SOMA GAUDREAU

ÉTUDE DE LA MODULATION DE L'EXPRESSION GÉNIQUE DE L'ARNm DES

CYTOKINES ET DES MOLÉCULES CYTOTOXIQUES DANS LE SANG

PÉRIPHÉRIQUE LORS DU REJET AIGU DE L'ALLOGREFFE RÉNALE

Mémoire

présenté

a la Faculté des études supérieures

de l'université Lavai

pour l'obtention

du grade de maître ès sciences (M.Sc.)

Département de Microbiologie-Immunolog ie

FACULTÉ DE MÉDECME

UNIVERSITÉ LAVAL

OSonia Gaudreau, 1 999

National Library l*l of Canada Bibliothèque nationale du Canada

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Your fi& Vorn nHmna

Our fi& Narre d H m a

L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant à la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distribuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de microfiche/film, de reproduction sur papier ou sur format électronique.

L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantieis de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.

à Lise el Jeun-paid,

mes parents.

À Murio.

mon copain

AU COUS de notre étude, nous avons comparé la modulation de l'expression géniqw

de la Granzyrne B à son activité enzymatique en relation avec le rejet aigu de l'allogreffe

rénale. Le groupe de patients etudié a eu un suivi irnrnunologique seulement pour cette

molécule, au moment d'un doute de rejet, diagnostiqué par les néphrologues, ainsi que 2

semaines après les traitements immunosuppresseurs. Les résultats obtenus n'ont démontré

aucuns liens entre l'expression génique et phénomène de rejet aigu ainsi qu'entre l'activité

enzymatique et phénomène de rejet aigu. D'autre part, nous avons étudié la modulation de

l'expression génique des cytokines dans le sang périphérique en relation avec le rejet aigu.

Nous avons étudié les cytokines de type Th1 (l'IL-2 et I'INFy), de type Th2 (l'IL-4, l'IL-5,

l'IL-6, l'IL-10) et une chimiokine dérivée des macrophages (l'IL-1 5) de même que les

molécules cytotoxiques (GrB, Perforine et Fas L). Un suivi immunologique de 3 mois

post-transplantation a été fait. Les résultats obtenus par RT-PCR ont indiqué qu'il y avait

une élévation significative des cytokines IL-4, IL-5, IL-6, INFy et des molécules

cytotoxiques GrB et Perforine lors des épisodes de rejet aigu.

Sonia Gaudteau R a w d Roy

REMERCIEMENTS

Je désire d 'abord exprimer mes remerciements à mon directeur de thèse, Raynuid

Roy, de m'avoir accueilli au sein de son équipe en me permettant de réaliser ce projet ainsi

que pour sa disponibilité.

Je riens égaiement à remercier André Darveau, mon ancien directeur de projet de

recherche réalisé dans le cadre du bacculauréat en biochimie, de m'avoir initié au monde

de la recherche scientijique et pour uvoir réveiller en moi I'intérét de poursuivre dans ce

domaine.

Mes remerciements s 'adressent aussi à l 'équipe de néphrologues de 1 'hbtel-Dieu de

Québec sans qui ce projet n'aurait pu être possible. Je tiens à remercier, plus

spécialement, le Dr. Isabelle Houde pour sa collaboration lors de mes visites à l'unité de

greffe rénale. Merci à Isabelle Houde, Jean-Guy Lachance ainsi qu'à Réal Noël.

Je désire aussi remercier Francine Cossette et Simone Lille de rn 'avoir fait profiter

de leurs connaissances dans le domaine ainsi que pour m'avoir aidé à grandir sur le plan

personnel.

Je riens également (i exprimer ma reconnaisscmce envers ma consœur Hoada Bilrha

pour son amitié, son soutien, sa complicité et sa sincérité. Merci Houda!

Pour terminer, je tiens à remercier et Ù exprimer ma grutitude à mes parents de

m 'avoir soutenus et encouragé dam tour mes projets er mes études ainsi qu'à mon copain

Mario pour son oreille attentive et ses bons conseils aimi que d'avoir toujours été lù dam

les moments de joie comme dans [es moments plus d@ciles.

TABLE DES MATTERES

Résumé ......................................................................................... i

Remerciements .............................................................................. i i

Tables des matières ......................................................................... iii

Liste des figures ............................................................................. v

Liste des tableaux ........................................................................... vii

Liste des abréviations ........................................................................ viii

CHAPITRE 1

................................................... ................................ Introduction .. .............................................................. 1 . 1 Le rein. un organe essentiel

1 .1 .1 Anatomie des reins ........................................................... ...................................................... 1.1.2 Maladies dégénératives

1.2 La transplantation ......................................................................... ......................................... 1.3 Les complications suite à une transplantation

1.4 Le rejet ...................................................................................... ............................................. 1.4.1 Le rejet à médiation cellulaire

1.4.2 Le rejet à médiation humorale ............................................. ............................. 1.4.3 Mécanismes inflammatoires non spécifiques

1.5 L e phénomène de tolérance .............................................................. 1.6 Les immunosuppresseurs .................................................................

CHAPITRE II

......................................................................... Molécules cytotoxiques 44

2 . 1 Introduction ............................... ... ........................................ 44

........................................................ 2.2 Objectifs spécifiques de travaux 46

2.3 Matériels et méthodes .............................................................. 47

................................................................................... 2.4 Résultats 53

........... 2.4.1 Analyse de l'expression génique des molécules cytotoxiques 53

2.4.2 Comparaison entre l'expression génique et l'activité enymatique

......................................................... delaGrBloadurejet 55

2.5 Conclusion ............................................................................... 58

CHAPITRE III

Travaux de recherche ............................................................................. 3.1 Revue de littérature .......................................................................

.................................. 3.1.1 Cytokines intragreffe associées au rejet

....................... 3.1.2 Cytokines du sang périphérique associées au rejet

3.2 Problématique .............................................................................. 3.3 Objectif spécifique des travaux ......................................................

3.3.1 Hypothèse ..................................................................... 3.4 Article ...................................................................................

3.4.1 Résumé .........................................................................

CHAPITRE IV

Conclusion ........................................................................................ 91

Bibliographie ..................................................................................... 96

Figure 1.1

Figure 1.2

Figure 1.3

Figure 1.4

Figure 1.5

Figure 1.6

Figure 1.7

Figure 1.8

Figure 1.9

Figure 1.1 0

Figure 1.1 1

Figure 1.12

Figure 1.13

Figure 1.14

Figure 1 . 15

Figure 1.16

Figure 1.17

Figure 1.18

Figure 1.1 9

Figure 1.20

Figure 1.2 1

Figure 1.22

.................................................... Anatomie interne du rein

...................................................... Structure des néphrons

................................................ Schéma d'un hémodyaiiseur

............................................. Greffe hétérotopique d'un rein

.............................................................. Types de greffes

...................................... Induction de la tolérance à l'antigène

............................ Étapes menant au rejet de l'allogreffe rénale

Vue d'ensemble du processus imrnunologique

........................................................... conduisant au rejet

Sensibilisation des lymphocytes T à l'antigène présenté à la

......... surface des cellules présentatrices d'antigène (macrophages)

Mécanismes de reconnaissance de l'allogreffe et activation

....................................... de la réponse cellulaire et humorale

Mécanisme cytolytique de la lyse des cellules du greffon

................................. médié par la Perforine et les Granzymes

........... Processus cytotoxique médié par les interactions Fas/Fas L

Activation de la réponse effectrice des anticorps suite à la

................................. sensibilisation des cellules T ii l'antigène

Différents mecanismes inflammatoire non spécifique utilisés

........ par les macrophages activés pour éliminer l'antigène nominal

.................. Interaction F M a s L dans l'induction de la tolérance

.................................. Structure chimique des corticostéroides

..................................... Structure chimique des azathioprines

..................................... Structure chimique de la cyclosporine

.............................................. Structure chimique du FK506

...................................... Structure chimique de la raparnycine

................................. S tnicture chimique du brequinar sodium

........................... Structure chimique du mycophenolate mofetil

Figure 1.23

Figure 1.24

Figure 2.1

Figure 2.2

Figure 2.3

Figure 2.4

Figure 2.5

Figure 3.1

Interaction des anticorps anti-CD3 (OKT3) avec le CD3

..................................................... la surface des cellules T

........ Sommaire des sites d'action des drogues immunosuppresives

.................................................. Substrat de la Granzyme B

Principe de la réaction enzymatique ALA-ALA-PRO-LEU-GrB ..... Comparaison entre l'intensité du signal fournis par RT-PCR de

l'expression génique des molécules cytotoxiques GrB, Fas L et

P lors d'une stimulation mitogénique des PBMCs a) et sans

stimulation des PBMCs b) le jour de la biopsie et 2 semaines

.................................. après le traitement immunosuppresseur

Modulation de la Granzyme B chez des patients avec un

rejet aigu - sans rejet a) par l'analyse de l'expression génique

mesurée en demitornétrie, b) par la détermination de l'activité

.................. enzymatique mesurée par l'intensité de fîorescence..

Comparaison des indices de variation de la Granzyme B

analysées en mesurant I'expression génique et l'activité enzymatique

a) chez des patients avec un rejet aigu, b) chez des patients sans rejet

Suivi dans le sang périphérique de la modulation de l'expression

génique des cytokines et des molécules cytotoxiques chez des

receveurs en rejet et sans rejet .............................................

LISTE DES TABLEAUX

.............. Tableau 1 .1 Immunosuppresseurs utilises en transplantations rénales. 3 5

............ Tableau 2.1 Séquences d'amorces utilisées pour la réaction de RT-PCR 49

Tableau 3.1 Profil de l'expression génique, selon différents groupes,

de 1'ARNm des cytokines retrouvé intragreffe lors du

rejet aigu de l'allogreffe rénale ............................................. 6 1

Tableau 3.2 Relation entre les cytokines présentes dans le sang périphérique

selon l'expression du gène ou la protéine sécrétée et le phénomène

........................... de rejet à la suite d'une transplantation rénale 64

....... Tableau 3.3 Séquences des amorces utilisées pour la réaction de RT-PCR.. 75

Tableau 3.4 Corrélation entre l'expression de 1'ARNm des cytokines et des

................ molécules cytotoxiques avec le processus de rejet aigu 79

Tableau 3.5 Augmentation de l'expression de l ' M m pour chacune des

cytokines et molécules cytotoxiques étudiées chez des patients

avec et sans rejet aigu ....................................................... 80

viii

LISTE DE ABRÉWATIONS

Ac

ADCC

ADN

ADNc

Ag ALA

ARNm

ASP

B

BQR

ca2+

CD4+

CD8+

CMH 1

CMH 11

CPA

CsA

CTL

dNTP

DTH

ELISA

Fas

Fas L

Fc

GrA

GrB

HLA

k A

Anticorps

Cytotoxicité dépendante des anticorps

Acide désoxyribonucléique

Acide désoxyribonucléique complémentaire

Antigène

Alanine

Acide ribonucléique messager

Acide aminé Aspartate

Lymphocyte B

Brequinar sodium

Calcium 2'

Cellule T auxiliaire

Cellule T cytotoxique

Complexe majeur d'histocompatibilité de classe 1

Complexe majeur d'histocompatibilité de classe II

Cellule présentatrice d'antigène

Cyclosporine A

Lymphocyte T cytotoxique

Dinucléotide triphosphate

Réponse d'hypersensibilité de type retardée

Essais enzymatique lié à un immunoabsorbant

Récepteur Fas

Ligand Fas

Récepteur Fc

Granzyme A

Granzyme B

Antigène leucocytaire humain

Immnuoglobuline de type A

IgG

IgM

IL- I

IL-2

IL-3

1 L-4

IL-5

IL-6

IL-IO

IL-13

IL- 15

MFY

LAK

LEU

M ~ "

NK

OKT3

P

PAF

PBL

PBS

PCR

PDGF

Rh

RT

T

TCR

TGFP

Th0

Th 1

Immunoglobuline de type G

Immunoglobuline de type M

Interleukine- 1

Interleukine-2

Interleukine-3

Interleukine4

Interleukine4

Interieukine-6

Interleukine- 1 O

Interleukine- 1 3

Interleukine- 1 5

Interféron gamma

Lymphocyte tueur activé

Acide aminé Leucine

Magnésium 2+

Cellule tueuse naturelle

Anticorps anti-CD3 (Orthoclone)

Perforine

Facteur activateur des plaquettes

Lymphocyte du sang périphérique

Solution de phosphate de potassium et chlorure de sodium

Réaction de polymérisation en chaine

Facteur de croissance des prostaglandines

Protéine du sang Rhésus

Réaction de transcription inverse

Lymphocyte T

Récepteur de cellule T

Facteur de croissance transformant bêta

Cellule T auxiliaire de type O

Cellule T auxiliaire de type 1

Cellule T auxiliaire de type 2

Cellule T auxiliaire de type 3

Facteur nécrosant des tumeurs alpha

Facteur nécrosant des tumeurs bêta

Chapitre 1

INTRODUCTION

1.1 Le rein, un organe essentiel

Les reins ont un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie, car ils contribuent

à purifier et à équilibrer les liquides du milieu interne. Ils travaillent à filtrer les liquides en

circulation et à éliminer les e a u usées, cette activité passe habituellement inaperçue, sauf

si ceux-ci ont une défaillance ce qui entraîne alors, une accumulation interne des déchets.

Sans relâche, les reins filtrent le plasma et excrètent dans l'urine les toxines en provenance

du foie de même que les déchets métaboliques comme l'urée ainsi que les ions en excès,

par la suite, ils renvoient les substances nécessaires dans le sang.

Outre ce qu'ils excrètent de l'organisme, les reins participent à la régulation du

volume et de la composition chimique du sang, d'une part en conservant un juste équilibre

entre l'eau et les électrolytes et d'autre part, en conservant un juste équilibre entre les

acides et les bases. Les fonctions régulatrices du rein ne s'arrêtent pas là. Les reins

produisent aussi la rénine, une enzyme qui règle la pression artérielle et la fonction rénale

ainsi que l'hormone érythropoiétine qui a pour but de stimuler la formation des globules

rouges dans la moelle rouge des os. De plus, les cellules rénales participent aussi a la

transformation de la vitamine D en sa fonne active.

(Marieb NE., Anatomie et physiologie humaine, 1992)

1.1.1 Anatomie des reins

La partie externe du rein se nomme le cortex rénal et recouvre la médulla rénale qui

expose des masses de tissu conique appelé pyramides rénales ou Mabighi. Chaque

pyramide rénale constitue, avec son enveloppe de tissu cortical, un lobe rénal. Au niveau

du hile, dans le sinus rénal, se trouve un tube plat en forme d'entonnoir appelé le bassinet

qui communique avec 1 'uretère. Le bassinet se prolonge vers l'intérieur du rein à travers

deux ou trois calices majeurs se ramifiant en calices mineurs. Les calices reçoivent l'urine

qui est drainée sans interruption par les orijices papillaires et la déverse dans le bassinet.

L'uretère emporte ensuite, l'urine jusqu'à la vessie (figure 1 A). Ce processus se poursuit

sans relâche durant toute une vie par des reins sains.

Chaque rein contient plus d'un million de minuscules unités de filtration du sang

appelés néphrons où se déroulent les processus menant a la formation de l'urine. Chaque

néphron est formé d'un corpuscule rénal associé à un tubule rénal. Le corpuscule rénal est

une vésicule composée de la capsule glomérulaire rénale ou capsule de Bowman et d'un

bouquet de capillaires artériels nommé glomérules rénaux (figure 1.2).

Les reins traitent quotidiennement environ 180 litres de liquide dérivé du sang. Ils

excrètent sous forme d'urine environ 1% de cette quantité et renvoient le reste dans la

circulation. La filtration de l'urine appartient entièrement aux néphrons. L'élaboration de

l'urine et l'adaptation simultanée de la composition du sang se font essentiellement en trois

processus. La filtration glornérulaire joue le rôle de filtre non sélectif. La réabsorption

tubulaire est un phénomène de transport transépithélial. La sécrétion tubulaire a pour but

d'éliminer les médicaments et les substances nuisibles telles que l'urée et l'acide urique

ainsi que les ions potassium (K+) en excès et régule aussi le pH sanguin. Ces deux derniers

événements sont soumis B des mécanismes de régulation rénale et hormonale très précis

(Marieb m., Anatomie et physiologie humaine, 1992).

1.1.2 Maladies dégCnérativcs

L 'imuflsance rénale survient lorsque le nombre de néphrons sains diminue au point

où la fonction rénale ne peut plus maintenir 1' homéostasie de l'organisme. L insuffisance

rénale est causée par plusieurs facteurs comme des infections rénales répétées, des

traumatismes aux reins (écrasement), comme !'intoxication chimique des cellules tubulaires

par des métaux lourds (mercure, plomb) ou par des solvants organiques (perchloroéthylène

utilisé dans le nettoyage à sec, diluant à peinture, acétone, etc.. . .) et peut aussi être causée

par une insuffisance de I'imgation des cellules tubulaires due à l'artériosclérose.

