THÈSE Présentée

Par SOMDA Kounbèsiounè Marius

Pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université de Ouagadougou

Option : Sciences Biologiques Appliquées

Spécialité : Microbiologie-Biotechnologie

Soutenue le 21 Février 2012, devant le Jury composé de :

Président : Comlan De SOUZA, Professeur Titulaire, Université de Lomé (Togo)

Membres : Alfred S. TRAORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou (Directeur de thėse, Burkina Faso)

Philippe THONART, Professeur Titulaire, Université de Liège-Gembloux (Rapporteur, Belgique)

Georges AMANI, Professeur Titulaire, Université de Cocody (Rapporteur, Côte d’Ivoire)

Dayéri DIANOU, Maître de Recherche, CNRST/IRSS (Rapporteur, Burkina Faso)

Contribution à la dépollution de l’environnement par la valorisation de la biomasse végétale au Burkina Faso : cas

de la biotransformation des résidus de mangues

UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU -------------------

École Doctorale Sciences et Technologies

-------------------- Laboratoire de Microbiologie et Biotechnologies Microbiennes

(LAMBM)

N° d’ordre…………..

i

PREFACE DU PRESIDENT DU RA-BIOTECH.

L’école Doctorale régionale de Ouagadougou offre une formation doctorale de biotechnologie dans ses options : Biotechnologie

microbienne et cellulaire, Biotechnologie Animale et Biotechnologie végétale.

Elle regroupe la plupart des Universités de l’Afrique francophone sub-saharienne en un réseau : le Réseau Ouest Africain de

Biotechnologie (RA-BIOTECH) fruit de la coopération inter-universitaire et dont le siège est au CRSBAN, à l’Université de

Ouagadougou.

Les Universités et structures de formation des pays ci-dessous constituent les membres fondateurs de ce réseau : Bénin, Burkina Faso,

Côte d’Ivoire, Guinée-Conakry, Mali, Niger, Togo et d’autres partenaires comme le Centre International de Recherche Développement

sur l’Elevage en zone Sub-humide (CIRDES)-Bobo Dioulasso ; EISMV-Sénégal.

Ce réseau sous régional bénéficie de l’appui de plusieurs partenaires de l’enseignement supérieur : Association des Universités

Africaines -AUA, UNESCO, Banque Mondiale, CAMES, Agence Universitaire de la Francophonie -AUF, Agence Africaine de

Biotechnologie -AAB, etc.

L’école Doctorale que le réseau anime assure une formation de haut niveau à travers une recherche utilitaire sur plusieurs thématiques

touchant la vie quotidienne des populations africaines. Cette école a permis au CRSBAN d’être érigé en pôle régional d’excellence en

Biotechnologie d’une part par l’AUA et d’autre part par l’AUF. Elle accueille des étudiants de plus de 14 pays d’Afrique centrale et

de l’Ouest.

Le réseau bénéficie aussi du soutien de certains spécialistes des biotechnologies des universités du Nord : Université de la

méditerranée (France), Université Louis Pasteur de Strasbourg (France), Centre de Génétique Moléculaire de Gif-sur-Yvette-CNRS

(Paris France), Université de liège (Belgique), Faculté Universitaire de Gembloux (Belgique) , Université de Rome, Université

Agronomique de Wagenningen .

L'importance des biotechnologies dans la résolution des problèmes de développement socioéconomiques des pays de l’Afrique sub-

saharienne (Alimentation, Santé, Environnement, etc.) Justifie amplement la mise en place de cette formation. Elle est cogérée par un

comité pédagogique international africain, constitué par des enseignants, des chercheurs, tous spécialistes dans les divers domaines des

biotechnologies.

La mutualisation des expériences par toutes ces compétences est un atout majeur pour la formation des ressources humaines de qualité

au profit du continent africain et de l’humanité.

Pr. Alfred S TRAORE

Professeur titulaire de Biochimie Microbiologie

CRSBAN/UFR-SVT/Université de Ouagadougou

Chevalier de l’ordre du mérite

Officier de l’ordre des palmes académiques/ CAMES

Directeur pédagogique du CRSBAN

Chevalier de l’ordre national

Chevalier de l’ordre international

ii

«Le merveilleux est la chose la plus noble dont nous puissions

faire l’expérience. C’est l’émotion qui se tient près du berceau de la

véritable science.

Celui à qui cette émotion est étrangère et qui ne peut

s’émerveiller ni s’étonner, celui-là est comme s’il était mort».

Albert Einstein.

iii

DEDICACE

A mon père Yvon et ma Mère Djina

Pour le support et la compréhension dont il s ont fait preuve a

mon egard tout au long de mes études…

A mes sœurs Theodile et Madeleine

A mon Grand père Wend-yanin, médaillon d’honneur à Dien

bien-fu dont le courage et la combativité ont été des modèles

pour moi

iv

REMERCIEMENTS

Le présent travail a été effectué au Burkina Faso au Centre de Recherche en Sciences

Biologiques Alimentaires et Nutritionnelles (CRSBAN) de l‟Université de Ouagadougou et en

Belgique au Centre Wallon de Bio-industries (CWBI) à l‟université de Liège.

Bien de personnes ont été très actives à l‟accomplissement de cette œuvre. Aussi voudrais-je

personnellement leur témoigner ma très grande reconnaissance.

Je témoigne ma grande reconnaissance aux illustres rapporteurs et membres du jury qui ont bien

voulu me faire l‟honneur de juger ce travail. Principalement aux Pr. Alfred S. TRAORE, Pr.

Comlan De Souza, Pr. Georges AMANI, Dr. Dianou DAYERI, Pr. Philippe THONART.

Mes profonds remerciements vont droit :

Au Professeur Alfred S. TRAORE, responsable de la formation de troisième cycle au

Département de Biochimie-Microbiologie, et Directeur du Centre de Recherche en Sciences

Biologiques Alimentaires et Nutritionnelles (CRSBAN) et Directeur de cette thèse, pour

l‟opportunité qui m‟a été offerte pour réaliser mes travaux de recherche dans les meilleures

conditions possibles. Par ailleurs, ses enseignements et sa disponibilité constante à m‟assister

m‟ont largement aidé à m‟orienter dans ma jeune carrière scientifique. Puisse-t-il trouver dans ce

document, la concrétisation de ses multiples conseils et encouragements pour lesquels je lui

exprime toute ma reconnaissance.

Je tiens tout particulièrement à exprimer ma reconnaissance et ma profonde gratitude au

Docteur Aly SAVADOGO pour avoir guidé mon stage de DEA qui a abouti aux travaux de la

présente thèse. Sa participation tant enrichissante à mon encadrement du DEA à la thèse, la

qualité et la rigueur scientifique exigées à mon égard et ses conseils si précieux surtout dans

l‟élaboration de mes protocoles d‟études m‟ont été d‟un grand recours. Il a permis la valorisation

des résultats de mes travaux à travers plusieurs publications dans des journaux internationaux.

Mes remerciements vont droit au Professeur Nicolas BARRO pour sa contribution si

enrichissante dans la valorisation des résultats de mes travaux, ses conseils, ses encouragements

et surtout d‟avoir relever notre moral pendant les instants difficiles.

Je remercie le professeur THONART de m‟avoir accueilli dans son laboratoire CWBI

(Centre Wallon de Bio-industries) à l‟université de Liège (Belgique) et pour sa disponibilité ainsi

que ses conseils précieux.

v

J‟adresse toute ma reconnaissance aux enseignants du CRSBAN qui ont chacun à un

moment donné ou à un autre contribué efficacement à ma formation. Je pense en particulier au

Pr. Aboubakar S. OUATTARA, et aux Dr Cheik A.T. OUATTARA, Philippe NIKIEMA,

Marcel D. BENGALY, André Jules ILBOUDO, Marcel D. Imaël N. BASSOLE.

Mes sincères amitiés aux personnels techniques du CRSBAN qui ont contribué chacun à sa

façon à la réalisation de cette thèse, particulièrement à Benoît Sa TRAORE technicien de

laboratoire au CRSBAN.

J‟ai passé des bons moments avec les doctorants du CWBI : Rasoul de l‟université de

l‟Iran, Delia de l‟université de la Roumanie, wissal, Asma, Wafa de l‟université de la Syrie et du

Maroc, Irène du Centre Agro-Biotech de l‟université de Gembloux. J‟ai bénéficié également de

l‟expérience des chercheurs du CWBI: Christophe, Sabri, Julien, Slim. Que toutes ces personnes

recoivent le témoignage de mon amitié.

Je remercie mes aînés Docteurs pour leur encouragement : Dr. Fidèle TIENDREBEOGO,

Dr. Ynoussa MAIGA, Dr. Christel NADEMBEGA.

Mes remerciements vont aussi à tous les doctorants du CRSBAN pour leur soutien :

CHeikna ZONGO, Rakieta COMPAORE, Isidore O. Juste BONKOUNGOU, Zara NIKIEMA,

Léon NITIEMA, Zenabou SEMDE, François TAPSOBA, Monique SORO, Pauline

OUEDRAOGO, Clarisse COMPAORE, Assèta KAGAMBEGA, Oumar TRAORE, Nicolas

OUEDRAOGO, Joseph SAWADOGO, KOURAOGO Rakeita, Chaibou YAHOU, Joseph

MAKAYA. Merci et surtout bon courage à vous pour la suite de vos travaux.

Je remercie enfin tous mes amis pour leurs encouragements et leurs multiples soutiens :

Mr. Bienvenu Martin SOMDA, Hamidou ILBOUDO, Lucien BADO doctorants à l‟université de

Bobo Dioulasso, Denise ILBOUDO doctorante à l‟université de Milan (Italie), François

KIEMDE, Olivier OUEDRAOGO, Berthine DABIRE, Abel ILLA, Harouna SAMA, Mahamat

ABDELLATIF, Antoinette OUEDRAOGO, Fatouma ABDOULATIF, Cymphor MEDA.

Je remercie dernièrement ma très chère fiancée Flore W. D. Bissyandé, elle qui a supporté

mes multiples absences liées à la préparation de cette thèse, je voudrais qu‟elle trouve

aujourd‟hui une raison de se consoler.

vi

Merci à tous ceux dont les noms n‟ont pu être cités mais qui, de loin ou de près, ont discrètement

mais efficacement, contribué à l‟aboutissement de ce travail.

La réalisation de l‟ensemble des travaux de la présente thèse a été rendue possible grâce à

l‟appui financier du Programme ISP / IPICS (International Sciences Programm/ International

Programm in the Chemicals Sciences, Suède), de l‟UEMOA (Union Economique et Monétaire

de l‟Afrique de l‟Ouest), de l‟IFS (Fondation Internationale pour la Science, Suède). Que ces

donnateurs soient assurés de me sincères remerciements.

vii

Résumé Cette thèse a porté sur la valorisation des résidus de mangues par la biotransformation et

l‟optimisation des rendements de conversion de ces résidus en bioéthanol. Les travaux réalisés

s‟incrivent dans un axe de recherche des énergies renouvelables, notamment dans le domaine des

biocarburants.

L‟analyse chimique des résidus de mangues montre qu‟ils renferment 22,62% (g/g)

d‟hydrates de carbone, dont 5,7 % (g/g) de sucres réducteurs, substrats exploitables pour la

biofermentation. La sélection de microorganismes performants nécessaires pour la

transformation des carbohydrates de résidus de mangues en bioéthanol, a permis de retenir six

(6) souches levuriennes et deux (2) bactériennes. Ces souches qui ont été isolées par des

techniques standards de microbiologie présentent les atouts nécessaires pour leur utilisation en

fermentation éthanolique. Parmi les souches de levures caractérisées, la souche de levure S3 a

fourni une conversion maximale des résidus de l‟ordre de 12 g/L de bioéthanol.

L‟étude de l‟influence des paramètres environnementaux sur la performance des

microorganismes, a conduit à la sélection de ceux capables de s‟adapter aux facteurs externes par

la conservation de leurs propriétés métaboliques. Les souches de levures caractérisées (A1, S1,

S3, B1, W1, W6) sont thermo-tolérantes (45°C) et alcoolo-tolérantes (14 % v/v). Les souches

bactériennes (Bacillus sp1 (A1M1), Bacillus licheniformis) renferment des enzymes (α-

amylases) hydrolysant les polymères des polysaccharides complexes comme l‟amidon et ses

derivés. Les taux de sucres réducteurs dans les résidus de mangues ont été optimisés pour

atteindre 62 % à 78 % (g/g) sous l‟action des enzymes provenant d‟espèces de Bacillus.

Les procédés d‟optimisation combinant une saccharification du substrat par Bacillus

suivie d‟une fermentation par Saccharomyces sp, ont permis d‟obtenir des concentrations de

bioéthanol de l‟ordre de 14 à 16 g/L. Ces concentrations atteignent 18 à 21,75 g/L avec l‟ajout de

sels minéraux dans le milieu de fermentation. Il ressort de cette étude que les résidus de mangues

constituent une biomasse potentiellement valorisable par voies biotechnologiques. Cela

permettra de diversifier les sources d‟alcool à coût réduit en utilisant des substrats peu onéreux

que sont les résidus de mangues.

Mots-clés : Mangue, résidus, microorganismes, valorisation, bioéthanol

viii

Abstract

This study relayed on was the valorization of mango residues by their biotransformation

into bioethanol and the optimization of the conversion yield. The achieved works are oriented in

the research of the renewable energy, notably in the domain of biofuels.

The chemical analysis of mango residues showed 22.62% (g/g) of carbon hydrates, along

with 5.7% (g/g) of reducing sugars.

The selection of efficient microorganisms for the transformation of the carbohydrates of

mango residues into bioethanol, permitted to retain six (6) yeast strains and two (2) bacterial

strains. These strains that have been selected by microbiological standard technics, present the

necessary assets for their use in ethanolique fermentation. Among the selected yeast strains, S3

gave the highest conversion yield of the mango residues in the order to 12 g/L of bioethanol.

Indeed, the study of the influence of environmental parameters on the strains‟

performance drove to the selection of those capable to adapt to the external factors while keeping

their properties. The yeast strains selected (A1, S1, S3, B1, W1, W6) were found thermo-tolerant

(45°C) and alcoolo-tolerant (14 % v/v). The bacterial strains (Bacillus sp1 (A1M1), Bacillus

licheniformis) produced some enzymes (α-amylases) which can hydrolyze the polymers of the

polysaccharides complex as starch and its derivatives. The rates of reducing sugars in the mango

residues have been optimized to reach 62 % to 78 % (g/g) under the action of the enzymes issued

from the Bacillus strains. The processes of optimization which combined a saccharification of

the substrate by Bacillus strains followed by Saccharomyces fermentation, permitted to get

concentrations of bioethanol ranging from 14 to 16 g/L. These concentrations reached 18 to

21.75 g/L with the addition of mineral salts and nitrogen source in the medium of fermentation.

It appears from this study that mango residues constitute a biomass potentially valorizable by

biotechnical way. The process will allow to produce alcohol at low cost from various substrates

such as mango residues.

Keys words: Mango, residues, microorganisms, valorization, bioethanol.

ix

Listes des articles et communications

a) Articles publiés

1. M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A.

S.TRAORE. Production of alcohol from mango (Mangifera Indica L.) using strains of Saccharomyces and Schizosaccharomyces genera isolated from wasted mangos in Burkina Faso.

Biosci. Biotech. Res. Asia. 7(2): 529-536, (2010).

2. M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A.

S.TRAORE. Thermotolerant and alcohol-tolerant yeasts targeted to optimize hydrolyzation from

mango peel for high bioethanol production. Asi. J. Bioetch. 3(1): 77-83, (2011a).

3. M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A.

S.TRAORE. Improvement of bioethanol production using amylasic properties from Bacillus

licheniformis and yeast strains fermentation for biomass valorization. Asi. J. Biotech. 3(3): 254-

261, (2011b).

4. M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, N. BARRO, P. THONART, A. S.TRAORE. Effect of

mineral salts in fermentation process using mango residues as carbon source for bioethanol

production. Asi. J. Industri. Engineer. 3(1): 29-38, (2011c).

b) Communications

1-M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A. S.TRAORE.

Isolement et characterization de souches de levures d‟intérêt industriel au Burkina Faso

Communication orale. Journées portes ouvertes sur les travaux des doctorants. (Mai 2009,

Université de Ouagadougou/ Burkina Faso).

2- M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A. S.

TRAORE. Valorization of agri-resources of Burkina Faso by the biofuels production. Poster

presented at the International conference of Research ISP/IPICS Networks/1-4 September, 2009,

Addis-Abeba (Ethiopia).

x

3- M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A. S.

TRAORE. Valorization of agri-resources of Burkina Faso by the biofuels production.

Communication at the International conference on Waste and Biomass Residues valorization in

Developing countries. Waste Engineering/2Eie.9-11 July, 2009, Ouagadougou (Burkina Faso).

4- M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A.

S.TRAORE. Valorisation de la biomasse végétale (mangues) par la recherche de source de

biocarburant et contribution à la dépollution de l‟environnement. Communication orale. Journées

portes ouvertes sur les travaux des doctorants. (Février 2010, Université de Ouagadougou/

Burkina Faso).

5- M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A. S.

TRAORE. Valorization of agri-resources of Burkina Faso by the biofuels production. Poster

presented at the International conference of Environment Wastes and Durable Development

Networks/28 March-02 April, 2010. Alexandrie (Egypt).

xi

Liste des abréviations

a) Organismes et institutions

CEAS : Centre Ecologique Albert Schweitzer

CRSBAN : Centre de Recherche en Sciences Biologiques Alimentaires et

Nutritionnelles

FAO : Food and Agricultural Organisation

IFS : International Foundation for Science

ISP / IPICS : International Science Programme/ International Program in the Chemical

Sciences

UFR/SVT : Unité de Formation et de Recherche/Sciences de la Vie et de la Terre

b) Autres abréviations

ADN : Acide désoxyribonucléique

ARN : Acide Ribonucléique

CPG : Chromatographie en phase gazeuse

DHAP : Dihydroxyacétone phosphate

DO : Densité optique

EMP : Voie d‟Embden Meyerhof Parnas

F6P : Frucose 6 Phostate

G6P : Glucose 6 Phostate

PEP : Phosphoénolpyruvate

PGA: Phosphoglycérate

SSF : Procédé de saccharification et fermentation simultanée

T : Température

X : Biomasse

Xo : Biomasse initiale

YE/S : Rendement en éthanol produit par rapport au substrat consommé

YX/S Rendement en biomasse produite par rapport au substrat consommé

xii

c) Lettres grecques

α : Alpha

ß : Bêta

μ: Vitesse spécifique de croissance

μmax : Vitesse spécifique de croissance maximale

xiii

xiv

xv

xvi

1

INTRODUCTION L‟épuisement à terme des réserves de pétrole brut ainsi que la prise en compte des

problèmes liés à l‟environnement ont conduit à rechercher des sources alternatives aux énergies

d‟origine fossile (Makkar et Cameotra, 2002). La crise pétrolière de 1973, l‟augmentation

progressive du prix du baril de pétrole, ainsi que les différentes crises économiques que traverse

le monde, ont créé une conjoncture favorable au développement des biocarburants par la

transformation des matières premières d‟origine végétale. Les plantes et les déchets agricoles sont

vis-à-vis de la biologie, sources de substances fermentescibles pour la production de bioéthanol,

pouvant être employé comme combustible (Alazard-Toux et al., 2006). La recherche sur les

énergies renouvelables prend de l‟essor dans l‟optique de préserver l‟environnement d‟une

exploitation non contrôlée.

Dans le contexte de developpement durable pour l'Afrique et le Burkina Faso en

particulier, la protection de l'écosystème figure parmi les priorités. En ce sens qu'il faut

promouvoir la gestion des déchets afin de réduire leur impact sur l'environnement. La biomasse

végétale accumulée constitue une source de déchets biologiques pouvant engendrer la pollution

environnementale. Ainsi il est nécessaire de gérer les déchets agro-industriels en y extraiant les

biomolécules qu‟ils renferment pour les valoriser si l‟on veut réduire cette pollution.

En effet plusieurs techniques de valorisation des résidus agro-industriels sont aujourd‟hui

connues dans le monde. Il s‟agit essentiellement de techniques de biotransformation.

Des techniques de biotransformation sont améliorées au Brésil et aux USA où la production de

bioénergie est axée sur la matière végétale à travers la synthèse de bioéthanol, par la

fermentation de différents sucres contenus dans les déchets (Sree et al., 2000; Kim et Dale 2004;

Farell et al., 2006; Baï et al., 2008). Ces sucres sont présents dans un état plus ou moins

polymérisé dans de nombreuses espèces végétales comme la bétterave, la canne à sucre, le blé, le

maïs, mais également dans le bois (Naim et al., 1983). Le Brésil a produit 14,2 millions de litres

d‟éthanol en 2004 par fermentation de la canne à sucre (Licht, 2005). L‟équipe de Lee en 1992

au Japon a pu amélorer la capacité fermentative de Zymomonas mobilis et obtenir ainsi 40 g/L

d'éthanol sur 100 g/L d'amidon (Lee et al., 1992).

En 2000, une autre équipe de chercheurs Japonais dirigée par Montesinos , a réussi à obtenir

67 g/L d'éthanol sur de la paille de blé, en utilisant successivement des α-amylases et

glucoamylases (Montesinos et Navarro, 2000) .

2

En effet l'amélioration du taux de sucres fermentescibles dans la matière brute est faite en

utilisant des enzymes spécifiques telles les α et ß amylases (Nakurama et al., 2002; Gupta et al.,

2003).

En Afrique, le Maroc a fait des essais de production de bioéthanol à partir de l‟amidon

essentiellement extrait du maїs en utilisant des α-amylases du champignon Candida tropicalis.

L‟utilisation de cette technique a permis d‟accroître le rendement de production de bioéthanol

jusqu‟à 56 g/L (Latifa et al., 2007). En Côte d'Ivoire, Yeboua (1989) utilisant l'hydrolysât

d'amidon de manioc a obtenu un rendement de 0,502 g d'éthanol pour 1 gramme de matière

utilisée.

Le Burkina Faso n‟est pas en reste dans cette dynamique de recherche sur les bioénergies à

travers la production d'alcool. De nombreuses expérimentations sont en cours pour la production

de bioéthanol à partir de la canne-à-sucre (Saccharum officinarum), et de la betterave

(Betavulgaris) et également la production des bioesters sur les grains de coton (Gossipum sp.).

Actuellement ce moment, une politique basée sur la production de biocarburants à partir de

Jatropha (Jatropha curcas) est largement vulgarisée à travers tout le pays. Au Burkina Faso,

chaque année on enregistre une production importante de fruits (substrats très riches en

carbohydrates fermentescibles). En effet la production annuelle est d'environ 150000 tonnes dont

on estime 1/3 de pertes (Fogue, 1998). Ces pertes sont liées à plusieurs facteurs : le temps

d'écoulement des fruits sur le marché, les conditions de conservation et les attaques par les

parasites. Ces déchets peuvent aussi causer de sérieux problèmes sanitaires et environnementaux

(De Laroussilhe et al.,1980). Toutefois, les résidus issus de ces pertes sont susceptibles de servir

de matières premières dans la valorisation des déchets.

Des stratégies sont recherchées pour la valorisation des déchets de mangues issus non

seulement des pertes annuelles mais également de l‟activité industrielle. Elles visent aussi à

contribuer à la dépollution de l‟environnement et à améliorer l‟environnement sanitaire pour les

populations.

La principale voie de valorisation des mangues est assurée par les techniques de

transformation et de conservation dévelopées par des unités industrielles telles que : DAFANI,

CEAS, STATION MAYA etc. Mais ces unités gèrent une faible proportion des quantités

produites. Les pertes demeurent toujours importantes malgré les transformations susmentionnées

et les exportations.

3

Environ 3000 tonnes de mangues fraîches seulement sur 50000 tonnes de production, ont été

exportées vers l'Europe en 2002 (Rey et al., 2004).

Les résidus issus de différentes pertes et transformations industrielles sont susceptibles de

servir de matières premières en biotechnologie. La biotransformation de ces résidus de mangues

constitue donc une deuxième voie de valorisation de la production des fruits (mangues) au

Burkina Faso, à travers la production de divers solvants (bioéthanol) ou de biocombustibles

(biogaz, biocarburants).

Notre travail s‟incsrit dans cette dynamique de production de bioéthanol à partir des résidus

de mangues sous l‟action de microorganismes. L‟objectif général est de valoriser les déchets de

mangues par la biotransformation de sucres fermentescibles qu‟ils renferment et partant

contribuer du même coup à la dépollution de l‟environnement.

Pour ce faire nous nous donnons comme objectifs spécifiques:

La détermination de la composition chimique et macromoléculaire des résidus de

mangues, afin d'évaluer leur potentiel de bioconversion en alcool;

Le screening à partir de différents biotopes de la flore microbienne capable de convertir

les sucres en alcool dans des conditions de mésophilie (20-30°C) et de thermophilie (45-

50°C) avec des rendements économiquement intéressants;

L‟étude des conditions optimales de métabolisme des souches sélectionnées;

Le suivi de la cinétique de production de bioéthanol pour déterminer les souches les plus

performantes et l‟optimisation du rendement en bioéthanol, en utilisant des processus

simultanés d'hydrolyse et de fermentation dans le même milieu réactionnel.

4

Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

5

I. GENERALITES SUR LES MANGUES 1. Historique et évolution de la filière mangue

Le manguier (Mangifera indica) aujourd‟hui très apprécié en Afrique de l‟Ouest pour ses

fruits et son ombrage est pourtant d‟introduction récente en Afrique.

