à être expulsé

- chromatine très condensée : au début quelques masses chromatiniennes sont encore visibles, puis les masses fusionnent et la chromatine devient picnotique, violet noir en tache d'encre.

Cytoplasme- acidophile: beige rosé, souvent un peu plus gris que les hématies car il contient en plus de l'accumulation de l'hémoglobine encore quelques ribosomes.

5 - 5 - RéticulocytesRéticulocytes

Cellules anucléées, possédant encore des mitochondries et des ribosomes.A la coloration de May Grünwald-Giemsa, ils apparaissent polychromatophiles, mais il est souvent difficile de les distinguer d'hématies matures.

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fig 18: Précurseurs érythroblastiques - G x 1000 - coloration MGG

Proérythroblaste

Érythroblastes basophiles

Érythroblastes polychromatophiles Érythroblaste acidophile

Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 2 – Lignée érythroblastique

Attention : ne pas confondre érythroblastes basophiles, lymphocytes et plasmocytes

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Érythroblaste basophile

Lymphocyte Plasmocyte



ignée granulocytaire neutrophile normaleignée granulocytaire neutrophile normaleLes précurseursLes précurseursLL

Ces précurseurs proviennent de la différenciation du progéniteur CFU-GM.

1 - 1 - Myéloblaste neutrophileMyéloblaste neutrophile

Cellule arrondie ou ovalaire de 15 à 20 µm

Noyau :- très volumineux (N/C > 8/10), - plus ou moins ovalaire et rarement centrale- chromatine en fin réseau rougeâtre- présence constance de nucléoles (1 à 5) bien nets.Cytoplasme- peu étendu- basophile (bleu vif) car riche en ribosomes- absence de zone plus claire (Golgi peu important)-quelques granulations azurophiles rouge violacé, souvant localisées dans une zone.

2 - 2 - Promyélocyte neutrophilePromyélocyte neutrophile

Cellule arrondie ou ovalaire de 20 à 30 µm

Noyau :- volumineux (N/C > 1/2), - souvent excentré- ovalaire : la face interne est aplatie ou légèrement concave- chromatine lâche mais un peu plus condensée que dans le myéloblaste- présence facultative de nucléoles (1 à 2) .Cytoplasme- basophile - granulations azurophiles grosses et nombreuses - présence d'un archoplasme : zone incolore proche du noyau (appareil de Golgi).

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Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 3 – Lignée granuleuse neutrophile

3 - 3 - Myélocyte neutrophile Myélocyte neutrophile Cellule arrondie ou ovalaire de 15 à 20 µm

Noyau :- moins volumineux (N/C = 1/2), - excentré- en forme de haricot- chromatine plus condensée que dans le promyélocyte- les nucléoles disparaissent.Cytoplasme- devient incolore- granulations azurophiles peu nombreuses et nombreuses granulations neutrophiles, fines, beige à violacé.

4 - 4 - Métamyélocyte neutrophile Métamyélocyte neutrophile Cellule arrondie de 15 µm

Noyau :- peu volumineux (N/C < 1/2), - nettement incurvé en U, parfois en S- chromatine condensée Cytoplasme- aspect identique au polynucléaire neutrophile : incolore avec de nombreuses granulations neutrophiles.

5 - 5 - Granulocyte neutrophile à noyau non segmenté Granulocyte neutrophile à noyau non segmenté

6 - 6 - Granulocyte neutrophile à noyau segmentéGranulocyte neutrophile à noyau segmenté

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fig 19: Précurseurs granuleux neutrophiles - G x 1000 - Coloration MGGMétamyélocyte neutrophile - Polynucléaire neutrophile

Myélocytes neutrophiles

Promyélocyte neutrophileMyéloblaste

Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 3 – Lignée granuleuse neutrophile

Attention : ne pas confondre myélocyte neutrophile et lymphocyte granuleux.

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fig 20: Myélocyte neutrophile fig 21: Lymphocyte granuleux



ignée granulocytaire éosinophile normaleignée granulocytaire éosinophile normaleLes précurseurs Les précurseurs LL

Ces précurseurs proviennent de la différenciation du progéniteur CFU-Eo.

1 - 1 - Myéloblaste éosinophileMyéloblaste éosinophileExceptionnelAspect très proche du myéloblaste neutrophile; il est identifiable par ses granulations azurophiles plus volumineuse.

2 - 2 - Promyélocyte éosinophilePromyélocyte éosinophileTrès rarePrésence de grosses granulations qui remplissent le cytoplasme et masquent plus moins le noyau.Selon le degré de maturation, ces granulations peuvent avoir des affinités tinctoriales différentes : les plus immatures sont azurophiles (rouge foncé), puis elles deviennent bleu foncé, puis orangé (éosinophiles) à maturité. Les trois stades sont présents simultanément.