Figure 1.1. Anatomie interne du rein

Cortex rénal

Medulia rénale

Néphron ~uxta.rnédulhire

Figure 1.3. Structure des niphrons

Les personnes diabétiques sont prédisposées aux maladies rénales. Celles qui ont

vécu avec un diabète sucré pendant plus de 20 ans deviennent souvent atteintes

d'insuffisance rénale a cause de blessure vasculaire. La glomérulonéphrite aiguë est une

affection qui cause des lésions glomérulaires permanentes qui conduisent à l'insuffisance

rénale et ceci est caractérisé par une inflammation des glomérules qui est généralement

consécutive à une réaction immunitaire- La polykystose r é d e de I 'adulte est une maladie

dégénérative héréditaire conduisant aussi à l'insuffisance rénale. De plus, des maladies

congénitaZes en générales, vont provoquer ce phénomène. Ainsi, une foule de circonstance

peut conduire à l'insuffisance rénale.

L'insuffisance rénale est associée à une diminution ou un arrêt de la formation du

filtrat glomérulaire ce qui amène un déséquilibre électrolytique appelée urémie qui perturbe

le processus physiologique vital. L'urémie cause la diarrhée, des vomissements, un œdème,

des malaises respiratoires, des arythmies cardiaques et dans des situations extrêmes, des

convuIsions, le coma et la mort.

Pour prévenir l'urémie, il faut débarrasser le sang des déchets métaboliques et

comger sa composition ionique au moyen de la dialyse. L'insuffisance rénale est

irréversible. Les reins fullssent par devenir totalement inaptes à filtrer le plasma et à

concentrer l'urine. Chez les patients en insuffisance rénale terminale, le recours à la

transplantation s'avère être une solution toutefois, l'hémodialyse demeure égaiement une

modalité thérapeutique (Marieb N.E., Anatomie et physiologie humaine, 1992). Cependant,

chez les patients présentant une maladie cardiaque ou une maladie hépatique, la

transplantation constitue la seule solution permanente. L'hémodialyse (figure 1.3)

s'effectue a l'aide d'un rein artificiel et consiste à faire passer le sang du patient à travers

une tubulure dont la membrane n'est perméable qu'a certaines substances.

Air Solution de Bain a tempê- comprimd dialyse fraiche rature constante

Figure 3. Schéma d'un hémodyaliseur

Satution de dialyse usée

1.2 La transplantation

Né de la médecine moderne, le vaste champ de la transplantation a allié les bases de

la science aux applications cliniques. L'ère moderne de la transplantation commença il y a

une trentaine d'années avec Medawar qui démontrait que chez le lapin, une greffe de peau

provenant d'un autre lapin était rejetée par un mécanisme actif avec une mémoire

(Medawar PB. J. anat. 1994).

La plupart des greffes qui sont faites de manière classique en médecine clinique,

sont des greffes d'organes vascularisés directement reliés a la circulation du patient.

Généralement, la greffe de rein est hétérotopique, c'est-à-dire, que l'organe est implanté

dans un autre site anatomique (sur le côté de l'abdomen) que dans son site naturel qui est la

fosse rénale (figure 1.4). La transplantation de tissus pour remplacer des organes malades

est maintenant un acte important de la thérapie médicale. L'organe qui est de loin le plus

transplanté est le rein et il fut transplanté pour la première fois avec succès sur des jumeaux

identiques dans les années 50 (Depelchin A., Immunobiologie 1997).

La greffe d'organe représente le seul traitement efficace pour de nombreux patients

en phase terminale d'une maladie cardiaque ou rénale. Elle est pratiquée depuis plus de 30

années toutefois, avec un succès inégal. C'est la réponse immunitaire contre les tissus

greffés qui représente dans la plupart des cas l'obstacle majeur à la réussite de la

transplantation (Marieb NE., Anatomie et physiologie humaine, 1992).

Bien que la réponse immune rende dificile la transplantation d'un organe, il y a peu

de traitements de substitution pour soigner des maladies consécutives à la défaillance d'un

organe. Trois progrès majeurs ont rendu possible en clinique le recours régulier a la

transplantation d'organe. Premièrement, l'habileté technique permettant de réaliser le

remplacement chimgical d'un organe. Deuxièmement, les centres de transplantation qui se

sont organisés en réseaux pour s'assurer que les quelques organes sains disponibles, après

détermination de leur haplotype HLA (antigènes leucocytaires humains), seraient adressées

aux patients les plus aptes a les recevoir. Troisièmement, l'emploi de médicaments

immunosuppresseurs très efficaces pour inhiber l'activation des cellules T. Tous ces

progrès ont augmenté la survie de I'allogreffe de façon spectaculaire (Benichou G., et al. J.

Exp. Med., 1992).

GREFFE ORTMOTOPlQUE

.

:IN DU DONNEUR

c8t6 de l'ABDOMEN

GREFFE H~T~ROTOPIQUE RECEVEUR

Figure 1.4. Greffe hétérotopique d'un rein

Quatre types de transplantation sont pratiques en clinique. Tout d'abord, les

autogreffes (figure 1 Sa) où le tissu est prélevé sur la personne greffée même, on a recours à

ce type de transplantation surtout lors de briilures localisées. La deuxième catégorie est

appelée isogreffes (figure 1Sb) et se pratique chez les jumeaux identiques, elle se

caractérise par le fait que le donneur et le receveur sont génétiquement identiques. Le type

de greffe dont l'ouvrage qui suit traite est l'ahgrefle (figure 1 Sc) qui consiste à greffer un

organe provenant d'un individu qui n'est pas génétiquement identique au receveur et qui

origine généralement d'un cadavre. C'est aussi le genre de transplantation le plus

couramment pratiqué et aussi celui qui c a w le plus de problèmes. Finalement, il y a les

xénogrefes (figure 1 Sd) où l'organe transplanté provient d'une espèce autre que l'humain

par exemple, le porc. Ce type de greffe pounait éventuellement devenir une alternative

courante dans les cas où il y aurait un manque d'organes humains (Marieb N.E., Anatomie

et physiologie humaines, 1992).

La réussite de la transplantation dépend de la compatibilité du tissu, puisque les

lymphocytes T inflammatoires et T cytotoxiques vont réagir fortement pour détruire tout

tissu étrangé à l'organisme. Des anticorps vont aussi contribuer au rejet du tissu greffé.

Depuis les premières descriptions cliniques du rejet d'allogreffe, ce probkme qui semblait

irréversible et incontournable, a beaucoup évolué. Némoins, à l'heure actuelle le rejet

aigu précoce de l'allogreffe est le plus souvent contrôlé en augmentant

l'irnmunosuppression, mais fréquemment, il passe inaperçu et il est difficile à distinguer

des autres dysfonctions d'organes (Charpentier B. M, Transplant Proc., 1983).

L'importance de la compatibilité HLA dans le devenir des allogreffes rénales est

bien établie. La suMe a 10 ans est d'environ 75% chez les germains (provenant de la

même famille) HLA identiques et de plus de 50% si seulement 1 haplotype ist partagé

comparativement à 40% pour les reins provenant de donneun cadaveriques (Marieb N.E.,

Anatomie et physiologie humaine, 1992)

Figure 1.5. Types de greffes a) autogreffe. b) isogreffe. c) alIogreffe, d) xénopffe

Plusieurs mesurent doivent être prises avant de pratiquer une allogreffe, on doit tout

d'abord, rechercher la compatibilité. Puisque toute transplantation implique, une

reconnaissance allogénique chez le receveur soit, un mécanisme immunologique beaucoup

plus complexe qu'une simple réponse a un antigène soluble. Il est donc nécessaire dans un

premier temps, de déterminer les antigènes des groupes sanguins du système AB0 et Rh

ainsi que de préciser l'existence chez le receveur d'anticorps qui réagissent avec les

globules blancs du donneur. Si des anticorps de ce type sont reconnus, il y a une contre-

indication sérieuse à la transplantation, car elle conduira à un rejet hyperaigu assuré. En ce

qui concerne la compatibilité, elle est essentielle afin d'empêcher le rejet qui proviendrait

des attaques sur les antigènes des groupes sanguins qui sont aussi présents sur la plupart des

cellules de l'organisme (Depelchin A., Irnmunobiologie, 1997,4530487).

Dans un deuxième temps, il faut déterminer le niveau de compatibilité des antigènes

du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) du donneur et du receveur, A l'aide d'un

typage sérologique et moléculaire. Dans les cas ou la transplantation nécessite des tissus

contenant des cellules nuclées, la réponse des cellules T contre les antigènes très

polymorphes du CMH induit pratiquement toujours une réaction contre l'organe greffe

(Depelchin A., lrnmunobiologie 1997). La compatibilité du CMH du donneur avec celui

du receveur augmente le taux de réussite des greffes, néanmoins, une compatibilité parfaite

n'est possible qu'entre un donneur et un receveur apparentés. De plus, même dans ce cas

des differences génétiques portant sur d'autres loci déclenchent parfois un rejet.

Les antigènes d'histocompatibilité représentent la cible majeure de la réaction

immunitaire. Ce sont principalement les produits des gènes du CMH ainsi que les produits

codés par les systèmes mineurs additionnés aux produits spécifiques des organes qui jouent

un rôle primordial dans le déclenchement de certains rejets tardifs et ce, malgré les

traitements immunosuppresseurs.

1.3 Les complications suite P une tmnsplantatioa

Les complications à la suite d'une transplantation rénale humaine résultent

principalement de la thérapie immunosuppressive. Les infections par les organismes Gram

négatifs sont communes, ainsi que les infections pulmonaires, provenant d'une variété

d'organismes incluant Candida, Aspergillus, Nocardia, Pneumocystis et Cytomégalovirus

sont courantes. Les infections bacteriemes et virales himinantes demeurent des causes de

complications chez ces patients (Marieb N.E., Anatomie et physiologie humaines, 1992).

Leur relation avec la défectuosité du système immunologique, en raison de

l'immunosuppression, est claire. Toutefois, la majorité des décès post-transplantation

rénale sont attribuables à des complications cardio-vasculaires en premier lieu et à des

complications néoplasiques en second lieu. Il y a aussi les complications en partie causées

par la thérapie aux corticostéroïdes qui provoque des problèmes gastro-intestinaux et des

effets secondaires cosmétiques, de I'osteoporose, de l'intolérance au glucose et de

l'hypertension artérielle. Sans oublier les leucopénies, les anémies et les jaunisses dérivant

de I'administration d'aziathioprine.

Une autre complication, a long terme, chez les allogreffds rénaux est le

développement de nephrosclérose avec prolifération de l'intima des vaisseaux sanguins, de

la fibrose intimale et une diminution marquée de la lumière des vaisseaux. Ceci se traduit

par une ischémie rénale, de l'hypertension, une atrophie tubulaire, de la fibrose interstitielle

ainsi qu'une atrophie glornérulaire entraînant uw diminution de la fonction du greffon. Les

Iésions vasculaires et l'atrophie glornérulaire sont sans doute le résultat de plusieurs

épisodes de rejet ayant laissés des dommages aux capillaires ainsi qu'à l'endothélium

vasculaire (Marieb N.E., Anatomie et physiologie humaines, 1 992).

La thérapie immunosuppressive favorise malheureusement l'existence et la

propagation des tumeurs malignes. Par conséquent, l'arrêt du traitement

immunosuppresseur déauira la tumeur et le rein. Donc pour assurer le succès de la greffe

et la survie du patient, l'immunosuppression doit être suffisante pour contourner le rejet,

sans toutefois, être trop agressive et toxique. De plus, il est nécessaire d'avoir recours aux

antibiotiques pour maîtriser les infections.

1.4 Le rejet

Depuis les études entreprises par Medawar sur les bases imrnunologiques du rejet de

l'allogreffe, les réponses alloimmunes se sont avérées être très complexes et la nature

précise des différents mécanismes effecteurs échappe encore aux imrnunologistes.

Medawar, Brent et Billingham montraient que des animaux rendus tolérants à leur

naissance par l'injection de cellules allogéniques, ne rejetaient pas les greffes de peau du

même donneur. Ce double concept de rejet et de tolérance continue, en grande partie a

gouverner l'immunologie de la transplantation. Cependant, la complexité de ces deux

phénomènes reste telle que leur l'élucidation complète est encore lointaine (figure 1.6, 1.7)

(Billigharn RE., et al., Pric R Soc. Lond(B) 1954).

Les dommages causés à l'allogreffe se font par des mécanismes irnmunologiques

spécifiquement cellulaires et humoraux ainsi que par une variété de mécanismes

inflammatoires non spécifiques (Tilney N., et ai., Immunol. Rev., 1984). Le rejet est

suspecté dans les cas où le patient a une élévation de créatinine dans le sang, une

diminution du volume urinaire et une augmentation de tension artérielle ainsi qu'une chute

de la natriurèse (Marieb N.E., Anatomie et physiologie humaines, 1992). À cela

s'accompagnentjièvre, douleur et enflement au niveau du greffon. Le plus difficile est de

faire la discrimination entre un cas de rejet aigu et un cas de néphrotoxicité aux

immunosuppresseurs (généralement, la cyclosporine A). De plus, dans les cas où les

fonctions de I'allogref5e sont diminuées. il peut y avou présence d'infection et la plus

fréquente est celle au cytomégalovirus (CMV) (Plan K., et al., I. exp. Med., 1982).

lusqu'a maintenant, le diagnostic définitif du rejet de ITallogrefTe rénale, se base sur

des critères cliniques et histologiques. L'examen immunochimique des spécimens de

biopsie est routinière dans plusieurs centres dans le suivi des fonctions du grefnon ainsi

que dans l'évaluation locale du processus de rejet. Les spécimens de biopsie sont analysés

d'après la charte internationaie de Banff qui regroupe les critères histologiques permettant

de diagnostiquer tous les types de rejet de l'allogreffe rénale. Cette charte fut établie par

un groupe de pathologistes rénaux, de néphrologues et de chirurgiens à Banff en 1991

(Solez K., Yamaguchi Y., et al., Kidney International, 1993). Toutefois, la biopsie n'est

pas sans risque et n'offre pas l'opportunité d'étudier la dynamique de l'expression des

cytokines dans le système immunitaire confontré à l'allogreffe (Kraus et coll.,

Transplantation Proceeding, 199 1 ; Rukavina D., et coll., Transplantation, 1996).

PROLIFERATION DES CELLULES T

Figure 1.6. Induction de la tolérance cellulaire face à l'antigène

CPA CELLULE T

'CE DE A

I 4- ÉTAPE : BLESSURE AU REIN

S-ETAPE : REJET

Figure 1.7. Étapes menant au rejet de I'allogreffe rénale

II existe plusieurs types de rejet. Le reiet hvwrainu est considéré comme étant un

événement majoritairement humoral irréversible qui se manifeste par une interaction

rapide, dans les minutes qui suivent la transplantation, entre les anticorps cytotoxiques

circulants du receveur et les antigènes du greffon exprimés en prédominance sur

l'endothélium vasculaire. Il est rarement rencontré aujourd'hui, étant donné les tests de

compatibilité effectués avant la greffe. Ce type rejet est surtout rencontré dans les

xénogreffes (Tilney NL., et al., Annual Surg. 1990).

Le reiei aim est celui sur lequel mon étude porte. Le rejet aigu est majoritairement

cellulaire et réversible. De façon générale, il survient dans les 6 mois pst-transplantation

et il est caractérisé par de l'œdème et par I'infiltration de cellules mononuclées qui

relâchent des cytokines dans l'interstitium rénal (Plan K., et al., J. Exp. Med., 1982).

Finalement, le reiet chroniuue est la conséquence d'une suite de traumatismes subis

par le rein. Par exemple, plusieurs rejets aigus qui ont été mal traités ou traites trop

tardivement ont laissé des lésions sur le greffon. Le rejet chronique se manifeste

normalement après des mois et voir même des années à la suite de la transplantation. Ce

type de rejet conduit à une fibrose graduelle du greffon et se manifeste par le déclin des

fonctions du rein. De plus, il serait essentiellement a médiation humorale et

malheureusement, il conduit souvent à la perte du greffon (Tilney N., et al., Annual Surg.

1990).

Avant tout, le rejet est la conséquence de la réponse du système immunitaire qui

réagit a la présence des cellules du greffon du d o ~ e u r en utilisant ~'~mrnunité cellulaire et

l'immunité humorale (figure 1.8).

Figure 1 .S. Vue d'ensemble du processus immunologique conduisant au rejet

1.4.1 Le rejet à médiation cellulaire

Les mécanismes du rejet aigu de l'allogreffe rénale impliquent de multiples

réactions tant cellulaires qu'humorales. Néanmoins, le rejet aigu semble être de façon

prédominante une réponse à médiation cellulaire qui est initiée par la recomaissance

spécifique par les macrophages et les précurseurs des cellules T auxiliaires de l'dloantigène

exprimé sur l'organe du d o ~ e u r et conduit a la destruction du rein.

Les lymphocytes dérivés du thymus ont un rôle essentiel dans le rejet aigu de

I'allogreffe rénale. Une étude a montré, dans un modèle de transplantation expérimentale,

que les receveurs dépourvus de cellules T étaient incapables de rejeter l'allogreffe. Par

contre, si cette déficience était comblée par des cellules T syngéniques, il y avait

automatiquement rejet de la greffe (Hall B., Dorsch S., Irnmunol. Rev. 1984; Tilney N., et

al., Imrnunol. Rev. 1 984; Loveland B., Mckenzie I.,Transplantation 1982; Rolstad B., Ford

W.,Transplantation 1974).

