Composition chimique et activité antibactérienne des ... · Laboratoire de Recherche sur les systèmes biologiques et Géomatiques Laboratoire de biotoxicologie expérimentale,

Département de Biologie

Laboratoire de Recherche sur les systèmes biologiques et Géomatiques

Laboratoire de biotoxicologie expérimentale, de Biodépollution et de phytoremédiation

Thèse de doctorat Es-sciences

Option : Biochimie

Composition chimique et activité antibactérienne des huiles essentielles des feuilles de Glycyrrhiza glabra

Présentée par : Mme CHOUITAH OURIDA

Devant le jury :

Président : Pr. SLIMANI MILOUD (Université d’Oran).

Directeur de thèse :

Pr. MEDDAH BOUMEDIENE (Université de Mascara).

Co-directeur de thèse :

Pr. AOUES ABDELKADER (Université d’Oran).

Examinateurs :

Pr. BELAHCENE MILOUD (Université de Mostaganem).

Pr. BENSOLTANE AHMED (Université d’Oran).

Pr. TIR TOUIL AICHA (Université de Mascara).

2011-2012

« Le don d’une plante utile me paraît plus précieux que la découverte d’une mine d’or, et un monument plus durable qu’une pyramide ».

Bernardin de Saint-Pierre

Voyage à l'Île de France, p. 58,

http://fr.wikipedia.org/wiki/Jacques-Henri_Bernardin_de_Saint-Pierre�

Remerciements

Ce travail de thèse, a été effectué en grande partie au Laboratoire de

Recherches sur les systèmes biologiques et Géomatiques du département

de Biologie , de la Faculté des sciences de l’université des Mascara sous

la direction de Mr le professeur Meddah Boumedienne et, au laboratoire

de biotoxicologie expérimentale, de Biodépollution et de

phytoremédiation sous la direction de Mr

J’exprime ma profonde reconnaissance et toute ma gratitude à monsieur

le professeur Aoues

Abdelkader.

J’exprime aussi mes vifs remerciements à monsieur

les professeurs Meddah Boumedienne et Aoues Abdelkader pour l’aide et

le suivi qu’ils m’ont fournis tout au long de la réalisation de cette thèse.

Leurs conseils et leurs encouragements m’ont permis de mener à bien

cette étude.

le professeur Slimani

Miloud de l’Université d’Es-senia d’Oran qui a consenti à participer à

cette commission et a présidé le jury, qu’il trouve ici toute l’expression de

ma considération.

Mes vifs remerciements vont également à Monsieur le professeur

Bensoltane Ahmed de l’université d’Oran, qui m’a fait l’honneur de

participer à cette commission et d’apporter un regard critique sur ce

travail.

Je suis également très sensible à l’honneur que m’a fait Mme Tir Touil

Aicha Maitre de conférences à l’université de Mascara pour avoir

Accepter de participer à ce jury ; qu’elle trouve ici l’expression de toute

ma gratitude.

Je remercie monsieur le Professeur Belahcene Miloud de l’université de

Mostaganem pour sa participation au jury et lui demande d’accepter toute

ma reconnaissance.

Mes remerciements vont à l’égard du laboratoire d’énergie de Kafur

Sousa à damas pour les réalisations des chromatographies (CPG/SM).

J’adresse aussi mes remerciements les plus vifs à monsieur le professeur

Mashmawi Mahmoud, de la faculté de pharmacie, université de

Mansoura égypt et Monsieur Ibri pour leur l’aïd précieux dans les

méthodes séparations chromatographiques.

Enfin, mes remerciements vont à l’égard de monsieur le professeur

Adnane Ali (Laboratoire de physiologie végétale) de l’université de

damas, pour son accueil dans son laboratoire et son aide.

Table des matières

Introduction 02 1.1-Généralités 07 Partie 1-Recherche Bibliographique 1.2- Histoire de la plantes 07 1.3- Caractéristique de la plante de réglisse 08 1.3-1- Classification botanique 08 1.3.2. Nomination 08 1.3.3 - Botanique et géographie 09 1.3.4- Description botanique 09 1.3.4.1Tige 09 1.3.4.2 les Feuilles 09 1.3.4.3 Les Fleure 09 1.3.4.4 Les racines 09 1.3.4.5 Les Fruit 09 1.3.5- Habitat et origine 10 1.3.6 Les variétés de réglisse 10 1.3.7. Les principaux constituants de la plante de réglisse 10 1.3.7.1-Saponosides triterpéniques 10 1.3.7.2. Flavonoïdes 11 1.3.7.3. Coumarines 11 1.3.7.4. Composés volatils aromatiques 12 1.3.7.5. Saccharides 12 1.3.7.6. Les huiles essentielles 12 1.3.8 Domaines d’utilisation de réglisse 12 1.3.8.1 En médecine 12 1.3.8.2. En agro-alimentaire 13 1.3.8.3. En pharmaceutique 13 1.3.9 Composition chimique de la racine 14 1.3.9. 1 Des coumarines 14 1.3.9.2 Des composes volatils aromatiques 14 1.3.9.3 Des sucres 14 1.3.9.4 Des polysaccharides 14 1.3.9.6 Autres 15 2-Les Huiles essentielles 16 2.1Historique 16 2.2Définition 17 2.3 Répartition, localisation 17 2.4Fonction 18

2.5Le rôle des huiles essentielles chez les plan. 18 2.6 -Propriétés physiques 18 2.7 Techniques d’extraction des huiles essentielles 19

Table des matières

2.7.1 L’extraction proprement dite, appelée hydro-diffusion 20 2.7.2 Distillation 20 2.7.3 L'hydro distillation 20 2.7.4-La distillation à vapeur saturée 21 2.7.5L'hydro diffusion 21 2.7.6. L'expression à froid 22 2.7.7. Extraction par solvants 22 2.7.8. Extraction par les corps gras 23 2.7.9Extraction par micro- ondes 23 2.7.10-extraction par les gaz supercritiques 24 2.8 Composition chimique des huiles essentielles 25 2.8.1. Les terpénoïdes 25 2.8.2 les mon terpène 26 2.8.3 Sesquiterpénes 26 2.8.4Les composés aromatiques 26 2.8.5 Les composés d'origines diverses 26 2.8.6 Les chémotypes 29 2.8.7 Biosynthèse des huiles essentielles 29 2.8.8. Voie des Terpenoïdes 29 2.8.9- Voie des Phenylpropanoïdes 30 2.9 Méthodes d’analyse chimique des huiles essentielles 32 2.9.1 Chromatographie en phase gazeuse monodimensionnelle 32 2.9.2Chromatographie en phase gazeuse couplée à l’olfactométrie 32 2.9.3. Chromatographie en phase gazeuse à deux dimensions 33 2.9.4 Chromatographie à deux dimensions heart-cutting CPG/SM 33 2.9.5. Chromatographie totale CPG-2D 33 2.12.2 Les Facteurs influençant la composition 38 2.12.3 Activités biologiques 39 2.12.4. Les huiles essentielles et leur activité anti-microbienne 40 2.12.5 Le mode d’action antimicrobienne des huiles essentielles 41 2.10. Différentes utilisations des huiles essentielles 42

Table des matières

Partie 2- Matériels et méthodes

45

2.1. Matériel biologique 45

2.4. Récolte et le séchage 46

2.5. Souches microbiennes testé 46

2.6. Extraction des HE. 50

2.7. Détermination du rendement 53

2.8. Indice physico-chimique. 53

2.8.1.2- La densité relative 54 2.8.1.3- L’indice de réfraction 54 2.8.1.4- Le pouvoir rotatoire 55 2.8.1.5- La miscibilité à l’éthanol 56 2.8.1.6- Le point de congélation 56 2.8.2- Propriétés chimiques 57 2.8.2.1- Détermination de l'indice d'acide 57 2.9-Analyse des huiles essentielles 58 2.9.1- Caractérisation et identification des huiles essentielles par CPG/SM 59 2.9.2Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) 59

2.9.3 -Conditions du spectromètre de masse 59 2.9.4-L’identification des constituants 59 2.10-Etude du pouvoir antibactérien des huiles essentielles des feuilles Glycyrrhiza glabra 60

2.10.1-Vérification de la purification des bacteries et identification des souches 60 2.10.1.1 .Identification des bactéries 60 2.10.1.2. Préparation des précultures 60 2.10.1-Méthode d’étude du pouvoir antimicrobien d’huile essentielle 61 2.10.2.Activiterantimicrobienne 61 a/Méthode de diffusion sur disque (aromatogramme) 61

62 b/concentration minimale inhibitrice (CMI)

Table des matières

Partie 3 : Résultats et discussion

64 3. Résultats et discussion 3.1. Rendement en huile essentielle des feuilles de réglisse 3.2. Indices physicochimique des huiles essentielles

65 65

3.2.1. Résultats des analyses physicochimiques 65 3.2.2. Analyse des huiles essentielle 66 3.2.3. Chromatographe d’huile essentielle des feuillets de 68

Glycyrhiza glabra 3.3.Etude du pouvoir antibactérien de l’huile essentielle de 87

glychrrhiza glabra 3.3 .1. Identification des bactéries 87 3.4. L’évaluation de l’activité antibactérienne des huiles essentielles Conclusion et perspectives.

90 98

102 Références bibliographiques 120 ANNEXES 132 Publication

Liste des figures

Figure 1 : la plante de réglisse 8

Figures 2 : Les grappes de réglisse à deux stades de maturation 9

Figure 3 : Le système racinaire de reglisse 10

Figure 4 : Les gousses et graines de réglisse 10

Figure 5 : Structure chimique de l’acide glycyrrhizique 11 Figure 6:Exemple de structures de monoterpènes acyclique et cycliques rencontrer dans les huiles essentielles

28

Figure 7 : Voies responsables de la synthèse de terpènes et

phenylpropenes, les principaux métabolites présents dans les huiles

31

essentielles des plantes

Figure 8: La plante de réglisse de la région Jdiouya de

Rélizane(Algerie).

46

Figure 9: carte géographique de la région de Djidiouia Relizane 49 Figure 10: Différentes étapes d’extraction des huiles essentielles des feuilles de Glycyrrhiza glabra

52

Figure 11 : Profile chromatographique de huiles essentielle des

feuilles de

68

Glycyrhiza glabra

Figure 12:spectre de masse du composant linalool d’huile

essentielle des feuilles de glycyrrhiza glabra

71

Figure 13 : spectre de masse du composant trans-Permethrin

de huile essentielle des feuilles de glycyrrhiza glabra

73

Figure 14:spectre de masse du composant Aspartic acid de huile


74

Figure 75 15 :spectre de masse du composant Bicyclo[4.1.0]hept-2-

ene, 3,7,7-trimethyl-de huile essentielle des feuilles de glycyrrhiza

glabra

Figure 75 16:spectre de masse du composant Le benzène de huile


Figure 17:spectre de masse du composant 2-Propenenitrile, 2-

methyl de huile essentielle des feuilles de glycyrrhiza glabra

76

Figure 18:spectre de masse du composant prasterone de huile


77

Figure 19:spectre de masse du composant Isoniazide 78 , de huile


Figure 20:spectre de masse du composant L’acide 79 benzoïque de

huile essentielle des feuilles de glycyrrhiza glabra

Figure 21:spectre de masse du composant le diethyltoluamide de


80

Figure 22 :spectre de masse du composant EThylenimine de huile


81

Figure 23:spectre de masse du composant Le wafarin 82 de huile


Figure 24:spectre de masse du composant L’iodoquinol 82 de huile


Figure 25:spectre de masse du composant Phenol, 2-methoxy-4-(1-

propenyl)-, (E)de huile essentielle des feuilles de glycyrrhiza glabra

83

Figure 26:spectre de masse du composant Le retinol 83 de huile


Figure 27:spectre de masse du composant Phenol, 4-(2-

aminopropyl)- de huile essentielle des feuilles de glycyrrhiza glabra

84

Figure 28:spectre de masse du composant Pyridinamine de huile


84

Figure 29 :spectre de masse du composant 3-Cyclohexen-1-ol, 4-

methyl-1-(1-methylethyl de huile essentielle des feuilles de

glycyrrhiza glabra

85

Figure 30:spectre de masse du composant Pyrazine, 1,4-dioxide de


86

Figure 31:spectre de masse du composant Hydrochlorothiazide de


86

,Figure 32: spectre de masse du composant Methacrylonitrile de


86

Figure 33: Ensemble schématique de certains des mécanismes

de l'activité antimicrobienne des huiles essentielles dans la

cellule bactérienne

94

Liste des Tableaux

Tableau 1 : lieu de récolte de la plantes et Les caractéristiques géographiques et bioclimatiques de la zone de récoltes 48

Tableau 2 : liste des souches microbiennes testées 50

Tableau 3: Composition Physico-chimique d’ huile essentielle de

Glycyrrhiza glabra 65

Tableau 4: Les composants majeurs identifiés huile essentielle de

Glycyrrhiza glabra par GC / MS technique avec les indices de rétention sur HP-

5ms

Tableau 5: Etude des caractères morphologiques et type respiratoire des

différentes souches 87

capillaire 69

Tableau 6: identification des entérobactéries et Pseudomonas aeruginosa par

Tableau 7: identification de staphylococcus aureus par plaque API STAPH 89

API20E 88

Tableau 8: Zone Inhibition (mm) and MIC (µg/mL) pour les huiles

essentielles de

Glycyrrhiza glabra 90

Liste des photos

Photo 1 : Evaluation de l’activité antimicrobienne des Huiles Essentielles

de la réglisse contre pseudomonas Aeruginosa selon la méthode

d’aromatogramme……………………………………………………...123


de la réglisse contre salmonella typhi selon la méthode

d’aromatogramme……………………………....................................124


de la réglisse contre Staphylococcus aureus selon la méthode

d’aromatogramme…………………………………………………….124

Photo4 : Evaluation de l’activité antimicrobienne des Huiles Essentielles

de la réglisse contre d’Escherichia

Photo 5 : Evaluation de l’activité antimicrobienne des Huiles essentielles

de la réglisse contre

coli ATCC 25922 selon la méthode

d’aromatogramme…………………………………………………….125

d’Escherichia

coli ATCC35218 selon la méthode

d’aromatogramme……………………………………………………..125

VII

Liste des abréviations

ATTC : American type culture collection

CPG : Chromatographie en phase gazeuse

CPG-SM : Chromatographie en phase gazeuse couplé à la spectrométrie de masse

AFNOR : Association Française de normalisation

CMI : Concentration minimale inhibitrice

FID : Détecteur à ionisation de flamme

µl : microlitre

g : Gramme

IA :

I

Indice d’acide

R :

HE : Huile essentielle

Indice de réfraction

min : Minutes

µl : Microlitre

mm : Millimètre

nm : Nanomètre

mg : Milligramme

OMS: Organisation Mondial de santé

h : Heure

N : Normalité

pH : Potentiel hydrogénique

R : Rendement

V : Volume

°C : Degré Celsius

% : Pourcentage

Introduction

2

Les plantes ont toujours fait partie de la vie quotidienne de l’Homme,

puisqu’il s’en sert pour se nourrir, se soigner et parfois dans ses rites religieux.

L’histoire des plantes aromatiques et médicinales est associée à l’évolution des

civilisations. Dans toutes les régions du monde, l’histoire des peuples montre que

ces plantes ont toujours occupé une place importante en médecine, dans la

composition des parfums et dans les préparations culinaires. La Chine, berceau de la

phytothérapie, l’Inde,le Moyen–Orient, notamment au cours de l’ère arabo-

musulmane, l’Egypte, la Grèce, Rome, constituent des civilisations phares chez

lesquelles les plantes aromatiques et médicinales ont occupé une place de premier

choix.

L’extraction des plantes médicinales est une pratique basée sur les avancées

et les preuves scientifiques qui recherchent des extraits actifs des plantes. Les

extraits actifs identifiés sont standardisés.Cette pratique conduit aux

phytomédicaments et selon la réglementation en vigueur dans le pays, leur

circulation est soumise à l'autorisation de mise sur le marché pour les produits finis,

et à la réglementation sur les matières premières à usage pharmaceutique pour les

préparations magistrales de plantes médicinales,celles-ci étant délivrées

exclusivement en officine.On parle alors de pharmacognosie ou de biologie

pharmaceutique. (Azalenko K. 2005)

Mais, les plantes médicinales sont faiblement utilisées dans le traitement de

certaines affections, bien qu'elles aient fait leurs preuves dans le passé où nos

grands-parents les utilisaient presque exclusivement pour leurs vertus curatives.

Selon l'OMS, la phytothérapie est considérée comme une médecine

traditionnelle et est encore massivement employée dans certains pays , dont les

pays en voie de développement. C'est une médecine non conventionnelle du fait de

l'absence d'étude clinique (Azalenko K. 2005).Le retour, et pour cause, vers la

phytothérapie est aujourd’hui une démarche planétaire.

http://fr.wikipedia.org/wiki/Pharmacognosie�

http://fr.wikipedia.org/wiki/Organisation_mondiale_de_la_sant%C3%A9�

http://fr.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9decine_traditionnelle�



http://fr.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9decine_non_conventionnelle�

http://fr.wikipedia.org/wiki/%C3%89tude_clinique�

Introduction

3

En effet, la chimiothérapie dominante jusqu’ alors, a atteint ses limites au vu

de l’incertitude de ses bienfaits, de ses effets secondaires, et de son inadaptabilité à

la physiologie humaine.

Selon ARMRLIN (1974), La phytothérapie ou thérapie par les plantes est la

première thérapeutique connue ; elle reste la base de l’ensemble de la thérapeutique

utilisée de nos jours. En phytothérapie et en aromathérapie, les huiles essentielles

sont utilisées dans le traitement de nombreuses maladies infectieuses et sont aussi

utilisées dans les préparations pharmaceutiques.L’effet antimicrobien marqué de

certaines essences sur le développement des micro-organismes a été démontré.

L’activité antimicrobienne des huiles essentielles sur une large catégorie de micro-

organismes a été rapportée par une bibliographie internationale abondante. Ainsi, les

chercheurs se sont intéressés à tester le pouvoir antimicrobien des huile essentielles

de certaines plantes aromatiques sur les bactéries, les levures et les moisissures.Les

résultats ont montré que le pouvoir antimicrobien des plantes aromatiques est du en

totalité ou en partie aux essences qu’elles contiennent (Akgul et Kivanc, 1988 ).

Les huiles essentielles sont très efficaces sur les germes résistants aux

antibiotiques; ce qui leur donne une place parmi les moyens thérapeutiques pour

guérir, atténuer ou prévenir les maladies et les infections (Buehbauer et Jirovetz,

1994).

Les perspectives d’application sont nombreuses comme, par exemple, le

traitement des affections bactériennes et fongiques de la cavité buccale (Shapiro et

al, 1994) et du système respiratoire (Inouye et aI, 2001).Ces auteurs ont demontré

que les huiles essentielles de thym, d’écorce de cannelle, de lemongrass, de périlla

et de menthe poivrée se sont révélées très efficaces sur les principaux germes

pathogènes,responsables des infections respiratoires, notamment Streptococcus

pneumoneae, Streptococcus pyogenes et Staphylococcus aureus les plus étudiés

sont l’inhibition des germes.

Introduction

4

Les huiles essentielles s’opposent au développement des germes tels que les

bactéries pathogènes, y compris les souches habituellement antibiorésistantes, les

champignons responsables de mycoses et les levures (Candida) dont, les doses

actives sont en général faibles et se traduisent soit par l’inhibition de la croissance

des micro-organismes soit par un effet létal (Bruneton, 1993 ; Crémieux, 1990).

En outre, des études récentes ont montré que certaines huiles essentielles possèdent

des propriétés antivirales (Bammi et al, 1997) et antiparasitaires (Larhsini et al

1999).

Se trouvant dans le bassin méditerranéen avec de grandes variations climatiques

du Nord au Sud, l’Algérie présente un terrain de prédilection au développement de

ces cultures. La culture des plantes aromatiques et médicinales en Algérie reste

traditionnelle. Elle se limite aux jardins familiaux et aux jardins d'agrément,

notamment avec des espèces florales faisant l'objet de cultures de fleurs. La

valorisation de ces ressources naturelles peut avoir des retombées économiques

considérables pour notre pays. Récemment des projets de production des plantes

aromatiques et médicinales ont vu le jour et sont essentiellement orientés vers

l’exportation des plantes fraîches, d’huile essentielle et d’huile concrète.

