Des édifices moléculaires modèles en phase gazeuse pour la compréhension d’une réaction

chimique du vivant

Niloufar Shafizadeh, Minh-Huong Ha-Thi

Institut des Sciences Moléculaires d’Orsay (ISMO )

Lionel Poisson et Benoit Soep

Introduction

Myoglobine Hémoglobine

L’Hème ou

la protoporphyrine IX

du Fer II

Hèmoprotèine -Ligand Hèmoprotèine + ligand

Introduction

La réaction est bien localisé au sein du protéine sur un site actif. Le site actif est dans une poche hydrophobe. Liaison réversible entre l’oxygène et l’hème. L’énergie de liaison Fer-ligand n’est pas connue. Hème libre est dans un état de spin élevé

ou quintet V.

Heme ligandé est dans un état de spin

bas ou singulet I.

.

Métalloporphyrine -Ligand Métalloporphyrine + ligand

• L’association ou la dissociation d’un ligand de l’hème au sein d’un protéine est un processus complexe qui est accompagné d’un changement de spin de la fonction l’hème.

• Hème libre est dans un état de spin

élevé ou quintet V

• Heme ligandé est dans un état de spin bas ou singulet I

Etudes théoriques

Harvey J.AC.S. 2000, 122, 12401

Hème-ligand Hème + Ligand

hn

Le potentiel d’ionisation de la Porphyrine est bas IP (H2TPP) =6.5 eV

L’affinité electronique de la Porphyrine est haute AE (H2TPP)= 1.69 eV

Le fer atomique peut exister dans des degrés d’oxydation +2 ,+3,or +4

Le Porphyrine et le Métal de transition sont deux entités donneur et accepteur d’électrons

Propriétés d’oxydo –réduction remarquable

Métallo porphyrine

Notre Statégie

La spectroscopie de photoion - photoélectron

dépendant du temps en phase gazeuse

Des molécules modèles

•.Métalloporphyrines isolées pour étudier leurs relaxation électroniques

•Hème isolée

•Métalloporphyrine avec un environnement modèle

•Mesure d’énergie de la liaison Métal-Ligand sur un système modèle

Ruthénium Tétraphenyl Porphyrine-Carbonyle

Études expérimentales

Absorption transitoire J.L.Martin et al. Boichemstry 27 (1988) 4049

S. Ishizaka et al. Phoyochem. Photobio Sc. 8 (2009) 562

Hochstrasseret al. Chem.Phys 259 (2000) 71

….

Raman de Résonance dépendant du temps J.L. Martin et al. Biophysical J 80 (2008) 2372, ….

Absorption X dépendante du temps Chergui et al Phys Rev Lett 102 (2009) 068103

Diffraction X dépendante du temps Anfinrud et al. Science 300 (2003) 1945

Hème-ligand Hème + Ligand hn

1- ~100 femtosecondes Transfert de charge

Porphyrine vers le métal ?

ou métal vers la Porphyrine ?

2- ~ ps Relaxation électronique ? Ou

refroidissement vibrationnel

interaction avec le solvant ?

3- centaine ps

Mouvement conformationel de la matrice protéique Anfinrud et al. Science 300 (2003) 1945

Questions Ouvertes ?

• Des métalloporphyrine isolée : Tetraphenyl Porphyrine ou octaethyl porphyrine

Cobalt, Nickel, Cuivre, Zinc

• Heme isolée

• Métalloporphyrine avec un environnement modèle

• Mesure d’énergie liaison Métal-Ligand

MTPP : Tetra Phenyl Porphyrine M OEP: Octa Ethyl Porphyrine

S0 (p,p)

S2 (p,p*)

400 nm

266 nmm

S1 (p,p* )

Porphyrine Métal

Spectre d’absorption

Life time of the S2 excited state for different metals

S. SORGUES et al. J. Chem. Phys. 124 (2006) 114302

TPP : Tetra Phenyl Porphyrine

OEP: Octa Ethyl Porphyrine

Fe III OEP d5 50 fs 2 ps

Ru II TPP d6 70 fs 1.2 ps

Ru II OEP d6 80 fs 1.2 ps

Co II TPP d7 100 fs 0.5 ps

Ni II TPP d8 50 fs 0.4 ps

Cu II TPP d9 65 fs 2 ps

Cu II OEP d9 65 fs 2 ps

Zn II TPP d10 600fs 1.2ns

t1 t2

Mécanisme de Relaxation

d x2

-y2 (b1g)

