CHAPITRE V ETUDE IN VITRO DES BIOVERRES POREUX - …docinsa.insa-lyon.fr/these/2007/arioua/08_chapitre_5.pdfà la formation des couches de liaison à l’os. V-1-2-2: Préparation

Chapitre V Etude in vitro des bioverres poreux

CHAPITRE V

ETUDE IN VITRO DES BIOVERRES POREUX

86


V-1: Etude préliminaire

V-1-1: Bioactivité in vitro

L’objectif est d’utiliser ces verres comme implant, matériau de comblement osseux ou de

recouvrement. Avant de travailler sur leur mise en forme et sur leurs propriétés mécaniques, il

est indispensable de s’assurer de leur caractère bioactif.

Il existe deux manières classiques pour tester la bioactivité d’un matériau :

- Une étude « in vivo » nécessitant la préparation et la mise en forme de substitut osseux,

ainsi que son implantation en milieu vivant. La bioactivité est validée par une liaison

stable entre le matériau et les tissus hôtes.

- Une étude « in vitro » qui correspond à l’immersion d’un échantillon massif ou

pulvérulent ou même poreux dans une solution à 37°C et de pH voisin de 7 (pH et

température du plasma humain). La bioactivité est contrôlée par la présence d’une couche

d’apatite cristallisée à la surface de l’échantillon.

T. Kokubo et al.[KOKU90], ont montré que l’immersion du matériau dans du liquide

physiologique contenant les mêmes ions à la même concentration que le plasma humain,

reproduisait les changements structuraux de la surface du matériau implanté in vivo. La couche

d’apatite cristallisée formée par les réactions de surface permet l’accrochage de l’implant à l’os

vivant.

M.Ogino et al.[OGIN80], ont eux aussi cherché à montrer que la formation d’une couche

d’apatite cristallisée à la surface du verre dans une solution de fluide physiologique est indicative

de sa capacité de se lier à l’os. Leur étude réalisée sur 6 verres à base de SiO2- CaO-Na2-P2O5

étudiés in vitro et in vivo, a confirmé ces hypothèses.

Il y a donc correspondance entre la formation de la couche d’apatite cristallisée obtenue

par immersion in vitro et la liaison à l’os in vivo [EBIS90].

La bioactivité des verres que nous avons préparés a été étudiée par leur immersion in

vitro.

87


V-1-2: Milieu d’immersion

V-1-2-1 : Choix du milieu d’immersion

Dans la bibliographie, un grand nombre de milieux d’immersion est évoqué.

Le plus simple est une solution tamponnée à pH 7,4 composée de

trishydroxyméthylaminométhane et d’acide chlorhydrique [ZHON97]. A cette même solution de

« tris» tamponné, il est possible d’ajouter quelques ions qui font partie du plasma humain: Ca2+,

PO43-, Na+, K+, Mg2+, Cl-, HCO3

-, HPO42- à des concentrations diverses, individuellement ou

ensemble, le pH variant généralement de 7.25 à 7.42 .

La solution d’immersion la plus utilisée est le SBF (Simulated Body Fluid) qui contient

les mêmes ions aux mêmes concentrations que le plasma humain, avec un pH variant de 7,2 à

7,4.

Certains milieux, plus complexes, sont formés de SBF et de sérum, source de protéines

qui reproduisent mieux ce qui se passe dans le corps humain puisque la solution contient alors la

partie minérale et organique du plasma réel.

Nous avons choisi de travailler tout d’abord dans une solution qui contient la partie

minérale du plasma humain, le SBF, puisqu’il s’approche de la composition chimique du fluide

physiologique réel. En effet, il contient les éléments nécessaires à la réactivité des échantillons et

à la formation des couches de liaison à l’os.

V-1-2-2: Préparation du SBF (Simulated Body Fluid)

Les produits de départ, qui sont sous forme de poudres fines, sont mélangées à un peu

moins d’un litre d’eau déminéralisée : [KOKU92a, KOKU92b]

NaCL, chlorure de sodium de pureté 99.5% minimum,

NaHCO3, hydrogénocarbonate de sodium de pureté 99.7% minimum

KCL, chlorure de potassium de pureté 99% minimum,

K2HPO4, 3H2O, hydrogénophosphate de potassium trihydraté de pureté 99.5% miminum

MgCl2,2H2O, chlorure de calcium dihydraté de pureté 99% minimum

Na2SO4, sulfate de sodium de pureté 99% minimum

Tris ( trishydroxyméthylaminométhane ) de pureté 99%

88

Chapitre V Etude in vitro des bioverres poreux Le tableau V-1 résume les concentrations des ions présents dans le SBF