Dans le but de continuer à exploiter les plantes poussant en Algérie et réputées

pour leurs vertus médicinales, nous avons étudié les propriétés physico-chimiques et

la composition chimique des huiles essentielles de Glycyrrhiza glabra ainsi que

l’étude de leur pouvoir antibactérien .Pour ce faire, nous avons subdivisé notre

travail de recherche en trois chapitres : Le premier chapitre consiste en une

synthèse bibliographique sur la plante de Glycyrrhiza glabra, les huiles essentielles

avec leur utilisation.

Dans le deuxième chapitre nous avons évoqué les principales techniques

d’analyse des huiles essentielles.Le dernier chapitre portera sur le pouvoir

antimicrobien des huiles essentielles, et son utilisation.

Introduction

5

La deuxième partie représente la partie expérimentale où nous présenterons les

techniques utilisées:

-Extraction des huiles essentielles de Glycyrrhiza glabra par l’hydrodistillation.

-Détermination de quelques caractéristiques physico-chimiques, organoleptiques

et de la composition chimique de l’huile essentielle, par méthodes

chromatographiques.

-le deuxième axe consiste à déterminer l’effet antibactérien des huiles essentielles.

Enfin les résultats obtenus des caractéristiques physico chimiques ; de la

composition de l’huile essentielle des feuilles de Glycyrrhiza glabra et leurs

activités antibactériennes sont interprétés à la lumière de la littérature. Le travail est

clôturé par une conclusion et des perspectives.

Recherche bibliographique

7

1.1. Généralités :

Glycyrrhiza : La Réglisse officinale .Légumineuses Papilionacées, tire son nom de

deux mots grecs « Glucus » doux et « riza » racine ; elle possède plusieurs

synonymes : Réglisse glabre, Bois doux, Racine douce, Racine bonne, Racine

sucrée.Il en existe plusieurs espèces (Truelle, 2009).

La Réglisse a longtemps été utilisée à des fins à la fois culinaire et médicale.

Utilisée pour aromatiser les bonbons et les édulcorants remèdes médicaux, la

réglisse a également des effets puissants, en particulier pour les ulcères et les

insuffisances rénales.La Réglisse entière est utilisée pour des cas d’insuffisances

surrénales et d'inflammation.Une autre forme plus largement utilisée est le

deglycyrrhizinated qui est aussi efficace que la Réglisse entière dans le traitement

d’ulcère, mais sans effets secondaires hypertensifs. (Gaby,1988)

1.2. Histoire de la plante

La réglisse était connue des Grecs et des Romains, de Théophraste et de Sainte

Hildegarde, qui l'employaient notamment pour éclaircir la voix. Mélangée à du

chiendent, elle entrait dans la composition de la boisson dite "hospitalière", qui se

trouvait jadis sur les tables de chevet dans tous les hôpitaux. En 1950, on a démontré

son effet bénéfique sur l'estomac, et elle a été utilisée dans les cas d'ulcères et de

gastrites (Afchar, 1987).

En médecine populaire, la racine jaunâtre de réglisse était utilisée pour ses vertus

adoucissantes, digestives et rafraîchissantes. Il est cependant signalé que l’abus de la

réglisse provoque de l’hypertension artérielle, la substance qui en est responsable est

l’acide glycyrrhizique (Baba Aissa, 2000). (Voir Figure 1).


8

Figure 1 : la plante de réglisse algérienne (Teman, 2008).

1.3. Caractéristique de la plante de réglisse :

1.3.1. Classification botanique

Famille:légumineuse.

Sous famille:papilionacées.

Genre:glycyrrhiza.

Espèce:glabra L.

1.3.2. Nomination :

Nom scientifique:glycyrrhiza glabra.

Nom local:arqessous.

Nom Français:réglisse.

Nom Anglais:liquorice root (Sihem Ben Khemis

,2007)

http://www.google.fr/search?hl=fr&sa=G&tbo=1&tbm=bks&tbm=bks&q=inauthor:%22Sihem+Ben+Khemis%22&ei=6L2hTuD4EoWN-wbB7-WHBQ&ved=0CDgQ9Ag�


9

1.3.3.Botanique et géographie :

Elle est indigène dans le Midi de l’Europe, notamment dans la Sicile, l’Espagne,

etc.: ou d'Asie mineure (Biovhard, 1988).

1.3.4.Description botanique:

Plante herbacée, vivace par un rhizome stolonifère, sauvage ou cultivée elle

possède:

1.3.4.1. Les Tiges:annuelles presque ligneuses, pouvant atteindre 1 m.Bien dressées,

rigides et creuses.

1.3.4.2. Les Feuilles:alternes, glabres, composées d'un nombre impair de folioles (à

4-7 paires de folioles ovales lancéolées), sont ovales, bien vertes et plutôt

visqueuses sur leur face interne (Henry, 1991).

1.3.4.3. Les Fleurs : petites, violettes ou bleu pâle apparaissent de Juin à Juillet,

groupées en épis. Disposées en grappes pédonculées, atteignant la moitié de la

longueur des feuilles. (Figure 2).

Figures 2 : Les grappes de réglisse à deux stades de maturation (Teman, 2008)


10

1.3.4.4. Les racines: vivaces rampantes, atteignant 1 à 2 m. brunes à l’extérieur,

jaunes à l’intérieur, à saveur sucrée et agréable (Voir Figure 3).

Figure 3 : Le système racinaire de reglisse (Teman, 2008).

1.3.4.5 .Les Fruits: gousse très aplatie, glabre, bosselée. (Voir Figure 4).

Figure 4 : Les gousses et graines de réglisse (Teman, 2008).


11

1.3.5. Habitat et origine

La réglisse est une plante originaire de Chine, mais cultivée surtout dans un large

bassin méditerranéen, elle est cultivée en Espagne depuis le Xème siècle et en Italie

depuis le XIIIème siècle.La réglisse se naturalise rarement.Le principal exportateur

de racines est actuellement la Turquie; pour la poudre, c'est la Chine.L’Italie les

transforme en rubans et pastilles (Henry, 1991).

1.3.6. Les variétés de réglisse :

• Glycyrrhiza glabra (var-typica) : de la région méditerranéenne à

l’Afghanistan (Wichtl et Anton, 2003)

•Glycyrrhiza glabra (var-violacea) : principalement de l’Iran (Loic, 2001).

•Glycyrrhiza glabra (var-glandulifera) : d’Europe de l’Est et de Russie

(Wichtl et Anton, 2003).

•Glycyrrhiza foetida Desf : dans la Mitidja et dans les wilayas d'Ain Defla

et d’Oran (Djerroumi et Nacef, 2004).

1.3.7. Les principaux constituants de la plante de réglisse :

1.3.7.1.Saponosides triterpéniques :

Principalement la glycyrrhizine, dénommée aussi « acide glycyrrhizique » et un

mélange de sels de potassium et de calcium correspondants.

La glycyrrhizine possède un pouvoir sucrant 50 fois supérieures à celui du sucre de

canne (Pedneault et al, 2001) (Figure 5).


12

Figure 5 : Structure chimique de l’acide glycyrrhizique (Loic, 2001).

1.3.7.2. Flavonoïdes :

Les flavonoïdes sont des pigments jaunes ; ce sont des composés phénoliques

fréquemment présents sous la forme hétérosidique, hydrosoluble (Andrew, 2001).

Représenté environ 0.65-2%,dont plus de 30 ont été identifiés :chalcone,

l’isoliquiritigènine….etc.

Les flavonoïdes isolés peuvent être utilisés dans un traitement adjuvant des ulcères

gastriques ou plus simplement pour calmer les douleurs de l’estomac (Loic, 2001).

1.3.7.3. Coumarines :

C’est des Ombelliférone, herniarine et posés prénylés comme la glycycoumarine,

licopyranocoumarine (Wichtl et Anton, 2003).

1.3.7.4. Composés volatils aromatiques:

Dont plus de 40 constituants ont été identifiés : anéthol, estragole, géraniol, acide

aliphatiques, aldéhydes, cétones, alcools et hydrocarbures (Wichtl et Anton, 2003).


13

1.3.7.5. Saccharides:

Le sucre est un produit alimentaire d’origine végétale composé pour l’essentiel de

saccharose et de diverses substances naturelles appartenant à la classe des glucides,

responsable d’une des quatre saveurs gustatives fondamentales ; parmi les sucres on

cite le glucose, le saccharose, l’amidon (Meyer, 1989).

1.3.7.6. Les huiles essentielles :

Les huiles essentielles sont des substances huileuses, volatiles et odorantes,

présentes dans les plantes aromatiques et localisées, dans les fleurs, les feuilles, les

fruits, les graines, l’écorce, les racines (Meyer, 1989).

1.3.8. Domaines d’utilisation de réglisse :

1.3.8.1. En médecine:

Utilisée conjointement avec du miel, elle traite les estomacs et rates faibles, les

douleurs de ventre, les selles molles, la fatigue et la fièvre, la toux, les palpitations

(Shaohoa, 1994).

Utilisée crue, elle traite les gorges douloureuses et gonflées, les ulcères d’estomac,

les abcès et élimine les toxines alimentaires et médicamenteuses (Shaohoa , 1994).

1.3.8.2. En agro-alimentaire:

Le suc de réglisse est également employé en confiserie pour la fabrication des

pastilles, de bâtonnets et de rubans noirs enroulés, souvent associé à la gomme

arabique (Baba aissa, 2000).

On fabrique un extrait aqueux, concentré par évaporation ce qui a pour effet

d’éliminer la majeure partie des arômes (Baba aissa, 2000).


14

1.3.8.3. En pharmaceutique:

L’action adoucissante de la réglisse est causée principalement par la glycyrrhizine.

Cette substance est aussi responsable de ses propriétés antitussives et expectorantes,

car elle accélère les secrétions de la muqueuse trachéale.

L’extrait aqueux ou alcoolique de la réglisse réduit les sécrétions gastriques, et

inhibe l’ulcère gastrique causé par d’autres produits ou médicaments acides tel que

l’aspirine.

La glycyrrhizine et son aglycone ont des activités antiphlogistiques, et augmentent

la sécrétion muqueuse par les cellules de la muqueuse gastrique.

Les mécanismes de ces effets se traduisent par l’accélération de l’excrétion de la

mucine qui induit l’augmentation de la synthèse glycoprotéine de vie des cellules

épithéliales et aussi la protection contre l’activité des pepsines.

Il a été démontré que l’activité spasmytique de la réglisse est due principalement

aux flavonoïdes de la réglisse.

La glycyrrhizine réduit l’action toxique de la tétrachloride de carbone et de la

galactosamine.

L’effet anti-inflammatoire et antiallergique de la réglisse est attribué à l’action de la

glycyrrhizine qui a la même activité que les corticoïdes (Monder et al, 1989).

Les racines et les rhizomes de réglisse ont des propriétés physiologiques complexes

provenant des différents principes actifs qui ont été isolés et dont la structure

chimique et les actions thérapeutiques sont aujourd’hui bien connues.

(HORNOK, 1992).

1.3.9. Composition chimique de la racine :Au total, environ 400 constituants

ont été décrits pour Glycyrrhiza glabra L. mais les activités biologiques ne

concernent qu’environ un quart d’entre eux. Les flavonoides tel que : liquiritine,


15

liquiritigénine, isoliquiritine et isoliquiritigénine, dérivés coumariniques: herniarine

et umbelliférone. Glycosides: liquiritoside et isoliquiritoside.L'ensemble de ces

substances participerait à l'activité anti-ulcéreuse.

1.3.9. 1. Des coumarines:

Se sont des licocoumarone varient en plusieurs types : ombelliferone, herniarine,

licobenzofurane et kaempferol 3-O-methyl ether (HATANO, 1989).

1.3.9.2. Des composés volatils aromatiques:

Plus de 40 ont été identifiés: anethol, estragole, eugenol, carvacrol, fenchone,

guaiacol, geraniol, linalol, pcymene, thujone, thymol, α-terpineol ; les 3 premiers

étant à l’origine des arômes de la racine, avec l’indole et la γ-nonalactone. Sont

présents également des acides aliphatiques (acides benzoique, caproique, linoleique,

palmitique, propionique, salicylique), des aldehydes (benzaldehyde, furfural), des

cétones, des esters, des éthers, des alcools et des hydrocarbures (TANG et al, 1992).

1.3.9.3. Des sucres :

Glucose (jusqu’à 4%), fructose, maltose, saccharose (2,4-6,5%).

1.3.9.4. Des polysaccharides:le glycyrrhizane est un polysaccharide

essentiellement composé d’arabinose (54%) et de galactose (30%). Sont présents

également 2 autres polysaccharides. Ces deux

Polysaccharides ont respectivement un effet immunomodulateur et mitogéne. Parmi

ces polysaccharides, nous trouvons 25 à 30% d’amidon et 2,5% de saccharose

(Fintelmann et al, 2004).

1.3.9.5. Des stérols : β-sitosterol, stigmasterol.

1.3.9.6 .Autres : acides aminés, gommes, résines, graisses (0,8%), substances

amères (Tang et al, 1992).


16

2-Les Huiles essentielles :

2.1. Historique :

Les huiles sont connues depuis des millénaires pour leur action bénéfique sur

l’homme. Quatre mille ans avant J.C, les égyptiens utilisaient déjà les huiles comme

parfum dans les momifications des corps. Il faudra attendre le XVI éme siècle pour

voir apparaitre la généralisation de la production et de l’utilisation des huiles

essentielles, grâce aux travaux sur les huiles essentielles de romarin, de bois de

genièvre, de lavande (Lamaty et al ;1997)

Selon Ntezurubanza (2000), l'histoire de l'aromathérapie, qui est celle des huiles

essentielles, peut se résumer en quatre époques suivantes :

L’époque au cours de laquelle étaient utilisées des plantes aromatiques telles

quelles ou sous forme d'infusion ou de décoctions :

Celle dans laquelle les plantes aromatiques étaient brûlées ou mises à infuser ou à

macérer dans une huile végétale. A cette époque, intervient la notion d'activité liée à

la substance odorante.

La troisième correspond à la recherche de l'extraction de cette substance odorante.

Apparaît alors le concept d’huile essentielle qui aboutit à la création et au

développement de la distillation :

Enfin, la dernière qui est la période moderne dans laquelle la connaissance des

composants des huiles essentielles intervient et explique les effets physiques,

chimiques, biochimiques, physiologiques, voire électroniques des arômes végétaux.

Enfin, la valeur médicinale des plantes est de plus en plus prouvée

scientifiquement; c'est ce qui constitue d'ailleurs un argument de taille pour leur

usage en médecine.


17

2.2. Définition des Huiles essentielles: Plusieurs définitions disponibles d'une

huile essentielle convergent sur le fait que les huiles essentielles, communément

appelées «essences »,sont des produits de composition généralement assez

complexe, renfermant les principes odorants volatils contenus dans les végétaux.

Elles diffèrent des huiles fixes (huile d'olive,...) et des graisses végétales par leur

caractère volatil ainsi que leur composition chimique. (Balz, 1986).

Le terme huile essentielle est le parfum des plantes aromatiques.Elle s’appelle

aussi " essence" ou" huile volatile", qui est un produit de composition généralement

assez complexe renfermant les principes volatils contenus dans les végétaux et plus

ou moins modifiés au cours de la préparation (Bruneton ,1999).

Plus récemment,la norme AFNOR NF T 75-006 5FEVRIER 1998 a donné la

définition suivante d’une huile essentielle : « produit obtenu à partir d’une matière

première végétale soit par entrainement à la vapeur soit par procédés mécaniques à

partir de l’épicarpe des citrus soit par distillation sèche .L’huile essentielle est

ensuite séparée de la phase aqueuse par des procédés physiques pour les deux

premiers modes d’obtention.Elle peut subir des traitements physiques n’entrainant

pas de changement significatif de sa composition (Bruneton, 2008 ).

2.3. Répartition, localisation :

Les huiles essentielles n’existent quasiment que chez les végétaux supérieurs.Il y

aurait ,selon Lawrence17500 espèces aromatiques. Les genres capables d’élaborer

les constituants qui composent les huiles essentielles sont repartis dans un nombre

limité de familles :Myrtacées,lauracées,rutacées ,lamiacées, astéracées; opiacée

;cupressacées , zingibéracées ,pipéracées …etc.

Les huiles essentielles peuvent être stockées dans tous les organes végétaux:des

fleurs ,des feuilles ,des écorces ,des bois , des racines,et des rhizomes .

Dans le cas le plus simple, les huiles essentielles se forment dans le cytosol des

cellules où, soit elles se rassemblent en gouttelettes comme la plupart des substances


18

lipophiles, soit elles s’accumulent dans les vacuoles des cellules épidermiques ou

des cellules du mésophile de nombreux pétales ( Gehard ;1993).D’autre structures

histologiques spécialisées souvent localisées sur ou à proximité de la surface de la

plante sont impliquées dans l’accumulation des huiles volatiles.Ces structures

regroupent les poils et canaux secteurs et les poches sécrétrices(Bruneton ,1999 ).

2.4. Fonction :

La fonction biologique des térpenoides des huiles essentielles demeure le plus

souvent obscure .Il est toutefois vraisemblable qu’ils ont un rôle écologique .A

l’appui de cette hypothèse, on remarquera que le rôle de certains d’entre eux a été

établi expérimentalement aussi bien dans le domaine des interactions végétales

comme agents idiopathiques, notamment inhibiteurs de germination, que dans celui

des interactions végétales –animales contre les insectes et les champignons.

(Bruneton, 2008).

2.5. Le rôle des huiles essentielles chez les plantes:

Les huiles essentielles permettent aux plantes de s’adapter à leur environnement et

assurer leur ultime défense, elles jouent plusieurs rôles écologiques :

Interaction plante- plante (inhibition de la germination et de la croissance)

Interaction plante animale, pour leur protection contre les prédateurs.

(Fouché et al. 2008).

2.6. Propriétés physiques:

Liquides à température ambiante, les huiles essentielles sont volatiles, ce qui les

différencie des huiles fixes. Elles ne sont que très rarement colorées .Leur densité

est en général inferieure à celle de l’eau. Elles ont un indice de réfraction élevé et la

plupart dévie la lumière polarisée. Solubles dans les solvants organiques usuels,

elles sont liposolubles. (Bruneton, 2008).


19

2.7. Techniques d’extraction des huiles essentielles :

L’analyse des huiles essentielles émises par une plante se déroule en trois étapes ;

extraction des composés aromatiques, analyse de l’extrait et traitement des résultats

pour identifier et quantifier les composés. Les composés organiques volatils sont

généralement présents dans les matrices végétales à de très faibles concentrations, et

sont de polarités, solubilités, volatilités et stabilités très variables. Les molécules

odorantes sont constituées d’un squelette hydrocarboné qui peut être linéaire,

cyclique ou aromatique. Presque toutes les fonctions chimiques portées par ces

chaînes sont représentées:alcools,composés carbonylés(principalement les

aldéhydes), esters, éthers, phénols et enfin dérivés soufrés et hétérocycles.

Les huiles essentielles sont extraites principalement par deux méthodes de

distillation, une méthode d’expression à froid et l’entraînement à la vapeur de

l’eau : L’hydro distillation.

Elles peuvent être mises en œuvre sur les systèmes discontinus ou continus, à la

pression ambiante, en surpression ou en dépression (Pollien, 1998).

La durée de la distillation peut être ramenée de quelques minutes jusqu’à 30 heures,

on davantage, suivant les paramètres intervenant au cours du procédé.

Avant d’aborder chacune des méthodes, il est intéressant de procéder à l’étude des

paramètres régissant les mécanismes d’extraction des huiles essentielles. D’une

façon générale, la production des huiles essentielles peut être assimilée à une

combinaison de trois processus :

2.7.1. L’extraction proprement dite, appelée hydro-diffusion :

Ces relargage des composés volatils dans le milieu aqueux sous l’action physique

qu’exerce le gonflement de la matière végétale (phénomènes d’absorption d’eau ou

osmotiques) via la pression interne,et de l’action chimique exercée par l’eau.


20

(Pollien,1998).La séparation de l’huile essentielle des condensats impliquant la

coalescence et la décantation (Mazza et al ,1992).

2.7.2. Distillation :

La plupart des huiles essentielles sont obtenues par distillation et entrainement à la

vapeur d’eau, à l’exception des huiles essentielles d’hespéridés (citron, oranges) et

l’huile de cade .On admet que la vapeur pénètre dans les tissus de la plante et

vaporise toutes les substances volatiles ; isolement des essences de la plante

démontrant donc uniquement une quantité suffisante de vapeur.

La distillation par entrainement à la vapeur d’eau par divers procèdes physiques et

chimiques.

