Cours de Virologie3ime anne Pharmacie

Virus de la mosaque du tabac

Herpesvirus Papillomavirus

Virus de la grippe Adenovirus

Rtrovirus de Moloney Virus Ebola

Philippe Georgel

philippe.georgel@pharma.u-strasbg.fr

Intrt mdical60% des

maladies

infectieuses

Intrt fondamental

modle de biologie

molculaire

Intrt en gnie gntiquevectorologie, thrapie gnique, vaccination

Virologie

Maladies infectieuses : 17 millions de dcs par an soit 1/3 de la mortalit humaine

6 maladies reprsentent 90% des dcs par infection dans le monde :

~ 900 000 de dcs / an (alors quil existe un vaccin efficace!)Rougeole

~ 1 million de dcs / an (300 500 millions de cas annuels)Paludisme (Plasmodium falciparum)

~ 2 millions de dcs / anTuberculose (Mycobacterium tubertulosis)

2,5 millions de dcs / anDiarrhes bactriennes (shigellose, colilose, cholra, fivre typhode) ou virales (rotavirus)

3 millions de dcs / anSyndrome dimmunodficience humaine acquise (SIDA d au HIV)

3 millions de dcs / anMaladies respiratoires bactriennes (pneumocoque) et virales(grippe, virus respiratoire syncitial)

Plus de 90% de ces maladies surviennent dans les pays en dveloppement : l'Organisation

Mondiale de la Sant, dans son " Rapport sur la sant dans le monde, 2002 " estimait que

plus dun milliard de personnes taient prives de " rvolution sanitaire "

Au moins 16% des cancers sont dorigine infectieuse : bactrienne (Helicobacter

pylori) ou virale (virus des hpatites, virus dEpstein Barr, papillomavirus)

Virologie et intrt mdical en quelques chiffres

Les virus sont responsables de nombreuses maladies (animaux, vgtaux, bactries, algues, champignons, )Chez lhomme, >60% des maladies infectieuses sont dorigine virale :- Bnignes : bronchiolites (Adenovirus), rhinites (Rhinovirus)- Svres et mortelles : Fivres hmoragiques (Ebola), SIDA (HIV)

De telles maladies peuvent se transformer en de vritables pidmies et pandmies comme la grippe espagnole (1917-1919), le SIDA ou lhpatite C.Chez les plantes, de telles pidmies ont des consquences conomiques importantes.

Intrt mdical de ltude des virus

Virologie et gnie gntique

Bactriophages, outils de gnie gntiqueVecteurs de clonage ou dexpression (ex : , 13)

Vecteur de squenage, mutagense dirige (ex : M13)

Enzymes (T4 ligase, ARN polymrase ADN dpendante de T7, ) ou promoteurs

(T7, T3) de phages

Virus eucaryotes, outils de biologie molculaireVecteurs dexpression de protines dans des cellules eucaryotes en culture (ex :

SV40, Baculovirus, Rtrovirus)

Enzymes (RT) ou promoteurs (promoteur 35S du CaMV, enhancer de SV40) viraux

Virus eucaryotes, outils thrapeutiquesVaccinologie

Thrapie gnique

Principaux virus utiliss en

thrapie gnique

Systmes Avantages Inconvnients Remarques Rtrovirus (entre 2 LTR en aval de la squence

dencapsidation F, insertion du gne dintrt en

remplacement des gnes gag,

pol et env encapsidation

aprs transfection dune

ligne cellulaire

transcomplmentantes ex :

HIV, MoMLV)

Forte efficacit de

transduction entre

efficace dans les cellules

cibles large spectre de

cellules infectables

possible intgration stable incapacit se propager seul (virus

dfectif) systme trs

bien tudi

immunognicit faible

pas de protines virales

exprimes par lhte

Faible titre (106-10

7

pfu/ml) limite de taille

de linsert (

Les virus sont lorigine des dcouvertes fondamentales dans les domaines de la biologie (molculaire et cellulaire) des eucaryotes et des procaryotes (rplication, transcription et traduction).