Originaire d‟Inde, le manguier a été signalé pour la première fois en Afrique de l‟Ouest,

au Sénégal, en 1824. C‟est à la fin du 19è siècle que les manguiers ont commencé à connaître une

diffusion significative, surtout dans les zones côtières. Leur extension deviendra importante

pendant la première moitié du 20è siècle. Une des variétés de manguiers “Amélie” introduite au

Mali vers 1890 fut à l‟origine de nombreux plants greffés qui furent largement diffusés dans les

pays limitrophes. Dès la fin des années 1940, des collections furent établies progressivement dans

toute la zone et, au cours de la décennie 1970-1980, chaque pays d‟Afrique de l‟Ouest

francophone possédait au moins une collection de manguiers (Rey et al., 2004), (Figure 1).

Le Mali fut le premier pays à exporter, vers la fin des années 1960, des mangues vers

l‟Europe. Il fut suivi par le Burkina, la Guinée, le Sénégal, et surtout la Côte d‟Ivoire, dont les

exportations, d‟environ 2500 tonnes au début des années 1990, ont été multipliées par 4,5 en

2000. Cette croissance rapide des exportations ivoiriennes a bénéficié de la présence d‟une façade

maritime et d‟un effet de masse créé par les exportations de bananes et d‟ananas. La varièté

“Amélie” a longtemps constitué l‟essentiel des exportations de mangue du Mali, du Burkina Faso

et de la Côte d‟Ivoire. Cependant dès 1971, des expéditions expérimentales de mangues colorées

furent réalisées avec succès. La consommation de mangues s‟augmentant en Europe, le choix

variétal s‟est progressivement resserré : Amélie, en début de campagne, puis Kent, Keitt et

Palmer (Rey et al., 2004). Parallèlement à cette évolution variétale, les techniques de

conditionnement se sont progressivement modernisées.

6

Figure 1 : Zone d‟extension du manguier en Afrique de l‟Ouest francophone (Rey et al., 2004). : Site de production de mangues.

2. Importance des mangues au Burkina Faso

Les fruits sont en général des produits alimentaires à haute valeur nutritive et

commerciale. Ils contribuent à l‟amélioration du bien-être social et à de l‟état de santé des

populations (FAO, 1999). Ces fruits contiennent généralement de la vitamine A dont la

déficience provoque souvent un sévère problème de santé publique (Nana et al., 2006). Au

Burkina Faso, diverses spéculations fruitières sont rencontrées, dont 4 connaissent une activité

économique importante. Il s‟agit de la mangue, des agrumes, de la banane et de l‟anacarde

(Ouédraogo, 2002).

7

Occupant 57,73% de la superficie du verger national et 55,78% de la production fruitière

nationale, la mangue constitue la première culture fruitière du Burkina Faso (SICAREX, 2000).

L‟exportation des produits fruitiers, incluant la mangue fraîche ou séchée, vers des pays

de la sous région, de l‟Europe et de l‟Asie constitue une source d‟entrée notable de devises pour

l‟économie burkinabé. Ces exportations représentaient une valeur d‟environ un milliard cent

trente millions (1.130.000.000) de francs CFA en 2002 pour la mangue séchée (JUDICOME,

2004). Selon les responsables du terminal fruitier de Bobo-Dioulasso, citant les services de

Douane du Burkina Faso, les exportations de mangues fraîches en direction de l‟Union

Européenne pour la campagne 2005-2006 étaient de l‟ordre de 2000 tonnes. Une étude du

ministère de l‟agriculture conduite en 2004 par le cabinet JUDICOME estimait à environ 5332

tonnes les exportations de mangues fraîches du Burkina Faso vers la sous région. Selon la même

source, l‟importance de la filière mangue pour l‟économie nationale vient aussi du fait qu‟elle fait

fonctionner de petites unités de transformation et tout un réseau de démarcheurs et de

transporteurs, constituant ainsi, une source de revenus pour des milliers de personnes à travers le

pays. Dans les régions Ouest et Sud-Ouest du Burkina Faso où sa production est développée, la

mangue constitue une source de revenu pour des milliers de producteurs et contribue à améliorer

l‟alimentation des populations locales. De ce fait, dans le cadre de la politique de développement

des filières agricoles, la filière mangue a été retenue comme une des filières porteuses pour le

Burkina Faso.

Aussi, l‟ouverture du terminal fruitier de Bobo-Dioulasso en avril 2005 et l‟implantation

d‟une usine de transformation de fruits, dont la mangue à Orodara, traduisent la place et

l‟importance de cette filière dans les Hauts Bassins et particulièrement dans la province du

Kénédougou, souvent qualifiée de « verger du Burkina ». Cette province contribue en effet de

façon significative à la production fruitière du Burkina Faso.

Les pertes post-récoltes de mangues

A l‟instar des autres cultures, la mangue en Afrique, et particulièrement au Burkina Faso,

est attaquée par de nombreux prédateurs, dont les phytopathogènes, les insectes, et les acariens

(FAO, 1999). Les exportations de mangues fraîches du Burkina en direction de l‟Union

Européenne ont connu une baisse de l‟ordre de 10% entre 1995 et 2002, due aux problèmes

phytosanitaires (Dabiré, 2001; JUDICOME, 2004).

8

La mangue occupe la première place en terme de production et d‟exportation de fruits au

Burkina Faso. Sa production annuelle est d'environ 150000 tonnes dont 50000 tonnes de pertes

(Fogue et al., 1998). Ces pertes sont liées à plusieurs facteurs :

- les attaques parasitaires (mouches Tifridili), champignons (Aspergillus), insectes (fourmis) ,

(Dodd et al., 1998 ; Vayssieres et al., 2004);

- la mauvaise conservation : altérations physiologiques et mécaniques, microbiennes,

enzymatiques et non enzymatiques ( De Laroussilhe et al.,1980) ;

- les mauvaises techniques de conditionnement qui accroissent les pertes lors des transferts des

mangues sur les marchés.

Les infections fongiques latentes retrouvées dans la mangue sont celles causées par:

Alternata Alternaria (Prusky et al., 1983), Colletotrichum sp. (Peterson, 1986), Dothiorella sp.

(Johnson et al., 1991) et Subglutinans Fusarium (Ploetz, 1994), lequel est présent dans la pousse

penche et dans les différentes parties du panicule (Kumar, 1983). Ces contaminants latents

peuvent altérer des parties cellulaires de tissu de la plante tel que le cortex, le phloème, le xylème

et la moelle du parenchymateuse. Ils affectent la survie de la culture en diminuant la perméabilité

de la membrane (Kumar, 1983).

3. Description générale du fruit (mangue)

La mangue est le fruit du manguier Manguifera indica L., un des arbres fruitiers les plus

anciennement cultivés (De Laroushile, 1980).

Le manguier est une plante de la famille des Anacardiacées appartenant à l‟ordre des Sapindales

et qui serait originaire de l‟Asie du Sud ou de l‟archipel Malais (De Laroushile, 1980).

Selon De Laroushile (1980), la mangue est une drupe (fruit charnu), plus ou moins aplatie

latéralement selon la variété. Sa forme est très variable (oblongue, réniforme, elliptique, ovoïde,

cordiforme ou aplatie) avec à l‟extrémité un bec qui peut être de différentes formes. Certaines

variétés donnent des fruits qui peuvent avoir moins de 100 g pendant que d‟autres donnent des

fruits atteignant 1 kg. Des fruits de taille moyenne sont toutefois plus recherchés pour la

commercialisation.

De l‟extérieur vers l‟intérieur, la mangue comporte plusieurs parties qui sont la peau ou

épicarpe, la pulpe ou mésocarpe et le noyau ou endocarpe (Figure2).

9

La peau est assez mince chez les variétés cultivées et son épaisseur est généralement

inférieure à 1 mm. Elle est de couleur verte, devenant jaune à jaune-verdâtre chez certaines

variétés ou rouge-violacé, soit sur la totalité du fruit, soit par plage sur fond souvent jaune ou

orange. Elle présente des lenticelles plus ou moins apparentes.

La pulpe ou mésocarpe est de couleur jaune-orangée, avec une fermeté variable selon la

variété. L‟endocarpe ou noyau est plus ou moins garni de fibres extérieures qui peuvent pénétrer

dans la chair. Celles-ci sont plus ou moins nombreuses, dures et résistantes suivant les variétés.

La figure 2 illustre les différentes parties de la mangue. La condition recherchée chez les variétés

à grande valeur commerciale, est que même si les fibres se prolongent dans la chair, elles ne

doivent pas constituer une gêne à la consommation.

A maturité, les mangues de certaines variétés dégagent une odeur marquée, leur chair est

sucrée, très légèrement acidulée, avec une saveur variable. Les mangots (fruits des manguiers

sauvages) sont en général très fibreux et ont un goût nettement prononcé de térébenthine. Malgré

cela, ils sont très appréciés des populations locales. Ce goût de térébenthine persiste parfois

quoique atténué chez certaines variétés sélectionnées.

Figure 2 : Différentes parties d‟une mangue (De Laroushile, 1980).

10

3.1 Caractéristiques des variétés

Selon Guira (2003), six variétés de manguiers greffés sont essentiellement cultivées dans

les vergers du Burkina Faso. Il s‟agit des variétés Amélie, Brooks, Kent, Keitt, Lippens et

Springfield.

Amélie est une variété à port ramassé en boule et à nouaison bonne et très étalée. C‟est

une variété de pleine saison. Ses fruits de forme arrondie ont un poids variant entre 300 et 600 g.

Leur peau est de coloration vert-orange pendant que la chair de coloration orange-foncée est

molle, fondante.

Brooks est une variété à port étalé. Elle donne de fortes récoltes avec une nouaison

abondante et groupée. C‟est une variété tardive dont les fruits oblongs de 450 à 910 g, sont sans

bec. La peau du fruit de couleur vert-jaunâtre, avec des lenticelles de taille moyenne, blanchâtres

est résistante et épaisse. La chair de couleur jaune-brillant est ferme, moyennement aromatique et

légèrement acidulée.

Keitt est une variété tardive à production bonne et régulière. Les arbres de cette variété

ont un port étalé avec de longues pousses. Ses fruits ovales, sont sans bec avec des poids moyens

de 500 à 700 g. Cueillis à demi-coloration, ils mûrissent en 10 jours.

La peau du fruit, à fond jaune-orange est colorée en rose-carminé sur le coté au soleil avec de

nombreuses lenticelles jaune-pâles à roux et une assez forte pruine lavande. Epaisse et assez

résistante, la peau ne se sépare pas aisément de la chair qui est de couleur orange à jaune-foncée.

La chair est relativement ferme, avec un nombre important de fibres de longueur moyenne près

de la base du noyau, mais fines et non gênantes.

Kent se caractérise par son port dressé à étalé avec des branches érigées peu ramifiées.

Variété de fin de pleine saison, elle donne régulièrement de bonnes récoltes. Ses fruits ovoïdes

sont sans bec, avec des poids moyens variant entre 440 et 740 g. La peau colorée de rouge-foncé

cramoisi en plein ensoleillement avec une légère pruine grisâtre, a une coloration à fond jaune-

verdâtre. Elle est épaisse et résistante et se sépare facilement de la chair. De couleur jaune intense

à jaune-orange, la chair est de consistance moyenne, sans fibres avec une saveur moyennement

aromatique.

Lippens a un port étalé parfois érigé, avec un développement végétatif moyen et un

feuillage peu épais. C‟est une variété de saison qui a un bon rendement avec des fruits

légèrement aplatis, avec un bec arrondi. Leur poids moyen est compris entre 200 et 350 g.

11

La peau est de coloration jaunâtre et la chaire juteuse. Les photos présentent un manguier (a) et

les différents types de mangues (b).

Photos 1: Manguier (a) et fruits (b) ( Banfora, Mai 2008. Prises par SOMDA K. Marius)

3.2 Composition et usage des mangues

La chair de la mangue contient de l‟eau, des glucides (amidon, sucres, cellulose, pectines),

des substances minérales, des lipides, des protéines et des esters. Elle contient aussi les vitamines

A et C; sa valeur diététique est due essentiellement à sa teneur en sucres et en vitamines.

L‟amidon se transforme en sucres au cours de la maturation du fruit et il en reste peu dans le fruit

mûr. Le tableau 1, établi par De Laroushile (1980), donne la teneur moyenne des différents

éléments constitutifs de la chair de la mangue ainsi que sa valeur nutritive.

Les mangues sont consommées vertes ou mûres pour leurs propriétés nutritionnelles.

Les mangues vertes sont utilisées pour la fabrication de condiments comme le « chutneys » et les

« pickles » très connus en Afrique australe et en Inde (De Laroushile, 1980). Les fruits mûrs sont

utilisés comme desserts, sorbets ou entrent dans la préparation de boissons et confitures.

Compte tenu de l‟importance des pertes annuelles des fruits sur les exportations de mangue et au

niveau des exploitations (baisse de la quantité et de la qualité de la production), un meilleur

système d‟exploitation serait nécessaire pour mieux gérer le secteur fruitier.

b a

12

En effet, la valorisation des résidus de mangue constitue un enjeu primordial dans un pays

comme le notre où la production agricole est concentrée sur des courtes périodes de récolte.

Tableau 1: Composition de la pulpe de mangue

Constituants Teneur moyenne

Mangue verte Mangue mûre

Eau (%) 90,0 86,1

Protéines (%) 0,7 0,6

Lipides (%) 0,1 0,1

Glucides (%) 8,8 11,8

Fibres (%) 1,2 1,1

Matières minérales (%) 0,4 0,3

Calcium (%) 0,01 0,01

Phosphore (%) 0,02 0,02

Fer (% mg/g) 4,5 0,3

Vitamines A (UI) 150 4800

Riboflavine (mg/100 g) 0,03 0,05

Thiamine (mg/100 g) 0,04

Vitamine C (mg/100 g) 3 13

Acide nicotinique (mg/100 g) 0.3

Valeurs en calorie pour 100 g 30 50 - 60

Source : (De Laroushile, 1980)

Par ailleurs, des techniques de conservation et de transformation ont été développées par

certaines structures telles CEAS (Centre Ecologique Albert Schweitzer), STATION MAYA etc.,

afin de mieux valoriser ce fruit. Mais cela s'avère insuffisant compte tenu du faible taux

d'exportation. Environ 3000 tonnes de mangues fraîches ont été exportées vers l'Europe en 2002,

sur une production annuelle d'environ 150000 tonnes dont 1/3 de pertes (Rey et al., 2004).

13

Ainsi les résidus de mangue considérés comme déchets agro-industriels, peuvent constituer une

importante source de biomasse pour la production de bioéthanol.

II. BIOMASSE ET BIOETHANOL

1. Définition et sources de biomasse

La biomasse est l'ensemble de la matière organique d'origine végétale, animale ainsi que

les sous-produits de transformation (Beer et al., 2006).

Dans le domaine de l'énergie, le terme de biomasse regroupe l'ensemble des énergies

provenant de la dégradation de la matière végétale. Le terme «biomasse» désigne également l'énergie

récupérable à partir de différentes matières organiques (bois, déchets, cultures), par combustion ou par

tout autre procédé (http://www.actu-environnement.com,2011). La biomasse est une énergie

renouvelable tant que sa consommation ne dépasse pas l'accroissement biologique.

Cette biomasse d‟origine végétale provient initialement de l‟activité photosynthétique nécessitant

de l‟énergie :

Photosynthèse aérobie : nCO2 + nH2O + Lumière (h ) (CH2O)n + nO2

Photosynthèse anaérobie : nCO2 + 2nH2S + Lumière (h ) (CH2O)n + nH2O + 2nS

avec ΔGo’= 2870 Kj/mole (www.biologie.univ-mrs.fr,2011).

En effet la biomasse formėe par photosyntėse peut constituer une fraction biodégradable

générant à nouveau de l‟énergie :

On distingue trois constituants principaux, auxquels correspondent des procédés de valorisation

spécifiques :

• La biomasse lignocellulosique, ou lignine, constituée par : le bois et les résidus verts, la paille,

la bagasse de canne à sucre, le fourrage. La valorisation se fait plutôt par des procédés par voie

sèche, dits conversions thermochimiques.

14

• La biomasse à glucides, riche en substances glucidiques facilement hydrolysables : céréales,

betteraves sucrières, cannes à sucre, résidus agro-industriels. La valorisation se fait plutôt par

fermentation ou par distillation dits conversions biologiques.

• La biomasse oléagineuse, riche en lipides : colza (Brassica napsus), palmier à huile (Eleae

guineensis) dont la valorisation se fait par extraction.

(http://www.biomassenergycentre.org.uk,2011)

2. BIOETHANOL 2.1 Définition et historique Le bioéthanol se définit comme de l‟alcool produit par synthèse chimique à partir

d‟hydrates de carbones, ou par fermentation à partir de la biomasse. Seule cette deuxième façon

de procéder mérite l‟appelation bioéthanol (Perréon-Delamette, 2004). Le bioéthanol connaitra

un essor avec le développement de l‟automobile. Ainsi lorsque Henry Ford conçut son modèle T

de véhicule au début du 20ème siècle, il pensait que l‟éthanol, produit à partir de matières

biologiques renouvelables, serait la principale source d‟énergie dans les transports. Après la

première guerre mondiale et jusqu‟en 1944, la consommation de bioéthanol comme carburant a

été significative et comprise entre 1 million et 2 millions d‟hectolitres par an, avec un pic à 4

millions d‟hectolitres en 1936 (Pasty, 2004).

Aujourd hui, d‟excellentes perspectives sont notées pour le bioéthanol suite aux soucis de

la dégradation de l‟environnement et celui de l‟épuisement des énergies fossiles comme le pétrole

ou le gaz. Il est probablement la source d‟énergie alternative la plus utilisée au monde (Agores,

2001). Le Brésil a decidé de produire un combustible à base de canne à sucre. En Amérique du

Nord le bioéthanol est utilisé comme agent améliorant l‟indice d‟octane pour l‟essence (Oestling,

2001).

2.2 Production de bioéthanol par voie fermentaire

La production d‟éthanol est controlée par différents facteurs qu‟on peut regrouper en trois

catégories : la maitière première ; les microorganismes et les technologies de mise en œuvre.

15

*La matière première : elle doit être un substrat riche en sucres susceptibles d‟être fermentés

(saccharose, glucose, fructose ou des composés cellulosiques ou amylacés).

Industriellement, les principales sources de matières premières les plus utilisées sont : les jus de

betterave, les mélasses de canne à sucre ou de bétterave, les égouts de sucrerie et les jus

d‟hydrolyse de diverses céréales (blé, maïs, riz et seigle).

*Les microorganismes: plusieurs micoorganismes interviennent dans ce processus de production

de bioéthanol. Ce sont les levures et bactéries des genres tels que : Saccharomyces, Candida,

Kluyveromyces, Brettanomyces, Hansenula, Pichia, Bacillus. Parmi les levures utilisées dans ce

processus de fermentation figure l‟espèce Saccharomyces cerevisiae.

*La fermentation : c‟est un processus de transformation biochimique au cours duquel un substrat

organique subit des changements chimiques, provoqués par l‟action des enzymes produit par les

micro-organismes (Jay, 1996). A partir de cette opération biochimique, l‟éthanol va être fabriqué.

Cette opération de fermentation est l‟étape la plus importante dans le procédé de production du

bioéthanol. Cette fermentation est ettayée par l‟équation de fermentation du glucose suivante :

C6H12O6 + 2Pi + 2 ADP 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 56Kcal

*La distillation : elle consiste à récupérer du milieu réactionnel, l‟alcool qui s‟y trouve. C‟est

l‟étape la plus coûteuse dans la fabrication de l‟alcool et qui permet de récupérer l‟éthanol

provenant de la fermentation (Cardona et Sanchez, 1997).

2.3 Utilisation du bioéthanol L‟alcool d‟origine agricole (par voie fermentaire) est largement utilisé dans l‟industrie

agro-alimentaire, dans les industries chimiques, pharmaceutiques et parapharmaceutiques

(parfumérie). Egalement il peut être utilisé sous forme d‟éthanol hydraté, éthanol anhydre en

mélange avec l‟essence, le diesel, l‟ETBE (étyl-tertio-butyl-éther) ou l‟estérol.

16

Actuellement, les principaux pays producteurs d‟alcool sont le Brésil, les Etats-Unis et la France

(Fargione et al., 2008). Le tableau 2 présente la production du bioéthanol et autres formes de

biocarburant.

Tableau 2 : Différents types de biocarburant et leur production sur le plan international

Carburant

de base, biomasse

Régions

dominantes

Sous-

produits

Production

brute PB

(tep/ha)

Rendement

énergétique

RE= PN/PB

Production

nette

(tep/ha)

Gain

GES

(%)

Ethanol

Canne à sucre Brésil Bagasse 2,28 a, c 0,81 e 1,8 87h

Betterave Europe Pulpes 2,53 a, c 0, 23 f 0,6 32h

Blé Europe Drèches 0,48 a, c 0, 23 f 0,1 30h

Maïs Etats-Unis Drèches 0,98 a, c 0, 20 g 0,2 12g

Huiles

Colza Europe Tourteau 0,98 b,d 0, 60 f 0,6 39h

Soja Etats-Unis,

Brésil,

Argentine

Tourteau 0,43 a, d 0, 48 g 0,2 41g

Palmier à huile Tropicales Tourteau 3, 50 a, d 0, 89 e 3,1 70j

PB : production brute d‟éthanol ou d‟huile par hectare, en valeur énergetique ; PN : production énergétique nette par hectare (production brute diminuée de la quantité d‟énergie nécessitée, corrigée de la contribution des sous-produits) ; tep : tonnes équivalent pétrole. Le gain en gaz à effet de serre (GES) est la diminution, exprimée en %, de dégagement de GES quand on utilise le biocarburant au lieu d‟essence (cas de l‟éthanol) ou de gazole (huiles), sans tenir compte du changement d‟usage des sols. Sources d’informations : a/FAO (2008) valeurs mondiales; b/ Ballerini (2006); c/ 0,5 tep pour 1 000 litres ; d/ 0,787 tep pour 1 000 litres ; e/ FAO (2008) moyenne de la fourchette; f/ Concawe et al. (2007); g/ Hill et al. (2006); h/ Gosse (2008); i/ Fargione et al. (2008).

17

2.3.1 Avantages de l’utilisation du bioéthanol comme biocarburant - L éthanol en remplaçant le plomb dans l‟essence, réduit les émissions de particules, notamment

de particules fines qui constituent une ménace pour la santé des enfants, des personnes agées

ainsi que des personnes atteintes de troubles respiratoires.

- Il est également utilisé à la place du benzène dans l‟essence (produit toxique cancérigène,

extrait de l‟essence),

- L‟éthanol est non toxique, soluble dans l‟eau et rapidement biodégradable.

- La plupart des obstacles à l‟incorporation du bioéthanol dans les carburants fossiles peuvent

facilement être surmontés.

2.3.2 Inconvénients de l’utilisation du bioéthanol comme biocarburant

L‟utilisation du bioéthanol comme biocarburant présente des atouts mais également des

inconvénients en certains points de son application :

- Du point de vue écologique, le principal inconvénient des carburants additionnés de bioéthanol

est la formation accrue d‟acétaldehyde (Oestling, 2001). L‟acétaldéhyde peut contribuer à la

formation de brouillard photochimique lorsqu‟il réagit avec d‟autres substances à base de

carbone organique volatile présentes dans l‟air.

- La formation de nitrates de peroxyacétyle (PAN) moins nocifs que le formaldéhyde peut aussi

advenir lors du mélange essence /bioéthanol.

- Le mélange avec le bioéthanol est moins énergétique que les carburants provenant du pétrole ;

en plus il est corrosif (Mustafa et al., 2008).

L‟optimisation et l‟intensification de la production de bioéthanol à partir de la biomasse

végétale nécéssite la recherche de souches microbiennes performantes et mieux adaptées. A cet

effet il s‟avère nécéssaire de faire le screening des microorganismes ayant un potentiel de

biotransformation et d‟étudier leurs propriétés physiologiques.

18

III. PHYSIOLOGIE ET METABOLISME DES MICROORGANISMES IMPLIQUES

DANS LA PRODUCTION DE BIOETHANOL

1. Taxonomie et morphologie des bactéries du genre Bacillus

Ce groupe de bactéries joue un rôle important dans l‟hydrolyse des polysaccharides en

sucres simples.

Les bactéries du genre Bacillus de la famille des Bacillaceae regroupent environ 70 espèces

bactériennes. Ce sont des bacilles à Gram positif, aérobies à anaérobies. Leur culture sur milieu

solide se caractérise par des colonies polymorphes, productrices de catalase.

Ce sont des souches sporulantes dont l‟extrême résistance des spores leur confère un caractère

ubiquiste. Les espèces appartenant au genre Bacillus constituent un ensemble de souches

génétiquement et phénotypiquement très hétérogène selon Combet-Blanc (1995).

Les morphologies des sporanges et de la spore sont des critères importants du point de

vue de la systématique. Gordon et al. (1973) en fonction de ces critères; proposent de classer les

espèces appartenant au genre Bacillus en trois groupes :

Le groupe 1 comprend les espèces dont les spores sont ellipsoïdales et ne déforment pas le

sporange, mais la cellule mère contient la spore;

Le groupe 2 comprend les espèces dont les cellules ont également des spores ellipsoïdales

mais déformant le sporange;

Le groupe 3 comprend les espèces dont les spores sont sphériques et déformant le

sporange. Ce classement a été en grande partie conforté par les études nutritionnelles.

