DEVELOPPEMENT D’UNE THERAPIE

OPTOGENETIQUE DANS LE CADRE

DES RETINITES PIGMENTAIRES

Encadrement : Laurence Nieto et Rémy Poupot

Camille GRASMUCK

Mélissa HANIQUE

Victor TRAMON

Yannick VIEU

Remerciements

Nous souhaitons remercier tout d’abord Laurence Nieto pour l’aide précieuse qu’elle nous a

apportée, pour sa bienveillance en toutes circonstances. Nous la remercions également pour la

confiance qu’elle nous a témoignée tout au long du projet malgré l’exotisme de notre sujet.

Nous remercions Rémy Poupot pour son attention et sa sympathie.

Enfin, nous remercions tous les acteurs de notre année de master, pour cet apprentissage

agréablement intensif.

« Comment un parachutiste aveugle sait-il qu'il va toucher le sol ?

Quand il y a du mou dans la laisse du chien. »

Résumé

La rétinite pigmentaire regroupe un ensemble de maladies progressives et génétiques

qui amène à une perte de la vision incurable et touchent deux millions de personnes à travers la

monde. Cette pathologie induit une dégénérescence précoce des photorécepteurs de la rétine et

de l'épithélium pigmentaire. Les cônes sont les cellules photoréceptrices permettant la vision

diurne. En cas de rétinite pigmentaire, ils sont très vite dégénérés. La dégénérescence

commence par les segments externes. Cette structure particulière est responsable de la

transduction du signal lumineux en signal chimique.

Dans le but de progresser dans la thérapie des rétinites pigmentaires, Busskamp et ses

collaborateurs ont montré que l’expression du cluster de microARNs 183/96/182 est suffisant

pour le maintien des segments externes lorsque la machinerie de maturation de l’ensemble des

microARNs est absente. Cependant, le modèle étudié ici n’est pas représentatif d’une

pathologie existante chez l’Homme. Ainsi, le projet c’est tourné vers une autre perspective

appelée la thérapie optogénétique.

Table des matières Glossaire .................................................................................................................................... 1

Introduction .............................................................................................................................. 2

La rétine .................................................................................................................................. 3

La rétinite pigmentaire ............................................................................................................ 4

MicroARNs et photorécepteurs .............................................................................................. 5

Présentation de la publication (Busskamp et al., 2014) ........................................................ 7

La perte des microARNs dans les connes adultes conduit à la perte des segments externes . 7

Les miR-182 et 183 sont suffisants pour le maintien des segments externes ......................... 8

Le cluster mir-182/96/183 induit la formation de courts segments externes de cônes et une

photoréponse in vitro ............................................................................................................ 10

Projet de recherche ................................................................................................................. 12

I. Choix des modèles et purification des cellules ganglionnaires ..................................... 12

II. Identification d’un promoteur spécifique des cellules ganglionnaires .......................... 13

1) Transcriptome des cellules .......................................................................................... 13

2) Vérification de la spécificité du gène.......................................................................... 13

3) Définition du promoteur ............................................................................................. 14

III. Construction du système de transduction ...................................................................... 15

1) Transduction d’un photo-senseur dans la rétine par AAVs ....................................... 15

2) Production des AAVs ................................................................................................. 16

IV. Validation du système .................................................................................................... 17

1) Test de localisation du photo-senseur ......................................................................... 17

2) Tests fonctionnels ...................................................................................................... 18

Perspectives ............................................................................................................................. 20

Bibliographie ........................................................................................................................... 21

1

Glossaire

AAV : Adéno-associated Virus

miR : MicroARNs

RP : Rétinite Pigmentaire

KO : Knock Out

ChR2 : Channelrhodopsine-2

NpHR : Natronomonas Pharaonis Halorhodopsine

WT : wild type / sauvage

DGCR8 : DiGeorge syndrome critical region 8

C-DGCR-KO : Knock out de DGCR8 cône spécifique

P30, P60, … : Postnatal day / Nombre de jour après naissance

Sh-miR : Short hairpin microRNA

ES : Embryonnic Stem Cells

CNG : Cyclic nucleotide-gated

FRT-seq : Flowcell Reverse Transcription Sequencing

eGFP : enhanced Green Fluorescent Protein

eYFP : enhanced Yellow Fluorescent Protein

ITR : Inverted Terminal Repeat

PEI : Polyéthylènimine

Tet : Tetracycline

CG : Copie de génome

PEV : Potentiels évoqués visuels

Figure 1 : Schéma d’une coupe transversale de

rétine humaine.

La couche externe, la sclérotique, est une enveloppe de

protection. Elle donne à l'œil sa couleur blanche et sa

rigidité.

La Choroïde est en continuité avec le corps ciliaire et

l'iris, qui se situent à l'avant de l'œil. Elle absorbe les

rayons lumineux inutiles pour la vision, elle est très

riche en vaisseaux sanguins afin de nourrir les

photorécepteurs de la rétine.

La rétine est une membrane recouvrant le fond de l’œil.

C’est la couche sensible à la lumière grâce aux cellules

photoréceptrices.

La cornée est une membrane solide et transparente au

travers de laquelle la lumière entre à l'intérieur de l'œil.

La cornée est privée de vaisseaux sanguins, elle est

donc nourrie par un liquide fluide comme l'eau :

l'humeur aqueuse. La cornée est la principale lentille

de l'œil, elle assure environ 80% de la réfraction.

Le cristallin est une lentille auxiliaire molle.

B

A

Figure 2 : Organisation de la rétine.

(A) Coupe de rétine schématisée et détaillée en bas. La

lumière arrive et traverse l’ensemble des couches

cellulaires jusqu’à atteindre les segments externes

des photorécepteurs (bâtonnets et cônes). Suite à

l’interprétation du signal par les photorécepteurs,

celui-ci passe par les cellules bipolaires. A ce

niveau les amacrines et les cellules horizontales

permettent la transmission latérale des

informations. Pour finir, les cellules ganglionnaires

transmettent le signal vers le nerf optique.

(B) Schéma des photorécepteurs : cônes et bâtonnets.

Ils sont constitués d’une partie axonales permettant

de transmettre le signal. Avant ça, le segment

externe interprète les photons lumineux et les

transmets à la terminaison axonique via le segment

interne.

2

Introduction

La rétine

La rétine est l’organe responsable de la sensibilité à la lumière au sein de l’œil (cf. figure 1).

Elle couvre 75% de la face interne du globe oculaire et est intercalée entre l’humeur vitrée et

l’épithélium pigmentaire sous-choroïdal. Elle est composée de nombreux types cellulaires en

couches permettant l’interprétation du signal lumineux et la transmission au nerf optique. Celui-

ci envoie alors le signal vers le cerveau. Curieusement, la lumière doit traverser successivement

les différentes couches cellulaires de la rétine avant d’atteindre les photorécepteurs.

