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Cours de formation OMS sur la gestion des MTN au niveau district

Guide de l’apprenant

Module 9 : Diagnostic des MTN à chimiothérapie préventive

Session 9.3: Outils de Diagnostic et de Laboratoire pour Filaires, Helminthiases

Transmises par le Sol et Schistosomiase

Message clé adressé aux communautés

La sensibilisation et la mobilisation communautaires constituent la clé pour obtenir la taille de

l'échantillon nécessaire pour avoir le taux de prévalence exacte de chaque filaire, parasite intestinal

et urinaire ayant une implication pour la mise en œuvre des DMM dans les districts. Donc, il est

important que les gens soient correctement informés sur le fait que leur participation pourrait aider à

décider si la distribution de masse de médicaments devrait être mise en œuvre ou non dans leurs

zones de résidence.

Message clé adressé au personnel MTN de District

Au cours de la réalisation d'une cartographie ou d'une enquête de suivi pour la FL, l'onchocercose,

la SCH et les HTS, les personnels de santé de district sont impliqués. Des locaux de laboratoire au

sein du district sont également utilisés. Il est donc important que le personnel de laboratoire du

district de santé soient bien formés et suivent les bonnes pratiques de laboratoire et les procédures

opératoires standardisées pour chaque méthode ou technique afin que des résultats précis soient

obtenus et utilisés pour orienter la prise de décision ou la politique à mener par l'autorité nationale

en matière de mise en œuvre des DMM.

Message clé pour cette session

L'élimination ou le contrôle de la FL, de l'onchocercose, des HTS et de la SCH en 2020 nécessite

l'implication et la mobilisation des communautés ciblées et de personnels MTN bien formés, y

compris les personnels MTN des laboratoires suivant les bonnes pratiques de laboratoire et des

procédures opératoires normalisées pour chaque méthode diagnostique ou technique. Ainsi, il est

important que le personnel du district et le personnel MTN des pays endémiques soient familiers

avec ce livre comportant la préparation et les conseils pour la mise en œuvre réussie d'une enquête

de suivi et évaluation ciblant, l'élimination de la FL et de l'onchocercose.

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Partie I: Introduction

But de la Session:

Le but de cette session est de fournir aux individus, une compréhension des techniques de

laboratoire et de diagnostic qui sont utilisées pour détecter et identifier les filaires, les parasites

intestinaux et urinaires. Cette session fournit plus de détails sur chaque test diagnostique, en se

fondant sur la session 1 du module 9.

Pour tous les tests diagnostiques décrits, plus de détails sur les méthodes peuvent être trouvés

dans les procédures opératoires standardisées se rapportant à chaque test dans les ressources

additionnelles.

Modules prérequis:

Bien que le matériel vu dans ce module soit autonome, une solide connaissance pratique des MTN

à CTP, leur épidémiologie et leurs mesures de prévention ainsi que les pratiques de suivi et

d'évaluation utilisées pour chaque maladie est nécessaire.

Les informations générales sur les MTN à CTP seront couvertes dans le module 1, Mise en œuvre

pratique et la description des activités de S & E recommandées par l'OMS, destinées à mesurer

l'impact de la DMM au sein des communautés, sera couvert dans le module 9.

Objectifs d'apprentissage:

Les objectifs de la Session 3 sont les suivants:

1. Tous les participants connaitront les outils de diagnostic utilisés sur le terrain pour la

détection, l'identification et la quantification des filaires liées à la filariose lymphatique et à

l'onchocercose, ainsi que les vers liés à la schistosomiase et aux helminthiases transmises

par le sol.

2. Tous les participants comprendront l'importance des SOP suivantes et du contrôle de qualité

pour la détection des filaires.

Abréviations et acronymes:

Les abréviations et acronymes suivants sont utilisés dans cette session:

• ICT - Carte de Test Immunochromatographique

• CFA - Antigène Filarien Circulant

• FEC - Concentration Formol-éther

• KK - Test de Kato Katz

• SCH - La Schistosomiase

• HTS - Helminthes transmises par le sol

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Partie II : Concepts clés

Concept 1: Test de Diagnostic Rapide de Terrain

Les tests de diagnostic rapide sont couramment utilisés dans les programmes de CTP, pendant les

activités de cartographie, d'enquêtes dans les sites sentinelles, d'enquêtes d'évaluation de la

transmission.

Sous-concept 1: Tests pour microfilaires

Les tests de Microfilaires sont utilisés pour détecter, identifier et quantifier toutes les espèces de

filaires aussi longtemps que le sang est collecté au bon moment pour tenir compte de la périodicité

démontrée par les espèces.

Concept 2: Outils utilisés pour détecter les parasites intestinaux

Les techniques de comptage des œufs fécaux sont largement utilisées pour la détection,

l'identification et la quantification des parasites intestinaux telles que les Helminthiases Transmises

par le Sol (Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoïdes, Ancylostoma duodenale et Necator

americanus), la schistosomiase (Schistosoma mansoni). Ces outils nécessitent le prélèvement

d'échantillons de matières fécales suivi de la préparation et finalement examinés par microscopie.

Diapositives PowerPoint:

Diapositive 4: Pour les tests décrits dans cette Session, les informations suivantes s’appliquent:

- QUI sera testé?

Les diagnostics des filarioses sont réalisés dans le cadre des enquêtes communautaires

- QUELS échantillons seront prélevés?

Les diagnostics décrits pour les filaires nécessitent soit des échantillons de sang soit de petits

échantillons de tissus

- POURQUOI ces tests diagnostiques sont effectués ?

Les résultats des tests diagnostiques permettront de calculer la prévalence de chaque maladie, soit

dans le cadre des enquêtes de base, soit dans le cadre des activités de S & E pour déterminer si

une CTP est nécessaire.

Diapositive 5: le Test de Diagnostic Rapide de la Filariose lymphatique (ICT)

Le test ICT ou Test par la Carte Immuno chromatographique est utilisée pour détecter l'antigène de

Wucheria bancrofti. Le test est un outil sensible qui est largement utilisé par les programmes de

lutte contre la FL au niveau mondial où W. bancrofti est l'agent causal. Pendant les activités de

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cartographie, les cartes ICT sont le principal outil recommandé par l'OMS pour déterminer la

prévalence de la maladie et la nécessité de conduire des DMM.

Le test est un test relativement simple et convivial qui nécessite un faible volume de sang (100 µl)

qui peut être recueilli à tout moment de la journée. Bien que simple, ce test nécessite une formation

adéquate afin de réduire la variabilité des observations et les erreurs de lecture des cartes qui

peuvent entraîner de faux positifs.

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Les résultats de la carte ICT sont prêts en 10 minutes; ces résultats doivent être lus à la 10ème

minute puisque tout retard peut entraîner une augmentation des faux positifs.

Quand les tests sont prêts pour la lecture, l'utilisateur devra examiner la bandelette réactive; Ici, une

forte ligne de contrôle devrait être visible près du 'C' pendant qu'une autre ligne apparaîtra à côté

du 'T' si le test est positif; s'il n'y a pas de ligne près du 'T', le test est négatif.

Voir ci-dessous pour de plus amples information SVP:

Diapositive 6 : une nouvelle bandelette test pour FL

Les nouvelles bandelettes test FL sont conçues pour remplacer l'utilisation de la carte ICT dans les

programmes de lutte contre la FL, ciblant W. bancrofti. Les nouveaux tests montrent une sensibilité

légèrement plus élevée que celles des ICT traditionnelles et une chaîne de froid n'est pas

nécessaire.

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Bien que le test soit relativement simple et ne nécessite qu'un faible volume de sang (75µl), pouvant

être recueilli à tout moment de la journée, il peut être plus difficile à utiliser en raison de la taille de

la bandelette elle-même. En plus de ceci, une formation adéquate est nécessaire pour réduire la

variabilité des observations et les erreurs de lecture des cartes qui peuvent entraîner de faux

positifs.

Les résultats de la bandelette réactive sont prêts après 10 minutes; ces résultats doivent être lus à

la 10ème minute, puisque tout retard peut entraîner une augmentation des faux positifs. Lorsque les

tests sont prêts à être lus, ici, une ligne épaisse de contrôle doit être vue près du 'C' pendant qu'une

autre ligne apparaît à côté du 'T' si le test est positif. S'il n'y a pas de ligne près du 'T', le test est

négatif. Voir image ci-dessous s'il vous plaît.

