Comment valider vos procédures de

nettoyage et désinfection?

Faille C., Clarisse M., Zundel S., Villain M., Derache E.

Réunion d’information

ADRIANOR 26 septembre 2013

INRA, UR 638 PIHM

369 rue Jules Guesde, 59651 Villeneuve d’Ascq

+33 (0)3 20 43 54 24

.2

Qu’est-ce qu’un biofilm?

.3

Qu’est-ce qu’un biofilm?

Communauté de micro-organismes fixés à une surface, enchâssés dans une matrice d’exopolymères

Processus naturel

Structure vivante, dynamique, en perpétuel remaniement

Dominant en milieu hostile

Structure et physiologie du biofilm => conditions d’organisation sociale proches de celles qu’établissent entre elles les cellules eucaryotes au sein des tissus

.4

Qu’est-ce qu’un biofilm?

Mode de vie ubiquitaire

Observé sur tous types de surfaces

tissus animaux & végétaux

matériaux chimiquement inertes

Observé pour tout milieu de suspension

air

liquide

aliment

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Les biofilms en IAA…

.6

Les biofilms en environnements agro-alimentaires

Chaînes de transformation des aliments : rôle majeur dans la contamination des produits

1996-1998: 40% des TIAC = conséquence d’une contamination des équipements (Haeghebaert, 2001)

+ récemment: ~ 25% des infections par les aliments dues à une contamination durant le procédé de transformation

Japon 2000: > 14 000 personnes malades par consommation de lait

contaminé (vanne encrassée)

Problème domestique

Surfaces des cuisines à l’origine de nombreuses contaminations 30% des salmonelloses

nombreuses épidémies à Campylobacter, E. coli O157

.7

Où trouve-t-on les biofilms en IAA

Ateliers (viandes, poissons, fromages, etc.)

Équipements

Murs, sols

Aération, air conditionné, écoulement des eaux usées, siphons

Équipements fermés (produits laitiers, etc.)

Circuit de fabrication

Conditionnement

Circuit de nettoyage

Cuisines collectives ou non

Surfaces en contact direct ou non avec les aliments

+/- Éponges, torchons

.8

Les biofilms en environnements agro-alimentaires

Aliments / ingrédients

Feuille de salade

.9

Les biofilms en environnements agro-alimentaires

Surfaces d’équipements

Industrie de la viande

=> Surface de réfrigérateur

ex: Listeria monocytogenes

Pisciculture

=> Surface de bassin

ex: Yersinia ruckeri

.10

Les biofilms en environnements agro-alimentaires

Domestique, restauration

Planche de découpe

Eponge

.11

Les biofilms en environnements agro-alimentaires

Domestique, restauration

Torchons

.12

Spécificités de ces biofilms

.13

Bactéries capables de se développer dans les conditions difficiles rencontrées en environnement d’ateliers

(dessiccation, présence de sel, pH acides, T° basses, …)

Surface de réfrigérateur dans l’industrie de la viande

Fromagerie [ NaCl] + pH acide

.14

Bactéries capables de résister aux procédures de nettoyage et de désinfection

Rôle de la bactérie

• Propriétés de surface

• Structure du biofilm (3D, exopolymères)

Rôle du matériau

• physico-chimie de surface

• topographie

.15

Exemples de micro-organismes pathogènes en biofilms d’environnement agroalimentaire L. monocytogenes (biofilms mixtes, adaptation au froid)

acier, polymères (tapis convoyeurs, bacs saumurage), bois (maturation fromage), siphons

filière lait, viande, poissons, légumes

Salmonella spp.

acier, ciment, polymères, verre

filières volaille, viande (abattoirs), eau

E. coli

acier (couteaux), polymères (tapis convoyeurs)

filière viande

Bacillus cereus… (cellules végétatives et spores)

acier (conduites, tanks, remplisseuses), polymères (joints), papier

filière lait, légumes

.16

Exemples de micro-organismes d’altération en biofilms en environnement d’IAA Pseudomonas spp. (biofilms hébergeant Listeria, Salmonella)

sols, aliments (viande), siphons, eau

filière lait (bas pH), viande, légumes, fruits

Bactéries lactiques

Lactobacillus sake (viande)

Carnobacterium spp. (lait, viande, poisson)

Bactéries thermorésistantes

.17

Détection de souillures

.18

Choix du protocole

Choix des méthodes de détection de l’hygiène des surfaces

Surveillance et vérification des procédures de nettoyage et désinfection (CCP

essentiel à sécurité alimentaire) Surveillance au minimum quotidienne

Établissement de la validité des méthodes de surveillance pour établir si

pas de dérive

corrélation entre réponse du test et qualité hygiénique de surface :

Périodicité moindre (1-2 fois/semaine)

.19

Caractéristiques du test à prendre en compte? Vitesse

Tests biochimiques.