fragments d'OKAZAKI dans la rplication de lADN : bactriophage T4

introns et lpissage des ARN messagers eucaryotiques : adnovirus

squences activatrices de la transcription et fonctionnement dun promoteur : SV40

stratgies dexpression des protines : bactriophage, poliovirus ...

proto-oncognes qui rgulent le cycle cellulaire et dont les mutations sont lorigine

des cancers : rtrovirus

extinction post-transcriptionnelle des gnes ou RNAi (systme dlimination dARN

trangers ou aberrants) : virus des plantes

utilisation de squences virales comme vecteurs de gnes (vaccinologie, thrapie

gnique, gnie gntique, )

Leur gnome renferme peu de gnes

Ltude des relations structures - fonction(s) peut-tre ralise facilement par mutagense dirige

Leur multiplication est trs rapide (25 minutes 30 heures selon le virus)

les virus : dexcellents modles dtude

Naissance du concept de virus

Antiquit

fin

XIXme

XVIIme

1794-6

1840

fin XIXme

1876

1878

1880

1885

1888

Virus ( poison , latin) = tout agent lorigine de maladies infectieuses

Antony Van Leeuwenhoek effectue les premires observations de microbes

Edward Jenner vaccine contre la variole laide de pustules de virus contenus

dans les pustules de la maladie assez bnigne des vachers. Mise en place de la vaccination avant mme de connatre la nature des virusJacob Hence propose lhypothse dagents infectieux trop petits pour tre

observs au microscope et capables dengendrer des maladies. En labsence de

preuves, lhypothse nest pas retenue.

Essor de la Microbiologie avec Louis Pasteur et Robert Koch.

Enonc des Postulats de Koch permettant de dfinir un agent pathogne

Charles Sdillot cre le mot microbe pour dsigner les tres vivants

visibles seulement au microscope

Louis Pasteur vaccine contre le cholra des poules

Louis Pasteur vaccine Joseph Meister contre la rage

Inauguration de lInstitut Pasteur

La recherche des agents responsables de maladies virales ne rpondait pas tous les postulats de Koch : mise en vidence dun nouveau type dagents infectieux.

Un peu dhistoire

Virus prsents depuis l'origine de la vie (dbut de lre Prcambien - 3,5 milliards annes/Phages)

gypte : bas relief poliomylite (1500 BC)

Variole : dclin empire romain (III s), dcime 1/3 population Aztque en 1520 (Cortes)

Chine, Turquie (1000) : inhalation de crotes de variole pour se prmunir de la maladie ...

Vaccination contre la variole

Pratique de la vaccination avant la dcouverte de lexistence des virus

1798 : E. JENNER protge lhomme de la variole en lui inoculant la vaccine, une maladie voisine et bnigne de la vache

1885 : L. PASTEUR russit vacciner efficacement contre la rage

Postulats de Koch (1876) pour la dfinition dun agent pathogne :

1. Le microorganisme suspect doit tre prsent dans chaque cas de maladie, mais absent des organismes sains (association agent/ syndrome)

2. Le microorganisme suspect doit pouvoir tre isol et cultiv en culture pure partir dun hte malade (isolement)

3. Lorganisme doit pouvoir tre r-inocul un hte sain et entraner lapparition de symptmes identiques ceux observs sur lhte de dpart (reproductibilit)

4. Lorganisme doit pouvoir tre r-isol de lhte contamin, mis en culture pure, et tre identique lorganisme initialement isol (risolement).

1884

1892

1898

1899

1901

1908

1911

1915-17

Agents ultrafiltrablesCharles Chamberland met au point la bougie du mme nom (filtre de

porcelaine). Lide que certains agents pathognes peuvent passer travers

commence apparatre : virus filtrables (Sdillot), infrabactries (Pasteur

propos de la rage).

Dimitri Ivanowsky observe que la maladie de la mosaque du tabac est

transmise par des agents non retenus par filtration Notion dagents

ultrafiltrables. Mais il pense quil sagit dune toxine bactrienne.