Le rejet de l'dlogreffe est associé à l'infiltration des lymphocytes T CD4+ a

l'intérieur du greffon (Podack ER., et al.,Transplantation, 1996). Ces cellules sont connues

pour produire des facteurs solubles servant de messagers popularisés sous le nom de

cytokines. Les cytokines paraissent jouer un rôle majeur dans le rejet aigu de l'allogreffe.

Cependant, les cytokines spécifiques initiant le rejet aigu demeurent encore mai connues

(Nast CC., et al., Transplantation, 1994). Cliniquement, le rejet aigu a été associé a

l'augmentation de la sécrétion des cytokines IL-2, IL-4, IL-6, IL- I O dans le sérum ainsi que

dans l'urine et à l'augmentation de leur expression génique chez des patients ayant subi ce

type de transplantation.

Les cellules T auxiliaires (Tho) activées peuvent être segréguées en trois sous-

classes distinctes, Les Tho deviement Th1 sous I'influence de l'IL-2 et ils deviennent Tfi2

sous l'influence de l ' IL4 II existe a w i une troisième soustlasse appelée Th3 qui n'est

pas encore bien connue. Chacune des sous-classes développent différentes cytokines ayant

des propriétés uniques ainsi que des rôles propres. Par exemple, les Thl fabriquent l'IL-2,

I'INFy et le W F P . Tandis que les Th2 synthétisent plutôt l'IL-4, l'IL-5, l'IL-6, l'IL40 et

l'IL- 13 (Julius M. Cnw, Robert E. Lewis, Atlas of immunology, 1999).

Lechler et Batchelor ont proposé deux voies de reconnaissance. La reconnaissance

directe où les cellules T du receveur reconnaissent l'dlo-CMH intact à la surface des

cellules du donneur. La reconnaissance indirecte OU les cellules T du receveur

reconnaissent l'alloantigene processé et présenté par les cellules présentatrices d'antigènes

(CPA)( Lechler R. Batchelor J., J. Exp. Med. 1982). En réponse à la liaison des molécules

de costimulation à la surface des cellules T et des cellules B, les cellules T deviennent alors

activées (figure 1.9).

De façon plus détaillée, dans la reconnaissance indirecte, les alloantigènes du

donneur, I'allo-CMH et les antigènes mineurs d'histocompatibilité ainsi que les antigènes

spécifiques au tissu sont relâchés par le greffon et par la suite, captes par les CPA du

receveur et présentés aux cellules T CD4+ (Lechler R. Batchelor J., J. Exp. Med. 1982). Par

la suite, un second signai appelé la costimulation est nécessaire et indispensable à

l'activation et à la prolifération des cellules T. Cette costimulation provient de l'interaction

de la molécule de surface CD28 à la surface des cellules T avec son ligand, un membre de

la famille 87 à la surface des CPA (Pattison J.M., Krensky A. M., Am. J. Med. Sci., 1997).

Les cellules Th0 maintenant activées se divisent sous l'influence de l'IL-2 ou de

l'IL-4 qui agissent comme messagers en procurant les signaux nécessaires à la croissance et

à la maturation des effecteurs Th1 qui deviendront des lymphocytes T cytotoxiques et à la

maturation des effecteurs Th2 qui destineront leurs signaux activateurs aux lymphocytes B

(figure 1 .IO) (Vandensroeke C., et al., Transplantation 1991). Subséquemment, d'autres

cytokines comme l'IL-3, l'IL-4, l'IL-5, l'IL-6, I'IL-10, l'IL43 et l'My ainsi que l'IL-15

seront sécrétées. Il faut retenir que l'IL-2 est la clef de l'induction de la prolifération des

cellules T. De plus, cette cytokine est autocrine et paracrine, c'est-à-dire qu'elle a le

pouvoir de s'autostirnuler en plus de stimuler les autres cellules. L'IL-15, une chimiokine

qui a récemment été décrite comme étant un facteur de croissance sécrété par les

macrophages qui servirait de chimioattractant pour les cellules T. L'IL45 aurait une

activité biologique similaire a I'IL-2. L'IL-IS a des effets stimulateurs sur la prolifération

des lymphocytes T, des celluIes NK et des cellules B. Toutefois, a la différence de l'IL-2,

l'IL- 15 n'est pas sécrétée par les lymphocytes T (Baan CC., et al., Transplantation, 1998).

(macrophage)

Figure 1.9. Sensibilisation des lymphocytes T à l'antigène présenté à la surface des cellules présentatrices d'antigène (macrophages)

Présentation directe Présentation indirecte 6 ,

-- Y . ' !

IL-4, IL-5, IL6 IL-10, IL-13

. 1 ' I Immunité huma

Récepteur Fc

&*

Figure 1.10. Mécanismes de reconnaissance de l'allogreffe et activation de la réponse cellulaire

et humorale. CPA = Cellules présentatrices d'antigènes; Fus L = Ligand Fus; l W y =

Interféron I L 2 = Interleukine-2; IL4 = Interleukine-4; IL-5 = Interleukine-5: IL-6 =

Interleukine-6; I L 1 O = Interleukine-l O; IL-1 2 = Interleukine-1 2; IL- f 5 = Interleukine- I5; Per

= Perforine; GrB = Granzynte B; CMH I et II = Complexe majeur d'histocomp~~tibilité classe

1 et classe 2; T CD8+ = Cellules T cytotoxiques, T CD1+ = Cellules T auxiliaires; B =

Lymphocytes B.

Les celiules mediant la cytotoxicite (Lymphocyte T cytotoxique (CTL) et les

cellules hieuses (NK)) jouent un rôle qui n'est pas à négliger dans le rejet aigu et dans le

phénomène d'immunité reliés aux tumeurs. Trois à cinq jours suivant la recomaissance et

la liaison aux cellules cibles (cellules du greffon) les CTLs et les NKs sécrètent des

cytokines qui attirent d'autres lymphocytes au site de la greffe. Les CTLs et les NKs

relâchent des molécules cytolytiques telles que des sénnes protéases et des perforines qui

vont perforer la membrane cellulaire et induire la lyse des cellules du greffon (figure 1.1 1)

(Lechler R. Batchelor J.J.exp.Med. 1982 ; Julius M. Cruse, Robert E. Lewis, Atlas of

immunology, 1998). Ce type de cellule a une interaction directe avec la cellule cible et ne

nécessite pas l'aide des anticorps (Kourilsky P., Clavene LM., Immunol. 1989).

Deux mécanismes cytolytiques distincts par lesquels les CTLs détruisent les cellules

cibles aliogéniques ont été caractérisés. Un mécanisme implique un processus lytique

biphasique médié par les perforines. C'est-h-dire, que le processus comprend une phuse

d'adhésion qui est dépendante du Magnésium (Mg2+) et une phuse létale qui est

dépendante du Calcium (Ca2+). Dans la phase d'adhésion, la perforine est introduite dans

la membrane de la cellule cible. Dans la phase létale, les granules cytolytiques sont

relâchées à l'intérieur de la cellule orchestrant ainsi une lyse osmotique de la cellule cible

(Henkart P., Annu. Rev. Irnmunol., 1985 ; Spits H., et al., Sciences, 1986).

Le deuxième processus cytolytique est médié par les interactions Fas/Fas ligand qui

impliquent une liaison entre l'antigène Fas (CD95, APO-1) et le ligand Fas (Berke G.,

Immunol. Today, 1995 ; Nagata S., et al., Cell, 1993) (figure 1.12). Les cellules

cytotoxiques T et NK peuvent utiliser les mécanismes médiés par les perforines et le Fas L

pour ainsi détruire la cellule cible. Selon certaines recherches, le niveau d'expression de

1'ARNm du Fas L et de la perforine corrélerait directement avec la sévérité histologique du

rejet aigu ( S h m a V., et al.,Transplantation, 1996). Ceci serait une évidence que dans la

population des cellules T, la cytotoxicité médiée par le Fas L est principalement une

fonction des cellules TCW+ (Berke G., Cell, 1995 ; Berke G., Human immunology, 1997).

CELLULE CIBLE

Figure 1 . 1 1 . Mécanisme cytolytique de la lyse des cellules du greffon médié par 1aPerfonne et les Granzymes

I APOPTOSE

Figure 1.12. Processus cytotoxique médié par les interactions Fas/Fas L

1.4.2 Le rejet à médiation humorale

Les premiers efforts sérieux en transplantation des tissus et organes ont pris place

très tôt au 19e siècle. En 1946, Medawar a décrit un rejet accéléré en réponse à une greffe

de peau chez des lapins préalablement stimulés avec le sang du donneur. Pour faire suite a

cela, il décrit le processus de rejet aigu chez des animaux qui n'avaient pas été sensibilisés

(Medawar PB., British Journal of experimental Pathology, 1946). Le rejet accéléré pour

les greffes vascularisées fut rapporté par Simonsen et collaborateurs en 1958. Ils ont

montré qu'à la suite d'une seconde transplantation provenant du donneur original canin,

l'organe était rejeté plus vite que dans la première greffe (Simonsen M., et al., Acta

Pathologica et Microbiologica Scandinavica, 1953). En 1 966, Kissmeyer-Nielsen et

collaborateun ont observé un rejet aigu accéléré chez l'humain ayant subi une greffe de

rein (Kissmeyer-Nielson F., et al., Lancet., 1966). Par la suite, plusieurs études ont été

entreprises afin d'élucider ce phénomène.

Jusqu'à ce que les anticorps dirigés contre I'dlo-CMH furent décrits en 1958,

plusieurs allogreffes rénales furent réalisées chez des receveurs qui étaient sensibilisés aux

alIoantigènes du donneur. Ces receveurs avaient quelquefois des anticorps préformés

contre le CMH du donneur ce qui conduisait en un rejet très rapide de la greffe

ultérieurement à la revascularisation. Des anticorps et des molécules de complément

étaient détectés dans le tissu greffé. Ce phénomène est en fait appelé rejet hyperaigu

comme j'ai mentionné plus tôt. Maintenant, on vérifie la présence d'anticorps dirigés

contre les antigènes du receveurs chez tous les receveurs potentiels (Male D., et al.,

Advanced immunology, 1990).

Des observations suggèrent que l'immunité conférée par les cellules B n'est pas

suffisante pour médier le rejet de l'allogreffe. L'habilité des anticorps à infliger des

blessures à la greffe a été impliqué dans la pathogenèse des rejets hyperaigus, aigus et

chroniques (Baldwin W., Sanfillipo F.,Transplant Proc., 1989). Ces phénomènes ne sont

pas entièrement nets. Cependant, on peut croire que les produits des cellules B participent

activement a plusieurs types de rejet. De futures études mettront l'accent sur le rôle et la

collaboration entre l'immunité cellulaire et l'immunité humorale lors du rejet.

La réponse des cellules B, tout comme celle des cellules T est spécifique aux

antigènes et s'ensuit de la production d'anticorps de hautes affnités (Turka

L.A.,Transplantation and immunology letter, 1996). Toutefois, la réponse des B contre les

antigènes de la membrane commence avec la liaison de l'antigène aux récepteurs des

immunoglobulines présents à la surface de la cellule B. Par la suite, l'antigène est

intemalisé dans la cellule. Pour initier l'activation des cellules B, la présence des molécules

de costimulation est nécessaire. Cependant, l'identité de ces molécules de costimulation

n'est pas bien connue encore, mais l'on croit que la molécule CD28 et la paire B7BBl

seraient des candidats favorables. Ces événements initient l'expression du ligand CD40 sur

la cellule T ainsi que la sécrétion des cytokines TNFa, IL-2, I L 4 et IL-IO.

En parallèle, le CMH du donneur est reconnu par des immunoglobulines de surface

spécifiques et il est intemalisé puis présenté aux cellules T CD4+, maintenant apte a

répondre aux peptides du donneur. L'interaction du CD40 avec son ligand stimule la

cellule B à devenir réceptive aux cytokines produites par la cellule T. Par la suite, les

cellules B subissent une expansion clonale, prolifêrent et produisent des anticorps qu'elles

sécrètent ensuite. Ainsi, ces interactions conduisent a une réponse effectrice des anticorps

seulement en présence de l'aide des cellules T (figure 1.13) (Campbell and Halloran, Atlas

of immunology, 1998).

CPA

CELL 14 LE B

PLASMOCYTES

Figure 1.13. Activation de la réponse effectrice des anticorps suite à la sensibilisation des cellules T à l'antigène

Les cellules T CD4+ sont déjà activées grice à la présentation des peptides

antigéniques par les CPAs (cellules dendritiques de l'hôte). Les CPAs du donneur peuvent

présenter les peptides du donneur dans le cadre du CMH classe 11 de celui-ci et recruter

l'aide des cellules T pour la réponse anticorps. Néanmoins, ceci n'est pas encore bien

définis (Fuleihan R., et al., I. Clin. Invest. 1994).

Pourtant, les anticorps peuvent jouer un rôle indirect dans la destruction de la greffe.

La liaison des anticorps aux monocytes peut amener une destruction des tissus par un

phénomène de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Plusieurs

évidences de cette activité ont été montrées h vitro hitivement après la transplantation.

Ceci est toutefois, à démontrer dans un modèle in vivo (Male D., et al., Advanced

imrnunology , 1 990).

Chez les receveurs d'une transplantation humaine, I'ADCC spécifique dirigée

contre le donneur a été associée au rejet dans plusieurs études (LafEerty K., et al., AMU.

Rev. Immunol., 1983 ; Stiller C., et al., Transplant. Proc., 1977). D'autres recherches ont

démontré qu'il y avait de I'ADCC spécifique à l'endothélium et ce, même dans des cas de

rejet de greffe où le HLA est identique (Miltenburg A., et al.,Transplantation, 1989).

Quelques rapports ont aussi démontré la présence d'ADCC antidonneur chez des receveurs

qui avaient un greffon fonctionnel. D'autres ont suivi la réaction ADCC ant ido~eur chez

plusieurs patients transplantés sur une période de 2 à 10 ans post-transplantation et ils ont

trouvé une association très significative avec les symptômes cliniques et histopathologiques

du rejet chronique (Thomas J., et al., Transplantation, 1976). Les receveurs chez qui on a

noté une réaction ADCC pouvaient avoir un greffon fonctionnel par contre, éventuellement

la réaction ADCC conduisait à une détérioration du greffon. L'ADCC se révèle être un

mécanisme auxiliaire effecteur hautement sensible qui pourrait jouer un rôle important dans

le rejet chronique chez les hôtes immunosupprimés (Slakey DP., Thomas JM., Kidney

Transplant rejection, 1998).

Les dommages médiés par les anticorps sur l'endothélium vasculaire peuvent aussi

être engendrés par des mécanismes effecteurs non spécifiques comme le complément, la

coagulation, les cellules phagocytaires ainsi que leurs produits. La médiation par les

anticorps pourrait causer des lésions à l'endothélium vasculaire à travers des enzymes

lysosomales relâchées par la dégranulation des plaquettes ou par l'action direct du

complément fixé au cellules liées aux anticorps (Thomas HW., et al., Am. J. Med. Sci.,

1997).

1.4.3 Les mécanismes inflammatoires non spécifiques

Le rejet de I'allogreffe met en cause des fonctions antigènes spécifiques et des

fonctions antigènes non spécifiques de la part des cellules irnmunocompétantes et de leurs

produits solubles. Les cellules participant au rejet sont des cellules effectrices distinctes

phénotypiquement et fonctionnellement. De plus, la prédominance d'un type de cellule ou

d'un mécanisme est fonction d'une multitude de facteurs.

La réponse d'hypersensibilité de type retardée @TH) peut être considérée comme

un exemple de l'efficacité des composantes de la réponse immune non spécifique. Plusieurs

cellules T auxiliaires spécifiquement sensibilisées par le recrutement des cellules effectrices

non spécifiques mènent à la destruction du tissu. Dans la réponse Dm, les cellules T

auxiliaires activées en réponse a la rencontre de l'antigène sécrètent plusieurs cytokines qui

vont recruter des cellules effectrices non spécifiques du système immunitaire. Les plus

nombreuses sont les macrophages qui agissent pour éliminer l'antigène. (Adams DO.,

Hamilton TA., Annu. Rev. Immunol., 1984).

Une fois recrutés, les monocytes du sang se différencient en macrophages activés

sous l'influence de I'iNFy. Les macrophages activés sont affectés à l'élimination de

l'antigène nominal de différentes façons. Premièrement, ils peuvent directement éliminer

l'antigène nominal par la phagocytose (figure 1.14a).

Deuxièmement, les macrophages peuvent attirer des cellules non spécifiques

additionnelles en sécrétant des médiateurs infiarnrnatoires de courte demi-vie comme les

neutrophiles, les facteurs activateurs des plaquettes (PAF), les prostaglandines, les

leucotriènes ainsi que les lipides (figure 1.14b). PAF a un large spectre d'activité allant de

l'agrégation à l'activation des plaquettes et des neutrophiles. Aussi, il augmente la

perméabilité vasculaire et la libération d'amines vasoactives. PAF a aussi été décrit comme

étant un médiateur clef dans la pathogénèse du rejet hyperaigu médié par les anticorps

(Thomas HW., et al., Am. J. Med. Sci., 1997).