Les photorécepteurs sont les cellules de la rétine sensibles aux signaux lumineux. Il en existe

deux types : les cônes et les bâtonnets (cf. figure 2) (Larhammar et al., 2009). Ces cellules

interprètent l’arrivée des photons en les transformant en signaux électrochimiques. Les

bâtonnets sont les cellules responsables de l’interprétation du signal lumineux crépusculaire et

nocturne en noir et blanc. Elles sont donc très sensibles à l’intensité de la lumière. En

contrepartie, les cônes sont les cellules rétiniennes permettant l’interprétation du signal

lumineux diurne et en couleur. Les cônes font aujourd’hui l’objet de nombreuses études du fait

de leur large implication dans les pathologies liées à la vision, comme la dégénérescence

maculaire liée à l’âge ou les rétinites pigmentaires (Busskamp et al., 2014). Les photorécepteurs

sont constitués d’un segment externe sensible aux photons, d’un segment interne relié au

segment externe par un cil connecteur et enfin d’une terminaison axonique (cf. figure 2B). Le

segment externe est constitué d’un empilement de disques membranaires renouvelés en

permanence. C’est à ce niveau que la réaction de ces cellules à l’énergie lumineuse a lieu. Elle

est due à la présence de protéines membranaires appelées opsines qui se localisent

exclusivement au niveau des segments externes. Cette famille de protéines est photosensible

grâce à la liaison avec un chromophore.

En aval de cette couche cellulaire, une succession de cellules gliales et neuronales permettent

la transduction du signal vers le nerf optique (cf. figure 2A). Parmi ces cellules indispensables

à la vision, les neurones bipolaires, cellules horizontales et amacrines s’organisent dans une

couche de cellules. Pour finir, les cellules ganglionnaires ON/OFF sont les dernières cellules

rétiniennes transductrices du signal avant le nerf optique. Les cellules ON se dépolarisent et les

cellules OFF s’hyperpolarisent lorsque les photorécepteurs sont exposés à la lumière.

Rétine saine Rétinite Pigmentaire

Hyperpigmentation de la rétine Amincissement des vaisseaux

Figure 3. Diagnostic d’une rétinite pigmentaire par fond d’œil.

A gauche, un fond d’œil sain. A droite, un fond d’œil de rétine atteinte de rétinite pigmentaire.

Les vaisseaux sanguins sont nettement amincis et la rétine est marquée par des taches

d’hyperpigmentation.

3

Leur position dans la transduction du signal en fait une cible potentielle intéressante pour les

thérapies dans le cadre de dégénérescences de la rétine. En effet, dans le cadre des différentes

rétinites pigmentaires, les cellules rétiniennes dégénérées peuvent être multiples et variées.

Ainsi, le ciblage des cellules ganglionnaires garanti une réponse quelles que soient les

dégénérescences cellulaires en amont de la transmission du signal.

La rétinite pigmentaire

La rétinite pigmentaire (RP) regroupe un ensemble de maladies progressives et génétiques qui

amènent à une perte de la vision incurable et touchent deux millions de personnes à travers la

monde (Busskamp et al., 2011). Elle atteint donc une personne sur quatre mille et représente la

cause la plus fréquente de cécité pour les personnes d'âge intermédiaire dans les pays

développés. Cette pathologie induit une dégénérescence précoce des photorécepteurs de la

rétine et de l'épithélium pigmentaire entraînant ainsi comme premier symptôme, la perte de la

vision nocturne suivie d'un rétrécissement du champ visuel pour finir par une perte de la vision

centrale.

Un diagnostic précoce est possible par électrorétinogramme, on peut ainsi observer chez les

personnes atteintes de rétinite pigmentaire un retard de la réponse au stimulus lumineux et une

baisse de l'amplitude de cette réponse. De plus, ces effets sont proportionnels à la gravité de la

maladie. Le diagnostic tardif se réalise par fond d'œil sur lequel on peut détecter une

hyperpigmentation de la rétine et un amincissement des vaisseaux sanguins (cf. figure 3). Dans

30% des cas les patients présentent des syndromes associés dont le plus courant est la surdité

dans le syndrome d'Usher. Actuellement il n'existe pas de traitement curatif.

Pour les différentes RP, des mutations dans plus de 44 gènes ont pu être identifiées et encore

50% des cas de RP n’ont pas encore été décrits (Farrar et al., 2002). Les RP sont donc

représentées dans la population par de trop nombreuses mutations génétiques pour envisager

une quelconque thérapie génique (Smith et al., 2009). A ce jour, les gènes mutés identifiés sont

essentiellement impliqués dans les premières étapes de transduction du signal lumineux dans la

rétine et plus spécifiquement dans les bâtonnets. La mort de ces derniers est étroitement liée à

la dégénérescence des segments externes photosensibles des cônes (Sancho-Pelluz et al., 2008).

C’est pour cela que Busskamp et ces associés ont cherché à régénérer les segments externes de

cônes qui sont la partie essentielle pour l’interprétation des signaux lumineux (cf. figure 2)

AAA m7G

DROSHA/DGCR8

Pri-miARN

Gène

miARN Exon Exon

MicroARNs

Pré-miARN

DICER

miARN duplex

miARN

Transcription

Figure 4. Voie de maturation des microARNs au

sein des cellules.

La première étape de transcription d’un intron ou un

gène permet de donner un pri-miARN. Celui-ci est

pris en charge par le complexe Drosha/DGCR8 pour

donner un pré-miARN. Enfin, DICER effectue la

maturation terminale du pré-miARN en miARN

duplex donnant ainsi un miARN.

4

(Busskamp et al., 2014). En effet, les segments externes des cônes sont indispensables pour la

vision et ils sont dégénérés dès les stades précoces de RP. C’est au niveau de ces segments que

les protéines photoréceptrices de type opsines jouent le rôle d’interprétation des photons.

MicroARNs et photorécepteurs

Dans une publication récente, l’équipe de Busskamp a voulu étudier les voies moléculaires qui

contrôlent la maintenance des segments externes chez les adultes sains (Busskamp et al., 2014).

Les microRNAs (miRs) sont connus pour avoir un rôle essentiel dans le développement

fonctionnel des cônes. Ce sont des répresseurs post-transcriptionnels de l’expression des gènes.

Leur biogénèse se produit en deux étapes (cf. figure 4). Les premiers ARN transcrits, les pri-

miRNAs, sont clivés en pré-miRNAs par le complexe Drosha/DGCR8, puis sont ensuite pris

en charge par Dicer pour devenir des miRNAs matures (Krol et al., 2010). Ainsi, Busskamp et

ses collaborateurs ont montré que le disfonctionnement de DGCR8 peut causer la perte des

miRNAs dans les photorécepteurs et en conséquence la perte des segments externes des

photorécepteurs chez la souris (Busskamp et al., 2014). Ceci entraine alors une perte

significative de la réponse des cellules à la lumière. Par la suite, grâce à la réexpression des

miR-182 et miR-183 spécifiques des cellules sensorielles, ils ont pu montrer qu’il y avait

maintien des segments externes de cônes. Dans le contexte d’une culture de cellules souches

dérivées en cellules rétiniennes, ces miRNAs sont nécessaires et suffisants à la formation de

segments internes, de cils connecteurs et de courts segments externes. Cette publication que

nous présenterons par la suite, a servi de support à l’établissement du projet.

Malheureusement, l’ensemble des recherches effectuées sur les rétinites pigmentaires a montré

que l’utilisation des miRNAs pour rétablir la fonctionnalité des cônes dégénérés n’est pas un

projet envisageable. En effet, ces miRs pourraient être utilisés en guise de prévention à la perte

des segments externes mais ne permettent pas encore d’envisager un rôle thérapeutique post-

traumatique. Les travaux de recherches de Busskamp et ses associés sont faits sur un Knock

Out (KO) de DGCR8 qui ne correspond à aucune pathologie connue à ce jour. De surcroît, les

rétinites pigmentaires entraînent une dégénérescence de la rétine à un stade plus ou moins

avancé et parfois la mort des cellules photoréceptrices dans leur totalité (Busskamp and Roska,

2011).

