62 BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA VOL. 1 5 (1954)

C O N T R I B U T I O N A L ~ T U D E D E LA S T R U C T U R E

D E LA S A L M I N E D ' O N C O R H Y N C H U S

II. t~TUDE DE QUELQUES PEPTIDES Rt~SULTANT

DE L 'HYDROLYSE TRYPSIQUE

pa r

R O G E R M O N I E R ET M A R I A N J U T I S Z

Laboratoire de Ghimie biologique de la Facult~ des Sciences, Paris (France)

L'6tude des hydrolysats acides partiels de la salmine d'Oncorhynchus nous a permis de pr6ciser les enchalnements de quelques-uns des r6sidus d'aminoacides neutres qu'elle contient 1. La fragilit6, au cours de l 'hydrolyse acide,, de certaines liaisons peptide dont nous pouvions soup~onner l'existence dans la chalne de la salmine, nous a amen6s utiliser comme mode de d6gradation partielle susceptible de respecter ces liaisons, l 'hydrolyse trypsique. L'on sait en effet que la trypsine possSde vis k vis des substrats synth6tiques une sp6cificit6 6troite 2, 3 qu'elle semble conserver lorsqu'elle agit sur une prot6ine a. Dans le cas particulier de la salmine, on peut donc s'attendre & ce que son action soit limit6e ~t des liaisons situ6es du c6t6 carboxyliqne de r6sidus d'arginine. Le nombre 61ev6 de ces liaisons (34 r6sidus d'arginine sur un total de 50 r6sidus) permet d'ailleurs d'obtenir une d6gradation tr~s profonde 5 qui se traduit par l 'apparition de nombreux peptides courts.

P~kRTIE EXPI~RIMENTALE

Hydrolyse par la trypsine

Le chlorhydrate de salmine utilis6 est obtenu par chromatographie d'une solution aqueuse de sulfate sur un 6changeur d'anions (Dowex I ; 200-400 mesh) et neutralisation du filtrat par l'acide chlorhydrique.

Les conditions d'hydrolyse sont les su ivantes :A une solution de chlorhydrate de salmine k 0.5% dans un tampon borate M/2o (pH 7.8) renfermant C12Ca ~ la concen- tration M/Ioo e, on ajoute de la trypsine cristallis6e (Worthington Lab.) de fa~on r6aliser un rapport pond6ral enzyme/substrat de 1/5o et on maintient ~ 37 ° pendant 5 heures. Dans ces conditions, le nombre des liaisons peptide rompues par mol6cule (m~thode VAN GLYKE) est de 18 ~ 19.

Fractionnement de l'hydrolysat par extraction d~ contre-courant

Quelle que soit la structure d6taill6e de la mol6cule de salmine, les diff6rents types

de liaisons qu'elle peut renfermer sont repr6sent6s dans un sch6ma: ..-Arg~'(X)n •

Arg-~Arg ¢.--, dans lequel X d6signe un r6sidu d'un aminoacide neutre quelconque; les

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VOL. 15 (1954) STRVCTtlRE DE LA SALMINE D'Oncorhynchus II 63

fl~ches indiquent les liaisons dont la rupture par ia trypsine parait possible a priori. I1 en r6sulte qu'apr~s action de la trypsine sur la salmine, il doit exister dans l 'hydrolysat des peptides de formule g6n6rale (X)n'Arg qui renferment un ou plusieurs r6sidus neutres et un seul r6sidu d'arginine. Tous les autres peptides imaginables k partir du sch6ma indiqu6 renferment au moins deux r6sidus d'arginine (pax ex. : Arg. (X)n'Arg; (X)n'(Arg)m; (Arg)p). On utilise cette diff6- rence dans la teneur en arginine de peptides r6sultant de l 'hydrolyse trypsique pour frac- tionner l 'hydrolysat.

Pour cel~t, on transforme les peptides de l 'hydrolysat en leurs d6riv6s dinitro- ph6nyl6s (DNP) ~ l'aide de la technique de GANGER 7. et on goumet le m6lange de DNP- peptides ~ un fractionnement ~ contre-cou- rant dans un appareil h transfert automatique de CRAIG s. Le syst~me solvant utilisd est le syst~me n-butanol--eau, le volume de chaque phase 6tant de IO ml. A la fin de l'op6ration, c haque fraction est examin6e au photom~tre ~ 4o0 m~ (voir courbe de la Fig. I) et son contenu, analys6 par chromato- gvaphie sur papier dans le m~lange n-butanol- acide formique-eau.

