Rencontre Agence de l’Eau Artois-PicardiePerturbations endocriniennes

Contamination et effets des Contamination et effets des xxéénono--oestrogenesoestrogenesdans le compartiment aquatique en Manche dans le compartiment aquatique en Manche

OrientaleOrientale

C. MinierC. Minier

Lille, 23 novembre 2006

Les Les perturbateursperturbateurs endocriniensendocriniens : : StratégieStratégie de de rechercherecherche

Les questions :Les questions :Quels contaminants sont présents dans l’environnement?

Sont-ils biodisbonibles ?

Ont-ils des effets mesurables ?

La démarche :La démarche :Identifier les composés biologiquement actifs

Intégrer différents niveaux d’organisation biologique

L ’oestrogénicité des échantillons d ’eau et de sédiment

Le test YES (yeast estrogen screen) est basé sur l’expression du récepteur humain à l’oestradiol couplée à un gène rapporteur dans une levure génétiquement modifiée 0 0,2 0,4

E2 equiv. (ng/L)

Yville

Poses

ER receptor

E2

transcription traduction

Identification des Identification des composcomposééss actifsactifs

Profil HPLC de l ’eau

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59

Temps (minutes)

Abs

orba

nce

(AB

S

Profil HPLC des extraits tissulaires

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59

Temps (minutes)

Abs

orba

nce

(AB

S

1 1 –– Fractionnement HPLC 2 Fractionnement HPLC 2 –– Dosage de l’activitéDosage de l’activité

Accumulation et Accumulation et métabolisationmétabolisation de de l’estradioll’estradiol

Total [14C] residue data over time in mussels.

0

5

10

15

20

25

30

0 5 10 15 20 25 30Total time (days)

14C

Activ

ity (n

g- o

estra

dio

equi

vale

nts/

g tis

sue)

ClearanceExposure

Time (mins)

CPM

Chromatogramme HPLC des composés radiomarqués

présents dans les tissus de moules exposées au [14C] oestradiol

Métabolite 2

Métabolite 1

concentration moyenne dans l’eau : 9,4 ± 2,9 ng/Lfacteur de bioconcentration après 13 jours: 2428 ± 257

ActivitActivitéé oestrogoestrogééniquenique (YES) (YES) moulesmoules

Ouse Arun

Le Havre

Antifer

Somme

Oye

Whitstable North Foreland

Pegwell Bay Ramsgate Sevenoakes

Rother

Poses

La Bouille

Yville-sur-Seine

Amiens

Douai

Audruicq Don

100 Km

Caudebec

Oissel

Résultats négatifsRésultats positifsRésultats positifs, activité forteNon analysé

ActivitéActivité estrogénique de la bile de estrogénique de la bile de gardonsgardons des des rivièresrivièresdudu nordnord de la Francede la France

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Bile

est

roge

nici

ty (

ng E

Eq /

.

µL)

Poses

Elbe

ufOiss

elRou

enDuc

lair

Gourn

ayDam

pier

reEr

quig

hemNor

thke

rque

Audru

icq Ailly

Eauc

ourt

Amie

ns

DonBru

ay

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59

Time (minutes)

Abso

rban

ce (A

BS)

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59

Time (minutes)

Abso

rban

ce (A

BS)

Gournay en Bray Duclair

Identification des Identification des composcomposééss actifsactifs

Induction de la synthèse de Induction de la synthèse de vitellogéninevitellogénine chez les poissons mâleschez les poissons mâles

Liver Gonads

Vitellogenine

Oestradiol

TauxTaux de de vitellogéninevitellogénine dansdans le plasma de le plasma de gardonsgardons mâlesmâles

Des concentrations très significatives ( > 100µg/L) sont trouvés dans certains sites

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

1,E+05

Ailly

Amie

ns

Don

Dam

pier

re

Gou

rnay

Ois

sel

Elbe

uf

Mar

tot

Fren

euse

Pose

s av

al

Vite

llogé

nine

(µg/

L)

mâles

1 102 104 106 108

TyneThamesCrouchMersey

AldeLiverpool BayMer du Nord

Noordwijk

Estuaire de Seine

VTG (ng.mL-1)

Un estuaire des plus perturbés d’Europe

TauxTaux de de vitellogéninevitellogénine dansdans le plasma de le plasma de fletsflets mâlesmâles

Recherche d’un gène de la Recherche d’un gène de la vitellogéninevitellogénine chez chez MytilusMytilus edulisedulis

1. Identification du gène:une portion de 720bp, de séquence homologue à celle de l’huître, a été isolée

2. Étude de l’expression du gène par QPCR

Quantification de l’expression de la Quantification de l’expression de la vitellogéninevitellogénine chez M. chez M. edulisedulis