2.7.3. L'hydro distillation:

Le principe de l'hydro distillation est celui de la distillation des mélanges binaires

non miscibles. Elle consiste à immerger la biomasse végétale dans un alambic

rempli d'eau, que l'on porte ensuite à ébullition. La vapeur d'eau et l'essence libérée

par le matériel végétal forment un mélange non miscible. Les composants d'un tel

mélange se comportent comme si chacun était tout seul à la température du

mélange, c'est à dire que la pression partielle de la vapeur d'un composant est égale

à la pression de vapeur du corps pur.Cette méthode est simple dans son principe et

ne nécessite pas un appareillage coûteux.Cependant, à cause de l'eau, de l'acidité, de

la température du milieu, il peut se produire des réactions d'hydrolyse, de

réarrangement, de racémisation, d'oxydation, d'isomérisation, etc. qui peuvent très

sensiblement conduire à une dénaturation (Bruneton, 1993).

L'entraînement à la vapeur d'eau:

Les méthodes d'extraction par l'entraînement à la vapeur d'eau sont basées sur le fait

que la plupart des composés volatils contenus dans les végétaux sont entraînables

par la vapeur d'eau, du fait de leur point d'ébullition relativement bas et de leur


21

caractère hydrophobe.Sous l'action de la vapeur d'eau introduite ou formée dans

l'extracteur, l'essence se libère du tissu végétal et est entraînée par la vapeur d'eau.

Le mélange de vapeurs est condensé sur une surface froide et l'huile essentielle se

sépare par décantation (Afnor, 2000).En fonction de sa densité, elle peut être

recueillie à deux niveaux:

-niveau supérieur du distillat, si elle est plus légère que l'eau, ce qui est fréquent ;

- niveau inférieur, si elle est plus dense que l'eau.

Les principales variantes de l'extraction par l'entraînement à la vapeur d'eau sont

l'hydro distillation, la distillation à vapeur saturée et l'hydro diffusion (Teuscher et

al, 2005).

2.7.4. La distillation à vapeur saturée:

Dans cette variante, la matière végétale n'est pas en contact avec l'eau. La vapeur

d'eau est injectée au travers de la masse végétale disposée sur des plaques perforées.

La distillation à vapeur saturée est la méthode la plus utilisée à l'heure actuelle dans

l'industrie pour l'obtention des huiles essentielles à partir de plantes aromatiques ou

médicinales. En général, elle est pratiquée à la pression atmosphérique ou à son

voisinage et à 100°C, température d'ébullition de l'eau. Son avantage est que les

altérations de l'huile essentielle recueillie sont minimisées(Wichtl et Anton,

2003).Pour certaines productions (lavande, menthe), on utilise des alambics

mobiles qui sont en fait des bennes de récolte conçues pour être intercalées par

l’agriculteur lui –même , après remplissage ,dans un montage de distillation .

(Bruneton,2008 ).

2.7.5. L’hydrodiffusion:

Elle consiste à pulvériser de la vapeur d'eau à travers la masse végétale, du haut vers

le bas. Ainsi le flux de vapeur traversant la biomasse végétale est descendant

contrairement aux techniques classiques de distillation dont le flux de vapeur est


22

ascendant. L'avantage de cette technique est traduit par l'amélioration qualitative et

quantitative de l'huile récoltée, l'économie de temps,de vapeur et d'énergie

(Bassereau, 2007).

2.7.6. L'expression à froid:

L'extraction par expression à froid, est souvent utilisée pour extraire les huiles

essentielles des agrumes comme le citron, l'orange, la mandarine, etc. Son principe

consiste à rompre mécaniquement les poches à essences.L'huile essentielle est

séparée par décantation ou centrifugation.D'autres machines rompent les poches par

dépression et recueillent directement l'huile essentielle, ce qui évite les dégradations

liées à l'action de l'eau (Chaintreau et al, 2003).

2.7.7. Extraction par solvants:

La méthode de cette extraction est basée sur le fait que les essences aromatiques

sont solubles dans la plupart des solvants organiques.L'extraction se fait dans des

extracteurs de construction variée, en continu, semi-continu ou en discontinu.Le

procédé consiste à épuiser le matériel végétal par un solvant à bas point d'ébullition

qui par la suite, sera éliminé par distillation sous pression réduite.L'évaporation du

solvant donne un mélange odorant de consistance pâteuse dont l'huile est extraite

par l'alcool. L'extraction par les solvants est très coûteuse à cause du prix de

l'équipement et de la grande consommation des solvants.Un autre désavantage de

cette extraction par les solvants est leur manque de sélectivité de ce fait de

nombreuses substances lipophiles (huiles fixes, phospholipides, caroténoïdes, cires,

coumarines, etc.)peuvent se retrouver dans le mélange pâteux et imposer une

purification ultérieure (Shellie et al, 2004).

Le choix du solvant est influencé par des paramètres techniques et économiques.

Le Pouvoir du solvant à l’égard des constituants odorants (la stabilité, inertie

chimique, température d’ébullition) pour permettre son élimination totale, pas trop


23

faible pour éviter les pertes et donc une élévation des couts, sécurité de

manipulation.

Les solvants les plus utilisés sous réserve de législations restrictives particulières.

Ce sont les hydrocarbures aliphatiques : éther de pétrole, hexane, propane ou butane

liquides, après l’extraction le solvant est distillé en fin de l’opération.

Si l’utilisation de solvants à bas point d’ébullition évite les dégradations induites par

la présence d’eau et par les pH acides. Diverses modifications ne demeurent

néanmoins possibles avec des solvants comme l’acétone ou comme les alcools

quoique dans ce dernier cas des traces d’éthers éthyliques ne sont pas toujours

nuisibles aux qualités olfactives du produit final.

2.7.8. Extraction par les corps gras:

La méthode d'extraction par les corps gras est utilisée en fleurage dans le traitement

des parties fragiles de plantes telles que les fleurs, qui sont très sensibles à l'action

de la température. Elle met à profit la liposolubilité des composants odorants des

végétaux dans les corps gras. Le principe consiste à mettre les fleurs en contact d'un

corps gras pour le saturer en essence végétale.Le produit obtenu est une pommade

florale qui est ensuite épuisée par un solvant qu'on élimine sous pression réduite.

Dans cette technique, on peut distinguer l'enfleurage où la saturation se fait par

diffusion à la température ambiante des arômes vers le corps gras et la digestion qui

se pratique à chaud, par immersion des organes végétaux dans le corps gras

(Cordero et al., 2007).

2.7.9. Extraction par micro- ondes :

Le procédé d'extraction par micro-ondes appelé:Vacuum Microwave Hydro

distillation (VMHD), consiste à extraire l'huile essentielle à l'aide d'un rayonnement

micro-ondes d'énergie constante et d'une séquence de mise sous vide.Seule l'eau de

constitution de la matière végétale traitée entre dans le processus d'extraction des

essences.Sous l'effet conjugué du chauffage sélectif des micro-ondes et de la


24

pression réduite de façon séquentielle dans l'enceinte de l'extraction,l'eau de

constitution de la matière végétale fraîche entre brutalement en ébullition.Le

contenu des cellules est donc plus aisément transféré vers l'extérieur du tissu

biologique, et l'essence est alors mise en œuvre par la condensation, le

refroidissement des vapeurs et puis la décantation des condensats.

2.7.10. Extraction par les gaz supercritiques :

Au –delà du point critique, un fluide peut avoir la densité d’un liquide et la viscosité

d’un gaz ,d’où une bonne difusibilité dans les solides et un bon pouvoir solvant .Si

plusieurs gaz peuvent en théorie être utilisés, l’intérêt s’est porté initialement sur le

dioxyde de carbone ,ce qui s’explique si l’on considére ses atouts:produit

naturel,inerte chimiquement ,ininflammable ,strictement atoxique ,facile à éliminer

totalement ,sélectif ,aisément disponible ,peu réactif chimiquement et peu couteux.

Si les contraintes technologiques sont loin d’être négligeables (point critique se

situe à P =73.8 bars et T= 31.10C) les avantages sont nombreux : capacité à fournir

des extraits de composition très proche de celle des produits naturels, possibilité de

faire varier la sélectivité, la viscosité en jouant sur la température et la pression,

absence d’hydrolyse et de réarrangements. (Bruneston, 2008)

Le dioxyde de carbone refroidi et comprimé à une pression inférieure à la pression

critique passe à l’état liquide.Il est comprimé puis chauffé à une pression et

température fixées selon la nature de l’extrait voulu(huiles essentielles et oléorésine)

le fluide traverse ensuite la cuve d’extraction où se trouve le matériel végétal, le

CO2 supercritique chargé en solutés est ensuite d’étendu au dessous de la pression

critique avant d’entrer dans le séparateur et passer à l’état gazeux .Il perd ainsi ses

propriétés de solvant et permet aux solutés de précipiter et d’être récupérées le CO2

peut être alors recyclé ou éliminé.Cette technique assure l’obtention d’extrait non

hydrolysés, oxydés ou estérifiés et du fait que la température critique du CO2 est

37 0C, les risques de dégradation thermique sont éliminés.La pression critique est

facilement atteinte dans une opération de production. (Reverchon ,1997).


25

Cette technique n’est pas facilement recommandée pour le matériel végétal donnant

un produit à faible valeur ou avec un rendement faible (Benjilali et al ,2004).

Avec le procédé il est possible d’effectuer une extraction sélective de Produit

chimiques.Il est important de préciser que ce procédé est le seul procédé connu qui

permet la migration de composantes désirées hors de leur matrice .ceci résulte de

l’application de l’énergie de façon sélective à l’intérieur de la matrice ; les procédés

conventionnels d’hydrodistillation d’extraction par solvant chaud , soxhlet ...etc.

sont fondés sur un mécanisme commun soit le transfert aléatoire d’énergie au

contenant et à l’entourage de la matrice .Les rendements et la qualité de l’huile

essentielle obtenue suite à l’extraction par micro-ondes se sont souvent avérés

supérieurs à ceux des méthodes conventionnelles .La stabilité des extraits produits

par le procédé assisté par micro-ondes était également supérieure à tous les extraits

obtenus par les autres méthodes . (Benjilali et al,2004)

2.8. Composition chimique des huiles essentielles:

L'étude de la composition chimique des huiles essentielles révèle qu'il s'agit de

mélanges complexes et variables de constituants appartenant exclusivement à deux

groupes caractérisés par des origines biogénétiques distinctes : les terpénoïdes et les

composés aromatiques dérivés du phenylpropane (Gildo, 2006).

2.8.1. Les terpénoïdes :

Le terme terpène rappelle la toute première extraction de ce type de composé dans

l'essence de térébenthine.Dans le cas des huiles essentielles, seuls les terpènes les

plus volatils, c'est à dire, ceux dont la masse moléculaire n'est pas élevée sont

observés. Ils répondent dans la plupart de cas à la formule générale (C5H8) n. Les

constituants des huiles essentielles sont très variés .On y trouve en plus de terpènes,

des hydrocarbures, des esters, des lactones, des aldéhydes, des alcools, des acides,

des cétones, des phénols, des oxydes et autres (Seenivasan, 2006).


26

2.8.2. Les monoterpènes:

Les carbures sont presque toujours présent .ils peuvent être acycliques

(terpinene,cyméne )ou bi cycliques pinène camphéne ,sabinene ).Ils constituent

parfois plus de 90 % de l’huile essentielle (citrus ,térébenthines) (Bruneton, 2008).

2.8.3 . Sesquiterpénes:

Les Sesquiterpènes sont de structures très diverses (C15) : les carbures, les alcools

et les cétones sont les plus fréquents (Bruneton ,2008).

2.8.4. Les composés aromatiques :

Contrairement aux dérivés terpéniques, les composés aromatiques sont moins

fréquents dans les huiles essentielles. Très souvent, il s'agit d'allyle et de

propénylphénol. Ces composés aromatiques constituent un ensemble important car

ils sont généralement responsables des caractères organoleptiques des huiles

essentielles.Nous pouvons citer en exemple l'eugénol qui est responsable de l'odeur

du clou du girofle (Kunle et okogum, 2003).

2.8.5. Les composés d'origines diverses :

Compte tenu de leur mode d'extraction, les huiles essentielles peuvent renfermer

divers composés aliphatiques,généralement de faible masse moléculaire,

entraînables lors de l'hydro distillation.Ces produits peuvent être azotés ou soufrés

(Inouye et Abe ,2003).

-Alcools : menthol, géraniol, linalool,...

-Aldéhydes : géranial, citronellal,...

-Cétones : camphre, pipéritone

-Phénols: thymol, carvacrol ...

-Esters : acétate de géranyle,...


27

Acides : acide géranique,...

Oxydes : 1,8-cinéole,...

Phénylpropanoïdes ; eugénol.

Terpènes : limonène, para-cymène,...

Autres : éthers, composés soufrés, composés azotés, sesquiterpène,... (Inouye et

abe,2003).


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Figure 6:Exemple de structures de monoterpènes acycliques et cycliques

rencontrés dans les huiles essentielles ( Bruneton,2000).


29

2.8.6. Les chémotypes

La connaissance des chémotypes d'une huile essentielle et leur comportement sont

fondamentaux car ils permettent d'envisager l'activité pharmacologique, de prévoir

aussi la pharmacocinétique et la biodisponibilité. Pour une même espèce botanique,

la composition chimique de l'huile essentielle n'est pas immuable. Les huiles

essentielles sont élaborées par les plantes aromatiques au sein des cellules

sécrétrices. Leur élaboration est totalement tributaire du rayonnement solaire en

l'absence duquel le rendement en produits aromatiques et leur nature sont affectés.

En sa présence, et tout particulièrement en fonction de la présence de tel ou tel

rayonnement, les types de composants pourront varier considérablement au sein

d'une même espèce. Par exemple, le basilic cultivé en pleine lumière à Madagascar a

un taux de chavicol de 57% alors que la même plante cultivée à l'abri de la lumière

en contient 74% (Franchomme et Penoël , 1990). Cette variabilité peut être

influencée également par la composition du sol et la position géographique; le

Lippiamutiflora récoltée au Togo a révélé les chémotypes à citral, à thymol (acétate

de thymyle), à para-cymène, à 1 -8 cinéole (Inouye et Abe ,2003).

2.8.7. Biosynthèse des huiles essentielles:

La biosynthèse des huiles essentielles se fait suivant deux principales voies

(Helander et al ,1998).

2.8.8. Voie des Terpenoïdes:

Le matériau de base est l'IPP (isopentylpyrophosohate), molécule à cinq atomes de

carbones ayant une structure semi- alvéolaire. Il est dérivé de l'AcétylCoA

(carrefour important), lui-même issu du PEP (phosphoenolpyrivate) provenant

directement du fructose. La construction des squelettes hydrocarbonés a lieu de la

même manière par la juxtaposition "tête à queue" d'unités isopréniques, unités

pentacarbonés ramifiées assemblées enzymatiquement. Ainsi on trouve des

squelettes hydrocarbonés à dix carbones (monoterpènes), puis à quinze carbones


30

(sesquiterpènes) et plus rarement, à vingt carbones (diterpènes). Le processus peut

se poursuivre mais dans d'autres buts que la synthèse des essences (Hammer et al,

2003).

2.8.9. Voie des Phenylpropanoïdes:

La synthèse des huiles essentielles par la voie des phenylpropanoïdes: commence

par un métabolite du fructose, le PEP (phosphoenolpyrivate). Elle aboutit à un très

grand nombre de substances aromatiques, via une série d'acides, dont l'acide

shikimique (d'où son nom, voie shikimique) et l'acide cinnamique. Les métabolites

terminaux, importants en thérapeutique, sont les acides aromatiques suivants: acide

salicylique, cinnamique et benzoïque et leurs esters dont le salicylate de méthyle, les

cinnamates, les benzoates, certains phénols (eugénol) ainsi que les coumarines,...

Quelques grandes familles chimiques de molécules non volatiles, comme les

tannoïdes et les flavonoïdes, se trouvent incluses dans cette voie (Faleiro et al

,2003).


31

Figure 7 : Voies responsables de la synthèse de terpènes et phenylpropenes, les principaux métabolites présents dans les huiles essentielles des plantes (Benchaar et Greatherd,

2011).


32

2.9. Méthodes d’analyse chimique des huiles essentielles :

Une fois l’extrait le plus représentatif obtenu, l’analyse permet d’identifier et de

quantifier les produits qui le composent. Les progrès des méthodes analytiques

permettent d’identifier rapidement un très grand nombre de constituants. (Arpino et

al, 1995).

2.9.1 .Chromatographie en phase gazeuse monodimensionnelle :

La séparation et l’identification des constituants volatils d’un extrait présentent bien

moins d’alternatives que sa préparation. En effet, la CPG est la méthode de

référence dans l’analyse des huiles essentielles (Lehotay et Hajslova, 2002) elle

permet l’analyse de mélanges, qui peuvent être très complexes, de nature et de

volatilité très variées (Arpino et al., 1995).

2.9.2. Chromatographie en phase gazeuse couplée à l’olfactométrie (CPG/O) :

Les huiles essentielles obtenues renferment très souvent des centaines de composés

volatils. Le couplage CPG/O combine la séparation des composés volatils par CPG

avec l’évaluation olfactive. En sortie de colonne, une partie des composés élués est

envoyée vers un cône de détection nasale qui permet l’évaluation olfactive en même

temps que l’enregistrement du chromatogramme. Tous les types de détecteurs

peuvent être utilisés en parallèle au port d’olfaction, mais ce sont les détecteurs FID

ou de masse qui sont les plus fréquemment utilisés. Afin d’éviter l’inconfort dû aux

effluents chauds et la déshydratation de la muqueuse nasale qui conduit à une perte

de sensibilité, de l’air humide est ajouté en sortie de cône. L’opérateur enregistre ses

données olfactives grâce à divers dispositifs de saisie reliés à un ordinateur. La

CPG/O trouve de nombreuses applications tant en Recherche et Développement

qu’en Contrôle de Qualité.

En effet, un certain nombre de composés à odeurs négatives ne sont pas détectés

par les instruments classiques. Dans ce cas, la CPG/O est un moyen très efficace

pour les mettre en évidence grâce au faible seuil de perception du nez humain. Deux


33

types de données peuvent être obtenus lors d’une analyse CPG/O. Tout d’abord la

sensation perçue par l’évaluateur qui est décrite à l’aide d’un descripteur et

l’intensité de la perception. (Dugo et al, 2005).

2.9.3. Chromatographie en phase gazeuse à deux dimensions:

La chromatographie bidimensionnelle consiste à coupler deux colonnes de polarités

différentes pour avoir une séparation parfaite. Cette méthode est appliquée aux

mélanges complexes présentant de nombreuses Co-élutions.

Parmi les méthodes de chromatographie à deux dimensions, on distingue la méthode

dite par piégeage « heart-cutting », notée CPGCPG, de la chromatographie totale,

notée GC×GC (Dugo et al, 2005).

2.9.4. Chromatographie à deux dimensions heart-cutting CPG/SM :

La CPG-CPG était la première méthode de chromatographie bidimensionnelle.

Cette méthode consiste à sélectionner une fraction du chromatogramme qui est mal

résolue sur la première colonne pour la séparer sur la seconde colonne. Cette

méthode consiste à utiliser deux colonnes, deux détecteurs et un système de

piégeage, à dimensions classiques. La seconde colonne est alors polaire , mais bien

plus courte et de plus faible diamètre pour permettre une élution rapide. Il est

également fréquent d’utiliser une colonne chirale comme seconde colonne. Les deux

colonnes peuvent être placées dans le même four ou non. Le piégeage d’une fraction

à la sortie de la première colonne se fait le plus souvent à l’aide d’une trappe

cryogénique. Elle permet de stocker les composés élués de la fraction jusqu’à ce que

la seconde colonne soit disponible pour l’analyse (Dunn et al, 2004).

2.9.5. Chromatographie totale CPG-2D :

La chromatographie totale, ou Chromatographie compréhensive GC×GC, permet

d’étudier tous les composés élués de la première colonne sur la seconde, non pas

comme la CPG-CPG où une fraction subit une séparation sur la deuxième colonne.


34

Elle a pour principe l’injection continue de petites fractions éluées de la première

colonne dans la seconde (Venkatramani, 2005). Tout comme dans la CPG-CPG,

on utilise deux colonnes de polarités différentes, la seconde ayant une dimension

beaucoup plus faible (0,5 à 1,5 m, diamètre interne compris entre 0,1 et 0,25 mm,

épaisseur de film de 0,1 μm).

