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BCM 2505 Cintique enzymatique 1 Page 1/15

Revue et prolongement du modle michaelien

Modle cintique un substrat :

- o E, S, ES et P symbolisent l'enzyme, le substrat, le complexe enzyme-

substrat, et les produits respectivement.

Selon ce modle, lorsque la concentration de substrat devient suffisamment

importante afin de capter tout enzyme sous forme ES, la deuxime tape de la

raction est limitante et la raction globale devient insensible aux augmentations

supplmentaires en concentration de substrat.

- Dans une raction enzymatique, le taux de catalyse (v) est dpendent de la

concentration du produit final par unit de temps.

- La vitesse de la raction est donc reprsente par :

- La vitesse de production de ES est la diffrence entre les vitesses des deux

ractions lmentaires dcrivant la formation de ES et sa disparition:

- Cette quation diffrentielle ne peut pas tre intgre de faon explicite

pour tous les cas sans des approximations qui la simplifient.

k1 k2

E + S ES E + P k-1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Saturation

[S]

vit

esse

] ES [ k = t d

] S[ d - =

t d

] P [ d = v 2

] ES [ k -] ES [ k -] S[] E [ k = t d

] ES [ d 21-1


1. quilibre rapide

En 1913, Lonure Michaelis et Maud Menten ont assum que k-1 >> k2 pour

que la premire tape de la raction soit toujours en quilibre. Donc Ks = k-1

/ k1 = [E][S] / [ES] qui est la constante dissociation du substrat de l'enzyme.

Le complexe non-covalent ES entre enzyme et substrat est connu par le nom

de complexe Michaelis.

2. tat stationnaire

La concentration d'ES est relativement constante pendant la raction si [S]

>> [E]. Donc, la vitesse de production de ES doit tre gale sa disparition

pour la plupart de la raction. Par consquent, si [ES] est relativement

constant, d[ES]/dt = 0. Dsignation comme sous forme d'approximation de

l'tat stationnaire propos d'abord par Briggs et Haldane en 1925.

Points noter dans des approximations Michaelis-Menten et Briggs-Haldane

1) La formation du produit est proportionnelle la concentration du complexe enzyme-substrat (ES)

2) Dcomposition du complexe central reprsente l'tape limitante

3) Condition de mesure de vitesse doit minimiser la raction du retour

E + P EP ES

4) Imposition de la notion de la vitesse initiale; autrement la solution est difficile aborder.

Traitement Briggs-Haldane; tat stationnaire

L'approximation de l'quilibre rapide nest pas approprie dans les systmes

biochimiques, et ce, pour plusieurs raisons :

1) Les intermdiaires enzymatiques sont chimiquement plus ractifs par rapport la notion de dcomposition du ES lente vers le produit.

2) Le temps disponible pour une raction d'atteindre son quilibre dans les tapes prcdentes de l'tape limitante est trs souvent insuffisant; donc, pas

d'quilibre vritable entre des complexes intermdiaires.

3) Les systmes biochimiques reprsentent frquemment des squences de ractions conscutives o le produit devient le substrat de la raction subs-

quente, pas d'quilibre vritable possible.


Lapproximation simplifie permet la drivation mathmatique dune

relation explicite entre la vitesse dune raction catalyse enzymatiquement (v) et

la concentration du substrat (S); cette relation est connue sous le nom de

Michaelis-Menten.

o 1

212max ][

k

kkKetEkV MT

Donc kcat = Vmax / [E]T

Les paramtres VMAX et KM permettent de cerner trois aspects de

la catalyse :

1) Caractrisation de la spcificit enzymatique.

2) Type de mcanisme : tat stationnaire ou quilibre rapide .

3) Rle mtabolique de l'enzyme.

][

][max

SK

SVv

M

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

[S]

Vit

es

se

KM

Courbe

hyperbolique

Vmax

Vmax/2

quation Michaelis-Menten Reprsentation graphique


] S[] E [ K

k v

M

cat

] S [] E [ )K

k( v ] S [] E [ )

K

k( v 2S

M

cat

S1SM

cat

S 2211

1) Spcificit

Si la vitesse enzymatique est dcrite par :

alors quand Km >> [S], [E]T [E]; donc

o kcat / Km reprsentent une constante apparente de deuxime ordre qui dcrit la

raction entre un enzyme libre et un substrat libre - spcificit.

- sil y a deux substrats, S1 et S2, qui sont utiliss par le mme enzyme.