Troisièmement, les macrophages peuvent devenir des CPAs plus efficaces,

principalement via une augmentation de l'expression des molécules de surface du CMH de

classe II (figure 1.14~). Finalement, les macrophages peuvent sécréter des cytokines telles

que le TNFa et l'IL-1 qui vont augmenter la réponse immune cellulaire. De plus, !es

macrophages peuvent sécréter des cytokines telles que le facteur de croissance transformant

bêta (TGFP) ainsi que le facteur de croissance des prostaglandines (PDGF) lesquels

stimuleront la fibrose du tissu (figure 1.14d) (Sabatine MS., Auchincloss H. Ir., Solid organ

transplant rejection, 1997).

Ces composantes non spécifiques peuvent être directement ou indirectement reliées

aux fonctions de la sous-classe de type Th1 et associées aux produits cytokines IL-2, IL-3

et INFy. L'IL-2 amplifie les cellules T alloréactives et augmente l'activité cytotoxique des

CTLs, des NKs, des LAKs et des anticorps en fonction des cellules tueuses présentes au

site de la greffe (Smith K., Sciences, 1988 ; Erard F., et al., J. Immunol., 1985). Tandis que

l'IL-3 induit l'expression de Thy-1, une glycoprotéine de surface exprimée par les

lymphocytes et aussi présente à la surface des neurones et des fibroblastes qui a pour rôle

de promouvoir l'expansion des macrophages et des monocytes (Chen B., Clark C.,

J.Irnmuno1.,1986). Les cellules T activées sécrètent l 'My, un amplificateur potentiel de

l'expression des gènes de classe II et des fonctions sécrétoires des macrophages (Bashan T.,

Mengan T., J.Immunol., 1983). Les macrophages et les monocytes ainsi activés produisent

le facteur nécrosant des tumeurs (TNF), qui participe davantage à la destruction du tissu

(Hori K., et al., Cancer Res., 1987).

Augmentation du CMH II

Figure 1.14. Différents mécanismes inflammatoires non spécifiques utilisés par les

macrophages activés pour éliminer l'antigène nominal a : la phagocytose; b : recrutement

de d'autres cellules non spécifiques; c :augmentution des molécules de surfce du CMH

classe II; d : augmentation de la réponse cellulaire.

1.5 Le phénomlae de tolérance

Dans le contexte de la transplantation d'organe, la tolérance peut être définie

comme étant un état sans réponse immune allospécifique favorisant le maintien des

fonctions initiaies du greffon sur une période indéterminée. Présentement en clinique, on

est incapable d'induire cette situation de tolérance, on est donc forcé d'utiliser une thérapie

irnmunosuppressive à long terme qui expose le patient à différent risque d'infection et au

développement de néoplasie. Conceptuellement, il existe trois mécanismes de base

impliqués dans le développement de la tolérance des cellules T, la délétion clonale des

cellules, l'anergie et la suppression (Arnold B., et al., Imrnunol. Today, 1997 ; Kabelitz D.,

Janssen O., Front Biosci., 1997).

La déléfion clonate est la base centrale de la tolérance, la mort des cellules T peut

aniver dûe à l'absence des gènes de division des cellules (bcl-x) ou par une induction active

de la mort programmée médiée par la protéine Fas (Tompson CB., Science, 1995 ; Nagata

S. and Golstein P., Science, 1995). Plusieurs tissus comme la cornée et les testicules

bénéficient d'un état immun privilégié, c'est-à-dire, qu'ils ne rejettent pas la transplantation

même avec un CMH différent du d o ~ e u r (Kabelitz D., Transplantation, 1998). Ceci

suggère qu'un haut niveau d'expression du Fas L sur l'organe greffé serait suffisant pour

induire la tolérance, vraisemblablement grâce aux interactions Fas/Fas L qui envoient des

signaux de mort a u cellules infiltrantes évitant ainsi la destruction de l'organe (figure

1.15).

L'anergie est définie comme étant un état actif de l'absence de réponse spécifique.

Une cellule T anergique ne devient jamais activée et ne prolifëre pas en réponse à

l'exposition à un antigène spécifique.

La suppression est définie par l'habileté des cellules provenant d'un animal tolérant,

qui après avoir été transférées dans un animai possédant des cellules à l'état naïf supprime

la réponse immunitaire de celui-ci. Il existe aussi un autre mécanisme, le microchimérisme

qui fait référence à la persistance permanente d'un petit nombre de cellules

hématopoïétiques provenant du donneur présentes chez le receveur. Toutefois, il est

possible que le microchimérisme soit la conséquence de la tolérance chez les animaux qui

ne peuvent éliminer les cehles du d o ~ e u r a travers une réponse immune normale

(Shreeram A., Turka L.A., Am. J. Med. Sci., 1997).

SIGNAL DE MORT @+

Figure 1.15. Interaction Fas-Fas L dans l'induction de la tolérance

1.6 Les immunosuppresseun

L'immunosuppression est décrite comme étant l'administration de drogues qui

enmanent une profonde dépression de la réponse immunitaire chez des patients qui ont une

maladie auto-immune ou qui ont subi une transplantation ou bien chez des patients qui ont

fait l'utilisation de ces drogues dans un traitement contre toute autre forme de maladie où

l'on est dans l'obligation de supprimer en partie, les réactions immunitaires (Campbell and

Halloran, Atlas of immunology, 1998).

La découverie des miathioprines ainsi que leur utilisation combinée aux

glucocorticostéroides ont amené une ère nouvelle dans la transplantation d'organe.

Pourtant, la toxicité introduite par ces immunosuppresseurs s'est vite faite c o ~ a î t r e et

constitue une limitation importante du traitement. Par exemple, on s'est aperçu que les

azathioprines induisaient une leucopénie et qu'un excès chronique de glucocorticostéroides

induisait le syndrome de Cushing (Ryffel B., et al., Solid organ transplant rejectionJ997).

La découverte de la cyclosporine et son introduction en clinique en 1978 f w n t une

percée qui a permis de contrôler I'immunosuppression qui était employée chez les patients

transplantés (Borel JF., Pharmacol. Rev. 1989 ; Morris PJ., Curr.Opin. Immunol., 1991).

Toutefois, cette drogue a plusieurs propriétés néphrotoxiques et doit être prise à dose

réduite, à long teme. Cet agent immunosuppresseur, peut augmenter les risques de

développer des lymphomes reliés au virus Epstein-Barr (EBV) ainsi que d'autres

lymphomes associés aux cellules B (Campbell and Halloran, Atlas of immunology, 1998).

Néanmoins depuis 1990 sont apparus de nouveaux immunosuppresseurs à action

sélective et puissante qui conferent une plus grande capacité de prévention du rejet aigu et

par conséquent, du rejet chronique (FK506, Mycophéno fate moftii, Brequinm,

Rrrpamycine, . . .) et l'intérêt pour ceux-ci est présentement en évaluation (Baumann G.,

Borel J.F., Med. Sci., 1992).

Tableau 1 .1 Immunosuppresseurs utilisés en transplantation rénale

Corticostéroïde : Une hormone stéroïde lympholytique dérivée du cortex adrénal.

Cytotoxique pour les sous-populations de lymphocytes T sélectionnés et aussi capable de

supprimer l'immunité cellulaire et la synthèse d'anticorps ainsi que la formation des

prostaglandines et leucotriènes. Élimine l'inflammation (figure 1.16).

Aziathioprine : Un nitroimidazole dérivé du 6-mercaptopurine, un antagoniste des purines

où sa principale action est d'interférer avec la synthèse d'ADN. Il est aussi un meilleur

inhibiteur de la réponse cellulaire que de la réponse humorale et diminue le nombre de NKs

circulants (figure 1.17).

Cyclosporine (cycIosporine A) : Un endécapeptide cyclique isolé des champignons de la

terre et son action principale est de supprimer la synthèse de l'interleukine-2. Il affecte les

cellules T CD4+ sans altérer l'activité des cellules T suppressives, des cellules B, des

granulocytes et des macrophages (figure 1.18).

FKjO6 : Le FKSO6 est synthétisé par le micro-organisme Steptomyces tsukubaenris

ressemblant à la cyclosporine. Il interfêre avec la synthèse de l'IL-2 ainsi qu'avec sa

liaison. Cependant, il est 50 fois plus puissant que la CsA et tout comme la CsA, il a un

potentiel néphrotoxique et peut même avoir des effets neurotoxiques en plus d'avoir un

potentiel diabétogénique (figure 1 .19).

Rapamycine : Dérivé du champignon des sols de Rapa Nui sur l'île Easter c'est un

immunosuppresseur &ès puissant qui supprime la prolifération des lymphocytes B et T, la

synthèse des lymphokines ainsi que la réponse des cellules T A l'IL-2 (figure 1.20).

Brequinar de sodium (BQR) : Agent antinéoplasique et immunosuppresseur développé en

laboratoire. En transplantation, il inhibe autant la réponse humorale que cellulaire de l'hôte

et supprime efficacement le rejet aigu médié par les anticorps (figure 1.2 1).

Mycophénolate rnofëtil : Un morpholinoéthyl ester de l'acide mycophénolique qui bloque

la prolifération des cellules mononuciees du sang périphérique ainsi que la division des

cellules B et T. Il bloque aussi la formation des anticorps de même que la glycosylation

des molécules d'adhésion qui facilitent l'attachement des leucocytes aux cellules

endothéliales. Il prévient aussi la génération des cellules T cytotoxiques. Des études

récentes ont démontré que l'utilisation du Mycophénolate en synergie avec la CsA et le

Prednisone conduisait à une diminution marquée du rejet de l'allogreffe comparativement à

la combinaison de ces drogues sans le Mycophénolate (figure 1.22).

Orthoclone OKT3 : Un anticorps monoclonal commercial de souris dirigé contre le

marqueur de surface CD3 des cellules T. Il diminue la réactivité des cellules T et agit de

concert avec le système du complément pour induire la lyse des cellules T. II peut aussi agir

comme une opsonine rendant ainsi les cellules T susceptibles d'être phagocytes (figure

1 .Z).

(Campbell and Halloran, Atlas of immunology, 1998 ; Marieb N.E., Anatomie et

physiologie humaine, 1992).

Plusieurs classifications des agents xénobiotiques disponibles jusqu'à présent, ont

été proposées en fonction du site d'action employé pour bloquer la réponse immune. Dans

la première classe, on retrouve les inhibiteurs de la transcription des cytokines soit la

cyclosporine et le tacrolimuî, dans la deuxième classe on a, les inhibiteurs des signaux de

transduction des facteurs de croissance, le sirolimuï(Rapamycine) et le iejunomide, dans la

troisième classe on trouve les inhibiteurs de la synthèse des nucléotides c'est-à-dire, le

Mycophénolate rnofétil, les miathioprines, le Brequinar, le miroribine et le lejunomide,

dans la quatrième classe on note, un inhibiteur de la différentiationlmaturation cellulaire

soit le déoxyspergualine et dans la dernière classe on a les agents biologiques qui inclus les

préparations arttilym@xytes po&c/onawr et les anticorps monocionaux (figure 1.24)

(Kaplan NM., et al., The American journal of the medical sciences, 1997).

Figure 1.16. Structure chimique des corticostéroïdes

Figure 1.17. Structure chimique des azathioprines

Figure 1.1 9. S tnicture chimique du FU06

Figure 1.20. Stnicture chimique de la Rapamycine

CO, Na

I 2' 7 F

1L

5'

Figure 1.2 1 . Structure chimique du Brequiw sodium / 6"'-

Figure 1.22. Structure chimique du Mycophénolate mofétil

Figure 1.23, Interaction des anticorps anti-CD3 (OKT3) avec le CD3 à la surface des cellules T

RECONNAISSANCE A~GINIQUE :

ANTICORPS MONOCLONA UX ANTI- CELLULE T (OKT3)

CELLULE MÈRE

CYCLOSPORINE AW THIOPRINE PREDNISONE \ RA PAM YCINE BREQUINAR SODIUM MYCOPHENOU TE MOFETJL

GLOBULINE W ANTIL YMPHOCYTiQUE

Figure 1.24. Sommaire des sites d'action des drogues immunosuppressives

Donc, une foule d'agents imrnunosuppresseua sont disponibles pour le traitement à

la suite d'une transplantation rénale. Le traitement offre l'opportunité d'utiliser différents

composés qui agissent à des étapes différentes de la réponse immune. La sélection d'une

stratégie immunosuppressive particulière pour un patient donné est complexe et nécessite

une étude particulière des options éventuelles. Dans le but d'améliorer, à long terme, les

perspectives de réussite à la suite d'une transplantation rénale, le choix d'une thérapie

immunosuppressive se pense en trois étapes : il y a I 'induction de la thérapie, oii celle-ci est

appliquée très tôt après la transplantation, il y a la thérapie untirejet qui est intense et

concentrée sur une période limitée et la période de maintenance de la thérapie qui est de

longue durée et dont le but est de prévenir le rejet ainsi que les dommages à l'allogreffe

(Kaplan NM., et al., The American journal of the medical sciences, 1997).

Chapitre 11

LES MOLÉCULES CYTOTOXIQUES

2.1 Introduction

Les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) sont, plus spécifiquement, des lymphocytes

T sensibilisés qui sont normalement de phénotype CD8+. Ils reconnaissent l'antigène sur

les cellules de l'hôte à l'aide de leur récepteur de surface (TCR). La reconnaissance

cellulaire de la cellule cible par les cellules T CD8+ se fait dans le contexte du CMH de

classe 1. A la suite de la reconnaissance et de la liaison des effecteurs a la cellule cible, la

mort de la cellule survient rapidement.

Consécutivement aux interactions entre les effecteurs et la cellule cible, les CTLs

sécrètent des cytokines qui attirent d'autres lymphocytes sur les lieux. Les CTLs relâchent

des granules cytotoxiques de types protéases sérines et deoxyribonucléases telle que les

Perforines (P) et les Granzymes (Gr). Les Perforines se distribuent autour de la membrane

cible induisant ainsi de larges pores à la surface de celle-ci ce qui permet aux Granzymes

d'induire la lyse nucléaire de la cellule. Ce phénomène engendré par les molécules

cytotoxiques se nomme apoptrose (Julius M. Cruse, Robert E. Lewis, Atlas of immunology,

1998). Les lymphocytes T cytotoxiques tuent en menant a l'apoptose dans les minutes qui

suivent le contact avec leur cible par un processus qui ne requiert ni l'expression de

nouveau gène ou même la synthèse de protéine par la cellule cible (Peters PL, et al., Eur. J.

of Immunol., 1989). Le processus cytolytique des lymphocytes requiert 2 mécanismes

moléculaires distincts a action lytique rapide.

Le premier mécanisme lytique est régit par 1 'exocytose de granules. Les Perforines

sont des protéines lytiques sécrétées qui induisent des poly-pores dans la membrane de la

cellule cible. Les médiateurs solubles Perforines sont cosécrétés avec les Granzymes et

sont contenus dans des granules à l'intérieur du cytoplasme des lymphocytes T

cytotoxiques. Les Granzymes pénètrent la membrane de la cellule cible à travers ses pores.

L'entrée de la Granzyme B (GrB) dans la cellule cible via les pores crées par la perforine

active des proteines cibles qui catalysent des réactions conduisant au déclenchement du

processus qui mène à l'apoptose (Vasconcellos LM., et al., Transplantation, 1998).

Le deuxième mécanisme lytique est un processus nonsécrétoire qui implique un

ligand nommé Fas à la surface de la membrane. Le Fas Ligand est une protéine

transmembranaire faisant partie de la famille des facteurs nécrosant des tumeurs et il est

exprimé à la surface des lymphocytes T cytotoxiques. La liaison du Fas Ligand avec son

récepteur Fas à la surface de la cellule cible induit la mort par l'apoptose de la cellule cible

en déclenchant une cascade d'interactions protéine-protéine et d'activités protéolytiques

menant à l'oligornérisation d'une région cytoplasmique conservée (Vasconcellos LM., et

al., Transplantation, 1998; Berke G., Human Immunology, 1997; Wever PC., et al.,

Transplantation, 1998).

L'expression au site de la greffe de I'ARN messager codant pour la Perforine, la

Granzyme B, et le Fas Ligand a été associée A l'activité des lymphocytes T cytotoxiques et

s'est avérée être un marqueur sûr pour le diagnostic du rejet aigu de la greffe rénale

(Strehlau W., et al., Medical Sciences, 1997). Cependant, considérant la nature invasive de

la biopsie, l'application clinique de cette procédure est limitée.

Le but d'étudier ces molécules était dans un premier temps, d'explorer la possibilité

de préciser si l'expression des gènes de la P, de la GrB ou du Fas L à l'intérieur des cellules

mononuclées du sang périphérique (PBMCs) corrélait avec le diagnostic histologique du

rejet aigu de l'allogreffe rénale (Section 3.4).

Pour l'étude dont il est question dans ce chapitre, en premier lieu, nous avons voulu

nous assurer que la stimulation des PBMCs par un mitogène était nécessaire à la détection

d'un meilleur signal en employant la méthode de RT-PCR.