Ainsi, les différentes fractions sont analysées et conduisent chacune à de petits

chromatogrammes. L’ensemble des chromatogrammes enregistrés au cours de

l’analyse est représenté dans un diagramme à deux dimensions, communément

nommé contour plot, sur lequel l’abondance des composés détectés est traduite par

des couleurs variables. À l’heure actuelle, le seul détecteur de masse parfaitement

adapté au couplage à la CPG-2D est le détecteur de masse à temps de vol

(GC×GC/TOF-MS). Ce spectromètre possède la vitesse d’acquisition des spectres

(> 500 Hz), autorisant l’enregistrement de 10 à 20 spectres par pic, nécessaire au

couplage à la CPG-2D.

Les huiles essentielles possèdent de nombreuses activités biologiques. En

phytothérapie, elles sont utilisées pour leurs propriétés antiseptiques contre les

maladies infectieuses d’origine bactérienne. Cependant, elles possèdent également,

des propriétés cytotoxiques qui les rapprochent donc des antiseptiques et des

désinfectants en tant qu’agents antimicrobiens.

Dans des préparations pharmaceutiques, les terpènes phénoliques, comme le thymol

et le carvacrol, sont souvent utilisés comme antiseptiques antibactériens et

antifongiques. Le thymol est très irritant, astringent et caustique. Dans les domaines

phytosanitaires et agro-alimentaires, les huiles essentielles ou leurs composés actifs

pourraient également être employés comme agents de protection contre les

champignons phytopathogènes et les microorganismes envahissant les denrées

alimentaires. Les huiles essentielles les plus étudiées dans la littérature pour leurs

propriétés antibactériennes et antifongiques appartiennent à la famille des

Lamiacées : thym, origan, lavande, menthe, romarin, sauge...etc(Dunn et al, 2004).


35

2.10. Phénomènes physico-chimiques et facteurs produisant l’altération

des huiles essentielles :

Au cours de l’hydro-distillation, le milieu aqueux possédant un pH compris entre 4

et 4.5, atteint occasionnellement des valeurs inférieures à 4 pour certains fruits. Les

constituants de l’essence native sont soumis aux effets combinés de l’acidité et de la

chaleur, et peuvent subir des conversions chimiques (Morin et al, 1985).

L’huile essentielle récupérée est un produit qui diffère sensiblement de l’essence

originelle, d’autant plus que l’ébullition est longue et le pH faible.

La matière chimique présente dans le végétal fait l’objet de réactions chimiques

diverses : hydrolyses, déprotonations, hydratations et cyclisations pouvant être

catalysées par des métaux présents à l’état de traces dans la plante, provoquant des

transformations chimiques des constituants (Koedam, 1982).

L’hydrolyse d’esters est souvent la première réaction qui se produit durant le

chauffage du végétal. Elle conduit à la formation d’acides organiques qui à leur

tour catalysent les réactions de cyclisation et de déshydratation.

La dégradation du sabinène donne un exemple des transformations chimiques de

l’huile essentielle lors de l’hydro-distillation. Les fréquentes modifications

chimiques du sabinène ont été étudiées par Koedam et al. (Koedam et al, 1980).

Divers auteurs ont confirmé ce résultat et montré que le réarrangement du sabinène

produit en plus du terpinèn-4-ol, de l’α-terpinène, du γ -terpinène, et du terpinolène,

préconisent de maintenir le pH proche de la neutralité et de minimiser la durée

d’hydro-distillation, quand bien même il est connu que la dégradation de la matière

végétale induit la formation d’un milieu acide fortement tamponné. (Koedam et al,

1980).


36

En résumé, parmi les constituants sujets aux artefacts, les auteurs signalent

particulièrement : les mono-terpènes (mono et bi-cycliques), les alcools mono-

terpéniques, les aminoacides soufrés et les oxydes sesquiterpéniques .

Les étapes successives conduisant à l’isolement d’une essence et les diverses

transformations susceptibles de l’accompagner se traduisent par la modification de

la teneur en certains constituants ou par la formation de nouveaux composés, d’où

une grande variabilité de sa composition. De profondes modifications de l’huile

essentielle peuvent intervenir lors de l’exploitation des végétaux depuis leur collecte

jusqu’à leur transformation industrielle. La période de récolte, les conditions de

transport, de séchage et de stockage peuvent engendrer des dégradations

enzymatiques. Les changements les plus importants interviennent lors de l’hydro-

distillation sous l’influence des conditions opératoires, notamment du milieu (pH,

température) et de la durée d’extraction. D’autres facteurs tels que les traitements

survenus avant ou pendant l’hydro-distillation (broyage, dilacération, dégradation

chimique, pression, agitation) contribuent à la variation du rendement et de la

qualité de l’huile essentielle. Les variations de la composition des huiles essentielles

provenant d’un même phénotype se développant dans le même environnement sont

l’expression de différences génotypiques. Elles peuvent être attribuées à des

hybridations, à un polymorphisme génétique ou à des mutations. (Koedam, 1982).

2.11. Différentes utilisations des huiles essentielles:

Outre l'emploi strictement médical des huiles essentielles, celles-ci sont utilisées

dans de nombreux domaines tels que la parfumerie, la cosmétologie, l'agro-

alimentaire et l'industrie chimique. Deux industries se partagent ce marché mondial

florissant ; il s'agit de l'industrie agroalimentaire et la parfumerie. Les huiles

essentielles interviennent dans la fabrication :

-Des produits alimentaires: jus de fruits, crèmes glacées, bonbons, etc.,

-De tabac pour cigarettes,


37

-Des produits d'hygiène et de beauté,

-Des parfums, la désinfection des locaux (elles sont antiseptiques),

-Des colles et vernis dans l'industrie chimique.

Les huiles essentielles sont utilisées également pour leurs différentes propriétés et

effets thérapeutiques divers (Anton et al, 2006), tels que les effets anti-infectieux.

Parmi ces molécules antibactériennes les plus puissantes, nous pouvons citer: le

Cavacol, le Thymol et l'Eugénol, le Géraniol, le Linalool, Térpineol menthol, etc.

Cette activité antivirale se retrouve surtout dans les huiles essentielles contenant des

cétones, des monoterpenols ou certains aldéhydes ; des effets calmants et

antispasmodiques; les aldéhydes (citral de la verveine,...), les esters (salicylate de

méthyle,...) ; des effets antiparasitaires; surtout les phénols ; des effets anti-

inflammatoires; selon le type de douleurs, on peut utiliser les esters, des alcools

(menthol) ou des aldéhydes (cuminal).

Les huiles essentielles possèdent aussi des propriétés antioxydants expectorantes,

diurétiques, antifongiques. Ces dernières propriétés sont illustrées par Kosh

Komba , 2004 dans son travail sur les huiles essentielles des espèces d'eucalyptus

du campus universitaire de Lomé.

Les huiles essentielles sont de même utilisées pour traiter des aphtes, gingivites et

maux de gorge en faisant les gargarismes et les bains de bouche. Le massage aux

huiles essentielles constitue un traitement curatif puissant, stimulant et relaxant. Les

huiles essentielles sont incorporées dans les crèmes, les lotions, gels et

shampooings. Les huiles essentielles possèdent également des propriétés

insecticides et insectifuges : c'est le cas de l'huile essentielle de Cymbopogons

choenanthus, un biopesticide efficace contre collasobruchus maculatus F., prédateur

de niébé (Oussalah , 2007).

L'huile essentielle de Bétulalenta (betula aleghaniensis), composée de 98,5% de

salicylate de méthyle naturel est très recherchée pour son excellente activité


38

antirhumatismale (Belanger et al, 2004). Certaines huiles sont recherchées pour

leurs propriétés particulières. C'est le cas de :

L’huile de cyprès, connue pour ses exceptionnelles qualités comme tonique de la

circulation veineuse ; l’huile essentielle de Artemisia dracunculus, connue pour ses

propriétés, antispasmodiques, antivirales et antiallergiques ;

- l'huile essentielle de romarin, régénérateur hépatique et draineur de la bile. Elle est

utilisée en cas d'affections hépatiques et biliaires. Elle est aussi cicatrisante,

bactéricide, utilisée aussi pour les soins de la peau et l'eczéma ;

L’huile essentielle de Thymus vulagaris à linalool, excellent antibactérien, anti-

infectieux, stimulant immunitaire et tonique cutané. Soulignons également que cette

espèce possède plusieurs chémotypes à propriétés pharmacologiques intéressantes.

Les huiles demeurent un réservoir potentiel de matières actives de soins naturels et

une chance pour la médecine (Azalenko, 2005).

2.12.2 .Les Facteurs influençant la composition:

La composition chimique et le rendement en huiles essentielles varient suivant

diverses conditions : L'environnement climatique, la localisation, le génotype,

l’origine géographique, la période de récolte, le séchage, le lieu de séchage, la

température et durée de séchage, les parasites, les virus et mauvaises herbes

(Svoboda et Hampson, 1999)

C'est ainsi que l'action des huiles est le résultat de l'effet combiné de leurs composés

actifs et inactifs, ces derniers (composés inactifs) pourraient influencer la

disponibilité biologique des composés actifs et plusieurs composants actifs

pourraient avoir un effet synergique (Azalenko, 2005).Ajouter à la complexité

d'huiles volatiles (Svoboda et Hampson, 1999). Les proportions des différents

constituants d'une huile essentielle peuvent varier de façon importante tout au long

du développement, aussi les chimiotypes ou races chimiques sont très fréquents


39

chez les plantes aromatiques ; exemple : on compte pour Thymus vulgaris; espèce

morphologiquement homogène sept chimiotypes différents (Bruneton, 1999).

Les conditions principales requises pour une production rentable en huile essentielle

sont: bon matériel végétal, variété de la plante, le sol, équipement de distillation, le

climat.

2.12.3. Activités biologiques:

- Les huiles sont employées pour leur saveur et odeur en industrie des produits

naturels et en industrie des parfums (Smallfield, 2001).

- Les huiles des propriétés antiseptiques pour les poumons (Eucalyptus), dépuratives

ou cicatrisantes (Lavande) (Gaillard, 2003), activité analgésique (Origan, Thym)

(Pedneault et al, 2001).

- Activité antimicrobienne et antiparasitaire : terpénes ou terpénoïdes ont des effets

contre les bactéries, les mycètes, les virus et les protozoaires. En 1977,il a été

signalé que 60% des dérivés des huiles essentielles examinées jusqu'en 1999 sont

inhibiteurs de mycètes tandis que 30% inhibent les bactéries. Le triterpénoide,

l'acide betulinique est de juste l’un des nombreux terpénoïdes qui ont montré une

action inhibitrice envers HIV. Le mécanisme de l'action des terpénes n'est pas

entièrement compris mais on pense qu'il s'agit de la rupture de la membrane par les

composés lipophiles (Cowan, 1999).

Le carvacrol, thymol, possède une activité antibactérienne, activité antifongique

contre les mycètes phytopathogéne (Schwämmle et al, 2001), également l'huile

essentielle de la Menthe pouliot dont le composé majoritaire est le Pulégone (82%)

est dotée d'un fort pouvoir antifongique contre Pénicillium et Mucor .Le nérolidol,

un sesquiterpene actif de la plante de l’Amazone Viola surinamensis possède une

activité antimalaria, prouvé par les études de (Lopes et al. 1999), dont l'huile

essentielle cause l'inhibition à 100% du développement de l'agent infectieux, cette

activité est liée à l'inhibition de la biosynthèse des glycoprotéines.


40

Chez Inula helenium, l'alantolactone et son isomère sont les constituants majeurs de

l'huile essentielle et ont des propriétés antibactériennes notamment contre

mycobacterium tuberculosis, anti-protozoaires contre Entamoeba histolytica, qui

cause des amibiases et antifongiques contre des pathogènes opportunistes comme

certains dermatophytes (Pedneault et al, 2001).

Activité antioxydante : la capacité antioxydante de l'huile volatile est étroitement

liée à tout le contenu phénol (Stefanovits-Bânyai et al, 2003).

Le carvacrol est un des composants principaux des huiles essentielles de certaines

labiaceae (lamiaceae), comme l’origan, thym dont la teneur peut atteindre jusqu'à

86%. L'activité antioxydante de ces herbes est dû au carvacroL ,thymol et un autre

phénol ; ceci a été confirmé par un certain nombre de travaux. Jukie et Milos

(2005) ont montré dans une étude portant sur l'huile essentielle de Thymus (Thymus

vulgarae L.), que les chemotypes phénoliques (thymol et carvacrol) et non

phénoliques (linalool) sont capables de réduire le radical 2,2'-diphenyl-l-

picrylhydrazyl, avec un effet plus élevé enregistré pour les chemotypes phénoliques.

Ces observations, l'ont expliqué par la concentration élevée de thymol et carvacrol

dans ces derniers.

2.12.4. Les huiles essentielles et leur activité anti-microbienne:

L’objectif principal de cette partie est la présentation de l’action antimicrobienne

des huiles essentielles, des mécanismes d’action de ces composés sur les

microorganismes et de certains facteurs déterminant cette activité. Les huiles

essentielles ou les volatiles, sont des liquides aromatiques obtenus à partir de

différentes parties de plantes (fleurs, bourgeons, graines, feuilles, brindilles, écorce,

fruits, herbes et bois) le plus souvent par la méthode de distillation à la vapeur

d’eau.


41

Les terpénoïdes et les phénylpropanoïdes constituent les composants actifs les plus

importants des huiles essentielles, dont les mono- et sesquiterpénoïdes forment la

majeure partie (Calsamiglia et al, 2007).

Les huiles essentielles peuvent comporter plus de soixante composants différents

dont le composant majeur peut constituer plus de 85% (Bauer et al, 2001).

2.12.5. Le mode d’action antimicrobienne des huiles essentielles:

Du fait de la variabilité des quantités et des profils des composants des HES, il est

probable que leur activité antimicrobienne ne soit pas attribuable à un mécanisme

unique, mais à plusieurs sites d’action au niveau cellulaire (Carson et al, 2002). De

façon générale, il a été observé une diversité d’actions toxiques des huiles

essentielles sur les bactéries comme la perturbation de la membrane cytoplasmique,

la perturbation de la force motrice de proton, fuite d'électron et la coagulation du

contenu protéique des cellules .Le mode d’action des huiles essentielles dépend en

premier lieu du type et des caractéristiques des composants actifs, en particulier leur

propriété hydrophobe qui leur permet de pénétrer dans la double couche

phospholipidique de la membrane de la cellule bactérienne. Cela peut induire un

changement de conformation de la membrane, une perturbation chémo-osmotique et

une fuite d’ions (K+): ce mécanisme a été observé avec l’huile de l’arbre à thé sur

les bactéries Gram+ (Staphylococcus aureus) et Gram -(E. coli) et levure (Candida

albicans) in vitro (Carson et al., 2002).

Certains composés phénoliques des huiles essentielles interfèrent avec les protéines

de la membrane des micro-organismes comme l’enzyme ATP ase, soit par action

directe sur la partie hydrophobe de la protéine, soit en interférant dans la

translocation des protons dans la membrane prévenant la phosphorylation de l’ADP

Les Huiles essentielles peuvent inhiber la synthèse de DNA, RNA, des protéines et

des polysaccharides inhibition de la décarboxylation des acides aminés chez

Entérobactéries.


42

Les études sur les mécanismes d’action de cette activité sont en nombre négligeable.

Jusqu’à présent, il n’existe pas d’étude pouvant nous donner une idée claire et

précise sur le mode d’action des HE. Etant donné la complexité de leur composition

chimique, tout laisse à penser que ce mode d’action est assez complexe et difficile à

cerner du point de vue moléculaire. Il est très probable que chacun des constituants

des huiles essentielles a son propre mécanisme d’action ; d’une manière générale,

leur action se déroule en trois phases :

* attaque de la paroi bactérienne par l’huile essentielle, provoquant une

augmentation de la perméabilité puis la perte des constituants cellulaires.

* acidification de l’intérieur de la cellule, bloquant la production de l’énergie

cellulaire et la synthèse des composants de structure.

* destruction du matériel génétique, conduisant à la mort de la bactérie

Le mode d’action des huiles essentielles dépend aussi du type de microorganismes:

en général, les bactéries Gram négatives (Sikkema et al, 1995).

2.12. Huiles essentielles comme agents antimicrobiens :

Depuis l’Antiquité, les extraits aromatiques des plantes ont été utilisés dans

différentes formulations, comme pour les médicaments et la parfumerie (Heath,

1981).

Les huiles essentielles ont été considérées comme les agents antimicrobiens les plus

efficaces présents dans ces plantes. Les qualités antimicrobiennes des plantes

aromatiques et médicinales sont connues depuis l’antiquité. Toutefois, il aura fallu

attendre le début du XXème siècle pour que les scientifiques commencent à s’y

intéresser. Ces propriétés antimicrobiennes sont dues à la fraction des huiles

essentielles contenue dans les plantes. Il existe aujourd’hui approximativement 3000

huiles, dont environ 300 sont réellement commercialisées, destinées principalement

à l’industrie des arômes et des parfums. Mais la tendance actuelle des


43

consommateurs à rechercher une alimentation plus naturelle, a entraîné un regain

d’intérêt des scientifiques pour ces substances (Essawi et al, 2000).

Depuis deux décennies, des études ont été menées sur le développement de

nouvelles applications et l’exploitation des propriétés naturelles des huiles

essentielles dans le domaine alimentaire. Les effets antimicrobiens de différentes

espèces d’herbes et d’épices sont connus depuis longtemps et mis à profit pour

augmenter la durée de vie des aliments.

Ainsi, les huiles essentielles, actuellement employées comme arômes alimentaires

sont également connues pour posséder des activités antimicrobiennes et pourraient

donc servir d’agents de conservations alimentaires, ou approuvés comme additifs

alimentaires par la Food and Drug Administration. Ils n’ont, par conséquent, pas

besoin d’autorisation d’emploi dans les aliments ; cependant, des études préalables

sont nécessaires afin de mieux cerner leur activité antimicrobienne. Les huiles

essentielles ont un spectre d’action très large puisqu’elles inhibent aussi bien la

croissance des bactéries que celle des moisissures et des levures. Leur activité

antimicrobienne est principalement fonction de leur composition chimique, et en

particulier de la nature de leurs composés volatils majeurs (Sipailiene et al, 2006).

Elles agissent en empêchant la multiplication des bactéries, leur sporulation et la

synthèse de leurs toxines. Pour les levures, elles agissent sur la biomasse et la

production des pseudo-mycéliums alors qu’elles inhibent la germination des spores,

l’élongation du mycélium, la sporulation et la production de toxines chez les

moisissures.

Matériels et méthodes

45

2-Materiel et méthodes: Ce présent travail a pour objectif, la valorisation des feuilles de l’espèce

Glycyrrhiza glabra (L) qui pousse à l’état spontané dans la région Jdiouya de

Relizane (carte ci jointe de la région d’etude).Il a été realisé au laboratoire de

recherche sur les systèmes biologiques et Géomatiques (LRSBG) de la faculter

des sciences de l’université de Mascara.

Dans cette partie expérimentale nous avons présenté les deux axes de recherche

Le premier axe, est consacré à nous avons fait les analyses suivantes :

-L’extraction des huiles essentielles de l’espèce végétale.

-L’étude de composition chimique de l’huile essentielle extraite.

-Caractérisation des huiles essentielles de la réglisse par méthode

chromatographique en phase gazeuse couplée à une spectrométrie de masse

(CPG-SM).

Dans le deuxième axe, l’étude du pouvoir antibactérien des huiles essentielles

des feuilles de réglisse vis-à-vis de souches bactériennes à Gram (+) et à Gram

(-) a été evalué par la détermination de la concentration minimale d’inibition

(CMI) et la concentration minimale bactéricide (CMB) .après solubilisation de

l’huile essentielle dans un émulsifiant, DMSO.

2.1-Matériel biologique :

2.2 -Matériel végétal :

2.3- Description botanique :

L’éspéce Glycyrrhiza glabra est une Plante spontanée herbacée, vivace par un

rhizome stolonifère, elle présente des tiges de 1.50 metre, bien dressées,

rigides et creuses. Ses feuilles sont alternes, glabres, composées d'un nombre

impair de folioles ovales lancéolées, bien vertes (Figure 8)

(Teman ; 2008).


46

Figure 8: La plante de réglisse de la région Jdiouya de

Rélizane(Algerie).

2.4. La recolte et le séchage :

La récolte des feuilles a été effectuée à partir de la population végetale

spontanée dans la région de Djidiouia dans la willaya de Relizane (l’ouest

d’Algérie) des années 2008 à 2010 durant le mois d’avril. L’identification à été

réalisée par les professeurs botanistes du département des sciences biologiques

de l’université de Bechar.Le tableau 1 résume les caractéristiques géographiques

et bioclimatiques de la zone d’étude de la plante étudièe de la station de récolte.