Traduction légende schéma ci-dessus

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Schéma 1 schéma 2 schéma 3

Positif* Positif* (faible) Négatif

seµle ligne témoin présente

Toute ligne rose visible au cours du test devra être considérée comme un résµltat positif

Schéma 4 Schéma 5

Non valide Non valide

Pas de ligne apparente ligne test seµle présente

* Classer les tests des bandelettes est utile mais optionnel. Négatif; 0=ligne test plus faible que

ligne témoin 1= ligne test égale ligne témoin 2= ligne test plus forte que ligne témoin

Diapositive 7: Brugia rapid test

Similaire à la carte ICT, le test Brugia RapidTM est utilisé pour détecter la présence d'infections à

Brugia malayi et à Brugia timori. Ces cartes sont utilisées dans les programmes de lutte contre la

FL quand les agents responsables sont soit B. malayi soit B. timori.

Quoique simples, ces tests sont légèrement plus techniques, comparés aux cartes ICT, puisqu'ils

requièrent un tampon spécial.

Les résultats du test sont prêts au bout de 15 minutes pour des échantillons de sérum/ plasma et de

25 minutes pour les échantillons de sang total. Quand les tests sont prêts à être lus, l'utilisateur

devra examiner les bandelettes; une ligne épaisse de contrôle devrait être visible près du 'A' alors

qu'une autre ligne va apparaître près du 'B' si le test est positif. S'il n'y a pas de ligne près du 'B', le

test est négatif

Traduction des légendes ci-dessus

Positif Négatif Invalide

C= Témoin

T= Test

A = Témoin

B = Test

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Diapositive 8: Tests diagnostiques pour microfilaires

Les tests pour microfilaires sont utilisés pour détecter, identifier et quantifier n'importe quelle espèce

de filaire aussi longtemps que le sang est prélevé au moment approprié pour tenir compte de la

périodicité démontrée par les espèces de la manière décrite ci-dessous:

Espèces Périodicité

Wucheria bancrofti Périodicité nocturne

Brugia malayi Périodicité nocturne

Brugia timori Périodicité nocturne

Mansonella spp. Apériodique

Loa loa* Périodicité diurne

*Note: La Loa loa est incluse ici, puisque les microfilaires peuvent être détectées sur un frottis

sanguin et doivent être notées si elles sont trouvées, à cause des implications que la Loa loa a dans

les programmes de lutte en Afrique centrale.

Diapositive 9: Tests diagnostiques pour microfilaires

Goutte épaisse

Le frottis sanguin nocturne est la méthode traditionnelle utilisée pour la détection, l'identification et la

quantification des microfilaires à partir du sang capillaire.

Pour réaliser une goutte épaisse, un petit volume de sang (60µl) doit être collecté et placé sur une

lame de microscopie en 3 bandes parallèles d'une quantité approximative de 20 µl chacune.

Une fois que ceci est fait, la lame a besoin d'être séchée avant qu'elle puisse être déglobinisée et la

coloration peut être réalisée; ceci peut prendre 12 - 24 heures, en fonction de l'humidité. Une fois

que la lame est sèche, les dernières préparations peuvent être faites.

Chambre de comptage de Sedgwick

Comme alternative à la goutte épaisse, la chambre de comptage est une technique rapide,

quantitative, pas chère et fiable qui permet à la collecte d'échantillons de microfilaires d'être

mesurée.

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La méthode de la chambre de comptage est une technique très simple qui nécessite la collecte de

100 µl de sang selon le mode de périodicité spécifique des espèces. Ce sang est ensuite ajouté à

un tube de collecte de 900µl d'acide acétique à 3% et on mélange doucement. Une fois que les

échantillons ont été prélevés, ils peuvent être visualisés en utilisant un microscope et une chambre

de comptage à tout moment et le nombre de microfilaires peut être compté.

Traduction légende schéma ci-dessus

Remplissage du chevron de la chambre de Sedgewick

échantillon introduit à un coin

couvercle à l'angle pour permettre Bordure de la Chambre

à l'air de s'échapper

Diapositive 10: interprétation des résultats

La prévalence et l'intensité de l'infection sont calculées ainsi qu'il suit:

Prévalence:

= nb. d'individus avec lames positives à mf x100

nb. total d'individus examinés pour microfilaires

Intensité : mf par ml de sang (considérant 60microl par lame)

= nb. total microfilaires comptées sur les lames positives x16.7

nb. total de lames positives

voir première image ci-dessus

voir deuxième image

suivante ci-dessus

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Diapositive 9: Biopsie cutanée

La méthode de la biopsie cutanée est utilisée pour détecter la présence du parasite Onchocerca

volvulus qui est responsable de l'onchocercose, également connue comme cécité des rivières. La

biopsie cutanée reste la méthode de choix pour le diagnostic de l'onchocercose car il est très

spécifique, même si elle peut être affectée par l'intensité et le stade de l'infection.

En effectuant la biopsie, une petite quantité de tissu doit être prélevée, idéalement 2 à 6

échantillons provenant de la crête iliaque; les fesses, l'omoplate ou les membres inférieurs

procurent cependant la meilleure sensibilité. Ces échantillons peuvent être prélevés en utilisant soit

un poinçon pour biopsie sclérocornéenne, soit en soulevant une petite portion de peau (d'environ 3

mm de diamètre) et en la découpant avec un scalpel.

(Image provenant de Dr Tekle’s)

Les biopsies sont placées individuellement dans le trou d'une plaque de microtitrage et mises en

incubation dans 100 µl d'un tampon phosphate à la température ambiante pendant 24 heures de

sorte que les microfilaires d'O. volvulus puissent émerger et être identifiées par microscopie. Les

trous des plaques seront vérifiés pour les MF émergents après 30 minutes et après une nuit

d'incubation.

Diapositive 12

- Qui sera testé?

Les diagnostics des HTS et des SCH sont réalisés dans le cadre des programmes à base scolaire

(quand les taux de scolarisation sont élevés) ou celui des programmes à base communautaire

(quand le taux de scolarisation est faible), en fonction de la conduite des DMM

- Quels échantillons seront prélevés?

Les diagnostics décrits pour les HTS et les SCH nécessitent que soient collectés des échantillons

d'urines ou de selles.

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- POURQUOI ces tests diagnostiques sont effectués?

Les résultats de ces tests permettront de calculer la prévalence de chaque maladie, soit dans le

cadre des enquêtes de base, soit dans le cadre des activités du S & E pour déterminer si une CTP

est nécessaire.

Diapositive 13-14: Kato Katz Le test de Kato Katz (KK) est utilisé pour détecter la présence d'œufs d'helminthes dans les

échantillons fécaux. Cet outil est largement utilisé à l'échelle mondiale dans les programmes de

lutte contre les HTS et les SCH, puisqu'il n'est pas cher et il est relativement facile à utiliser et

permet de détecter la présence de T. trichiura, Ascaris lumbricoïdes, Schistosoma mansoni,

Ancylostoma duodenale et Necator americanus. Au cours de la cartographie, les kits de test KK

sont le principal outil utilisé pour déterminer la prévalence de l'infection et si une CTP avec

l'Albendazole / Mebendazole ou Praziquantel est nécessaire. Après la mise en œuvre des DMM, le

test est utilisé pour suivre les changements dans la prévalence et l'intensité des infections.

Des échantillons de selles sont recueillis auprès des individus et envoyés au laboratoire pour

traitement. Dans l'heure qui suit la préparation, la lame peut être examinée pour les œufs

d'ankylostome et après 24 heures, elle doit être examinée pour les œufs de Trichuris trichiura,

Ascaris lumbricoïdes et Schistosoma mansoni.

Diapositive 15: Flotac

FLOTAC

L'appareil FLOTAC est également très utile pour récupérer des éléments de parasites après

flottaison. Il est une technique alternative valable, sensible et potentiellement de faible coût, qui

pourrait être utilisée dans des milieux à ressources limitées- en particulier pour le diagnostic des

helminthes. La technique implique la rotation de l'échantillon qui va permettre le dénombrement des

parasites avec une précision d'un œuf par gramme.

Traduction Figure 1. Le remplisseur de FLOTAC et le kit du mini-FLOTAC

Le principal facteur limitant de la technique du FLOTAC est qu'elle nécessite la centrifugation de

l'échantillon avec un dispositif spécifique; souvent, cet équipement n'est pas disponible dans les

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pays en développement. Ceci a été résolu par le mini-FLOTAC qui ne nécessite pas l'utilisation

d'une centrifugeuse et qui peut être transféré et réalisé dans un laboratoire facilement.