En deuxième lieu, nous avons voulu vérifier que cette stimulation n'entraianait pas

une fausse positivite du signal détecte. La nécessité de stimuler les PBMNs au préalable,

dans le but d'optimiser le signal de détection de d'autres cytokines qui proviennent

notamment, des cellules T auxiliaires et de d'autres cellules, est déjà connu. Le fait de

stimuler nous permet d'étudier la dynamique des cytokines dans le sang périphérique sans

avoir l'obligation d'utiliser de grande quantité I'ARN.

En troisième lieu, nous avons voulu analyser l'activité enzymatique de la GrB lors

du rejet à l'aide d'une nouvelle méthode de détection basée sur les réactions enzymes-

substrats. Cette nouvelle approche est simplifiée et permet de mesurer l'activité

enzymatique intracytoplasmique. Cette méthode est beaucoup plus rapide que la RT-PCR

et ne nécessite que très peu de sang. Cependant, ce procédé ne peut s'appliquer que lorsque

l'élément recherché est un enzyme. Puisque le principe de la méthode est base sur des

réactions enzymes-substrats, c'est la raison pour laquelle nous l'avons testé sur la

Granyme B un enzyme sécrété par les cellules cytotoxiques. Par la suite, nous avons

voulu comparer l'activité enzymatique de la GrB à l'expression génique de la GrB analysée

par la méthode de RT-PCR et ce, toujours en relation avec le rejet.

2.2 Objectifs spécifiques des travaux

Comparé l'expression des gènes de la P, de la GrB et du Fas L provenant des

PBMCs stimulées par un mitogene avec l'expression de ces mêmes gènes provenant de

PBMCs non stimules et observer le lien avec le rejet aigu (Section 2.4.1). Déterminer s'il y

a un lien entre I'expression génique de la molécule cytotoxique GrB étudiée par RT-PCR et

son activité enzymatique intracytoplasmique, étudiée par cytométrie en flux lors du rejet

aigu (Section 2.4.2).

2.3 Matériels et Méthodes

Patients et immunosuppression

Les échantillons sanguins ont été obtenus de 28 patients 2 fois. Une première fois

Ion du soupçon de rejet et deux semaines après les traitements immunosuppresseurs. Tous

les patients ont reçu une immunosuppression conventio~elle, soit un cocktail composé de

cyclosporine A (CsA), de Prednisone, de Solumédrol et de Mycophénolate mofétil. La

cyclosporine A (CsA-Neoral) a été donnée à une dose initiale de 8 mg/kg/jour et ajustée à

des taux sériques de 200 à 300 pg/L initialement puis par la suite les niveaux ont été réglés

et maintenus a une concentration de 150 à 200 pgL à long terne. Le Mycophénolate

mofetil à été donné à une dose initiale de 2g/jour et le Prednisone à lmg/jour. Tous les

patients ont aussi reçu du Diltiazem, un bloqueur des canaux calcique. Les stéroïdes ont été

administrés à 0'25 mg/kg/jour et diminués graduellement. Après 6 mois, la médication a été

réévaluée.

Un rejet aigu a été diagnostiqué chez 1 1 patients. Aucun épisode de rejet ou autres

complications n'ont été rapportés chez 12 autres patients. 5 patients présentant une

dysfonction de la greffe autre que le rejet (infections, néphrotoxicité aux

immunosuppresseurs, obstructions . . .) ont été rejetés. Les rejets ont été identifiés par un

diagnostic histologique et classifiés à l'aide des critères de Banff.

Préparation des PBMCs pour la RT-PCR

Les ceilules mononuclées du sang périphérique ont été isolés de 10-12 ml de sang

veineux périphérique, collectes dans des tubes héparinés et séparés par un gradient de

densité Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Biotech, Uppsala, Sweden). Les cellules rouges ont

été lysées par immunolyse (Coulter Clone, Miami, FL). Par la suite, les PBMCs ont été

lavées et resuspendues dans un milieu de stimulation (RPMI avec 10% de sénun AB et 1%

pénicilline/streptornycine/glutamine). Une partie des PBMCs (1 x 106cellules/ml) a été

activée in vitro avec la phytohérnagglutinine (Sigma, St-Louis, MO) à une concentration

finale de 1.25 pglml et incubée à 37OC, 5% CO2 pour une période de 18 heures dans des

flacons de culture de 25 cm2 (Falcon, Becton-Dickinson, USA). La seconde partie a été

incubée sans être activée à 37OC, 5% CO2 pour une période de 18 heures dans des flacons

de culture de 25 cm2.

Extraction de I'ARN et transcription inverse (RT)

L'ARN total a été extrait des PBMCs stimulés et des PBMCs non stimulés par la

méthode du TRlzol décrite par le fabricant (Gibco BRL, Gaithenburg, MD, USA). La

synthèse du premier brin d'ADN complémentaire (ADNc) a été réalisée dans un volume de

réaction de 20p1 contenant 400 ng d ' A m total, 200 ng d'Oligo dT et 0.5 rnM de chaque

dNTPs (Boerhinger Mannheim) ainsi que de 26 unités de RNAsin (Promega Fisher,

Québec, Canada) et 200 unités de MMLV-RT (Gibco BRL, Burlington, Ontario, Canada).

Analyse PCR

L'amplification PCR de I'ADNc synthétisée provenant de chacun des échantillons

s'est faite par les techniques standards. L'ADNc (0.8 pl) a été amplifiée dans un volume de

réaction de 25 pl contenant un tampon de 1.5 m M de MgC12 (Perkin Elmer), 0.2 mM de

chaque dNTPs, 0.5-0.75 unité de Taq polimérase (Perkin Elmer) et des amorces (Tableau

4.1). Les réactifs ont été addi t io~ds a chaque échantillon. Par la suite, ks échantillons ont

été agités. L'amorce d'actine a été utilisée tout d'abord, pour s'assurer du bon

fonctio~ement de la réaction de transcription inverse (RT) et également pour détecter ies

variations dans la quantité d'ADNc pour chacun des échantillons. Les échantillons ont été

amplifiés dans un cycleur thermal à ADN 9600 (Perkin-Elmer) programmé avec les

paramètres suivants : 3 min de dénaturation à 94OC, 1 min d'amplification à 58OC (45-60

sec.), à 72OC (45-60 sec.) et 5 min d'extension à 72OC. On a optimisé les conditions pour

chacune des amorces afin d'éviter une fausse apparence d'uniformité du produit.

Tableau 2.1. Séquences d'amorces utilisées pour la réaction de RT-PCR

GENE SEQUENCE D'AMORCE

fi-Actine S 5' CGT GAC ATT AAG GAG AAG CTG TGC 3' AS 5' CTC AGG AGG AGC AAT GAT CTT GAT 3'

Fas Ligand S 5' GGA TT% GGC CTG GGG ATG Tï ï CA 3' AS 5' TTG TGG CTC AGG GGC AGG TTG TTG 3'

GrB S 5' GAC TI% GTG CTG ACA GCT GCT CAC 3' AS 5' CGT CCA TAG GAG ACA ATG CCC TGG 3'

Perforine S 5' CAG TAC AGC TI% AGC ACT GAC 3' AS 5' ATG AAG TGG GTG CCG TAG TTG 3'

Analyse semi-quantitative

10 pl du produit amplifié et 500 ng du marqueur standard d'ADN pGEM (Proméga-

Fisher, Québec, Canada) ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 1.5%

contenant du bromure d'éthidiurn. Le gel a été photographie avec un Polaroid 667 de type

film et l'intensité des bandes a été analysée par densitometrie (BioImage-Visage 1 IOS - Millipore, AM Arbor, MI, USA). Pour comger les variations dans la concentration

d' ARNm de chacun des échantillons, les valeurs de densitornétrie pour chacune des

cytokines ont été divisées par la valeur de p-actine correspondante.

Analyses statistiques

Les comparaisons statistiques entre les groupes ont été réalisées par le test d'analyse

pairé "tu de Student et le test d'égalité des variances "f'

Réactions enzymatiques

(pour la détermination de l'activité enzymatique intracytoplasmique de In GrB)

Les échantillons sanguins analysés provenaient de 24 patients ayant subi une

allogreffe rénale. Ces patients provenaient du groupe de 28 patients étudiés pour l'analyse

des molécules cytotoxiques par RT-PCR. Sur ces 24 receveurs, seulement 3 rejets aigus

ont été diagnostiqués, 11 patients n'avaient aucun signe de rejet tandis que 10 patients ont

été rejeté car pour certains nous n'avions pas reçu le 2' prélèvement et d'autres présentaient

des infections.

A la réception des échantillons sanguins (10-12 ml de sang veineux), 1 ml a été

prélevé et destiné à l'analyse de l'activité enzymatique. Tout d'abord, les cellules ont été

lavées 3 fois avec une solution de PBS 1:10 (solution de phosphate de potassium et

chlorure de sodium) (Coulter Clone, Miami, FL) et centrifugées a 200g pendant 10

minutes. Par la suite, les cellules rouges ont été lysées par immunolyse (Coulter Clone,

Miami, FL) et les cellules restantes ont été resuspendues dans 1 ml de PBS à une

concentration finale de 3x10~ cellules/ml. Ensuite, 100 pl de la suspension cellulaire, 100

pl de PBS (contrôle -) et lOOpl de Cellzyme (contrôle +; cellules cellzyme dans une

solution saline Hank's balancée a 3~ 106 cellules/ml) (Coulter Corporation, Miami, FL)

préalablement incubés à 37'C ont été mis en présence d'un excès (4 nM) de substrat .

spécifique a la GrB (un dérivé des acides aminés Alanine-Alanine-Proline-leucine)

(Coulter Corporation, Miami, FL) (figure 2.1) pendant 10 minutes. Par la suite, le tout a

été mis sur glace pour trois minutes le temps d'arrêter la réaction. Les cellules ont ensuite

été fixées avec 125 pl de parafornialdéhyde (Coulter Clone, Miami, FL) pendant 1 minute.

Ensuite, on a procédé à la mesure de l'intensité de la fluorescence entre 504 et 541 nrn a

l'aide du cytofluorimètre.

Le principe de cette technique est base sur des réactions enzymes-substrats. Alors,

une fois le substrat ajouté, il pénètre à l'intérieur de la cellule et il se lie à la Granzyme B

engendrant ainsi une réaction enzymatique qui donne un produit final de réaction

fluorescent. Le dérivé de substrat est lié à la R h h i n e 10 1 . La Rhodamine 1 O 1 est une

molécule fluorescente qui est excitée entre 468 et 509 nrn et qui émet de la fluorescence

entre 504 et 541 nm. Étant donné que le substrat est en excès, plus il y aura de GrB, plus il

y aura de produit final et en conséquence, plus de fluorescence sera mesurée (figure 2.2).

Mesure de l'activité enzymatique

La mesure de l'activité enzymatique s'est faite au cytofluorimètre (de type Coulter)

entre 504 et 54 1 nm.

coo- C O U coo- 500- 1 I I

H3N'- CH- H~P- CH- H!N+- CH -H3V- CH I I I I CH3 CH3 CH2 CH2

\ / CH2 I

CH2 CH \

ch3 CH3

&A ALA PRO LEU

Figure 2.1. Substrat de la Granzyme B (Alanine-Alanine-Proline-Leucine)

Lecture au cytofluorimétre entre 504-541nm

Figure 2.2. Principe de la réaction enzymatique (ALA-ALA-PRO-LEU)-Rho I O 1 -GrB

2.4 Résultats

2.4.1 Analyse de l'expression génique des mol4cules cytotoxiques

Dans cette première partie, nous avons analysé l'expression des genes provenant des

cellules cytotoxiques à la suite d'une stimulation mitogénique des cellules mononuclées

(PBMCs). Nous avons aussi comparé l'expression génique de ces mêmes genes avec ceux

provenant de PBMCs non stimulés lors du rejet aigu de l'allogreffe rénale.

Les résultats que nous avons obtenus nous montrent, dans un premier temps, que la

stimulation mitogénique n'interfere en rien avec la positivité des résultats. C'est-à-dire que

le fait de stimuler ou de ne pas stimuler conduit vraisemblablement aux mêmes résultats.

Toutefois, les gènes provenant de PBMCs non stimulés ont un niveau d'expression

légèrement plus faible (figure 2.3). Cependant, la différence ici, n'est pas assez grande

pour que l'on considère nécessaire la stimulation pour l'obtention de meilleurs résultats.

En ce qui a trait au lien entre le rejet et l'apparition de ces molécules, nous n'avons

observé aucune variation significative quant à l'expression de ces molécules et la

manifestation du rejet. Contrairement à nos recherches parallèles (Section 3.4) où nous

avons étudié l'élévation de ces molécules chez des patients qui ont eu un suivi

immunologique sur une &ode de 3 mois post-transplantation, ici nous avons analysé

l'expression des gènes seulement au moment du soupçon du rejet. Nous avons observé que

le niveau d'expression génique le jout de la biopsie et 2 semaines après le traitement

immunosuppresseur était sensiblement le même (figure 2.3).

1.5 1 RE JET(stimul6) REJET(non stimulé)

Biopsie 2 sarn. Après (p=O. 11 )

Biopsie 2 sem. Apres

(p= 0.09)

REJET(stimu1e) 2.0 1 REJET(non stimulé)

O

Biopsie 2 sem. Aprb Biopsie 2 m. Après @=O, 3 8) (P-0,w

REJET(stirnu1e) 2.5 1 2,s - REJET(non stimulé)

Q C

O c = 2.0 { - O O 2.0 ? 1.5 i O O ? e 1.5' O 4 5 O Q, I 8 al E 1.0; - ô 0.5 / 8 t i O 0. 0.0 !- 0.0 c-.-C_____I_)+

Biopsie 2 s m . Apres ( p=O :23 )

Biopsie 2 sem. Apres

(p=O, 14)

Figure 2.3. Comparaison entre l'intensité du signal foumis par RT-PCR sur l'expression

génique des molécules cytotoxiques GrB, Fas L et P Ion d'une stimulation mitogénique des

PBMCs a) et sans stimulation des PBMCs b) le jour de la biopsie et 2 semaines après le

traitement immunosuppresseur

2.4.2 Comparaison entre l'expression génique et I'activité enzymatique de la GrB lors

du rejet aigu de 19allogreffe rénale

Dans cette section nous avons comparé l'expression génique de la GrB provenant de

PBMCs ayant subi une stimulation mitogénique à l'activité enzymatique

intracytoplasmique de cette molécule dans le sang complet de receveurs d'allogreffe avec et

sans rejet.

Les résultats obtenus nous montrent, en premier lieu, qu'il n'y a pas d'augmentation

significative de l'expression génique de la GrB lors du rejet puisque le niveau demeure

sensiblement équivalent au moment du rejet et 2 semaines après les traitements

immunosuppresseun (figures 2.3,2.4a). Ce phénomène perdure pour l'expression de cette

molécule chez les patients sans rejet, ce qui paraît normal (figure 2.4a). Nous avons

remarqué que l'activité enzymatique de la GrB était significativement moins élevée lors du

rejet @=0,06) par rapport à 2 semaines après les traitements. Ce résultat est encore mai

compris, puisque c'est l'inverse que l'on aurait dû observer cependant, ce phénomène

demeure sous investigation pour le moment, étant d o ~ é le petit nombre de patients.

D'ailleurs, on peut s'attendre qu'en augmentant la cohorte de patients, l'activité

enzymatique de la GrB sera plus élevée au moment du rejet. Malgré ce, aucune variation

de l'activité enzymatique de l'enzyme n'a été observée chez les receveurs sans rejet ce qui

semble normale (figure 2.4b).

Par la suite, nous avons comparé l'indice de variation (figure 2.5) de l'expression

génique et l'indice de variation de l'activité enzymatique de cette même molécule chez des

receveurs avec et sans rejet. Nous avons observe que ces deux mesures variaient

pratiquement ensemble @=0,06) chez les receveun sans rejet. Tandis que chez les

receveurs avec un rejet nous n'avons remarqué aucune corrélation entre les indices de

variation pour l'expression génique et l'activité enzymatique de la GrB à cette période

(figure 2.5).

-- - - -. . -- - -- .- -

Expression @nique de la Ganzyme B chez des patients en rejet vs sans rejet

- -- * Patientssans rejets /'

/" /'

/ ~(0,31) ._ ._ " 4

Biopsie 2semAqrés

- - - - - -

Activit6 enzymatique de la Granzyme B chez der patients en rejet vs sans rejet

Patients en rejet

Patients sans

Biopsie 2 sem. A p r b traitement

Figure 2.4. Modulation de la Granzyme B chez des patients avec un rejet aigu - sans rejet a) par l'analyse de l'expression génique mesurée en densitométrie, b) par la détermination

de l'activité enzymatique mesurée par l'intensité de fluorescence. Les analyses statistiques

ont été réalisées à l'aide du test d'analyse pairé 'Y' de Student.