- donc au mme [S],

- Ce rapport de vitesses peut tre utilis afin dvaluer la spcificit de l'enzyme

Exemple : fumarate hydratase

Substrat kcat/Km (M-1

s-1

)

fumarate 1.6 x 108

fluorofumarate 9.8 x 107

chlorofumarate 2.0 x 105

bromofumarate 2.5 x 104

- Lenzyme est hautement spcifique pour le fumarate et le driv fluoro.

2

1

2

1

SM

cat

SM

cat

S

S

K

k

K

k

v

v

][

][][

SK

SEkv

M

Tcat


2) Type de mcanisme

Si k2 > k-1 (forme extrme de l tat stationnaire )

Km = k2/k1 et puisque kcat = k2

kcat/Km = k1 qui est la constante de vitesse d'association entre enzyme et

substrat

Lassociation entre enzyme et substrat est limite par diffusion, donc k1 ne

peut pas dpasser la valeur de la constante de diffusion du substrat ~ 109 M

-1 s

-1.

si kcat/Km sont de cet ordre de valeur, le mcanisme tat stationnaire est

applicable.

Enzyme kcat/Km (M-1

s-1

)

fumarate hydratase 1.6 X 108

catalase 4 x 107

triosephosphate isomrase 2.4 x 108

si kcat/Km est plus petit, le mcanisme de type "quilibre rapide" sapplique.

3) Rle mtabolique

Le rle de l'enzyme dans le mtabolisme peut tre valu en comparaison

avec son KM et la concentration in vivo du substrat;

o Par exemple, l'isozyme IV de la glucokinase provenant du foie possde un KM 10mM tandis que les isozymes I - III (qui se retrouvent partout dans

le corps) ont tous des KM ~ 40 M.

o Chez un individu jeun, les niveaux de glucose sanguins sont ~ 5mM. A cette concentration, les isozymes I-III fonctionnent "

planche" tandis que lisozyme IV est seulement ~25% activ. Aprs

un repas dhydrates de carbone, la concentration de glucose sanguin

monte 10mM et isozyme IV fonctionnera Vmax/2

o cause du Km lev de l'isozyme IV, le foie est capable de grer le glucose supplmentaire en glucose-6-P

o cette raction reprsente la premire tape de glycolyse.


] ES [ ) k - ] P [ k+] S[ k

) k + k (] S[ k ( = v 1-

2-1

21-1

Prolongement du modle

i) raction rversible

La condition de conservation de masse pour la raction avec une

intermdiaire est [E]T = [E] + [ES] et en utilisant la condition du rgime

stationnaire de

qui simplifie

En faisant la substitution pour [E]= [E]T - [ES]

]ES [ 1) + ] P [ k+] S[ k

k + k( = ] E [

2-1

21-

T

La vitesse de la raction sexprime par

] ES [ k -] S[] E [ k = t d

] S[ d - = v 1-1

qui se simplifie en utilisant lexpression pour [E]

et en combinant avec la relation entre [E]T et [ES] on obtient

] E [ ) ] P [ k+] S[ k + k + k

] P [ k k -] S[ k k ( = v

T

2-121-

2-1-21

E + S ES|EP E + P

k1

k-1 k-2

k2

0 =] ES [ k -] ES [ k -] P [] E [ k +] S[] E [ k = t d

] ES [ d 21-2-1

] ES [ )] P [ k+] S[ k

k + k( =] E [

2-1

21-


] E [ )

] P [ k + k

k+] S[

k + k

k + 1

] P [ k + k

k k -] S[

k + k

k k

( = v T

21-

2-

21-

1

21-

2-1-

21-

12

La division par (k-1 + k2) dans le numrateur et dnominateur donne ensuite

Si on dfinit les termes suivants :

V fmax = k2[E]T ; V

rmax = k-1[E]T ;

K S

M = (k-1 + k2) / k1 ; K P

M = (k-1 + k2) / k-2

on obtient la relation de Michaelis-Menten pour une raction rversible avec un

intermdiaire

Par exemple, lorsque [P] = 0, v = v0, la vitesse initiale, et lquation devient

identique celle de Michaelis-Menten.

Relation Haldane

lquilibre, v = 0, et la relation ci-haut peut tre rsolu et donne

o par cette relation on dmontre que les paramtres cintiques dune raction rversible catalyse de faon enzymatique ne sont pas

indpendants lun de lautre,

o les paramtres cintiques sont en effet relis travers la constante dquilibre de la raction globale qui est indpendante de la prsence de

lenzyme

K

] P [ +

K

] S[ + 1

] P [ K

V -] S[

K

V

= v

PM

SM

PM

r

SM

fMAXMAX

K V

K V =

] S[

] P [ = K S

Mr

PM

f

eq

MAX

MAX


ii) Plus qu'un intermdiaire

o ES reprsente un intermdiaire activ

En appliquant les quations tat stationnaire , on obtient la mme forme

d'quation que celle de M-M rversible sauf que l'interprtation des Vmax et Km

pour les ractions en avant et de retour seront plus compliques puisquils

reprsentent des fonctions de six paramtres cintiques k1, k2, k3, k-1, k-2, et k-3.