Métal : d8

a1u (p)

a2u (p)

eg (p*)

Porphyrine

dz2 (ag)

dp (eg)

B1g3(d,d)

T1 3(p,p*)

S0

S1 (p,p* )

S2 (p,p*) ~ 1ps

ZnTPP

(p,d)

~10 ps

(d,d)

~ 1 ps

< 100 fs MTPP

Mécanisme de Relaxation

Le transfert de charge du cycle porphyrinique vers le métal est le processus qui domine la relaxation de l’état électronique excité S2 des métalloporphyrines. Cet état de transfert de charge est une porte vers d’autres voies de relaxation.

Des calculs théoriques ont été entrepris par Aurélien de la Lande du LCP pour confirmer la validité de notre Modèle

• des métalloporphyrine isolée : Tetraphenyl Porphyrine ou octaethyl porphyrine

Cobalt, Nickel, Cuivre , Zinc

• Heme isolée

• Métalloporphyrine avec un environnement modèle

• Mesure d’énergie liaison Métal-Ligand

Notre méthodologie

-200 0 200 400 600

-200 0 200 400 600

300 400 500 600 700

Pump/probe delay (fs)

[FeIII PP Cl]

[FeII PP]

[FeII PP]

[FeIII PP Cl]

t1 = 50 fs

t2 = 250 fs

Ionisation 400 + 800 nm du

Fer II et Fer III - Protoporphyrine IX

Hemin

Fer III Protoporphyrin Chloride

[FeIII PP-Cl ]

•La protoporphyrine du fer excité relaxe vers un état de transfert de charge.

•Le transfert de charge est l’étape qui permet le changement de spin du fer entre son état ligandé quintet V, et l’état non ligandé singulet.

•Vraisemblablement l’ état de transfert de charge se relaxe vers son état fondamental.

Mécanisme de Relaxation des Protoporphyrines du Fer II et FerIII

• des métalloporphyrine isolée : Tetraphenyl Porphyrine ou octaethyl porphyrine

Cobalt , Nickel , Copper , Zinc

• Heme isolée

• Métalloporphyrine avec un environnement modèle

• Mesure d’énergie liaison Métal-Ligand

Notre méthodologie

M-TPP : Métal Tetra-Phenyle Porphyrine M-OEP: Octa Ethyl Porphyrine

Reconstitution de l’environnement du site actif

Iron peroxo structure Triangulaire Liaison Irreversible

O O

Fe

Iron superoxo Structure en angle Liaison reversible

Iron Picket Fence Collaboration Institut Curie Ph Maillard

Cobalt Picket Fence

Collmann et Momenteau ont synthétisé une famille de composés nommée Picket Fence qui reproduit la gène stérique crée par la chaîne protéique autour du site actif

Fe

O

O

N

N

Site de ligandation

Une face protégée

Une seule liaison cobalt ligand massif

Deux faces non protégées

Deux liaisons cobalt ligands

N

N

N

N

-50 0 50 100 150 200 250 300

CoTPP (Im)n1 2 3

uam -50 0 50 100 150 200 250 300

Co PF(Im)n 1 2

N

N Les Molécules de Picket Fence Cobalt gardent leur propriété stérique en phase gazeuse

Spectre de masse du Cobalt Porphyrine Ligandée

N

N

Ligand

Futur ,…

Ligand : NO, H2S , O2, …

• des métalloporphyrine isolée : Tetraphenyl Porphyrine ou octaethyl porphyrine

Cobalt , Nickel , Copper , Zinc

• Heme isolée

• Métalloporphyrine avec un environnement modèle

• Mesure de l’’énergie liaison Métal-Ligand sur un système modèle RuTPP-CO

Notre méthodologie

[RuTPP –CO]

[RuTPP –CO] +

[RuTPP] +

[RuTPP]

Energies de liaison de [MP-ligand]+

Energies de liaison de [MP-ligand]

EIP free

EIP ligated

Efragment

Energie de liaison du Ru-CO

Expérience effectuée sur le montage Saphir au synchrotron Soleil Septembre 2013

Minh–Huong Ha-Thi, Séverine Boyé-Péronne. Satchin Soorkia, Lionel Poisson, Benoit Soep, Laurent Nahon, Gustavo Garcia, Barbara Miranda .