La récolte du matériel végétal collecté en début de matinée, a été nettoyée des

débris et étalée sur du papier filtre puis laissée sécher à l’ombre à l’abri de la

lumiére et de l’humidité à température ambiante, pendant une semaine avant

d’être utilisée pour l’extraction.


47

2.5- les souches microbiennes testées : Les souches bacteriennes utiliséés dans notre étude sont présenté dans le

tableau N02.Ces germes pathogéne font partie de la collection ATCC et ont été

délivrées par l’institut Pasteur d’Alger.

L'huile essentielle a été testée in vitro, sur cinq bactéries. Ces souches ont été

conservées pour dans le glycérol à -20 ° C et pour le stockage à court terme sur

la gélose tryptone soja à 40

C.


45

Tableau 01 : lieu de récolte de la plantes et Les caractéristiques géographiques et bioclimatiques de la zone de récoltes

La plante Lieu de la récolte Etage bioclimatique Altitude (m) Latitude (Nord) Longitude (Ouest) Période de récolte

Réglisse Jdieya (Rélizane) Semi-aride 139 m 35° 44′ 0° 33′

Avril 2008

2009-2010


46


45

Tableau N0

Souche testée

2 : liste des souches microbiennes testées.

N0ATCC

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Salmonella typhi NRRLB 4420

Escherichia coli (I) ATCC 35218

Escherichia coli (II) ATCC 25922

Staphylococcus aureus ATCC 25923

2.6-Extraction des huiles essentielles :

a) -l’hydro distillation :

L’utilisation des plantes médicinales contenant une substance chimique

bénéfique pour des vertus thérapeutiques ou alimentaires, varie suivant la

substance et la plante. Quelquefois, la substance est extraite des feuilles en

utilisant généralement l’hydro distillation. Le procédé le plus simple et souvent

utilisé, consiste à employer un liquide et de la chaleur.

Les huiles essentielles sont des substances extrêmement puissantes, pouvant

concentrer jusqu’à 100 fois certains principes actifs de la plante fraiche. Dans ce

travail, nous avons utilisé la méthode hydro distillation, pour l’extraction de

ces feuilles de réglisse dans un appareil type Clevenger pendant une durée

d’extraction de trois heures. (Bruneton ,2001)

Pour éliminer toute trace d’eau, nous séchons le produit avec une aliquote de

sulfate de sodium anhydre. Le sulfate de sodium anhydre a la capacité

d’absorber l’humidité et d’éliminer toute la quantité d’eau. L’échantillon

d’huiles essentielles est conservé à l’abri de l’air et de la lumière à une

température de 40C.


46

b) le relargage :

Nous ajoutons 3 g de chlorure de sodium pour 40 ml de distillat, nous

agitons jusqu’à dissolution, puis nous transvasons dans une ampoule à décanter.

c) l’extraction liquide- liquide :

La separation des deux phases ce fais par décantation. La phase supérieure qui

contient huiles essentielle est récupérée.

d) séchage et filtration :

Nous séchons le produit avec un peu de sulfate de sodium anhydre. Le

sulfate de sodium anhydre à la capacité d’absorber l’humidité et d’éliminer la

maximale quantité d’eau restée. Puis nous faisons une filtration.

Les huiles, après leur extraction, sont conservées au réfrigérateur entre 4°

et 6°C.

E) la concentration :

Le filtrat obtenu a été concentré sous vide à 35°C à l’aide du Rota à

vapeur. (Bendahou et al ; 2007).


47

Figure N0 8: Différentes étapes d’extraction des huiles essentielles des

feuilles de Glycyrrhiza glabra. (Bendahou et al ; 2007)

Matériel végétal sec broyé 300g

Hydrodistillation

Le relargage

Séchage et filtration

L’extraction liquide- liquide

Conservation d’huile essentielle à 40C

Résidu végétal

La concentration


48

2.7-Détermination des rendements en huiles essentielles :

Le rendement est défini comme étant le rapport entre la masse de l’huile

essentielle obtenue et la masse du matériel végétal utilisé pour cent. Apres

récupération d’huiles essentielles, le rendement est calculé par la méthode

suivante :

Rdt % =m /m0 x (100)

Rdt : rendement en huiles essentielles (en g) pour 100 g de la matière sèche

m : masse d’huiles essentielles récupérees (g)

m0

C’est le rapport de la masse d’un certain volume d’huile essentielle à 20 °C

à la masse d’un volume égal d’eau distillée à 20°C. Brièvement, à l’aide d’un

pycnomètre de capacité de 5 ml, on pèse successivement des volumes égaux

d’huile essentielle et d’eau distillée à la température ambiante (20°C). On

remplit le pycnomètre avec de l’eau distillée récemment bouillie, puis refroidie

: prise d’essai du matériel végétal (g) . (Afnor ; 2000)

2.8-Indice physico –chimique des huiles essentielles étudiées:

2.8.1-Propriétés physiques :

Pour obtenir des données sur la composition et le degré de pureté des

huiles essentielles et, dans certains cas, pour l'identifier, on procède à l'étude de

ses propriétés physiques et chimiques,

Les méthodes physiques d'examen pour l'analyse des huiles essentielles

s'attachent surtout à la détermination de la densité, du point de congélation, la

densité relative, l’indice de réfraction, la miscibilité à l’éthanol, et sur le pouvoir

rotatoire. . (Afnor ; 2000).

2.8.1.2- La densité relative : Afnor NFT 75.111.2000:


49

aux environs de 250 C. On plonge le pycnomètre dans un bain marie, jusqu’a

équilibre de la température aux environs de 200 C et on le retire .Après essuyage,

on pèse le pycnomètre, en remplaçant l’eau parl’huile essentielle.

La densité relative est donnée par la formule :

𝒅𝒅 =𝓶𝓶2 −𝒎𝒎0𝓶𝓶𝟏𝟏−𝒎𝒎0

Où :

m0 : est la masse en gramme du pycnomètre vide ;

m2 : est la masse en gramme du pycnomètre rempli d’huile essentielle ;

m1 : est la masse en gramme du pycnomètre rempli d’eau distillée ;

Si on désire obtenir la masse volumique des huiles essentielles, il faut multipler

la densité relative par la masse volumique de l’eau m (eaux) =0.99823 g/ml.

(Afnor ; 2000).

2.8.1.3- L’indice de réfraction : Afnor NFT 75 - 112-2000:

L’indice de réfraction est le rapport entre le sinus de l’angle d’incidence

de longueur d’onde déterminée, passant de l’air dans l’huile essentielle

maintenue à une température constante.

La longueur d’onde spécifique est : 589± 30 nm correspondant aux

radiations D1 et D2

Pour ce faire, nous avons utilisé un réfractomètre de type de (SCHMIDT,

HAENSCH n°4004), d’un thermostat permettant la stabilisation de la

du spectre de Sodium. La température de référence est 20

°C.


50

température, d’une source lumineuse (lampe à vapeurs de Sodium) et d’une

lame en verre.

On place une goutte d’huile essentielle sur le prisme de refractomètre, et on

attend que la température se stabilise puis on effectue le mesurage.

L’indice de réfraction t/D à la température de référence t est donné par la

formule :

[𝓷𝓷]°𝓓𝓓𝐭𝐭 = 𝓷𝓷𝓓𝓓𝐭𝐭′ + 𝟎𝟎.𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎 (𝐭𝐭’ – 𝐭𝐭)

nDt: est l’indice de réfraction de référence.

n D t’ : est l’indice de réfraction mesurée.

t : température de référence qui est à 200 C.

t’ : température au moment de la mesure. . (Afnor ; 2000).

2.8.1.4- Le pouvoir rotatoire Afnor NFT 75 - 113-2000:

Le pouvoir rotatoire d’une huile essentielle est un critère important de la

pureté de huile essentielle, et permet d’indiquer si elle posséde une activité

optique dextrogyre ou lévogyre. Pour ce faire on remplit la cellule par l’huile

essentielle dans l’ethanol à raison de 0.2g dans 100ml, puis l’angle de rotation

est lu directement sur l’appareil.

Le pouvoir rotatoire est donné par la formule suivante :

[α] 20d = α / (LxC)

où

α : La valeur lue sur l’appareil en degrés d’angle

L : L’épaisseur du film (cellule) en dm

C : La concentration de l’essence exprimée en (g/100 ml) . (Afnor ; 2000)


51

2.8.1.5- La miscibilité à l’éthanol : Afnor 75-101,2000:

Une huile essentielle est dite miscible à V volume et plus de l’éthanol de

titre alcalimétrique déterminé à la température de 20°C, lorsque le mélange de 1

volume de l’huile essentielle avec V volumes de cet éthanol est limpide, et le

reste après addition graduelle d’éthanol de même titre jusqu’à un total de 20

volumes.

Brièvement, on additionne graduellement à une prise d’essai d’huile

essentielle à la température de 20°C de l’éthanol de titre alcoométrique

convenable, puis on évalue leur miscibilité en agitant énergiquement pendant

l’addition du solvant. Lorsque la solution obtenue est parfaitement limpide, on

note le volume (V) de dilution d’éthanol utilisé puis on poursuit l’addition de

solvant par fractions de 0.5ml jusqu'à un total de 20 ml en agitant après chaque

addition.

La mixibilite des huiles essentielles à l’éthanol de titre t, à la température de

20 0

L’huile essentielle est mise dans des tubes à essais à l’intérieur d’un congélateur,

accompagnés d’un thermomètre, d’où l’observation des variations de

C, est exprimée par :

Un volume d’huiles essentielles dans V volumes d’éthanol de titre t . . (Afnor ;

2000)

2.8.1.6- Le point de congélation : Afnor 75-111,2000:

Le point de congélation d’une huile essentielle est la température constante

ou maximale observée pendant la phase de la libération de la chaleur de

solidification, lorsque cette huile essentielle à l’état liquide est refroidie.


52

température accompagnant la solidification de l’huile qui est refroidie lentement

et progressivement. . (Afnor ; 2000)

2.8.2- Propriétés chimiques :

2.8.2.1- Détermination de l'indice d'acide Afnor - NFT - 60 -2000:

La détermination de l’indice d’acide renseigne généralement sur le degré

d'hydrolyse. Les huiles essentielles ne contiennent pas ou très peu d'acides gras

libres à courte chaine carbonique. Ce paramètre est une variable qui dépend

essentiellement des conditions de conservation et surtout des conditions

d'extraction.

Il y a deux manières d'exprimer la teneur d'une matière grasse: l'acidité et

l'indice d'acide. Ces deux caractéristiques d'une même propriété sont mesurées

de la même façon. Seuls les résultats du dosage sont exprimés différemment.

On pèse 2 g d’huile essentielle qu’on introduit dans une fiole où on ajoute 5 ml

d’éthanol à 95%. Agiter et procéder au titrage avec une solution éthanolique

d’hydroxyde de potassium titrée (C (KOH) = 0.1 mol/l), en présence de

phénolphtaléine (indicateur coloré), à la température ordinaire (25°C). La

couleur jaune clair du liquide (la couleur de l’huile essentielle) vire à la

neutralisation vers une couleur rose qui persiste quelques minutes avant de

reprendre la couleur initiale. Le volume de KOH qui a servi à la neutralisation

est lu directement sur la burette.

L’indice d’acide est exprimé par la formule :

IA = (56,11x Nx V)/m

N : normalité de KOH.

V : Volume en ml de la solution éthanolique de KOH utilisée pour le titrage.

m : Masse en grammes de l’huile essentielle. (Afnor ; 2000).


53

2.9-Analyse des huiles essentielles :

2.9.1- Caractérisation et identification des huiles essentielles par

CPG/SM La composition des huiles essentielles est très complexe. Terpènes,

aldéhydes, cétones, phénols, lactones, esters, en sont les composants principaux.

Très volatiles, les huiles essentielles ne rancissent pas; elles sont solubles dans

l'huile et dans l’alcool, mais pas dans l’eau.

La détermination de la composition chimique des huiles a été faite par

chromatographie phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse.

La chromatographie est une méthode analytique qui est largement utilisée

pour la séparation, l’identification et le dosage des constituants chimiques dans

des mélanges complexes. Il s’agit d’une technique dans laquelles les

constituants d’un mélange se séparent en fonction des vitesses auxquelles ils

sont entraînés à travers une phase stationnaire par une phase mobile gazeuse

(Arpino P., et al. , 1995).

2.9.2Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de

masse (CPG-SM) :

Les analyses de la composition chimique de l’huile essentielle des feuilles de

glycyrrhiza glabra sont réalisées par chromatographie en phase gazeuse couplée

à la spectrometrie de masse (GC-MS).cette derniere est realisée sur un

chromathographe en phase gazeuse de type Hewlett-Packard GC-MS system

(GC :5890 series II, MSD 5972) Le gaz vecteur est l'hélium, avec un débit de

1,2 ml / min. Injecteur ports 2500C et la température du four a été programmée


54

comme flux: isotherme à 500C pendant 1 min, puis a augmenté à 2800 C à un

taux de 5C0 / min.

Le volume injecté: 0,1 l de solution dilue dans l’hexane.

Le mode d’injection

est split, L’appareil est relié à un système informatique gérant une bibliothèque

de spectres de masse (Nist, NBS, Wiley). (Adams ; 2001).

2.9.3 -Conditions du spectromètre de masse:

Tension d'ionisation: 70 electrovolt à la température de 280 ° C .la masse de:

40-300 unités de masse a un temps de 1,5 seconde un Logiciel adopté pour

gérer les spectres de masse et des chromatogrammes. Les composés de l’huile

essentielle ont été identifiés en comparant leurs spectres de masse avec la base

de données de la bibliothèque.Le Pourcentage des composants a été calculé à

partir de la surface du pic GC.

2.9.4-L’identification des constituants :

L'identification des spectres de masse des constituants analysés par GC/SM est

comparée à une bibliothèque informatique, la méthode d’identification des

constituants d’huiles essentielles étudiées est basée sur leurs indices de

rétention et de leurs spectres de masse par comparaison avec les données de la

librairie. (Joulain et al, 1998 ; Adams, 2001) les spectres de masse obtenus

sont comparés à ceux des bibliothèques informatisées Nist, NBS, wiley, 75K

Liée au spectromètre, l’identification des constituants analysés par CPG , est

faite par rapport à des échantillons authentiques.


55

2.10-Etude du pouvoir antibactérien des huiles essentielles des feuilles

Glycyrrhiza glabra : 2.10.1-Vérification de la pureté des bacteries et identification des souches :

La verification de la pureté des bacteries et leur identification se fait par l’étude

de leurs caractéres morphologiques et biochimiques.

2.10.1.1 .Identification des bactéries :

-Morphologique et coloration :

a-Aspet des colonies.

b-mobilite à l’état frais.

c-coloration de Gram (voir Annex).

-Caractéristiques biochimiques :

Nous avons utilisé des plaques API 20 E pour les entrobacteries et les

pseudomonas aeruginosa et API STAPH pour le Staphylococcus aureus.

2.10.1.2. Préparation des précultures :

Les souches sont ensemencées par stries dans un milieu de gélose nutritive,

aprés incubation 18h à 370C ,trois colonies bien isolées sont prélévées et

émulsionnées dans 10 ml d’eau physiologique stérile à 0.9% a l’aide d’un votrex

ensuite on fait des dilutions afin de standardiser la suspension

bactérienne.l’inoculum est ajusté à 0.5 Mc Farland correspondant à une densité

optique de (0.08 à 0.10 ) à 625 nm .La concentration finale de l’inoculum est de

107 UFC/ml. (Bendahou et al ; 2007)


56

2.10.2. Méthode d’étude du pouvoir antibacterien d’huile essentielle:

Pour l’évaluation de l’activité antimicrobienne des huiles essentielles des

feuilles de réglisse, nous avons utilisé deux :

a-La méthode de diffusion du disque l’aromagramme ; c’est une méthode qui

permet de déterminer l’activité inhibitrice des huiles essentielles sur la

croissance des germes par la mesure du diamètre d’inhibition autour d’un disque

de cellulose imprégné d’huiles essentielles ou de produit à base d’huiles

essentielles.puis de déterminer la concentration minimale d’inhibition (CMI) en

milieu bouillon Mueller-Hinton.

b-La methode de dilution en milieu liquide

1/Méthode de diffusion sur disque (aromatogramme) :

Cette méthode est décrite par Jacob et Tonei ,1979qui, appelée technique

aromatogramme, consiste à utiliser des disques de papier filtre sterile de 6mm

imprégnés des concentrations differantes d’huiles essentielles pure et déposes a

la surface d’un milieu gélose en boite pétrie préalablement ensemencé en

surface à l’aide d’une suspension standardisée.

L'agar Muller-Hinton mutriet a été coulé dans des boîtes de Pétri stériles

(diamètre 90mm). Disques de papier (diamètre 6mm) ont été imprégnés

aseptiquement d'huile essentielle et placés sur les surfaces de gélose inoculée.

Après une incubation aérobie pendant 24 heures à 370C, l'activité

antimicrobienne a été estimée en mesurant les diamètres des zones d’inhibition

en mm qui correspond à la distance autour des disques où nous constatons une

absence totale de culture microbienne.En parallèle nous avons utilisé des


57

témoins pour vérifier leur croissance aprés incubation. (Bendahou et al ;

2007)

2/ La méthode de dilution en milieu liquide par spectrometrie :

C’est une methode qui nous permet de déterminer la plus petite concentration

d’huiles essentielles suffisante pour inhiber, la croissance d'une souche

bactérienne (CMI) ou de tuer le germe (CMB).

La concentration minimale inhibitrice a été effectuée selon la méthode de

bouillon Mueller-Hinton microdilution dans 96 multipuits plaque de

microtitration. Les huiles essentielles ont été dissoutes dans le DMSO aqueux et

la concentration initiale était de 25 µg / ml. La concentration initiale d'essai a été

diluée en série double. Chaque puits a été inoculé avec 5uL de suspension

contenant 107 UFC / ml de bactéries et incubé pendant 24 heures à 37 ° C. La

CMB testé a été déterminée comme étant la plus faible concentration à laquelle

aucune croissance visible du micro-organisme n’avait eu lieu. Chaque test a été

réalisé en trois fois.Le temoin comporte chaque bacterie testé dans un milieu de

Muler -Hilton seul et le milieu de Muler -Hilton avec le solvant le DMSO.

2.10.3. Analyse statistique :

Toutes les experimentations ont été réalisées en triplicata.Tous les resultats ont

été exprimés en 𝑋𝑋 ± SEM.

Résultats et discussion

64

3. Résultats et discussion :

Selon Afnor (2000) les huiles essentielles sont habituellement liquides à

température ambiante et volatiles, ce qui les différencie des huiles dites fixes.

Elles sont plus ou moins colorées et leur densité est en général inférieure à celle

de l’eau.

La couleur de l'huile essentielle des feuilles Glycyrhiza glabra est de couleur

jaune claire, elle est mobile.

3.1. Rendement en huile essentielle des feuilles de réglisse :

Le rendement en huiles essentielles des feuilles de réglisse, qui est calculé en

fonction de la masse végétale sèche, est de 0.65 % .Cette quantité est très petite

par rapport à d'autres plantes aromatiques.

Shatar et al 1989 ont démontré que l’huile essentielle du rhizome séché de

Glycyrrhiza uralensis obtenue par distillation à la vapeur, donne un rendement

de 0,018%. Les variations dans le rendement peuvent être attribuées non

seulement à l’origine géographique de la plante, à la nature (séchée ou fraiche)

et à la technique d’extraction mais également à la période de la cueillette de la

matière végétale ainsi qu’au mode d’extraction.

3.2. Indice physicochimique des huiles essentielles :

3.2.1. Résultats des analyses physicochimiques :

Les propriétés physico-chimiques tels que : le pouvoir rotatoire, l’indice de

réfraction, l’indice d’ester …etc., constituent un moyen de vérification et de

contrôle de la qualité de l’huile essentielle. Ces essais sont déterminés selon un

protocole précis et obéissent à des normes édictées par l’association française de

normalisation (A.F.N.O.R). Les résultats obtenus sont portés dans le tableau

suivant :


65

Tableau 3: Composition Physico-chimique d’ huiles essentielles de

Glycyrrhiza glabra.

Specification Glycyrrhiza glabra

Densité D20 0.906

l’indice de Refraction N20 1.4614

le pouvoir rotatoire +22.157

miscibilité à l’ éthanol 90% 1 :3

Point de congélation (°C) -18

Acidité 0 .49

Les résultats obtenus des analyses physicochimiques indiquent que les

échantillons analysés se trouvent dans les fourchettes de référence établies par

les normes Afnor. Selon Gildo, 2006, ces paramètres physicochimiques sont

influencés par les conditions édaphiques et climatiques ainsi que les conditions

de culture des plantes ; cela fait partie aussi de la complexité de la notion de

chémotype.