- ceci est galement juste sil sagit de trois ou plus intermdiaires

Il nest pas possible de caractriser une raction de plus quun seul

intermdiaire partir des quatre paramtres cintiques : V fmax , V

rmax , K

SM , et

KP

M,

Les mesures cintiques faites en rgime stationnaire fournissent une

description phnomnologique du comportement de lenzyme et laissent la nature

des intermdiaires indtermine. Les intermdiaires doivent tre caractriss par

dautres moyens, par exemple la spectroscopie.

Une analyse en rgime stationnaire ne peut pas dmontrer de faon non

quivoque le mcanisme dune raction. Cependant si les paramtres

cintiques ne sont pas cohrents avec un mcanisme, ce mcanisme doit tre

rejet.

iii) Inhibition par substrat

- Dcroissance de la vitesse v hautes concentrations de substrats.

Dans la reprsentation double rciproque, ceci signifie une courbure croissante la

valeur 1/[S] faible.

o Une explication possible est la liaison avec un 2e site de substrat de faible affinit qui inhibe l'activit

k-1 k-2

E + S ES ES E + P k1 k2

k-3

k3

Inhibition par excs de substrat

Cas particulier de linhibition incomptitive : 2 molcules de S peuvent se lier E, mais ne peuvent tre transformes en P (autorgulation de lactivit enzymatique).

Exemple de lexcs dactylcholine vs actylcholinestrase :

Site allostrique

Site actif

PDB 2HA4

E + S ES E + P

+

S

ESS

kcat

KS

KI

inactif

Bourne et al., J. Biol. Chem. 2006, 281, 29256


Inhibition par excs de substrat (suite)

[ES]

[E][S]m K

[ESS]

[ES][S]i K

Vo = kcat[ES]

[E]T = [E] + [ES] + [ESS] i

2

m

max

[S][S]

[S]VVo

KK



Effet du pH sur les ractions enzymatiques

Le changement de pH peut avoir plusieurs effets directs sur des ractions

catalyses de faon enzymatique :

1) inactivation de l'enzyme

2) changement dans l'tat d'ionisation du substrat

3) changement dans l'quilibre d'une raction

o par exemple :

Cratine + MgATP2-

Phosphocratine + MgADP2-+ H+

Laugmentation du pH favorise la synthse de phosphocratine.

a) Drivation du profil pH

Leffet indirect est celui du changement de l'tat d'ionisation des chanes

latrales des acides amins, et qui sont essentiels pour l'expression de l'activit

catalytique. L'effet du pH sur la vitesse d'un enzyme peut tre complexe puisque

Vmax et Km sont la fois perturbs.

Considrant le cas o il y aurait deux chanes latrales dont l'tat d'ionisation

modifie l'activit de l'enzyme

La comprhension rside dans le fait que la protonation et la dprotonation

soient parmi les ractions les plus rapides et par consquent, ils sont toujours en

quilibre rapide avec lenzyme. On peut donc rsumer la rpartition des

intermdiaires enzymatiques en fonction des constantes dquilibres.

Par exemple, dans la raction avec lenzyme libre ci-haut pour les tapes:

EH + H+ EH2

+ et E

- + H

+ EH

EH + S ESH +E P

E-

ES-

EH2+

ESH2+

k2k1

k-1

KE2

KE1

KES2

KES1


f] H E [ = ) ] H [

K+1 +

K

] H[ (] H E [ = ] H E [ 1+

E2

E1

+

T

Les constantes dquilibre (dissociation) sont dfinies par KE1 =

[H+][EH]/[EH2

+] et KE2 = [H

+][E

-]/[EH] (une pareille relation dfinie les autres

constantes dquilibres - KES1, KES2).

La condition de conservation de lenzyme exige, o [E]T reprsente la

concentration de lenzyme totale, que :

[E]T = [ESH]T + [EH]T

Les deux termes [ESH]T et [EH]T peuvent tre rcrit en fonction des

constants dquilibres en dfinissant :

[EH]T = [EH+

2] + [EH] + [E-]

qui devient

de faon similaire, [ESH]T = [ESH+

2] + [ESH] + [ES-] et qui devient

En utilisant la notion du rgime stationnaire,

0][][]][[][

211 ESHkESHkSEHkdt

ESHd.