Martinus Beijerinck fait la mme observation puis dmontre que lagent est

transmissible dune plante une autre sur plusieurs gnrations lagent se

multiplie ce nest pas une toxine fluide contagieux. Le premier virus identifi est un virus de plante : le virus de la mosaque du tabac (MTV).Friedrich Loeffler et Paul Frosch dcouvrent le premier virus animal : le virus de la fivre aphteuse des bovins.Ces nouveaux agents sont appels agents ultrafiltrables puis tout simplement virus. La virologie est ne. La premire dfinition des virus se fait en termes ngatifs : ils sont non filtrables, non visibles, non cultivables.Walter Reed identifie le premier virus humain : le virus de la fivre jaune.

Vilhelm Ellerman et Olaf Bang identifient un virus responsable de leucmies

chez le poulet premier virus oncogne.Peyton Rous identifie un virus responsable de tumeurs solides chez le poulet

(RSV pour Rous sarcoma virus).

Frederick Twort et Felix dHrelle dcouvrent indpendamment les

bactriophages.

Rgles de Koch modifies par Bos

- Le virus doit tre isol dun individu malade

- Il doit tre multipli en cellules htes

- Il doit tre filtrable

- Il doit produire une maladie comparable chez un hte

voisin

- Il doit tre isol des htes infects par la souche cultive

- Une rponse immunitaire spcifique du virus doit tre

dtecte

Les VIRUSLes VIRUS

Diamtre/ longueur x largeur en nmE.coliRickettsies, Chlamydia(bactries endophytes)

Poxvirus

Virus de la grippeBactriophage T4

Virus de la mosaque du tabacPoliovirus

300 x 18

4000 x 1300

25

95 x 65 (tte)

475

450 x 230

85

Nanovirus 17 .

i) la culture cellulaire in vitro=> production des virus des animaux

ii) l'ultracentrifugation => purification des virus

iii) la microscopie lectronique => dtermination de la forme, la taille et l'architecture des virusen 1939, G. KAUSCHE et H. RUSKA ont pu visualiser au microscope lectronique la forme en btonnet du VMT

iv) la diffraction aux rayons X => dtermination de la structure tridimensionnelle des particules virales la premire analyse par diffraction des rayons X des cristaux de VMT a t ralise en 1941 par J.BERNAL et I. FANKUCHEN

Dveloppements technologiques permettant ltude des virus et de leur cycle infectieux (I)

v) la biologie molculaire et le gnie gntique 1980 -

=> dtermination de la structure primaire des gnomes viraux et par dduction,

celle des protines

=> comprhension des mcanismes impliqus dans l'expression et la rplication

du gnome viral

vi) la gntique inverse qui permet de convertir lARN en ADN grce la

transcriptase inverse, une ADN polymrase-ARN/ADN dpendante (enzyme des

rtrovirus), a tout particulirement permis de faire des progrs considrables

dans ltude des virus ARN

vii) Les virus sont galement utiliss en thrapie gnique, comme matriaux de

base en nanotechnologies,

Dveloppements technologiques permettant ltude des virus et de leur cycle infectieux (II)

Exprience de A.HERSHEY et M. CHASE (1952)

Protine 35S

Bactriophage

ADN 32P

agitation dans un mixer

centrifugation

surnageant radioactif (35S)

culot bactrien

agitation dans un mixer

centrifugation

surnageant

culot bactrienradioactif (32P)

E.coli

Fraenkel-Conrat & Singer /GIERER et SCHRAMM montrent en 1956 que lARN du VMT est suffisant pour diriger la synthse de virions

lADN du bactriophage porte toute linformation ncessaire pour la synthse de nouveaux virions

Sommaire

1. Dfinitions

2. Architecture

3. Taxonomie

4. Multiplication

1. le virus est une entit nucloprotique renfermant qu'un seul type d'acide nuclique, de lADN ou de lARN : cet acide nuclique constitue le gnome viral

2. le virus se reproduit uniquement partir de son acide nuclique

3. le virus est incapable de crotre en taille et en volume et de subir des divisions binaires pour se multiplier. Il se multiplie dans la cellule uniquement par synthse et assemblage de ses constituants