Le mini-FLOTAC nécessite une petite quantité d'échantillon de selles à ajouter à la chambre (Xg de

selles mis = XmL 5% de formol mis) avec une quantité égale de formol. Une fois ajouté et la

chambre scellée, il doit être agité pour s'assurer que l'échantillon et le formol sont homogénéisés

avant d'ajouter le liquide de flottaison et secouer de nouveau. Une fois ceci fait les deux chambres

de flottaison qui sont fournies doivent être remplies avec l'échantillon filtré qui pourra être examiné

après 5-10 minutes en utilisant un microscope standard.

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Images des Parasites intestinaux

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Images des Parasites intestinaux (traduction légende des images)

Fig1:

a. les œufs fertiles normaux d’Ascaris lumbricoïdes mesurent 55-75µm x 35 - 50 µm, sont de couleur

jaune doré à brun et sont au stade de cellule unique quand ils passent dans les selles. Les œufs sont

visibles avec de forme mamelonnée sur la surface.

b. Œuf fertile typique d’Ascaris lumbricoïdes comme il apparaît dans une préparation de Kato Katz

Fig 2

a. œufs infertiles typiques d’Ascaris lumbricoïdes dans les selles. Ces œufs sont de forme allongée et

beaucoup plus grands en taille (85 - 95 µm x 43 -47 µm), ont des coques fines et une couche

grossière, irrégulièrement mamelonnée. Le contenu de l'œuf est généralement granulaire et ne

présente aucune organisation.

b. Œuf fertile (en bas et à gauche) et œuf infertile d’Ascaris lumbricoïdes dans une préparation de Kato

Katz

Fig 3

a. Ascaris lumbricoïdes: Quelques fois les œufs fertiles normaux ne présentent pas de couches

mamelonnées et sont considérés comme des "œufs décortiqués".

b. Œuf normal et décortiqué (en haut et à gauche) d’Ascaris lumbricoïdes dans une préparation de

Kato Katz

c. œufs d'Ascaris lumbricoïdes (en haut) et de Trichiuris trichiura (en bas) dans une préparation de

Kato Katz

Fig 4

a. Œufs d'Ascaris lumbricoïdes (en haut) et de Trichiuris trichiura (au milieu) et d'Ankylostome (en bas)

dans le même champ microscopique, illustrant leurs tailles relatives

b. Œufs typiques de Trichiuris trichiura: mesurent 50 - 55 µm x 22 - 24 µm, possèdent une coque lisse

et brune et des proéminences bipolaires (bouchons) et contiennent une cellule ovulaire unique

c. Dans une préparation de Kato Katz, les œufs de Trichiuris trichiura peuvent apparaître plus grands et

enflés avec des contenus dégénérés. Les proéminences bipolaires et les couches des cellules ne sont

pas bien définies.

Fig 5:

a. Les œufs d'Ankylostome trouvés dans les selles sont caractéristiquement en forme de baril avec une

coque fine et hyaline; ils mesurent 60 - 75 µm x 36 -40 µm. Ils sont généralement au stade de 4 ou 8

cellules dans les selles fraiches ou à un stade plus avancé de clivage dans des selles qui ont été

gardées dans une température ambiante, même pendant de quelques heures.

b. Les œufs d'Ankylostomes dans des préparations de Kato Katz, sont souvent presque ronds et l'ovule

en division est infiniment difficile à voir. Dans les climats chauds, le glycérol va rendre les œufs trop

clairs et invisibles au bout de 30 - 60 minutes après la préparation.

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Fig 6

a. Les œufs de Trichostrongyles ressemblent aux œufs d'Ankylostomes, mais sont plus grands (75 - 95

µm x 40 - 50 µm) et de formes allongées. L’ovule dans un stade de clivage plus avancé quand il passe

dans les selles.

b. Ternidens deminutus est un autre parasite strongyle qui infecte les humains, le plus souvent en

Afrique australe. L'œuf ressemble à celui de l'Ankylostome et mesure près de 85 µm x 50 µm. Il a

tendance à être dans un stade de clivage plus avancé quand il passe dans les selles.

c. L'infection à Strongyloides stercoralis est habituellement diagnostiquée sur la présence dans les

selles d'une larve rhabditoïde de 180 - 380 µm x 14 - 20 µm. La larve a une capsule buccale courte,

une queue atténuée et un primordium génital proéminent (flèche).

Fig 7:

a. Les œufs de Clonorchis sinensis sont 27 - 35 µm x 12 - 19 µm ont un opercule assis et

habituellement une petite protubérance à la terminaison opposée. La coquille peut avoir de petits

débris adhérents. Les œufs dans les selles contiennent un miracidium. Les œufs d’ Opisthorchis sont

similaires

b. Les œufs de Métagonimus yokogawaï mesurent 20 -30 µm x 15 - 17 µm, ont un opercule discret et

sont dépourvus de bouton ou protubérance à la terminaison opposée; la coque est habituellement

dépourvue de débris adhérent. Les œufs dans les selles contiennent un miracidium.

c. Les œufs de Fasciola hepatica sont généralement de 130 - 150 µm x 63 - 90 µm, ont un opercule

discret, sont non embryonnés et ont souvent une irrégularité de la coque à la terminaison opposée

(le dernier n'est pas vu dans l'œuf similaire de Fasciola buski).

Fig 8:

a. Les œufs de Paragominus mesurent 80 - 120 µm x 45 -70 µm, sont de couleur bruns dorés à coque

épaisse, non embryonnés dans les selles ou dans les expectorations et ont un opercule proéminent.

La coque est épaissie à la terminaison opposée.

b. Les œufs de P. uterobilateralis, une espèce africaine sont habituellement plus petits que ceux de P.

westermani, i.e 50 - 95 µm x 35 - 55 µm et l'opercule est moins proéminent.

c. Diphyllobotrium latum. Ces œufs operculés de cestodes, mesurent habituellement 58 - 75 µm x 40 -

50 µm, sont non embryonnés dans les selles et peuvent avoir un bouton ou une petite protubérance

à la terminaison opposée.

Fig 9:

a. Les œufs de Taenia spp. sont tous virtuellement identiques en taille et morphologie, i.e. 31- 43 µm

de diamètre avec un contour épais d'apparence prismatique et contient un embryon à 6 crochets,

l'oncosphère. Occasionnellement, une fine membrane hyaline, embryonique primaire peut être

retenue autour de ces œufs.

b. Les œufs de Hymenolepis diminuta mesurent 70 - 85 µm x 60 - 80 µm, sont sphériques, bruns

jaunâtres et contiennent un embryon à 6 crochets, l'oncosphère. Il n'y a pas de filaments, comme

avec H. nana

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c. Les œufs de Hymenolepis nana sont habituellement sphériques, de 30 - 47 µm de diamètre, ont une

coque hyaline mince et contiennent un oncosphère à 6 crochets. Il y a 2 épaississements polaires sur

la membrane autour de l'oncosphère à partir de laquelle partent 4 - 8 filaments, qui se prolongent

dans l'espace qui se trouve entre l'oncosphère et le pourtour de la coque.

Diapositive 16: CCA

Le test CCA est un test qualitatif de présomption qui détecte l'antigène circulant cathodique du

parasite (CCA) dans l'urine du patient. Le test est bon pour la détection de S. mansoni et peut

potentiellement remplacer le test traditionnel Kato-Katz. Une goutte d'urine est introduite dans un

puits du test CCA et une goutte de tampon y est ajoutée. Si l'antigène CCA est présent, il

s'attachera à l'anticorps monoclonal marqué du parasite et réagira avec lui pour former une

deuxième ligne rose. Le test CCA est rapide, très sensible et facile à réaliser.

Diapositive 17: Outils utilisés pour détecter les parasites urinaires

Hemastix

L'outil Hemastix, communément appelé le test à la bandelette réactive ne peut pas détecter la

présence d'une infection parasitaire, mais est utilisé pour détecter la présence de sang dans les

urines. Ce test est largement utilisé dans les programmes de lutte contre la schistosomiase où

Schistosoma haematobium est présent puisque la libération des œufs se traduira par une

hématurie.