5

Optogénétique

Une alternative réside dans l'application d'une nouvelle technologie, l'optogénétique. Cet outil

a été mis en place suite à la découverte de la Channelrhodopsine-2 (ChR2) microbienne. Cette

opsine est capable de dépolariser les cellules des tissus mammifères suite à une exposition à la

lumière et ceci sans cofacteurs additionnels habituellement indispensables.

Cette découverte a mené au développement d’un grand nombre de photo-senseurs

« optogénétiques » du même type. Ainsi, cette stratégie consiste en l'expression de cette

molécule ectopique, appelée photo-senseur, pour l’induction d’un changement de potentiel

membranaire des cellules cibles suite à un stimulus lumineux. Il s'agit donc de cibler des cellules

et d’en faire des cellules photoréceptrices artificielles. Ainsi, la transmission du signal

électrique jusqu'au nerf optique est restaurée.

Une étude récente d'optogénétique se base sur l'utilisation ChR2 (Chlamydomonas reinhardtii),

canal ionique activable par la lumière bleue et NpHR (Natronomonas pharaonis), pompe à

chlore activable par la lumière jaune et entraînant une hyperpolarisation membranaire

(Busskamp et al., 2010). Ces deux protéines peuvent être insérées soit de manière indifférenciée

dans les cellules de la rétine, soit en ciblant l'expression de ChR2 dans les cellules

ganglionnaires ON et NpHR dans les OFF afin de restaurer une réaction physiologique. Mais

ils peuvent également être exprimés dans les cellules bipolaires (ON/OFF) les cônes voir les

cellules amacrines (Busskamp et al., 2011). Ces dernières activent et inhibent les cellules ON

et OFF et ne nécessitent donc pas une expression différentielle des deux protéines. Il existe trois

types de protéines photo-senseurs : des pompes entraînant une hyperpolarisation, des canaux

entraînant une dépolarisation ou des récepteurs couplés aux protéines G activant un canal.

Cette approche de supplémentation génique est une stratégie conceptuellement simple et

attrayante si, comme c’est le cas pour les RP, la maladie est due à une perte de fonction.

Dernièrement, Maguire a montré les progrès dans la thérapie génique pour une pathologie au

niveau de l’épithélium pigmentaire de la rétine (Maguire et al., 2008). Leur étude a non

seulement offert un espoir pour les patients atteints de cette maladie, mais aussi a entraîné la

confiance générale dans les stratégies de thérapies géniques pour les maladies rétiniennes en

démontrant la sécurité et l’efficacité des Adeno-associated virus (AAVs). Les AAVs permettent

une expression stable et à long terme (Kwong et al., 2014).

6

De surcroît, ils permettent le ciblage d’un type cellulaire via l’utilisation d’un promoteur

spécifique ou l’adaptation du sérotype de la capside. Ainsi, dans le cadre de l’optogénétique,

l’apport d’un photo-senseur par AAVs dans la rétine peut restaurer artificiellement une activité

rétinienne proche de celle trouvée dans une rétine normale (Busskamp et al., 2011).

En somme, l’optogénétique via l’utilisation des AAVs représente une stratégie attrayante dans

le cadre de l’étude des RP. En premier lieu, la dégénérescence des cellules de la rétine dans le

cadre des RP est difficile à prédire. C’est pourquoi, la stratégie d’optogénétique via les AAVs

pourrait servir pour le ciblage des cellules ganglionnaires qui sont comme précédemment

évoqué, les dernières cellules responsables de la transmission du signal au nerf optique. Ainsi,

l’efficacité de l’optogénétique dans ces cellules ne dépendra pas de l’état de dégénérescence

des cellules en amont comme les photorécepteurs ou les cellules bipolaires. Le projet exposé

ici est issu de cette réflexion et de nombreuses recherches suite à la lecture des travaux de

Busskamp et ses collaborateurs (2014). Ainsi, avant de décrire le projet, nous résumerons cette

publication.

Figure 5 : Les cônes de souris C-DGCR-KO à P60 perdent leurs segments externes et leurs fonctions

(A) Western Blot quantitatif révélé avec un anticorps anti-DGCR8 sur des cônes de souris Wild Type (WT) ou Knock Out (KO) C-DGCR8-KO

à P30 (n=3). Le témoin de charge utilisé est la tubuline avec son anticorps associé (anticorps Anti-tubuline).

(B) Mesure RT-qPCR de miRNAs matures d’intérêts (n=3) dans des cônes à P30.

(C) Electrorétinogramme photopique (reflétant principalement l’activité des cônes) de rétines WT ou KO à P30 stimulées avec de la lumière

aux intensités indiquées. Comme contrôle un électrorétinogramme scotopique est montré en haut (reflétant principalement l’activité des

bâtonnets).

(D) Western Blot quantitatif révélé avec un anticorps anti-DGCR8 sur des cônes de souris Wild Type (WT) ou Knock Out (KO) C-DGCR8-KO

à P60 (n=3). Le témoin de charge utilisé est la tubuline avec son anticorps associé.

(E) Mesure RT-qPCR de miRNAs matures sélectionnés (n=3) dans des cônes à P60.

(F) Electrorétinogramme photopique (reflétant principalement l’activité des cônes) de rétines WT ou KO à P60 stimulées avec de la lumière

aux intensités indiquées. Comme contrôle un électrorétinogramme scotopique est montré en haut (reflétant principalement l’activité des

bâtonnets).

7

Présentation de la publication (Busskamp et al., 2014)

Le disfonctionnement des segments externes des cônes est le premier signe de dégénérescence

de la rétine. Dans cet article, l’importance des microARNs miR182 et 183 a été étudiée. Il a été

démontré que ces deux miRNAs sont nécessaires et suffisants pour la formation du segment

interne, du cil connectant et d’un court segment externe dans les cellules ES dérivés en rétine

in vitro. Les résultats ont aussi permis de montrer que les voies de régulations gérées par les

miR182 et 183 sont nécessaires pour le maintien des segments externes in vivo et de leur

fonction in vitro.

La perte des microARNs dans les cônes adultes conduit à la perte des segments externes

Afin d’étudier le rôle des miRNAs dans la viabilité des cônes adultes, les auteurs ont

génétiquement interrompu la machinerie Drosha/DGCR8 permettant la formation des miRNAs.

Pour cela ils ont croisé des souris dans lequelles DGCR8 est floxé (encadré par des sites LoxP)

avec des souris exprimant spécifiquement la Cre-recombinase dans les cônes (D4-Cre

hétérozygotes). La lignée résultante de ce croisement, KnockOut DGCR8 cône spécifique (C-

DGCR-KO) est obtenue après recombinaison homologue dans l’exon 3 floxé du gène cible,

provoquant un décalage du cadre de lecture et la production d’une protéine tronquée. Dans les

différentes expériences, ils ont utilisé des vecteurs viraux conditionnels (AAVs) pour effectuer

l’infection des cônes C-DGCR-KO ou WT.

Trente jours après la naissance des souris (P30), la rétine est totalement développée. A ce stade,

le western blot quantitatif anti DGCR8 révèle une diminution de plus de 50% de la protéine

dans les cônes C-DGCR-KO (cf. figure 5A). A P60 (60 jours après la naissance), la production

de DGCR8 chez le C-DGCR-KO est quasiment nulle (18% du WT) (cf. figure 5I). De surcroît,

le niveau de microARNs matures diminu seulement de 20-25% pour le cluster de

miR183/96/182 à P30 (cf. figure 5B) alors qu’à P60 ces miRs sont quasiment absents (cf. figure

5J). Il semble donc que le KO de DGCR8 est totalement effectif à P60.

