BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 183

P r e l i m i n a r y N o t e s

PN 61o11

Comportement de la lipase pancr~atique sur Sephadex Application & la purification et it la ddtermination du poids mol~culaire

de cet enzyme

Les techniques', 2 d6crites jusqu'icien vue de la purification de la lipase pancr6atique de porc (glyc6rol ester hydrolase, EC 3.1.1.3) fournissent des quantit6s d'enzyme trop faibles pour aborder des 6tudes de structure. La pr6sente note indique une tech- nique plus satisfaisante utilisant la chromatographie, notamment la chromato- graphie sur Sephadex G-2oo durant laquelle la lipase manifeste un comportement tr~s particulier.

Des homog6nats de pancr6as de porc dans 9 volumes d'eau sont centrifug6s 60 mill ~ IO0 O00 × g. L'extrait limpide est lyophilis6 pour donner une poudre stable enti~rement soluble dans l'eau 3. Un 6chantillon de cette poudre (500 mg) est dissous dans l'eau (5 ml) contenant du D F P IO -4 M et la solution est pr6cipit6e A 0. 5 satn. par (NH4)zSO 4 satur& Apr~s une nouvelle pr6cipitation dans les m6mes conditions, le culot est repris par 5 ml d'une solution 0.75 M en NaC1 et 0.025 M en CaC1 v On obtient ainsi une suspension trouble qu'une centrifugation ~ 25 ooo × g durant 45 min ne parvient pas ~ clarifier. Cette suspension est directement filtr6e A travers

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Fig. I. Chromatographie de la lipase sur Sephadex G-2oo. Colonne (15o × 0.9 cm) de Sephade~ G-2oo. Solution o.75 M e n NaC1 et o.o25 M e n CaCI v Temp. , 4 °. D6bit : i fraction de 1.75 ml/h~ Activit6 lipasique (titrim6trie), trait plein. Prot6ines (Lowry), trait en pointi]M. A gauche, pr6- pa ra t ion (2.5 ml) provenant d'un homog6nat de pancr6as (voir le texte) et contenant 85oo unit6s lipase et 3.o4 o mg de prot6ines par ml (activit6 sp6cifique, 28o). A droite, les fractions d u p i c de lipase du diagramme de gauche sont trait~es par un m61ange 6thanol-oxyde d'6thyle en prdsence de d6soxycholate (volt le texte) et chromatographi6es A nouveau dans les m6mes conditions.

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une colonne de Sephadex G-2oo soigneusement dTsa@r@e et @quilibr@e avec la solution pr@cTdente (diagramme de gauche de la Fig. i).

Le diagramme montre que la lipase provenant des homog@nats de pancr@as se comporte sur Sephadex G-2oo comme une substance de tr~s haut poids mol@culaire (volume d'@mergence (Ve) 29.8 ml; Ve de la ~,-globuline utilisTe par WHITAKER 4 pour mesurer le volume mort des colonnes de Sephadex G-2oo, 33.0 ml). La lipase n'est accompagn@e durant sa migration rapide que par IO~/o des prot@ines des pr@- parations. La purification est donc consid@rable (activit@ spTcifique du pic de la lipase, 3560). Le rendement est excellent (90-95 °/o ). La technique devient pr@parative si l'on utilise des colonnes de 3 cm de diam@tre qui acceptent 20 ml de suspension contenant environ 25 mg de lipase pure.

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Fig. 2. Chroma tog raph ie de la l ipase sur DEAE-cel lu lose . I ,a l ipase "lente" (12o ooounit@s; 25.75 ° m g prot~ines ; act ivi t6 spTcifique, 465 o) es t d issoute dans 8 ml d ' u n t a m p o n p H 8.0 5" IO-a M en Tris et 3" IO-a M e n CaCI2, qui ser t @galement ~, la dia lyse prTalable de l ' enzyme et ~, l 'Tquil ibrage de la colonne (15 × 0.9 cm). E lu t ion pa r u n g rad ien t lin@aire de NaC1 dans le t a m p o n (de o g 0. 3 M ; v o l u m e total , 3oo ml). DTbit, lO. 5 ml /h . Frac t ion , 3.5 ml. Act iv i t6 lipase, t r a i t plein. ProtTines,

t r a i t en pointil]@. Le r e n d e m e n t d'@lution de la l ipase es t supTrieur ~ 75 ~/o.

Toutefois, une migration aussi rapide de la lipase sur Sephadex G-2oo est manifestement anormale. Lorsqu'on chromatographie dans les mTmes conditions du suc pancrTatique de porc ou un extrait aqueux de pancr@atine (pancrTas trait6 l'ac@tone et A l'@ther), l 'enzyme sort apr@s le 2~me volume mort. On peut donc admettre que la lipase provenant des homog@nants est polym@ris@e ou qu'elle a contract6 une association stable avec d'autres mol@cules durant l'homogTnTisation du tissu frais. Dans ce dernier cas, une hypoth@se s@duisante, dont la validit@ reste d'ailleurs ~ dTmontrer, consiste A supposer que les mol@cules en question sont des lipides dont les sucs sont naturellement d@pourvus et que les solvants employ@s au cours de l'obtention de la pancrTatine auraient 61imin@s.