Energies de liaison Ru–CO pour l’ion [TPP Ru CO ]+

PI du [TPP Ru- CO] =6.6 ev

Spectre de photoélectron du RuTPP CO

[RuTPP-CO]+

Flu

x d

’ions

[RuTPP]+

Seuil d’apparution du fragment [Ru TPP]+ = 7.8 eV

6 7 8 9

Energie (ev)

Spectre de photoion

Énergie de liaison du [RuTPP-CO]+=1.2 ev =9 700 cm-1

Je vous remercie pour votre Attention

[RuTPP –CO]

[RuTPP –CO] +

[RuTPP] +

[RuTPP]

Binding energy of [MP-ligand]+

Binding energy of [MP-ligand]

EIP free

EIP ligated

Efragment

Energie de liaison du Ru-CO

PI_cotpiv111005b-ave Hélium

0

100

200

300

400

500

600

0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000

B

B

Spectre de masse du RuTPP-CO

200 240 280 320 360 400 440 480 520 560 600 640 680 720 760 800

210 280 350 420 490 560 630 700 770

7 ev

10 ev

Pourquoi la phase gaz ?

Espèces isolées de leur environnement

Propriétés intrinsèques

Comparable avec la théorie

Sélectivité en masse

Absorption

B1g3(d,d)

T1 3(p,p*)

S0

S1 (p,p* )

S2 (p,p*)

(p,d)

(d,d)

d x2

-y2 (b1g)

Metal : d8

dp (eg)

a1u (p)

a2u (p)

eg (p*)

Porphyrin

dz2 (ag)

Ionisation Résonante 400+266nm

Spectre Photo-ion

-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000

-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000

-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Ni II OEP

delai Pompe/ Sonde (fs)

Cu II OEP

Zn II TPP

sign

al d

’Ion

isat

ion

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

0

20

40

60

80

100

1200.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

0

20

40

60

80

100

120

Spectre Photo-electron

sign

al d

e P

hot

oele

ctro

n

Zn II TPP

Cu II OEP

Aux longs délais ~1 ps

Energie (eV)

Aux Délais égal à zero

S0

S2

400 nm

266 nm

S1

Evaporation Method

Porphyrin and

Graphite Pellet

pulsed

Valve

Thermo-coax

Vespel

Gas

Evaporation Laser

532 nm

Graphite/Porphyrine

Pellet

Thermo-desorption Laser desorption

Augm

enta

tion d

e

l’in

tensi

té L

aser

Augm

enta

tion d

e la

tem

pér

ature

RuTPP CORuTPP

2vaporation du RuTPP-CO

T=150°?

T=280°

P =4 mJ

60 mJ

15 mJ

Time of flight mass spectra of hemin

400 450 500 550 600 650 700

400 450 500 550 600 650 700

650 660610 620550 560 570

Thermo-desorption

Laser desorption

[FePP minus CH2COOH] [FePP] [FePPCl]

[FePPCl] and [FePP] : narrow and asymmetric, well produced by the isotopic distribution (vaporization) Other lighter fragments : broad and symmetric (ionic fragmentation) Different formation processes between the lighter fragments and the intact FePPCl and FePP

m/z

Variation of laser intensity

550 600 650 700

m/z

Hemin

[FePP]

Fragment

0 100 200 300 400 500 600 7000

10

20

30

FePP/hemin

Fragment/hemin

Laser intensity (mJ)

Cl loss is a result of vaporization (independent on laser intensity)

The other fragments result from ionic fragmentation

The ratio of the area under the FePP peak and

the fragment peak to the area under the hemin peak

Hemin

Ion + e-

Probe Laser

La détection des ions apporte des informations concernant les masses et les fragments. La détection des électrons apporte des informations sur l'énergie cinétique de l'électron éjecté, cette énergie reflète l 'évolution temporelle de l'état électronique excité.