Les bandelettes individuelles peuvent être utilisées sur un seul échantillon d'urine; mais pour

doubler le nombre de tests par kit, les bandelettes peuvent être coupées dans le sens de la

longueur. Une fois que l'urine a été recueillie, elle doit être testée dans les 2 heures qui suivent afin

de garantir un résultat précis. Pour ce faire, une bandelette réactive unique devrait être

complètement immergée dans l'échantillon pendant quelques secondes avant d'être retirée et tout

excès d'urine enlevé en passant la bandelette le long du bord du récipient de l'échantillon. Après

une attente de 1-2 minutes, la bandelette réactive, à la fin du test devra être comparée à la carte

des couleurs sur le récipient pour déterminer le niveau d'hémolyse de l'échantillon.

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Filtration urinaire

Le test de filtration de l'urine est utilisé pour identifier et quantifier les œufs de S. haematobium dans

l'urine; cet outil est couramment utilisé dans les programmes de lutte contre la SC, car il est l'une

des rares méthodes disponibles dans ce domaine.

L'outil est une technique facile et rapide qui utilise 10 ml d'urine; l'échantillon est passé à travers un

filtre nucléopore qui peut alors être examiné avec un microscope à un grossissement de 40 x avec

de l'iode pour déterminer l'intensité de l'infection à S. haematobium. Il est important de noter que la

lecture doit être reportée en nombre d'œufs par le volume utilisé; ce sera généralement le nombre

d'œufs/10 ml.

Partie III : Activités de la session

Activité 1: Partage d'expériences

Les participants se répartiront en groupes de 4-6 personnes et discuteront de leurs expériences

avec les outils courants de laboratoire et de diagnostic qu'ils ont utilisés dans le passé et auxquels

ils sont familiers.

Les groupes devraient mettre l'accent sur les points suivants:

• Les outils qu'ils ont utilisés

• Les défis associés à chaque outil

• Les gaps qu'ils pensent exister dans les outils de laboratoire et de diagnostic des MTN.

Après 10 minutes, chaque groupe discutera des points clés qu'il a mis en évidence avec les

animateurs et les autres participants.

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Le but de cette activité est pour que les participants soient familiers avec les défis auxquels d'autres

personnes dans la communauté MTN ont été confrontés à l'égard des outils de laboratoire et de

diagnostic.

Activité 2: Etude de cas

En RDC, dans les Provinces de l'Equateur et du Bas-Congo, la plupart des districts sont co-

endémiques à la FL, la Loa Loa et l'onchocercose. En réalisant la cartographie pour la FL, la Loa

loa et l'onchocercose, pourriez-vous décrire les méthodes de diagnostic qui devraient être utilisées

pour confirmer l'endémicité de la FL comme nous savons que la DMM avec l'ivermectine ne pourrait

pas être mise en œuvre dans les districts où la FL et la Loa loa sont endémiques?

Quelles méthodes allez-vous utiliser pour cartographier la FL?

Quelles méthodes de diagnostic allez-vous utiliser pour cartographier Loa loa? Quelles méthodes

de laboratoire et de diagnostic supplémentaires allez-vous utiliser pour confirmer l'endémicité de la

FL et de la Loa loa dans la plupart des districts? Pour chacune des méthodes de diagnostic et de

laboratoire, s'il vous plaît, expliquez votre choix.

Partie IV : Outils de travail (y compris là où c'est applicable) Mots clés (maximum 10) Point d'action clés pour le personnel de niveau district

Part V: Références et ressources additionnelles

Références:

CDC Onchocerciasis website (http://www.cdc.gov/parasites/onchocerciasis/)

ICT bench aid (http://www.ntdsupport.org/resources/immunochromatographic-card-test-ict-bench-aid)

LF test strip bench aid (http://www.ntdsupport.org/resources/filariasis-test-strip-bench-aid)

WHO LF M&E Handbook (http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241501484_eng.pdf)

WHO LF Entomology Handbook

(http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/87989/1/9789241505642_eng.pdf?ua=1)

WHO Bench aid for the diagnosis of filarial infections

(http://whqlibdoc.who.int/publications/1997/9241544899_eng.pdf)

WHO Intestinal Helminth Bench Aids for the diagnosis of Intestinal Parasites

(http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/37323/1/9789241544764_eng.pdf?ua=1)

Annexes et ressources additionnelles:

Annexes

1. Procédures opératoires standardisées (SOP) ICT

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2. SOP bandelette test FL

3. SOP Brugia

4. SOP Goutte épaisse

5. SOP Chambre de comptage Sedgwick

6. SOP Biopsie cutanée

7. SOP Kato Katz

8. SOP Flotac

9. SOP Hemastix

10. SOP filtration d'urines

Ressources additionnelles:

1. WHO Bench aid for the diagnosis of filarial infections

2. CDC Onchocerciasis Website

3. WHO LF M&E Handbook

4. WHO LF Entomology Handbook

5. WHO Intestinal Helminth Bench aid

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Annexe 1: Procédures opératoires Standardisées (SOP) pour la Carte de Test

Immunochromatographique (ICT )

Directives

Entreposage et transport

1. Les cartes ont une durée approximative de vie d’environ 3-6 mois (OMS, 2011) lorsqu'elles

sont conservées à 30 ° et jusqu'à 9 mois lorsqu'elles sont conservées à 4 °.

2. Tester 2 cartes de chaque lot en utilisant un contrôle positif, si elles apparaissent négatives,

ne pas utiliser le lot.

3. Lors du transport des cartes sur les lieux d'étude, ne pas les exposer à une chaleur extrême

pendant des périodes de temps prolongées.

Prélèvement d'échantillons

1. Porter des gants.

2. Nettoyer la partie du doigt qui sera piquée à l'aide d'une lingette désinfectante.

3. Prélever une petite quantité de sang en utilisant une lancette pour piquer le doigt du

participant.

4. A partir de ça, recueillir 100 µl de sang à l'aide d'un tube capillaire (fourni avec les cartes ICT)

5. Ajouter un échantillon de sang sur la partie blanche du support de prélèvement.

• Noter le moment où le sang a été ajouté à la carte.

• NE PAS ajouter du sang directement sur la partie rose.

• NE PAS fermer la carte avant que l'échantillon ne migre vers la partie rose; ça prend environ 30

secondes.

6. Les résultats sont prêts pour lecture après 10 minutes; noter les résultats en marquant la carte

comme positive ou négative

• NE PAS lire les résultats à aucun autre moment, car le risque de faux positifs peut augmenter

7. Jeter dans des conditions sécurisées la carte ICT, le tube capillaire et tout reste de sang trouvé

dans le tube capillaire

Référence:

World Health Organization, 2011; Global Programme to Eliminate Lymphatic Filariasis: Monitoring and

Epidemiological Assessment of Mass Drug Administration

23

Annexe 2:

Bandelette test FL et SOP

Entreposage et transport

1. Les kits doivent être conservés à des températures comprises entre 2 ° et 37 °; Ils NE

doivent PAS être congelés. La date d'expiration qui se trouve sur l'emballage extérieur doit

être respectée; une fois que la date est dépassée, les kits NE devraient PAS être utilisés

car ils ne sont plus stables.

2. Tester2 bandelettes de chaque livraison en utilisant un contrôle positif; si elles se

révèlent négatives, ne pas utiliser le lot.

3. Lors du transport des cartes aux lieux d'étude, ne pas les exposer à une chaleur extrême

pendant des périodes de temps prolongées.

Collection d'échantillon et utilisation de la bandelette

24

Traduction légende ci-dessus

Procédure du test

1 Permettre à toutes les composantes de s'adapter à la température ambiante (15 -37 °C) avant le test.

Enlever les contenus du sachet juste avant utilisation. Le matériel fourni, comprend une bandelette test, un plateau de

travail en plastique et une micropipette à volume fixe (75 µl)

2 image i

Les bandelettes doivent être manipulées avec précaution et tenues seulement à l'extrémité dépourvue de flèches. NE

PAS appliquer de pression sur le support de l'échantillon en bas de la bandelette.

image ii

Les bandelettes doivent être étiquetées avec des identifiants appropriés. Les bandelettes peuvent être étiquetées

directement (de préférence) (A). Autrement, le plateau de travail peut être étiqueté (B)

image iii

La bandelette doit être placée dans le plateau de travail avant d'ajouter l'échantillon

NOTE: il est conseillé d'attacher la bandelette au plateau de travail avec un autocollant - type étiquette ou bande de

l'identifiant du patient

3 Recueillir 75 µl de sang capillaire en tenant la micropipette fournie légèrement au dessus du plan horizontal. NE

PAS presser le bout en forme de bµlbe de la micropipette quand on prélève le sang. Alternativement, mesurer 75 µl de

sang anticoagµlé à partir d'un tube à centrifuger en utilisant un micropipette calibrée. NE PAS ajouter du sang directement

du doigt à la bandelette.