Comparaison des indices de variation de la Granzyrne B chez des patients

en rejet vs sans rejet Patients en rejet p=(O. 1 O)

Patients sans rejet ~(0906)

l ndice de vatiatiorindice de variation d'expression d' activi te

génique enzymatique

Figure 2.5. Comparaison des indices de variation de la Granzyme B analysées en mesurant

l'expression génique et l'activité enzymatique chez des patients avec un rejet aigu vs sans

rejet. L'indice a été obtenu en divisant la valeur obtenue le jour de la biopsie par la valeur

obtenue 2 semaines après le traitement. Les analyses statistiques ont été effectuées avec le

test d'égalité des variances "j".

2.5 Conclusion

En conclusion, la stimulation mitogénique des PBMCs préalablement à l'étude des

molécules cytotoxiques, ne s'avère pas nécessaire pour l'obtention d'un signal optimal

puisque nos résultats ne démontrent aucune différence significative dans l'intensité du

signal (figure 2.3). On peut supposer que même sans stimulation, les cellules ont déjà

atteint un plateau dans la production d ' A M servant à la transcription des molécules

cytotoxiques. C'est pour cette raison que la stimulation ne change pas -le niveau

d'expression de ces molécules. Par contre, il a été démontré que la stimulation

préalablement à l'étude des cytokines augmente le niveau d'expression de celles-ci jusqu'a

l'obtention d'un plateau. La stimulation permet d'amplifier le signal de détection de

chacune des cytokines sans avoir à utiliser de grande quantité I'ARN.

Nous supposons que l'augmentation des molécules cytotoxiques se fait

graduellement dans la période précédant le rejet, puisque nous n'avons pas observé un

niveau plus élevé d'expression de ces molécules au moment du rejet par rapport au niveau

d'expression deux semaines après les traitements (figure 2.4 ). Toutefois, cette hypothèse

est basée sur les analyses faites quotidiennement discutées dans la Section 3. C'est dans

cette optique que l'analyse de la modulation des cytokines et des molécules cytotoxiques

dans le sang périphérique faite sur une période de temps d'au moins 3 mois pourrait

constituer un meilleur et un excellent test diagnostique précoce du rejet aigu par rapport à

l'analyse des cytokines seulement au moment du soupçon de rejet (Section 3.4).

Nous avons aussi remarqué que l'activité enzymatique de la GrB était beaucoup

moins élevée lors du rejet par rapport a l'activité enzymatique mesurée deux semaines

après le traitement immunosuppresseur (figure 2.4b). Normalement, l'expression d'un

gène et sa traduction en protéine sont reliées alors, on aurait dû observer un niveau assez

semblable entre l'expression et l'activité de l'enzyme. Or, on peut sans doute expliquer ce

résultat par le fait que l'expression du gène se fait en premier lieu don que sa traduction en

protéine se fait en deuxième lieu. D'après cela, on pourrait observer un niveau

d'expression de la molécule plus élevé lors du rejet tandis que l'on pourrait observer une

activité plus élevée de l'enzyme un peu plus tard. Dans notre analyse, le 2' prélèvement a

été effectué deux semaines après les traitements immunosuppresseurs, par conséquent,

l'augmentation de l'activité enzymatique a donc été observée à ce moment (figure 2.4a).

Toutefois, ce n'est pas ce que nous avons observé chez les receveurs sans rejet (figure

2.4b). Le niveau d'activité enzymatique au moment de la biopsie et 2 semaines après les

traitements est semblable. Ceci semble normal puisque ces patients n'ont subi aucun

traumatisme pouvant conduire a l'activation de leur système immunitaire ce qui n'a pu

engendrer la transcription et la traduction de la GrB.

Pour l'analyse de I'indice de variation de l'expression génique et de l'activité

enzymatique, nous avons remarqué que les deux indices ne variaient pas ensemble de façon

significative durant le rejet (figure 2.5). 11 semble que l'indice de variation de l'expression

génique soit beaucoup plus élevé que I'indice de variation de l'activité enzymatique à cette

période. Ceci nous indique que la différence mesurée le jour de la biopsie par rapport à la

mesure 2 semaines après les traitements est beaucoup plus grande pour l'expression du

gène comparativement a la différence mesurée pour l'activité enzymatique. Cela pourrait

indiquer que la méthode de RT-PCR serait peut-être plus sensible que la méthode

enzymologique. Toutefois, il est encore trop tôt pour conclure à ce sujet, d'autres études

devront être effectuées avec un plus grand nombre de patients. Malgré cela, nous avons

observé un certain synchronisme entre l'indice de variation de l'expression génique et celui

de I'activité enzymatique. C'est-à-dire que ces deux indices varient ensemble apparemment

de façon significative chez les patients sans rejet (figure 2.5). Ceci nous confirme qu'en

mesurant l'activité enzymatique, chez les receveurs sans rejet et sans complication, nous

obtenons le même résultat qu'en mesurant l'expression génique. Donc, cette méthode n'est

pas à éliminer complètement malgré le fait qu'elle est peut-être moins sensible.

Chapitre III

TRAVAUX DE RECHERCHE

3.1 Revue de littérature

Au début des années 90, la mesure des cytokines devint très populaire avec

l'introduction de la réaction de transcription inverse de polymérisation en chaîne (RT-PCR)

et de la disponibilité des trousses d'essais enzymatiques liés à un immunoabsorbant

(ELISA). Ces techniques ont rendu possible le suivi de I'expression de I'ARN messager

des cytokines dans les tissus ainsi que le suivi des concentrations de cytokines sous forme

de protéines dans les fluides du corps. L'hybridation in situ, les tests biologiques ainsi que

l'immunohistochimie ont aussi été utilisés pour déterminer la présence des cytokines. Avec

toutes ces méthodes, il y a eu un nombre énorme de publications traitant de la mesure des

cytokines à différents stages de la réponse immune à la suite d'une transplantation (Baan

CC., Weimar W.,Transpl. Int., 1998).

En immunologie de la transplantation, le changement dans l'équilibre des cytokines

z souvent été utilisé pour étudier les mécanismes de régulation du rejet aigu ainsi que du

rejet chronique ou pour étudier la diminution de la réponse immune. Dès lors, plusieurs

recherches, au niveau du champ clinique, ont mis l'accent sur les médiateurs produits par

les cellules T activées infiltrant la greffe. Depuis récemment, on s'intéresse au rôle de ces

médiateurs au niveau du sang périphérique.

3.1.1 Cytokines intrrigreffe associées au rejet

La majorité des études sur la mesure et le suivi des cytokines a été réalisée au site de

la greffe. C'est pourquoi on connaît assez bien aujourd'hui, la corrélation entre les

différentes pathologies et la présence des cytokines dans le tissu greffé (Tableau 3. 1).

Tableau 3.1. Profil de l'expression génique, selon différents groupes, de 1'ARNm des

cytokines retrouvées intragreffe lors du rejet aigu de l'allogreffe rénale

ihJFy Précède l'évidence de rejet (Nast CC., et ai., Transplantation, 1994)

Fortement impliqué dans (Joseph W., et al., Transplant. Proc., 1995) reiet

IL-2 Précède l'évidence de rejet (Dallman et al.,Transplantation, 1992) (Grimm et al., Transplantation, 1995) (Vandenbroke C., et ai., Transplantation, 1 99 1 ) (Suthanthiran M.,Am.J.med.Sci., 1 997)

Aucune relation avec les (Krams et al., Transplantation, 1992) différents stages du rejet

I L 4 Dans la greffe stable (StromTB.,et al.,Curr.Opin.Immunol., 1996)

I L Aucune de ces cytokines (Krams SM., et al., Transplantation, 1992) IL-5 n'ont été associées au rejet

IL-6 Dans un rein normal (Krams SM.,et al., Transplantation, 1992) Non spécifique Réponse inflammatoire

Présent dans un rein en rejet (Jeyarajah DR., et al., Transplantation, 1995) avecTNFa.IL-4.5

TNFa Retrouvé dans un rein en (Loong CC., et al., Transplant. Proc., 1996) rejet avec IL-2,4,6,10

Associé au rejet précoce (Joseph N., et al., Transplant. Proc., 1995) et au rejet retardé (avant 100 jours et après 100 jours) avec l'IL-2.6

IL40 Retrouve dans des échantil- (Xu GP., et al., Kidney Int., 1995) Ions d'allogreffe a néphro- pathie chronique avec l'IL-2

Associé au rejet aigu Rôle pro-inflammatoire

Associé au rejet sans la prés- (Strehlau N ., et al., Proc.Natl.Acad.Sci, 1997) ence d'IL-2 et d'IL4

Rôle anti-inflammatoire (Joseph N.,et al.,Transplant Proc., 1 995) Associé à l'acceptation (Lipman et ai., Transplantation, 1998)

TGFP Associé au rejet chronique (Xu GP., et al., Kidney Int., 1996) (S uthanthiran M.,Transplantation& lmmunolog y letter, 1 996)

Joue un rôle dans la réponse (Bishop GA.,et al.,Transplant. Immunol., 1993) inflammatoire associée à l'IL-4,1 O (Goes N., et al., Transplantation, 1 995)

a -15 Associé au rejet chronique (Strehlau IV., Proc.Natl.Acad.Sci., 1997)

Expression augmentée lors (Lipman ML.,et ai.,Transplantation, 1998) du rejet aigu

TNFa Associé au processus de (Bishop GA.,et al.,Transplant. Immunol., 1993) GM-CSF rejet avec GrB, (Goes N., et ai., Transplantation, 1995)

Perforine. Fas L

GrB Outil diagnostique dans (Strehlau N., et al.,Medical Sciences, 1997) Perforine le suivi du rejet avec

le Fas L

Présent dans la greffe (Lipman M. et ai.,Journal ofimmunology, 1994) lors du rejet aigu

Fus L Sa présence corrèle avec (SuthanthiranM.,Transplantation&Immunology le rejet aigu letter, 1996)

Plusieurs groupes ont obtenu des résultats oD la tendance montre que les cytokines

de type Thl sont reliées au rejet de l'allogreffe tandis que les cytokines de type Th2 sont

reliées à la tolérance (Kusaka S., et al.,Transplant Proc., 1995).

3.1.2 Les cytokines du sang pdriphérique associées au rejet

Contrairement aux cytokines mesurées au site de la greffe, les cytokines mesurées

dans le sang périphérique sont moins bien définies. Le rôle des cytokines dans le sang

périphérique n'est pas encore bien compris, certaines sont associées au phénomène de rejet,

d'autres au phénomène de tolérance mais la majorité des cytokines ont encore un rôle

incertain dû au fait qu'elles peuvent aussi être impliquées dans d'autres dysfonctions de la

greffe (Nast CC., et al.,Transplantation, 1994). Certains groupes se sont penchés sur

l'étude des cytokines directement mesurées dans le sérum ou le plasma dors que d'autres

ont mesuré leur niveau dans l'urine (Jeyaraye DR., et al., Transplantation 1995 ; Xu GP., et

al., Kidney Int., 1995; Kraus et al., Transpl.Proc., 1991; Grant SCD., et al., Transplantation

1996 ; Kimball PM., et al., Transplantation 1996).

Toutefois, ces études ont donné des résultats variables. Quelques-unes ont pointé

l'analyse potentielle des cytokines de l'urine, du sérum et du plasma dans le diagnostic du

rejet de la greffe rénale (Kumano K., et ai., Transplant Proc., 1996 ; Simpson MA., et

al.,TranspIantation, 1989) tandis que d'autres études ont échouées ce qui ne permet pas de

conclure sur l'usage htur de ces paramètres dans un test diagnostique (Jonhson CP., et al.,

Transplant Proc., 1990).

Tableau 3.2. Relation entre les cytokines dans le sang périphérique selon l'expression du

gène ou la protéine sécrété et le phénomène de rejet a la suite d'une transplantation rénale

Cytokine Commentaires Endroit Technique Références utilisée

TNFa

IL-2

INFy

I W L - 5

IL-5

IL-6

Augmente avec PBL l'IL-6 dans rejet

Présente durant le PBL rejet aigu et rejet chronique

Précède les épiso- Plasma des de rejet aigu

Présente durant le PBL rejet aigu et rejet chronique

Précède le rejet PBL aigu

Augmente avec le urine rejet

Diminue au moment PBL du rejet

Sa présence associée PBL de à l'IL4 indique une souris possibilité de rejeter l'allogreffe

Utilisé pour discri- Plasma miner les cas rejets des cas sans rejet avec l ' I L 4 mais pas suffisant pour prédire rejet

ELISA

ELISA

ELISA

ELISA

ELISA

ELISA

ELISA

ELISA

ELISA

(Jeyarajah DR., et al. Transpl .Proc., 1 995)

(Tary-Lehmann M.,et al., Transplantation, 1998)

(Kutukculer N., et al. Transplantation, 1995)

(Tary-Lehmann N., et ai., Transplantation, 1998)

(Matesic D e y et al., Lof Immunol., 1998)

(Jeyarajah DR., et al. Transpl.Proc., 1995)

(Matesic D., et al., J. of Imrnunol., 1998)

(Kutukculer Ney et al., Transplantation, 1 995)

Associé à différents traumatismes et infections

Perforine GrB Fus L

Perjbr ine

Perforine

Diminue après réso- PBL lution du rejet

Un bas niveau avant PBL la transplantation prédit une basse incidence de rejet aigu

Présence corréle PBL avec le rejet aigu associé au diagnostique du rejet

Sensible mais pas PBL spécifique au rejet aigu

Précède le rejet PBL aigu

Dans cellules T et PBL NK pour discriminer patients imrnunosup- primés des patients stables

Dans cellules T et PBL NK corrélation entre l'activation immuni- taire et la dysfonction de la greffe

Marqueur diagnos- PBL tique précoce de l'activation des lymphocytes dans I'allogreffe rénale

ELISA (Jeyarajah DR., et ai. Transpl.Proc., 1995)

ELISA (Weimer R., et al., Transplantation, 1 996)

RT-PCR (Vasconcellos LM.,et al. Transplantation, 1998)

Cytométrie (Portales P., et al., Transplant Proc., 1997)

RT-PCR (Rukavina D., et al., Transplantation, 1996)

Cytométrie

RT-PCR (Kem F., et al., J. AM. Soc. Nephrol., 1996)

Hybridation (Clément M.V., et al., in situ Human Immunol., 1990)

3.2 Pro blématique

Le phénomène de rejet a été très bien contrôlé depuis l'avènement des

immunosuppresseurs, plus particulièrement, de la cyclosporine qui a remarquablement

amélioré les chances de survie des patients ayant subi une transplantation rénale, hépatique,

cardiaque ou cœur-poumon. Toutefois, le rejet demeure encore un obstacle important au

succès de la transplantation et conduit souvent a la perte du greffon. Le diagnostic précoce

du rejet aigu de I'allogreffe rénale est essentiel à l'administration d'une

imrnunosuppression adéquate et optimale. Cependant, il n'existe à l'heure actuelle encore

aucune méthode de détection du rejet aigu précoce qui soit simple, rapide et sans danger

pour les receveurs d'une greffe et qui permettre de diagnostiquer le rejet aigu sans avoir

l'obligation de pratiquer une biopsie du greffon. La plupart des tests diagnostiques

disponibles foumissent les domees nécessaires à I'appiication d'un traitement approprié

seulement lorsque le rein a subi des dommages.

Bien que la biopsie soit couramment pratiquée pour confirmer le diagnostic de rejet,

elle demeure pourtant invasive et coûteuse et les procédures répétitives sont limitées

puisqu'elles comportent certains dangers pour le patient. C'est pourquoi la venue d'un

nouveau mode de détection de la présence de rejet serait grandement bénéfique en clinique

puisqu'il permettrait de pratiquer la biopsie seulement lonqu'elle s'avérait nécessaire.

Ainsi, le suivi des cytokines dans le sang périphérique pourrait procurer

d'importantes informations et par conséquent, guider les interventions thérapeutiques

futures visant à diminuer l'incidence de rejet aigu de manière à influencer sa conséquence,

le rejet chronique qui malheureusement, conduit souvent à la perte du greffon à long terne.

L'avènement de la technologie des réactions de polymérisation en chaîne (PCR) a rendu

possible la détection de I'ARNm des cytokines exprimé par différentes cellules a la suite

d'une stimulation du système immunitaire. La méthode du PCR représente une technologie

qui est sensible, reproductible et peu coûteuse qui pourrait éventuellement devenir de

grande utilité dans la détection précoce du rejet.

3.3 Objectif spécifique des travaux

Établir une corrélation avec le rejet aigu en étudiant sur une période de 6 mois post-

transplantation la modulation dans le sang périphérique de l'expression génique des

cytokines provenant de différentes sous-classes de cellules mononuclées. Les Th1 (MFy,

IL-2) et Th2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-IO), d'autres types cellulaires (1'1-15) et molécules

cytotoxiques (Perfonne, Fas L et Granzyme B). Dans le but fiitur de mettre au point une

méthode de détection du rejet en phase précoce, à partir d'une ponction sanguine, qui serait

non invasive et sécuritaire pour les patients.

3.3.1 Hypothèse

Les cytokines INFy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-1 0 et i14-1S ainsi que les molécules

cytotoxiques Perforines, Fas L et Granzyme B agissent comme précurseurs du rejet aigu en

augmentant dans le sang périphérique préalablement aux épisodes de rejet aigu.