En variant le délai entre le laser pompe et le laser sonde on peut suivre l’évolution temporelle de l’état excité S2

Spectroscopie photo ions –photo électrons

dépendante de temps

S0

S2

Cation e- e-

Pump Laser

400 nm

266 nm

Ligandation site

Co

Co

Co

Co

a4 a3

a2 trans a2 cis

Ionisation résonnante de 400 +800 nm de la

Proto Porphyrine du fer

800nm

S0

S2

400 nm

S1

300 350 400 450 500 550 600 650 700

m/z

[Fe III PP Cl]

[Fe II PP]

[Fe III PP-Cl ] +heat →[FeIII PP] + + Cl- 5.7 eV

→ [Fe II PP] + Cl● 2.4 eV

Hémin

Chlorure Protoporphyrin IX fer III

[Fe III PP-Cl ]

Time evolution fs

Free and ligated Cobalt Picket Fence

-1000 0 1000 2000 3000 4000

-1000 0 1000 2000 3000 4000

pump/probe delay ( femto seconde)

t1=60fs

t2=600fs

t1=40fs

t2=300fs

Free Cobalt Picket Fence

Cobalt Picket Fence

ligated to methylimidazole

800nm

S0

S2

400 nm

S1

MP

MP+

Conclusion

Des expériences en phase gazeuse

des informations sur

• la composition

• la structure

• la dynamique réactionnelle

des systèmes d’intérêt biologique

Ion or Electron Time dependent Spectroscopy

Ion + e-

S0

S2

Cation e- e-

Pump Laser

400nm

Probe Laser

Detecting the ions leads to information on masses and fragments. Detecting the electrons leads to information on the kinetic energy of the ejected electrons, reflecting the evolution of electronically excited intermediate states. By varying the time delay between pump and probe laser, one can follow the evolution of the S2 state.

Iron metalloporphyrins

I invite you to visit our poster n°11 on

electronic relaxation of different iron porphyrins

Molecular Oxygen -Iron Bonding

Iron peroxo Triangular structure Irreversible bonding

O O

Fe

Iron superoxo End-on angular structure reversible bonding Fe

O

O

1- ~100 femtosecondes

Relaxation vers l’état fondamental dans le cas du fer

ou

Relaxation vers un état de transfert de charge

Porphyrine vers le métal

ou métal vers la Porphyrine ?

2- ~ ps

Relaxation électronique Ou

refroidissement vibrationnel

interaction avec le solvant ?

Conclusions

Dans le cas des métalloporphyrines ces expériences ont permis de mettre en évidence le mécanisme de transfert de charge. Les états de transfert de charge sont des portes vers d’autres processus de relaxation et en particulier le moteur de la dissociation du ligand .

Relaxation Mechanism

d x2

-y2 (b1g)

Metal : d8

a1u (p)

a2u (p)

eg (p*)

Porphyrine

dz2 (ag)

dp (eg)

B1g3(d,d)

T1 3(p,p*)

S0

S1 (p,p* )

S2 (p,p*) ~ 1ps

ZnTPP

(p,d)

~ 1 ps

< 100 fs

~10 ps

(d,d)

MTPP

Hématoproteines

Liaison réversible entre l’oxygène et l’hème L’hème non ligandé se trouve dans un état quintet " haut spin " L’hème ligandé à l’oxygène se trouve dans un état singulet " bas spin "

The aim of this work

Metal Porphyrin

The Porphyrins and the Metal are both electron donor and electron acceptor

+2 ,+3,or +4 oxydation degree exist for Iron in heme

The Ionisation potentiel of Porphyrins is low IP (H2TPP) =6.5 eV

The electronic affinity of Porphyrins is high for AE (H2TPP)= 1.69 eV

MP-Ligand MP + ligand

hn

The microscopic understanding of mechanism of photodissocition

To characterized the transition state and the relaxation pathway

Oxydo-reduction properties

Metal Porphyrin

The Porphyrins and the Metal are both electron donor and electron acceptor

+2 ,+3,or +4 oxydation degree exist for Iron in heme

The Ionisation potentiel of Porphyrins is low IP (H2TPP) =6.5 eV

The electronic affinity of Porphyrins is high for AE (H2TPP)= 1.69 eV

Zgierski et al. J.Chem.Phys. 121 (2004) 1317

S2

S1

Vertical energies of excited state NiP(eV)

Introduction

Myoglobine Hémoglobine

P Fe II → [P Fe III]+ + ē ←

Propriété donneur - accepteur d’électron

Transport de l’oxygène dans le

sang

L’Hème ou la protoporphyrine du Fer

Métaux de transitions Zinc

t1 < 100 fs t1 < p s

t2 ps dépends de la nature du métal

t2 ns

N’est pas fluorescent Fluorescent

Comparaison entre

Métaux de transitions / Zinc