Quoi qu'il en soit, la lipase "rapide" peut 8tre convertie en la forme "lente" par un traitement rTput@ pour son aptitude ~ scinder les lipoprotTines. Les fractions dn pic "rapide" (69 800 unit@s, 19.91o mg de prot@ines dans 20 ml) sont dialys@es une nuit contre de l'eau ~t 2 °, additionn@es de io ml de d@soxycholate de Na ~ 0.5% et 7.5 ml d'oxyde d'@thyle sans peroxydes, puis prTcipit@es A --12 ° par addition d'un @gal volume d'@thanol. Repris par 3 ml du m@lange NaC1-CaC12, le culot donne

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une solution (51 O00 unit6s lipases; lO.62o mg de prot6ines; activit6 sp6cifique, 4800) parfai tement limpide apr&s centrifugation. Une nouvelle chromatographie de la solution sur Sephadex G-2oo (diagramme de droite de la Fig. I) montre que le t ra i tement restitue A la lipase le compor tement apparement normal qu'elle poss~de au sein du suc et des extraits de pancr6atine. L 'enzyme sort maintenant apr~s le 2~me volume mor t de la colonne. Une d6termination approch6e du poids mol6culaire de l ' enzyme "lent" peut ~tre r6alis6e par les techniques de WHITAKER 40U d'IwATSUBO ET CURDEL 5 en utilisant une colonne (155 X 1.2 cm) de Sephadex G-Ioo. La pre- mi&re donne la valeur 37 800 4- 2500. La deuxi~me permet de voir que le Ve de la lipase "lente" (lOO.4 ml) est situ6 entre celui de la pepsine (EC 3.4.4.1 ; Ve, lO7.O ml; poids mol6culaire, 35 500) et celui de la peroxydase (EC 1.11.1.7; Ve, 94.9 ml; poids mol6culaire, 4o 200). Les deux techniques sont donc d 'accord pour a t t r ibuer ~ la lipase tin poids mol6culaire de l 'ordre de 38 ooo.

Cette lipase "lente" est susceptible de subir avec un bon rendement une nouvelle et tr~s sensible purification par chromatographie sur DEAE-ceUulose ~ A p H 8.0 dans un gradient de force ionique (Fig. 2). Apr~s l'~lution d 'un pic plus ou moins impor tan t de prot6ines cationiques, le gradient fait sortir un petit pic anionique con- tenant principalement de l 'amylase, puis le pic de lipase dont les fractions 30-35 renferment 88% de l 'activit6 totale et une activit6 sp6cifique moyenne de 7ooo **

Dans son 6tat actuel, la technique permet de purifier environ 20 mg de lipase en une seule op6ration avec un rendement global d 'environ 350/0 . Des exp6fiences sont en cours pour savoir si les pr6parations obtenues sont r6ellement homog~nes. I1 ne nous a pas 6t6 possible jusqu'ici de confirmer l 'observat ion de BASKYS et al. 2 selon laquelle la DEAE-cellulose inactiverait la lipase par 61imination d 'un cofacteur.

Duran t l 'ex6cution de ce travail, nous avons b6n6fici6 de l 'aide financi~re de la D616gation ~ la Recherche Scientifique (Convention 6 I - F R - I I 3 ) du Nat ional In- s t i tute of Heal th (Grant AM 4642) et de la Fondat ion Rockefeller (Grant R F 62022).

Ins t i tu t de Chimie Biologique, Facultd des Sciences, Marseille (France)

L. SARDA

M. F. MAYLII~ J. ROGER P. DESNUELLE

1 G. MARCHIS-MouREN, L. SARDA ET P. DESNUELLE, Arch. Biochem. Biophys., 83 (1959) 309 • 2 B. BASKYS, E. KLEII~ :ST W. F. LEVER, Arch. Biochem. Biophys.. lO2 (I96~) 2Ol. 8 G. BENZONANA, B. ENTRESSANGLES, G. MARCHIS-MOUREN, L. SARDA ET P. DESNUELLE,Nato's

Conference on The Physiological Significance of Lipids, Cambridge, I963. 4 j . R. WHITAKER, Anal. Chem., 35 (1963) 195o. s M. IWATSUBO ETA. CURDEL, Compt. Rend., 256 (1963) 5224 •

Re~u le 20 Avril, 1964

* D6riv6e d'une autre technique 3 utilisant une 61ution discontinue des colonnes de DEAE- cellulose.

** L'6cart entre cette valeur et ce]le ant6rieurement attribute 1 A la lipase pure (35oo) provient essentiellement d'un choix diff*rent des unit6s lipase et de la prot6ine de r6f6rence de la technique de Lowry. Les unit6s lipase sont maintenant exprim6es en /,equiv/min et par mg de prot6ines. La prot6ine de r6f6rence est la s6rumalbumine de boeuf, fraction V de Cohn (Armour).

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