Les espèces du genre Bacillus ne sporulent que dans certaines conditions physiologiques

et, d‟une manière générale, en fin de phase de croissance. De plus, la proportion des cellules

sporulées varie considérablement suivant l‟espèce et même suivant la souche. Les spores

diffèrent des cellules végétatives par leur réfringence optique, leur composition chimique et leur

résistance aux agents physiques et chimiques. Chez certaines souches, l‟aptitude à sporuler peut

être perdue après une série de repiquages successifs (Combet-Blanc, 1995).

Les bactéries du genre Bacillus produisent des α-amylases et ß-amylases permettant de

dégrader les polymères glucidiques en glucose et en des molécules voisines telles :

19

fructose, mannose, galactose, tréhalose, saccharose… (Olsen, 2001). L‟habitat primaire des

Bacillus est le sol, mais on les retrouve dans les aliments où ils jouent des rôles utiles à néfastes

(Guiraud, 1998; Buchaman et Gibbous, 1975).

2. Taxonomie et morphologie des levures

2.1 Définition et caractéristique des levures

Les levures peuvent être définies comme des champignons unicellulaires mésophiles, de forme

ovoïdes se reproduisant par bourgeonnement ou fission, douées de pouvoir fermentaire. Elles

sont capables d‟assimiler un grand nombre de substrats carbonés mais incapables d‟utiliser

l‟amidon. Elles sont aérobies et anaérobies facultatives (Kreger-Van Rij, 1984).

Les champignons levuriformes sont des protistes eucaryotes unicellulaires, capables de se

développer en saprophytes ou en parasites sur presque tous les milieux, tout comme certaines

bactéries. Ce sont des micro-organismes hétérotrophes et l‟absence de chlorophylle, les

différencie à la fois des algues et des végétaux (Guiraud et al., 1984; Konlani et al., 1996).

Les cellules végétatives sont polymorphes et leur taille varie selon les espèces. Certaines

espèces peuvent former des associations cellulaires (pseudo mycélium) ou se présenter sous

forme de filaments (mycélium) à un certain stade de leur vie, elles sont ubiquistes dans la nature

et la majorité est non pathogène (Larpent et Larpent, 1990).

Les levures sont des micro-organismes chimio-organotrophes à métabolisme respiratoire

et fermentaire ; capables de se développer dans des conditions extrêmes. (Leclerc et al., 1995).

Elles se multiplient par un processus asexué (mitose) qui s‟effectue par bourgeonnement dans la

plupart des cas ou par scissiparité pour quelques espèces (Saccharomyces cerevisiae,

Schizosaccharomyces pombe) ou encore par un processus intermédiaire de sporulation (Larpent

et Larpent, 1990).

Les caractéristiques les plus importantes pour les levures d‟après Bouix et Leveau (1993) sont:

- une fermentation rapide mais sans excès de croissance en biomasse ;

- une bonne conversion du glucose en alcool (éthanol);

20

- une résistance à la pression osmotique;

- un caractère floculant et éventuellement une bonne stabilité génétique dans le temps.

2.2 Classification des levures Les levures appartiennent au groupe des champignons supérieurs et se répartissent

essentiellement en trois classes : les basidiomycètes, les ascomycètes, les deutéromycètes.

La classification de référence est celle de Lodder (1971) et Kreger Van Rij (1984). Elle est basée

sur les caractères morphologiques, physiologiques, biochimiques et nutritionnels des levures.

2.3 Multiplication des levures

La reproduction végétative des levures se déroule généralement par bourgeonnement ou

scissiparité (processus asexué) et dans certaines conditions une reproduction sexuée peut être

induite avec alternance d‟un cycle sporal, c'est-à-dire une phase haploïde et une phase diploïde,

(Leclerc et al., 1995).

2.3.1 Multiplication végétative asexuée

A l‟exception de quelques genres, les bourgeons apparaissent dans des zones à proximité

des extrémités des grands axes des cellules. Certaines espèces de levures sphériques sont

caractérisées par un bourgeonnement multilatéral. Il ne se produit pas deux bourgeonnements au

même site, exception faite du bourgeonnement bipolaire (Leclerc et al., 1995).

2.3.2 Reproduction sexuée

Lorsque le milieu devient défavorable (peu de nutriments) les levures cessent de se

multiplier par bourgeonnement et sporulent. Les levures sont des eucaryotes diploïdes donc

présentent les caractéristiques de la division cellulaire mitotique. Seule la membrane nucléaire

persiste, ce qui aboutit à la formation de l‟asque contenant les ascospores. Ces ascospores sont de

deux types « a ou α », chacun d‟entre eux après libération de l‟asque peut se développer en

cellule haploïde par bourgeonnement.

21

La fusion d‟une cellule a avec une cellule α conduit à la formation d‟un zygote qui est

diploïde aα. Ce dernier peut à son tour se multiplier par bourgeonnement ou sporuler selon les

conditions du milieu (Leclerc et al., 1995).

3. Aspects physiologiques et métaboliques

Les levures ont un métabolisme de type fermentatif ou oxydatif selon l‟espèce considérée

et les conditions de culture. La première étape de transformation du glucose suit la voie

d‟Embden Meyerhof Parnas (EMP) aussi appelée glycolyse.

Cette étape qui se déroule dans le cytosol est commune pour la respiration et la fermentation. Elle

comprend une série de dix réactions, chacune catalysée par une enzyme spécifique.

La glycolyse conduit à la formation de deux molécules de pyruvate à partir duquel les voies de

respiration ou de fermentation seront activées.

3.1 La glycolyse

La glycolyse est la séquence de réactions enzymatiques conduisant à la transformation

dans le cytosol, du glucose en pyruvate. La première étape de la glycolyse chez la levure S.

cerevisiae implique le transport du glucose du milieu extérieur à travers la membrane. Ce

transport se fait par diffusion facilitée c'est-à-dire qu‟il se fait selon le gradient de concentration à

l‟aide d‟une perméase. L‟étape de transport exerce un niveau important de contrôle sur le flux

glycolytique chez cette levure et est extrêmement complexe. Au moins 17 gènes HXT (hexose

transporter) ont été identifiés (Kruckeberg, 1997). Ils codent pour des transporteurs qui ont des

affinités différentes pour le glucose avec un transport régi cinétiquement par des caractéristiques

enzymatiques. Ainsi par exemple les HXT 1et 3 auraient une faible affinité pour le glucose et

interviendraient lorsque la concentration en glucose dans le milieu serait élevée alors que les

HXT 6 et 7 auraient une forte affinité et interviendraient quand la concentration en glucose serait

faible. HXT4 aurait une affinité intermédiaire et HXT 2 une affinité dépendante des conditions de

croissance.

Toutefois la procédure expérimentale pour mesurer et interpréter les cinétiques de

transport du glucose reste encore le sujet d‟un débat continu (Teusink et al., 1999).

22

Le glucose est dégradé par la voie de la glycolyse ou encore voie d‟Embden-Meyerhof-Parnas

(EMP) caractérisée par un intermédiaire qui est le fructose-1,6-biphosphate (FBP). La synthèse

de cet intermédiaire nécessite 2 ATP (voire figure 3).

Une aldolase rompt ensuite la molécule de FBP en deux trioses phosphate : le D-glycéraldéhyde-

3 phosphate (G3P) et le dihydroxyacétone phosphate (DHAP) en équilibre l‟un avec l‟autre grâce

à la triose-phosphate-isomérase.

La partie suivante comporte une oxydation et deux étapes formatrices d‟ATP. Elle

transforme le G3P en 1,3-bisphosphoénolpyruvate et du pyruvate. La transformation du G3P en

acide pyruvique engendre 2 ATP.

Comme chaque molécule de glucose donne deux trioses phosphate, sa transformation en deux

molecules de pyruvate produit 4 ATP, soit un gain net de 2 ATP. Le bilan énergétique est positif

même si les oxydations s‟arrètent au stade du pyruvate ; cependant 2 molécules de NAD+ ont été

transformées en NADH au cours de l‟oxydation catalysée par la glycéraldéhyde-3 phosphate

déshydrogénase et doivent être régénerées.

Il s‟agit d‟un des impératifs des cellules : outre faire de l‟ATP et récupérer des intermédiaires

utiles aux synthèses (6 précurseurs métaboliques sont synthétisés au cours de la glycolyse : G6P,

F6P, PEP, pyruvate, DHAP et PGA), la cellule doit reoxyder tous ses coenzymes réduits. Cela se

déroule dans la chaîne respiratoire dans le cas d‟un métabolisme oxydatif et grâce à la réduction

du pyruvate en éthanol dans le cas d‟un métabolisme fermentaire en anaérobiose. La figure 3

illustre les différents mécanismes.

23

Figure 3 : Schéma métabolique de la glycolyse et du cycle de Krebbs (Poilpré, 2002).

3.2 Le métabolisme oxydatif

Le métabolisme oxydatif du glucose aboutit à son oxydation comlpète en H2O et CO2 au

travers de la glycolyse, du cycle de krebbs et de la phosphorylation oxydative. Le bilan

énergétique s‟écrit ainsi :

C6H12O6 + 6 O2 6H2O + 6CO2 + (4+12 P/O) ATP

Avec P/O nombre de moles d‟ATP formées par atome d‟oxygène consommé.

24

Le rendement de la conversion du glucose en biomasse en métabolisme oxydatif dépend

de la souche. Guillou (1996) a fourni une équation permettant de calculer les besoins théoriques

de l‟anabolisme pour la synthèse de 1 g de cellules d‟après la composition de la levure en

protéines, en acides nucléiques, en lipides et en hydrates de carbone :

7,6 10-3 C6H12O6 + 14,5 NAD+ + 7,9 NH3 + NADPH 1gX + 4,7 CO2 + 14,5 NADH + 7,9 NADP+

Le rendement théorique limite correspondant à cette équation est Yx/s = 0,73 gxg-1. Cependant

les rendements pratiques les plus élevés obtenus sont de l‟ordre de 0,5 gxg-1.

La régénération des coenzymes réduits NADH et FADH2 produits dans la voie de la

glycolyse et le cycle de Krebs se fait dans la chaîne respiratoire.

L‟éfficacité de la chaîne respiratoire est illustrée par le rapport P/O qui représente le nombre de

moles d‟ATP formées par atome d‟oxygène consommé.

Il est également variable selon la souche de levure considerée. La valeur du rapport P/O

est fréquemment sujette à discussion. Pour Saccharomyces cerevisiae, un nombre inférieur à 2 est

souvent rapporté (Bruinenberg et al., 1985).

3.3 Le métabolisme fermentaire

En anaérobiose la cellule est privée d‟un excellent accepteur d‟électron : l‟oxygène. En

l‟absence de celui-ci, la cellule utilise d‟abord un accepteur intermédiaire d‟électrons autre que

le NAD+ qui est transformé en NADH. Elle doit cependant pour régénerer les NAD+, fabriquer

son accepteur final qui dérive du substrat de départ.

Il s‟agit prinicipalement de l‟éthanol pour la levure. La réduction finale de l‟acétaldéhyde en

éthanol permet ainsi de maintenir l‟équilibre de la balance redox en réoxydant les NADH

produits au cours de la glycolyse.

L‟éthanol est rejeté dans le milieu. Le glucose est utilisé comme source d‟énergie puisque

de l‟ATP est formé en excédent. Mais le rendement est médiocre car chaque molécule de

glucose aboutit à la formation de 2 molécules d‟ATP alors que son oxydation complète en CO2

et H2O par le métabolisme oxydatif aboutit à presque 19 fois plus d‟ATP (Cette voie est fonction

du type de cellule inpliquée).

25

La fermentation est en fin de compte le compromis trouvé par la cellule, moyennant des

oxydations incomplètes et une perte de matière carbonée tout en régénérant leurs NAD+. Le

bilan énergétique de la transformation du glucose en éthanol s‟écrit :

1 Glucose + 2 Pi 2 Ethanol + 2 CO2 + 2 ATP

Le rendement théorique limite Yp/s de cette conversion est de 0,51 gramme d‟éthanol par

gramme de glucose.

Ce rendement ne tient pas compte du fait qu‟une partie du glucose est convertie en anaérobiose

et transformée en biomasse (environ 0,1 g/g d‟après Kapelli, 1986). Les rendements pratiques Y

p/s sont en général moins élevés de l‟ordre de 0,4 g/g.

D‟autres produits secondaires sont aussi formés au cours de la fermentation comme

l‟acétate, le succinate et surtout le glycérol. La formation de ce dernier semble illogique d‟un

point de vue énergetique puisqu‟elle dévie une partie du flux de carbone de la portion de la voie

EMP productrice d‟énergie. Schulze (1995) explique la synthèse par le déséquilibre que crèe

l‟anabolisme sur la balance redox. Car si les NAD+ consommés dans la voie EMP, est équilibrée

par la réaction finale de formation de l‟éthanol à partir de l‟acétaldéhyde, la consommation des

intermédiaires pour l‟anabolisme déséquilibre la balance vers une acccumulation NADH.

La production de glycérol permettrait d‟oxyder les coenzymes réduits et d‟équilibrer la

balance redox au détriment d‟une dissipation d‟énergie.

La production de l‟acétate et du succinate accentue également le déficit de la balance redox et

leur production serait également à l‟ origine de la production d‟une partie du glycérol (Schulze,

1995). Le glycérol produit aurait en outre un rôle protecteur et osmorégulateur dans la cellule

(Mager et Varela, 1993).

3.4 Le métabolisme oxydo-réductif

Ce type de métabolisme engendre souvent la production d‟éthanol en présence d‟oxygène et

celle-ci, peut avoir plusieurs explications :

26

- Effet Crabtree observé sur les levures Crabtree positives. Une levure sera considérée comme «

Crabtree positive » si on observe pour de fortes concentrations de glucose une répression de son

métabolisme oxydatif et donc une formation d‟éthanol.

- En culture continue, Fiechter et al. (1981) ont demontré qu‟il existait chez Saccharomyces

cerevisiae un taux de dilution critique au-delà duquel la levure commence à produire de

l‟éthanol. Ce taux dépend fortement de la souche utilisée et du mode opératoire utilisé;

- Bardford en 1990 attribue le passage du métabolisme oxydatif au métabolisme oxydo-réductif

à une capacité respiratoire limite des microorganismes;

- Lei et al. (2001) fournit une autre interprétation du shift du métabolisme des levures (oxydatif /

oxydo-réductif) basée sur le phenomène d‟overflow au niveau des nœuds pyruvate et

acétaldéhyde. Au niveau du nœud pyruvate, l‟enzyme pyruvate désydrogénase à une affinité

plus forte pour le pyruvate que l‟enzyme pyruvate décarboxlyase, mais sa vitesse maximale est

plus faible. Aux faibles flux glycolytiques, le pyruvate est converti via la pyruvate

désydrogénase vers le cycle de krebbs. Quand le flux glycolytique dépasse une valeur critique,

la pyruvate désydrogénase est saturée et l‟acétaldéhyde est formé. Il en est de même au niveau

du noeud acétaldéhyde. Celui-ci est préférentiellement converti en acétate mais lorsque

l‟acétaldéhyde déshydrogénase est saturée, l‟acétaldéhyde serait transformé en éthanol. La

figure 4 illustre les voies métaboliques de respiration et de fermentation.

27

Figure 4 : Schéma recapitulatif des voies métaboliques (respiration et fermentation) et

voies annexes pouvant conduire à la production des sous-produits

(Castro-Martinez, 2007).

3.5 Voie des pentoses phospates

La voie des pentoses phosphates illustrée dans la figure 5 part du glucose-6-phospate avec

deux oxydations successives aboutissant au ribulose-5-phosphate. A partir de celui, il se

produit deux isomérisations qui fournissent les intermédiaires essentiels que sont le ribose-5-

phosphate et le xylulose-5-phosphate. Une succession d‟échanges de chaînons carbonés a lieu

à partir du ribose-5-phosphate et du xylulose-5-phosphate, catalysés par des transaldolases et

transcétolases et aboutissant au fructose-6-phosphate et à un triose-3-phosphate.

L‟intérêt de la voie des pentoses phosphates pour le microorganisme est la fabrication de

deux métabolites essentiels :

Le ribulose-5-phosphate (matière première pour la synthèse des acides nucléiques également

intermédiaire essentiel chez les organismes photosynthétiques qui fixent le CO2 par le Cycle de

Calvin) et l‟érythrose-4-phosphate (précurseur du noyau aromatique dans les acides aminés

aromatiques : phenylalanine, tyrosine et tryptophane). Cette voie est également la source de

NADPH, agent réducteur requis pour certaines synthèses (exemple : les lipides).

28

Figure 5 : Schéma métabolique simplifié de la voie des pentoses phosphates.

(Ben-Chaabane, 2006).

4. Besoins nutritionnels Les levures nécessitent différents substrats pour leur développement. Ces substrats selon

leur concentration dans le milieu de culture et leur nature vont avoir un effet activateur ou

inhibiteur sur la croissance.

4.1 Assimilation de sources de carbone Les composés carbonés représentent la source de carbone et d‟énergie pour les

microorganismes. Les fermentations alcooliques se font sur des milieux riches en sucres.

Les levures du genre Brettanomyces peuvent fermenter le glucose, le saccharose, le maltose, le

tréhalose, le cellobiose et le lactose (Smith et Van Grinsven, 1984).

29

Par contre, le genre Saccharomyces n‟a pas la capacité à fermenter le lactose, le melibiose, la

cellobiose, ni les sucres à 5 atomes de carbone comme la xylose ou l‟arabinose (Jones et al.,

1981). Ces deux genres de levures peuvent assimiler l‟éthanol, l‟acide lactique, l‟acide

succinique, entre autres.

En ce qui concerne les mécanismes d‟assimilation des sucres, selon Gaunt et al. (1988),

chez certaines levures comme Brettanomyces anomalus le glucose pénètre par transport actif;

alors que pour Gancedo et Serrano (1989) le transport du glucose se fait par diffusion facilitée

comme chez Saccharomyces. Géros et al. (1997) ont mis en évidence deux types de transporteurs

du glucose chez les levures (précisement Dekkera anomala): un transporteur de faible affinité qui

accepte aussi le fructose et un transporteur à haute affinité qui accepte le galactose, mais pas le

fructose.

Les levures du genre Saccharomyces peuvent également croître en présence de l‟éthanol

comme source de carbone, mais il faut d‟abord transformer l‟éthanol en acétate. Elles peuvent

aussi utiliser l‟acide acétique comme source carbonée jusqu‟à 3% v/v pour des valeurs de pH

comprises entre 3 à 6 (Géros et al., 2000).

4.2 Assimilation des sources d’azote

L‟azote représente environ 10% du poids sec de la cellule. Il joue un rôle capital car il

entre dans la constitution de molécules simples (acides aminés, nucléotides, vitamines et

coenzymes) essentielles au fonctionnement cellulaire.

Les études menées par Ribérau-Gayon et al. (1998) sur Saccharomyces ellipsoideus ont

montré que plus les levures sont riches en azote, plus forte est leur activité fermentaire et au

contraire plus faible est leur activité respiratoire. Cela pourrait s‟expliquer par la forte synthèse

d‟enzymes impliquées dans le processus de fermentation. L‟azote peut être utilisé par les levures

sous plusieurs formes (inorganique ou organique).

Les levures comme Brettanomyces bruxellensis et B. intermedius ont la capacité d‟utiliser les

nitrates contrairement aux genres Saccharomyces, Kluveromyces, Pichia… pour lesquels la seule

source d‟azote inorganique assimilée est l‟ion ammonium (Larpent, 1991).

L‟espèce Brettanomyces anomalus possède les enzymes nitrate réductase et nitrite

réductase. Cependant, ces enzymes sont inhibées par un excès d‟ammonium, ce qui favorise

l‟utilisation de sources d‟azote organique plutôt que minéral.

30

En règle générale, le sulfate d‟ammonium et le phosphate di-ammonique sont les sels les

plus utilisés comme source d‟azote, puisqu‟ils apportent en même temps le soufre et le phosphore

nécessaire à la cellule (Brock, 1970). Enfin, l‟utilisation et l‟assimilation de l‟azote ammoniacal

et de l‟azote aminé varient selon la levure utilisée et sont affectées par de nombreux facteurs à

savoir, l‟aération, la concentration de substrat carboné, ainsi que par la propre concentration de la

source azotée.

Les études réalisées par Aguilar-Uscanga et al. (2000) sur les besoins nutritionnels de

Saccharommyces cerevisiae, et de Brettanomyces bruxellensis ont mis en évidence que le sulfate

d‟ammonium a une influence significative sur la consommation de glucose, la croissance et la

production d‟éthanol. Dans leurs conditions expérimentales, ces auteurs ont observé un effet

inhibiteur sur la croissance de ces levures lorsque la concentration en sulfate d‟ammonium

excède 2 g/L.

4.3 Assimilation du phosphore Le phosphore est nécessaire pour la croissance de la levure et pour la fermentation. Il est

assimilable par la levure sous forme de phosphate par un mécanisme de transport actif (Jones et

al., 1981). Le rôle du phosphore est de maintenir l‟intégrité de la paroi cellulaire; il participe

aussi dans la synthèse de lipides et carbohydrates.

L‟ion phosphate n‟apparaît pas généralement comme limitant pour le développement de

Saccharommyces cerevisiae. Il semble que cet ion soit apporté en quantité suffisante dans les

milieux de fermentation « naturels » ou par l‟extrait de levure dans les milieux synthétiques.

Ainsi, Saccharomyces cerevisiae peut être considérée comme une levure peu exigeante sur le

plan nutritionnel (Aguilar-Uscanga et al., 2000).

4.4 Utilisation des oligo-éléments, vitamines et facteurs de croissance

Les oligo-éléments sont essentiels pour la cellule, puisqu‟ils réagissent comme cofacteurs

de diverses enzymes impliquées dans le métabolisme microbien. Ils sont nécessaires en très

petites quantités mais un excès peut provoquer une dénaturation d‟enzymes, une perturbation de

la morphologie et de la physiologie cellulaire, ainsi que de la vitesse de croissance (Blackwell et

al., 1995).

31

Par rapport aux facteurs de croissance, la plupart des levures sont considérées comme auxo-

autotrophes, puisqu‟il a été montré qu‟elles peuvent toujours avoir une croissance en l‟absence

complète de vitamine. Cependant la présence de ces vitamines est positive. Par exemple, en

milieu carencé en thiamine, la population levurienne finale est très faible (10% de la population

normale) et la transformation des sucres est extrêmement lente. De même en ce qui concerne la

biotine, Castro-Martinez (2007) a montré que son absence retarde beaucoup plus la fermentation

de sucre que la croissance.

5. Influence des paramètres environnementaux sur les microorganismes La croissance microbienne est influencée par les constituants du milieu de culture et par

les facteurs physico-chimiques (température, pH, oxygène, etc…). Donc la connaissance de ces

facteurs environnementaux pour une levure donnée va permettre de connaître sa distribution

écologique et de contrôler son développement.

5.1 Effet de la température La température est un facteur qui affecte profondément les micro-organismes, comme

tous les êtres vivants. En effet, les microorganismes sont particulièrement sensibles à la

température parce qu‟ils sont unicellulaires et que leur température varie avec celle du milieu

extérieur. Il est donc important de connaître les effets de la température sur la croissance du

microorganisme et la thermosensibilité des réactions catalysées par les enzymes. Aux faibles

températures (T< 10°C), l‟activité cellulaire microbienne peut être totalement bloquée. Par

contre, une élévation de la température (25°C < T< 37°C) va augmenter la vitesse de croissance.

En effet, on considère généralement qu‟à chaque augmentation de 10°C la vitesse de réaction

catalysée par une enzyme sera doublée (Torija et al., 2002). Alors, le métabolisme cellulaire sera

plus actif aux températures plus élevées et le microorganisme se développera plus vite.

Cependant, au-delà d‟un certain point, la croissance diminue et des températures élevées sont

létales, puisqu‟elles endommagent les micro-organismes en dénaturant les enzymes, les systèmes

de transport et d‟autres protéines. Les membranes microbiennes sont aussi détruites par la chaleur

(Converti et al., 1996).

Ainsi, même si certaines enzymes fonctionnelles sont activées à ces températures élevées,

le micro-organisme peut être tellement endommagé que sa croissance est inhibée, et ce de façon

irréversible (Prescott et al., 1995).

32

Dans le cas de faibles températures, les membranes perdent leur fluidité et les enzymes travaillent

moins rapidement. Enfin, la température optimale d‟activité est toujours plus proche de la

température maximale que de la température minimale.

La température a également une influence sur les voies métaboliques de la levure. Ainsi une

modification de la température de fermentation entraîne des différences dans la formation de

métabolites secondaires tels que le glycérol, l‟acide acétique, l‟acide succinique, etc., (Fleet et

Heard, 1993).

5.2 Effet du pH

Le pH est un autre facteur important de la croissance des levures, car il va déterminer

l‟activité métabolique des cellules. La valeur du pH a un effet sur la solubilité des nutriments et

sur la perméabilité de la membrane cellulaire (Martinez et al., 2003). Les pH alcalins sont, d‟une

façon générale, préjudiciables aux micro-organismes, la limite de leur développement se situant

pour des valeurs d‟ordre de 9 à 9,5. On observe pour les valeurs de pH entre 1 et 8 différents

types de comportement liés à l‟aptitude des microorganismes à tolérer et/ou métaboliser les

acides organiques (ou minéraux) présents dans le milieu. Ainsi, les bactéries en générale, sont

neutrophiles, présentant une meilleure croissance pour les pH voisins de 7 et sont partiellement

inhibées à une valeur de pH inférieure à 5. Au contraire, les levures et les moisissures présentent

une bonne aptitude à métaboliser les acides organiques et peuvent se développer très bien dans

une zone de valeurs de pH comprises entre 2,5 et 8,5(Martinez et al., 2003).