4 image iv

Ajouter lentement l'échantillon de sang sur la moitié inférieure du support en pressant doucement le tube

25

image v

Démarrer un chronomètre sur 10 mn

Note: Il est utile de noter le temps de lecture sur le plateau de travail

5 image vi

Lire les résultats du test 10 mn après que l'échantillon ait été ajouté

NOTE: Noter le résµltat approprié sur la bandelette (de préférence) ou sur le plateau de travail

image vi

NE PAS lire les tests si l'échantillon n'a pas migré sur toute la hauteur de la bandelette

Annexe 3:

Brugia rapide SOP

Le test Brugia RapIDTM est un dosage immunochromatographique d'anticorps dans un

format de cassette. Ces tests sont utilisés dans les programmes de lutte contre la FL pour

détecter la présence de la protéine recombinante (BmR1) et d' IgG4 humain spécifiques

aux deux infections Brugia malayi et Brugia timori.

Directives

Entreposage et Transport

1. Le test a une durée de vie de 18 mois lorsqu'il est conservé entre 20 °- 25 ° C qui peut être

prolongée si conservé à 4 °C. Ils NE doivent PAS être congelés.

2. Lors du transport des cartes sur les lieux de l'étude, NE PAS les exposer à une chaleur

extrême pendant des périodes de temps prolongées.

Collecte des échantillons

1. Porter des gants.

2. Nettoyer la zone du doigt à piquer à l'aide d'une lingette désinfectante.

3. Recueillir une petite quantité de sang en utilisant une lancette pour piquer le doigt du

participant.

4. A partir de cette quantité de sang, prélever 35 µl en utilisant un tube capillaire (ou 25 µl de

sérum / plasma).

5. Une fois l'échantillon collecté et une goutte de tampon devra être ajoutée au puits # 1 sur le

kit de test. (voir étape 1 sur le schéma ci-dessous)

6. Ajouter soigneusement 3 gouttes du tampon au puits # 2 ainsi. (voir étape 2 sur le schéma

ci-dessous)

7. Tirer sur l'onglet clair jusqu'à sentir une résistance et ajouter 1 goutte de tampon dans le

puits carré.

26

Traduction de la légende du schéma ci-dessus

Etape 2: Ajouter 3 gouttes de tampon spécial; goutte à goutte et le laisser coµler à travers

le support entre les gouttes. Passer à l'étape 3

ligne bleue

A = ligne de contrôle

B = ligne test

Etape 1:

Pour les échantillons de sérum et de plasma

Ajouter 25 µl de l'échantillon dans le puits carré, suivis d'une goutte de tampon spécial dans le même

puits.

Le sérum/ plasma va commencer à diffuser sur la membrane. Les globules rouges vont diffuser plus lentement. La

cassette peut être tapée doucement sur la table pour faciliter l'écoulement de l'échantillon sur la membrane. Attendre

jusqu'à ce que la partie frontale humide de l'échantillon de sérum/plasma atteigne la ligne bleue. Aller à l'étape 3. Dans la

rare éventualité où la partie frontale de l'échantillon n'atteigne pas la ligne bleue, après avoir attendu approximativement 3

minutes, s'il vous plaît, aller à l'étape 2.

Etape 3:

Tirer sur la partie claire de l'onglet jusqu'à sentir une résistance. Ajouter une goutte de tampon spécial dans le puits

carré. Commencer à chronométrer. Lire les résultats dans 15 minutes pour le sérum/plasma et dans 25

minutes pour le sang total

8. Les résultats sont prêts à être lus après 25 minutes pour les échantillons de sang (ou 15

minutes pour le sérum ou le plasma); noter les résultats en marquant les cartes

27

NE lire les résultats à AUCUN AUTRE moment, car ceci peut augmenter le

risque de faux positifs

9. Les cartes doivent être lues dans un endroit bien éclairé, les lignes pâles peuvent être

difficiles à lire si l'éclairage est faible.

10. Jeter de façon sécurisée la carte Brugia Rapid, les tubes capillaires et tout restant de sang

trouvé dans le tube capillaire

Référence:

World Health Organization, 2011; Global Programme to Eliminate Lymphatic Filariasis: Monitoring and

Epidemiological Assessment of Mass Drug Administration

Annexe 4:

SOP pour Goutte Epaisse

TITRE: PREPARATION DES LAMES POUR L'EXAMEN DES MICROFILAIRES AU COURS DES

ENQUÊTES HÉMATOLOGIQUES NOCTURNES

INTRODUCTION

Les enquêtes hématologiques nocturnes pour les sites sentinelles dans le cadre de la filariose lymphatique

visent les populations âgées de 5 ans et plus et sont utilisées pour déterminer la prévalence et la densité des

microfilaires. Avant la collecte de nuit, la communauté locale doit être sensibilisée de manière adéquate et

encouragée à se rassembler à un endroit désigné où la collecte sera effectuée. Des dispositions adéquates

devraient être prises par le personnel technique pour garder les participants éveillés en projetant des films et

d'autres supports visuels relatifs à la maladie avec un projecteur.

But

Le but de ces SOP est d'utiliser adéquatement un frottis sanguin pour détecter les microfilaires de W.

bancrofti.

28

Principe

L'enquête hématologique nocturne est normalement réalisée en collectant du sang la nuit, en

préparant les lames, en les colorants et en procédant à leur examen microscopique. Une lame de

sang correctement colorée est une méthode peu coûteuse, utilisée pour découvrir si une personne

a des microfilaires dans le sang périphérique. Les microfilaires de Wuchereria bancrofti

apparaissent dans le sang avec une périodicité nocturne marquée, de façon à ce que la collecte de

sang soit faite entre 22 h 00 - 02 h:00.

Précautions de manipulation

• Équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire et gants) doit être porté lors de cette

procédure.

• Jeter tous les objets tranchants dans les boîtes à objets tranchants.

Matériels

Lames

Coton hydrophile (ou compresse)

Lancettes

Tubes de prélèvement

Tubes capillaires calibrés

Micropipettes

Micropipettes et embouts

Giemsa

Microscope

Stylos et crayons d'étiquetage

Gants

Blouses

Boites à lames

Boîtes de crayons

Boîtes de déchets

Ethanol à 70%

Eau distillée

Méthanol

Formµlaires d'enregistrement des résultats

29

Conditions d'entreposage

Toutes les lames sèches doivent être stockées dans la boîte de rangement pour le transport au laboratoire

pour traitement ultérieur.

Procédures/ méthodes

Remarque: Mettre EPP (blouse de laboratoire et gants)

1. Rassurer le client et le (la) mettre à l'aise

2. Nettoyer la lame avec un tampon d'alcool pour enlever les peluches et les résidus d'huile en essuyant

doucement les lames.

3. Etiqueter le bord de la lame avec un crayon indiquant les détails d'identification des clients.

4. Avec la paume de la main gauche du client tournée vers le haut, choisir le troisième ou quatrième doigt.

- IMPORTANT - Le gros orteil peut être utilisé pour les nourrissons. Le pouce ne devrait jamais être utilisé

pour les adultes ou les enfants. Utiliser du coton hydrophile légèrement imbibé d'éthanol pour nettoyer le doigt

- en effectuant des mouvements fermes pour enlever la saleté et la graisse de l'extrémité du doigt (Figure 1).

Sécher le doigt avec un morceau de coton propre (ou compresse).

Figure 1: Nettoyage du doigt avant le prélèvement de l'échantillon de sang (WHO, 2011).

5. Avec une lancette stérile, piquer la face interne du doigt (Figure 2) en utilisant une action de laminage

rapide. En appliquant une légère pression sur le doigt, faire sortir la première goutte de sang et l'essuyer avec

du coton hydrophile sec. S'assurer qu'aucun débris de coton n'est resté sur le doigt. Jeter la lancette dans les

boîtes pour objets tranchants.

Figure 2: Piquer la pointe du doigt avec une lancette (OMS, 2011).