Pour étudier l’influence du KO, le nombre de cellules coniques a été estimé (résultats non

montrés). Celui-ci ne varie pas entre les rétines de souris WT et C-DGRC-KO. Les auteurs ont

aussi montré que l’opsine n’est plus présente dans les cônes C-DGCR-KO (résultats non

montrés). Donc, l’opsine est nécessaire pour la photoréponse des cônes.

Figure 6 : Rétrécissement des segments externes de cônes de souris C-DGCR-KO entre P30 et P90

(A) Quantification de la surface d’une coupe transversale de SI (Segment Interne), CC (Cil Connecteur), et SE (Segment Externe) de

cône P60 WT (blanc) et P60 KO (noir).

(B) Vue de côté de cônes à P30, P40, P50, et P60 C-DGCR8-KO. (C) Quantification de la longueur du SE (Segment Externe) à P30, P40, P50, et P60 sur des cônes WT et KO. Barre d’erreur : erreur

standard à la moyenne.

Figure 7 : La réintroduction des miR-182 et 183 sont suffisants

pour le maintien des segments externes de cônes (A) Expression conditionnelle d’une cassette DGCR8 AAV

conduite par un promoteur CMV. En présence de Cre-

recombinase, la séquence d’ADN encadrée par deux sites différents loxP (triangles noir et gris) est inversée, permettant

l’expression de DGCR8. WPRE : woodchuck hepatitis virus

post transcriptional regulatory element. (B) Quantification de l’immunomarquage des opsines OPN dans

des cônes WT, KO, et KO rescue (complémenté) à P90.

8

La fonctionnalité des cônes est alors testée in vivo par électrorétinographie.

L’électrorétinographie consiste à mesurer la réponse à la lumière des cellules rétiniennes. Le

scotopic flash permet de mesurer la réponse à la lumière des bâtonnets. Le flash photopique

permet de mesurer la réponse des cônes. A P30, l’électrorétinographie ne révèle pas de

différence entre la réponse au stimulus lumineux des rétines WT et C-DGCR-KO (cf. figure

5C). En revanche, la réponse à P60 est fortement diminuée dans les cônes de rétine C-DGCR-

KO (cf. figure 5F).

Pour révéler les changements morphologiques des cônes à P60, des biopsies 3D de rétines de

souris P30 et P60 C-DGCR-KO sont analysées par microscopie électronique (SBEM :

technique de microscopie à haute résolution 3D). Les cônes des C-DGCR-KO P60 ont perdu

leurs segments externes. Le diamètre du segment interne est plus large que dans les souris WT

(cf. figure 6A). Le corps cellulaire du cône et l’organisation nucléaire sont intactes et

n’apparaissent pas être différents du WT (données non montrées). La morphologie des cônes à

P30 dans les souris C-DGCR-KO et la morphologie des bâtonnets à P30 ainsi qu’à P60 de

souris C-DGCR-KO apparaissent normaux (données non montrées). Pour déterminer le temps

qu’il faut pour perdre le segment externe, ils ont reconstruit en 3D la rétine externe tous les 10

jours entre P30 et P60. Les segments externes des cônes P30 C-DGCR-KO ont une longueur

similaire au WT, mais à chacun des points de temps suivant ils raccourcissent de façon linéaire

jusqu’à devenir indétectables à P60 (cf. figure 6B et 6C). Cela indique que DGCR8 est

nécessaire au maintien des segments externes des cônes dans la souris adulte.

Ensuite, DGCR8 est réintroduit dans des cônes P45 (rescue) C-DGCR-KO via un AAV (cf.

figure 7A). La séquence WPRE rajoutée en 3’ permet d’augmenter la stabilité de l’ARN

messager. A P90, le niveau d’opsine dans les cônes est alors significativement plus haut dans

les rétines C-DGCR-KO infectées par AAV que dans les rétines contrôles non infectées (cf.

figure 7B). Donc, la réexpression de DGCR8 est suffisante pour ré-initier l’expression de

l’opsine.

Les miR-182 et 183 sont suffisants pour le maintien des segments externes

Les auteurs ont précédemment mis en évidence que l’absence des miRNAs induit la perte

progressive des segments externes des cônes. Selon eux, si cette perte est due à l’absence de

miRNA matures, alors la réexpression des miRNA les plus pertinents (soit les plus exprimés)

Figure 8 : La réintroduction des miR-182 et 183 est suffisant pour le maintien des segments externes de cônes

(A) Profil d’expression des miRNAs matures dans les cônes des souris Wild Type à P60 (séquençage haut débit)

(B) Cassettes d’expression de sh-miR du vecteur viral adéno-associé (AAV) sous l’influence du promoteur CMV. En présence de Cre, le segment d’ADN

flanqué de sites loxP est inversé, réprimant le répresseur Tet (TetR) et activant l’expression de la GFP. En absence de TetR les sh-miRs sont exprimés

via le promoteur H1-TetO2.

(C) Observation par microscopie confocale du sauvetage des segments externes des cônes (souris C-DGCR8-KO), et de l’expression d’opsine par les

sh-miR-183/182. Marquage GFP des cônes infectés (Jaune) ; Opsine (vert) ; Marquage spécifique des cônes par tdTomato (magenta). La ligne en

pointillé indique la localisation des segments externes.

(D) Quantification des opsines (OPN) suite à l’immunomarquage effectué en (C) (foci).

(E) Observation par microscopie confocale des cônes de souris C-DGCR8-KO à P90. La réexpression de miR-182/183 à P60 ne permet pas la

restauration des segments externes 30 jours après. Marquage GFP des cônes infectés (Jaune) ; Opsine (vert) ; Marquage des cônes par tdTomato

(magenta).

9

dans les cônes C-DGCR-KO permettrait de prévenir ce problème. L’expression des miRNAs

dans les cônes « adultes » chez les souris wild type (soit à 60 jours postnatals) a été révélée par

séquençage haut débit. Les auteurs ont estimé que les miRNAs les plus exprimés seraient

probablement ceux impliqués dans la maintenance des segments externes des cônes (cf. figure

8A). Le profil d’expression des miRNAs est très inégal. Le miR-182 est le plus abondant et

représente à lui seul 64 % d’abondance par rapport à la population totale de miRNAs. Sachant

que miR-183, miR-182 et miR-96 (abondance < 1%) sont issus du même transcrit primaire

(cluster miR-183/96/182), les auteurs ont choisi de ré-exprimer miR-182 et miR-183 dans les

cônes C-DGCR-KO, d’autant plus que ces deux miRNAs ont des séquences apparentées.

Afin de s’affranchir du mécanisme de maturation des pri-miRNAs en pré-miRNAs assuré par

le complexe Drosha/DGCR8 (absent dans la lignée C-DGCR-KO), les auteurs ont généré des

ARNs mimétiques des miRNAs matures (sh-miRs) ; ces sh-miRs subissent uniquement la

dernière étape de maturation opérée par DICER, qui génère des miRs matures à partir de pré-

miRNAs. L’expression des miRs dans les cônes C-DGCR-KO est réalisée à 30 jours postnatals

(P30) par infection avec des vecteurs viraux adéno-associé (AAVs) (cf. figure 8A). A ce stade,

les segments externes des cônes sont encore présents comme montré précédemment.