Contrairement à la température, le pH interne n‟est pas nécessairement égal à celui du

milieu de culture et sa valeur est proche de la neutralité dans la majorité des microorganismes.

Cette différence entre le pH interne et externe peut résulter de l‟imperméabilité de la membrane

plasmique aux protons. La concentration en ions hydrogène intracellulaire et extracellulaire n‟est

pas équilibrée et un gradient de concentration d‟ions peut être créé à travers la membrane.

Ce gradient de concentration, associé au potentiel électrique de la membrane, détermine la force

motrice des protons qui contrôle les réactions membranaires.

Le pH interne a une influence importante sur l‟activité des cellules et des systèmes

intracellulaires tels que la synthèse des protéines, les mécanismes de transport, l‟activité

enzymatique et l‟excrétion des métabolites pendant la fermentation (Liu et al., 2003).

33

Le pH externe, peut influer sur la vitesse avec laquelle les molécules sont transportées vers

l‟intérieur de la cellule et des valeurs de pH extrêmes peuvent endommager la membrane

cellulaire et provoquer la mort cellulaire (Liu et al., 2003).

5.3 Rôle de l’oxygène L‟oxygène est une molécule nécessaire pour la biosynthèse de molécules indispensables

pour la cellule tout particulièrement celle des acides gras insaturés et des stérols qui protègent les

levures du stress alcoolique (Scheffers, 1992).

En fermentation alcoolique chez Saccharomyces cerevisiae, une faible aération est donc

indispensable pour assurer la survie des levures et l„épuisement complet des sucres en présence

de concentrations élevées en éthanol. De plus dans ces conditions, la vitesse spécifique de

production d‟éthanol est améliorée (Sablayrolles, 1992).

L‟oxygène est un “substrat” particulier puisqu‟il est difficile de le dissoudre comme

d‟autres substrats. Son apport doit donc être continu tout au long de la culture.

Cependant, lorsque la concentration levurienne dans le milieu devient importante, le transfert de

l‟oxygène dans le milieu devient limitant, les besoins de la biomasse étant supérieurs aux flux

transférés. La concentration d‟oxygène dissous dans le milieu de culture a été identifiée comme

l‟un des principaux facteurs contrôlant la capacité des levures à se développer en métabolisme

oxydatif. Par rapport à la présence d‟oxygène, les levures peuvent être aérobies strictes

(croissance en présence d‟oxygène) ou aérobies facultatives. Il n‟existe pas de levures anaérobies

strictes (Sablayrolles, 1992).

5.4 Effet des produits de fermentation et du dioxyde de soufre

En fermentation alcoolique, l‟effet des produits de la fermentation est très variable et

dépend des conditions du milieu de culture et des conditions environnementales. Dans cette

partie, nous nous limiterons aux effets liés à l‟éthanol, à l‟acide acétique et au dioxyde de soufre.

34

5.4.1 Effet de l’éthanol

L‟éthanol est le produit principal de la fermentation alcoolique. Son action est très

négative sur le développement des levures, sur la viabilité cellulaire, sur sa propre synthèse

(Charpentier, 1993). L‟inhibition de la croissance par l‟éthanol commence autour de 20 à 40 g/L

(Casey et Ingledew, 1986). Chez Saccharomyces la concentration inhibitrice (vitesse de

croissance = 0) est de l‟ordre de 70 à 110 g/L (Casey et Ingledew, 1986) selon l‟espèce. Pour la

production de l‟éthanol, la concentration inhibitrice peut aller jusqu‟à plus de 15% (v/v) pour

Saccharomyces cerevisiae (Hayashida et Ohta, 1981). Enfin, l‟effet de l‟éthanol sur la viabilité

cellulaire est moins marqué que sur la croissance elle-même (Casey et Ingledew 1986). L‟éthanol

peut aussi conduire à l‟inhibition de la fermentation (Moulin et al., 1984). Les facteurs qui ont

une influence sur la sensibilité de la levure à l‟éthanol sont la température, l‟aération et la

composition du milieu de culture.

Ainsi, plus la température de fermentation est élevée (30-40°C), plus la croissance, la

viabilité et la production d‟éthanol sont sensibles à l‟éthanol (Aldiguier et al., 2004).

L‟augmentation de l‟aération en condition de production d‟éthanol améliorerait les vitesses de

production d‟éthanol et diminuerait son effet inhibiteur sur la croissance. L‟effet inhibiteur de

l‟éthanol ajouté sur le taux de croissance et la vitesse spécifique de production dépend aussi des

conditions d‟aération. Pour ces deux paramètres, l‟effet inhibiteur de l‟éthanol diminue en

condition aérobie par rapport à l‟anaérobiose (Aguilera et Benitez, 1985).

La composition du milieu doit contenir des lipides et vitamines qui vont avoir un impact sur la

tolérance à l‟éthanol (Alfenore et al., 2002). Ces composés protégeraient la surface membranaire

de la cellule microbienne.

A ce jour les mécanismes d‟inhibition de l‟éthanol ne sont pas bien élucidés bien qu‟ayant fait

l‟objet de nombreux travaux.

Les premières études ont été faites par Nagodawithana et Steinkraus (1976) qui ont

démontré que l‟éthanol produit durant la fermentation était plus toxique pour les

microorganismes que s‟il est ajouté au milieu de culture. Par la suite, il a été montré que l‟éthanol

avait un effet inhibiteur sur les enzymes impliquées dans la glycolyse, spécialement sur

l‟hexokinase (Novak et al., 1981). On pense alors que l‟accumulation de l‟éthanol à l‟intérieur de

la cellule serait due à un problème de gradient de diffusion de l‟intérieur vers l‟extérieur.

35

Mais cette théorie est contradictoire avec les résultats obtenus par Millar et collaborateurs

(1982) qui ne font pas état d‟effet inhibiteur de l‟éthanol au-dessous de 10%.

Strehaiano (1984) suggère que le problème d‟inhibition serait lié à d‟autres métabolites excrétés

par la levure tels que l‟acétate, les alcools supérieurs (Pampulha et Loureiro, 1989). L‟éthanol

perturbe aussi le flux transmembranaire de protons, qui tend à tamponner le pH du cytosol. Ainsi,

l‟activité ATPasique est alors activée pour rétablir un gradient électrochimique entre le milieu

cellulaire et extracellulaire, en dépensant plus d‟énergie.

Cette perte énergétique peut atteindre un niveau supérieur aux capacités cellulaires de

compensation. Le cytoplasme s‟acidifie et les perméases glucidiques deviennent inactivées c‟est

l‟arrêt de croissance (Leao et Van Uden, 1982).

Enfin, l‟explication la plus probable est donnée par Charpentier (1993). Cet auteur

explique le phénomène d‟inhibition par la présence de sites d‟action de l‟éthanol dans les sites

membranaires mitochondrial et cytoplasmique.

Ainsi, les molécules d‟éthanol pénètrent à l‟intérieur de la membrane cytoplasmique pour

s‟associer aux molécules d‟acides gras des phospholipides en se substituant aux molécules d‟eau.

Ce comportement entraîne une altération de la fluidité et de la perméabilité membranaire, causant

la mort cellulaire.

5.4.2 Effet de l’acide acétique L‟acide acétique est un produit secondaire de la fermentation alcoolique produit en très

faibles quantités pour une fermentation classique. Cependant, il peut être produit par certains

micro-organismes (Brettanomyces) en quantités plus importantes, ce qui est une des

conséquences redoutées en cas de contamination pendant la fermentation. Maiorella et

collaborateurs en 1983 ont montré qu‟une concentration d‟acide acétique comprise entre 0,5 à 9

g/L peut affecter la morphologie des levures Saccharomyces qui deviennent irrégulières.

Plus tard, il a été montré que l‟acide acétique est un puissant inhibiteur de la croissance de

Saccharomyces sous sa forme non dissociée (toxique). Cette inhibition est plus marquée sur la

synthèse de biomasse que sur la production de l‟éthanol et indépendante du pH du milieu de

culture (Phowchinda et al., 1995). Le mécanisme d‟action de cet acide faible se situe au niveau

de l‟acidification du cytoplasme et de la modification de certaines enzymes de la glycolyse

(Pampulha et Loureiro, 1990), particulièrement l‟hexokinase.

36

Sur l‟effet conjoint de l‟éthanol et de l‟acide acétique Pampulha et Loureiro (1989) ont

observé que le pH interne est indépendant de la concentration en acide acétique dissocié et du pH

externe. Par contre, il dépend de la concentration en acide acétique non dissociée.

De ce fait, quand le pH interne décroît, la vitesse de fermentation diminue et devient nulle pour

un pH interne de 4,8. Lorsque la concentration en éthanol est supérieure ou égale à 8%,

l‟inhibition est plus importante et elle devient complète pour un pH interne de 5,5.

D‟autres auteurs ont souligné que l‟acide acétique diminue la tolérance des levures à

l‟éthanol: Ramos et Madeira (1990), ont observé que la concentration critique en éthanol passe de

11% sans acide acétique à 0% pour 1% d‟acide acétique.

5.5 Effet du dioxyde de soufre Le dioxyde de soufre (SO2) est le plus ancien additif utilisé en vinification. Le rôle

principal du SO2 est de sélectionner la flore fermentaire, les levures étant plus résistantes que les

bactéries. Il est aussi un antioxydant et un solvant.

Le dioxyde de soufre est une molécule qui peut se présenter sous différentes formes

chimiques en fonction du pH. Ces formes sont illustrées dans la figure 6. Des constantes de

dissociation régissent le passage d‟une forme à l‟autre.

Le dioxyde de soufre libre est la forme principale qui agit sur la croissance des micro-

organismes, ce qui fût confirmé par Ingram et Buttke (1984). Selon Macris et Markakis (1974)

seule la forme H2SO3 de la partie libre est active vis-àvis des levures. La forme HSO3-

(majoritaire dans le vin), se combine d‟autant plus que le pH est élevé.

37

Figure 6 : Les différentes formes de l’anhydride sulfureux (Castro-Martinez, 2007). Le SO2 combiné à des concentrations supérieures à 30 mg/L prolonge la phase de latence

et limite la croissance dans le vin. A plus de 50 mg/L de SO2 combiné ou de 100 à 150 mg/L de

SO2 total, la croissance peut être complètement inhibée (Wibowo et al., 1985). Un pH bas et une

quantité élevée d‟éthanol agissent de façon synergique avec le SO2. Les levures peuvent

également produire des sulfites pendant la fermentation alcoolique. Habituellement 10 à 30 mg/L

de sulfite sont produits au maximum.

La plupart des souches de S. cerevisiae en produisent moins de 10 mg/L. Néanmoins, il

existe des souches qui produisent jusqu‟à 100 mg/L (Alexandre et al., 2004). La résistance des

souches de levures au dioxyde de soufre est connue pour être génétiquement déterminée et

transmise aux générations suivantes, même en l‟absence de dioxyde de soufre (Beech et Thomas,

1985). De plus, cette résistance va dépendre de l‟espèce et de la souche de levures. Ces auteurs

ont rapporté que Saccharomycodes ludwigii et Zygosaccharomyces bailii peuvent supporter des

concentrations en SO2 supérieures à 500 mg/L.

38

Romano et Suzzi (1992) ont établi une liste des levures de vinification tolérantes au

dioxyde de soufre telles que : Saccharomyces, Saccharomycodes, Torulaspora,

Zigosaccharomyces et Brettanomyces/Dekkera. Concernant plus particulièrement le

Brettanomyces, son comportement varie selon l‟oxygène et la concentration du SO2 ajouté au

milieu de culture. DU-Toit et collaborateurs (2005) rapportent que des concentrations entre 0,25

et 0,35 mg/L de SO2 moléculaire inhibent la croissance de Brettanomyces bruxellensis après un

jour d‟incubation. Par contre, la présence d‟oxygène diminue l‟effet du SO2 chez Brettanomyces.

Le mécanisme d‟action antimicrobienne du dioxyde de soufre n‟est pas complètement

élucidé. En 1987, Ough et Crowell, ont proposé le mécanisme suivant: le SO2 pénètre dans la

cellule par transport actif. Après, dans le cytosol, il peut directement se lier aux molécules

carbonylées, les rendant inaptes à emprunter les voies métaboliques normales qui leur sont

destinées. Une autre possibilité du dioxyde de soufre est de s‟intégrer à la place du soufre dans

les protides soufrés, ce qui les dénature (Yang, 1973). Finalement, la forme active du SO2 diffuse

librement dans la cellule et se retrouve sous forme de HSO3- au pH interne qui est autour de 7 ce

qui s‟accompagne d‟une accumulation de sulfite chargé qui réagit avec les constituants cellulaires

et conduit à la mort cellulaire (Gunnison, 1981).

Cependant, ces mécanismes restent du domaine des hypothèses. Beech et Thomas (1985)

résument les actions intra et extracellulaires du dioxyde de soufre de la manière suivante:

limitation des substances nutritives et de l‟oxygène, adsorption, peroxydation des lipides,

inhibition de la glycolyse, destruction de la thiamine, dommages sur les protéines post-

structurelles, élimination des intermédiaires des cofacteurs et des vitamines, transformation de

l‟ADN et de l‟ARN, mutations (Dorange et Dupuy, 1972).

Au niveau métabolique, le dioxyde de soufre agit en se combinant au glucose et à la

dihydroxyacétone-P, au pyruvate et à l‟acétaldéhyde, à l‟acide oxaloacétique et à l‟acide

α-cétoglutarique.

6. Mécanismes de répression catabolique

L‟activation des voies métaboliques de la levure dépend des mécanismes génétiques de la

cellule et des facteurs physico-chimiques tels que : le pH, la température, l‟oxygène, la présence

de composés inhibiteurs et la concentration en substrats.

39

Dans ce sens, la concentration en glucose et l‟aération dans le milieu de fermentation jouent un

rôle important. Ainsi, divers mécanismes de régulation ont été décrits chez les levures

(Saccharomyces, Brettanomyces) tels que: l‟effet Pasteur, l‟effet Crabtree et l‟effet Custer.

7. Etablissement des équations cinétiques

Les équations derivent de l‟étude des paramètres cinétiques des souches.

Les étapes de la croissance microbienne

La croissance microbienne se traduit par une augmentation en taille ou en nombre des

micro-organismes. Pour provoquer une croissance microbienne dans une culture il faut fournir

aux cellules initiales les nutriments nécessaires et des conditions environnementales favorables.

Le schéma de la croissance d‟une population microbienne en culture discontinue (c'est-à-dire

milieu non renouvelé), selon Sanaa (2002) présente dans la figure 7 se décompose alors

traditionnellement en sept phases distinctes :

1) La phase de latence : elle correspond à une phase de transition entre un état

physiologique initial et un état de croissance à proprement parlé. Il s‟agit d‟une phase

d‟adaptation au nouvel environnement. Cette phase dépend soit de l‟âge de l‟inoculum, soit d‟une

adaptation enzymatique. Par ailleurs, dans certaines conditions, la concentration initiale en

cellules est si faible qu‟il est difficile de quantifier l‟augmentation du nombre d‟individus. Ce

phénomène est considéré comme une pseudo-latence. La phase de latence peut être réduite en

utilisant comme inoculum une pré-culture prélevée en phase exponentielle.

2) La phase d’accélération : elle commence à partir de l‟adaptation effective des cellules

à leurs nouvelles conditions de culture. Durant cette période, la valeur du taux spécifique de

croissance (μ) augmente, jusqu‟à atteindre sa valeur maximale (μmax).

3) La phase de croissance maximale ou exponentielle : lorsque les concentrations

microbiennes sont exprimées en coordonnées semi logarithmiques en fonction du temps, la pente

de la droite correspond au taux spécifique maximal de croissance, μmax (h-1).

Dans cette phase le taux de mortalité est nul, l‟activité métabolique est maximale et le

taux de croissance est constant.

40

4) La phase de décélération ou phase de freinage : elle intervient au fur et à mesure que le

substrat s‟épuise ou que des produits toxiques s‟accumulent. La population continue à croître

mais le temps de génération augmente.

5) La phase stationnaire maximale : au cours de cette phase, la population microbienne

n‟évolue plus (μ=0) donc la population demeure stationnaire. Il y a un équilibre entre le nombre

de nouvelles cellules et le nombre de cellules qui meurent. Cette phase peut durer plusieurs

heures et même plusieurs jours.

6) La phase de début de décroissance : elle correspond à un début de disparition des

cellules.

7) La phase de décroissance exponentielle de la population : cette phase apparaît lorsque

le milieu devient fortement défavorable à la multiplication des micro-organismes et entraîne leur

mort rapide (Manry, 2005).

Figure 7 : Différentes phases de la croissance bactérienne en milieu liquide non renouvelé

(batch).

41

CHAPITRE II: MATERIEL ET METHODES

42

A. Matériel d’étude

1. Les zones concernées par l’étude

L‟étude s‟est intéressée aux sites de vente, de stockage et de transformation des mangues.

Pour ce faire, nous nous sommes intéressés aux régions par excellence de production de mangue

au Burkina Faso: Houet (Bobo-Dioulasso), Comoé (Banfora), Kénédougou (Orodora) et Centre

(Ouagadougou). Ces différentes régions ont des conditions agroclimatiques différentes. Les

différentes zones de production sont mentionnées dans la figure 8.

Zones de production de mangues

Figure 8 : Carte du Burkina Faso présentant les sites de prospection.

43

2. Prospections et collecte des échantillons de mangues.

Des prospections ont été conduites dans toutes les zones productrices de mangues au Burkina

Faso et dans les centres de transformation des mangues (DAFANI, CEAS). Cinq Cent Cinquante

(550) échantillons de résidus frais de mangues (peau, chaire, noyau) ont été collectés sans

distinction de variétés. Le poids moyen pour chaque échantillon est l‟ordre de 1kg.

La taille des échantillons par site a été fonction de la quantité de résidus rencontrés sur le site.

Pour ce faire, dans la zone Ouest, plus grande zone de production (75% de la production

nationale), 400 échantillons ont été retenus, dont 100 à Bobo-Dioulasso, 150 à Banfora et 150 à

Orodora.Dans la région du centre et dans les centres de transformation, respectivement 50 et 100

échantillons ont été rassemblés. Ces échantillons conditionnés dans des sacs en plastique sont

achéminés au laboratoire. Le tableau 3 présente la repartition des zones d‟échantillonnage.

Tableau 3 : Répartition des échantillons de résidus de mangue collectés par site

Site Bobo-Dioulasso Banfora Orodora Ouagadougou Unités de transformations

Echantillons 100 150 150 50 100

B. Méthodologie

1. Traitement des échantillons

Les échantillons ont été triés par variété avant toute analyse. Une portion des résidus de

mangues ( noyau délipidé et pulpe ) est broyée séparement à l'aide d'un broyeur électrique. Les

filtrats frais obtenus sur une unité de filtration en verre à partir des broyats, sont stockés dans des

flacons de 500 ml et conditionnés à +4°C pour bloquer toute action microbienne en toute

utlisation. Ainsi la détermination des paramètres physico-chimiques et composition

macromoléculaire, portera sur les résidus de broyats frais ainsi que sur les filtrats pour

comparaison. Par ailleurs une autre portion des échantillons collectés est séchée à l‟étuve à 90°C

pendant 72 heures jusqu‟à obtention d‟un poids constant à 0,2% près.

44

Elle est ensuite broyée puis tamisée (tamis de maille: 2 mm) pour faciliter la conservation en vue

des essais de fermentation. La pulpe et le noyau délipidé sont traités séparement.

45

I : EVALUATION DES PARAMETRES PHYSICO-

CHIMIQUES ET MACROMOLECULAIRES

DES RESIDUS DE MANGUES

46

1. Analyses des paramètres chimiques et composition macromoléculaire des échantillons

Toutes les opérations sont réalisées en duplicata lors des analyses portant sur les résidus de

broyats du noyau délipidé et de la pulpe des échantillons de mangues frais traités séparement.

1.1 Détermination du pH

Le pH est mesuré sur 10 g de chaque échantillon de mangues, homogénéisés avec 20 ml

d'eau distillée à l'aide d'un pH-mètre (Hanna Instruments HI8418) préalablement étalonné avec

des solutions de tampon phosphate (pH7) et tampon acétate (pH4) à 25°C, selon la méthode de

Nout et al.(1989).

1.2 Détermination du taux d’humidité, de matières sèches et de cendres

Ces paramètres ont été déterminés à partir de 10 g d'échantillon frais, par pesée differentielle,

après passage à l'étuve (Heraeus T5042) à différentes températures en fonction du temps

(méthode AOAC, 1990).

Une quantité de 10 g de broyat de chaque échantillon a été pesée dans une capsule en aluminium

préalablement tarée. La capsule a été placée ensuite pendant 24 heures dans une étuve (Heraeus

T5042) à 105° C. Après refroidissement de la capsule dans un dessiccateur pendant 30 minutes,

l‟ensemble a été pesé à nouveau à la balance électronique (Denver Instrument Company).

L‟opération a été répétée jusqu‟à l‟obtention d‟un poids constant à 0,2 % près.

Les taux ou pourcentages d‟humidité et de matière sèche sont déterminés par les formules suivantes :

% Hum (g/g) = (mo-m)/mo x 100

% Ms (g/g) = 100 - % Hum

avec : % Hum = pourcentage en humidité ; % Ms = pourcentage en matière sèche ; m = masse

du résidu à 105°C et mo = masse de l‟échantillon frais.

47

Les cendres totales ont été déterminées par incinération. Un étuvage à 105°C pendant 24

heures des échantillons, est suivi par une calcination au four à moufle. Un creuset contenant le

résidu à 105°C est remis dans le four. La température est alors augmentée progressivement

jusqu‟à 550°C pendant 5 heures. Après refroidissement pendant 30 minutes au dessiccateur le

creuset est pesé à la balance électronique. L‟opération est répétée jusqu‟à l‟obtention d‟un poids

constant à 0,2 % près. Le taux de cendres exprimé en pourcentage en masse est donné par la

formule suivante :

% Cendres (g/g) = [(P3-P1) / (P2-P1)] x100

avec : P1 = Poids du creuset; P2 = Poids du creuset + la prise d‟essai ; P3 = Poids du creuset +

Cendres

1.3 Détermination de la teneur en glucides

Elle a été réalisée par dosage spectrophotométrique des échantillons, à l'aide d'un

spectrophotomètre lecteur de plaque couplé à un ordinateur muni d'un logiciel KC Junior intégré.

La lecture des densités optiques a été faite à 540 nm et 460 nm respectivement pour les sucres

totaux et les sucres reducteurs. Les concentrations des sucres sont calculées à partir de deux

courbes d'étalonnage établies respectivement avec du D-glucose et du maltose comme standards.

1.3.1 Dosage des sucres totaux

En milieu acide à chaud, les liaisons glycosidiques des carbohydrates sont hydrolysées.

Les oses simples ainsi libérés subissent une déshydratation intramoléculaire pour donner des

dérivés furfuraux (furfural ou hydroxyméthyl furfural). La fonction aldéhyde se condense ainsi en

milieu acide avec l‟hydroxyle d‟un composé phénolique pour donner des acétals ou hémi-acétals

de couleur rougeâtre qui absorbent dans le visible (450-500 nm). Les hexoses sont transformés en

5- hydroxyméthyl furfural, et les pentoses en furfural. Cette méthode permet ainsi de doser tous

les glucides totaux d‟un matériel biologique.

Préparation des échantillons à analyser

Dans des tubes à essais, 1 g de poudre de chaque échantillon (pulpe ou noyau de mangue)

est dispersé dans 10 ml de DMSO à 25% (v/v) dans l‟eau. Le mélange est incubé au bain-marie

bouillant pendant 15 min puis 0,1 ml du mélange est dilué dans 9,9 ml d‟eau.

48

Une gamme de concentrations de la solution standard de D-glucose à 0,05 mg/ml (0,5 g

de glucose dans 100 ml d‟eau distillée) a été utilisée pour établir une courbe étalon des sucres

totaux. Aux différentes concentrations de glucose ont été ajoutées; 0,5 ml de phénol 5% et 2 ml

de H2SO4. Après 15 min d‟incubation au bain marie ‟ bouillant” puis 15 min d‟incubation à

l‟obscurité, on lit l‟absorbance (densité optique) à 492 nm au spectrophotomètre lecture de plaque

(type µquant) couplé à un ordinateur avec un logiciel KC junior intégré.

Pour le dosage des échantillons, 0,5 ml de phénol 5% est ajouté à 0,5 ml de l‟échantillon

préalablement préparé. Après homogénéisation, on ajoute 2 ml du H2SO4 (75%). Le mélange est

ensuite traité comme le standard ayant servi à construire la courbe d‟étalonnage. L‟essai est fait

en duplicata. La concentration des sucres totaux est déduite à partir de courbe étalon des sucres

totaux (annexe 12) avec le D-Glucose comme sucre de référence (Fox et Robyt, 1991).

1.3.2 Dosage des sucres réducteurs

Une série de concentrations de la solution standard de D-glucose à 0,05 mg/ml a été

utlisée pour établir une courbe étalon des sucres réducteurs. Un volume de 1 ml de réactif au

DNS (Acide 3,5 Dinitrosalycilique) a été ajouté aux différentes concentrations de glucose. Après

8 min d‟incubation au bain marie ‟ bouillant”, mesure l‟absorbance a été mesuré à 546 nm.