3.4 Article

3.4.1 Résumé

La prévention et le traitement du rejet aigu sont des mesures couramment prises

pour réduire les risques à long terme du rejet chronique de I'allogreffe rénale. lusqu'a

maintenant, la biopsie semble être le seul outil diagnostique prédictif dans la surveillance

du rejet aigu de l'allogreffe. Cependant, les applications cliniques sont limitées par la

nature invasive de cette procédure. Le but de cette étude était d'analyser la relation entre

les marqueurs du système immunitaire dans le sang périphérique avec le rejet aigu rénal.

Les cellules mononuclées préalablement stimulées par un mitogène ont été isolées

du sang périphérique et testées pour I'IL-2,1'IL4,I'IL-5,l'lL-6,1'IL-lO, l'IL-15, I'iNFy, la

Perforine, la Granzyme B et le Fas L par la méthode de PCR par transcription inverse. Les

niveaux d'IL-4, d'IL-5, d'IL-6, d'MFy, de Perforine et de Granzyme B ont été associés au

phénomène de rejet aigu.

L'augmentation de l'expression génique de ces cytokines est considérée comme un

marqueur potentiel du rejet lorsque l'expression de I'ARNm est élevée de façon

significative au moment du rejet et durant les premiers jours post-transplantation. Lorsque

deux marqueurs cytokines étaient augmentés, on détectait 75% des patients qui

manifestaient un rejet par rapport à 15 % des patients qui étaient sans rejets.

Nous avons démontré que les épisodes de rejet aigu, chez des receveurs d'une

transplantation rénale, étaient associés à l'augmentation de l'expression génique de

1'ARNm des cytokines dans les cellules mononuclées du sang périphérique préalablement

stimulées par un mitogène. L'évaluation de l'IL-4, IL-5, IL-6, IFNy, GrB et Perforine

pourraient constituer un test diagnostique de première ligne du rejet. Ces marqueurs vont

s'avérer très utililes pour l'identification clinique des patients souffrant d'un rejet ainsi que

dans l'administration d'une thérapie antirejet appropriée avant que le rein ne subisse de

dommages.

CYTOKINE AND CYTOTOXIC MOLECULE GENE EXPRESSION

DETERMINED IN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS AS A

DIAGNOSTIC TOOL OF CLINICAL ACUTE RENAL REJECTION

SONIA GAUDREAUI* FRANCME J. DUGR.É~* 2,, MARTHE BELLES-ISLES~,

ISABELLE HOU DE^ and RAYNALD ROY'

' Centre de recherche en Rhumatologie et Immunologie, CHUQ, Pavillon CHUL,

Université Laval, Quebec, Canada

Both authors contributed equally to this work

Service de Néphrologie, C W Q , Pavillon HDQ, Université Laval, Québec,

Canada

INTRODUCTION

Despite improvements in available methods of immunosuppression, long-term

allograft survival remains practically unchanged. Late graft loss, caused mostly by chronic

rejection, is a poorly defined imrnunological event having no known antirejection therapy

(1,2). Consequently, better prevention of early gr& lost and treatment of acute rejection are

the most effective measures in reducing the risk of chronic allograft nephropathy. Although

monitoring acute rend alIogr& rejection by biopsy is an effective method, its invasive

nature limits its clinical application (3). Immune markers that correlate with diagnosed

clinical rejection episodes, especially fiom peripheral blood mononuclear cells (PBMCs),

have not yet been clearly defined, but are of particular interest.

Interactions between alloactivated T-cells and other cells of the immune system,

with attendant cytokine secretions, are involved in immune response and nonspecific

inflammatory reaction of allograft rejection (4-6). Cytokines are implicated in the activation

or regulation of Th1 and Th2 subsets of Ttells. Th1 cells, producing IL-2 and IFN-y, are

involved in the cellular immune response mediated by cytotoxic cells (CTLs),

macrophages, and natural killer (NK) cells (7). In contrast, the Th2 cellular subset produce

IL-4, IL-5, IL-6 and IL- 1 O, al1 of which stimulate predominantly the antibody-mediated

humoral immune response (8). It has been reported that Th2 cells could be implicated in

cross-regulation of immune response and $raft acceptance (9). However, the exact role of

Th-2 cells in the tolerance of allograft is not known (10).

Macrophages, eosinophils, and NK cells are also regulated by cytokine production

during the inflarnmatory response of allograft rejection. IL-6 and IL-10 have been

described as being produced by monocytes and macrophages during the inflammatory and

immune response of infection and injury (1 1,12). NK cells may also exert cytotoxicity by

mechanisms similar to that of CTLs. NK cells can be activated by cytokines, and, once

activated, can themselves produce significant arnounts of IFN-y (1 3).

In terms of cell-mediated cytotoxic mechanisms of target cell lysis, Perforin,

Granzyme (Gr) and Fas Ligand (Fas L) have been implicated as active participants in the

process of acute rejection (14). Perfotin and GrB are proteins present in the granules of

cytotoxic T lymphocytes and in NK cells. Both cytotoxic molecules are involved in the

apoptotic pathway (FasIFas L), in DNA fragmentation, and in ce11 death. Recently, gene

expression of cytolytic molecules as well as the cytokine transcripts, detennined in

peripheral blood lymphocytes of patients, have been found correlated with their intragraft

rnRNA expression during allograft rejection (1 5, 16).

In this prospective study we investigated the diagnostic value of cytokine gene

transcripts and the mRNA expression of cytotoxic molecules detemined from mitogen-

induced PBMCs of patients during the tirne course of the development of acute rend

allograft rejection.

MATERIALS AND METHODS

Patients

Sixty-one [6 11 recipients of kidney transplants, who had undergone their surgery at

the Hôtel-Dieu de Québec Hospital (6 living-related and 55 cadaveric transplants) between

July 1996 to December 1998, were selected for this study. PBMCs were obtained twice

weekly during hospitalisation and weekly thereafter over three consecutive months. Al1

patients were given Cyclosponne A (CsA - Neoral) at an initial dose of 8 mg/kg/day,

Mycophenolate Mofetil at Zg/day, and Prednisone at Img/day. Al1 patients also received

the calcium channel blocker drug Diltiazem. Doses of CsA were adjusted according to

blood levels. Steroids were tapered to O.ZSrng/kg/day and @en slowly decreased.

Rejection episodes were defined by clinical diagnosis (such as increasing serurn

creatinine level in the absence of other pathologies, including urinary tract obstruction,

allograft artery stenosis or CsA toxicity), and were confhned by biopsy when required (12

patients). Al1 rejection episodes were treated with a steroid pulse.

Out of the sixty-one [61] patients initially considered for the snidy, forty [40]

patients were excluded for the following reasons: various infections such as

cytomegalovinis; acute tubular necrosis; CsA nephrotoxicity; other medical complications

and uncertain rejection episodes. Out of the twentysne [21] patients that reached our

criteria, thirteen [13] patients had no rejection episodes or any of the complications listed

above, whereas eight [8] patients had a proven acute rend allograft rejection based on

clinical diagnosis and response to the steroid pulse, or kidney biopsy.

Preparation of PBMCs

PBMCs were isolated fiom 10-12 mL of the patient's penpheral venous blood,

collected in heparinized tubes, and separated in a Ficoll-hypaque gradient (Pharmacia.

Biotech, Uppsala, Sweden). Red cells were lysed with Immunolyse (Coulter Clone, Miami,

FL) and the washed cells were resuspended in stimulation medium (RPMI with 10% blood

group AB serum, 1% penicillin (1 0000 U/mL), 1 % streptomycin (10000 pg/mL), and 1%

glutamine (200 mM). The PBLs ( I x l ~ ~ c e l l s / m ~ ) were activated in vitro with

phytohemagglutinin (Sigma, St-Louis, MO) at a final concentration of 1.25 pghL and

incubated at 37OC, 5% CO2 for 18 hours in 25 cm2 culture flasks (Falcon, Becton-

Dickinson, USA).

RNA extraction and Reverse Transcription

Total RNA was extracted from mitogen-activated PBMCs by the TRIzol method

according to the manufacturer's instructions (Gibco BRL, Burlington, Ontario, Canada).

First strand synthesis was perfonned in a 20 pL reaction volume containhg 400 ng of total

RNA, and 200 ng of oligo dT and 0.5 mM of each dNTPs (Boehringer Mannheim), 25 units

of RNAsin (Promega Fisher, Quebec, Canada), and 200 units of MMLV-RT (Gibco BRL).

PCR anaiysis

Standard PCR amplification of the synthesised cDNA from each sample was carried

out. cDNA (0.8 PL) was amplified in a 25 pL reaction volume containing bufTer (Perkin

Elmer, Branchburg, New Jersey, U.S.A.) with 1.5 mM of MgCl2 (IL-15 with 2.0 mM of

MgC12), 0.2 m M of each dNTP, 0.5-0.75 unit of Taq polymerase (Perkin Elmer), 0.1 5-0.50

pM cytokine and cytotoxic molecule primen (Table 1). Reagents were added to samples as

a master mix. p-actin primers were used first to nile out fa i lw of the RT reaction and PCR

amplification and second to detect gross variation in cDNA quantity among sarnples. The

sarnples were amplified in a 9600 DNA thermal cycler (Perkin-Elmer) with the followhg

parameters: denaturation 3 min. 94OC; amplification cycle 1 min. 94OC, 45-60 sec. 58OC,

45-60 sec. 72T; 25-38 cycles; extension 5 min. 72OC. Conditions were optimised for each

primer pair to avoid false appearance of amplified product uniformity.

Semiquantitative mRNA analysis

Amplified products (10pL) and 500 ng of DNA markers pGEM (Promega-Fisher,

Quebec, Canada) were analysed by electrophoresis on 1.5% agarose gels containing

ethidium bromide. The gel was photographed with Polaroid 667 film and band intensity

was analysed by densitometry (BioImage-Visage 1 iOS Millipore, Ann Arbor, MI, USA).

To correct for fùrther variations in mRNA concentration in each sample, the densitometry

value for each cytokine or cytotoxic molecule was divided by the corresponding p-actin

value.

Definition of upregulated mRNA expression

The upregulated rnRNA expression for a given molecule was defined as follows:

a) The mRNA expression (as described under semi-quantitative mRNA anafysis) for a

given molecule was determined during the early post-TX penod (less than 7 days afker

surgery) and at the time of a rejection episode (or 3 months pst-TX in the case of

patients without a rejection episode).

b) The mRNA expression value obtained in the early pst-TX period was subtracted fiom

that obtained at a rejection episode (or 3 months pst-TX in the case of patients without

a rejection episode). The result of this subtraction was termed "di fferential expression".

C) The differential expression value, for a given patient and molecule, was deemed

positive and considered a repmentation of upregulated mRNA expression, if it was

equal or higher than the mean differentiaf expression value calculated fiom patients

without a rejection episode + one standard deviation.

Statistical analysis

Messenger RNA expression values obtained in the early pst-TX period and at a

rejection episode (or 3 months in the case of patients without a rejection episode) were

compared using the paired Student t test (Fig. 1). Statistical comparisons between the acute

rejection group and the nonrejecting group, and between the two early pst-TX groups

were performed using the Student t-test (the equality of variances was tested and the

appropriate t-test was used) (Fig. 1). The comparison of the number of patients with an

upregulated mRNA expression (for a given marker) in the acute rejection and nonrejection

groups was performed with the test for comparison of two proportions (Table 2). The

Student t-tests and paired t-tests were performed respectively with the TTEST and MEANS

procedures of the SAS System (Release 6.12)

Table 3.3. Primer sequences

GENE SEQUENCE mRNA REF.

B- Actin

IFN-y

IL-2

IL-4

IL-5

IL-6

IL-1 O

IL- 15

Perforin

GrB

Fas L

S 5' CGT GAC ATT AAG GAG AAG CTG TGC 3' 375 pb 17 AS 5' CTC AGG AGG AGC AAT GAT CTT GAT 3'

S 5' ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TT 3'494 pb 18 AS 5' GAT GCT CTT CGA CCT CGA AAC AGC AT 3'

S 5' ATG TAC AGG ATG CAA CTC CTG TCT T 3' 458 pb 19 AS 5' GTT AGT GTT GAG ATG ATG CTT TGA C 3'

S 5' ATG GGT CTC ACC TCC CAA CTG CT 3' 456 pb 18 AS 5' CGA ACA CTT TGA ATA TTT CTC TCT CAT 3'

S 5' CTA CGT GTA TGC CAT CCC CA 3' 292 pb 20 AS 5' TAC TCT CCG TCT TTC TTC TC 3'

S 5' ATG AAC TCC TTC TCC ACA AGC GC 3' 628 pb 18 AS 5' GAA GAG CCC TCA GGC TGG ACT G 3'

S 5' TGA GAA CCA AGA CCC AGA CAT CAA GG 3'350 pb 2 1 AS 5' CAA TAA GGT TTC TCA AGG GGC TGG GT 3'

S 5' CCG TGG CTT TGA GTA ATG AG 3' 409 pb 14 AS 5' CAG ATT CTG TTA CAT T'CC C3'

S 5' CAG TAC AGC TTC AGC ACT GAC 3' 176 pb 22 AS 5' ATG AAG TGG GTG CCG TAG TTG 3'

S 5' GAC TTC GTG CTG ACA GCT GCT CAC 3' 509 pb 17 AS 5' CGT CCA TAG GAG ACA ATG CCC TGG 3'

S 5' GGA TTG GGC CTG GGG ATG TTT CA 3' 344 pb 23 AS 5' TTG TGG CTC AGG GGC AGG T'TG TTG 3"

RESULTS

Cytokine and cytotoxic molecuk mRNA expression

Our results concumd with those of other studies showing that allogenic (24)

and/or mitogenic stimulation (25, 26) is needed to detect a specific cytokine signal from

PBMCs (data not show). Figure 3.1 shows that the expression af I L 4 , IL-5, and IL-6

mRNA measured in patients' PBMCs was significantly higher @=0,02; ~=0,02; p-0,01

respectively) at the time of acute rejection diagnosis compared with the signal levels

determined in the first days posttransplantation (early pst-TX). Although IFN-y mRNA

expression was significantly upregulated in the acute rejection group (AGR) @=0,01), its

expression had also increased in the nonrejecting group (NGR) @=0,05). IL-2 and IL-IO

mRNA expression did not change significantly during the follow-up period. IL-15, a T-cell

growth factor secreted by macrophages also did not increase during the follow-up period of

both groups of patients. However, its mRNA expression level was significantly higher @=

0,003) in the group of patients with acute rejection compared with the NGR group.

Furthemore, significant increases of the cytotoxic T lymphocytes (CTLs) effector

transcript molecules GrB (p=0,05) and Perforin @10,03) were observed with the process of

acute rejection (Fig. 3.1). In the absence of rejection, gene expression for Perforin was also

significantly upregulated in PBMCs @-0,O 1). Finally, no evidence of conelation with

acute rejection was found with Fas L.

Upregulated mRNA expressions leading to the identirinton of rejection

The rates of the different molecular upregulated mRNA expressions were examined

for the AGR and the NGR groups. The statistical cornparison of the two groups lead to

significant cytokine expressions for IL4 @=0,04), IL-5 @=0,003), IL-6 @=0,01), IFN-y

@=0,01) and for the cytotoxic molecules GrB @=0,04) and Perfonn @=0,01) (Table 2).

Between 50 and 63% of the AGR patients had an upregulated mRNA expression for these

rnolecule marken as compared io 8 to 15 % in the NGR recipients group. IL-2, I L 4 O, IL-

15 and Fas L molecules did not reach significant correlation values and could not

contribute to the identification of a rejection process.

Selection of upregulated mRNA expression marken for the diagnosis of rejection

Table 3.4 shows the individual upregulated mRNA expression of cytokine and

cytotoxic molecules for patients with and without acute rejection. When at least two of the

cytokine markers were upregulated for a given patient, (618) 75% of the rejecting recipients

were identified against (211 3) 15% of the nonrejecting patients @=0,003). The upregulated

mRNA expression of the cytotoxic molecules GrB and Perforin did not M e r contribute to

the identification of the rejection process. Furthennore, we observed a very different

upregulated mRNA expression pattern in two of the rejecting patients as compared with the

other rejecting patients. The first patient (#7) displayed one market, while the latter (#8)

displayed none,,compared with 3 to 6 upregulated markers each for the other patients. The

biopsies of these two patients were detemined as borderline rejection (mild mononuclear

cortical infiltration).

Acute Acute Earl Non- :% rajsstion $% $% rejection po& mjectiion

Figure 3.1 Modulation of cytokine and cytotoxic rnolecule gene expression in the

monitoring of peripherd blood of rejecting and nonrejecting,recipients. The mRNA level

for each molecule was divided by the conesponding P-actin value. (S) represents mean t

standard error of the mean. Each open circle (O) represents a rejecting recipient (n=8) and

the dark circle (a) represents a nonrejecting recipient (n=l3). In both groups the

monitoring started at the early post-transplantation tirne until rejection (AGR) and until 3

months post-TX (NGR). Statistical cornparisons @ values) between early post-TX values

and the AGR or the NGR groups were perfonned using the paired Student t test.