En fonction des indications fournies par ces deux modes d'analyse, les fractions de l'appareil de Craig sont r~parties en cinq groupes A, B, C, D, E (volt Fig. I). Seuls ]es peptides des groupes C, D, E sont 6tudi6s

0.300.

o~oo

o ~0 n ° de* tubes de I~pporeiJ -~ n ° des tmnsfe r ts _

Fig. I. F r a c t i o n n e m e n t pa r ex t r ac t i on ~. c o n t r e - c o u r a n t d ' u n D N P - h y d r o l y s a t t r yp -

s ique de sa lmine .

en d~tail; nous verrons qu'ils renferment tous un seul r~sidu d'arginine. Quant aux peptides des groupes A et B, en comparant leur teneur en arginine, d~termin~e par la m~thode Colorim6trique de SAKAGUCm 9 aprSs hydrolyse, ~ leur teneur en radical DNP, d~termin6e par spectrophotom6trie dans l'U.V, sans hydrolyse, on peut constater qu'ils renferment en moyelme deux r~sidus d'arginine par molecule.

Isolement des DNP-peptides des ]ractions C, D et E

Les peptides des fractions C, D et E sont s6par6s les uns des autres par chromato- graphie de partage sur colonne de kieselguhr tamponn6 (Hyflo-supercell) selon une technique voisine de celle de PERRONE 1°, dans les conditions suivantes:

a. Fraction E: La chromatographie en presence d'un tampon phosphate 0.25 M (pH 6.35) dans la m6thyMthylc6tone satur~e d'eau fournit 5 bandes: a, b, c, d, e. La bande a correspond h des traces de dinitroph6nol et d'artefacts. La purification de la

* L ' e x t r a c t i o n p a r l '6 ther , en mil ieu acide, du m61ange de D N P - p e p t i d e s o b t e n u s p e r m e t de v6rifier l ' absence de pep t ides ou d ' a m i n o a c i d e s neu t r e s libres, ce qui t e n d 5. conf i rmer que la t ryps ine conserve sa sp6cificit6 au cours de l ' hydro lyse de la s a l mme .

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64 g. MONIER, M. JUTISZ VOL. 15 (1954)

bande b (souill6e par a) est achev6e par hne seconde chromatographie ~ p H 6.35 dans le m61ange m6thyl6thylc6tone-chloroforme (85:15) satur6 d'eau. Celle de la b a n d e d (souill6e par c) est achev6e ~ pH 7.25 (tampon phosphate 0. 4 M) dans le m61ange indiqu6 pour b.

b. Fraction D: La chromatographie ~ pH 7.25 (tampon phosphate 0. 4 M) dans la m6thyl6thylc6tone satur6e d'ean fournit trois bandes: la plus rapide est identique h la bande e isoMe dans E. Les deux autres, bien s6par6es, sont d6sign6es par f et g.

c. Fraction C: Cette fraction, chromatographide dans les mfimes conditions que D, fournit un nouveau corps ddsign6 par h, ~ c6t6 d'une certaine quantit6 du corps g et de traces de peptides peu solubles en milieu organique qui restent au sommet de la colonne.

Au total, ces diverses chromatographies fournissent donc 7 corps b, c, d, e, f, g, h. Les corps c et e ont respectivement le m~me comportement chromatographique

que la DNP-arginine*, et la DNP-prolylarginine (isolde pr6c6demment ~ part ir de la DNP-salminel).

Etude des DNP-peptides isol¢s

Chaque peptide est hydrolys6 par HC1 5-5 N en tube scell6 ~ IiO ° pendant un temps convenable, fonction de la nature du DNP-aminoacide qu'il libbre (voir Tableau I). Le DNP-aminoacide lib6r6 est identifi6 dans l 'extrait 6th6r6 de l 'hydrolysat par deux chromatographies sur papier 1. Les aminoacides pr6sents dans la fraction acidosoluble sont de leur c6t6 identifi6s par chromatographie sur papier dans le ph6nol tamponn6

pH 411. Le Tableau I donne les r6sultats de ces identifications, ainsi que les structures qu'ils permettent de proposer pour chacun des peptides.

TABLEAU I D N P - P E P T I D E S ISOL~S DANS UN HYDROLYSAT T R Y P S I Q U E DE SALMINE

Composition de l'hyd*olysta

T* 5truclure Fradion Frcwtion gtk~rosoluble acidosoluble

b 2 4 DNP-Ileu Arg DNP-Ileu • Arg c 2 4 - - DNP-Arg DNP-Arg d 6 DNP-Val Ser, Arg DNP-Val • Ser • Arg e 6 Dinitroph~nol Pro, Arg DNP-Pro. Arg f 6 DNP-Ala Ser, Arg DNP-A1 a • Ser • Arg g 4 DNP-Gly Gly, Arg DNP-Gly. Gly. Arg h 6 DNP-Ser Ser, Arg DNP-Ser • Ser • Arg

* Dur6e des hydrolyses, en heures.