30

6. Travailler rapidement et manipuler les lames propres seulement par les bords, prélever le sang comme

suit:

a. Appliquer une légère pression sur le doigt et recueillir au moins 60 μl de sang dans un tube

de collecte de sang ou un tube capillaire calibré.

b. Cela aide de maintenir le tube capillaire horizontalement (plat) pendant que vous collectez le

sang.

c. Essayer de ne pas introduire des bulles d'air dans le tube capillaire. Si c'est le cas, remplir le

sang au-delà de la ligne pour compenser.

d. Essuyer le sang restant avec du coton hydrophile. Demander au client de maintenir

fermement le coton sur le doigt jusqu'à ce qu'il arrête de saigner.

7. Préparation de la lame: Toujours manipuler les lames par les bords, ou par un coin, pour préparer la lame

comme suit:

a. Utiliser une micropipette pour mesurer 20 µl de sang à partir du tube de collecte et préparer

trois bandes de sang parallèles (20 µl chacune) dans le sens de la longueur de la lame (figure

3).

b. Sécher soigneusement la lame, à l'air libre pendant 24-72 heures. Ranger soigneusement les

lames dans les supports de coloration.

c. Deshémoglobiniser le frottis de sang pendant environ 5 minutes dans de l'eau de robinet, de

l'eau distillée ou une solution saline normale.

Note: Il faut être prudent en ce moment car le frottis est fragile et le lavage brutal ou l'agitation peut entraîner

sa disparition de la lame.

Figure 3: Une lame sanguine préparée, prête à être examinée (OMS, 2011).

8. Fixation des lames dans le méthanol: Bien que la fixation dans le méthanol n'est pas absolument

nécessaire, il en résulte une meilleure coloration des microfilaires.

a. Sécher à l'air libre les lames. Ceci peut être fait dans les chevalets de coloration.

b. Fixer au méthanol 3-5 minutes en plaçant la lame de sang déshémoglobinisée dans une cuve

de coloration contenant du méthanol.

c. Colorer avec 3% de Giemsa en plaçant diapositives dans un bocal de Coplin contenant la

solution de Giemsa pendant 50 minutes.

d. Sécher à l'air libre les lames.

31

9. Examiner la préparation sous microscope. Utiliser l'objectif 10 x d'abord pour localiser les microfilaires; puis

identifier les espèces filariennes en utilisant les objectifs 40 x et 100 x. Noter les lames positives et compter le

nombre de parasites par lame.

Interprétation et enregistrement des résultats

Sur votre formulaire d'enregistrement, notez la présence ou l'absence de microfilaires en face de

chaque identifiant de client.

Traduction légende de la figure ci-dessus

Microfilaires de Wuchereria bancrofti après coloration à l'hématoxyline (a, c, d) et au Giemsa (b). Caractéristiquement,

les gaines se colorent légèrement avec l'hématoxyline mais non avec le Giemsa. Les traits morphologiques clés

comprennent un espace céphalique court (a, b, c) et un discret noyau dans le corps. La colonne de noyaux ne s'étend pas

jusqu'à l'extrémité de la queue (d). Le corps intérieur se colore en rose avec la coloration de Giemsa (b, pointe de flèche)

mais non avec la coloration à l'hématoxyline.

Figure 4: Microfilaire de Wuchereria bancrofti

Présentation des résultats

Tous les résultats positifs doivent être discutés avec le chef de service.

Archivage et stockage des résultats

Tous les résultats doivent être consignés sur une feuille Excel dans un ordinateur. Les formulaires doivent

être rassemblés et correctement stockés dans l'armoire désignée dans le laboratoire.

Référence

World Health Organization, 2011; Global Programme to Eliminate Lymphatic Filariasis: Monitoring and

Epidemiological Assessment of Mass Drug Administration

32

Annexe 5: SOP pour La chambre de comptage de Sedgewick

Protocole pour la Chambre comptage pour l'estimation quantitative de microfilaires

La détection des microfilaires dans le sang requiert que les échantillons soient prélevés au cours de la soirée,

entre 21:00 (21 heures) et 02:00 (2 heures). Les équipes de recherche seront nécessaires pour tester les

individus qui ont présenté des résultats positifs à la carte ICT.

Collecte d'échantillons

1. Porter des gants.

2. Nettoyer le site de la piqûre au doigt à l'aide d'une lingette désinfectante.

3. Tirer une petite quantité de sang en utilisant une lancette pour piquer le doigt du participant.

4. A partir de ceci, prélever 100 µl de sang en utilisant un tube capillaire.

5. Ajouter un échantillon de sang (100 µl) aux tubes (petits tubes en plastique / flacons, 2-4 ml avec

couvercle contenant 900µl d'acide acétique à 3%)

• Tourner doucement le tube, sens dessus dessous pour dissoudre le sang dans le liquide. L'acide

acétique va fixer et préserver les microfilaires permettant le stockage et l'examen des mois plus tard.

Analyse des échantillons en laboratoire

1. Transférer tout le liquide du tube d'échantillonnage à la chambre de comptage avec une pipette à travers

l'ouverture créée par le couvercle incliné. Retirer toutes les bulles d'air avant l'examen (ceci peut être fait en

utilisant une aiguille)

• Suivez les instructions qui viennent avec la Chambre de comptage Rafter de Sedgewick

2. Placer la chambre de comptage avec le spécimen sous le microscope. Laisser le spécimen tranquillement

pendant environ 3-5 minutes pour laisser les microfilaires se déposer au fond de la chambre. Ensuite,

examiner le spécimen sous des grossissements de 40 x.

3. Noter le nombre de microfilaires qui sont présents dans la chambre de comptage sur le formulaire de S &

E avec l'identifiant correct des participants ainsi que le questionnaire démographique.

4. Après l'examen, le spécimen peut être transféré dans le tube de l'échantillon et conservé pour une

référence ultérieure.

5. Nettoyer la chambre de comptage en la rinçant avec de l'eau de robinet ou de l'eau distillée. Après

séchage, elle peut être réutilisée.

33

Référence:

Denham, D.A., Dennis, D.T., Ponnudurai, T., Nelson, G.S., Guy, F., 1971, Comparison of Counting Chamber

and Thick Smear Methods of Counting Microfilaria. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine

and Hygiene 65(4)

McMahon, J. E., Marshall, T.F., Vaughan, J. P., Abaru, D.E., 1979, Bancroftian filariasis: A comparison of

microfilaria counting techniques using counting chamber, standard slide and membrane (nuclepore) filtration.

Annals of Tropical Medicine and Parasitology 73: 457-464.

34

Annexe 6: Biopsie cutanée pour Onchocerca volvulus

Matériel

Le matériel suivant est requis pour que la biopsie cutanée puisse être réalisée:

Gants

lingettes désinfectantes

Poinçon de biopsie sclérocornéenne ou aiguille et scalpel

tube de prélèvement

Sérum physiologique

Prélèvement d'échantillons

1. Mettre des gants.

2. Nettoyer le site de prélèvement de l'échantillon en utilisant une lingette désinfectante.

• Prise recommandée jusqu'à 6 échantillons au niveau de la crête iliaque, de l'omoplate ou des extrémités

inférieures

3. En utilisant le poinçon de biopsie sclérocornéenne, prélever l'échantillon. Cela se traduira par le

prélèvement d'environ 2 mg de tissu.

OU

En utilisant une aiguille, soulever un petit cône de peau (environ 3 mm de diamètre) et couper avec un

scalpel. Cela se traduira par le prélèvement d'environ 2 mg de tissu.

4. Placer l'échantillon de tissu dans un tube pour échantillon pré-marqué qui est rempli de sérum

physiologique. Incuber à la température ambiante pendant 24 heures pour permettre aux microfilaires de

sortir de l'échantillon.

5. Examiner le sérum physiologique pour identifier les microfilaires par microscopie; ceci doit être préparé

selon la manière traditionnelle de préparation humide.

• Identifier et noter le nombre de microfilaires qui sont détectées dans chaque échantillon.

Référence:

CDC Website; Onchocerciasis webpage.

http://www.cdc.gov/parasites/onchocerciasis/health_professionals/index.html

35

Annex 7: Test de Kato Katz

Diagnostic de: Schistosoma mansoni, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides,

Ancylostoma duodenale et Necator americanus

Principe général: les personnes infectées par les HTS ou les Schistosomes intestinaux éliminent

les œufs des vers à travers leurs selles. En examinant un échantillon de selles au microscope, il est

possible de compter le nombre et le type d'œufs présents.