Surveillance et vérification des procédures de nettoyage et désinfection.

Sensibilité, exactitude Tests microbiologiques, PCR, visualisation directe des surfaces

Établissement de la validité des méthodes de surveillance

Simplicité Facilité de mise en œuvre ou automatisation complète

Reproductibilité Influence du manipulateur…

Coût Méthodes par contact…

Technique reconnue Publiée ou testée par organismes reconnus

.20

Caractéristiques de la souillure à prendre en compte?

Constituants du biofilm Microorganismes / matière organique / matière minérale

Etat des microorganismes

Vivants et cultivables

VNC

Morts

Où se situe le biofilm? Accessibilité ou non

Surface place lisse / recoin / surface rugueuse

Pop. totale

Pop. Viable (CTC+)

Pop. cultivable

Prélèvement de surfaces en ateliers de la filière fromage (Alliot, 1999)

.21

Cadre de l’étude Contrat en partenariat avec l’ADRIANOR et l’ADRIANORMANDIE, et des PME agroalimentaires

Projet DIAMS (DRAF) : Diagnostic Autocontrôle Mesure des Souillures.

Objectif Diagnostic de la pertinence des produits et procédures d’autocontrôle sur la

détermination du niveau d’encrassement par des souillures complexes à l’issue des opérations de nettoyage et désinfection

.22

Outils de contrôle de l’hygiène des surfaces

Evaluation de l’hygiène des surfaces

Souillure

Tests par frottis

Non microbiologique Microbiologique (viable cultivable)

Tests par empreintes

Ecouvillons Eponges

Chiffonnettes

Boîtes contact Lames contact

Films

Visuel

Microscopique Non microscopique

Bioluminescence Cytométrie

Protéines Sucres Lipides

EPS NADPH Allergènes

.23

Approche expérimentale

.24

Méthodes d’étude Biofilms

3 souches bactériennes (IAA)

• Pseudomonas fluorescens D3-276 (produits laitiers)

• Escherichia coli CECT 434 (légumes)

• Bacillus cereus CUETM 98/4 (produits laitiers)

Matériaux Très répandus dans les IAA

• Acier inoxydable 304 2B (1)

• Acier inoxydable 304 2R (2)

• Polyéthylène (3)

• Polypropylène (4)

• Téflon (5)

Verre (6)

1 2

3 4 5

6

.25

Propriétés des matériaux

Téflon Polypropylène Polyéthylène

Acier inoxydable 2B Acier inoxydable 2R Verre

Verre Acier

inoxydable 2R

Acier

inoxydable 2B Polypropylène Téflon Polyéthylène

Rugosité moyenne

Ra (µm) <0,01 0,02 0,13 0,14 0,45 11,61

Angle de contact à

l’eau 25,5° 43,0° 50,3° 97,1° 113,0° 89,0°

.26

Mode opératoire

Production de biofilms

Méthodes test

Tests microbiologiques par frottis

Coloration

Observation Tests biochimiques

Dénombrement

Immersion horizontale Incubation 24 h à 25°C

incubation48 h à 30°C

Tests microbiologiques par empreintes

.27

Décrochement par frottis

.28

Outils de décrochement

Ecouvillons (différentes « tiges », différents matériaux de prélèvements…)

Coton (Copan)

Rayonne (Copan)

Fibre de Polyester (Texwipe)

Nylon floqué (Quantiswab, Copan)

.29

Outils de décrochement

Mousse Polyester biseautée (Enviro-Swab, 3M)

Eponge (Sponge Stick, 3M)

Chiffonnette (Grosseron)

Efficacité des outils de prélèvements, rôle du matériau

Eponge : test parmi les plus performants quelque soit le matériau

Quantiswab, Enviroswab, chiffonnette performants sur verre et aciers +/- polypropylène

Ecouvillons en rayonne et polyester, voire coton : peu performants même sur acier inoxydable

.30

Outils les plus performants: Résultats les plus élevés sur P. fluorescens et E. coli

Outils les moins performants: Résultats les plus faibles sur P. fluorescens et E. coli