La densité est parmi les caractéristiques physiques généralement utilisées dans la

classification des huiles essentielles. Mais elle ne peut pas être utilisée seule

pour l’identification des huiles. Les résultats obtenus sont conformes à la norme

afnor.

L’indice de réfraction dépend de la composition chimique qui augmente en

fonction des longueurs des chaînes d’acides, de leurs degrés d'instauration et de

la température. Il varie essentiellement avec la teneur en monoterpènes et en

dérivés oxygénés. Une forte teneur en monoterpènes donnera un indice élevé.

Pour certains auteurs, le faible indice de réfraction de l'huile essentielle indique

sa faible réfraction de la lumière ce qui pourrait favoriser son utilisation dans les

produits cosmétiques. L’indice de réfraction obtenu est de 1.4614.Il est à la

norme mentionnée par les normes françaises des huiles essentielles.


66

L’analyse du pouvoir rotatoire indique si l’huile est dextrogyre ou lévogyre ce

qui est un critère important pour connaitre la pureté d’une huile essentielle. Les

résultats du pouvoir rotatoire mentionnent une valeur de +22.157 .Cette huile

est déxtrogyre. La miscibilité à l'éthanol 90% est d'un volume d'huile essentielle

pour trois volumes d’éthanol. Ces valeurs sont aux normes françaises (Afnor,

2000).

Le point de congélation de notre huile est égale à -18°C pour l’huile essentielle.

Ce qui est à l’intervalle fixé des normes française NFT 75-222 qui est -15°C

jusqu’à -19°C selon Afnor 2000.

Les résultats indiquent que les paramètres physico-chimiques des

échantillons analysés se retrouvent dans les fourchettes de références établies

par les normes.

La détermination des propriétés physico-chimiques (densité, indice d’acide,

indice de réfraction…) est une étape nécessaire mais non suffisante pour

caractériser les huiles essentielles. Il est donc nécessaire de la compléter par des

analyses chromatographiques : GC/SM, ces dernières, sont souvent utilisées

comme moyen analytique complémentaire pour l’analyse structurale des

substances volatiles, elles ont été employées pour identifier qualitativement les

huiles essentielles des feuilles de la réglisse.

3.2.2. Analyse des huiles essentielles :

La caractérisation des huiles essentielles a été réalisée par CPG /SM.

Les pics du chromatogramme de l’huile essentielle de feuilles de Glycyrrhiza

glabra sont comparés à ceux des composés de référence prèsents dans une

bibliothèque de spectre avec une banque de données informatisées, l’appareil

CPG/SM nous a donné les différents chromatogrammes de masse et les indices

de rétention des substances comparables qui peuvent constituer cet extrait .

Les chromatogrammes de l'huile essentielle ont de nombreux pics et beaucoup

d'entre eux se chevauchaient.Le profil chromatographique de l’huile essentielle

des feuilles de Glycyrhiza glabra est dans la figure 10.


67

temperature programmee, 10-Jan-2010 + 09:41:58reglisse

13.2615.26

17.2619.26

21.2623.26

25.2627.26

29.2631.26

33.2635.26

37.2639.26

41.26 Time0

100%

Ech ReglisseScan EI+

TIC1.17e11

29.27

23.78

23.2319.89

19.2715.61

14.58

14.44

18.5215.7217.14

16.3717.90

21.9421.11

23.91

28.31

27.8926.82

24.5326.0027.34

30.51

29.51

31.21

38.06

37.0631.51

32.8434.01

34.56

39.90

39.42

40.47

3.2.3. Chromatographe d’huile essentielle de

Figure

Glycyrhiza glabra

10 : Profil chromatographique de l’huile essentielle des feuilles de

Glycyrhiza glabra


68

Plus de 35 composants ont été séparés sur HP-Colum et vingt et un d’entre eux

ont été identifiés comme composante majeure représentant 70% du total

(Tableau 4). L'identification des composants chromatogrammes a montré que

cette espèce a été caractérisée par son taux élevé d’Isoniazid. L'analyse chimique

de l'huile essentielle a montré que ses produits majeurs ont été Méthacrylonitrile

(9,69%); l'acide benzoïque (5,37%); diéthyltoluamide (6,56%); pyrazine, 1,4-

dioxyde de carbone (2,20%) benzène (4,58%), le linalool (2,25 %); bicyclo

[4.1.0] hept-2-ène, 3,7,7-triméthyl-(2,80%),d’autres composants étaient présents

avec de très faibles pourcentages. Les analyses GC / MS ont permis d'identifier

les principaux composants bioactifs qui possèdent d'intéressantes actions

inhibitrices contre les microorganismes. D’après Tang, 1992 les composants

volatils aromatiques (environ 0,04 à 0,06%) dont plus de 40 ont été identifiés de

l’extraction de la totalité de la plante de glycyrrhiza Glabra : anéthol, estragole,

eugenol, carvacrol, fenchone, guaiacol, geraniol, linalol, pcymene, thujone,

thymol, α-terpineol ; les trois premiers étant à l’origine des aromes de la racine,

avec l’indole et la γ-nonalactone ;Sont présents également des acides

aliphatiques (acides benzoïque, caproïque, linoléique, palmitique, propionique,

salicylique), des aldéhydes (benzaldéhyde, furfural), des cétones, des esters, des

éthers, des alcools et des hydrocarbures.


69

Tableau 4:Les composants majeurs identifiés de l’ huile essentielle de

Glycyrrhiza glabra par GC / MS technique avec les indices de rétention sur

HP-5ms

Composants

capillaire.

RI (%) TR

Linalool 1082 2.25 14.58

trans-Permethrin 2756 1.57 15.72

Aspartic acid 1310 1.44 15.84

Bicyclo[4.1.0]hept-2-ene, 3,7,7-trimethyl- 948 2.80 38.06

Benzene 680 4.58 19.89

2-Propenenitrile, 2-methyl- 631 7.86 31.29

Methacrylonitrile 574 9.69 30.51

Prasterone 2139 5.63 29.51

Isoniazid 1431 13.36 29.27

Benzoic acid 1150 5.37 23.91

Diethyltoluamide 1505 6.56 23.78

Ethylenimine 505 1.57 15.61

Warfarin 2636 1.43 15.72

Iodoquinol 2254 1.90 18.52

Phenol, 2-methoxy-4-(1-propenyl)-, (E) 1410 1.30 19.27

Retinol 2238 1.40 23.23

Phenol, 4-(2-aminopropyl)- 1392 1.30 17.90

4-Pyridinamine 986 1.43 17.14

3-Cyclohexen-1-ol, 4-methyl-1-(1-methylethyl 702 1.32 31.51

Pyrazine, 1,4-dioxide -- 2.20 37.06

Hydrochlorothiazide -- 1.30 40.47


70

RI :indice de retentions

(%) : pourcentage

TR : temps de retentions

FU Y et al ,2009 ont démontré que l'huile essentielle des parties aériennes de la

réglisse (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) analysée par GC-MS contient 28

composants représentant 74,39% de la teneur totale en huile et ont été identifiés

pour la première fois dans cette espèce. Les principaux composants dans l'huile

ont été β-cadinène (12,28%), β-caryophyllène (10,04%), γ-cadinène (9,49%),

phytol (8,43%), α-cadinène (4,43%), oxyde de caryophyllène (3,65% ) et α-

gurjunene (3,48%).

La chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectre de masse, nous a

permis l’identification des constituants des huiles essentielles directement , de

séparer et aussi d'isoler chacun des constituants du mélange pour obtenir des

données importantes sur la structure de composés organiques inconnus des

huiles de Glycyrrhiza glabra :

http://www.refdoc.fr/?traduire=en&FormRechercher=submit&FormRechercher_Txt_Recherche_name_attr=auteursNom:%20%28FU%29�


71

Figure 11:spectre de masse du composant linalool d’huile essentielle des

feuilles de Glycyrrhiza glabra .

linalool est une substance chimique naturelle d'alcool terpénique qui se trouve

dans beaucoup de fleurs et de plantes à épices et possède de nombreuses

applications thérapeutiques. Ce composant mono terpène est parmi les

principaux composants des huiles essentielles de plusieurs espèces aromatiques

et se trouve dans les huiles essentielles de la réglisse à un pourcentage de 2.25%.

Ses activités pharmacologiques sont attribuables au contenu des alcools comme

le linalool (Peana et al , 2002). Ce dernier a été évalué récemment pour son

activité psychopharmacologique chez la souris, révélant des effets sédatifs sur le

centre système nerveux central (SNC) (Jirovetz et al, 1991). Il a également été

rapporté qu’il a une activité antimicrobienne contre plusieurs bactéries et

champignons (Peana et al, 2002).


72

Le linalool est un des composants responsables de l'odeur caractéristique de

l'huile essentielle des feuilles. Des proportions différentes se retrouvent sous

forme libre ou liée dans plusieurs espèces végétales et sont parmi les

constituants les plus abondants rencontrés dans des huiles essentielles (Stahl-

Biskup et al, 2002).

Des études ont montré que le rhizome of Glycyrrhiza uralensis de Mongolie

contient un pourcentage de linalool de 0.42% (Shatar S. et al, 1989).

Certaines plantes ont un pourcentage trés élevé en linalool tel que l'huile

essentielle de feuilles Heteropyxis dehniae qui est constituée

Figure 12 : spectre de masse du composant trans-Permethrin de huile

essentielle des feuilles de Glycyrrhiza glabra .

de (58,3%)

(Sibanda S. et al ,2004).


73

Figure

Ce composant represente dans l’huile essentielle des feuilles de Glycyrhiza

glabra , un poucentage de 1.57%.

D’autres études ont

13 :spectre de masse du composant acide Aspartic de l’huile


L’acide aspartic a un pourcentage presque équivalent à celui du trans-

Permethrin, d’une valeur de 1.44%.

permis découvrir la composition chimique de l'huile

essentielle des feuille de Glycyrrhiza uralensis Fisch obtenus par la méthode d’

hydro distillation, et analysé par chromatographie GC-MS . 76 pics ont été

isolés, et 61 d'entre eux ont été identifiés. Les principaux composants chimiques

de l'huile essentielle ont été nonadécane (12,89%), eicosane (12,23%), le 1-

heptadécène (12,05%), 2, 6, 11-triméthyl-dodécane (7,54%), octadécane

(7,46%) (-)-pinane-E (5,54%), docosanes (5,30%), tricosanoïque (4,92%) et


74

hexadécyl-oxirane (3,09%), respectivement. Ces neufs composés ci dessus cités

représentaient 71,02 % ( MA Jun-yi et al ,2005)

Figure 14 :spectre de masse du composant Bicyclo[4.1.0]hept-2-ene, 3,7,7-

trimethyl-de l’huile essentielle des feuilles de Glycyrrhiza glabra .

Le Bicyclo[4.1.0]hept-2-ene, 3,7,7-trimethyl- est

.

Figure 15: spectre de masse du composant Le benzène de l’huile essentielle

des feuilles de Glycyrrhiza glabra .

un hydrocarbon qui se trouve

dans l’huile essentielle de Glycyrrhiza glabra à un pourcentage de 2.80% .


75

Le benzène est un composé chimique organique qui se trouve dans l’huile

essentielle des feuilles de glycyrrhiza glabra à 4.58%. Le benzène est un

hydrocarbure aromatique des plantes.

Figure 16:spectre de masse du composant 2-Propenenitrile, 2-methyl de

l’huile essentielle des feuilles de Glycyrrhiza glabra .

Le composant 2-Propenenitrile, 2-methyl est parmi les composants majoritaires

de l’huile essentielle étudiée dans un pourcentage de (7.86%) ; Il contient un

groupement de nitrogène.


76

Figure 17:spectre de masse du composant prasterone de l’huile essentielle


On remarque que le composant prasterone représente une quantité importante

dans l’huile essentielle de Glycyrrhiza glabra (5.63%) . le composant

prasterone acetate a aussi été identifie par JIA ,2010 sur l’huile essentielle le

Thymus proximus.


77

Figure 18:spectre de masse du composant Isoniazide, de l’huile essentielle


Le composant Isoniazide est un composé organique qui contient des

groupements de nitrogène. C’est le composant le plus important de cette huile

essentielle avec un pourcentage de l’ordre de 13.36%.

Une étude récente en 2010 de YU Xiao-mei qui a analysé la composition de

l'huile volatile de Glycyrrhiza uralensis , a démonté que l’acide eicosanoïque

était le composant le plus élevé (32,02%) des 31 éléments séparés et identifiés,

de l'huile essentielle de Glycyrrhiza uralensis .


78

Figure 19:Spectre de masse du composant L’acide benzoïque del’ huile


L’acide benzoïque est un acide carboxylique aromatique dérivé du benzène. Ce

composant organique est présent dans l’huile essentielle de Glycyrrhiza

glabra à une quantité appréciable de 5.37%.

Figure 20:spectre de masse du composant le diethyltoluamide de l’huile


http://fr.wikipedia.org/wiki/Acide_carboxylique�

http://fr.wikipedia.org/wiki/Compos%C3%A9_aromatique�


79

le diethyltoluamide est parmi les composants identifiés de l’huile essentielle

des feuilles de Glycyrrhiza glabra dans un pourcentage de 6.56%.

On remarque une variation des composants identifiés d’une espéce de réglisse à

une autre .En 2004 ZHANG Ji et al, on pu identifier par chromatographie GC-

SM les composants chimiques volatils des feuilles de Glycyrrhiza pallidiflora

qui ont été extraits par hydro distillation. 27 pics ont été isolés, et tous les

composés ont été identifiés. Le contenu relatif de chaque composant a été

calculé ,et les principaux composants chimiques ont été 5 - (2-yl) -1,3-

benzodioxole (19,02%), le 3,7-diméthyl-1 ,6-octadiène-3-ol (17,70%), [1R-(1R

* ~, 4Z, 9S ~*)]- 4,11,11-triméthyl-8-méthylène-bicyclo [7.2.0] undéc-4-ène

((11,53%) ), 2,3,6-triméthyl-1 ,6-heptadiène (8,36%), 2-undécanone (4,24%), la

coumarine-7 ,8-diol ((3,81%)), le 2-méthyl-6-méthylène-7-octène-2-ol

((3,47%)), et 3,7,11,15-tétraméthyl-2-hexadécène-1-ol ((3,43%)). Ces huit

composés constituent 71,56% du total d’huile essentielle Glycyrrhiza

pallidiflora.


80

Figure 21:spectre de masse du composant ethylenimine de l’huile

essentielle des feuilles de Glycyrrhiza glabra.

Le composant Ethylenimine est un composant très huileux et volatil, parmi les

composants des huiles essentielles étudiées de 1.57%.


81

Figure 22:spectre de masse du composant Le wafarin de huile essentielle

des feuilles de Glycyrrhiza glabra

Le wafarin est composé de

Figure

divers groupes fonctionnels. Sa structure

moléculaire est représentée dans la figure ci dessus. Il représente 1.43% dans la

composition de l’huile essentielle de Glycyrrhiza glabra .

23:spectre de masse du composant L’iodoquinol de l’huile

essentielle des feuilles de Glycyrrhiza glabra

L’iodoquinol représente 1.9% dans la composition d’huile essentielle étudiée


82

c’est l’un des composants à divers groupes fonctionnels comme on le voit dans

la figure précédente.

Figure24:spectre de masse du composant Phenol, 2-methoxy-4-(1propenyl )

de l’huile essentielle des feuilles de Glycyrrhiza glabra

Ce composant le Phenol, 2-methoxy-4-(1-propenyl)-, (E) représente 1.30% dans

l’huile essentielle étudiée des feuilles de Glycyrrhiza glabra

Figure 25:spectre de masse du composant le rétinol de l’huile essentielle

des feuilles de Glycyrrhiza glabra


83

Figure 26: spectre de masse du composant Phenol, 4-(2-aminopropyl) de

l’huile essentielle des feuilles de Glycyrrhiza glabra

Composant de divers groupes fonctionnels, le Phenol, 4-(2-aminopropyl)- est

parmi les composants de l’huile essentielle de la plante étudiée ; son spectre de

masse est représenté dans la figure 26 représente 1.30%.

Le retinol, composant à fonction alcoolique , représente 1.40% dans l’huile

essentielle etudiée .

Figure 27:spectre de masse du composant Pyridinamine de l’huile



84

Le Pyridinamine, composant identifié, contient du nitrogène et existe dans

l’huile de Glycyrrhiza glabra à 1.34%.

Figure 28:spectre de masse du composant 3-Cyclohexen-1-ol, 4-methyl-1-1-

methylethyl) de l’huile essentielle des feuilles de Glycyrrhiza glabra

Le composant 3-Cyclohexen-1-ol, 4-methyl-1-(1-methylethyl) représente dans

les feuille de Glycyrrhiza glabra 1.32%.Le même composant a été identifié par

ZHANG Ji et al, 2005 dans l’étude effectuée sur les constituants chimiques des

racines de Glycyrrhiza pallidiflora max obtenus par hydro distillation , ces

derniers sont identifiés par GC /SM dont 25 pics séparés ont été identifiés .La

teneur relative du composé 3-Cyclohexen-1-ol, 4-methyl-1-(1-methylethyl)est

de 3,70%. Les autres composants chimiques identifiés sont : ester éthylique

d'acide linoléique (32,77%), hexadécanoïque ester éthylique d'acide (10,02%), le

décane, 2,3,7 triméthyl (6,49%) , 5 méthyl heneicosane (5,74%), tricosanoïque

(3,80%), eicosane (3,63%), octadécanoïque et l'ester éthylique (3,59%)

respectivement .


85

Figure 29:spectre de masse du composant Pyrazine, 1,4-dioxide de l’huile


La structure moléculaire de

Figure 30:spectre de masse du composant Hydrochlorothiazide de l’huile


Pyrazine, 1,4-dioxide est représentée dans la figure

précédente et représente 2.30% de la composition de l’huile essentielle de

Glycyrrhiza glabra.


86

Le Hydrochlorothiazide est parmi les composants identifiés d’huile essentielle

étudiée par CPG/MS d’un pourcentage de 1.30%.Cette étude nous a permis

l’identification de 21 composants actifs .L étude faite par MA Jun-yi sur

l’

Figure 31:spectre de masse du composant Methacrylonitrile de l’huile


Ce composant représente 9.69% de la composition de l’huile essentielle de

Glycyrrhiza glabra.

huile essentielle des racines de Glycyrrhiza uralensis extraite par hydro

distillation et analysée par chromatographie GC/SM a fait la séparation de 50

pics. Les principaux composants chimiques identifiés sont 2-methyl-

heptane(14.70%);3-methyl-heptane(12.22%);heptane(7.73%);3-methyl-

hexane(6.61%);octane(6.12%);2,3-dimethyl-pentane(6.04%);2,4-dimethyl-

hexane(5.82%);3-ethyl-pentane((4.99%);)2-methyl-hexane(4.47%); cyclohexane

methyl- (3.88%);2,3-dimethyl-hexane(3.53%) respectivement constituent

66,09% des composants de l’huile essentielle de Glycyrrhiza uralensis.


87

souches

3.3. Etude du pouvoir antibactérien de l’huile essentielle de glychrrhiza

glabra :

3.3 .1. Identification des bactéries :

Les caractères morphologiques et le type respiratoire sont mentionnés dans le

tableau 5

Tableau 5 : Etude des caractères morphologiques et type respiratoire des

différentes souches :

Staphylococcus

aureus

Escherichia

coli (I) Pseudomonas

aeruginosa

Escherichia

coli (II)

Salmonella

typhi

Forme cocci bacilles bacilles bacilles bacilles

Mobilité Immobile très mobiles mobiles mobiles mobiles

Gram

bactérie Gram-

possitive

bactérie

Gram-

négative

bactérie

Gram-

négative

bactérie

Gram-

négative

bactérie

Gram-

négative

Type

Respiratoire

Aéro-anaérobie

Aérobie strict

Aéro-

anaérobie

Aéro-

anaérobie

Aéro-

anaérobie

Les caractéristiques biochimiques sont déterminées en utilisant des plaques

d’identification des souches avec leur catalogue analytique. Les résultats

obtenus des plaques API20E pour les entérobactéries et Pseudomonas

aeruginosa sont dans le tableau No6 et pour Staphylococus aureus sont dans

tableau 7 (api Staph).

http://fr.wikipedia.org/wiki/Bact%C3%A9rie�


http://fr.wikipedia.org/wiki/Gram-n%C3%A9gative�












88

Tableau 6: Identification des entérobactéries et Pseudomonas aeruginosa par

Souches

API20E

Escherichia

Coli (I)

Pseudomonas

aeruginosa

Escherichia

coli (II)

Salmonella

typhi

ONPG

- + + +

ADH + - - -

LDC - + + -

ODC - - - +

CIT + - - +

H2S + - - -

URE

- - - -

TDA

- - - -

IND

- + + -

VP

- - - +

GEL

+ - - -

GLU - + + +

MAN - + + +

INO - - - -

SOR - - + +

RHA - + + +

SAC - + - +

MEL

- + + +

AMY - - - -

ARA - + + -

Ox

+ - - -

NO3-NO2 - + + +

N + 2 - - -

+ : teste positif. - : teste négative


89

Tableau 7: Identification de Staphylococcus aureus par plaque API STAPH

Souche Staphylococcus aureus 0 -

GLU +

FRU +

MNE +

MAL +

LAC +

TRE +

MAN +

XLT -

MEL -

NIT +

PAL +

VP +

RAF -

XYL -

SAC +

MDG -

NAG +

ADH +

+ : teste positif.