Précautions de sécurité

Les selles doivent être considérées comme potentiellement infectieuses

Porter des gants et des blouses de laboratoire à chaque fois qu'on manipule des

échantillons de selles.

Les bancs, les instruments et les équipements doivent être régulièrement décontaminés

avec des désinfectants après utilisation.

Les matériels contaminés par les déchets infectieux doivent être désinfectés avant leur

élimination.

Boire ou manger pendant les procédures de laboratoire est prohibé

Des désinfectants appropriés doivent être utilisés pour l'élimination des matériels

contaminés, des spatules en bois et des boîtes de spécimen et pour le nettoyage des

paillasses

Les boîtes d'échantillons utilisés doivent être désinfectées avant lavage.

Equipement pour Kato Katz

Kato-Katz:

échantillon de selles dans un récipient

lames en verre

feuilles de cellophane

vert de malachite

glycérol

tamis métallique (Tamis Endecott) avec mailles de 212µm

boîtes de lames

Papiers journal

Spatules en bois

Forceps

Kit Kato-Katz:

o 400 modèles en plastique avec un trou de 6 mm sur un gabarit d'une épaisseur de

1,5mm (livrant 41,7mg de matières fécales)

o Un rouleau de cellophane hydrophile (34um d'épaisseur, 20m)

36

o 400 bâtonnets applicateurs/ spatules en plastique

o Un rouleau de mailles de filet en nylon pour tamisage (20m)

Examen Microscopique:

• Microscope

• Compteur manuel de pointage

• Formulaires de laboratoire

Dispositifs pour élimination des déchets:

• Lingettes désinfectantes

• Savon médical

• Alcool à flamber

• Boite à ordures (contenant un désinfectant)

Préparation des réactifs Kato Katz Images

Etape 1: Peser 0.5g de poudre de vert de Malachite

Etape 2: La diluer dans 100 ml d'eau distillée (ceci constitue

la solution mère)

Etape 3: Diluer 50ml de glycérine dans 50 ml d'eau distillée

Etape 4: Prélever 1 ml de Malachite solution mère et

l'ajouter à 100 ml à 50% de solution de glycérine (ceci est la

“solution de travail”).

Etape 5: Découper du cellophane en pièces de 25 mm x

30 mm et les laisser tremper toute la nuit dans la solution

de travail.

Etapes du Kato-Katz Images

Etape 1: Étiqueter une lame de verre avec le numéro de

l'échantillon, puis placer un gabarit en plastique sur le dessus de

celle-ci.

Etape 2: Placer une petite quantité de l'échantillon de selles sur un

journal et presser par la face inférieure du tamis métallique. En

utilisant une spatule, racler la matière fécale tamisée à travers le

tamis de sorte que seuls les débris restent.

37

Etape 3: Gratter un peu de matière fécale tamisée pour remplir le

trou du gabarit en évitant les bulles d'air et niveler les fèces pour

enlever l'excédent.

Etape 4: Soulever avec précaution le gabarit et le placer dans un

seau d'eau mélangée avec un détergent concentré afin qu'il puisse

être réutilisé.

Etape 5: Placer une pièce de cellophane, qui a été trempée

pendant toute la nuit dans une solution de bleu de méthylène et de

glycérol sur l'échantillon de selles.

Etape 6: Placer une lame propre sur le dessus et appuyer de façon

régulière vers le bas pour étaler les excréments dans un cercle. Si

c'est bien fait, il devrait être possible de lire des écritures du journal

sur le frottis de selles.

Etape 7: Si l'ankylostome est présent dans la zone, la lame devrait

être lue dans les 30-60 minutes. Après ce temps, les œufs

d'ankylostome disparaissent.

Examen microscopique de S.mansoni et HTS Images

Etape 1: Pour lire la lame, la placer sous le microscope en utilisant l'objectif de grossissement 400 x.

Etape 2: Lire tous les champs de la lame en utilisant le système 'zig zag' vertical et le compteur de pointage pour enregistrer combien d'œufs sont vus sous la lame au fur et à mesure qu'elle est lue.

Etape 3: Noter le nombre et la nature de chaque œuf sur un formulaire d'enregistrement à côté du numéro de l'échantillon. S'il n'y a pas d'œufs, marquer "0".

Etape 4: Jeter les fèces et le cellophane en utilisant un tissu, dans la boite à déchets et placer toutes les lames utilisées lors de la réalisation du Kato-Katz dans le désinfectant. Ces lames doivent être nettoyées et réutilisées pour l'enquête.

Note:

Le contrôle de qualité lors de la lecture des lames de Kato-Katz est important. Par exemple, pour

confirmation du % de concordance pour les techniciens de laboratoire pour garantir la qualité (voir

le % de concordance sur un prélèvement de l'échantillon).

38

Annexe 8: Test Flotac

1. Introduction

Les techniques de comptage des œufs fécaux (FEC) sont largement utilisées pour le diagnostic

parasitologique chez les humains et les animaux. Ils évaluent le nombre d'éléments parasitaires (œufs,

larves, oocystes) présents dans les échantillons fécaux, exprimés par gramme de fèces. L'appareil

FLOTAC est également très utile pour récupérer des éléments parasitaires après flottaison. Dans ce

protocole, les deux solutions de flottaison devraient être utilisées en même temps pour maximiser la

production des éléments parasitaires.

2. But

Le but de ce SOP est de décrire l'utilisation de la technique FLOTAC pour le diagnostic des helminthiases

transmises par le sol dans les programmes de suivi et évaluation (S&E).

3. Précautions

1. Les échantillons de selles sont potentiellement dangereux et doivent donc être manipulés avec

précaution.

2. L'EPP doit être porté en tout temps durant le processus

3. Les solutions utilisées peuvent être dangereuses

4. Éviter les gaspillages

4. Matériel

1. Remplisseur - FLOTAC

2. Mini - FLOTAC (figure 1)

3. Solutions de flottaison:

i. Chlorure de sodium saturé, s.g = 1,20 pour HTS

ii. Sulfate de zinc; s.g. = 1,35 pour S. mansoni et protozoaires intestinaux

4. Solution de formol à 5%

5. Compteur de pointage

6. Gants

7. Désinfectants pour les mains

39

8. Détergent

9. Eau de Javel

10. Sacs de déchets en plastique

5. Conditions de stockage

Les échantillons de selles non traités doivent être conservés à 4 ° C ou dans de l'alcool polyvinyle (PVA),

ajouté comme agent de conservation.

6. Procédure

1. Prendre 1 gramme de selles à mettre dans le récipient de remplissage FLOTAC

2. Ajouter 1 ml de formol à 5% et visser le bouchon

3. Agiter vigoureusement pour homogénéiser

4. Ouvrir le bouchon à vis et ajouter le liquide de flottation pour atteindre 20 ml (1:10 dilution de

l'échantillon)

5. Remonter le bouchon à vis et agiter vigoureusement pour homogénéiser

6. Filtrer et remplir les deux chambres de flottation

7. Patienter pendant 5-10 min, traduire et examiner au microscope (en utilisant un grossissement

maximum de 400 x et compter les éléments de parasites individuellement)

Note: * X grammes de selles requièrent X ml de formol à 5%

7. Résultats et interprétation du test

L'intensité de l'infection a été calculée en œufs par gramme (OPG).

8. Archivage et conservation

40

Le personnel responsable devra assurer une conservation en sécurité et un archivage correct des

résultats.

9. La mesure de l'incertitude

Malgré leur grande sensibilité, la limitation principale des techniques FLOTAC est la complexité de la

méthode qui fait appel à la centrifugation de l'échantillon avec un dispositif spécifique, équipement qui n'est

souvent pas disponible dans les laboratoires des pays en développement. Pour surmonter cet obstacle, un

nouveau dispositif simplifié a été développé, appelé mini-FLOTAC.

10. Reference:

1. Cringoli G. (2006) FLOTAC, a novel apparatus for a mµltivalent faecal egg count technique.

Parassitologia.;48(3):381-4.

2. Rinaldi L1, Maurelli MP, Musella V, Santaniello A, Coles GC, Cringoli G. (2010) FLOTAC: an improved method

for diagnosis of lungworm infections in sheep. Vet Parasitol.;169(3-4):395-8.