Verre Inox 2R Inox 2B Polyéthylène Polypropylène Téflon

Coton

Rayonne

Polyester

Quantiswab Enviroswab Eponge

Chiffonnette

.31

Intérêts/inconvénients des prélèvements par frottis

Autorisent des analyses ultérieures variées

Facilité de mise en œuvre

Consommables bon marché

Analyse de zones +/- accessibles

Récupération +/- bonne de la souillure (- 1 log / microscopie)

Influence du manipulateur

.32

Méthodes par contact

Outils de détection des souillures microbiologiques par contact

.33

Géloses contact: Pétrifilms™ (Coliformes et

Flore Totale, 3M)

Lames bifaces gélosées (Coliformes et Flore Totale, LiofilChem)

Boîtes contact (Flore Totale, ATL)

Résultats proches pour les 3 méthodes

Outils de détection des souillures microbiologiques par contact

.34

Applicateur (500 g, 10 s)

Boites contact (RODAC, ATL) Gélose présentant ménisque convexe

Reproductibilité de pression et durée => applicateurs

Outils de détection des souillures microbiologiques par contact

.35

PétrifilmTM 3M Double film

• partie inférieure contenant un milieu déshydraté (réhydratation de 30 min à 1-2 h)

• film supérieur quadrillé pour le dénombrement

Reproductibilité de pression et durée => applicateur

Lecteurs automatiques disponibles commercialement

Outils de détection des souillures microbiologiques par contact

.36

Incubateur

Lames gélosées (LiofilChem) Lames biface (milieux différents)

Application manuelle

Outils de détection des souillures microbiologiques par contact

.37

Intérêts / inconvénients

Facilité d’utilisation

Empreinte d’une surface => localisation précise d’une contamination

Consommables bon marché (1-2 €) +/- mini-étuves, applicateurs et portoirs commercialement disponibles

Accessibilité nécessaire • Géométrie • Surfaces plates et lisses [boîtes contact]

Récupération partielle des souillures • Bonne sur surface mouillée, moins bonne parfois sur surface sèche • +/- reproductible [ex : lames gélosées, pas d’applicateur]

Incubation longue (24 h à 72 h) Problème des cellules mortes et VNC, de résidus bactéricides

.38

Méthodes biochimiques

Outils biochimiques

.39

Méthodes par frottement + analyse (Kit)

Principe

Prélèvement par écouvillon et dosage direct (colorimétrique…) • des protéines +/- sucres réducteurs • des sucres • de l’ATP, NADP • de résidus alimentaires

Outils biochimiques

.40

Protéines : Clean-Trace Plus (3M)

Clean-Trace Instant (3M)

Pro-Clean (Hygiena)

Rida et Path-Check (R-Biopharm / Microgen)

Flash (Biocontrol)

.41

Protéines, sucres et lipides : Clean Test (LiofilChem)

Glucose/lactose : Spotcheck Plus (Hygiena)

NAD(P)/NAD(P)H : Speed Check (Ecolab)

Résidus alimentaires : Vericleen (Charm)

EPS sur surfaces d’acier : Biofilm Detector Kit (REALCO)

Outils biochimiques

Bilan efficacité

Spotcheck Plus (lactose /glucose) pas adapté aux biofilms

Vericleen et Flash : les moins performants surtout sur le Polyéthylène

Tests positifs demandant une certaine expertise Clean Trace Instant (3M) : lecture très rapide parfois nécessaire

Biofilm Detector Kit sur acier (REALCO) : étape de « nettoyage » de la surface

ProClean (Hygiena) : tige très souple, prélèvement parfois inférieur à celui des autres kits

.42

- + 1: Témoin (pas de biofilm) 2: Résultat positif orangé 3: Résultat positif violet

1 2 3

Outils biochimiques

Bilan efficacité

Tests positifs, lecture facile :

Speed Check (Ecolab) : changement de couleur très net

Ridacheck, Pathcheck (R-Biopharm / Microgen)

Clean trace Plus (3M), Clean Test (LiofilChem)

.43

Outils biochimiques

Intérêts / inconvénients

Meilleure accessibilité que méthodes par contact

Très rapides (qq secondes à qq minutes)

Très faciles à mettre en œuvre (avec gabarit usage unique [~1 €] ou acier [~25 €])

Sensibilité faible: qq µg qq 10aines µg (selon auteurs)

Influence du manipulateur (pression appliquée, schéma de prélèvement)

Outils biochimiques

.45

Conclusion

Méthodes biochimiques : méthodes rapides, relativement sensibles, bon complément aux méthodes microbiologiques

pour détecter des biofilms sur des surfaces