Cette relation est rsolue dans la mme faon comme le prcdent et aprs la

mme dmarche quavant on obtient

Avec

] S[ + ) f

f ( K

] S[ ] E [ f

k

=H] S[E k = v

2

1M

T

2

2

2

f] H S[E = ) ] H [

K+1 +

K

] H[ (] H SE [ = ] H SE [ 2+

ES2

ES1

+

T


En dfinissant des valeurs apparentes de KM et Vmax par

KM = KM (f1 / f2) et VMAX = VMAX / f2

ceci dfinit alors une relation Michaelis-Menten modifie pour les effets de pH

Cette relation nous informe que :

1. Le changement en VMAX reflte l'tat d'ionisation d'enzyme-substrat f2.

2. Le changement en VMAX / KM reflte l'tat d'ionisation de l'enzyme libre f1.

3. Le changement en KM reflte l'tat d'ionisation de l'enzyme libre et son complexe enzyme-substrat f1/f2.

La vitesse initiale de beaucoup

d'enzymes dmontre en fonction du pH

un profil ressemblant une cloche prdit

par une telle relation

- par exemple : la cintique

daldolase de muscle de lapin

Il nest pas toujours possible

dobserver tout le profil de pH, de faon

exprimentale, dus aux constantes

dionisation qui sont soit trop acides ou

basiques

voir comportement du mutant

Glu187Gln de laldolase de lapin.

Mutant

Native

ESH2+ ES

-

] S[ + K

] S[ V= v

M

0MAX


Rappel : Seulement EH et ESH contribuent la valeur catalytique et

lchange des protons est implicite dans le rgime de lquilibre rapide.

Ceci est raisonnable puisque la constante de deuxime ordre pour lchange d'un proton est rapide ~ 10

9 M

-1 s

-1.

L'change rapide des populations fait en sorte que les espces EH et ESH, possdant de la comptence catalytique, sont rduites par des facteurs f1 et

f2.

L'analyse des pKa

Ltude des profils de pH de lenzyme consiste analyser les paramtres

cintiques, Vmax et KM, dtermins des pH diffrents, en fonction des constantes

d'ionisation, KE1, KE2, KES1, et KES2.

La variation de VMAX en pH, dcrite par la fonction f2, dpend uniquement des valeurs de KES1 et KES2.

La variation du rapport Vmax/KM en pH, dcrite par la fonction f1, informe uniquement sur les valeurs de KE1 et KE2.

La dtermination mathmatique des valeurs KEi et KESi est faite par des mthodes destimation non-linaire disponibles sous forme logicielle.

Cependant, partir dinspection visuelle des graphiques, soit VMAX vs pH

ou Vmax/KM vs pH, il est possible dobtenir des estimations approximatives.

Les pKa (log KEi ou log KESi) fournissent des indices importants sur l'identit

des acides amins au site actif.

Rappel : pKE1 = - logKE1, pKE2 = - logKE2, pKES1 = - logKES1, et pKES2 = -

logKES2

Alors,

1. Les pKEi informent sur lidentit des acides amins impliqus dans linteraction de lenzyme avec le substrat

2. Les pKESi informent sur lidentit des acides amins impliqus dans la catalyse.

pK ~ 4 suggre quun rsidu Asp ou Glu soit essentiel pour l'activit de l'enzyme.

Des valeurs pK ~ 6 ou ~ 10 indiquent des rsidus His ou Lys.


Cependant, les pKa des acides amins peuvent tre modifis au sein du site actif

de plusieurs faons importantes.

1. Le groupement carboxylate d'un rsidu Asp en pont salin (lectrostatique) avec un groupement Lys est stabilis par la charge positive de Lys et possde un pKa

plus bas (plus difficile protoner).

2. Inversement un groupement amin dans une rgion peu polaire est moins basique que dans une rgion polaire. Dans ce cas, il sagit du fait quun rsidu

charg est toujours plus difficile stabiliser dans une rgion hydrophobe que sa

forme neutre correspondante.

3. galement, il existe la possibilit que deux acides amins voisins (distance ~ 3-4 pont hydrogne) possdant la mme charge qui dstabilisera une des deux

charges en le rendant neutre.

Donc il faut tre prudent dans l'identification des groupements essentiels

pour l'activit catalytique.

N C

O

O

H

HH

pKa

Lys Asp

NH3

pKa

NH2 Micro-environnement

hydrophobique

NH3

pKa

NH2NH3 NH3

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