- : teste négative

3.4. L’évaluation de l’activité antibactérienne des huiles essentielles :

En utilisant la méthode de diffusion sur disque dans le milieu de gélose; on

constate que toutes, les souches testées sont sensibles aux huiles essentielles des

feuilles de Glycyrrhiza glabra, sauf pour Pseudomonas aeruginosa. L'huile

essentielle de Glycyrrhiza glabra feuilles a montré une réduction de croissance

plus élevée : Staphylococcus aureus (zone d'inhibition: 12 mm, MIC: 14,5 µ g /

ml) de zone d'inhibition, Salmonella typhi (13 mm, MIC :14.6 µg / ml),

Escherichia coli ATCC 25922 (zone d'inhibition: 9 mm, 14,2 µ g / ml) et

Escherichia coli ATCC35218 (zone d'inhibition: 10µMIC: 4,2 µ g / ml)

(tableau 8).


90

Tableau 8 : Zone Inhibition (mm) et MIC (µg/mL) pour les huiles

essentielles de Glycyrrhiza glabra

Microrganismes diametre des zones d’inhibition MIC((µg/mL)

(mm)

Pseudomonas Aeruginosa (G-) ATCC 27853 R R

Escherichia coli (G-) ATCC 25922 09 ±0.88 4.20

Escherichia coli (G-) ATCC 35218 10 ±0.90 4.20

Salmonella typhi (G-) NRRLB 4420 13 ± 0.63 14.60

Staphylococcus aureus (G+) ATCC 25923 12 ± 0.33 14.50

L’huile essentielle des feuilles de Glycyrrhiza glabra a montré une forte activité

contre toutes les bactéries testées sauf pour Pseudomonas aeruginosa qui a

résisté à une forte concentration en huiles essentielles. Le mécanisme de

résistance des bactéries est par leur pompe à efflux. Certaines molécules des

huiles essentielles inhibent activité de ces pompes, mais Pseudomonas

aeruginosa est une bactérie très résistante. (Voir photo 1et 2).

L’activité antimicrobienne de l’huile essentielle analysée peut être attribuée

principalement à son constituant majoritaire, par exemple les alcools terpéniques

qui sont particulièrement actifs contre les cellules microbiennes car ils sont

solubles dans les milieux aqueux et ils provoquent d’importants dégâts sur les

parois cellulaires des microorganismes (Fillippi et al ,2006).les alcools

possèdent une activité bactéricide plutôt que bactériostatique. (Hogg et al

,2005)


91

Photo 1 : Evaluation de l’activité antimicrobienne des huiles essentielles de la réglisse contre

Staphylococcus aureus selon la méthode d’aromatogramme.

Photo 2 : Evaluation de l’activité antimicrobienne des huiles essentielles de la réglisse contre

Pseudomonas aeruginosa selon la méthode d’aromatogramme.

L’activité antimicrobienne de l’huile essentielle analysée peut être attribuée

principalement à son constituant majoritaire, par exemple les alcools terpéniques

sont particulièrement actifs contre les cellules microbiennes, car solubles dans


92

les milieux aqueux et ils provoquent d’importants dégâts sur les parois

cellulaires des microorganismes (Filippi, et al 2006).

Le Linalool est un composé monoterpène parmi les principaux composants

volatils d’huiles essentielles de plusieurs espèces aromatiques. Très utilisé

dans la médecine traditionnelle grâce à son activité pharmacologique (Peana et

Moretti

Les composés, ayant la plus grande efficacité antibactérienne et le plus large

spectre, sont les phénols. Les phénols entraînent notamment des lésions

irréversibles sur les membranes et sont utilisés dans les infections bactériennes,

quelle que soit leur localisation. Ils exercent un effet inhibiteur et létal sur

différentes souches et, parmi elles, Escherichia coli et Staphylococcus aureus,

sur lesquelles ils provoquent des fuites d’ions potassium. Par contre, ils ne sont

pas actifs sur Pseudomonas aeruginosa. Les alcools avec 10 atomes de carbone

(ou monoterpénols) viennent immédiatement après les phénols, en terme

d’activité, avec le géraniol, linalool, terpinéol, pour les plus connus. Molécules

à large spectre, elles sont utiles dans de nombreuses infections bactériennes.

Les aldéhydes sont également quelque peu bactéricides. Les plus couramment

utilisés sont les citronnellal. Elles sont efficaces contre un large spectre de

microorganismes pathogènes et non pathogènes.

, 2002). Des recherches ont également signalé, une activité

antimicrobienne contre plusieurs bactéries et champignons (Carson et al

,2002). Par ailleurs, le linalool, ainsi que certains terpènes et terpénoïdes,

pourraient améliorer la perméabilité d'un nombre de médicaments à travers les

tissus biologiques comme la peau ou muqueuses (Kunta et al 1997. Plusieurs

activités biologiques, sont attribuables à ce composé monoterpène de forme

racémique. Les résultats obtenus par Peana et al 2002 ont confirmé la

présence d’une bonne propriété anti-inflammatoire. En terme d’activité

antibactérienne, c’est le linalool qui s’est montré le plus efficace et a inhibé 17

bactéries.


93

L’activité biologique d’une huile essentielle est liée à sa composition chimique,

aux groupes fonctionnels des composés majoritaires (alcools, phénols, composés

terpéniques et cétoniques) et à leurs effets synergiques.

Plusieurs études ont ainsi montré l’apparition de fuites d’ions potassium dans

des cellules microbiennes d’Escherichia coli et Staphylococcus aureus en

contact avec de l’huile essentielle (Spellberg Brad . ,2010).Cette fuite de

potassium est la toute première preuve de l’existence de lésions irréversibles au

niveau de la membrane de la bactérie ; certains des composants actifs d’huiles

essentielles, rendent perméable la membrane des bactéries, un effet précurseur

de leur mort. Les huiles essentielles de Glycyrrhiza glabra ont donc bien des

propriétés bactériostatiques.

Les études d’Inouye et al, 2001 ont examiné les effets antibactériens d’un

certain nombre d’huiles essentielles sur l’espèce Staphylococcus aureus parmi

les principaux microbes pathogènes du système respiratoire. L’activité de 14

huiles essentielles et de leurs principaux composants a montré l’effet de

sensibilité aux huiles essentielles. Les huiles essentielles contenant des

aldéhydes ou des phénols montraient l’activité antibactérienne la plus forte,

suivie par celle contenant des alcools terpéniques..

Les propriétés antibactériennes de cinq huiles essentielles ont été évaluées et

quantifiées sur une souche non toxigénique d’Escherichia coli. Cinq huiles

essentielles connues pour leurs propriétés antibactériennes ont été examinées et

les plus actives ont été sélectionnées pour d’autres essais. (Burt S., 2003)

Une étude a examiné le mécanisme d’action des huiles essentielles, leurs

composants à fonction alcoolique sur les bactéries Escherichia coli ont été

utilisées respectivement comme modèles de bactérie Gram+. Les deux huiles

essentielles tout comme leurs deux composants ont été capables d’induire une

lyse cellulaire. La lyse des bactéries a été montrée par la libération de substances

absorbant à 260 nm. Pour Escherichia coli, les résultats étaient similaires à ceux


94

obtenus avec de la poly myxine B. Cette libération des substances associée à la

rapide mortalité bactérienne pourrait être la conséquence de lésions sur les

enveloppes induites par les agents antibactériens. L’utilisation d’un microscope

électronique a permis de montrer que les huiles essentielles attaquaient en même

temps les membranes et les parois cellulaires (Rayour et al ;2003)

La membrane externe des bactéries Gram positifs est très chargée elle agit

comme une barrière aux huiles essentielles. Il a été suggéré que les huiles

essentielles actives contre les bactéries à Gram négatif contiennent des

composants de métabolites secondaires qui sont assez petits pour passer à

travers les protéines dans les récepteurs de la membrane externe et ainsi de

pouvoir accéder à la membrane cytoplasmique (Dorman et Deans, 2000).Dans

le cas des bactéries à Gram négatif ,les protéines, qui se trouvent dans la

membrane externe sont désactivées avant qu'elle n'atteignent la membrane

cytoplasmique et le cytoplasme (Fujisawa et al., 2009).la figure suivante

résume les différentes actions des huiles essentielles.


95

Figure 32:

Ensemble schématique de certains des mécanismes de l'activité antimicrobienne des

huiles essentielles dans la cellule bactérienne.(Benchaar et al. , 2011).


96

Toutefois, les produits des métabolites secondaires contenant de l'oxygène,

tels que les phénols, tendent à afficher une forte activité antimicrobienne. Les

groupes hydroxyles sont censés contribuer à la perturbation normale du

transport d'ions à travers la membrane cytoplasmique (Ultee et al, 2002) et dans

l'inactivation des enzymes microbiennes (Burt, 2004).

Selon Benchaar, 2011 l’hydrophobie semble être cruciale pour l'activité

antimicrobienne. Cela signifie que les huiles essentielles seront

préférentiellement une partition à partir de phase aqueuse dans la bicouche

lipidique de la membrane cytoplasmique où elles s'accumulent. C'est au sein de

la bicouche lipidique que les huiles essentielles sont considérées actives sur un

ou plusieurs de leurs effets antimicrobiens en modifiant la perméabilité

membranaire et ainsi de perturber les processus de transport d'ions et d'interagir

avec les protéines membranaires ou d'autres composants cytoplasmiques.

L’action des huiles essentielles obtenue est soit médiatisée au sein de la

membrane cytoplasmique, soit diffusée dans le cytoplasme. Comme les huiles

essentielles sont des mélanges de plusieurs métabolites secondaires, il est

probable qu'il y ait un certain nombre de mécanismes d'action (Figure 34).

Enfin, on peut dire que le traitement d’une infection se fait dans la plupart des

cas, à travers une antibiothérapie, qui a pour résultat une guérison quasi

instantanée. Mais un des effets secondaires de ce traitement est la destruction

d’une partie de la flore saprophyte en charge de notre immunité. Le malade peut

alors entrer dans un cercle vicieux où, plus il prendra d’antibiotiques, plus son

immunité diminuera et plus le risque de récidive infectieuse sera important.

Différentes publications soulignent que les huiles essentielles respectent la flore

intestinale.

Avec l’apparition de germes résistant même aux antibiotiques les plus

puissants, la popularité de l’huile essentielle est en train de refaire surface. En

face de ces résultats encourageants, des études supplémentaires sur un plus


97

grand spectre d'activité antimicrobienne des souches seront nécessaires. En fait,

l'isolement des composants d'huiles essentielles sont en progrès.

Conclusions et perspectives

99

Il existe dans la nature des ressources insoupçonnées qui seront les

solutions de demain, et c'est l'affaire de tous de les préserver.

Le contrôle de l’huile essentielle par les caractéristiques physiques et

chimiques permet de mettre en évidence la qualité de cette huile, se distingue

par un indice d’acide et des propriétés physiques et chimiques comparables à

ceux obtenus par la littérature concernant les huiles essentielles d’une façon

générale.

Notre travail fait partie d’un long et important axe de recherche dont le but

est de valoriser davantage nos ressources locales, notamment l’utilisation des

plantes aromatiques et médicinales dans plusieurs domaines, parmi lesquels

la technologie agro-alimentaire, l’amélioration des différentes qualités des

aliments ainsi que leur conservation.Dans cet axe, nous continuons le travail

sur l’une des plantes aromatiques utilisée, qui est la réglisse, dont l’effet des

extraits de racines et leurs caractérisations a déjà été étudié et on continue

toujours à mettre en évidence leurs valeurs; mais dans notre étude, nous nous

sommes intéressés à poursuivre le travail sur la partie aérienne de la plante

de réglisse qui a révélé des atouts et des caractéristiques assez intéressantes.

Les résultats de la mesure du pouvoir rotatoire ont permis de s’assurer de

la pureté de cette huile essentielle. La bonne miscibilité des huiles

essentielles de la réglisse montre la possibilité de l’utiliser dans les

préparations pharmaceutiques.

Notre étude a montré que l’huile des feuilles de Glycyrrhiza glabra est

de couleur jaune pâle, avec une odeur agréable et un goût caractéristique.

Le rendement en huile essentielle obtenu par l'hydrodistillation de plante est

moyen, comparé avec le rendement en huiles essentielles d’autre plantes.

Conclusions et perspectives

100

Les huiles contenant principalement plus de 35 composants ont été

séparés sur HP-Colum et vingt et un d’entre eux ont été identifiés comme

composante majeure qui représente 70% du total.L'identification des

composants chromatogrammes montré que cette espèce a été caractérisée par

son taux élevé de Isosteviol.

L’huile essentielle de Glycyrrhiza glabra présente un effet antibacterien

interessant principalement contre Salmonella typhi ,Staphylococcus aureus

Escherichia coli (ATCC 25922) et Escherichia coli (ATCC 35218).

Alors que cette huile s’est révélée inactive contre les Pseudomonas

aeruginosa.

Nous espérons que ces études vont être achevées pour bien cibler les

molécules principales responsables de ces effets antimicrobiens, ce qui fait

appel à des techniques de purification et d’identification via l’étude

photochimique et les analyses spectrales. La relation intime qui lie la

structure chimique et l'activité des huiles essentielles de la réglisse constitue

le fondement de l'aromathérapie scientifique et doit être étudiée dans d’autres

travaux. Tel que l’application pratique dans l'industrie alimentaire pour

réduire les impacts indésirables sur propriétés sensorielles et de prolonger la

durée de conservation de l’aliment.

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Truelle Adriant,2009. Jardin familial des plantes officinales

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-

Supplément à La Nature.Ed Tec.Doc.paris.p29-44.

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118

Nogueirae, Jorge Alexandre Saraivab, Maria Leonor Nunesa ,

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Wichtl Max, Anton Robert ,2003 .

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sinica.vol8p900.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=15794554&dopt=Abstract�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=15794554&dopt=Abstract�

http://www.amazon.fr/Max-Wichtl/e/B004N92VG0/ref=ntt_athr_dp_pel_1�

http://www.amazon.fr/Robert-Anton/e/B004N7BFHI/ref=ntt_athr_dp_pel_2�

http://en.cnki.com.cn/Article_en/CJFDTOTAL-DNYX199906030.htm�



120

Annexes

Tableau 8 : lecture de la galerie miniaturisée Api staphylocoques Tests substrat Caractères

recherchés

Résultats

négatif

Résultats

positive

0 Aucun Témoin négatif Rouge

GLU D-glucose Témoin positif

FRU D-fructose Acidification à

MNE D-manose partir du

MAL Maltose carbohydrate Rouge Jaune

LAC Lactose

TRE D-tréhalose

MAN D-mannitol

XLT Xylitol

MEL D-melibiose

NIT Nitrate de

potassium

Réduction

des nitrates

nitrites

Incolore/rose Rouge

PAL B-naphtyl

ac.phosphate

Phospahtase

alcaline

Jaune Violet

VP Pyruvate de

sodium

Production

d’acétyl

méthyl-

carbonyl

Incolore/rose Violet/rose

RAF Raffinose Acidification à

XYL Xylose partir du

SAC Saccharose carbohydrate

MDG -méthyl-D

gluosamine

Rouge jaune

NAG N-acétyl-

glucosamine

ADH Arginine Arginine

dihydrolase

jaune Orange/rouge

121

Tableau 9 : lecture de la galerie miniaturisée Api 20 E

Tests Substrat Caractère recherché Résultats Négative

Résultats positive

ONPG

Ortho-nitro-phenylgalactoside

Beta-galactosidase incolore Jaune

ADH Arginine Arginine dihydrolase Jaune Rouge/orangé

LDC Lysine Lysine décarboxylase Jaune Orangé

ODC Ornithine Ornithine décarboxylase

Jaune Rouge/orangé

CIT Citrate de sodium Utilisation du citrate Vert pâle/jaune Bleu-vert/vert

H2S Thiosulfate de sodium

Production d’H2S Incolore/grisâtre Dépôt noir/ fin

URE

Urée Uréase Jaune Rouge/orangé

TDA

Tryptophane Tryptophane désaminase

jaune Marron foncé

IND

Tryptophane Production d’indole jaune Anneau rouge

VP

Pyruvate de sodium Production d’acétoine incolore Rosé-rouge

GEL

Gélatine de Kohn Gélatinase Non diffusion Diffusion du pigment noir

GLU Jaune

Glucose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune

MAN Mannitol Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune

INO Inositol Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune SOR Sorbitol Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune RHA Rhamnose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune SAC Sacchar ose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune MEL

Melibiose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune

AMY Amygdaline Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune ARA Arabinose Fermentation/oxydation Bleu/bleu-vert Jaune Ox

Sur papier filtre Cytochrome-oxydase incolore Anneau violet

NO3-NO2 Tube GLU

Production de NO2

Jaune Rouge

N Tube GLU 2

Réduction au stade N2

Rouge

Jaune

122

Photo 3 : Evaluation de l’activité antibactérienne d’huile Essentielle de la réglisse contre

salmonella typhi selon la méthode d’aromatogramme.

Photo4 : Evaluation de l’activité antibactérienne d’huile Essentielle de la réglisse contre

d’Escherichia

coli ATCC 25922 selon la méthode d’aromatogramme.

123

Photo 5 : Evaluation de l’activité antibactérienne d’huile Essentielle de la réglisse contre d’Escherichia

coli ATCC35218 selon la méthode d’aromatogramme.

124

Cette méthode nous permet de différencier les bactéries dites Gram +

à celles Gram -.

Coloration de Gram :

-Mode opératoire :

-Réalisation des frottis :

Prendre 0.01 ml de l'échantillon à analysé.

Etaler l'échantillon en couche mince et régulière.

Séchage et fixation du frottis au-dessus de la flamme du bec Bunsen

pendant 5 min.

-Réalisation de la coloration :

-Coloration par le violet de gentiane ou cristal violet. Laisser agir de

30 secondes à 1 minute. Rincer à l'eau déminéralisée.

-Rejeter le colorant en inclinant la lame. Ne pas laver.

-Mordançage au lugol (solution d'iode iodo-iodurée): étaler le lugol et

laisser agir 20 secondes ; Rincer à l'eau déminéralisée. On peut --

réaliser une deuxième fois l'opération identiquement pour plus de

sécurité.

-Décoloration (rapide) à l'alcool (+acétone): verser goutte à goutte

l'alcool ou un mélange alcool-acétone sur la lame inclinée

obliquement, et surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet

doit être clair à la fin de la décoloration.

-Rincer sous un filet d'eau distillée.

-Recoloration à la safranine ou à la fuchsine. Laisser agir de 30

secondes à 1 minute.

-Laver doucement à l'eau distillée.

http://fr.wikipedia.org/wiki/Violet_de_gentiane�

http://fr.wikipedia.org/wiki/Lugol�

http://fr.wikipedia.org/wiki/Iode�

http://fr.wikipedia.org/wiki/Ã‰thanol�

http://fr.wikipedia.org/wiki/AcÃ©tone�

http://fr.wikipedia.org/wiki/Safranine�

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fuchsine�

125

-Sécher la lame sur au-dessus de la flamme du bec Bunsen

-Observer avec une goutte d'huile à immersion objectif 100x.

-Remarque:

Les bactéries Gram + sont colorées en bleu ou violet

Les bactéries Gram - sont colorées en rouge ou rose

Méthode Mc Farland :

Normes Mc Farland sont utilisées comme référence pour ajuster la

turbidité de suspensions bactériennes de telle sorte que le nombre de

bactéries sera dans une plage donnée.