3 - 3 - Myélocyte éosinophileMyélocyte éosinophileCellule arrondie Noyau : identique à celui du myélocyte neutrophile ou plus rond.Cytoplasme:granulations spécifiques : - bleues si elles sont immatures - orangées si elles sont mûresIl peut y avoir des granulations de teinte intermédiaire (vert bronze).

4 - 4 - Métamyélocyte éosinophileMétamyélocyte éosinophile- Noyau incurvé en U, , non lobé- Granulations spécifiques orangées.

5 - 5 - Granulocyte éosinophileGranulocyte éosinophile- Noyau incurvé en U, , non lobé- Granulations spécifiques orangées.

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Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 4 – Lignée granuleuse éosinophile et basophile

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fig 22: Précurseurs granuleux éosinophiles - G x 1000 - coloration MGG

Myélocytes éosinophiles

Métamyélocytes éosinophiles

Polynucléaire éosinophile


ignée granulocytaire basophile normaleignée granulocytaire basophile normaleLes précurseurs Les précurseurs LL

Les polynucléaires semblent avoir une voie de différenciation commune avec les mastocytes à partir d'un progéniteur : CFU-Masto.

Les précurseurs des polynucléaires basophiles sont très rares dans la moelle osseuse. Ils sont identifiables grâce à leurs granulations basophiles métachromatiques, violet foncé, analogues à celles des polynucléaires basophiles du sang.

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fig 23: Précurseurs de granuleux basophiles- G x 1000 – Coloration MGG

Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 4 – Lignée granuleuse éosinophile et basophile

A vous de jouer !Identifier les cellules médullaires colorées par la technique de MGG et photographiées sur le champ microscopique ci-dessous.

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fig 24: Observation de cellules sur un frottis médullaire coloré par la technique de MGG



ignée mégacaryocytaire normaleignée mégacaryocytaire normaleLes précurseursLes précurseursLL

Les précurseurs de cette lignée sont peu nombreux (1 à 10 pour 1000 cellules nucléées), soit 10 à 100 par frottis médullaire.

Ils sont facilement repérables à faible grossissement (X100) grâce à leur grande taille.

1 - 1 - MégacaryoblasteMégacaryoblasteCellule très rare de 30 à 40 µm selon le degré de polyploïdie

Noyau :- volumineux (N/C > élevé), - ovalaire parfois déjà binucléé- légère, nucléolée, grossière et filamenteuse

Cytoplasme- très basophile , présente des languette cytoplasmique - aucune granulation.

2 - 2 - Mégacaryocyte basophileMégacaryocyte basophile

Cellule de grande taille : 30 à 100 µm selon le degré de polyploïdie

Noyau :- forme irrégulière, plus ou moins lobulé- chromatine se condensant- pas de nucléole visible Cytoplasme- abondant- basophile - quelques granulations azurophiles regroupées vers les centrioles.

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Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 5 – Lignée mégacaryocytaire

3 - 3 - Mégacaryocyte granuleuxMégacaryocyte granuleux

Stade le plus fréquent dans la moelle osseuse

Cellule de très grande taille : 40 à 100 µm selon le degré de polyploïdie

Noyau :- rapport N/C : faible- forme irrégulière, de grands lobes irréguliers- chromatine de plus en plus condensée

Cytoplasme- abondant- perd sa basophilie- nombreuses granulations azurophiles, rouge violacé, réparties régulièrement dans tout le cytoplasme.

4 - 4 - Mégacaryocyte thrombocytogèneMégacaryocyte thrombocytogène

Cellule de très grande taille : 40 à 100 µm selon le degré de polyploïdie

Noyau :- forme irrégulière- chromatine très condensée, devenant picnotique

Cytoplasme- les granulations azurophiles se regroupent en paquets de 10 ou 12 dans tout ou une partie du cytoplasme.

Remarque : Observation fréquente

– de noyaux nus liée au mode de formation des plaquettes– de fragments cytoplasmiques car les mégacaryocytes thrombocytogènes sont très

fragiles.

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Mégacaryoblaste Mégacaryocyte basophile

Mégacaryocytes thrombocytogènes

Mégacaryocyte granuleux

Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 5 – Lignée mégacaryocytaire

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fig 25: Observation des mégacaryocytes à faible grossissement sur un frottis médullaire coloré au MGG



iche de résultats d'un myélogrammeiche de résultats d'un myélogrammeIntervalles de référenceIntervalles de référenceFF

Référence du frottis médullaire:………………………Âge du patient..........................Lieu de ponction..........................................

LIGNÉES ET CELLULES STADES

INTERVALLES DE RÉFÉRENCE RÉSULTATS

CELLULES SOUCHES

non identifiées en pratique

GRANULOCYTAIRE NEUTROPHILE

- Myéloblaste- Promyélocyte N- Myélocyte N- Métamyélocyte N- P.N.