A P65, 35 jours après l’infection, la structure des cônes est analysée par immunomarquage sur

sections rétiniennes : miR-182/183 empêche la perte des segments externes des cônes ainsi que

des opsines (cf. figure 8C). Après avoir vérifié par RT-qPCR que l’expression des sh-miRs

182/183 n’a pas d’influence sur l’expression des autres miRNAs présents dans les cônes

(résultats non montrés), les auteurs ont pu conclure que la présence des miR-182/183 est

suffisante pour le maintien de segments externes (cf. figure 8D).

Cependant, les auteurs ont voulu examiner si la réexpression de miR-182/183 dans les cônes

C-DGCR-KO permettrait de reformer les segments externes. Le même protocole d’infection

via AAVs est réalisé à P60, c’est-à-dire après la perte des segments externes. L’inspection des

rétines à P90 via immunomarquage indique que les segments externes n’ont pas été restaurés

(cf. figure 8E).

En somme, les miR-182/183 sont suffisant pour le maintien des segments externes de cône dans

les souris C-DGCR-KO mais ne permettent pas de les restaurer après leur dégénérescence.

Figure 9 : Les microARNs du cluster miR-183/96/182 sont nécessaires et suffisants pour la formation de la structure distale des

photorécepteurs dans les cellules ES dérivées en rétine.

(A) Nombre de copies de miRNAs par cellule analysés à différents temps de culture in vitro des cellules ES dérivées. Cette mesure est réalisée en RT-qPCR (n=3). Les échantillons représentés en jaune sont infectés au jour 7 (d7) de culture par des AAVs surrexprimant le cluster miR-

182/96/183.

(B) Les cellules ES différenciées en cellules rétinales sont fixées et analysées en microscopie confocale à différents temps de culture. Les cellules ES dérivées sont infectées avec des AAVs exprimant la GFP et les miR-182/96/183. Le contrôle est fait avec une infection de la culture au

jour 7 avec des AAVs exprimant la GFP. Les immunomarquages de la Rhodopsine (rouge) et de la GFP (jaune) sont montrés. Les noyaux

cellulaires sont marqués par Hoechst (blanc). Barre d’échelle, 20µm. (C) De la même manière que précédemment, les cellules en culture sont observées. Les cellules sont infectées au jour 15 par des AAVs exprimant

le « triple-sponge » miR-182/96/183 et la GFP sous la dépendance d’un promoteur cône spécifique : le promoteur Rho.

10

Le cluster MiR-182/96/183 induit la formation de courts segments externes de cônes et

une photoréponse in vitro

Le cluster d’expression des miR-183/96/182 est nécessaire au maintien de la viabilité des cônes

de souris. Mais il reste encore à identifier et comprendre les effets de l’expression du cluster de

microARNs miR-183/96/182 au sein des cônes. Pour cela l’équipe a mis en place un modèle in

vitro de cellules ES de souris dérivées en cellules rétinales. Grâce à ce modèle, l’équipe a pu

étudier la progression des quantités de microARNs grâce à des RT-PCR quantitatives. En

parallèle, ils ont voulu observer l’évolution de la structure des cônes grâce à la microscopie à

fluorescence. La protéine Rhodopsine est notamment utilisée pour observer les segments

coniques formés. En effet, cette protéine est localisée naturellement dans le segment externe.

Les cellules ES dérivées en cellules rétinales sont étudiées en culture 3D. Dans ce contexte,

elles ne possèdent pas de segments. C’est donc un contexte propice à l’étude de la formation de

segments. C’est une rétine reconstituée in vitro. En effet, au bout de 25 jours de culture (d25),

L’analyse en RT-qPCR révèle une faible expression des miR183 et 182. Quant au miR96, il

n’est pas exprimé au 25ème jour (cf. figure 9A). A ce stade, la structure segmentaire n’est pas

visible en microcopie (cf. figure 9B). En revanche, au 35ème jour de développement des cellules

(d35), le segment interne est présent et l’expression des miR182 et 183 est haute. Toutefois, les

segments externes restent absents (cf. figure 9B).

Ainsi, l’équipe a pu étudier le lien de cause à effet entre l’expression du cluster miR-183/96/182

et la formation de la structure segmentaire interne. Une infection de la culture cellulaire est faite

au 7ème jour de culture avec des AAVs exprimant le cluster miR-183/96/182. Suite à cette

infection, les miRs du cluster sont fortement accumulés au 25ème jour et les segments internes

sont alors observés (cf. figure 9B en jaune). Ainsi, la surexpression de ce cluster de microARNs

entraîne le développement précoce du segment interne.

Mais il est nécessaire de confirmer que l’expression du cluster est nécessaire pour la formation

du segment interne. Pour cela, une construction « triple-sponge » spécifique des miR-

183/96/182 est apportée dans la culture cellulaire. Ainsi, l’activité des trois miRs étudiés est

bloquée in vivo et in vitro (Krol et al., 2010b). Suite à l’apport du « triple-sponge », la structure

des photorécepteurs est absente (cf. figure 9C). Ainsi, l’expression du cluster étudié est

nécessaire et suffisante pour la formation d’un début de structure de photorécepteur à partir de

Figure 10 : Le cluster miR-183/96/182 induit la formation de court segments externes et une réponse à la lumière dans

les cellules ES dérivées en culture rétinienne.

(A) Microscopie électronique de la structure distale au jour 25 d’une cellule ES dérivée en cône par infection au jour 7 avec

un AAV exprimant pri-miR-183/96/182.

(B) Quantification d’une réponse hyperpolarisante d’un pseudo photorécepteur en réponse à une stimulation lumineuse.

11

cellules ES dérivées en cônes.

Suite à ces résultats, les auteurs cherchent l’influence de l’expression de ce cluster sur la

formation de segments externes sur leur modèle cellulaire. Pour répondre à cette interrogation,

une reconstitution par microscopie électronique est faite pour pouvoir observer la morphologie

des cellules. Cette reconstitution est faite à partir de cellules en culture depuis 25 jours et en

présence des microARNs miR183, 96 et 182 (infection au 7ème jour de culture avec des AAVs

exprimant pri-miR-183/96/182). Ainsi, des structures de segments internes avec des

mitochondries et de longs cils connectants ont été mis en évidence (cf. figure 10A). De plus,

dans la partie supérieure de ce cil, il est observé un empilement de disques membranaires

caractéristiques du segment externe des cônes. Cet empilement pourrait être suffisant pour

obtenir une réponse au stimulus lumineux.

Afin de caractériser cette structure abortive de segments externes, la réponse des cellules à la

stimulation lumineuse est étudiée. En effet, celle-ci est strictement dépendante de la présence

du segment externe. Ainsi, pour évaluer la photoréponse, une mesure de l’hyperpolarisation des

cellules est faite. La photoréponse des cellules est effective contrairement aux cellules contrôles

non-infectées (cf. figure 10B).

Grâce à cette étude in vitro, les auteurs ont pu constater que l’expression du cluster miR-

183/96/182 induit la formation d’un court segment externe dans les cellules ES dérivées en

cellules rétinales. Ceci est confirmé par une réponse au stimulus lumineux identique à celle des

photorécepteurs normaux chez les vertébrés.