Concentration en mmol/l IONS

S.B.F Plasma humain

Na+

K+

Mg2+

Ca2+

Cl-

HCO-3

HPO42-

SO2-4

PH

142,0

5,0

1,5

2,5

147,8

4,2

1,0

0,5

7,25 - 7,42

142,0

5,0

1,5

2,5

103,0

4,2

1,0

0,5

7,24 - 7,40

Tableau V-1 : composition ionique en mmol par litre du Simulated Body Fluid (SBF) et du

plasma humain

Nous mettons 700 ml d’eau déminéralisée dans un flacon en plastique de 1000 ml. On

place un barreau magnétique, la température dans le flacon doit être autour de 36,5 °C.

Nous dissolvons les réactifs un par un suivant l’ordre indiqué dans le tableau V-2 :

Tableau V-2 : Ordre, réactifs, quantité pour la préparation d’un litre de SBF

Ordre Réactifs Quantité

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

NaCl

NaHCO3

KCl

K2HPO43H2O

MgCl26H2O

1M - HCl

CaCl2

Na2SO4

TRIS

1M – HCl

8,035 g

0,335 g

0,225 g

0,231 g

0,311 g

39 ml

0,292 g

0,072 g

6,118 g

1,5 ml

89


Le mélange est ensuite tamponné au pH normal du plasma humain (pH=7,42) à l’aide de Tris et

de l’acide chlorhydrique et complété à un litre avec de l’eau déminéralisée. Il est refroidi jusqu’à

20°C puis conservée à une température entre 5 et 10°c dans un congélateur.

La préparation du SBF a été faite dans le laboratoire de génie des procédées de l’école de

physique chimique électronique de lyon « CPE ».

V.2. Manipulation

L’idée est de maintenir une surface de contact entre le verre et le fluide physiologique

toujours constante. En effet, pour que les mesures soient reproductibles, il faut maintenir un

rapport surface du verre (S) / volume de SBF (V) constant

V.2.1. Préparation des échantillons

Il faut donc préparer des échantillons strictement identiques entre eux. Pour cela, les

verres ont été pressés sous forme de cylindres de diamètre égal à 10 mm et de hauteur égale à

2 mm.

V.2.2. Volume de SBF (Simulated Body Fluid)

De nombreuses publications font référence à des volumes très différents de SBF. Les

rapports S/V peuvent aller de 0,005 à 0,5 cm-1.

Le but est d’apporter à l’échantillon les quantités d’ions qu’il recevrait dans le milieu

naturel, à savoir un flux constant en calcium et phosphore nécessaire aux réactions de surface.

Deux types de manipulations sont alors possibles, soit utiliser de faibles volumes de SBF,

renouvelé régulièrement par changement de la solution, soit utiliser des volumes de fluides plus

importants qui dans ce cas, ne subiront pas de modifications de concentration.

Pour des échantillons massifs le rapport S/V est de 0.1cm, pour des échantillons poreux

le rapport S/V doit être plus élevé. Nous avons porté notre choix sur un rapport S/V égal à 0.025

cm-1, ce qui correspond à un volume de 100 ml de SBF. Cette quantité relativement importante

permet d’éviter le renouvellement du SBF, ce qui simplifie la manipulation et la rend

parfaitement reproductible.

90


V.2.3. Le bain thermostaté

Pour reproduire entièrement le milieu vivant, il faut non seulement un plasma de synthèse

mais aussi la température normale du corps humain. Pour cela, un bain thermostaté fixé à une

température de 37°C est utilisé. Il correspond à un thermostat à immersion dans lequel sont

placés, pendant différentes durées, des flacons en plastique qui eux-mêmes vont contenir le SBF

et notre verre.

V.3. Caractérisation Les échantillons sont immergés dans le SBF à 37°C pendant des durées allant de 1h à 10

jours. Après immersion, ils sont rincés à l’eau permutée puis séchés à l'air.

Nous avons ensuite mené une caractérisation par diffraction des rayons X, densité

absolue par pycnomètre à hélium et enfin des observations par microscopie électronique à

balayage (MEB) afin de contrôler et suivre l'évolution des phases présentes dans les matériaux

au cours du temps d’immersion.