Original normes Mc Farland ont été mélangeant des quantités spécifiées

de chlorure de baryum et d'acide sulfurique ensemble. Mélange des deux

composés forme un précipité de sulfate de baryum, ce qui provoque la

turbidité dans la solution. A 0,5 standard McFarland est préparé en

mélangeant 0,05 ml de chlorure de baryum dihydrate 1,175% (BaCl2 •

2H2O), avec 9.95 ml d'acide sulfurique à 1% (

H2SO4).

126

Composition des milieux de cultures utilisées :

1-Composition gélose nutritive :

-extrait de viande 1,0g

-extrait de levure 2.5g

-peptone 5,0g

-chlorure de sodium 5,0g

-Agar 15,0g

pH = 7,0

2-Composition de la gélose Mueller-Hinton :

Infusion de viande de bœuf:300,0 ml

Peptone de caséine:17,5 g

Amidon de maïs:1,5 g

Agar: 17,0 g

pH = 7,4

http://fr.wikipedia.org/wiki/Extrait_de_viande�

http://fr.wikipedia.org/wiki/Levure�

http://fr.wikipedia.org/wiki/Peptone�

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chlorure_de_sodium�

http://fr.wikipedia.org/wiki/Agar-agar�

http://fr.wikipedia.org/wiki/Potentiel_hydrog%C3%A8ne�

127

Identification et determination des formes chimiques des principaux

composés majeurs par SM :

Molécule :linalool

Molécule : trans-Permethrin

Molécule : acide aspartic


0

100%

0

100%

28 48 68 88 108 128 148 168 188 208 228 248 268 288 308 328 348 368 388 408 428 448 468 488 508m/z0

100%

59

43 55 9367 8371 11197 120 137154 209166 176 202 282260218 248 309290 420345322 403358 455430 472 482

Ech Reglisse 1954 (14.691) Rf (7,5.000)2.20e8

594355

9368 81

Hit 1R:992 WILEY 58071: LINALOOL OXIDE (2) $$ 2-FURANMETHANOL, 5-ETHENYLTETRAHYDRO-.ALPHA.,.ALPHA.,5-TRIMETHYL-, CIS

4355 11167 83 93

Hit 2R:967 WILEY 119916: PALUSTROL


0

100%

0

100%

27 47 67 87 107 127 147 167 187 207 227 247 267 287 307 327 347 367 387 407 427 447 467 487 507m/z0

100%

70

41 55 69 988572 141112 127 170148 208178 223 284265235 248 346293 331323 401354 393 458416 427 465 491

Ech Reglisse 2128 (15.723) Rf (7,5.000)2.81e9

70

42 56 71 1139884

Hit 1R:811 WILEY 11078: TRANS-N-I-PROPYL-2,3-DIMETHYL-2,3-DIHYDRO-AZIRIDINE

56

554228

7069 9871

84 141113 126

Hit 2R:793 WILEY 28893: BORANAMIN, N-ETHYL-1,1-DIPROPYL-


0

100%

0

100%

27 47 67 87 107 127 147 167 187 207 227 247 267 287 307 327 347 367 387 407 427 447 467 487 507m/z0

100%

69

41 55139

8379 1129199 137 140 154209170 194 221 262234 247 291284 379355328302 347 367 398 420 488

Ech Reglisse 2149 (15.847) Rf (7,5.000)2.46e9

13941 69

55 83154

Hit 1R:951 WILEY 41928: (2S,4R)-2-(2-METHYL-1-PROPENYL)-4-METHYL-TETRAHYDROPYRAN

6941 55

139

837097 109121 154

Hit 2R:928 WILEY 41387: ROSE OXIDE $$ 2H-PYRAN, TETRAHYDRO-4-METHYL-2-(2-METHYL-1-PROPENYL)- (CAS)

128

Molécule : Bicyclo[4.1.0]hept-2-ene, 3,7,7-trimethyl

Molécule : Benzene

Molécule : 2-Propenenitrile, 2-methyl-


0

100%

0

100%

30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 470 490 510m/z0

100%

1079141 7953 67 95

135108 150

180167 207 242216 274259 463344335312298 423415372 398 476 485

Ech Reglisse 2676 (18.970)2.23e8

10791803927 55 67 95

135108 150

Hit 1R:953 Nist 60401: BICYCLO[3.1.1]HEPT-3-EN-2-ONE, 4,6,6-TRIMETHYL-, (1S)-

107

9179

135108 150

Hit 2R:952 WILEY 36664: BICYCLO[3.1.1]HEPT-3-EN-2-ONE, 4,6,6-TRIMETHYL- (CAS) $$ BERBENONE $$ 2-PINEN-4-ONE $$ VERBENO


0

100%

0

100%

30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 470 490 510m/z0

100%

9177655043 89

10492 133

115149

155 169 208195 269238223 263 282 293 314

Ech Reglisse 2834 (19.906) Rf (7,5.000)2.45e9

28

2791

775139 65104

133118

Hit 1R:805 NBS 97: BENZENE, (AZIDOMETHYL)-

28

2791

775139 65104

133118

Hit 2R:798 WILEY 22200: BENZENE, (AZIDOMETHYL)- (CAS) $$ BENZYL AZIDE $$ (AZIDOMETHYL)BENZENE $$ .ALPHA.-AZIDOTOLUEN


0

100%

0

100%

19 69 119 169 219 269 319 369 419 469 519m/z0

100%

91795541 69 105131

161145 187 205 220233 248

Ech Reglisse 4741 (31.209) Cm (4723:4756-4799:4801)8.29e8

6967 9379 105 135121 189 204 222

Hit 1R:911 Nist 27825: 1-METHYLENE-2B-HYDROXYMETHYL-3,3-DIMETHYL-4B-(3-METHYLBUT-2-ENYL)-CYCLOHEXANE

41

27 55 918167 107 177133121 147 159 189 220205

Hit 2R:862 Nist 2519: AROMADENDRENE OXIDE-(2)

129

Molécule : Methacrylonitrile

Molécule : Prasterone

Molécule : Isoniazid


0

100%

0

100%

20 70 120 170 220 270 320 370 420 470 520m/z0

100%

91695541 79 136107 117149 161

187 204 220 236 283 324

Ech Reglisse 4623 (30.509) Cm (4612:4628-4570:4577)1.59e9

6967 9379 105 135121 189 204 222

Hit 1R:910 Nist 27825: 1-METHYLENE-2B-HYDROXYMETHYL-3,3-DIMETHYL-4B-(3-METHYLBUT-2-ENYL)-CYCLOHEXANE

13641 6955 9179 109 119

159149177 187

205 220

Hit 2R:884 Nist 79814: 10,10-DIMETHYL-2,6-DIMETHYLENEBICYCLO[7.2.0]UNDECAN-5.BETA.-OL


0

100%

0

100%

19 69 119 169 219 269 319 369 419 469 519m/z0

100%

1611059141 55 7767 119 131 145 187162 205

220 238 268253 277 304 357341 462

Ech Reglisse 4455 (29.512) Cm (4449:4460-4432:4440)2.26e9

1611059177

119147131 190162

Hit 1R:898 Nist 93508: 5,6-DECADIEN-3-YNE, 5,7-DIETHYL-

1611194339 1059155 7767 133 147 173 206188

Hit 2R:840 Nist 93541: 5-ISOPROPYLIDENE-4,6-DIMETHYLNONA-3,6,8-TRIEN-2-OL


0

100%

0

100%

20 70 120 170 220 270 320 370 420 470 520m/z0

100%

695543 9177107 123135 149 161 177

205 220 236

Ech Reglisse 4415 (29.274) Cm (4394:4419-4430:4438)1.85e9

55 7967 10991 121152135 165 318300203175 259229 275

Hit 15R:727 Pfleger 3680: Isosteviol @ P1589 Univ Homburg/Saar

1239341

2955 69 81

105 204133 161147 189175

Hit 16R:726 NBS 16920: THUJOPSENE

130

Molécule : Benzoic acid

Molécule : Diethyltoluamide


0

100%

0

100%

20 70 120 170 220 270 320 370 420 470 520m/z0

100%

15910591437955 69

119131 147 174 192 207220 234 250 267 296 309 341

Ech Reglisse 3510 (23.911) Cm (3498:3519-3439:3464)1.08e9

1059167

55 79 92 119 189147131 160173 236 262 316

Hit 2R:754 Pfleger 4355: Arachidonic acid-M -H2O ME @ P1577 Univ Homburg/Saar

15943

30121107915753 7971 134 202160

220

Hit 3R:752 Nist 92217: ETHANONE, 1-(1,3A,4,5,6,7-HEXAHYDRO-4-HYDROXY-3,8-DIMETHYL-5-AZULENYL)-


0

100%

0

100%

15 65 115 165 215 265 315 365 415 465 515m/z0

100%

6941 65 1059177 190121 175133 147 192 207219 236 261 269

Ech Reglisse 3488 (23.781) Cm (3476:3493-3464:3472)1.97e9

1901481339141 695577 119105

175

157 176 191

Hit 4R:725 Nist 107547: MEGASTIGMATRIENONE

69

4127 65

1211059177 190175133 147

Hit 5R:722 NBS 7890: 2-BUTEN-1-ONE, 1-(2,6,6-TRIMETHYL-1,3-CYCLOHEXADIEN-1-YL)-, (E)-

Jeobp 14 (3) 2011 pp 284 - 288 284

Journal of Essential Oil Bearing PlantsISSN Print: 0972-060X Online: 0976-5026www.jeobp.com

Chemical Composition and Antimicrobial Activities ofthe Essential Oil from Glycyrrhiza glabra Leaves

O. Chouitah 1*, B. Meddah 1, A. Aoues 2, P. Sonnet 3

1 LRSBG, Equipe, Chimie des substances naturelles et innovationthérapeutique, Université de Mascara - 29000, Algérie

2 Laboratoire de Biochimie Faculté des Sciences, Université d’Oran - 31000Algérie3 UMR-CNRS 6219, Laboratoire des glucides, UFR de Pharmacie,

Université de Picardie Jules Verne, 1 rue des Louvels, Amiens, 80037, FranceReceived 23 October 2010; accepted in revised form 12 February 2011

Abstract: The essential oil ofGlycyrrhiza glabra leaves was obtained by hydrodistillation and analyzedby GC and GC-MS. Other parameters such as refractive index, optical rotation; density, polarimetric deviation;freezing point and Solubility in ethanol are also measured. The main hydrocarbon and oxygen containingcompounds were: Isoniazid (13.36 %) ; Diethyltoluamide (6.56 %), Benzoic acid (5.37 %), Benzene (4.58%), Linalool (2.25 %), Prasterone (5.63 %),Warfarin (1.43 %), Iodoquinol (1.90 %), Phenol, 4-(2-aminopropyl)(1.30 %). The screening of antibacterial activity was conducted by a disc diffusion test and the minimuminhibitory concentration was determined against Pseudomonas Aeruginosa, Salmonella typhi, Escherichiacoli and Staphylococcus aureus.

Key Words: Glycyrrhiza glabra, Essential oil, antimicrobial activity.

Introduction: Licorice has been used and valued for thousands of years and found in the tombsof ancient Egyptian pharaohs, widely used as a flavoring agent. This familiar herb also has manytherapeutic benefits. It was used in ancient Greece and during the Roman Empire to treat manyillnesses. Licorice has also played a prominent role in Chinese herbal medicine 1.

Essential oils are steam volatile oils, distilled from plant materials and represent the typicalflavor and aroma (the essence) of a particular plant and everlasting essential oil is very valuable in theperfume and flavoring industries 2. They are found in flowers, leaves, roots, seeds and barks 3. Thisplant is known for its anti-inflammatory, anticancer, and antifungal activity 4. The flavonoid derivativeswere isolated and identified from the plant antioxidant extracts 5. The oil chemical composition isvariable, depending on the origin and the cycle’s vegetation 6. The aim of this study was to determinethe chemical composition and antimicrobial activities of the essential oil ofGlycyrrhiza glabra leaves.

ExperimentalPlant material:Leaves ofGlycyrrhiza glabrawere collected fromDjidioua Relizane (Algeria)

inApril 2009.This plant was identified by botanistsMOUSSAOUIAbdallah and Stord in theHerbarium

*Corresponding author (O. Chouitah)E-mail: < [email protected] > © 2011, Har Krishan Bhalla & Sons

www.jeobp.com

O. Chouitah et al. / Jeobp 14 (3) 2011 284 - 288 285

of Natural sciences Faculty, Mascara University (voucher n.-2009-6601).The essential oils wereobtained by hydro-distillation from the plant material using a Clevenger –type apparatus for 3 h. Theessential oil was dried over anhydrous sodium sulphate and stored at +4°C 7. The essential oil yieldwas calculated on a dry weight by gravimetric method

Gas chromatographic - Mass spectrometric analysis::The analyses of the volatile constituentswere run on a Hewlett-Packard GC-MS system (GC :5890 series II, MSD 5972) the fused-silica HP-5MS capillary Colum (30 m X 0.25 mm id, film thickness of 0.25 μm) was directly coupled to theMS.The carrier gas was helium, with a flow rate of 1.2ml/min. Injector port 250°Cand oven temperaturewas programmed as flows: isotherm at 50°C for 1 min, then increased to 280°C at a rate of 5°C/minand subsequently held isothermal for 20 min. Detector : 280°C, volume injected: 0.1 μl of 1 % solution(diluted in hexane) and split ratio: 1:50. Ionization voltage: 70 ev ion source temperature 280°C, massrange: 40-300; mass units scan time 1,5 sec. Software adopted to handle mass spectra andchromatograms was a skin station. The extract composition percentage was calculated from the GCpeak area.

For retention indices (RI) determination, a hydrocarbon series was chromatographed togetherwith the essential oil on apolar columns, and their retention times were used to convert GC retentionvalues to RI by linear interpolation with those of authentic compounds and literature data 9, and alsoby computer matching themwith the NIST mass spectral library data with those of the published databy Adams 10-11.

Microbial strains: The essential oil was tested in vitro against five bacteria gram negative:Pseudomonas Aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella typhi (NRRLB 4420), Escherichia coli (ATCC25922) andEscherichia coli (ATCC 35218) and gram-positive bacteria: Staphylococcus aureus (ATCC25923). All strains were supplied by the hospital of Mascara (Algeria).These strains were kept forlong term storage in glycerol at – 20°C and for short term storage on tryptone soya agar at 4°C.

Antimicrobial activity:Antimicrobial tests were carried out using the disc diffusion method.The muller-hinton mutriet agar and dimethyl sulfoxide (DMSO) solutions (in ratio 1:25 v.v-1) werevortexes for 2 min and immediately 20 ml were poured into sterile Petri dishes (90 mm diameter) andleft to set for 30 min. Paper discs (6 mm diameter) were impregnated aseptically with 3 μl of essentialoil at final concentrations of 1-20 μg/ml and placed on the inoculated agar surfaces. After aerobicincubation for 24 hours at 37°C, the antimicrobial activity was estimated by measuring the diametersof inhibition zone12. The control test by aqueous DMSO alone showed no toxicity in the concentrationsused for these bacteria.

The antibactrial minimum inhibitory concentrations (MICs) were performed according to theMueller-Hinton broth microdilution method in 96 multiwell microtiter plate. The essential oils weredissolved in the aqueous DMSO and the initial concentration was 25 μg/ml. The initial test concentrationwas serially diluted two fold. Each well was inoculated with 5 μl of suspension containing 107 CFU/ml of bacteria and incubated for 24 hours at 37°C. The MIC of the tested material was determined asthe lowest concentration at which no visible growth of the microorganism had occurred. Each test wascarried out in triplicate.

Results and discussion : Physicochemical analysis showed an essence pale yellow, with pleasantodor and taste characteristic. The essential oil yield obtained by the hydro-distillation of dry plant was0.65 %. Determination density was obtained by double weighing d = 0.906, the optical activity ± =+22.157 by polarimetry and the refractive index n = 1.4614 by an interferometric method. Thechromatograms of the essential oil had numerous peaks and many of them were overlapping. More

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than 35 components were separated on HP- Column and twenty one of them were identified as majorcomponent representing of 70 % of the total (table 2). The identification of chromatogram componentdemonstrated that this species was characterized by its high rate in Isosteviol. Chemical analysis ofessential oil showed that its major products were Isoniazid (13.36 %) Methacrylonitrile (9.69 %);Benzoic acid (5.37 %); Diethyltoluamide (6.56 %); Pyrazine,1,4-dioxide (2.20 %) Benzene (4.58 %),linalool (2.25 %); Bicyclo [4.1.0]hept-2-ene,3,7,7-trimethyl (2.80 %). Other components were presentwith smaller percent. The GC-MS analyses allowed us to identify the major bioactive componentswhich possess interesting inhibitory action against microorganisms.

By other findings, the essential oil from the aerial parts of licorice (Glycyrrhiza uralensis Fisch)used in Traditional Chinese Medicine. 28 components representing 74.39 % of the total oil contentwere identified in this species. The main compounds in the oil were β-cadinene (12.28 %), β-caryophyllene (10.04 %), γ-cadinene (9.49 %), phytol (8.43 %), α-cadinene (4.43 %), caryophylleneoxide (3.65 %) and α-gurjunene (3.48 %) 13. Using the direct contact technique in agar medium andmicrodilution method in 96multiwell microtiter plate; all the strains tested were essential oil sensitivewith a wide inhibition zone except for Pseudomonas aeruginosa. Little is known about the extractionof the essential oil fromGlycyrrhiza glabra leaves which has demonstrated higher growth inhibitionsof the medically important pathogens (table 3): Staphylococcus aureus (inhibition zone: 12 mm,MIC:14.5 μg/mL), Salmonella typhi (inhibition zone : 13 mm, MIC:14.5 μg/mL), Escherichia coliATCC 25922 (inhibition zone: 9 mm, MIC: 4.2 μg/mL) and Escherichia coliATCC 35218 (inhibitionzone: 10 mm, MIC: 4.2 μg/mL). Our results from licorice oil found in Algeria may be regarded as aIsoniazid chemotype and its broad spectrum of activity against bacteria supports the traditional usesof this plant as disinfectant. The oil could be exploited to treat topical infections. In front of theseencouraging results, further studies on a larger specter of antimicrobial strains activity will be necessary.Actually, the isolation of the essential oil components are under progress.

Acknowledgements: This work was supported by the Ministry of high school and scientificresearch of the republic of Algeria, CNEDRU project: 037200614

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Table 1. Physicochemical composition ofGlycyrrhiza glabra essential oils

Specification Glycyrrhiza glabra

Density D20 0.906Refractive index N20 1.4614Optical activity +22.157Solubility in ethanol 90 % 1:3Freezing Point (°C) -18Acidité 0 .49

Table 2. The major identified components in essential oil fromGlycyrrhiza glabraanalyzed by GC-MS technique with retention indices on HP-5MS capillary Column

Compounds RI %

Ethylenimine 505 1.57Methacrylonitrile 574 9.692-Propenenitrile, 2-methyl- 631 7.86Benzene 680 4.583-Cyclohexen-1-ol, 4-methyl-1-(1-methylethyl) 702 1.32Bicyclo[4.1.0]hept-2-ene, 3,7,7-trimethyl 948 2.804-Pyridinamine 986 1.43Linalool 1082 2.25Benzoic acid 1150 5.37Aspartic acid 1310 1.44Phenol, 4-(2-aminopropyl)- 1392 1.30Phenol, 2-methoxy-4-(1-propenyl)-, (E)- 1410 1.30Isoniazid 1431 13.3Diethyltoluamide 1505 6.56Prasterone 2139 5.63Retinol 2238 1.40Iodoquinol 2254 1.90Warfarin 2636 1.43trans-Permethrin 2756 1.57Pyrazine, 1,4-dioxide - 2.20Hydrochlorothiazide - 2.20

RI: Rétention Indices


Table 3. Inhibition zone (mm) using direct contact technique in agar medium and MIC(μg/mL) for the essential oil using microdilution method in 96 multiwell microtiter plate

Microorganism Diameter of inhibitionzones (mm)

MIC (μg/mL)

Pseudomonas Aeruginosa (G-) ATCC 27853Escherichia coli (G-) ATCC 25922

R09 ± 0.88

R4.20

Escherichia coli (G-) ATCC 35218 10 ± 0.90 4.20Salmonella typhi (G-) NRRLB 4420 13 ± 0.63 14.60Staphylococcus aureus (G+) ATCC 25923 12 ± 0.33 14.50

R : resistant

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Composition chimique et activité antibactérienne des ... · Laboratoire de Recherche sur les systèmes biologiques et Géomatiques Laboratoire de biotoxicologie expérimentale,