Pour le dosage des échantillons; 0,1 ml de l‟échantillon préalablement dispersé dans le

DMSO (Diméthylsulfoxyde) pour le dosage des sucres réducteurs est mélangé avec 0,4 ml d‟eau

distillée. La solution est ensuite mélangée avec 1 ml du réactif au DNS puis incubée au bain

marie comme décrit pour le standard des sucres réducteurs. Après homogénéisation, l‟absorbance

est lue à 546 nm à l‟aide du spectrophotomètre. Les concentrations en sucres réducteurs sont

calculées à partir de la courbe d‟étalonnage (annexe 13) établie avec le D-Glucose comme sucre

de référence (Miller 1958).

1.4 Détermination du taux d’amidon

1.4.1 Extraction et dosage de l’amidon total

Prendre 0,1 g des résidus bien broyé et y ajouter 5 ml de 1 N KOH. Bien homogénéiser la

solution à la température ambiante et la neutraliser ensuite avec 5 ml de 1 N HCl.

49

Bien s‟assurer que la solution est neutre à l‟aide d‟un papier pH. Mettre ensuite le

mélange en ébullition au bain-marie pendant 15 min. Réajuster le volume du mélange à 10 ml.

Centrifuger le mélange et prendre le surnageant. Filtrer au besoin le surnageant et

l‟utiliser pour le dosage de l‟amidon. Pour le dosage prélever 0,05 ml de cette solution et ajouter

4,85 ml d‟eau distillée et 0,1 ml de réactif I2/KI puis incuber comme précédemment pendant 10

minutes avant la lecture des densités optiques à 580 nm.

La teneur en amidon a été déterminée en utilisant une courbe étalon (annexe 14) avec une

solution d‟amidon à 5 mg/ml comme sucre de référence (Jarvis et Walker, 1993).

50

II : SCREENING DES MICROORGANISMES

IMPLIQUES DANS LE PROCESSUS DE

FERMENTATION

51

1. Procédé d’isolement et de sélection des souches de levures et bactéries

1.1 Les différentes sources d’isolement des microorganismes

Les souches de levures à sélectionner ont été recherchées dans les différents milieux.

Elles sont codifiées (A1 à Ax ; B1 à Bx ; S1 à Sx ; W1 à Wx) selon la provenance. Les sources

d‟isolement utilisées sont les ferments de levures provenant de la bière locale (dolo), du vin de

palme, et des résidus de mangues. Les souches de bactéries du genre Bacillus proviennent des

échantillons de condiments fermentés (Soumbala, Bikalga). Les souches Bacillus sp1(A1M1) et

Bacillus licheniformis proviennent du laboratoire de CRSBAN (Université de Ouagadougou).

1.2 Les différents milieux de cultures

Différents milieux de culture ont été utilisés selon les objectifs poursuivis. Dans tous les

cas le pH est ajusté avant la stérilisation avec des tampons acétate (pH 4) et phosphate (pH 7),

puis le milieu de culture est stérilisé par autoclavage à 120ºC pendant 15 minutes.

1.2.1 Milieu de conservation Les souches (levures et bactéries) ont été conservées à 4ºC et repiquées à des intervalles

réguliers (1 mois) dans le bouillon nutritif de conservation (Annexe 1). Le bouillon nutritif

additionné à du glycérol (20 % v/v) à raison de 1,5 ml par cryotube sert de milieu de conservation

des souches.

1.2.2 Milieux d’isolement des levures

L‟isolement et la sélection des souches des levures ont été effectués sur la gélose de

Sabouraud additionnée de Chloramphénicol ou Gentamicine, antibiotiques antibactériens à large

spectre. Le pH est ajusté à 6 ± 0,2 (Composition du milieu : Annexe 2). La gentamicine ou le

chloramphénicol sont ajoutés respectivement à raison de 0,40 g/l et de 0,50 g/l dans le milieu

Sabouraud après autoclavage à 121° C pendant 15 minutes et refroidissement de ce dernier dans

des conditions stériles. Le test à la cycloheximide a également été utilisé pour confirmer le genre

de levure à sélectionner.

52

Les milieux gélose, farine Maїs et YEPD (Yeast extract Peptone Dextrose), (Annexes 3

et 4), ont servi de milieux de confirmation et de purification (par triple repiquage successif) des

souches de levures isolées sur le milieu sabouraud. Le pH est ajusté à 6 ± 0,2.

La sélection des bactéries du genre Bacillus a été conduite sur milieu PCA (Plate Count

Agar).

1.2.3 Milieu pour l’étude de la tolérance à l’alcool

Après stérilisation, le mlieu synthétique minimum (Annexe 5) a été utilisé pour cette

étude.

1.2.4 Milieu pour la mse en évidence de la production d’acétoïne

Le milieu de Clark et Lubs (Annexe 6) a été utilisé pour mettre en évidence la production

d‟acétoïne par les souches bactériennes.

1.2.5 Milieu pour la détermination du caractère amylolytique des souches

bactériennes

Le milieu gélosé amylacé à 1 % (Annexe 7) a été utilisé pour la mise en évidence du

caractère amylolytique des bactéries.

1.2.6 Milieu pour le test de sporulation des levures

Le milieu utilisé pour ce test est un milieu liquide contenant le glucose synthétique

comme source de carbone (Annexe 8).

1.2.7 Milieu de base pour l’étude de la fermentescibilité des sucres

La fermentescibilité a été realisée sur un milieu synthétique liquide contenant soit le le

glucose, le fructose, le lactose, l‟arabinose, le galactose, le mannose, le raffinose comme source

de carbone (Annexe 9-10).

1.2.8 Milieu d’isolement des bactéries

Le milieu PCA a été utilisé pour la sélection des bactéries.

53

1.3 Isolement

La technique des stries serrées a été utilisée pour l‟isolement des levures et bactéries. A

cet effet 0,1 ml de la culture pré-enrichie a été repiqué sur le milieu gélosé Sabouraud contenant

du chloramphénicol et incubé 24 à 72 heures en aérobiose à 30 °C. Les bactéries ont été isolées

sur milieu PCA. Les colonies sélectionnées au niveau du quatrième quadrant, ont été

ensemencées par stries sur un nouveau milieu gélosé.

Après croissance, les souches ont été purifiées par trois repiquages successifs par

étalement et la pureté partielle a été confirmée par l‟obtention de culture homogène et par

observation à l‟état frais et après coloration de GRAM. Les souches pures ont été réensemencées

trois fois par stries sur milieu gélosé et dans du bouillon. Les souches pures obtenues, ont été

utilisées pour les tests de caractérisation.

L‟identification partielle des souches pures a été basée sur la détermination de leurs caractères

morphologiques, culturaux, biochimiques et physiologiques.

2. Biochimie et physiologie des souches

2.1 Caractères culturaux

La morphologie des colonies a été déterminée par une observation directe des colonies sur

les milieux gélosés. La forme, la taille et la couleur des colonies ainsi que l‟aspect de la culture

en milieu liquide ont été notées.

2.2 Test de catalase

Ce test a été réalisé en utilisant de l‟eau oxygénée à 10 volumes. La présence de catalase

a été révélée par un dégagement gazeux à partir d‟une culture sur gélose nutritive où l‟on a

déposé une goutte d‟eau oxygénée (H2O2) à 10 volumes (ou 3 %). La catalase est une enzyme qui

catalyse la dégradation du peroxyde d‟hydrogène (H2O2) en oxygène et en eau selon la réaction

suivante :

H2O2 ——> H2O + ½ O2

54

Le peroxyde d‟hydrogène formé au cours du métabolisme est un agent antimicrobien qui

exerce son activité inhibitrice sur les bactéries dépourvues de catalase ou de pseudo-catalase. La peroxydase permet à certaines souches (levures ou bactéries) qui n'ont pas de catalase, de

tolérer l'oxygène, mais cette tolérance reste à vérifier quand au peroxyde d‟hydrogène.

2.3 Test de cytochrome oxydase

La présence de cytochrome oxydase a été mise en évidence par la technique de Kovacs

(1956). Des disques imprégnés d‟une solution de tétraméthylphénylène diamine (TMD) dans du

diméthylsulfoxyde (DMSO) à 6% ont été utilisés. En présence d‟oxydase, le

tétraméthylphénylène diamine (TMD) vire au bleu violacé. Le TMD ne vire pas si le test est

négatif. Ce test détecte un type particulier de chaîne respiratoire qui comporte en fin de chaîne,

un cytochrome C et l‟oxydase associée.

2.4 Test de sporulation

La recherche de formes résistantes des levures et bactéries a été réalisée grâce à la

technique du choc thermique. Deux tubes de culture de chacune des souches ont été portés au

bain-marie à 90 °C pendant 10 minutes. Une aliquote de chaque suspension bactérienne traitée

ainsi a été prélevée pour inoculer deux tubes de milieu neuf stérile. Ces tubes ont été réincubés à

30 °C pour suivre la croissance pendant 24 à 72 heures. Une croissance notée qui se traduit par la

turbidité de la culture montre que la souche étudiée est capable de former des formes résistantes.

Si la souche est incapable de sporuler, la culture reste limpide.

2.5 Tests au rouge de méthyle et Voges-Proskauer

Ce test est realisé uniquement pour les bactéries. Le milieu de Clark et Lubs permet de

réaliser les tests au rouge de méthyle (RM) et de Voges-Proskauer (VP) selon la technique utlisée

par Sévastianos (1977). Ces tests permettent de révéler la nature des produits issus de la

fermentation des sucres (acides organiques ou acétoïne). Ces tests ont été réalisés en cultivant 24

heures à 30 °C, la souche concernée. Pour le test VP, 1 ml de la culture a été prélevé deux fois et

transvasé dans deux tubes à hémolyse. Un volume de 0,5 ml d‟α-naphtol (1% v/v) et un volume

égal de base (KOH) concentrée (40% m/v) ont été ajoutés. Le tube est incliné pendant quelques

minutes à une heure pour pemettre une bonne oxygénation.

55

Si la réaction est positive (VP+), il se forme un anneau rouge en surface. Une réaction négative

(VP-) se traduit par un anneau jaune en surface. Les souches VP+ produisent des quantités moins

importantes d‟acides organiques et une proportion non négligeable de pyruvate est transformée

en produit neutre (l‟acétoïne est réduite en général en butanediol). C‟est la fermentation

butanediolique.

Pour le test RM, à deux tubes contenant chacun 1 ml de la culture, on ajoute deux (02) à

trois (03) gouttes de rouge de méthyle. Une coloration rouge traduit une réaction positive (RM+)

et une coloration jaune, une réaction négative (RM-). Les souches RM+ produisent des acides

organiques par la voie des acides mixtes.

Ces tests permettent de révéler la nature des produits issus de la fermentation des sucres

(acides organiques ou acétoïne). Chez les bactéries anaérobies facultatives, ces tests permettent

de mettre en évidence la fermentation acide mixte conduisant à la formation de nombreux acides

organiques et la fermentation butanediolique qui aboutit à la production de l‟acétoïne, précurseur

du butanediol.

2.6 Test de thermo-tolérance

Pour tester l‟aptitude des souches de levure à croître à 40 et à 50 °C, la croissance sur

milieu gélosé a été réalisée respectivement à 40 et à 50 °C pendant 24 heures en aérobiose. Trois

boîtes de Pétri contenant le milieu gélosé ont été utilisées pour chaque souche. La croissance ou

non est confirmée par trois (03) repiquages successifs.

2.7 Métabolisme de l’amidon par les souches du genre Bacillus

Le caractère amylolytique des souches a été testé sur milieu gélosé amylacé à 1% selon la

technique utilisée par Bengaly (2001). C‟est un milieu gélosé contenant de l‟amidon pur comme

seule et unique source de carbone. Un test positif se traduit par un halo bien visible autour de la

colonie correspondant aux zones d‟hydrolyse de l‟amidon. Pour un test négatif, le milieu vire au

bleu. La gélose a été ensemencée par touche et l‟hydrolyse de l‟amidon, révélée par vaporisation

d‟une solution d‟iode 0,1 N. Le milieu vire au bleu sauf les zones d‟hydrolyse de l‟amidon pour

lesquelles un halo bien visible se forme autour de la colonie. Trois repiquages successifs ont

permis de confirmer les résultats obtenus. Ce test est realisé uniquement pour les bactéries.

56

2.8 Etude de la fermentescibilité des sucres

Elle a été effectuée dans des tubes de Hungate contenant le milieu de base (annexes 9-10)

stérilisé à 120 °C pendant 15 minutes. Le pH est ajusté à 7,2. Les solutions de sucres et de bleu

de bromothymol stérilisées par filtration à l‟aide d‟un filtre millipore (0,22 μm) ont été ajoutées

au milieu de base stérile de manière à obtenir une concentration finale de sucre de 5 grammes par

litre (Combet-Blanc, 1995). Les sucres testés sont le glucose, le fructose, le saccharose et le

lactose et une suspension levurienne en phase exponentielle de croissance a été utilisée. Deux

tubes ont été utilisés pour chaque sucre testé. Après inoculation, la surface d‟un des deux tubes a

été recouverte d‟huile de paraffine pour révéler la production de gaz.

Deux témoins ont été réalisés, un contenant le milieu neuf stérile et l‟indicateur coloré, un

autre contenant le milieu neuf stérile. Lorsque la souche concernée fermente le sucre testé, la

culture initialement verte vire au jaune après 24 à 72 heures. Un test négatif se traduit par une

culture bleu-verte. Trois repiquages successifs ont permis de confirmer les résultats obtenus.

2.9 Caractérisation taxonomique : Essai taxonomique

Les caractéristiques morphologiques, biochimiques et physiologiques des souches isolées

ont été comparées à celles du « Bergey‟s manual of determinative bacteriology » neuvième

édition afin de proposer une affiliation.

3. Les méthodes analytiques

3.1 Analyse de la biomasse et paramètres cinétiques

Le suivi de la biomasse a été fait par trois méthodes différentes. Ces méthodes apportent

des informations complémentaires et leur combinaison augmente la fiabilité de nos résultats. Le

suivi de la biomasse a été effectué tout au long du processus de sélection des souches.

3.1.1 Spectrophotométrie (Turbidimétrie)

La densité optique (DO) mesurée traduit le pourcentage de lumière non transmise par la

suspension de levures. L‟absorbance est proportionnelle à la quantité de biomasse présente dans

l‟échantillon. La DO a été mesurée avec un spectrophotomètre lecteur de plaque (type µquant)

couplé à un ordinateur avec un logiciel KC junior intégré.

57

Les mesures ont été réalisées dans des plaques multi-puits (96 puits). Des dilutions sont

effectuées afin de rester dans la gamme de linéarité (DO < 0,8).

3.1.2 Méthode gravimétrique (Poids sec)

Cette méthode a pour but d‟estimer la masse de levures contenue dans un volume donné

de l‟échantillon. Elle est basée sur la différence de poids sec d‟une membrane de porosité

déterminée (acétate de cellulose 0,45 μm) avant et après filtration (et séchage) d‟un volume

connu (25 et 10 ml) d‟échantillon. Les cellules levuriennes cultivées ont été recoltées par

centrifugation à 6000 tr/min pour 20 min, puis lavées deux fois avec de l'eau stérile et pesées

après 24 h de séchage à l‟étuve à 105 °C. La biomasse sèche est exprimée en g/L.

Elle a été utilisée parallèlement à la mesure turbidimétrique pour obtenir une corrélation

DO/concentration en biomasse (Poids sec), afin d‟éviter le recours systématique à cette technique

longue et peu précise pour les faibles valeurs de biomasse.

Les courbes standards de proportionnalité DO/Poids sec pour les levures ont été realisées sur

milieu minimum à 30 °C (annexe 11).

3.2 Evaluation de l’activité amylasique et saccharification des bactéries

L'hydrolyse enzymatique de la matière première (noyau de mangue) a été menée à des

températures de 50-55 °C, avec des α-amylases produites par des bactéries du genre Bacillus.

L‟évaluation de la performance de l'hydrolyse a été basée sur le rendement de la libération des

sucres réducteurs en fonction de la biomasse.

Initialement 1 L de bouillon nutritif contenant 50 g de substrat de mangue (broyat de

noyau de mangue: 50 g/L) a été préparé et stérilisé. L‟inoculum de chaque souche de Bacillus (10

ml) a été ensemencé; puis les cultures sont placées sous agitation lente (100 rpm) pendant 4

heures. La densité optique des préparations est suivie à 600 nm sur une plaque multi-puits à

l‟aide du spectrophotomètre décrit précédemment. On effectue un dosage progressif du taux de

sucres réducteurs liberés au cours de l‟hydrolyse. Auparavant les taux de sucres réducteurs et

totaux initiaux ont été déterminés.

58

4. Traitement des données

La moyenne des valeurs numériques de la densité optique (DO) des différentes cultures

ainsi que celles des témoins a été obtenue grâce à un tableur Excel 2007.

Calcul des rendements et paramètres cinétiques

La différence entre la densité optique de la culture (DOculture) et celle du témoin (DOtémoin) a

donné la densité optique réelle (DOréelle) de la culture selon la relation suivante :

Le rendement YX/S (g biomasse/g substrat) en biomasse par rapport au sucre est défini par :

Xf: biomasse finale; Xo: biomasse initiale ; So: concentration initiale en sucre; Sf: concentration

finale en sucre.

Le rendement YP/S (g produit/g susbtrat) en produit (éthanol) par rapport au sucre est

défini par :

Pf: concentration finale du produit (éthanol); Po : concentration initiale du produit (éthanol)

Les vitesses maximale et spécifique de croissance (µmax, μ ) sont définies par:

X : biomasse cellulaire; dX/dt : variation de la biomasse cellulaire en fonction du temps.

DO est la valeur de la densité optique en début de la phase exponentielle de croissance et DO’,

celle à l‟instant t durant la phase exponentielle de croissance.

K correspond à une constante = Charge cellulaire ou biomasse à l‟instant initial.

Yx/s = (Xf-Xo) / (So-Sf)

Yp/s = (Pf-Po) / (So-Sf)

μ (h−1) = (1/X) x (dX/dt)

DOréelle = DOculture - DOtémoin

Log10 (DO’/DO) = µmax.t + K

59

III: ETUDE DE L’INFLUENCE DE PARAMETRES

ENVIRONNEMENTAUX SUR LA BIOMASSE

MICROBIENNE ET LA FERMENTATION

60

Le but de cette étude est de vérifier l‟influence des facteurs du milieu réactionnel sur

l‟évolution de la biomasse microbienne et de la fermentation.

1. Etude de la tolérance à l’alcool

La technique utilisée a été celle décrite par Obire (2005) pour étudier la tolérance à

l‟alcool de l‟espèce Saccharomyces cerevisiae isolée de différents biotopes.

Après stérilisation, des volumes appropriés d‟éthanol ont été ajoutés au milieu de culture

par filtration à l‟aide d‟un filtre millipore (0,22 μm) conduisant respectivement à des

concentrations alcooliques de 0%, 5%, 7,5%, 10%, 12% et 18% (v/v). La croissance des souches

a été réalisée pendant 24 heures à 30 °C. Des milieux alcooliques non ensemencés ont été utilisés

comme témoins et pour chaque concentration donnée, la croissance a été réalisée dans trois tubes

pour chaque souche. Un volume de 100 µl de chaque suspension bactérienne en phase

exponentielle de croissance, a été utilisé comme inoculum.

La tolérance à l‟alcool a été appréciée à travers la croissance des souches pendant 24

heures en mesurant l‟absorbance à 600 nm à l‟aide du spectrophotomètre type « µQuant » couplé

à un ordinateur équipé du logiciel KC Junior susmentionné. Les mesures ont été effectuées en

triple pour chaque souche et pour chaque mesure.

La viabilité des souches dans l‟alcool a été testée en repiquant la culture réalisée entre 10

et 15 % (v/v) d‟alcool sur milieu gélosé. Une croissance positive témoigne de la viabilité de la

souche concernée à la concentration alcoolique testée. . Les valeurs des DO liées aux différentes

concentrations d‟alcool après 24 heures ont été utilisées pour tracer une courbe de tendance afin

de déterminer l‟effet de l‟alcool sur chacune des souches retenues. La pente de ces courbes donne

l‟effet de l‟alcool sur les souches.

Le tracé de la courbe de tendance définie par log10 (DO‟/DO) en fonction du temps t a permis

de déterminer les paramètres cinétiques de croissance durant la phase exponentielle de

croissance : la vitesse maximale de croissance µmax et le temps de génération t1/2.

log10 (DO’/DO) = µmax .t + K

La pente de cette courbe de tendance correspond à la vitesse maximale de croissance µmax

et le temps de génération t1/2 a été déterminé selon la relation :

61

t1/2 = 0,69/ µmax

DO est la valeur de la densité optique en début de la phase exponentielle de croissance et DO’,

celle à l‟instant t durant la phase exponentielle de croissance. K correspond à une constante.

L‟analyse de nos données a été basée sur la comparaison des paramètres cinétiques de

croissance déterminés durant la phase exponentielle de croissance.

2. Etude de l’effet du pH sur la croissance microbienne et la fermentation

En fermentation alcoolique le pH est un paramètre très important, réputé agir sur l‟activité

métabolique de la levure et moduler la synthèse des acides formés au cours de la fermentation. Il

nous a donc paru indispensable d‟étudier le rôle du pH sur les souches de levure sélectionnées

compte tenu des incidences possibles sur le procédé de fermentation (pertes de productivité,

modification de la composition des milieux de fermentation). Pour cela, des cultures en batch ont

été realisées à différents pH. Cette étude a été réalisée dans des fermenteurs type « Biolafite » de

500 ml de volume utile. L‟ensemencement est effectué à l‟aide au minimum d‟un inoculum de

5.105 UFC/mL à partir des souches de levures sélectionnées en fin de phase de latence. La

température de fermentation a été fixée à 30 °C, l‟agitation est de 150 tours/min. La souche de

levure a été ensemencée dans une série d‟erlenmeyers contenant le milieu synthétique avec 20

mM de glucose dont le seul paramètre variable est le pH (pH allant de 3,5 à 7,5). Ces milieux ont

été préparés avec des solutions tampons (tampon acétate de pH variant de 3 à 6 et tampon

phosphate de pH variant de 6 à 9). L‟intensité de la croissance pour chaque pH est évaluée par la

mesure de la densité optique à 600 nm au spectrophotomètre pendant 24 heures, (KONLANI et

al., 1996).

3. Influence de la température sur la croissance microbienne

L‟effet de la température sur la croissance optimale des souches a été déterminé en

mesurant directement l‟absorbance des cultures à une longueur d‟onde de 600 nm. Les souches de

levure ont été ensemencées dans une série de tubes contenant le même milieu de culture (20 mM

de glucose, pH 5,5) dont le seul facteur variable est la température d‟incubation (20 °C, 25 °C, 30

°C, 35 °C, 37 °C, 40 °C, 45 °C et 50 °C).

62

IV : PROCÉDÉ D’OPTIMISATION DE LA

PRODUCTION DE BIOÉTHANOL

63

1. Procédé simultané de saccharification et de fermentation (SSF) des résidus de mangues

1.1 Cocultures de Bacillus sp et Saccharomyces sp sur les résidus de mangues

L'hydrolyze des résidus de mangues (broyats de pulpe et noyau) et la fermentation

simultanée ont été realisées dans un Erlenmeyer de 500 ml à 10%, comme concentration en

substrat. Le milieu de fermentation contient le broyat de mangue prétraité comme substrat (200

mg/L du metabisulphite du potassium). Après liquéfaction, le pH a été ajusté à 4,5; le

metabisulphite de potassium ainsi que les inocula des souches de Bacillus (A1M 1, sp2, sp3, sp4)

et B. licheniformis ont été ajoutés à une température de 55°C pour optimiser la libération des

sucres réducteurs durant 4 heures. Après un refroidissement à 45 °C et 40 °C des inocula des

souches de levures (avec 5×105-2,5×106 cellules/ml) sélectionnées ont été ajoutés

indépendamment pour chaque balon de fermentation. Ces souches étaient thermotolérantes. La

SSF a été réalisée à 37 °C et 40 °C pour 7 jours à 150 rpm. Le rendement théorique de la SSF a

été calculé en supposant que tout le glucose potentiel dans la matière était disponible pour la

fermentation. Les expériences ont été réalisées en triplicata.

La concentration de l'éthanol a été déterminée chaque 24 heures après distillation de 50 ml

du milieu durant le processus de la fermentation. La figure 7 résume le procédé expérimental de

production d‟éthanol.

1.2 Détermination de la concentration en éthanol produit

Le distillat a été collecté à l‟aide d‟un distillateur à 78°C. L‟éthanol produit a été recolté

et son volume mesuré dans un cylindre cubique. La quantité d‟éthanol produit est déterminée en

multipliant le volume de distillat collecté à 78°C par la concentration d'éthanol (concentration

théorique : 0,8033 g/ml). La concentration en g/L est équivalente au rendement de 100 g de

substrat (Humphrey et Okafoagu, 2007). Le volume et la densité optique de l‟éthanol produit ont

été déterminés. La concentration est déterminée à l‟aide d‟une courbe standard donnant la

concentration de l‟éthanol (g/L) en fonction de la densité optique (600 nm) selon la méthode

préconisée par Humphrey et Okafoagu (2007).

64

1.3 Détermination du pourcentage d'éthanol par spectrométrie

Une courbe standard donnant la densité optique (600 nm) en fonction du pourcentage en

l'éthanol a été realisée. Une série de pourcentages croissants de solution d'éthanol variant de 2 à

20 % (v/v) a été préparée. La densité optique pour chacune des solutions a été mesurée

permettant d‟etablir la courbe standard DO = f [% alcool (v/v)]. Le pourcentage d'éthanol

produit a été obtenu en utilisant l‟équation de la courbe standard.