V.3.1. Etude par diffraction des rayons X Après immersion et séchage à l'air, chaque échantillon a été analysé par diffraction des

rayons X. Les figures suivantes montrent l'évolution des phases au cours du temps d'immersion.

La figure (V-1) montre les spectres de diffraction de rayons X de la poudre de verre après

immersion à différents temps dans le SBF. Nous avons constaté l’apparition de pics

d’hydroxyapatite après 24 h d’immersion dans le liquide physiologique.

La présence de pics moins intenses et plus larges s’explique par le fait qu’une grande

partie de l’hydroxyapatite (HA) reste sous sa forme amorphe et qu’une petite quantité seulement

cristallise.

Le temps de la formation de la phase de HA pour la poudre du verre correspond au temps

de formation que L.Hench a déjà mentionné dans ces publications.

91

Chapitre V Etude in vitro des bioverres poreux Poudre du verre =f (temps d'immersion)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 10 20 30 40 50 60 70

2T

inte

nsité

4h6h8h10h12h24h72h

Figure V-1 : Spectre de diffraction de rayons X de poudre du verre après immersion dans le SBF.

Nous avons ensuite effectué des analyses similaires en utilisant des pastilles de verre

traités à 600°C afin de savoir si la porosité influe sur le temps d’apparition de la couche

d’hydroxyapatite. A noter qu’à cette température une phase cristalline se forme dans les pastilles.

Les figures (V-2 et V-3) présentent les spectres de diffraction de rayons X des pastilles

élaborés respectivement par voie sèche et voie liquide, en utilisant la paraffine comme porogène.

La phase cristalline Na2Ca2(SiO3)3 observé auparavant au niveau des pastilles, reste visible

sur les spectres de RX jusqu’à 12h d’immersion dans le SBF. Après 3 jours d’immersion nous

avons observé l’apparition de pics d’hydroxyapatite.

Nous avons mis en évidence que la voie d’élaboration du bioverre poreux (voie sèche ou

voie liquide) ne joue pas beaucoup sur la vitesse de formation de la phase cristalline de

l’hydroxyapatite.

92

Chapitre V Etude in vitro des bioverres poreux V2P6L60 =(t SBF)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0 10 20 30 40 50 60 70

2T

Inte

nsité

1H6H8H10H12H72H

Figure V-2 : Spectre de diffraction de rayons X du bioverre poreux (voie liquide ; 60 % de

paraffine) après immersion dans le SBF.

V2P6S60=f(t SBF)

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 702T

Inte

nsité

0H1H2H4H6H8H10H12H24H72H

Figure V-3 : Spectre de diffraction de rayons X du bioverre poreux (voie sèche ; 60 % de

paraffine) après immersion dans le SBF.

93


La figure (V-4) montre les spectres de diffraction de rayons X effectué sur des pastilles

élaboré par voie sèche avec le PEG comme porogène, ceci afin de déterminer l’influence des

deux porogènes sur la formation de la couche d’hydroxyapaptite.

Nous avons observé sur ces spectres les pics d’hydroxyapatite après 3 jours d’immersion

dans le SBF.

igure V-4 : Spectre de diffraction de rayons X du bioverre poreux (voie sèche ; 60 % de PEG) après immersion

Le temps de formation de l’hydroxyapatite « 3jours » observé sur les pastilles nous a paru

rs de

V2PEG6S60=f(t SBF)

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 702T

Inte

nsité

0H

1H

2H

4H

6H

8H

10H

12H

24H

288H

F

dans le SBF.

plus long par rapport au temps de formation, sur des blocs massifs de même verre, cité dans la

littérature. En effet, L.Hench a observé la phase d’hydroxyapatite après 12 h d’immersion.

Nous pouvons expliquer cette différence de temps de formation par le fait qu’au cou

l’élaboration de notre verre poreux une dissolution des ions dans l’eau se produit pendant les

différentes étapes d’élaboration : trempe dans l’eau, broyage dans l’eau et mise en barbotine.

Tout ceci va rendre notre verre plus pauvre en ions, plus particulièrement le PO4+ qui se

dissout rapidement dans l’eau.