Grâce au modèle in vivo de souris KO (C-DGCR-KO), les auteurs ont démontré l'importance

des miR-182 et miR-183 pour le maintien des cônes dans la rétine de souris. En effet, en leur

absence les segments externes des cônes sont progressivement raccourcis et leur réexpression

prévient ce défaut. De plus, le cluster miR-183/96/182 s'est révélé nécessaire et suffisant pour

la formation des segments internes, du cil connecteur et de segments externes courts, dans des

cellules ES dérivées en rétine. Ce résultat est prometteur pour les applications thérapeutiques.

Les pathologies rétiniennes dans lesquelles on observe une dégénérescence progressive des

segments externes, pourraient effectivement être abordées par une stratégie de réexpression de

ce cluster de microARNs.

Rétine humaine WT et RP

Purification des cellules ganglionnaires

Transcriptome des cellules ganglionnaires de souris WT et

d’humain WT

RT-PCR sur tous les types cellulaire de la rétine (amacrines, horizontales, cônes,

bâtonnets, bipolaires) avec amorces du gène cible + UNIPROT

Vérification de l’expression spécifique du gène dans les cellules ganglionnaires

Souris WT

(C57BL/6J) Souris RP (GCNA

-/-

-/-

Biopsies de Rétines

Travail in-silico et expériences de gène rapporteur

Design du promoteur

Transfection AAV-eYFP ou AAV-photosenseur-eYFP sur rétines de souris WT ou

RP et sur rétines humaines WT ou RP

Vérification que localisation du photosenseur au niveau des cellules

ganglionnaires

Transfection AAV-vide ou AAV-photosenseur dans souris WT ou RP et dans rétines

humaines WT ou RP

+

Tests fonctionnels

Vérification de la restauration de la réponse à la lumière des cellules rétiniennes

Plan générale de la stratégie d’optogénétique dans le cadre d’une rétinite pigmentaire

12

Projet de recherche

Les cellules ganglionnaires sont les cellules les plus en aval dans la transduction du

signal lumineux, vers le nerf optique qui transmet l'information au cerveau supérieur. Nous

cherchons donc à exprimer spécifiquement notre photo-senseur dans ces cellules. Pour cela

nous devons rechercher un promoteur spécifique des cellules ganglionnaires, en analysant leur

transcriptome. Cette étude nécessite donc la purification de ces cellules à partir d'une biopsie

de rétine (cf. plan).

I. Choix des modèles et purification des cellules ganglionnaires

Dans le but d'obtenir des cellules ganglionnaires de rétine, nous partirons de trois types

de donneurs. Tout d'abord, nous commanderons des souris wild-type C57BL/6J (Claes et al.,

2004). Mais aussi des souris porteuses d'une rétinite pigmentaire, soit la souche CNGA3-/- Rho-

/- (Claes et al., 2004). La mutation Rho-/- (Rhodopsine knockout) entraîne la dégénérescence

des photorécepteurs. Ce résultat est cohérent puisque la rhodopsine est nécessaire au maintien

des segments externes des photorécepteurs. La mutation CNGA3-/-correspond à l'extinction du

gène codant pour la sous unité A3 d'un canal à cation spécifique des cônes (CNG = Cyclic

nucleotide-gated) qui créé une hyperpolarisation des cellules. La perte de CNGA3-/- induit la

dégénérescence des photorécepteurs ainsi que la disparition de leur photoréponse. Cette souche

est donc un bon modèle de rétinite pigmentaire de par l'absence totale de photoréponse. Mais

aussi car elle a l'avantage de conserver une organisation structurale normale de la rétine. Un

autre avantage est la dégénérescence progressive des photorécepteurs, débutant à quatre

semaines après la naissance pour enfin être totale à trois mois.

Pour finir, nous aurons besoin de prélèvements humains issus de donneurs, fournis par

la CorneaBank Amstersdam. La rétine doit être mise en culture moins de 36 heures après la

mort du patient (Busskamp et al., 2010). À partir de ces donneurs nous réaliserons une biopsie

de rétine selon le protocole classique du journal Nature publishing group (Powner et al., 2012)

mais sans les étapes de fixation de la rétine.

13

À partir des biopsies de rétines, nous pourrons isoler du tissu les cellules ganglionnaires

qui nous intéressent grâce à une stratégie de purification utilisant deux anticorps. Cette

technique a été découverte par Barbara A. Barres en 1988 (Barres et al., 1988). Nous suivrons

le "Nature protocols" (Winzeler and Wang, 2013).

II. Identification d'un promoteur spécifique des cellules ganglionnaires

1) Transcriptome des cellules

Grâce à l'étude transcriptomique nous souhaitons trouver un promoteur spécifique des

cellules ganglionnaires. Ce promoteur nous permettra de réaliser une expression du photo-

senseur uniquement dans ces cellules. Afin d'éviter tout biais lié à la rétinite pigmentaire ce

travail sera réalisé sur des cellules wild-type (C57BL/6J), en parallèle sur l'humain et la souris.

Pour commencer il faut extraire les ARN par le TRIzol® Reagent (Life Technologies)

selon la procédure conseillée. Sachant que la purification de cellules ganglionnaires à partir

d’une rétine donne environ 15 000 cellules, que l’extraction d’ARN possède un rendement

d’environ 8-15µg et que l’Illumina nécessite environ 250ng. Nous utiliserons les deux rétines

d’une souris pour faire le transcriptome. Notons aussi que ce transcriptome est réalisé en

triplicate. Ensuite, un enrichissement en ARNm est réalisé via des billes magnétiques

fonctionnalisées par des oligodT (dynabeads®Oligo (dT)25-61002 chez Life Technologies)

pour éviter d'amplifier les ARNr (ribosomiques). Les ARN seront ensuite envoyés à l'entreprise

Illumina afin de réaliser un séquençage haut débit FRT-Seq (Flowcell Reverse Transcription

Sequencing) (Mamanova and Turner, 2011). Le FRT-Seq permet de s'affranchir des biais de

PCR en réalisant la réverse transcription directement sur la puce à partir d'ARN non amplifiés

liés aux adaptateurs. Le traitement des données se fera via le programme DAVID. La fonction

des cellules ganglionnaires est la transduction du signal photoélectrique. Nous analyserons donc

en priorité les gènes impliqués dans la photoréponse (canaux, pompes, transducine,...) afin de

voir si un ou plusieurs d'entre eux sont largement surexprimés par rapport aux autres gènes.

2) Vérification de la spécificité du gène

À partir des gènes sélectionnés, nous désignerons des amorces afin de voir lesquelles

sont spécifiques des cellules ganglionnaires par RT-PCR. Cette analyse se fera sur les ARNm

(ARN messagers) des autres types cellulaires de la rétine à savoir : les cellules bipolaires, les

Tableau 1 : Logiciels utilisés pour l'analyse in-silico et informations apportées

Figure 11 : Carte du vecteur pGL2-Basis (Proméga).

Le pGL2 basic permet l'insertion d'un promoteur à tester, en amont de la luciférase dans le site de multi clonage (MCS en bleu de +1 à

+123). La luciférase est alors sous le contrôle du promoteur et son niveau d'expression dépend de la force et de la régulation du promoteur.

pBR322 origin est une origine de réplication procaryote, elle permet de faire la production de plasmide chez Escherichia coli. Ampicillin

correspond au gène de résistance à l'ampicilline, il est utile pour sélectionner les bactéries transformées pendant l'amplification du plasmide

en bactéries. Les primers EBV_rev et LucNrev sont des séquences à partir desquelles nous pouvons designer des amorces pour le

séquençage du promoteur inséré, pour vérifier notre construction. (Proméga - pGL2-Basic Vector)

14

cellules amacrines, les cellules horizontales, les cônes et les bâtonnets. Le résultat attendu est

une absence d'amplification si le gène est bien spécifique de ces cellules.