4. le virus ne renferme aucune information gntique spcifique des enzymes impliques dans la production d'nergie. Il ne peut pas dvelopper par lui-mme l'nergie ncessaire pour la synthse de ses constituants

5. le virus ne se multiplie qu' l'intrieur des cellules vivantes. Il est incapable de se dvelopper sur un milieu inerte mme si on lui fournit des lments nutritifs. Il est entirement dpendant pour sa multiplication, des structures de la cellule hte qu'il infecte. Ce point dfinit le virus comme tant un parasite intracellulaire obligatoire

DfinitionsAndr LWOFF (1953)

DfinitionsAndr LWOFF (1953)

Dfinition moderne des virus

Les virus sont des entits nucloprotiques possdant un seul type dacide nuclique*, parasite intracellulaire obligatoire,

infectieuses de faon autonome, incapable de crotre et de subir des divisions binaires, ne codant pour aucune fonction du

mtabolisme intermdiaire.* : nuancer (certains virus rtrodes, mimivirus, CMV)

Cette dfinition exclut les organites (mitochondries, chloroplastes) et les lments

gntiques mobiles (rtrotransposons, transposons) qui sont non infectieux, les

lments sub-gntiques (plasmides, pisomes) non autonomes dans les conditions

naturelles, et les prions (dpourvus dacides nucliques a priori). Les agents sub-viraux sont : les virodes (ARN nu circulaire non codant), les agents satellites (=

parasites de virus i.e. non autonome ce sont des acides nucliques satellites ou des

virus satellites sils codent leur propre capside) et les prions.

Distinction entre les termes virus et virion : le terme virus dsigne aussi

bien les formes extra- et intra-cellulaires de ces entits alors que le terme virion

dsigne uniquement la forme extracellulaire qui est la forme infectieuse mais

mtaboliquement (quasi) inactive.

Les virus, des entits la frontire du vivant

Classiquement, la dfinition du vivant repose sur la cellule :une membrane plasmique autour dun gnome transmissible la

descendance ayant une certaine autonomie mtabolique (au moins un systme de traduction et des voies ana- et cata-boliques) avec une capacit

dvolution et une dure de vie limite.

Les virus possdent des proprits des organismes vivants

(gnome, adaptation) mais sont incapables de capter et stocker de

lnergie, et sont ainsi fonctionnellement inactifs hors de la

cellule.

Proposition dune nouvelle dfinition qui pourrait inclure les virus ? Un organisme vivant est une entit lmentaire dun lignage continu (critre de

multiplication) avec une histoire volutive individuelle (critre dvolution) .

Les virus sont-ils des microbes ou des molcules ? En un mot, sont-ils vivants ?

Rponse :

" Les virus sont... des virus " (Andr Lwoff - Prix Nobel en 1970)

Origine des virus: 3 scenariiScnario n1. Les virus sont apparus avant "l'invention" des cellules

Hypothse peu probable, car si les virus avaient t autrefois "vivants", ils auraient eu du matriel rplicatif. Et il est difficile

d'envisager que ce matriel ait t assez stable avant l'invention de la cellule."

Scnario n2. Ils sont apparus en mme temps

Dans cette perspective, les virus seraient apparus simultanment des molcules les plus primitives qui, les premires,

russirent se reproduire. Quelques-unes de ces molcules auraient fini par constituer des units d'organisation et de

duplication appeles cellules, tandis que d'autres se seraient assembles pour former les particules virales, qui en voluant de

faon parallle aux cellules, en seraient devenues des parasites.

Scnario n3. Ils sont apparus aprs

Aujourd'hui, tous types de cellules peuvent tre infects. Ce qui laisse penser que les virus sont apparus aprs les premires

cellules. Comment ? Une cellule a pu en infecter une autre, puis perdre sa capacit tre autonome. C'est ce que suggrent

les rickettsies. Cette thorie voit galement dans les virus les plus complexes (comme les herps) le rsultat d'une rgression,

celle de petites cellules procaryotes ayant parasites de plus grosses puis s'tant simplifies l'extrme et tant devenues plus

dpendantes de leur hte. Les virus seraient donc une forme parasitaire qui aurait connu une volution simplificatrice.