1.4 Détermination du pourcentage d'éthanol par CPG

Le pourcentage en éthanol a été mesuré par chromatographie en phase gazeuse à l‟aide

d‟un chromatographe (121 DFL - Intersmat) utilisant une colone de verre remplie avec du

carbopack B 60/80 et de Carbowax 15% 20M et un détecteur à ionisation de flamme (FID). La

température de la colonne était 85°C, celle de l‟injecteur … et le gaz vecteur était l'azote. Le

méthanol a été utilisé comme étalon interne.

Figure 7 : Schéma de Fermentateur utilisant le procédé Simultanné de Saccharification et de

Fermentation (SSF).

65

2. Etude de l’effet des sels minéraux et de l’azote sur les potentialités des souches et

l’optimisation de la fermentation

Certains sels ont été retenus pour leurs effets positifs connus sur la croissance et la

production d‟éthanol. La biomasse est suivie par densitométrie à 600 nm au spectrophotomètre.

L‟acool est recueilli par distillation à 78°C. Le volume et la densité optique ont été determinés.

La concentration est déterminée à l‟aide d‟une courbe standard donnant la concentration de

l‟éthanol (g/L) en fonction de la densité optique sur la base de la méthode préconisée par

Humphrey et Okafoagu (2007). L‟étude de l‟effet des sels minéraux a été effectuée selon la

méthode de Boudjelal et Nancib (2001).

2.1 Effet de NaCl

Le milieu synthétique de fermentation (Annexe 3 sans Agar) a été utilisé comme milieu

de base pour étudier l‟effet de NaCl. Une gamme de concentrations de NaCl de l‟ordre de 2 à

20‰ (g/L) a été realisée dans des erlermeyers. Un volume de 200 µl de chaque inoculum

levurien a été ensemencé dans un milieu de 100 ml. Les cultures contenant 20 mM de glucose

sont placées sous agitation (150 rpm). La densité optique est suivie pendant 24 heures. La

biomasse ainsi que le taux d‟alcool produit sont évalués toutes les heures.

2.2 Effet de FeSO4

Les cultures levuriennes sont réalisées sur le même milieu synthétique de base. Dans ce

cas seule la concentration de FeSO4 varie graduellement de 0,01 à 0,1g/L. Les cinétiques de

fermentation et de production de biomasse ont été suivies pendant 24 heures.

2.3 Effet de MgSO4

L‟expérimentation se conduit avec le milieu synthétique de base. Les concentrations de

MgSO4 varient de 0,1 à 0,8 g/L. La fermentation et la production de biomasse ont été suivies

pendant 24 heures.

66

2.4 Effet de KH2PO4/K2HPO4

L‟effet de KH2PO4/K2HPO4 sur la croissance microbienne (biomasse) et la production

d‟éthanol a été suivie pendant 24 heures avec des concentrations croissantes de 0,1 à 0,8 g/L. Les

mêmes types de cinétiques ont été mesurés durant 24 heures.

2.5 Effet de MnSO4

Les concentrations de MnSO4 dans le milieu de culture varient de 0,1 à 0,8 g/L. Pendant

la technique a été utilisée. Les cinétiques de fermentation et de production de biomasse ont été

evaluées pendant 24 heures.

2.6 Effet de la source d’azote (Extrait de levures)

Afin d‟améliorer la production d‟alcool par les souches levuriennes, le milieu synthétique

de base a été enrichi avec différentes concentrations en extrait de levure respectivement : 5 à 30

g/L. Le même procédé a été appliqué pour le suivi de la fermentation et de la production de

biomasse.

67

CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSIONS

68

Partie 1 : Etude de la composition chimique et

macromoléculaire de la biomasse

(mangues et résidus)

69

1. Composition chimique et macromoléculaire des résidus de mangues

Le tableau 4 rapporte la composition macromoléculaire et les aspects physico-chimiques

obtenus sur les résidus de mangues. Les échantillons analysés sont regroupés par variété.

Tableau 4: Paramètres physico-chimiques des résidus de quatre (4) variétés de mangues.

Variété

Paramètre

Zill (Z) Sauvage (S)

Brook (B) Amélie (A)

Pulpe

pH 3,61± 0,3 4,48± 0,4 3,51± 0,38 4,71± 0,36

% Humidité (g/g) 76,36 ± 0,2 83,10 ± 0,5 76,50 ± 0,27 78,78 ± 0,29

% Matière sèche totale (g/g) 23,64 ± 0,32 16,90 ± 0,45 23,49 ± 0,35 21,22 ± 0,26

% Cendres (g/g) 2,03 ± 0,1 1,60 ± 0,3 2,71 ± 0,43 3,01 ± 0,16

% Sucres réducteurs (g/g) 2,81 ± 0,4 2,36 ± 0,38 2,82 ± 0,47 5,70 ± 0,29

% Sucres totaux (g/g) 6,38 ± 0,2 4,56 ± 0,3 6,34 ± 0,4 10,39 ±0,26

% Amidon (g/g) 0,79± 0,2 0,74± 0,11 0,65± 0,25 0,33± 0,15

Noyau

% Sucres totaux (g/g) 19,81± 0,3 20,40± 0,11 20,12± 0,13 22,62± 0,2

% Amidon (g/g) 18,22± 0,27 18,77± 0.13 18,51± 0,23 21,81± 0,18

La mesure du pH des échantillons de résidus de mangue montre que les variétés Amélie

(A) et sauvage (S) présentant des valeurs moyennes respectives de 4,48 ± 0,4 et 4,71 ± 0,36 sont

moins acides que celles de Zill (3,61± 0,3) et Brook (3,51± 0,38). Les travaux d‟Akubor (1996)

ont montré que la variété sauvage a un pH de 5,12; de même ceux de Hossain et collaborateurs

(2001) indiquent des pH compris entre 4 à 6 pour différentes variétés de mangues.

70

Le pH est lié à l‟acidité totale de la pulpe, due à la présence des acides organiques. Le taux

d‟acides organiques peut augmenter suite à une oxydation incomplète du glucose; par ailleurs une

forte proportion d‟acides organiques peut engendrer un pH acide. Ces pH acides offrent un

avantage au développement des levures et moisissures par rapport aux autres microorganismes.

Les taux d‟humidité compris entre 83,10 ± 0,5% et 76,36 ± 0,2% varient d‟une manière

inversement proportionnelle à ceux de la matière sèche totale. Les taux de matière sèche totale

obtenus dans les quatre variétés de mangue varient de 16,90 ± 0,45% à 23,64 ± 0,32%. Ces

résultats sont en corrélation avec ceux obtenus par Hossain et collaborateurs (2001) qui

indiquent que le taux de matière sèche totale pour la mangue fraîche se situe entre 17,60% à et

23,50%. D‟autres recherches antérieures menées par Colin et collaborateurs (1981) avaient

montrés des valeurs comprises entre 14,37% et 20,35%.

Les taux de cendres restent faibles avec une moyenne comprise entre 1,60 ± 0,3% et

3,01± 0,16%. Les taux de matière sèche varient de 16,90 ± 0,45 à 23,64 ± 0,32 témoignant une

forte teneur en eau, car il existe une corrélation entre ces deux paramètres. Askar et

collaborateurs (1972) ont montré que l‟augmentation de la teneur en matière sèche résulte d‟une

diminution de celle en eau et vice-versa. La teneur eau élevée prédisposérait la mangue fraîche à

une prolifération microbienne.

La teneur en sucres réducteurs de la variété Amélie double celle des trois autres variétés.

Les teneurs moyennes se situent entre 2,36 ± 0,38% et 5,70 ± 0,29% et sont proches de valeurs

présentées par Hossain et collaborateurs (2001) qui sont de 6,58% à 10,35% pour la pulpe

fraîche. Elles sont comparables également aux valeurs obtenues dans d‟autres fruits tels que la

banane, l‟orange, l‟ananas qui varient de 4 à 15 % (Akubor, 1996).

Les faibles taux de sucres réducteurs dans les mangues sont dus à leur dégradation par des

enzymes ou l‟action microbienne. Les sucres sont alors fermentés et les alcools se condensent

avec les acides pour donner des esters. La conséquence est une perte d‟eau, de sucres, d‟acides et

de saveur. Les déchets de mangues peuvent donc en même temps constituer une source pour le

prélèvement des souches de microorganismes utilisateurs de sucres.

Les pourcentages en sucres totaux varient de 4,56 ± 0,3% à 10,39 ± 0,26% pour la pulpe et de 19,81± 0,3% à 22,62 ± 0,2% pour le noyau. Ces valeurs pour la pulpe sont faibles par rapport à celles trouvées par Hossain et collaborateurs en 2001 (18,70% à 26,85%) et par Akubor en 1996 (21%), tandis que celles obtenus pour le noyau sont comparables aux données des mêmes auteurs.

71

Egalement ces valeurs de la pulpe sont également faibles comparées à celles trouvées par Traoré et Konlani (1989) dans la mélasse (38,57%). Le taux d‟amidon dans la pulpe varie de 0,33± 0,15 à 0,79± 0,2 et est largement inferieur à celui contenus dans le noyau (18,22± 0,27 à 21,81± 0,18).

Les teneurs en sucres totaux dans les résidus de la pulpe révélées dans nos travaux sont inférieures à celles du noyau. Cette différence peut s‟expliquer par la forte proportion d‟amidon dans le noyau (difficilement dégradables).

72

Partie 2 : Isolement des souches de bactéries

et de levures et essai taxonomique

73

1. Isolement et identification phénotypique des souches levuriennes

La sélection basée sur des critères morphologiques et culturaux, a permis de sélectionner 20 souches. Les caractéristiques

essentielles des souches rétenues sont résumées dans le tableau 5.

Tableau 5 : Principales caractéristiques des souches de levures rétenues

Souches levuriennes

Caractéristiques S1 S2 S3 S4 A1 B1 W1, 2 ,5, 6

Saccharomyces sp* Schizosaccharomyces sp*

Morphologie O/S O/S O/S O/S O/S O/S O/S Ovoïde/Sphérique Ovoïde/Sphérique (o/s) Bourgeonnement/ Pseudo-mycelium

+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ + +

Aéro-anaérobie facultatif + + + + + + + + +

Ascospores 8 8 4 4 4 4 4 4 8

Formation de voile blanche/ Sédiment

+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+

Coloration de GRAM + + + + + + + +/+ +/+

Oxydase /Catalase +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Substrats métabolisés

Acétate de sodium - - - - - - - - - Arabinose + + + + + + + + + Fructose + + + + + + + + + Galactose + + + + + + + + + Glucose + + + + + + + + + Lactose + + + + + + + + + Mannose + + + + + + + + + Raffinose + + + + + + + + + Nitrate + + + + + + + + + Amidon - - - - - - - - - *Lodder(1971)

74

Sur milieu solide il y‟a formation de colonies rondes, blanchâtres et mates ayant un diamètre

moyen de 2 à 4 mm avec des contours ronds. La couleur blanchâtre des colonies évolue vers le

gris au fur et à mesure que se prolonge la durée de conservation. Au microscope on observe des

cellules ovoïdes ou associées par paire formant des pseudo-mycéliums. En plus, on observe en

milieu liquide la formation d‟un voile blanchâtre avec un dépôt de sédiments au fond du tube ; le

milieu trouble s‟éclaircit au bout de 72 heures. Parmi les sources de carbone mises à la

disposition des souches, seuls l‟amidon et le lactose ne sont pas métabolisés. Les différents

examens de caractérisation ont permis de rassembler les caractéristiques essentielles afin de

regrouper et classer des souches isolées.

Les caractères des souches sélectionnnées (Tableau 5) se rapprochent de ceux publiés par

Obisanya (1987) sur les levures. Les caractéristiques obtenues des levures ont permis de réaliser

leur identification partielle par la clé dichotomique de Lodder (1971). Au regard des résultats du

tableau 5, les souches S1, S2 pourraient appartenir au genre Schizosaccharomyces et S3, S4, A1,

B1, W1, W2, W5, W6 au genre Saccharomyces.

La capacité à fermenter et la performance de ces souches ont été testées en milieu

glucosé et en milieu contenant les résidus de mangues comme hydrate de carbone. L‟article 1

(Somda et al., 2010) rapporte les détails expérimentaux, les résultats majeurs obtenus sur les

caractéristiques de 04 souches de levures sélectionnées (S1, S2, S3, S4) et la capacité à

fermenter les résidus de mangues de 02 souches de levures (S1, S3). Il en resort que les colonies

obtenues sont lisses, de forme sphéroïdes, de diamètre compris entre 2 à 5mm, et pourvues

d‟ascospores (4 et 8); pourraient appartenir respectivement au genre Saccharomyces et

Schizosaccharomyces. Elles présentent les atouts nécessaires pour leur utilisation en

fermentation. Les souches S1 et S3 rétenues, possèdent des rendements de biomasse de l‟ordre

respectif 0,36 et 0,28; ainsi que des rendements en alcool de 0,46 et 0,39.

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2. Sélection et identification phénotypique des souches bactériennes

Les résultats obtenus sur les bactéries et présentés dans le tableau 6 montrent que ce sont

des bacilles Gram positif ou négatif, aérobies anaérobies facultatifs, douées ou non d‟une

mobilité. Leur culture sur milieu solide se caractérise par des colonies polymorphes. Ces souches

ont un métabolisme respiratoire et fermentaire. Elles sont productrices de catalase, d‟oxydase,

mais toutes productrices d‟acétoïne. Ce sont des souches non sporulantes ou sporulantes dont

l‟extrême résistance des spores leur confère un caractère ubiquiste. A la différence des souches de

levures, elles ont la capacité ou non de métaboliser l‟amidon. La production de catalase par les

souches permet d‟exclure B. anthracis et B. cereus var. mycoïdes.

Tableau 6: Caractéristiques morphologiques, biochimiques et physiologiques des souches

bactériennes rétenues

Souches

Caractéristiques

Sb1

(A1M1) Sb2 Sb3 Sb4

Bacillus Sp*

Aspect

Bord régulier, Blanchâtre,

ø = 1 mm

Bord régulier, Blanchâtre

ø ≤ 2 mm

Bord régulier, Blanchâtre,

ø = 2 mm

Bord régulier, Blanchâtre,

ø ≤ 2 mm

Bord régulier, Blanchâtre,

1≤ø ≤ 2 mm

Forme Bacilles Bacilles Bacilles Bacilles Bacilles

Regroupement chaînettes chaînettes Chaînettes chaînettes chaînettes

Gram + + - - +/-

Oxydase + + + + +

catalase + + + + +

Mobilité + + + + +/-

V P + + - - +/-

R M - - + + +

Sporulation + + - - +/-

Amidon + - - +/- +/-

Glucose +G +G +G +G +G

Fructose +G +G +G +G +G

Saccharose +G +g +G +G +G

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*Bergey manuel of determinative bacteriology

+G : Utilisation avec production de gaz ; +g : Faible production de gaz ; + : test positif ; - : test négatif

V P : test de Voges-Proskauer ; RM : test de rouge de méthyle ; ø = diamètre

Sur la base des critères définis dans le "Bergey‟s Manual of determinative Bacteriology",

les caractéristiques globales morphologiques, biochimiques et physiologiques relatives aux

Bacillus (Gram, catalase, oxydase, sporulation, respiration, mobilité) permettent d‟affilier les

souches bactériennes sélectionnées au genre Bacillus.

Ces souches peuvent être affiliées à la famille des Bacillaceae. Elles pourraient appartenir

probablement au genre Bacillus car elles possèdent des caractères retrouvés chez Bacillus

subtilis, Bacillus pumilis et Bacillus licheniformis (Buchaman et Gibbons, 1975). Les souches de

Bacillus sélectionnées ont été utilisées pour l‟hydrolyse des glucides non réductibles afin

d‟améliorer le taux de sucres réducteurs et d‟optimiser le rendement de la fermentation.

85

Partie 3 : Etude des paramètres

environnementaux sur les potentialités

des souches isolées

86

L‟étude réalisée sur l‟effet de différents facteurs environnementaux concernant la

croissance de souches du genre Saccharomyces a permis de confirmer que cette croissance

microbienne est influencée notamment par les constituants du milieu de culture et mais également

par les facteurs physico-chimiques (température, alcool, etc…). Parmi ces facteurs l‟influence de

la température est principale. Le tableau 7 présente l‟influence de la température sur les

performances cinétiques de deux souches de levures rétenues pour leur performance.

Tableau 7 : Paramètres cinétiques de deux souches levuriennes à 40, 42 to 45°C en présence

80g/l de glucose.

Paramètres

cinétiques

Souches levuriennes

W6 B1

40°C 42°C 45°C 40°C 42°C 45°C

Yx/s (g X/g S) 0,14 ± 0,03 0,12 ±0,01 0,11 ±0,01 0,17±0,04 0,1 ±0,04 0,08 ±0,04

YE/s (g E/g S) 0,35 ±0,04 0,21 ±0,01 0,18±0,01 0,30±0,04 0,24 ±0,05 0,16±0,08

Les résultats obtenus montrent que les souches sont thermotolérantes car capables de

supporter des températures variant de 40°C à 45°C et qu‟elles tolérent également des dégrés

alcooliques de 12°. Cette tolérance aux températures élevées pourrait s‟expliquer par la synthèse

de certains groupes de protéines. Hiraishi et collaborateurs (2006) ont observé ce même

phénomène de thermotolérance chez certaines levures, et ont mis en souligné l‟implication des

protéines.

Les résultats des paramètres cinétiques montrent que la souche W6 présente des

rendements de biomasse de 0,14 ± 0,03 et 0,11 ±0,01 et d‟éthanol de 0,35 ±0,04 et 0,18±0,01

respectivement à 40°C et 45°C. Quant à la souche B1, elle possède des rendements lègèrement

inférieurs de biomasse de 0,17±0,04 et 0,08 ±0,04 et d‟éthanol de 0,30±0,04 et 0,16±0,08.

L‟étude des facteurs environnementaux sur les souches a permis d‟accroître leurs

potentialités fermentaires dans le processus de fermentation simultanée. Les principaux résultats

(Somda et al., 2011a) ont montré que l‟hydrolyse enzymatique ( par la souche Sb1) des résidus

de mangues, a permis d‟obtenir 62% de conversion de substrats en sucres réductibles. A la suite

de la fermentattion simultanee, les souches levuriennes W6 et B1 ont fournis des rendements

alcooliques de l‟ordre respectif de 0,35 et 0,30 (g/g).

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Partie 4 : Optimisation du procédé de

production de bioéthanol

95

Cette étude qui venait en complément à l‟étude sur la recherche des souches thermo-

tolérantes et alcoolo-tolérantes a été réalisée dans le but d‟optimiser le rendement en bioéthanol

en utilisant un processus simultané d‟hydrolyse et de fermentation.

Le procéde d‟hydrolyse de la matière première en vu d‟accroître le taux de sucres réducteurs, a

fournit les résultats consignes dans le tableau 8.

Tableau 8 : Cinétique de l‟hydrolyse des carbohydrates des résidus de mangues et de libération

des sucres réducteurs

% sucres réducteurs

Temps d’hydrolyse

(min)

B. licheniformis Bacillus A1M 1

Amylase (-) Amylase (+) Amylase (-) Amylase (+)

0 2 0 0 0

20 4 8 2 5

40 5 15 3 10

60 5 19 5 17

80 5 22 6 24

120 5 49 5 46

160 5 78 6 62

200 5 78 6 62

240 5 78 6 62

Le procédé enzymatique performant pour la biotransformation des carbohydrates non

fermentescibles, a permis de libérer à partir des résidus le maximum de sucres fermentescibles

en bioéthanol. Les souches de Bacillus A1M1 et Bacillus licheniformis ont pu hydrolyser les

carbohydrates non réductibles des résidus de mangues et libérer respectivement 62% et 78% (g/g)

de sucres réducteurs. Par ailleurs en l‟absence de l‟enzyme, il n‟ya pas de différence majeure de

taux de sucres réducteurs. Ainsi les sucres libérés ont été simultanément fermentés en éthanol. Le

tableau 9 résume les concentrations respectives en éthanol obtenues suite à la fermentation par les

souches levuriennes sélectionnées.

96

Tableau 9 : Production d‟éthanol par les souches levuriennes

Souches de levures W1 B1 A1 S3

Concentration en

Ethanol (g/l)

19-21,75

10,1 14,4 16

La production d‟alcool par les souches rétenues est de l‟ordre de 10,1 à 19. Mais l‟influence

positive des élements minéraux (notamment l‟azote) aditionnés de manière controlée dans le

milieu de fermentation, a permis d‟optimiser la concentration de l‟éthanol à 21,75.

Les résultats issus du procédé d‟optimisation de la production d‟éthanol (Somda et al., 2011b),

montrent que les souches levuriennes A1 et A3 produisent des concentrations alcooliques

respectives de 14,4 g/l et 16 g/l. Quant à la souche B1, elle produit un taux nettement inférieur

aux autres souches avec une concentration de 10,1 g/l. Par ailleurs l‟introduction controlée des

sels minéraux a permis d‟accroitre la performance fermentative des souches. Ainsi l‟apport de

l‟azote dans le milieu réactionnel révèle son influence positive selonSomda et al. (2011c). Cela

s‟est traduit par la hausse de la concentration d‟alcool de 19 a 21,75 g/l au niveau de la souche

W1 (rétenue pour sa performance).

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Partie 5 : Discussion générale

116

1. Composition chimique et macromoléculaire des mangues et résidus

La composition des mangues et résidus est très favorable à leur valorisation. Les résidus

(pulpe et noyau) renferment 4,56% à 22,62% de glucides totaux (Tableau 4), comprenant:

amidon, glucose, fructose, cellulose, pectines. A ce titre ils constituent une excellente source de

bioénergie ou biocaburant. L‟équipe de Gopalan et ses collaborateurs en 1999 ont trouvé un taux

inférieur au nôtre dont 15,9% de carbohydrates dans les résidus de mangues. Par ailleurs Ajila et

ses collaborateurs en 2007 par l‟hydrolyse acide réalisée sur les noyaux de mangue ont obtenu

une valeur supérieure (28,2%). Ainsi la teneur en cabohydrates des résidus mangues, montre

qu‟ils peuvent constituer une source importante de biomasse au même titre que les principales

sources déjà existantes que sont les résidus de céréales (maïs, sorgho, blé, mil, riz), de tiges des

plantes (canne à sucre), de tubercules (bétterave, patate, igname) et surtout de fruits (mélasse,

papaye, orange…) mais aussi d‟herbes renpentes (Ibeto et Okpara, 2010).

Nos résidus de mangues renferment des composés difficilement métabolisables, mais

l‟hydrolyse enzymatique a permis d‟obtenir 17,46% carbohydrates bioconversibles (Somda et al.,

2011b), soit un rendement de bioconversion de l‟ordre de 0,78. Ce résultat est inferieur à celui de

Rowan et ses collaborateurs au Maryland, qui en 2009 ont pu valoriser par procédé enzymatique

le Kudzu (Pueraria montana var lobata), une plante parasite des cultures de champ en optimisant

le taux de carbohydrates utilisables à 37 %. La paille du blé contenant de l‟hémicellulose a été

analysée en Inde par Nigam (2000). Le processus d‟hydrolyse leur a permis d‟obtenir un taux de

25 % de sucres simples bioconversibles (glucose, arabinose), supérieur au nôtre. Le taux de

sucres fermentescibles obtenu dans les déchets de mangues (17,46 %) répresente une valeur

moyenne comparée aux autres types de déchets agro-industriels. En effet il varie en fonction de la

nature des résidus et du procédé de transformation utilisés. Ainsi Les travaux de Chantata et

collaborateurs en 2008, ont montré que l‟enveloppe de la pomme après extraction du jus

constituait un déchet agro-industriel valorisable, car elle répresente 15-30 % de carbohydrates

fermentescibles. Pour la rationalisation des déchets agricoles, l‟équipe de Yamaji et ses

collaborateurs (2006) ont établi un processus d‟hydrolyse enzymatique permettant d‟obtenir 30 %

de carbohydrates réductibles à partir de résidus (son) des céréales. Au Nigéria Akin-Osanaiye et

collaborateurs en 2008, ont montré que les résidus de fruit de papaye contiennent 20,82 % de

carbohydrates réductibles. Ces résidus peuvent être valorisés.

117

En Algérie Boujelal et Nacib (2001) ont trouvé que les déchets de dattes renferment 55 %

de sucres totaux. Au Burkina Faso, Traoré et konlani (1989) ont pu montrer que les résidus de

mélasse renfermeraient plus de 25 % de sucres réducteurs.

L‟amélioration par moyen enzymatique du pourcentage de glucides fermentescibles dans

les résidus de mangues ainsi que les travaux de ces différents auteurs sur les résidus agro-

industriels, confirment que les résidus de mangues pourraient être exploités par la voie

biotechnologique.

2. Isolement et identification phénotypique des souches levuriennes et bactériennes

Les caractéristiques morphologiques et culturales des souches retenues se rapprochent de

celles citées dans la littérature sur les levures par Accolas (1984), Guiraud et collaborateurs

(1984) et Obisanya (1987). Ces souches sont immobiles. La présence des ascospores dans les

souches permet de les affilier à la classe des ascomycètes ou ascosporogènes. Ces souches

assimilent les nitrates et ne présentent pas de filamentation, contrairement à Candida albicans

(Bouchet et al., 1990). Les caractères physiologiques (assimilation et fermentation des sucres)

sont régis par la loi de Kluyver selon Bouchet et collaborateurs (1990) stipulant que toute souche

qui fait fermenter un sucre l‟assimile nécessairement. Les souches étudiées sont oxydase et

catalase positives, mais également aéro-anaérobies facultatives.