Ces structures sont confirm6es par des dosages quantitatifs, effectu6s de la f a $ o n

* La presence d'arginine libre dans les hydrolysats trypsiques de salmine, Cgalement indiqu~e par examen chromatographique direct sur papier, est en contradiction avec les r~sultats de PORTIS ET ALTMAN 6. Etant donn~ d'autre part les observations de WALEY ET W / k T S O N 12 d'apr~s lesquelles les hydrolysats trypsiques de poly-L-lysine ne contiendraient en fin d'hydrolyse que des traces de lysine libre, on peut se demander si cette liberation d'arginine n'est pas due ~ l'existence d°une impuret6 enzymatique dans la trypsine cristallis6e employ6e, impuret6 peut-~tre identique k la protaminase de WALDSCHMIDT-LEITZ 15. Ajoutons qu'une liberation analogue a lieu ~galement en prc~sence de trypsine cristallis~e "Armour".

Bibliog~aphie p. 68.

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su ivan te : sur une solut ion acide du pept ide , la concent ra t ion en radical D N P est d6termin6e p a r spec t ropho tom6t r i e en U.V. et le r6sul ta t ob tenu est compar~ h la concen t ra t ion en arginine d6termin6e pa r la m6thode color im6tr ique de S:tK~C.UCHL a v a n t ou apr~s hydro lyse du pep t ide ( rappor t A r g / D N P du Tab leau II) . D ' a u t r e par t , sur la f rac t ion acidosoluble de l ' h y d r o l y s a t du DNP-pep t ide , apr~s ex t rac t ion ~ l '6ther, la concen t ra t ion en acides a m i n 6 s t o t a u x est d6termin6e par la m6thode color im6tr ique

la n inhydr ine de MOORE ET STEIN 14 et compar6e k la concen t ra t ion en radica l D N P ( rappor t N H 2 / D N P du Tab leau II). Les r~sul ta ts de ces dosages sont rassembl6s dans le T a b l e a u I I .

TABLEAU II

ANALYSE QUANTITATIVE DES DNP-PEPT1DES

Rapport ArgIDNP

DNPd~eptide Avant Apr~ Rapport NHz!DNP hydrolyse hydrolyse

o.95 I .o6 0.96 2.o6 0.98

o.91 2.26 1.o3 2.15

b o.68 d o.84 e o.94 f 0.75 g 0.83 h o.74

On vol t que ces r6sul ta t s sont en accord avec les s t ruc tures propos6es. Le r appor t N H 2 / D N P est toutefois l~g~rement sup6rieur k sa va leur th6orique, du fai t de la d6grada t ion par t i e l l e du DNP-aminoac ide .

Quant au rapport Arg/DNP, il est int6ressant de constater qu'avant hydrolyse du peptide, il est, saul dans le cas de la DNP.Pro. Arg, inf~rieur ~. I (en moyenne 0.77 ). Cette observation est ~. rapprocher du fait bien connu que la coloration donn6e par une protdine native avec le r6actif de SAKAGUCHI est toujours plus' faible que ce que permet de pr6voir la teneur rdelle en arginine.

DISCUSSION

Dans le Tab leau I I I sont r6unis les sch6mas de tous les pep t ides qui ont fit6 isol6s k p a r t i r de la D N P - s a l m i n e ou de la salmine, ainsi que les encha inements dont la pr6sence, dans la mol6cule, est sugg6r6e pa r ces pept ides .

L ' encha lnemen t I occupe une posi t ion N- te rmina le dans la mol6cule. Son existence est c la i rement indiqu6e pa r les r~sul ta ts de l '6 tude de la DNP-sa lmine 1. On re t rouve en cons6quence le d ipep t ide P ro . Arg pa rmi les pep t ides issus de la d6gradat ion t ryps ique de la salmine.

P a r contre , l ' encha lnement 2, que les pep t ides obtenus pa r d~grada t ion acide p e r m e t t e n t de pr6voir , n ' a pas donn6 naissance en pr6sence de t ryps ine , au pep t ide P r o . V a I . A r g que l 'on pouva i t a t tendre . Ce fair est p robab lemen t dfi k la r6sistance de la l iaison Arg . Pro ~t ] 'hydro lyse t ryps ique 15,16. I1 est v ra i semblab le que l ' enchaine- men t 3 est, pour cet te raison, lui aussi, pr~c6d6 dans la chaine par un r6sidu d 'a rg in ine .