Une autre hypothse apprhende les virus comme des morceaux d'ADN ou d'ARN devenus indpendants et capables de sortir

d'une cellule et de mener une vie parasitaire.

Composants des virus

NC

Acide nuclique (ADN ou ARN)Simple ou double brin (parfois les deux :

hepdnaviridae)

Fragment ou non

Linaire ou circulaire

Parfois associ des nucloprotines basiques

(NC) pour le stabiliser et former le core ou

nuclode

Nuclocapside(= structure finale des

virus nus)Plusieurs nuclocapsides

pour certains gnomes

fragments (ex :

orthomyxovirus)

Ches les reovirus, capside

supplmentaire pour

entourer lensemble des

petites capsides

+

Hlicodale

Icosadrique

Mixte ou complexe

Parfois en plusieurs couches

(ex : 3 rotavirus)

+/- autres molcules : nucliques (ex : ARNt) ou protiques (ex : rplicases)

Spicules des virus nus

+/- tgument(= matrice, protines MA -

cohsion)

+ Enveloppe(= peplos)

Forme parfois complexe : en

obus (rhabdoviridae) ou

bacille (poxviridae)

Capside (protines CA)

coque

structure finale des virus envelopps

Spicules = projections de surface

= boutons = antircepteur viral

Structure mtastable

VIROIDES, VIRUS DE L'HEPATITE D ET PRIONOn a dcrit des agents infectieux encore plus simples que les virus :

- les virodes (1978)

Les virodes se composent d'un acide nuclique seul. Ce sont de simples boucles d'ARN d'environ 300 nuclotides qui se rpliquent mais ne

codent aucune protine. Leur prsence perturberait la maturation des ARN messagers cellulaires. Les virodes n'ont t observs jusqu' prsent

que dans le monde vgtal (pomme de terre, tomate...).

- le virus de l'hpatite D (1977)

Le virus de l'hpatite D est le seul membre connu des Deltavirus. Le gnome est un ARN circulaire codant une seule protine de capside

(l'antigne delta). C'est le plus petit virus connu parasitant l'homme : incapable de se multiplier seul, il se manifeste toujours associ au virus de

l'hpatite B, dont il emprunte l'enveloppe pour entourer sa nuclocapside. Un virus incapable de se multiplier seul est un virus dit dfectif .

- les prions (1982) (prion est un anagramme de prion : proteinaceous infectious particle)

Les prions sont la cause dencphalopathies spongiformes :

la maladie des vaches folles,

la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez lhomme.

Comme lagent infectieux rsiste aux nuclases, aux UV, l'bullition, on peut penser quil est dpourvu dacide nuclique.

C'est encore l'heure actuelle une nigme biologique.

Les prions seraient des protines sans acide nuclique associ, protines caractrises par une rsistance exceptionnelle l'action des protases.

Cette protine (la PrPres : protine du prion rsistante aux protases) est proche d'une protine normalement trouve dans le systme nerveux (la

PrPc : protine du prion cellulaire).

En sa prsence, la protine normale subirait une simple modification de sa conformation qui la transforme en protine anormale. Celle-ci devient

son tour rsistante laction des protases : elle saccumule dans les lysosomes qui clatent. Les enzymes lysosomiales endommagent les

neurones, crant des trous : le cerveau ressemble une ponge.

Les lments mobiles17% du gnome de Arabidopsis thaliana

18% du gnome de Drosophila melanogaster

42% du gnome de Homo sapiens

plus de 50% du gnome de Zea mas

les transposons ADN, dits aussi bactriens , bords de squences inverses rptes appeles IR; exemples: Tn, Tc1, lment P, Ac/Ds

les rtrotransposons de classe I qui transposent par l'intermdiaire d'un ARN; ils sont bords de deux "long terminal repeats" appeles LTR, en rptition directe; exemples: Ty, copia, IAP

(intracisternal-A particle);

ll existe des formes drives des rtrolments comme les lments Line et Sine qu'on nomme

rtrotransposons de classe II.

Les rtrovirus ne font pas partie des transposons puisqu'ils ont une forme infectieuse.