Il en résulte de l‟étude des différents critères (morphologiques, biochimiques et

physiologiques) que les souches identifiées appartiennent au groupe des levures et à la classe des

ascomycètes. Elles possèdent un métabolisme fermentaire et respiratoire et une tolérance au

milieu acide qui permet de les classer dans le genre Saccharomyces.

Les souches isolées et purifiées sont constituées de cellules ovoïdes. L‟étude des

caractères morphologiques, biochimiques et physiologiques a permis de donner une approche

d‟identification des souches selon la clé dichotomique de Lodder (1971). Du fait des

antibiotiques (gentamycine ou chloramphénicol) utilisés qui inhibent spécifiquement les

procaryotes et non les eucaryotes, on peut affirmer que ces souches sont des eucaryotes. Aussi le

test au cyclohexymide confirme que les souches isolées sont du genre Saccharomyces. Les

différents résultats permettent de tirer les conclusions suivantes :

118

Les souches appartiennent au groupe des levures, à la classe des ascomycètes, à l‟ordre

des endomycétales, à la famille des Saccharomycetaceae, à la sous famille des

Saccharomycetoideae, au genre Saccharomyces.

Les caractéristiques globales morphologiques, biochimiques et physiologiques montrent

que les souches bactériennes rétenues pourraient être affiliées à la famille des Bacillaceae. Elles

pourraient appartenir probablement au genre Bacillus car elles possèdent des caractères retrouvés

chez Bacillus subtilis, Bacillus pumilis et Bacillus licheniformis (Buchaman et Gibbons, 1975).

Les souches ayant des caractéristiques similaires à celles du genre Bacillus ont été également

isolées par certains auteurs au cours de la fermentation des graines de Parkia biglobosa (Jideani

et Okere, 1991) et de Bi-kalga (Bengaly, 2001). L‟habitat primaire des Bacillus est le sol, mais on

les retrouve dans les aliments où ils jouent divers rôles (Guiraud, 1998).

Les espèces appartenant au genre Bacillus constituent un ensemble de souches

génétiquement et phénotypiquement très hétérogène (Combet-Blanc, 1995). Les bactéries du

genre Bacillus produisent des α-amylases à action endomoléculaire leur permettant de dégrader

les polymères glucidiques en glucose et en des molécules voisines. La ß-amylase à action

exomoléculaire est excrétée par Bacillus subtilis (Bengaly, 2001). Egalement les enzymes

hydrolysant les polymères des glucides comme les amylases, sont produites par ces bactéries

(O‟Toole, 1999).

3. Etude de l’effet de paramètres environnementaux sur les potentialités des souches sélectionnées

Les résultats obtenus, montrent l‟importance des paramètres environnementaux sur la

croissance des souches et leurs capacités de fermentation. La concentration en éthanol et la

température ont un effet significatif.

Parmi les vingt souches levuriennes sélectionnées, seules les souches (W2) et (B1, W5,

W6) respectivement croissent à 42 °C et 45 °C tout en tolérant un dégré alcoolique de 14% dans

le milieu de croissance. Le pH affecte le profil cinétique des souches. Ainsi les souches

sélectionnées ont realisé un métabolisme optimal autour d‟un pH de 4,5. Pour des températures

allant de 40 °C à 45 °C, les souches W6 et B1 ont présenté des rendements maximals en

bioéthanol respectifs de l‟ordre de 35% et 30%. Les quantités de métabolites et de biomasse

produites diminuent avec l‟augmentation de la concentration en alcool.

119

Ces résultats mettent également en évidence une variabilité importante entre les souches

d‟un point de vue cinétique, même si les tendances sont les mêmes pour toutes. Toutes les

souches n‟ont pas la même sensibilité à l‟éthanol. L‟augmentation de la temperature, du pH et de

la concentration en alcool a un effet négatif sur la croissance et l‟activité fermentaire des souches

testées. Obire et collaborateurs (2005) au Nigeria, ont montré que la bactérie Zymomonas mobilis,

isolée du vin de palme était moins sensible à l‟alcool que Saccharomyces et que celle-ci pouvait

tolérer 15% d‟alcool dans un milieu de pH4. Des souches de Saccharomyces survivant à 55°C,

ont été obtenues par Rikhvanov et collaborateurs (2001), gràce à l‟adaptation des cellules à des

températures graduelles. Edgardo et collaborateurs (2008) ont également pu sélectionner des

souches de Saccharomyces capables de croître et de fermenter le glucose (20%) à 45°C, en

procédant à l‟adapation des ces souches.

L‟effet de l‟éthanol et du pH sur la synthèse de biomasse peut être expliqué par la

consommation de substrat pour l‟énergie de maintenance. Lorsqu‟il y a une concentration critique

d‟éthanol, le stress de la cellule augmente globalement les pertes d‟énergie observables par une

diminution de quantité de biomasse formée. Ainsi, l‟influence négative de l‟éthanol sur le

développement des micro-organismes peut s‟expliquer par une augmentation de l‟énergie de

maintenance de ces derniers (Torija et al., 2002). Cette énergie de maintenance est dépensée pour

assurer les fonctions de motilité, les régulations ATPasiques pour le maintien du potentiel

transmembranaire, les flux de relargage d‟excès de substrat (Torija et al., 2002). Cette dépense

d‟énergie pourrait conduire à ralentir ou arreter la croissance cellualire.

Par ailleurs, l‟action inhibitrice de l'éthanol pouvait être liée à la perméabilité de la membrane

des cellules modifiant la solubilité en lipides de la membrane (Leao et Van Uden, 1982).

L'éthanol peut également empêcher l‟action de l‟hexokinase et de quelques enzymes

impliquées dans la synthèse des acides aminés. Des insuffisances métaboliques sur la

reproduction peuvent alors être constatées (Nagodawithana et al., 1977). Des études réalisées sur

la tolérance de souches de bactéries lactiques ont permis d‟établir une relation entre la tolérance à

l‟alcool et la constitution lipidique membranaire (Kalmar et Lonvaud, 2001). Cette étude a

montré que la teneur en phosphore, en acides gras saturés des extraits lipidiques de la membrane

diminue quand la concentration en éthanol augmente dans le milieu de culture. En même temps,

celle des acides gras insaturés, certains glycolipides et la longueur moyenne des acides gras

totaux augmentent.

120

Des études rapportées par Nedwell (1999) sur l‟effet de la température ont montré qu‟une

augmentation de ce paramètre favorise la croissance des microorganismes par l'augmentation de

la fluidité de membrane et donc l'augmentation du système de transport des protéines.

Des comparaisons entre les résultats obtenus dans notre étude et ceux de travaux menés

par différents auteurs ont permis de confirmer l‟importance des paramètres environnementaux sur

le développement des souches de levures.

4. Optimisation de la production de bioéthanol

La maîtrise des paramètres environnementaux a été un facteur essentiel permettant

l‟optimisation du rendement en bioéthanol. Le procédé couplant successivement une

saccharification par hydrolyse enzymatique suivi d‟une fermentation a abouti à une nette

amélioration du taux de bioconversion des résidus de mangues en alcool. Les souches de Bacillus

Sp1 (A1M1) et Bacillus licheniformis ont pu hydrolyser les carbohydrates non réductibles des

résidus de mangues et libérer respectivement 62% et 76% à 78% (g/g) de sucres réducteurs. Les

résidus de mangues renferment en plus des sucres reducteurs, des hydrates de carbone non

fermentescibles (amidon, tannins). Les souches de bacillus produisent des α-amylases et

glucoamylases capables de rompre ces ponts osidiques et de libérer ainsi des sucres simples. Les

bactéries du genre Bacillus ont été exploitées dans ce procédé d‟optimisation car elles peuvent

synthétiser une diversité de vitamines dont la thiamine, la riboflavine et la biotine. Ces vitamines

joueraient un rôle dans l‟amélioration de la tolérance alcoolique de Saccharomyces (O‟Toole,

1999).

Lagzouli et collaborateurs (2007) ont montré que Candida guilliermondii produit des

glucoamylases capables d‟hyrolyser l‟amidon. L‟activité enzymatique subit parfois une

répression catabolique du glucose libéré reduisant ainsi le rendement de l‟hydrolyse.

Des fermentations simultanées à la suite des hydrolyses enzymatiques (réalisées par des

souches de Bacillus) des résidus de mangues ont montré que les souches de Saccharomyces S3 et

B1 ont produit des concentrations alcooliques respectives de 16 et 14,4 g/L. Par ailleurs les

résultats obtenus sur l‟utilisation séquentielle des éléments minéraux dans le milieu de

fermentation, ont élucidé l‟influence de ces derniers sur la capacité fermentaire des souches

levuriennes.

121

La souche W1 conservant sa stabilité dans l‟hydrolysat de mangues, a produit 14,2 à 17,5

g/L de bioéthanol sous l‟effet de MnSO4 et 18 g/L en présence de FeSO4. Quant à l‟azote, il a

exercé une influence plus positive sur l‟activation de la souche W1 permettant d‟obtenir une

concentrattion éthanolique de 21,75 g/L.

Le procédé SSF (saccharification simultanée et fermentation) éffectuant l‟hydrolyse

enzymatique et la fermentation éthanolique en une seule étape a montré une réduction de

l‟inhibition de l‟enzyme par le glucose qui est consommé par les micro-organismes fermentaires

au fur et à mesure de son apparition. Il en résulte souvent une augmentation des taux et vitesses

d‟hydrolyse et de production globale en éthanol. Par ailleurs, les risques de contamination

microbienne de l‟hydrolysat riche en glucose sont amoindris. Les principaux inconvénients de la

SSF sont la différence des températures optimales de l‟hydrolyse enzymatique (50°C) et de la

fermentation éthanolique (30°C à 35°C) et l‟impossibilité de recycler les levures. Le rendement

est fonction de la tolérance des souches à l‟alcool liberé dans le milieu. Pour une meilleure

tolérance à l‟alcool, la disponibilité des acides gras et leur incorporation dans des fractions de

glycolipides spécifiques au niveau membranaire seraient d‟une grande importance (Kalmar et

Lonvaud, 2001). La concentration en acide cis-vaccénique et en hopanoïdes rares dans la

membrane sont responsables de la haute tolérance à l‟éthanol. Les Hopanoïdes sont des acides

gras pentacycliques présents dans les membranes plasmiques des bactéries pour réguler leur

fluidité. Chez les eucaryotes c'est le cholestérol qui joue un rôle similaire (Buchholz et al., 1987).

Des études menées par certains auteurs tels Nigam et collaborateurs (2000) sont

parvenues à atteindre un rendement 0,41 (g/g) d‟éthanol (80,4% de rendement théorique)

supérieur au nôtre en utilisant des enzymes provenant de Pichia stipitis sur de l‟hemicellulose de

la paille de blé. Oyeleke et Jibrin (2009) au Nigeria ont pu valoriser les déchets agricoles, en

procédant simultanément à une saccharification de la paille de maïs et de mil par Aspergillus

niger suivi d‟une fermentation de Zymomonas mobilis. Des concentrations éthanoliques

respectives de 26,83 g/L et 18,31 g/L ont été obtenues sur la paille de maïs et de mil. Cette

production d‟alcool à partir de la paille de maïs est supérieure à celle issue de mangues que nous

avons enregistrée (21,75 g/L), et peut s‟expliquer selon Gunasekran et Chandra (2007) par la

présence de pyruvate décarboxylase et d‟alcool déshydrogenase chez Zymomonas mobilis,

facilitant une fermentation avec un fort taux d‟éthanol.

122

Lekneth et collaborateurs (1994) ayant travaillé sur les sucres du sorgho, obtinrent une

concentration de 27,7 g/L, concentration supérieure à la nôtre. L‟équipe de Suresh et

collaborateurs (1999) en utilisant une hydrolyse par des α-amylases de Bacillus subtilis suivie

d‟une fermentation de S. cerevisiae, ont pu obtenir des concentrations de 34 g/L sur la paille de

blé et 27 g/L sur les résidus de tiges de sorgho.

La concentration de l‟éthanol produit à partir des résidus de mangues obtenue dans notre

étude (21,75 g/L) est nettement supérieure à celle de Palmarola-Adrados et collaborateurs (2005).

Ces auteurs ont pu produire un taux d‟éthanol de 13 g/L sur la paille de blé.

123

CONCLUSION GENERALE ET

PERSPECTIVES

124

Conclusion

La recherche de valorisation des résidus de mangues par la biotransformation a été

réalisée par des techniques biochimiques et microbiologiques. Au terme de cette étude, les

résultats obtenus confirment que les résidus de mangues constituent une source importante de

biomasse exploitable pour la production de bioéthanol.

Les objectifs qui ont suscité cette étude peuvent être considérés comme atteints, car nous

disposons en amont : de la maîtrise des paramètres environnementaux sur le potentiel des

souches ; et en aval des procédés d‟optimisation de fermentations aboutissant à des

concentrations alcooliques satisfaisantes (21,75 g/l).

Les souches de Bacillus sp1 (A1M1) et Bacillus licheniformis rétenues ont présenté une

stabilité vis-à-vis de leur capacité à hydrolyser par voie enzymatique les polymères de glucose et

les polysaccharides. Egalement les souches de Saccharomyces sélectionnées ont temoigné leur

capacité à conserver leur potentiel fermentaire et à s‟adapter aux différentes conditions de

culture (Température de 45 °C et 14 dégré alcoolique).

Le SSF a permis la réduction de l‟effet inhibiteur des co-produits de l‟hydrolyse ou de la

fermentation. Les micro-organismes, notamment S. cerevisiae, peuvent dégrader certains

inhibiteurs. Par exemple, le furfural peut être oxydé en acide furoïque.

L‟utilisation des résidus de mangues pour la production de bioéthanol présenterait de

multiples avantages :

- du point de vu environnemental à travers la valorisation des co-produits et déchets,

- du point de vu socio-économique, il n‟existe pas de compétition avec l‟usage alimentaire

ou agroalimentaire, mais un moindre coût de la matière première.

Enfin les déchets de mangues ; loin d‟être uniquement des polluants pour

l‟environnement, peuvent être valorisés par la production d‟alcool (bioéthanol) et par conséquent

contribuer à l‟assainissement de l‟environnement. C‟est assurément la solution la plus pérenne à

une extension de l‟utilisation du bioéthanol.

Différents schémas et livres de procédé existent, basés sur des expérimentations menées à

des échelles représentatives. Cependant, certaines étapes sont complexes et leur amélioration

nécessite de progresser sur des aspects cognitifs, notamment sur l‟enzymologie de la cellulolyse

et sur la physiologie des levures.

125

Perspectives

L‟implantation d‟une unité pilote de production industrielle est un enjeu majeur dont

l‟avenir repose en grande partie sur les retombées de l‟essor des biotechnologies.

Les résultats obtenus au cours de nos travaux sont encourageants et méritent d‟être

approfondis par :

- La maîtrise du comportement physiologique de la levure en condition de forte teneur en éthanol

par la quantification de l‟efficacité métabolique fermentaire;

- L‟investigation et l‟identification des phénomènes entraînant les inhibitions, toxicités et létalité

des souches;

- L‟identification des cibles moléculaires impliquées dans l‟adaptation de la levure à de fortes

teneurs en éthanol (>15%) ;

- La réalisation d‟une identification complète des souches de levures performantes obtenues

reposant sur des caractérisations génétiques et biomoléculaires;

- L‟adaptation des souches à supporter des dégrés alcooliques élevés par des transferts de gènes

de résistance à l‟alcool.

126

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

127

REFERENCES

AOAC (1990). Association of Official Analytical Chemists 930 (04). Official method of

analysis, 15th ed. Arlington, VA. pp. 40-69.

Accolas, P. (1984). Techniques d‟analyse et de contrôle dans les industries agro-alimentaires.

pp.132-144.

Agores (2001). Biofuels Market Barriers.

http://www.europa.eu.int/en/comm/dg17/atlas/html/biodbarr/html.

Aguilar-Uscanga, M. G., Della, M., Strehaiano, P. (2000). Nutritional requirements of

Brettanomyces bruxellensis: Growth and physiology in batch and chemostat cultures.

Can. J. Microbiol. 46 : 1046-1050.

Aguilera, F., Benitez, T. (1985). Role of mitochondria in ethanol tolerance of Saccharomyces

cerevisiae. Arch. Microbiol. 142 : 389-392.

Ajila, C. M., Bhat, S. G., Prasada-Rao, U. J. S. (2007). Valuable components of raw and ripe

peels from two Indian mango varieties. Food Chem. 102 : 1006-1011.

Akin-Osanaiye, B. C., Nzelibe, H. C., Agbaji, A. S. (2008). Ethanol production from Carica

papaya (pawpaw) fruit waste. Asi. J. Biochem. 3 :188-193.

Akubor, P. I. (1996). The suitability of african bush mango juice for wine production. Plant food

Hum. Nutri. 49 : 213-219.

Alazard-Toux, N., Ballerini, D., Dohy, M., Montagne, X., Sigaud, J. B. (2006). La place des

biocarburants dans le contexte énergétique mondial, IFP Publications - Editions Technip -

Paris, Les Biocarburants : Etat des lieux, perspectives et enjeux du développement. ISBN:

2-7108-0869-2. pp. 1-77.

Aldiguier, A. S., Alfenore, S., Cameleyre, X., Goma, G., Uribelarrea, J. L., Guillouet, S. E.,

Molina-Jouve, C. (2004). Synergistic temperature and ethanol effect on Saccharomyces

cerevisiae dynamic behaviour in ethanol bio-fuel production. Bioproc. Byosyst. engineer.

26 : 217-222.

Alexandre, H., Costello, P. J., Remize, F., Guzzo, J., Guillouxbenatier, M. (2004).

Saccharomyces cerevisiae-Oenoccoucus oeni interactions in wine: current knowledge

and perspectives. Internat. J. F. Microbiol. 93 : 141-154.

128

Alfenore, S., Molina-Jouve, C., Guillouet, S. E., Uribelarrea, J. L., Goma, G., Bendadis, L.

(2002). Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a

vitamin feeding strategy during fed-batch process. Ap. Microbiol. Biotechnol. 60 : 67-72.

Askar, A., El-Tamani, A., Raouf, M. (1972). Constituents of mango fruit and their

behaviour during growth and ripening. Germany. Mitteihungen : Rebe ,Wein , obstban

and fruchterver werting. 22 (2) : 120-125.

Bai, F.W., Aderson, W. A., Moo-Young, M. ( 2008). Ethanol fermentation technologies from

sugar and starch feedstocks. Biotechnol. Adv. 26 : 89-105.

Ballerini, D. (2006). Les biocarburants. Paris : Editions Technip.135p. Bardford, J. P. (1990). A general model for aerobic yeast growth. Batch growth. Biotechnol.

Bioenerg. 35 : 907-920.

Beech, F. W., Thomas, S. (1985). Action antimicrobienne de l‟anydride sulfureux. Bulletin de

l‟O.I.V. 564-581,652-653.

Beer, T., T. Grant, G. Morgan, J. Lapszewicz and Anyon, P. (2006). Comparison of transport

fuels. Final Report (EV45A/2/F3C) to the Australian Greenhouse Office on the Stage 2

study of Life-cycle Emissions Analysis of Alternative Fuels for Heavy Vehicles.

http://www.environment.gov.au/settlements/transport/comparison/index.html.

Ben-Chaabane, M. F. (2006). Intensification de la production d‟ethanol biocarburant dans un

bioréacteur bi-étage avec recyclage cellulaire : modélisation et stratégie de conduite. Thèse

INSA Toulouse. 291p.

Bengaly, M. D. (2001). Etude microbiologique et valeur nutritionnelle d‟un condiment

traditionnel riche en protéines, obtenu par fermentation naturelle des graines d’Hibiscus

sabdarifa. Thèse. Université de Ouagadougou (Burkina Faso). 116p.

Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (1984). 1: 9th edition.510p.

Blackwell, K. J., Singleton, I., Tobin, J. M. (1995). Metal cation uptake by yeast. A review.

Ap. Microbiol. Biotechnol. 43 (4) : 579-584.

129

Boudjelal, A., N. Nancib (2001). Production d‟Acide Lactique par Lactobacillus Rhamnosus sur

Milieu à Base de Jus de Dattes. Production et Valorisation. Biomasse. Rev. Energ. Ren.

41-46.

Bouix, M., Leveau, J. Y. (1993). Les levures. Microbiologie industrielle : les microorganismes

d‟intérêt industriel. Tec. doc. Lavoisier. pp.1-10.

Brock, T. D. (1970). Biology of microorganisms. By Prentice-Hall, Inc. Englewood Cliffs,

New Jersey.

Buchaman, R. E., Gibbons, N. E. (1975). Bergey‟s manual Determinative Bacteriology.

8th ed. The William and Wilkins company, Baltimore. pp. 529-576.

Buchholz, S. E., Dooley, M. M., Eveleigh, D. E. (1987). Trends biotechnol. 5 : 199-204.

Bruinenberg, P. M., Jonker, R., Dijken, P. J., Sheffers, W. A. (1985). Utilisation of formate as

an additional energy source by glucose-limited chemostat cultures of Candida utilis CBS

621 and Saccharomyces cerevisiae CDS 8066. Evidence for the absence of

transhydrogenase activity in yeasts. Arch. Microbiol. 142 : 302-306.

Cardona, C. A., Sanchez, O. J. (2007). Fuel ethanol production: Process design trends and

integration opportunities. Bioresour. Technol. 98 : 2415-2457.

Casey, G. P., Ingledew, W. M. (1986). Ethanol tolerance in yeast. Crit. Rev. Microbiol.

13 : 219-280.

Castro-Martinez, C. (2007). Brettanomyces bruxellensis : Etude Métabolique, Cinétique et

Modélisation. Influence des facteurs environnementaux. Institut National Polytechnique

de Toulouse. Thèse. 207p.

Chatanta, D. K., Attri, C., Gopal, K., Devi, M., Gupta, G., Bhalla, T. C. (2008). Bioethanol

production from apple pomace left after juice extraction. Inter. J. Microbiol. 5 : 60-80.

Charpentier, C. (1993). Les arrêts de fermentation: rôle de l'éthanol, résistance de la levure.

R.F. d'OEnologie. 140 : 49-52.

Combet-Blanc, Y. (1995). Caractérisation physiologique d‟une nouvelle bactérie lactique de

Provence, Aix-Marseille. Thėse de doctorat. 150p.

130

Colin, M. N., Dalnic, R. (1981). Comparaison de mangues en provenance de Cote d‟Ivoire,

in : J. agrumes/mangues. Irfa. Inra. Montpellier. France. 50p.

Concawe, E. (2007). Joint Research Centre (JRC) Ispra. Well-to-Wheels Analysis of Future

Automotive Fuels and Powertrains in the European Context. Well-to-Wheels Report.

Version 2c. http://ies.jrc.cec.eu.int/WTW.

Converti, A., Bargagliotti, C., Cavanna, C., Nicolella, C., Del Borghi, M. (1996). Evaluation

of kinetic parameters and thermodynamic quantities of starch hydrolyse fermentation by

Saccharomyces cerevisiae. Bioproc. Engineer. 15 : 63-69.

Dabire, A. R. (2001). Rapport d‟activité campagne agricole 2000-2001, INERA, Programme

CMFPT, Burkina Faso. 70p.

DE LAROUSSILHE, F. (1980). Le Manguier. Techniques agricoles et productions tropicales.

Ed Maisonneuve et Larose. Paris. 312 p.

Du-Toit, W. J., Pretorius, I. S. G., Loavaud-Funel, A. (2005). The effect of sulphur dioxide

and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurians and a

strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. J. Ap. Microbiol. 98 : 862-871.

Dodd, J. C., Prusky, D., Jeffris, P. (1998). Fruits diseases.In: Litz RE, editor. The Mango-

Botany, Production and Uses. Wallingford Oxon / CAB International. pp. 257-280.

Dorange, J. L., Dupuy, P. (1972). Mise en évidence d‟une action mutagène du sulfite de sodium

sur la levure. C. R. Académie de Science. Paris, série D. 274 : 2798-2800.

Edgardo, A., Carolina, P., Manuel, R., Juanita, F., Jaime, B. (2008). Selection of

thermotolerant yeast strains Saccharomyces cerevisiae for bioethanol production. Enzy.

Microb. Technol. 43 : 120–123.

Farrell, A. E., Plevin, R. J., Turner, B. T., Jones, A. D., O’Hare, M., Kammen, D. M.

(2006). Ethanol can contribute to energy and environmental goals. Science 311: 506-508.

Fargione, J., Hill, J., Tilman, D., Polasky, S., Hawthorne, P. (2008). Land clearing and the

biofuel carbon debt. Science 319 : 1235-1238.

F.A.O. (1999). Cahier de production et protection intégrée appliquée à la culture du manguier

en Afrique soudano-sahélienne. Projet G.C.P./RAF/244/BEL. 70p.

131

FAO (2008). La situation mondiale de l‟alimentation et de l‟agriculture. Rome. 85p. Fiechter, A., Furhmann, G. F., Kapelli, O. (1981). Regulation of glucose metabolism in

growing yeast cells. Adv. Microbiol. Physiol. 22 : 123-183.

Fleet, G. H., Heard, G. M. (1993). Yeast: growth during fermentation. Harwood Academic

Publishers, ChurSwitzerland. In: Fleet GM. Ed. Wine Microbiology and Biotechnology.

pp. 27-54.

Fogue, K. (1998). Technologie de séchage des fruits et légumes. Service d‟appui aux PME

(SAPE); CEAS Ouagadougou. Burkina Faso. pp. 51.

Fox, J.D., Robyt, J.F. (1991). Miniaturization of three carbohydrates analysis using a

microsample plate reader. Anal. Bioch. 195 : 93-96.