94


Nous avons analysé les spectres de diffraction de rayons X des pastilles élaborés avec des

atite (HA) apparaît clairement sur les trois

Des essais de mesure de densité absolue par pycnomètre à hélium ont été menés pour

V.3.2. Mesure de la densité absolue

Le suivi de l'évolution de la densité absolue par pycnomètre à hélium (figure V-6) va

permettre de déceler la présence de nouvelles phases qui se forment durant le temps d'immersion

des échantillons dans le SBF.

taux de porogènes variés (10 ,30 ,60 % vol) afin de déterminer l influence du taux de porosité

des pastilles sur la formation de la couche d’HA.

Sur la figure V-5, la phase d’hydroxyap

spectres correspondant aux différents taux de PEG avec des pics plus au moins intenses, sans

que l’on puisse détecter une différence significative. Ce résultat ne nous permet pas de montrer

une influence de la porosité des pastilles sur la formation de la couche d’hydroxyapatite.

V2PEG6S(%)-12Jrs

0

50

100

150

200

250

0 10 20 30 40 50 60 702T

Inte

nsité V2PEG6S60-0JRS

V2PEG6S10-12JRS

V2PEG6S30-12JRS

V2PEG6S60-12JRS

Figure V-5 : Spectre de diffraction de rayons X du bioverre poreux (voie sèche ; 10, 30, 60 % de

PEG) après immersion dans le SBF

confirmer la formation d’une phase d’HA et en même temps suivre l’évolution de cette phase.

95


voie sèche

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 20 40 60 80

temps d'immersion en SBF (H)

dens

ité a

bosl

ue (g

/cm

3)

60% porogène10% porogène

Figure V-6 : Mesure de la densité absolue après les tests de bioactivité

Dans les deux cas, à savoir pastilles préparées avec 10%vol ou 60%vol de porogène, on

remarque que la densité absolue augmente rapidement au bout des premières 24 heures, pour

ensuite atteindre un palier et ce quelque soit le taux de porogène ( fig. V-6).

30% de porogène 6

7

0

1

2

3

4

5

0 10 20 30 40 50 60 70 80

tem ps d 'im m ersion ( H )

Den

sité

abs

olue

(g/c

m3)

liqu idesèche

Figure V-7 : Mesure de la densité absolue après les tests de bioactivité

96

Chapitre V Etude in vitro des bioverres poreux Nous avons effectué des tests de densité absolue sur des pastilles élaborées par voie sèche

V.3.3. Observation microstructurale après immersion dans le SBF servé la formation de la

et voie liquide avec un même taux de porogène, La cinétique de formation de nouvelles phases

(HA) paraît plus rapide dans le cas des échantillons obtenus par voie liquide que par voie sèche.

A l’aide du microscope électronique à balayage, nous avons ob

couche d’HA in vitro en changeant à chaque fois une variable (voie de préparation des pastilles,

taux de porogène, température de traitement des pastilles) pour évaluer son influence.

97

aces du cod’immersion . Colonne de gauche : voie sèche , colonne de droite : voie liquide.

V2P6S10%-10jrs 500µm V2P6L10%-10jrs 500µm

V2P6S10%-10jrs 10µm

V2P6L10%-10jrs 1µm

V2P6L10%-10jrs 10µm

V2P6S10%-10jrs 1µm

ntacte verre/SBF après 10 jours Figure VI-8 : Observation MEB des surf

Chapitre V Etude in vitro des bioverres poreux La micrographie (figure V- 8) montre la formation d'une couche d’HAC à la surface du verre

a t liquide.

près 10 jours d’immersion pour les deux échantillons, préparés par les voies sèche e

Figure VI-9 : Observation MEB des surfaces du contacte verre/SBF après 3 jours d’immersion. Colonne de gauche : traité à 700°C , colonne de droite : traité à 600°C

V2PEG7S10%-3jrs 500µm






98

Chapitre V Etude in vitro des bioverres poreux apatite

arbonaté (HAC) sur la surface du verre après 3 jours d’immersion pour les échantillons traités à

00 et à 700°C préparés par voie sèche.

s de taille 500µm qui se décollent. La couche

l’effet du séchage à l’air s’écaille et se décolle du verre. De plus, des particules arrondies

par le fluide physiologique et cette couche reste accrochée solidement au bioverre. Ces

sultats sont cohérents avec les résultats obtenus par diffraction des rayons X, c’est à dire qu’au

e couche d’HAC

orme des particules arrondies.