3. Barda BD, Rinaldi L, Ianniello D, Zepherine H, Salvo F, et al. (2013) Mini-FLOTAC, an Innovative Direct

Diagnostic Technique for Intestinal Parasitic Infections: Experience from the Field. PLoS Negl Trop Dis 7(8):

e2344. doi

41

Annexe 9: Test Hemastix

Diagnostic de: Schistosoma haematobium.

Equipement pour le test Hemastix

Bandelette réactive Hemastix et flacon Hemastix avec échelle de lecture

Ciseaux

Gants

Disinfectants et dispositif pour traitement des déchets

Formulaire de collecte de données

Etapes pour les bandelettes réactives Images

Etape 1: Recueillir un échantillon d'urines fraîches dans un récipient en

plastique propre. Assurez-vous que l'urine soit testée sur le terrain

dans les 2 heures suivant le prélèvement. Si il y’a un retard, réfrigérer

l'échantillon si possible.

Etape 2: Retirer une bandelette de sa bouteille (vous pouvez couper la

bandelette en deux pour économiser les ressources) et étiqueter les

bandelettes avec l'identifiant du patient.

Etape 3: Immerger complètement les parties réactives de la bandelette

dans l'échantillon d'urine pendant quelques secondes.

Etape 4: Lors du retrait de la bande, passer son bord contre le rebord

du récipient pour éliminer tout excès d'urine.

Etape 5: Mettre la bandelette horizontalement sur la table afin que les

produits chimiques ne se mélangent pas.

Etape 6: Lire la bandelette entre 1 et 2 minutes après qu'elle ait été

plongée dans l'échantillon d'urine.

Etape 7: Comparer la couleur de la bandelette avec la couleur de la

carte sur l'étiquette de la bouteille et noter les résultats sur le formulaire

de suivi. Enregistrer “0” si le résultat est négatif.

1= trace hemolysée

2 = trace non-haemolysée

3 = +

4 = ++

5 = +++

42

Note Importante:

NE PAS POSER LA BANDELETTE SUR L’ECHELLE DES COULEURS PUISQUE

CECI VA LA SALIR

• Il est extrêmement important de lire la bandelette dans les 1-2 mn après qu'elle ait été

plongée dans l'échantillon d'urine. Tout changement de couleur qui se produit après 2 minutes

est sans valeur diagnostique et doit être ignoré.

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Annexe 10: SOP Filtration urinaire

Diagnostic de: Schistosoma haematobium

Précautions de sécurité

• L'urine devrait être considérée comme potentiellement infectieuse

• Porter des gants et des blouses de laboratoire lors de chaque manipulation des

échantillons d'urine.

• Les bancs, les instruments et les équipements doivent être régulièrement décontaminés

avec des désinfectants après utilisation.

• Les matériaux contaminés par les déchets infectieux doivent être désinfectés avant

élimination.

• Boire ou manger pendant les procédures de laboratoire est prohibé

• Des désinfectants appropriés doivent être utilisés pour l'élimination des conteneurs

d'échantillons contaminées et pour le nettoyage des paillasses

Les conteneurs d'échantillons utilisés doivent être désinfectés avant le lavage

Equipement

Usage général:

• Gants

• Formulaires de laboratoire

Urine Filtration:

• pots d'urine (250ml)

• Porte-filtre de Swinnex

• Pinces à épiler / Forceps

• Seringues en plastique de 10ml

• Filtres à membranes nucléopores, 13mm de diamètre et taille des pores 12 µm

• lames de microscopie en verre

• Iodure de Lugol (solution à 5%)

Examen microscopique:

Microscope

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Compteur de pointage manuel

Désinfectants et élimination des déchets:

• Godet (pour jeter l'urine)

• Solution d'hypochlorite de 1% (eau de Javel domestique)

• Alcool pour flamber

• Savon médical

• Gants de toilette en caoutchouc

• Lingettes désinfectantes

• conteneur de déchets (contenant un désinfectant)

Prélèvement des échantillons:

Le nombre d'œufs dans les urines varie tout au long de la journée, avec un maximum entre 10

heures -14 heures. Les échantillons doivent être prélevés en ces moments, consistant en un

seul échantillon d'urines. Puisque les œufs sont le plus souvent trouvés à la fin d'un jet d'urines,

au moins 10 ml doivent être prélevés à la fin de la miction (urine terminale). La façon la plus

facile d'obtenir un échantillon d'urine terminale est de demander aux personnes d' «essayer de

remplir" un grand pot, de 250 ml par exemple. Noter que certains enfants, en particulier ceux

qui sont fortement infectés par la schistosomiase, peuvent ne pas être en mesure de fournir 10

ml d'urines. Ne pas jeter ces petits échantillons, mais il faut noter le volume (ml) d'urines fourni.

Les échantillons doivent être examinés dès que possible après la collecte puisque les œufs

peuvent éclore et devenir invisibles ou des cristaux peuvent se former et rendre un diagnostic

correct plus difficile.

NOTE IMPORTANTE: Pour augmenter le volume d'urines fourni lors de la collecte de

l'échantillon, il serait souhaitable de promouvoir l'apport hydrique et l'exercice physique avant la

miction (par exemple, offrir aux enfants 2 verres d'eau, une heure avant la collecte de l'urine et

leur demander de participer à un exercice de 10 minutes) (Doehring et al., 1983).

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Etapes pour une Filtration d'urines Images

Etape 1: Dévisser le porte-filtre et insérer un filtre Nucléopore entre les deux

parties du porte-filtre. Assurez-vous qu'il est correctement maintenu en place

avant de visser de nouveau l'unité, ensemble.

Etape 2: Agiter et mélanger l'échantillon d'urine avant de tirer un échantillon de

10ml dans la seringue. Ensuite, fixer l'unité de filtration.

Si moins de 10 ml d'urine sont disponibles dans d'échantillon, retirer la

totalité de l'urine du pot d'échantillon et noter la quantité d'urine (ml) sur le

formulaire de laboratoire à côté du numéro d'identification. Ne pas jeter

l'échantillon d'urine, s'il est inférieur à 10ml.

Etape 3: Garder la seringue et l'unité dans une position verticale; appuyer sur le

piston pour pousser toute l'urine à travers le filtre et vers un seau.

Etape 4: Détacher soigneusement la seringue du porte filtre. Aspirer de l'air

dans la seringue; rattacher la seringue au porte filtre et expulser l'air de

nouveau. Ceci est important, car il élimine tout excès d'urine et garantit que les

œufs sont solidement fixés sur le filtre.

Etape 5: Dévisser le porte-filtre et utiliser une paire de pinces à épiler pour

enlever le filtre et le placer inversé sur la lame de microscope en verre. Le côté

supérieur du filtre où les œufs ont été capturés doit être face vers le haut sur la

lame.

NE PAS JETER LE PORTE-FILTRE OU LA SERINGUE.

Etape 6: Ajouter une goutte d'iodure de Lugol et attendre 15 secondes pour que

la coloration pénètre dans les oeufs. Ceci rend les œufs visibles plus facilement.

Etape 7: Examiner immédiatement l'ensemble du filtre sous un microscope à

faible puissance (x40). Les œufs de schistosomes peuvent être vus clairement

parce qu'ils sont colorés en orange. Les charges d'infection sont enregistrées en

nombre d'œufs par 10 ml d'urine.

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Etape 8: À la fin de la journée, laver tout équipement réutilisable (forceps, porte-

filtres, seringues, pots d'urine, lames de microscopie) pour une utilisation le

lendemain, jeter les filtres usagés et nettoyer la paillasse.

Lorsque deux échantillons d'urine sont nécessaires: Répéter les étapes 1-7 pour préparer

un second filtre en double à partir du même échantillon d'urines et le placer sur la lame de verre

à côté du premier filtre ou sur une autre lame étiquetée avec le même code d'identification. La

seringue peut être réutilisée pour cette seconde filtration sur le même échantillon d'urines.

Cependant, il faut s'assurer qu'une seringue propre est utilisée pour chaque échantillon d'urines

différentes (i.e. appartenant à deux personnes). Deux filtres de l'échantillon d'urines doivent être

lus par deux techniciens de laboratoire indépendants.

IMPORTANT: Lire la lame dans l'heure où l'échantillon d'urine a été prélevé; autrement

les œufs peuvent être non viables et devenir translucides. Ne pas laisser les échantillons

exposés au soleil.