Table 3.4. Correlation of cytokine and cytotoxic molecule upregulated mRNA

expressions with an acute rejection process

Nurnber of ~atients with upreeulated mRNA expression,

NGR AGR P

(n= 13) (n=8) value b

Cytokines

IL-2 3 (23) c 3 (38) NS d

IL-4 2 (W 4 (50) 0,04

I L 4 U 8) 5 (63) 0,003

IL-6 l( 8) 4 (50) 0,O 1

IL-10 3 (23) 4 (50) NS

IL-15 2 (15) 3 (38) ' NS

IFN-y 2 (15) 5 (63) 0,o 1

, The upregulated mRNA expression was determined as follows: a sarnple was

deemed positive if its differential expression value (Le. AGR value or NGR value - early pst-TX value) was equal or higher than the mean differential expression value

calculaied fiom the NGR patients + one standard deviation.

t, Test for cornparison of two proportions

, % in parenthesis

d Non Significant

Table 3.5 Individual cytokine and cytotoxic molecule upregulated mRNA expressions, for

patients with or without acute rejection

Patients # molecules

Cvto kines Cvtotoxic

AGR I L 4 IL-5 IL-6 IFN-Y GrB Perforin 1 + + + + + 2 9 + + + + + 3 + + 9 + - +

NGR I L - IL-5 IL-6 IFN-Y GrB Perforin 1 O O * O

2 + O + 9 O

3 -

6 O - 9 -

7 + O 9 O +

8 O - O O

9 9 9 9 9 O L

10 O 9 +

1 1 9 9 O . -

12 O O - 9

13 - + + + - , The upregulated mRNA expression was determined as follows: a sample was deemed

positive if its differentiai expression value (i.e. AGR value or NGR value - earty pst-TX

value) was equal or higher than the mean differentid expression value calculated fiom the

NGR patients + one standard deviation.

In the present study, we showed that mitogenic stimulation of PBMCs could be a

sensitive approach to detemiining cytokine or cytotoxic molecule mRNA expressions by

RT-PCR analysis in the monitoring of renal allograft rejection. PBMCs transcriptions of T

ce11 a d o r non-T ce11 cytokines IL-4, IL-5 and IL-6, as well as the cytotoxic molecules GrB

and Perforin, had significantly increased in patients diagnosed with clinical rejection.

Although the levels of IL-2 transcription did not change significantly during allograft

rej ection, IFN-y mRNA expression was signi ficantly increased. However, a similar rise in

IFN-y was also observed in the nonrejecting group. These results may nonetheless concur

with reported conflicting data where studies were not able to confirm the clear association

between IFN-y, IL-2 and acute kidney allograft rejection. n i e role of Th1 cytokines in

human organ transplantation (27) and its animal models (28), in allograft rejection is still

controversiai. In the majority of the studies reported, cytokine measurements were taken at

the site of transplant. However, it might be possible that IFN-y production from MC cells

could be detected in the PBMCs of patients. Few studies have established a good

correlation between ï h l cytokines gene expression, detemined in the peripheral blwd of

recipients, and acute rejection. Kinetics of cytokine mRNA measurements could be crucial.

It has been s h o w that IL-2 mRNA is only bnefly expressed by gr&-infiltrating

lymphocytes (29) and this signal might precede the rejection episode (30). The monitoring

of these cytokines transcnpts in PBMCs could be dificult depending on the timing of blood

sampling.

Expression of IL-4, IL-5 and IL-6 mRNA was significantly higher at the time of

acute rejection than during the fmt days p t -TX. We also observed that the mRNA

expression of each of these cytokines was upregulated in at least 50% of the rejecting

recipients (Table 3.1). When at least two of these markers were upregulated for a given

patient, 75% of the rejecting recipients were identified against 15% of the nonrejecting

patients (Table 3.5). Meehan et al. (3 1) recently showed that 72% of the patients with

biopsies indicating bordedine infiltrates that were not given additional anti-rejection

therapy did not progress to acute rejection. We observed that the two patients, #7 and #8,

who were diagnosed with borderline rejection, did not show significantly upregulated

mRNA expression patterns when compared to the other rejecting patients. If these two

patients were eliminated fiom the statistical evaluation, 100% of the rejecting recipients

could be identified as compared to 15% for the nonrejecting recipients, when considering

the suggested panel of markers. Our findings corroborate severai studies in which these

cytokines were upregulated during rend allograft rej ection ( X , 3 3). In organ biopsies, IL-4,

IL-5 and, IL-6 mRNA expressions were also reported correlated with gr& rejection when

measured in PBLs of recipients by RT-PCR (1 5) or in serum (34) and urine (35) by ELISA.

The observation that IL- 15 was higher in the AGR group of patients is in agreement

with studies showing an upregulation of this cytokine in rejecting kidney graft tissue

(36,37). IL45 has k e n shown to act on various immune cells, including T and B-

lymphocytes, NK cells, and more recently, neutmphils (32,38). As a potent cyclosporine-

resistant T-ce11 growth factor, IL-15 may replace IL-2 in the rejection process (39). As it

was demonstrated that TNF-a and IL- 1 O gene polymorphisms were associated with rejection

(40), recipients IL-15 high producer genotype could be the most susceptible to grah

dysfimction.

IL-10 might be playing opposing roles when the immune system is confronted with

different clinical conditions. It is known that IL- l O could have immunostirnulatory effects

under certain circumstances, which might be associated with rejection (41),

immunosuppression functions (42) or immunological quiescence (43). Strong correlation

between intragraft mRNA IL-IO expression and acute rejection has been found in

association with cytotoxic activities measured by Granyme B expression (44). However, in

PBMCs of rend kidney recipients, we did not fmd a significant association with the

elevation of IL- 1 O mRNA expression and acute rejection.

In parallel with the evaluation of cytokine gene expressions in PBMCs as usehl

diagnostic markers of acute graft dysfunction, we investigated the implication of mRNA

cytotoxic molecules (GrB, Perforin and Fas L) as indicators of rejection. Perforin and GrB

transcript molecules were found significantly increased dtuing acute rejection episodes.

However, a significant augmentation of Perforin mRNA expression was also noted in the

nonrejecting group. Although the major causes of grafi dysfunction (such as infection, dnig

toxicity, tubular obstruction) were supposed to be absent in the nonrejecting group,

nonapparent or asymptomatic pathology could still have explained the significant signals

noted in the present study for Perforin as well as for IFN-y. It is also possible that

immunosuppressive therapies could have some effect on cytotoxic cells, thereby iduencing

Perfonn protein expression in PBLs as described by Rukavina et al. (45). Our findings are

in agreement with recent studies of Vasconcellos et al. (16) and of Lipman et al. (17)

showing a strong correlation between GrB and Perfonn gene transcripts determined

conjointly in PBLs and intragraft for the diagnosis of acute rejection. However, we were not

able to confirm their observation concerning the association between Fas L expression

determined in PBMCs and renal allograft rejection. This could be due to the method used, as

we extracted the mRNA from PBMCs instead of total blood cells (16). Our results also

support a recent study in which acute renal allograft rejection was associated preferentially

with cytotoxic granule-based CTLs killing rather than the FasfFas L pathway, which could

be more related to chronic rejection (46).

In summary, the advent of new immunosuppression therapies makes early or laie

acute rejection episodes more dificult to diagnose. Allograft biopsies are usehl to confïrm

acute or chronic rejection; however, cytokine ancilor cytotoxic molecule gene transcripts

measured by semiquantitative RT-PCR analysis fiom PBMCs rnay facilitate graft

surveillance by limiting these invasive biopsies. It is still not clear which crucial roles are

played by the specific immune response or non-specific in.ilammatory response in acute and

chronic allograft rejections. G d histology surveillance fails to ensure the correct diagnosis

of asymptomatic acute rejection episodes and uncontrolled inflammatory reactions, which

are clinical events known to be potentially associated with chronic allograft nephropathy.

Our investigation suggests that T ce11 andor non-T ce11 gene transcnpts of IL-4, IL-5, IL-6

and IFN-y as well as of cytotoxic molecules (GrB and Perforin) could be potential diagnostic

markers of clinical rejection episode when their level of mRNA expression are monitored in

PBMCs of kidney recipients. In the perspective of confiming their usefulness as a

prognostic tool in clinical rejection, we are applying this protocol to new transplant patients.

Acknowledgements. The authoa thank Simonne Lille, Lillianne Bérubé and Christine

Nielly for their technical assistance, and Dr Éric Wagner Ph.D., Dr Réal Noël and Dr Jean-

Guy Lachance for their usehl suggestions.

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Chapitre IV

CONCLUSION

Les résultats que nous avons obtenus par la technique de réaction de polymérisation

en chaine (PCR) nous ont montré qu'il serait possible de suivre le devenir du greffon dans

le sang périphérique chez des receveurs immunologiquement compatibles de façon partielle

avec le donneur. Nos résultats nous ont aussi permis de connaître les molécules qui étaient

impliquées lors des interactions du système immunitaire avec l'organe greffé.

Dans l'étude des molécules cytotoxiques (Chapitre 2)' nous avons conclu que la

stimulation mitogénique des PBMCs ne semblait pas nécessaire à l'obtention d'un signal

optimal. Nos résultats n'ont montré aucune différence significative dans l'intensité du

signal avant et après stimulation (figure 2.2). Nous supposons qu' avant la stimulation les

cellules avaient déjà atteint un plateau dans la production d'ARN servant à la transcription

des molécules cytotoxiques. C'est pour cette raison que la stimulation mitogénique n'a pas

changé le niveau d'expression de ces molécules. Nous avons aussi déduit que

l'augmentation des molécules cytotoxiques se faisait graduellement au cours de la période

précédant le rejet, comme nous a montré l'étude discutée au chapitre 3.

La méthode de RT-PCR s'est avérée plus sensible que la méthode enzymologique

dans l'analyse de la GrB. Toutefois, il est encore trop tôt pour conclure a ce sujet. D'autres

études devront être effectuées avec un plus grand nombre de patients. Outre cela, la mesure

de l'activité enzymatique a montré les mêmes résultats que l'analyse de l'expression

génique chez les receveurs sans rejets. Cette méthode n'est pas écartée complètement

malgré le fait qu'elle pourrait s'avérer être moins sensible.

Dans un deuxième temps, l'étude des différentes molécules au sein du système

immunitaire nous a permis de connaître l'identité des composantes impliquées dans les

interactions système immunitaire-greffon. Ainsi, l'étude de la modulation de l'expression

génique de 1'ARNm de différentes cytokines nous a montré que celles-ci étaient engagées

de façon active lors des épisodes de rejet aigu de I'allogreffe rénale (Chapitre 3). Plus

spécifiquement, cette étude nous a permis d'observer que l'IL-4, l'IL-5, l'IL-6 et I'iNFy en

plus des molécules cytotoxiques GrB et Perforines étaient des indicateurs spécifiques du

rejet aigu (Section 3.4). L'expression de I'ARNm de ces molécules est augmentée de façon

significative au moment du rejet. Malgré le f ~ t que les molécules cytotoxiques (GrB et P)

sont de bons marqueurs, les cytokines (IL-4, IL-5 et IL-6) se sont avérées être de meilleurs

marqueurs que les molécules cytotoxiques étant d o ~ é que nous avons détecté

l'augmentation de P aussi chez les patients sans rejet. L'INFy augmente aussi de façon

significative lors du rejet aigu. Cependant, il est possible que l'on détecte dans les PBMCs

du patients la production d'MFy provenant des cellules NK.

L'augmentation de l'expression de I'ARNm des cytokines (IL-4, IL-5, IL-6) est

significative chez 50% des receveurs ayant un rejet aigu. Lorsque 2 de ces 3 marqueun

sont augmentés pour un patient donné, on identifie 75% des patients ayant un rejet aigu

comparé à 15% des patients sans rejet. Nous avons remarque que 2 patients (no7 et no8)

qui ont reçu le diagnostic Bordeline (a la limite d'un rejet aigu) n'ont pas eu

d'augmentation significative de l'expression de 1'ARNm de ces marqueurs

comparativement aux autres patients en rejet aigu. Lorsque l'on ne tient pas compte de ces

2 patients, 100% des patients avec un rejet aigu sont identifiés comparativement à 15%

pour les patients sans rejet.

L'analyse des marqueurs immunitaires au sein des PBMCs pourrait donc constituer

un test de première ligne permettant de déterminer la nécessité de pratiquer une biopsie de

l'allogreffe. L'expression génique des cytokines IL-4, IL-5 et IL-6 dans le sang

périphérique pourrait, par conséquent, être destiné à la discrimination des receveurs

immunosupprimés qui sont immunologiquement stables de ceux qui sont prédisposés sur le

plan immunologique à faire un rejet (Krams SM., et al. , Transplantation, 1992 ;

Gorcynski M. , et al. , Surgery, 1996 ; Vasconcellos LM. , et al. , Transplantation, 1998 ;

93

Rukavina D., et al. , Transplantation, 1996). De plus, la positivité de ces marqueurs dans le

sang périphérique poumit influencer grandement la décision entourant l'initiation de la

thérapie anti-rejet.

Notre étude n'a montré aucune corrélation entre l'expression de 1'ARNm de l'IL-2

(Martinez OM. , et al., Transplantation, 1992 ; Cosenza CA. , et al. , Liver Transplant.

Surg. ,1995), de l'IL40 et de l'IL45 ainsi que du Fas Ligand avec les dysfonctions de

I'allogre Re rénale (Section 3.4).

L'IL-IO, est une cytokine particulière qui pourrait jouer des rôles contradictoires

dans différentes conditions. Elle pourrait donc avoir dans certaines situations, des effets

irnmunostimulateurs associés au rejet (Matesic D., et ai. , The Journal of Immunology,

19%) et dans d'autres situations elle pourrait avoir des effets immunosuppresseurs associés

à la tolérance (Gorczynski M., et al., Cell. Immunol. , 1995).

L'IL- 15 n'est pas fabriquée par les cellules T et peut agir sur différentes cellules du

système immunitaire. L'observation du niveau élevé de cette cytokine chez le groupe de

patients avec un rejet aigu est en accord avec les études montrant une augmentation de cette

cytokine dans le greffon en rejet (Pavlakis M., et al., Transplantation, 1996 ; Carson We., et

al. J. Exp. Med., 1994). L'IL-1 5 peut remplacer l'IL-2 dans le processus de rejet. il a été

démontré que le polymorphisme des gènes du TNFa et de l'IL40 était associé au rejet

(Turner D.. et al., Transplantation, 1997). Tout comme cette découverte, les receveurs qui

ont un génotype qui favorise la production d'IL- 15 peuvent être plus susceptibles aux

dysfonctions de la greffe.

Le rôle des interactions Fas/Fas L avec le rejet n'est pas encore bien COMU (Sunder-

Plassmann G., et al. , Kidney Int. , 1990). Selon notre étude, il ne serait apparemment pas

requis pour engendrer le processus de rejet aigu. Cependant, nos résultats supportent une

étude récente dans laquelle le rejet aigu de I'allogreffe rénale serait associé

préfërentieilement a l'action des granules cytotoxiques relâchées par les CTLs plutôt

qu'aux interactions FasEasL qui seraient plutôt associées au rejet chronique (Olive C.,et

al.,Transpl. Immunol., 1999).

Malgré les efforts constants réalisés dans ce domaine, les questionnements sur les

rôles relatifs de chacune des cytokines étudiées dans le sang périphérique par rapport au

phénomène de rejet persistent encore à ce jour. L'objectif est l'atteinte d'une constance

entre les résultats d'analyse sur la dynamique immune à l'intérieur du sang périphérique

lors du rejet aigu et les résultats analysés à l'intérieur du greffon par une technique qui a

fait ses preuves, la biopsie à l'aiguille. L'analyse des marqueurs du système immunitaire à

l'intérieur des PBMCs pourrait offrir l'avantage de détecter les dysfonctions du greffon

avant que celui-ci n'ait subi de dommages cliniques qui sont parfois irréversibles. Elle

pourrait aussi faciliter l'initiation d'une thérapie anti-rejet sans délai et ce, bien avant les

manifestations cl iniques et blessures à l'organe greffé.

D'autre part, il serait intéressant d'entreprendre des travaux sur l'immunité

humorale entourant le tejet de greffe. C'est-&-dire, sur l'interaction des anticorps avec

l'organe greffé et sur la modulation de I'expssion des molécules d'adhésion. Ainsi donc,

cela permettrait aux cliniciens d'avoir une we d'ensemble des interactions moléculaires au

sein du système immunitaire en relation avec l'organe greffe. Ceci semble être un champ

d'étude intéressant qui entraînerait l'avènement de hturs immunosuppresseurs et la mise au

point d'un outil diagnostique complet et efficace.

En conclusion, cette étude a démontre que la technique de RT-PCR constituait une

méthode de choix pour ce genre d'analyse. Cette méthode s'avère non seulement simple,

rapide et efficace mais elle représente pardessus tout, aussi un outil d'analyse non invasif

et sans danger pour les patien~Finalement cette recherche_nous a montré que l'analyse de

l'IL-4, l'IL-5, l'IL-6, I'INFy et des molécules cytotoxiques GrB et P comme marqueurs du

système immunitaire à l'intérieur des PBMCs pourrait représenter un test de départ

permettant de déterminer la nécessité de pratiquer une biopsie de l'allogreffe.

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