L'inconvénient de cette expérience réside dans l'obligation de travailler sur l'ensemble

des ARNm de tous les types cellulaires hormis les ganglionnaires. En effet nous ne pouvons

pas isoler chaque type cellulaire. Nous nous contenterons donc de séparer les cellules

ganglionnaires des autres cellules de la rétine. Si jamais la RT-PCR donnait une amplification,

nous retournerions aux données du transcriptome afin de sélectionner d'autres gènes d'intérêt.

La dernière étape de contrôle du gène d'intérêt consistera à aller voir son profil

d'expression sous le contrôle de son promoteur sur le site UNIPROT.

3) Définition du promoteur

Une fois le gène spécifique des cellules ganglionnaires identifié, nous ferons des

analyses bio-informatiques afin de retrouver le promoteur qui contrôle sont expression. À partir

de la séquence complète du promoteur, nous chercherons quelles sont les régions qui permettent

la meilleure expression du gène. Pour cela nous réaliserons tout d'abord un travail in-silico (cf.

tableau 1) puis des tests de gènes rapporteurs luciférase. L'étude in-silico commence par la

localisation des îlots CpG afin de les exclure puisqu'ils régulent généralement de manière

négative l'expression des gènes une fois méthylés. La recherche de séquences consensus permet

d'identifier des boîtes conservées pouvant être nécessaires à la transcription. Il est donc

nécessaire de les conserver. De même, il faut identifier les motifs similaires des facteurs de

transcription et en repérer les sites de fixations indispensables à la transcription (Casco-Robles

et al., 2014).

À la suite de ces analyses bioinformatiques, nous commanderons différentes

constructions contenants certaines séquences consensus identifiées. Nous testerons ces

constructions expérience de gène rapporteur. Les tests de gène rapporteur dans les cellules

ganglionnaires, serons réalisés par insertion des différents promoteurs dans le vecteur pGL2

(Proméga - pGL2-Basic Vector - cf. figure 11) selon le protocole recommandé. La

normalisation sera réalisée avec le vecteur phRG-TK (Proméga - phRG-TK Vector) qui permet

l'expression de la Renillia Luciferase, en cotransfectant les cellules ganglionnaires.

Figure 12 : Carte du vecteur pGL2-Control (Proméga).

Le pGL2 contrôle permet de vérifier l'efficacité de la transfection , en amont de la luciférase il y a un promoteur fort SV40. La luciférase est alors sous le

contrôle du promoteur et son niveau d'expression est fort et visualisable, donc la détection de luciférase sera tributaire de l'infection cellulaire. pBR322 origin

est une origine de réplication procaryote, elle permet de faire la production de plasmide chez Escherichia coli. Ampicillin correspond au gène de résistance à

l'ampicilline, il est utile pour sélectionner les bactéries transformées pendant l'amplification du plasmide en bactéries. (Proméga - pGL2-Control Vector)

Figure 13 : Illustration du ciblage cellule spécifique d’un AAV par injection

intraocculaire.

Selon le mode de délivrance, les particules virales peuvent cibler les cellules de

l'épithélium pigmentaire (RPE), les photorécepteurs (PR), les cellules de Müller,

les cellules ganglionnaires (GC), les cellules endothéliales de la cornée (CE), les

cellules de l'épithélium de l'iris (IR). Sue les quatre images de coupe de rétine

cellues marquées à l'iodure de propidium), nous pouvons observer quelles

cellules sont ciblées (en vert) en fonction du type de capside utilisée et du mode

d'injection : en haut à gauche, un adeno virus en injection intravitréenne cible

les cellules de Müller; en bas à gauche, un AAV2/2 en injection intravitréenne

cible les cellules de Müller et les cellules ganglionnaires; en haut à droite, un

adéno virus, un lentivirus ou un AAV2/1 en injection subrétinal ciblent les

cellules de l'épithélium pigmentaire; en bas à droite, un AAV2/2, un AAV2/5 en

injection subrétinale, ciblent les photorécepteurs et les cellules de l'épithélium

pigmentaire. (Bennett, 2003)

15

Le contrôle négatif en vecteur pGL2-Basic vide sera également cotransfecté avec le phRG-TK

ainsi que le contrôle positif avec le vecteur pGL2-Control (Proméga - pGL2-Control Vector –

cf. figure 12). Avant les transformations dans les cellules ganglionnaires, nous réaliserons les

étapes de production de plasmides chez Escherichia coli ainsi qu'une vérification des séquences

promotrices insérées par séquençage via les amorces contenues dans pGL2 autour du site

multiple de clonage. Une fois que nous avons les niveaux d'expression de chaque construction,

nous en choisirons un optimum pour la suite de nos travaux.

III. Construction du système de transfection

Grâce au promoteur, nous pourrons tenter d'exprimer le photo-senseur eNpHR

spécifiquement dans les cellules ganglionnaires via AAVs (Adéno-associated virus). Cette

stratégie d'optogénétique pourrait permettre la restauration de la réponse à la lumière de la rétine

et ainsi rendre la vue dans le cas de rétinite pigmentaire.

1) Transduction d’un photo-senseur dans la rétine par AAVs

Les virus adéno-associés sont des vecteurs qui permettent une expression stable et à

long terme de gènes. Ils peuvent cibler différents types de cellules en fonction du sérotype de

capside et l'utilisation d'un promoteur spécifique peut induire une expression contrôlée du

transgène. L’œil est une cible idéale pour le transfert de gènes médié par les vecteurs viraux :

c’est un organe petit et compartimenté qui nécessite donc une petite quantité de vecteur

(Lebherz et al., 2008).

Les AAVs sont des vecteurs viraux issues des parvovirus humains, dont 96% des

éléments viraux ont été éliminés (Grieger et al., 2006). Ils n’induisent donc aucune réponse

immunitaire à médiation cellulaire dans l’œil ou ailleurs dans le corps (Bennett, 2003). Les

protéines de la capside des AAVs sont responsables de leur tropisme et donc de leur efficacité

à transduire un type cellulaire spécifique. Les virus adéno-associés de sérotype 2 (AAV2)

ciblent efficacement les cellules de Müller (cellules gliales de la rétine) (cf. figure 13), et

particulièrement les cellules ganglionnaires après injection par voie intravitréenne (Bennett,

2003).

Figure 14 : Microscopie à fluorescence d’une coupe de rétine afin de visualiser le ciblage spécifique de différents AAVs.

Cryocoupes de rétine 6 mois après injection d'AAV (adéno-associated virus) avec marquage fluorescent des cellules infectées par l'AAV

et marquage des noyaux au DAPI. L'AAV2/1 (en haut à gauche) cible les cellules de l'épithélium pigmentaire (RPE); L'AAV2/2 (en

haut au milieu) ne cible aucun type cellulaire; L'AAV2/5 (en haut à droite) cible les photorécepteurs (RP) dans la couche externe (onl :

outer nuclear layer) ainsi que les cellules de l'épithélium pigmentaire; L'AAV2/5 (en bas à gauche) cible les RPE et les photorécepteurs;

L'AAV2/8 (en bas au milieu) cible les cellules ganglionnaires et les photorécepteurs; L'AAV2/9 (en bas à droite) cible les RPE.