Gancedo, C., Serrano, R. (1989). Energy-yielding metabolism. The yeasts metabolism and

physiology. 2nd ed. Rose A. H. and Harrison J. S. Academic Press Limited. London.

3 : 205-251.

Gaunt, D. M., Degn, H., Lloyd, D. (1988). The influence of oxygen and organic hydrogen

acceptors on glycolytic carbon dioxide production in Brettanomyces anomalus. Yeast.

4 : 249-255.

Geros, H., Cassio, F., Leao, C. (1997). Glucose transport mechanism in the yeast Dekkera

anomala. 18th ISSY. Yeast Nutri. Natur. Habit. 24-29. Bled, Slovenia.

Geros, H., Azevedo, M. M., Cassio, F. (2000). Biochemical studies on the production of acetic

acid by the yeast Dekkera anomala. Food Technol. Biotechnol. 38 : 59-62.

Gopalan, C., Ramasastri, B. V., Balasubramanian, S. C. (1999). Nutritive value of Indian

foods. India: National Institute of Nutrition, ICMR. Internat. Food Microbiol. 80: 47-53.

Gordon, R.E., Haynes, W.C., Pang, C. H. N. (1973). The genus Bacillus. Handbook No. 427.

U. S. Department of Agriculture, Washington, D. C.

Gosse, G. (2008) Impacts environnementaux des biocarburants. Ecole d‟été de Sauvons le

climat, Cabourg. www.sauvonsleclimat.org/new/spip/IMG/pdf/gosse.

Guillou, V. (1996). Etude du comportement dynamique de Saccharomyces cerevisiae en culture

continue dans la région oxydative des taux de croissance. Thèse INSA Toulouse. 160p.

Guiraud, J. P., Crelzy, P., Gli, T. (1984). Analyse microbiologique dans l‟industrie agro-

alimentaire. Collection Génie alimentaire. pp. 53-61.

132

Guiraud, J. P. (1998). Microbiolgie alimentaire. Dunod, Paris. pp.79-168.

Guira, M. (2003). Rapport d‟activité campagne agricole 2002-2003, INERA, Programme

CMFPT, Burkina Faso. 55p.

Gunasekaran, P., Chandra K. R. (2007). Ethanol fermentation Technology: Z. mobilis.

Madurai Kamary University, Madurai, Indi. 1-22.

Gunisson, A. F. (1981). Sulphite toxicity: a critical review of in vitro and in vivo data. F.

Cosmetol. Toxicol. 19: 667-682.

Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswami, V. K., Chauhan, B. (2003). Microbial

amylases: a biotechnological perspective. Process Biochem. 38 : 1599-1611.

Hayashida, S., Ohta, K. (1981). Formation of high concentration of alcohol by various yeasts.

J. Inst. Brew. 87 : 42-44.

Hill, J., Nelson, E., Tilman, D., Polasky, S., Tiffany, D. (2006). Environmental, economic, and

energetic costs and benefits of biodiesel and ethanol biofuels. Proc. Nat. Acad. Sci. USA;

103 : 11206-112110.

Hossain, M., Haque, M., Rahim, M. A., Rahman, M. A. (2001). Physio-morphological and

compositional variation in ripe fruit of three mango varieties. J. Biol. Sci. 1 (11) : 1101-

1102.

Humphrey, C.N., Okafoagu U. C. (2007). Optimization of ethanol production from garcinia

kola (bitter kola) pulp Agro Waste. Afr. J. Biotechnol. 6 (17) : 2033-2037.

Ibeto, C.N., Okpara, C. G. (2010). Nigeria‟s potentials of renewable energy sources for water

desalination with emphasis on biomass. J. Sci. Technol. Res. 9 : 66-73.

Ingram, L. O., Buttke, T. M. (1984). Effects of alcohols on microorganisms. Adv. Microbiol.

Physiol. 25 : 253-300.

Jarvis, C. E., Walker, J. R. L. (1993). Simultaneous, rapid, spectrophotometric

determination of total starch, amylose and amylopectin. J. Sci. Food Agric. 63 : 53-57.

Jay, J. (1996). Modern Food Microbiology, 5th ed. London: Chapman and Hall. 661p.

133

Jideani, I. A. O., Okere, C. R. (1991). Comparative study of microorganisms and sensory

attributes of condiments from the fermentation of different seeds. Plt. Food Human. Nutrit.,

41 : 27-34.

Johnson, G. I., Mead, A. J., Cooke, A. W., Dean, J. R. (1991). Mango stem end pathogens

infection levels between flowering and harvest. Ann. Appl. Biol. 119 : 465-473.

Jones, R. P., Pamment, N., Greenfield, P. F. (1981). Alcohol fermentation by yeasts. the

effect on environmental and other variables. Process Biochem. 16 : 42-49.

JUDICOME (2004). Etude pour l‟élaboration d‟un plan de développement de la filière fruit et

légumes. Rapport intermédiaire pour l‟atelier national. Ministère de l‟Agriculture de

l‟Hydraulique et des Rressources Halieutiques (MAHRH) Ouagadougou. 125p.

Kalmar, Z., Lonvaud, A. (2001). Recherche sur la tolérance à l‟éthanol des bactéries lactiques

d‟altération des vins. Relation avec la constitution lipidique membranaire. Thèse. Université

de Bordeaux 2, Bordeaux, France. 115p.

Kapelli, O. (1986). Regulation of carbon metabolism in Saccharomyces cerevisiae and related

yeast. Adv. Microbiol. Physiol. 28 : 181-209.

Kim, S., Dale, B. E. (2004). Glocal potential bioethanol production from wasted crops and crop

residues. Biom. Bioener. 26 : 361-375.

Konlani, S., Degenes, J. P., Moletta R., Traoré A. S., Doh A. J. (1996). Isolation and

characterization of yeasts involved in sorghum beer production. Food. Biotech.10 (1): 29-

40.

Konlani, S., Degenes, J. P., Moletta R., Traoré A. S., Doh A. J. (1998). Optimization of cell

yield of Candida krusei S01 and Saccharomyces sp. LK3G cultured in sorghum hydrolsate.

Bioress.Technol. 57 : 275-281.

Kreger Van Rij, N. J. S. (1984). The yeast: a taxonomic study, 3rd ed. Elsevier, Amsterdam.

Kruckeberg, A. L. (1997). The hexose transporter of the family of Saccharomyces cerevisiaie.

Arch. Microbiol. 163: 283-292.

Kumar J. (1983). Studies on symptomatology, etiology and control of mango malformation.

Ph.D. thesis, G.B. Pant University of Agriculture and Technology, Pantnagar. 118p.

134

Lagzouli, M., Charouf, R., Yachioui, E. M., Ouhssine, M., Berny, E. H., Djadal, M. (2007).

Optimization of the growth and the glucoamylase extracellular production by Candida

guilliermondii. Bull. Soc. Pharm. Bordeaux. 146 : 251-270.

Larpent, G., Larpent, M. (1990). Mémento, Technique de microbiologie. 2è ed. Technique et

documentation. Lavoisier. 417 p.

Larpent, G. M., Sanglier, J. J. (1991). Biotechnologies, Principes et méthodes, Doin. Ed.

Collection Biosciences et Techniques, Paris. 668p.

Latifa, J., Khalil, E., Jamal, E.Y., Mohamed, E. (2007). Production of ethanol from starch by

free and immobilized Candida tropicalis in the presence of α-amylases. Science Direct.

Bior. Tech. 98 : 2765-2770.

Leao, C. and Van Uden, N. (1982). Effects of ethanil and other alkanols on the glucose

transport system of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Bioengineer. 24 : 2601-2604.

Leclerc, H., Izard, D., Husson, M., Wattre, P., Jakubczake, P. (1995). Microbiologie

générale. Ed. Doin.Paris. 363p.

Lee, C. G., Kim, C. H. Rhee, S. K. (1992). A kinectic model and simulation of starch

saccharification and simultaneous ethanol fermentation by amyloglucosidase and

Zymomonas mobilis. Bioprocess Eng. 7 : 335-344.

Lekneth, V., Christaopouls, P., Marris, B. (1994). Bioethanol technology review. J.

Biotechnol. 16: 983-988.

Lei, F., Rotboll, M., Jorgensen, S.B. (2001). A biochemically structured model for

Saccharomyces cerevisiae. J. Biotechnol. 88 : 205-221.

Licht, F.O. (2005). World ethanol and biofuels report. pp. 3-15.

Liu, S., Lin, C., Xie, L., Cao, Z. (2003). Intrecellular pH and Metabolic Activity of long-

chain dicarboxylic acid-producing yeast Candida tropicalis. J. Biosci. Bioengineer.

96 (4): 349-353.

Lodder, J. (1971). The yeast taxonomic study. 2nd ed. Amterdam, London, Holland. 275p.

135

Macris, B. J., Markakis, P. (1974). Transport and toxicity of sulfur dioxide in Saccharomyces

cerevisiae var ellipsoideus. J. Sci. F. Agricult. 25 : 21-29.

Mager, W. H. and Varela, J. C. S. (1993). Osmostress response of the yeast Saccharomyces.

Molecul. Microbiol. 10 : 253-258.

Maiorella, B., Blanch, H., Wilke, C. R. (1983). By-product inhibition effects on ethanolic

fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Bioingeneer. 25 : 103-121.

Makkar, R. S. and Cameotra, S. S. (2002). An update on the use of unconventional substrates

for biosurfactant production and their new applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:

428-434.

Mann, P., Siewert S., Totter, J. (2002). Fermenting potato peels and chips into ethanol.

Biocycle. Millet husk. Afric. J. Microbiol. Resear. 3 (4) : 147-152.

Manry, L. (2005). Analyse automatique d‟images de populations microbiennes. Thèse, N°

808, Toulouse. 152p.

Montesinos, T., Navarro, J-M. (2000). Role of maltose in the simultaneous-saccharification-

fermentation process from raw wheat starch and Saccharomyces cerevisiae. Bioprocess

Eng. 23 : 319-322.

Martinez, E. A., Silva, S. S., Almeida, E., Silva, J. B., Solenzal, A. I. N., Felipe, M. G. A.

(2003). The influence of pH and dilution rate on continuous production of xylitol

from sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate by C. guillermondi. Process Biochem.

38 : 1677-1683.

Milar, D. G., Griffiths-Smith, K., Algar, E., Scopes, R. K. (1982). Activity and stability of

glycolytic enzymes in the presence of ethanol. Biotechnol. Lett. 4 : 601-606.

Miller, G. L. (1958). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.

Anal. Bioch. 195 : 93-96.

Moulin, G., Boze, H., Galzy, P. (1984). Inhibition of alcoholic fermentation. Biotechnol. Gen.

Eng. 2 : 365-382.

Mustafa, B., Havva, B., Cahide, O. (2008). Progress in bioethanol processing. Progress Energy

Combustion Sci. 34 : 551-573.

136

Nagodawithana, T. W., Steinkraus, H. K. (1976). Influence of the rate of ethanol production

and accumulation on the viability of S. cerevisiae in rapid fermentation. Ap.

Environment. Microbiol. 31 : 158-162.

Nagodawithana, T. W., Whitt, J. T., Cutaia, A. J. (1977). Study of the feedback effect of

ethanol on selected enzymes of the glycolytic pathway. J. Americ. Soci. Brew. Chem. 35 :

179- 173.

Naim, K., Andrzej W., Gregory, P. C., Robert, J. M., Jiri E. P. (1983). Biomass,

Microorganisms for Special Applications, Microbial Products , Energy from Fenewable

Resources. Biotechnol. Chap 3a. 3 : 257-386.

Nakamura, Y., Sawada, T., Komatsu, A. (2002). Ethanol production from raw starch by

recombinant yeast having saccharification and fermentation activities. J. Chem. Technol.

Biotechnol. 77 : 1101-1106.

Nana, C. P., Brouwer, I. D., Zagré, N. M., Kok, F. J., Traoré, A. S. (2006). Impact of

promotion of mango and liver as sources of vitamin A for young children : a pilot study in

Burkina Faso. Pub. Health Nutri. 9 (6) : 808-813.

Neves, M. A., Kimura, T., Shimizu, N., Shiiba, K. (2005). Production of alcohol by

simultaneous saccharification and fermentation of low-grade wheat flour. J. Zaffius

Biotechnol. 1 (2) : 1-10.

Nedwell, D. B. (1999). Effect of low temperature on microbial growth: lowered affinity for

substrates limits growth at low temperature. FEMS Microbiol. Ecol. 30 (2) : 101-111.

Nigam, J. N. (2001). Ethanol production from wheat straw hemicelluloses hydrolysate by

Pichia stipitis. Biotechnol. 87: 17-27.

Nout, M. J. R., Rombouts, F. M., Havelarr, A. (1989). Effect of accelerated natural lactic

fermentation of infant food ingredients on some pathogenic microorganisms. Int. J. Food

Microbiol. 8: 351-361.

Novak, M., Strehaiano, P., Moreno, M., Goma, G. (1981). Alcoholic fermentation: on the

inhibitory effect of ethanol. Biotechnol. Bioengineer. 23 : 201-211.

137

Obire, O. (2005). Activity of Zymomonas mobilis species in palm sap obtained from three areas

in Edo State. Department of Applied and environmental biology. Rivers State University of

Science and technology, Nkpoh-oroworukwo.P.M.B. J. Appl. Sci. Environ. Mgt. 9 (1) : 25-30

Obisanya, M. O., Aina, J. O., Oguntimen, G. B. (1987). Production of wine from mango

(Magnifera indica L.) using Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces species

isolated from palm Wine . J. App. Bact. 63 : 191-196.

Olsen, H. S. and Andersen, E. (2001). Utilization of enzymes in agricultural product processing.

Novozymes A/S. Catalogue A-6901.35p.

Oestling, A. (2001). Carburant additionné de bioethanol Stoa. Evaluation des choix scientifiques

et technologiques. Note d‟information n° 07/2001. http://www.europa.eu.int/stoa/publi/pdf.

O’Toole, D. K. (1999). Characteristics and use of Okara, the soybean residue from milk

production: A review. J. Agric. Food Chem. 47 : 363-371.

Ouédraogo, S. N. (2002). Etude diagnostique des problèmes phytosanitaires du manguier

(Mangifera indica L.), de l‟oranger (Citrus sinensis (L.) Osbeck) et du mandarinier (Citrus

reticulata Blanco) dans la province du Kénédougou. Mémoire d‟ingénieur du

développement rural option agronomie. Université polytechnique de Bobo-

Dioulasso/Institut du développement rural. 94 p.

Ough, C. S., Crowell, E. A. (1987). Use of sulfur dioxide in winemaking. J. F. Sci. 52 (2) : 386-

393.

Oyeleke, S. B., Jibrin, N. M. (2009). Production of bioethanol from guinea cornhusk and millet

husk. Afric. J. Microbiol. Researc. 3 (4) : 147-152.

Palmarola-Adrados, B., Choteborska, P., Galbe M., Zacchi, G. (2005). Ethanol

production from non-starch carbohydrates of wheat bran. Biores. Technol. 96 : 843-850.

Pampulha, E., Loureiro-Diaz, M. C. (1989). Combined effect of acetic acid, pH and ethanol

on intracellular pH of fermenting yeast. Ap. Microbiol. Biotechnol. 31 : 547-550.

Pampulha, E., Loureiro-Diaz, M. C. (1990). Activity of glycolytic enzymes of Saccharomyces

cerevisiae in the presence of acetic acid. Ap. Microbiol. Biotechnol. 34 : 375-380.

138

Pasty, J.C. (2004). Les débouchés non alimentaires des produits agricoles : un enjeu pour la

France et l‟Union Europeenne. Avis et rapports du Conseil Economique et Social. N°

2004. 1-201.

Perréon-Delamette (2004). De l‟or noir à l‟or vert, l‟avenir industriel des bioproduits. Dossier

de presse de l‟ADEME. http://www.chanvre-infoch./info/en/article2479html.

Peterson, R. A. (1986). Mango diseases. Proceedings of the CSIRO First Australian Mango

Research Workshop. pp. 233–247.

Phowchinda, O., Delia-Dupuy, M. L., Strehaiano, P. (1995). Effects of acetic acid on growth

and fermentative activity of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Lett. 17 : 237-242.

Ploetz, R. C. (1994). Distribution and prevalence of Fusarium subglutinans in mango tree

affected by malformation. Can. J. Bot. 72:7-9.

Poilpré, E. (2002). Mecanisme d‟adaptation rapide de Saccharomyces cerevisiae en

metabolisme oxydatif : implication des sucres de réserve et de la capacité respiratoire.

Thèse INSA Toulouse. 132p.

Prescott, M., Harley, J. P., Klein, D. (1995). Microbiologie, De Boeck Université (ed),

Bruxelles. p. 1014.

Prusky, D., Fuchs, Y., Yanko, U. (1983). Assessment of latent infections as a basis for control

of post harvest disease of mango. Plant Dis. 67 : 816–818.

Romano, P., Suzzi, G. (1992). Sulfur dioxide and wime microorganismes. In: Wine Technology

and Biotechnology. G. H. Fleet. Ed. Harwood, Academic Publishers, Chur. Suisse. pp.

373-393.

Ramos, M. T., Medeira-Lopes, A. (1990). Effects of acetic acid on the temperature profile of

ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Lett. 12 : 229-234.

Rey, J. Y., Diallo, T. M., Vanniere, H., Didier, C. (2004). The mango in french-speaching West

Africa: varieties and varietal composition of the orchards. Fruits. 59 (3) : 191-206.

Ribereau-Gayon, P., Dubourdieu, D., Doneche, B., Lonvaud, A. (1998). Traité d‟oenologie -

tome 1 - Microbiologie du vin, vinification, Dunod (ed), Paris. 617p.

Rikhvanov, E., Varakina, N., Rusaleva, T., Rachenko, E., Kiseleva, V., Voinikov, V. (2001).

Heat shock-induced changes in the respiration of the yeast Saccharomyces cerevisiae.

Microbiol. 70 : 462-465.

139

Rowan, F. S., Heather, A. C., Danielle, A. W., Runion, G. B., Stephen, A. P., H. Allen, T.,

Richard, S., Lewis, Z. (2009). Kudzu [Puerariamontana (Lour.)Merr.Variety lobata]: A

new source of carbohydrate for bioethanol production. Biom. Bioenerg. 33 : 57-61.

Sablayrolles, J. M. (1992). Importance de l‟azote assimilable et de l‟oxygène sur le déroulement

de la fermentation alcoolique. Biolog. Og. VI (1-2). 155-160.

Sanaa, M. (2002). Microbiologie prévisionnelle : principaux modèles de croissance utilisés en

appréciation quantitative des risques. Epidémiol. Sant. anim. 41 : 169-177.

Scheffers, W. A. (1992). Contaminants in Baker‟s yeast, proceeding of the COMMET course

on Microbial Contaminants. Helsinki 1991 and 1992. Ed. By M. Korhola and V.

Bacstrom. Research. 7 : 19-36.

Schulze, U. (1995). Anaerobic physiology of Saccharomyces cerevisiae. Thesis. Department of

Biotechnology. Technical University Denmark. 140p.

Sévastianos, R. (1977). Taxonomie et écologie des bactéries sphériques hétérotrophes isolées du

milieu marin. Thèse. Université de Provence. 132p.

SICAREX (2000). Analyse institutionnelle de la filière mangue dans les départements de

Orodara et Koloko : Rapport provisoire, Bobo-Dioulasso, Burkina Faso, Organisation

Neerlandaise des Volontaires (S.N.V.). 52p.

Sree, N. K., Sridhar, M., Suresh, K., Banat, I. M., Rao, L. V. (2000). High alcohol production

by repeated batch fermentation using an immobilized osmotolerant S. cerevisiae. J. Ind.

Microbiol. 24 : 22-226.

Strehaiano, P. (1984). Phénomènes d'inhibition et fermentation alcoolique. Thèse de doctorat

de l‟institut National Polytechnique de Toulouse, France. 148p.

Suresh, K., Kiransree, N., Rao, L. V. (1999). Production of ethanol by raw starch

hydrolysis and fermentation of damaged grains of wheat and sorghum. Bioprocess Eng.

21 : 165-168.

Teusink, B., Diderich, J. A., Westerhoff, H. V., Van Dam, K., Walch, M. C. (1999).

Intracellular glucose concentration in derepressed yeast cells comsuming glucose is high

enough to reduce the glucose transport rate by 50%. J. Bacteriol. 180 (3): 556-562.

140

Torija, M. J., Rozes, N., Poblet, M., Guillamon, J. M., MAS, A. (2002). Effects of

fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae. Internat.

Food Microbiol. 80 : 47-53.

Traoré, A. S., Konlani, S. (1989). Etude physiologique d‟une levure utilisée dans l‟alimentattion

humaine au Burkina Faso comme source de proteines. Abn-Symp. Biol/Food Prod. Afr.

741-747.

Vayssieres, J-F., Sanogo, F., Noussourou, M. (2004). Inventaire des espèces de mouches de

fruits (Diptera teppritidae) inféodées au manguier au Mali et essai de lutte raisonnée.

Fruits. 59 : 1-14.

Wibowo, D., Eschenbruch, R., Davis, C. R., Fleet, G. H., Lee, T. H. (1985). Occurrence and

growth of lactic acid bacteria in wine: a review. Americ. J. Enol. Viticult. 36: 302-313.

Yamaji, K., Matsumura, Y., Ishitani, H., Yamada, K., Wyman, C. E., Tolan, J. S. (2006).

Production of low-cost bioethanol to be a rival to fossil fuel.

http:www.nedo.go.jp/itd/teian/ann-mtg/fy18/project/h-03y_e.pdf.

Yang, H. Y. (1973). Deacidification of grape musts with Schizosaccharomyces pombe.

Americ. J. Enolog. Viticult. 24: 132-140.

Yeboua, A. F. (1989). Production d'éthanol par S. cerevisiae Y847NNRL, à partir d'hydrolysat

d'amidon de manioc. Abn-Sym. Biol. Food. Afri. 789-793.

Liens électroniques

1.http://www.actuenvironnement.com/ae/dictionnaire_environnement/definition/biomasse.php4.

(05/01/2011).

2. http://www.biomassenergycentre.org.uk/portal/page?_pageid=76,15049&_dad=portal&.

(05/01/2011).

3. http://www.biologie.univ-mrs.fr/upload/P251/Photosynthesis.pdf (05/01/2011).

141

ANNEXES

142

ANNEXES

Annexe 1 : Milieu de gélose de conservation

Agar-agar (Difco) 20 g

Glucose (Difco) 20 g

Extrait de levure (Difco) 10 g

NaCl (Prolabo) 10 g

Glycérol 10%

Eau distillée qsp 1000 ml

pH 7 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

Annexe 2 : Milieu de Sabouraud solide

Peptone (Difco) 10 g

Glucose (Difco) 20 g

Agar (Difco) 10 g

Eau distillée qsp 1000 ml

pH 6 ± 0,2

A ce milieu on ajoute après autoclavage et refroidissement dans des conditions stériles ; la

gentamicine ou le chloramphénicol à raison de 0,40 g/l pour la gentamicine et de 0,5 g/l

chloramphénicol. Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

143

Annexe 3 : Milieu YEPD

Yeast extract (Extrait de levure) 10 g

Peptone (Difco) 10 g

Dextrose (Difco) 20 g

Agar (Difco) 10 g

Eau distillée qsp 1000 ml

pH 6 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

Annexe 4 : Milieu gelose farine de Maїs

Infusion de farine de Maїs 10 g

Agar (Difco) 5 g

Eau distillée qsp 1000 ml

pH 6 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

Annexe 5 : Milieu alcoolique pour l’étude de la tolérance à l’alcool

Extrait de levure 5 g

Glucose 20 g

Ethanol X ml

Eau distillée qsp Y ml

pH 6 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

144

Annexe 6 : Milieu de Clark et Lubs

Peptone (Difco) 6 g

Glucose (Difco) 20 g

K2HPO4 5 g

Eau distillée qsp 1000 ml

pH 7 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

Annexe 7 : Milieu pour la détermination du caractère amylolytique des souches

Extrait de levure 5 g

Agar 20 g

Amidon 10 g

Eau distillée qsp 1000 ml

pH 7 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

Annexe 8 : Milieu pour le test de sporulation

Extrait de levure 3 g

Peptone 5 g

Glucose 20 g

Eau distillée qsp 1000 ml

pH 7 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

145

Annexe 9 : Milieu de base pour l’étude de la fermentescibilité des sucres

Extrait de levure 5 g

K2HPO4 1 g

MgCl2 (6H2O) 0,4 g

NH4Cl 1 g

FeSO4 (7H2O) 5 mg

Solution d‟oligoéléments 1 ml

Tween 80 1 ml

Sucre 3 g

Eau distillée qsp 1000 ml

pH 7 ± 0,2

Le milieu est stérilisé à 121° C pendant 45 minutes.

Annexe 10 : Milieu synthétique pour la fermentation des sucres (KONLANI, 1996)

Extrait de levure 3 g

Peptone 1 g

(NH4)2SO4 0,4 g

MgSO4 1 g

K2HPO4 5 mg

Solution d‟oligoéléments 1 ml

Eau distillée qsp 1000 ml

pH 7 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

146

Annexe 11 : Courbe étalon montrant corrélation entre le poids-sec et la densité optique à

600 nm pour Saccharomyces sp isolée du ferment de dolo (bière locale).

147

Annexe 12 : Courbe étalon des sucres totaux

148

Annexe 13 : Courbe étalon des sucres réducteurs

149

Annexe 14 : Courbe étalon de l’amidon total