50 à 70 %

0,1 à 3,50,5 à 55 à 2010 à 307 à 25

……………

………………………………………… ………...

GRANULOCYTAIRE ÉOSINOPHILE

1 à 3 % ……………

GRANULOCYTAIRE BASOPHILE

0,1 à 1 % ……………

ÉRYTHROCYTAIRE

- Proérythroblaste- E. basophile- E. polychromatophile- E. acidophile

8 à 30 %

0 à 2 %2 à 4 %3 à 8 %3 à 16 %

.............

...........

...........

...........

...........

LYMPHOCYTAIRE

- LYMPHOCYTES :

- PLASMOCYTES :

<20 % adulte<50 % enfant

0 à 3 %

……………

……………

MONOCYTAIRE < à 3 % ……………

THROMBOCYTAIRE

10 à 100 cellules par frottissoit 0,03 à 0,3 %

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Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 6 – Fiche de résultats

CCompte renduompte renduRendre les résultats comme suit :

1 - 1 - Lieu de ponctionLieu de ponctionIndiquer le lieu de ponction et noter aussi les incidents éventuels lors de la ponction et la dureté de l'os. La dureté de l'os apporte parfois un argument diagnostique majeur (os mous des myélomes, très durs des splénomégalies myéloïdes, des mastocytoses, etc...).Observer les grains ou grumeaux médullaires.

2 - 2 - Richesse et aspect du frottis (faible grossissement)Richesse et aspect du frottis (faible grossissement)a- Richesse cellulaireExemples :

désertique, très pauvre (le frottis ressemble à un frottis de sang normal : entre 1 à 10 cellules/ champs)

hypoplasique (nombre de cellules par champs est plutôt faible : entre 10 à 30) normal, les cellules sont relativement espacées (entre 30 à 60 cellules /champs) hyperplasique, les cellules sont collées les unes aux autres (> 60 cellules/champs).

b- Aspect du frottisExemples :

L’aspect du frottis est normal, hétérogène. L’aspect du frottis est homogène, monotone (cas des leucémies aiguës) Présence ou non de placards cellulaires (souvent cellules métastasiques).

3 - 3 - Étude cytologiqueÉtude cytologiquea- Richesse et aspect des mégacaryocytes (étude à faible grossissement)- Nombre des mégacaryocytes : ……………

. ce nombre est normal (si 10 à 100 cellules/frottis)

. ce nombre est diminué (si < 10 cellules /frottis)

. ce nombre est augmenté (présence de MK sur tous ou presque les champs).

- Aspect des mégacaryocytes :. leur aspect semble normal ou …………... la pyramide de maturation semble respectée ou non…..

b – Étude cytologique à fort grossissement

Étude qualitative Il faut pouvoir d’emblée, avant même l’étude du myélogramme, distinguer une moelle :

- normale- érythroblastique- mégaloblastique- lymphocytaire- granulocytaire ou granulopénique…

Attention : Les commentaires dépendent aussi des résultats de l’hémogramme toujours fait AVANT le myélogramme.

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Exemples de commentaires : - très nombreuses cellules mégaloblastiques, aspect de « moelle bleue »- ou nombreuses cellules en mitose, présence de cellules anormales (à préciser…ex : discordance de maturation nucléaire et cytoplasmique des érythroblastes, présence de nombreux corps de Jolly …)

Étude quantitative (fort grossissement)

lignée érythroblastique : richesse (pourcentage à comparer aux intervalles de référence) aspect normal ou ….. pyramide de maturation respectée ou …….

lignée granulocytaire richesse (pourcentage à comparer aux intervalles de référence) aspect normal ou ….. pyramide de maturation respectée ou …….

lignée lymphocytaire et plasmocytaire richesse (pourcentage à comparer aux intervalles de référence) aspect normal ou …..

lignée monocytaire richesse (pourcentage à comparer aux intervalles de référence) aspect normal ou …..

Conclusion générale : Exemples :

- Le frottis de moelle osseuse ne présente pas d’anomalie qualitative et quantitative significative.

ou- Le frottis présente des anomalies de répartition de cellules cytologiquement

anormales : à préciser ……..ou

- Le frottis présente des anomalies cytologiques : à préciser…..Ces anomalies associées aux résultats de l’hémogramme réalisé auparavant, évoquent ……… (préciser la pathologie).

Proposer éventuellement des examens supplémentaires pour orienter ou préciser le diagnostic.

Le myélogramme doit confirmer ou infirmer les résultats de l’hémogramme et jamais l’inverse.

B1ABM CM © 147

Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 6 – Fiche de résultats

Annexe : l'hématopoïèse

148 CM © B1ABM

Documents

Cellules normales du sang et de la moelle rouge des osmuller.ch.free.fr/bts-abm/images/documents/hematologie1tp/livret1.pdf · 0,3 % 0,04 % 6 à 40 % 2 à 4% ... • Transport dans