L ' encha lnemen t Val . Gly (4) n ' a pas fit6 t rouv6 pa rmi les pept ides t ryps iques 6tudi6s. Sa s i tua t ion darts la chalne reste donc ind6termin6e. On peut envisager qu ' i l fasse par t ie d ' un encha inement : • • -Arg . P r o . V a l . Gly . Arg . • • ou d ' u n encha lnement - • • A r g . V a l .

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66 R. MONIER, M. JUTISZ

A: D N P - p e p t i d e s isol6s apr~s d6g rada t ion par t ie l le de la D N P - s a l m i n e 1. B: Pep t i de s isol6s apr~s hyd ro l y se part iel le ac ide de la sa lmine x.

VOL. 15 (1954)

T A B L E A U

z 2 3 4

A D N P - P r o . Arg D N P - P r o • Arg . Arg

P r o . V a l Pro . I leu Val . G ly B Pro . Arg Pro . Val . Arg Pro . I leu . Arg

Arg . Pro . Val Pro . Val . Arg . Arg

C Pro . Arg

D Pro . Arg . Arg • - Arg . Pro . Val . Arg- Arg . . . . . P ro . I leu- Arg . . . . . . . . . . . Val . Gly . . . . . . .

G l y . A r g . P r o . X . A r g . - . , la r6sistance ~ la trypsine de la liaison Arg.Pro expliquant qu'on ne puisse trouver, parmi les peptides que nous avons ~tudi6s, de peptide com- portant l 'enchalnement Val.Gly.

Les enchainements 5 et 8 se d6duisent logiquement des peptides trouv6s. Quant aux enchalnements 7 et 9, il n 'est pas surprenant que les dipeptides neutres qui leur correspondent soient absents des hydrolysats acides, 6tant donn6e la labilit6 des liaisons s6rine 17.

Si l 'on rapproche les enchainements#tue nous proposons de la formule brute de la salmine, on voit que les enchalnements 2, 4 et 5 rendent compte des trois r6sidus de valine. De m6me les enchainements 5, 7 et 9 correspondent aux quatre r6sidns de s6rine, les enchainements 4 et 8, aux trois r6sidus de glycoeolle, et l 'enchainement 7, au r6sidu d'alanine. Les enchainements I, 2 et 3 nous renseignent sur la situation de trois r6sidus de proline sur les quatre que renferme la salmine. La situation du quatri~me r6sidu reste hypoth6tique: on peut concevoir qu'il participe ~ un enchainement Pro.Val-Gly, ou bien qu'il soit situ~ entre deux r6sidus d'arginine. Nos r6sultats ne permettent pas encore un choix ddfinitif entre ces deux hypotheses, quoique l'absence du tripeptide Pro .Val. Gly apr~s hydrolyse aeide soit plut6t en faveur de la seconde. Enfin, nous avons trouvd (enchainements 3 et 6) deux possibilit6s de liaison pour le r6sidu d'isoleucine unique de la salmine. I1 y a donc I~ une contradiction entre les r6sultats de cette 6tude ct la composition en aminoacides. Si l'on tait abstraction de la possibilit6 d'une rupture non sp6cifique par la trypsine de la liaison Pro.I leu, dormant naissance au peptide I leu.Arg, qui parait tr~s peu vraisemblable, cette contradiction ne pent s'expliquer que par l'h6tfirog6n6.it6 de la preparation de salmine employ6e, qui serait constitut~e non par un corps pur, mais par un m~lange d 'au moins deux types de polypeptides. Cette conclusion serait en accord avec celle de FELIX TM qui consid~re les monoprotamines comme des m6langes, peut-~tre tr~s complexes.

I1 est remarquable alors que la contradiction portant sur le r6sidu d'isoleucine soit la seule que nous ayons pu d6celer. Quoi qu'il en soit, l 'ensemble de nos r6sultats permet

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I I I

C: Peptides isol6s aprbs hydrolyse trypsique de la sahnine. D: Enchainements correspondant ~. ces diff6rents peptides dans la chaine de salmine. I = en-

chainement N-terminal; l 'ordre de succession des autres enchainements est arbitraire.