Niveaux relatifs de vtg mRNA dans les gonades(valeurs individuelles) collectées dansdifférents sites en Manche Orientale

Figure 4.7. VTG relative levels in M.edulis gonads exposed toequivalent of 10% sewage effluent. C- Control group, E- Exposed group, number- sampling day, M- males, F- females. Datapresented as individual values. N=>5

0,0E+00

1,0E-06

2,0E-06

3,0E-06

4,0E-06

5,0E-06

6,0E-06

7,0E-06

M F M F M F M F

C 3 E 3 C 10 E 10

VTG

/18S

rRN

A ra

tio0

0,0000005

0,000001

0,0000015

0,000002

0,0000025

0,000003

Males Females Males Females Males Females Males Females Males Females

Quend-Sept. Quend-March LeHavre-March Littlehampton-March

Newhaven-March

Sites/Sex

VTG

/18S

rRN

A ra

tio

Effet de traitement par effluent de STEP

Les marqueurs moléculaires peuvent-ils être reliés à la physiologie?

La gamétogenèse Le développement

Différenciation prématurée ou retardée réduction du GSI

Altération de la production d’ovocytes

Individus intersexués

EffetsEffets sursur les les individusindividus

Développement des gonadesDéveloppement des gonades

IntersexIntersex et et développementdéveloppement gonadiquegonadique (GSI)(GSI)

y = 0,11x + 3,7161R2 = 0,734

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Poucentage d'intersexués

GSI

(%)

Mâles Femelles

Effets sur la Effets sur la gamétogénèsegamétogénèse

Poissons intersexuésPoissons intersexués

Flet

Chevenne

GoujonGardon

IntersexualisationIntersexualisation des des poissonspoissons

Analyse en coursAbsence d’intersexuésPrésence d’intersexués

Ovocytes polynucléairesOvocytes polynucléaires

100µm

Des ovocytes polynucléaires ont seulement été déjà observés chez des rats exposés à de fortes doses de DES et chez les alligators du lac Apopka

NécrosesNécroses

0 10 20 30 40

occurence (%)

Intersex

Males

les nécroses sont plus fréquentes chez les poissons intersexués

Certains extraits sédimentaires contiennent des mutagènes directs

MesureMesure dudu potentielpotentiel mutagènemutagène par SOS par SOS chromotestchromotest

Le test SOS chromotest est basé sur l’expression du système de réparation de l’ADN (sfiA gene) dans E. coli (Quillardet & Hofnung, 1985)

Limite inférieure de mutagénécité

0

1

2

3

4

5

6

7

8

blank NQO Poses Oissel La Bouille Yville

SOS

indu

ctio

n fa

ctor

Upstream downstream reference

0

1

2

3

4

5

6

7

Al-F1 Al-F1blank

Al-F2 Al-F2blank

Al-F3 Al-F3blank

Si-F4 Al-F4blank

Si-F5 Al-F5blank

Si-F6 Al-F6blank

SOS

indu

ctio

n fa

ctor

crude organic fraction

polar fraction

aliphaticfraction alcane

PAH & PCB

unknown polar compounds

Les mutagènes indirects correspondent vraisemblablement à des HAP mais d’autres composés semblent impliqués

Identification des composés mutagènes Identification des composés mutagènes

Certains extraits contiennent des mutagènes directs

PotentielPotentiel mutagènemutagène après après bioactivationbioactivation (fraction S9 de rat)(fraction S9 de rat)

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

blank BaP Poses Oissel La Bouille Yville

SOS

indu

ctio

n fa

ctor

Upstream downstream reference

Carte des sCarte des séédiments potentiellement mutagdiments potentiellement mutagèènes identifines identifiéés par le SOS s par le SOS ChromotestChromotest

Le Havre

Amiens

Audruicq

Don

Bruay sur Escaut Quend-plage

Gournay-en-Bray

Dampierre-en-Bray

Poses Oissel

Antifer

Yville-sur-Seine

La Bouille

Absence de composés mutagénes

Présence de composés pro-mutagènes

Présence de composés mutagènes

35,9

0

34,2

39,6

0 20 40 60 80 100

percentage (% )

Roach

Eel

Gobby

Flounder

malefemale

SexSex ratios de quelques espèces présentes en estuaires de Seineratios de quelques espèces présentes en estuaires de Seine

663

667

73

27

Number of fish observed

ConclusionsConclusions

• Les milieux aquatiques (tous?) de la région Manche Orientale sont contaminés par des composés à activité oestrogénique

• Ces composés sont bioaccumulés dans les organismes aquatiques

• Ils sont responsables d’effets sur les organismes vivants• La signification écologique de ces perturbation est incertaine

bien qu’elle concerne de nombreuses espèces et un mécanisme d’action très conservé

AcknowledgementsAcknowledgements

Thanks to everybody who help in this study …