La micrographie ( figure V-9 ) montre également la formation de l’hydroxy

c

6

Sur les premières photographies des deux figures (V-8, V-9) la couche d’HAC est

observable. Elle correspond à un ensemble d’écaille

sous

sont parsemés sur les plaques de la couche de surface, ces particules ont un diamètre moyen de

10µm.

Dans le milieu naturel, le séchage de la couche n’a pas lieu puisqu’elle est en permanence

baignée

ré

bout de 3 jours il y a une formation de la couche de l’hydroxyapatite carbonaté.

La figure (V-10) présente l’état de surface du verre avant et après immersion dans le

liquide physiologique, les grains du verre laissent développer sur leur surface un

sous f

Figure VI-10 : Observation MEB des surfaces du verre . gauche : avant immersion ,

V2P6S10%-10jrs 10µmV2P6S10%-10jrs 10µm

droite : après 10 jours d’immersion.

99


La figure (V-11) présente une coupe transversale du bloc du verre après immersion dans le

physiologique. Nous avons observe des particules d’hydroxyapatite sur la surface de

ontact et même au centre du bloc.

plus loin de l’interface verre / SBF.

liquide

c

Grâce à la structure poreuse de notre verre, le liquide physiologique peut pénétrer plus

profond dans le verre, quelques centaines de microns à partir de la surface de contact, ce qui

explique la présence de HAC un peu

Surface du contact

V2P6S10% -10jrs 10µm

V2P6S10% -10jrs 1µmV2P6S10% -10jrs 1µm

Figure VI-11 : Observation MEB d’une coupe transversale du verre après 10 jours d’immersion : interface verre/SBF.

100


V.4. Test in vitro des blocs préparés par barbotine

rés par barbotine a été la même

merger ces blocs

le liquide physiologique pendant différents temps .

re le matériau et le SBF.

r ce spectre on observe qu’il y a une formation d’une nouvelle phase sur la surface après

La procédure de test in vitro ( SBF) pour les blocs prépa

ue pour ceux préparés par voie sèche et liquide ( pastilles), elle consiste à imq

dans

L’analyse de diffraction de rayons X réalisé sur ces blocs avant et après immersion a été

utilisé pour suivre l’évolution de la surface de contact ent

Su

12 jours d’immersion dans le SBF, cette phase correspond à une phase d’hydroxyapatite.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 10 20 30 40 50 60 70

HAP Na2Ca2(SiO3)3

Après 12 jrs d’immersion

Avant immersion

Fig.VI-12 : Spectre de diffraction de rayons X du bloc poreux : avant et après immersion

dans le SBF.

101


L’observation par MEB (fig.V.13) a confirmé la formation d’une couche

’hydroxyapatite, cette dernière a changé la surface du bloc à l’échelle macroscopique après 24h

’immersion dans le liquide physiologique.

Ce changement apparaît également à l’échelle microscopique, en effet, la microporosité

ugmente dans le matériau traité à haute température. Or nous avions vu dans le chapitre

o s é

ec le liquide physiologique.

d

d

a

précédent que la micr poro ité diminue avec la temp rature.

L’augmentation du nombre des micropores est due probablement à la dissolution de la

surface générée par les échanges ioniques av

Avant immersiondans le SBF

Après immersiondans le SBF

200µm 5µm

Fig.VI.13 : Observation MEB d’un bloc traité à 1050 °C après 24h d’immersion dans le SBF

102


onclusion

Pour les pastilles préparées par voie sèche et voie liquide et observé par diffraction aux

yons X, nous avons mis en évidence que le temps d’apparition de la couche d’hydroxyapatite

st long par rapport aux résultats de la littérature, 3 jours pour nos pastilles poreuses contre 12h

assifs de L.Hench. Nous avons supposé que cette différence de temps était du à

dissolution des ions a travers les étapes de préparation des pastilles.

Nous avons observé la formation d’hydroxyapatite à l’intérieur des pastilles en réalisant

C

ra

e

pour les blocs m

la

Les analyses que nous avons mené sur les pastilles ont montré que ni le taux de porogène,

ni de la température de traitement, ni la méthode de préparation des pastilles n’influent sur la

vitesse de formation de la couche d’hydroxyapatite.

des coupes transversales, ceci est du à la structure poreuse des pastilles qui permette une

pénétration du liquide physiologique lors de l’immersion.

Sur les blocs préparés par barbotine nous avons observé une couche d’hydroxyapatite au

bout de 24h d’immersion

103

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