5 6 7 8 9

Val. Ser Gly. Gly Arg. Val

Val. Ser. Arg Ileu. Arg Ala. Ser. Arg Gly- Gly. Arg Ser. Ser- Arg

• Arg.Val . Ser. Arg. • Arg. Ileu. Arg . . . . . Arg. Ala. Ser. Arg . . . . Arg. Gly. Gly. Arg. • Arg. Ser. Ser. Arg. •

de p r o p o s e r p o u r la ou les s a l m i n e s 6 tud i6es u n s c h 6 m a g6n6 ra l de s t r u c t u r e , a n a l o g u e

ce lu i d6 jk p r o p o s 6 p a r F~LIX p o u r la c l u p 6 i n e :

P r o . (Arg)m" X " (Arg)m," [ (Arg )m, . X . X] e" (Arg)m, ,

L ' o r d r e d a n s l e q u e l se s u c c ~ d e n t les u n i t 6 s X . X le l o n g de la cha ine , a in s i q u e la v a l e u r

de s coef f i c ien t s m, m ' , m ~ e t m ~', n o u s s o n t e n c o r e i n c o n n u s . L ' o n p e u t e n v i s a g e r q u e

ce s o i e n t de s d i f f6 rences s u r ces p o i n t s q u i d i s t i n g u e n t e n t r e e u x les d i f f 6 r e n t s p o l y -

p e p t i d e s d ' u n e p r 6 p a r a t i o n de s a l m i n e , p u i s q u e la n a t u r e m ~ m e des g r o u p e s X - X ne

p a r a i t p a s p o u v o i r c o n s t i t u e r u n f a c t e u r i m p o r t a n t de v a r i a t i o n .

RI~.SUMI~

i. Un hydrolysat t rypsique de salmine renferme des peptides de la forme (X)a" Arg (X d6signant un r~sidu d 'un aminoacide neutre) qui ont 6t~ isolds et 6tudi6s apr~s t ransformation en leurs d6rivds DNP.

2. En rapprochant les r6sultats de la pr6sente 6rude de ceux d 'une 6tude ant~rieure, on peut proposer, pour la salmine d'Oncorhynchus un schema de structure du type:

Pro. (Arg)m" X" (Arg)m,. [(Arg)m~. X. X]e. (Arg)m~,

3. Les enchainements d6termin6s sont en accord avcc la composition en aminoacides de la salmine, saul dans le cas du r6sidu d'isoleucine. Les conclusions qu 'on en peut tirer re lat ivement A l'h6t6rog6n6it6 de la preparat ion employ6e sont discut6es.

SUMMARY

I. A trypsic hydrolysate of salmine contains peptides of the form (X)a-Arg (X denoting a residue of a neu t ra l ' amino acid) which have been isolated and studied after t ransformation to their DNP derivatives.

2. On comparing the results of the present s tudy with those of a previous study, the following s t ructure can be proposed for the salmine of Oncorhynchus:

Pro. (Arg)m. X" (Arg)m,- [ (Arg)m~" X- X]e- (Arg)m"

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68 R. MONIER, M. JUTISZ VOL. 15 (1954)

3. T h e sequences d e t e r m i n e d are in accord wi th t he a m i n o acid compos i t ion of fhe sa lmine , e x c e p t in t h e case of t he isoleucine residue. The conc lus ions t h a t c an be d r awn re la t ive to the h e t e r o g e n e i t y of the p r epa ra t i on emp l oyed are d iscussed.

Z U S A M M E N F A S S U N G

I. Ein t r y p t i s c h e s H y d r o l y s a t von Sa lmin en t h~ l t Pep t ide v o n d e r F o r m (X)n. Arg (X beze ichne t e inen n e u t r a l e n Aminos i iureres t ) , die isoliert u n d n a c h l~berf f ihrung in ihre D N P - D e r i v a t e u n t e r s u c h t werden .

2. Auf G r u n d des Vergleiches dieser E rgebn i s se mi t denen fr t iherer U n t e r s u c h u n g e n k a n n ffir das Sa lmin yon Oncorhynchus Iolgende S t r u k t u r vo rgesch lagen we rden :

Pro- (Arg)m' X ' (Arg)m'" [(Arg)m"" X ' X" ]e" (Arg)m"'

3. Die angegebene V e r k e t t u n g s t i m m t mi t der A m i n o s / i u r e z u s a m m e n s e t z u n g des Sa lmins fiberein, m i t A u s n a h m e des Iso leucinres tes . Die Schltisse, die d a r a u s in B e z u g auf die Hete rogeni t / i t des v e r w e n d e t e n Pr/~parates gezogen werden k6nnen , werden d i sku t ie r t .

B I B L I O G R A P H I E

1 R. MONmR ET M. JuT~sz, Biochim. Biophys. Acta, 14 (1954) 551. 2 M. BERGMANN ET J. S. FRUTON, Adv. Emymol., I (1941) 6 3. 3 H. NEURATH ET G. W. SCHWERT, Chem. Rev., 46 (195 o) 69. 4 F. SANGER ET H. TUPPY, Biochem. J., 49 (1951) 481 ;

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Requ le 31 mars 1954