(Lebherz et al., 2008)

Tableau 2 : Spécificité cellulaire des différents types d’AAVs 6 mois après injection.

Les capsides 1,2,5,7,8,9 correspondent respectivement aux AAV2/2, AAV2/3, AAV2/5, AAV2/7,

AAV2/8, AAV2/9. Les RPE sont les cellules de l'épithélium pigmentaire, les PRs sont les

photorécepteurs, la colonne Muller correspond aux cellules de Müller et les GLC sont les cellules

ganglionnaires. (Lebherz et al., 2008)

16

Pour améliorer la spécificité du transfert de gène vis-à-vis du sous-type cellulaire

rétinien, une stratégie de pseudotypage d’AAV peut être mise en place. Le tropisme viral de

l’AAV2 peut être orienté de façon plus spécifique vers les cellules ganglionnaires de la rétine,

tout en conservant les avantages d’une expression stable et à long terme du transgène. Tel que

décrit dans la publication Lebherz et al., 2008, il s’agit de produire un AAV hybride en

empaquetant le génome de l’AAV2 dans une capside d’AAV de sérotype 8 (AAV2/8). Les

auteurs ont pu mettre en évidence qu’une injection intravitréenne d’AAV2/8 portant une

cassette codant pour le transgène eGFP chez des souris C57BL/6 adultes (deux mois), permet

d’obtenir un signal d’expression de l’eGFP au niveau des cellules ganglionnaires rétiniennes

(cf. figure 14 et tableau 2). L’efficacité de transduction du transgène eGFP est rapide

(fluorescence détectable dès 5 jours après l’injection) et stable sur une durée supérieure à 6

mois. L’utilisation de l’AAV2/8 semble donc être un outil approprié pour le transfert d’un

photo-senseur dans les cellules ganglionnaires de la rétine chez des modèles murins de rétinite

pigmentaire (Cnga3–/–; Rho–/–). L’avantage d’expérimenter sur les maladies cécitantes, est

qu’elles sont bilatéralement symétriques : il est donc possible d’effectuer des expériences de

transduction contrôlées en utilisant un œil comme « œil expérimental » et l’œil controlatéral

comme « œil contrôle » (Lebherz et al., 2008).

2) Production des AAVs

La production des AAVs sera effectuée comme décrit précédemment (Busskamp et al.,

2014) par triple transfection de cellules HEK293T en utilisant des polymères cationiques

polyéthylènimine-linéaire (PEI). Le plasmide pITR contient la cassette transgène (gène

« contrôle » eYFP ou gène codant pour le photo-senseur eNpHR fusionné à l’eYFP) sous

contrôle du promoteur spécifique des cellules ganglionnaires de la rétine et encadrée par les

séquences « inverted terminal repeat » (ITR). Le plasmide AAV-helper code les protéines Rep

spécifiques du sérotype 2, et les protéines Cap du sérotype 8 (Rep et Cap sont des protéines de

réplication et des protéines structurales de la capside virale, respectivement). Le plasmide

helper adénoviral pHGTI-Adeno1 héberge les gènes adénoviraux qui codent pour les protéines

E1A, E1B, E4 et E2A requises pour les fonctions auxiliaires (Grieger et al., 2006). Les AAVs

seront purifiés en utilisant un gradient discontinu de l'iodixanol (Sigma, Optiprep). L’ADN

encapsidé sera quantifié par RT-qPCR TaqMan (amorce sens :

GGCTGTTGGGCACTGACAA ; amorce antisens : CCAAGGAAAGGACGATGATTTC ;

sonde : TCCGTGGTGTTGTCG) après dénaturation des particules d'AAV en utilisant la

17

ProtéinaseK, et les titres seront calculés en tant que copies de génome (cg) par ml.

IV. Validation du système

1) Tests de localisation du photo-senseur

Dans notre stratégie d'optogénétique nous avons choisi d'exprimer eNpHR, pompe à

chlore activable par la lumière jaune. Elle entraînera une hyperpolarisation membranaire

(Busskamp et al., 2010) spécifiquement dans les cellules ganglionnaires grâce au promoteur.

En effet, des expériences d'optogénétique réalisées avec ce photo-senseur ont démontrées sont

efficacité à restaurer la réponse à la lumière dans des modèles de rétinites (Busskamp et al.,

2014).

Nos expériences de transduction seront réalisées dans deux lignées murines différentes:

C57BL/6J comme lignée wild type (WT) et Cnga3–/–; Rho–/– comme lignée modèle de rétinite

pigmentaire (Claes et al., 2004). Elles seront aussi réalisées sur rétine humaine (wild-type et

rétinite pigmentaire) en culture. Les injections d’AAVs seront réalisées à P60 (souris adultes).

Le vecteur AAV2/8 sera utilisé pour transduire soit le transgène codant pour le photo-senseur

fusionné à l’eYFP sous contrôle du promoteur spécifique des cellules ganglionnaires ; soit le

transgène « contrôle » codant pour l’eYFP seul. L’eYFP présent dans les deux cassettes

d’expression est nécessaire pour valider par mesure de fluorescence, que l’expression des

transgènes est bien localisée au niveau des cellules ganglionnaires. Pour chaque groupe de

souris (C57BL/6J n = 3 ; Cnga3–/–; Rho–/– n = 3), les animaux recevront une injection du

transgène « photo-senseur/eYFP » dans un œil, et une injection du transgène contrôle « eYFP »

dans l’œil controlatéral. L’administration des AAV2/8 est réalisée par injection intravitréenne

(2 μl/œil, soit une dose de 1 × 1010 cg/œil, n = 3/groupe) (Lebherz et al., 2008) chez les animaux

préalablement anesthésiés par 3% d’isoflurane (Busskamp et al., 2010). Les souris seront

ensuite sacrifiées et les yeux énucléés pour les étapes d’histologie décrites par Lebherz et al.

2008. Comme mentionné précédemment (Lebherz et al., 2008), le sérotype 8 a une efficacité

de transduction rapide (expression maximale du transgène 5 jours après l’injection). La

détection de l’eYFP par fluorescence pourra donc être réalisée peu de temps après les injections.

Les mêmes mesures seront égalements réalisées en triplicate sans aucune injection sur WT

(n=3) et sur modèle de rétinite (n=3).

Figure 15 : Représentation du patch clamp sur cellules entière

(Whole-cell patch clamp). L'électrode est placée sur la cellule, puis une aspiration est appliquée pour rompre la membrane au niveau de l’ouverture de

l’électrode. Cela permet de créer un accès à l'espace intracellulaire

afin de mesurer la totalité des courants cellulaires.

18

2) Tests fonctionnels

Des tests fonctionnels de PEV (potentiels évoqués visuels) chez la souris et de patch

clamp sur cellules ganglionnaires, nous permettrons de voir si la fonction de la rétine est

recouvrée. Ceci permettrait de valider cette stratégie d'optogénétique. Pour cela, les animaux

(C57BL/6 n = 3 ; Cnga3–/–; Rho–/– n = 3) recevront une injection intravitréenne d’AAV2/8

contenant : le gène codant pour notre photo-senseur sous le contrôle du promoteur spécifique ;

aucun transgène (vecteur vide dans l’œil controlatéral), ou ne recevront aucune injection dans

un œil et le vecteur vide dans l’autre. Ces tests fonctionnels seront également réalisés sur des

rétines humaines (WT et modèle de rétinite pigmentaire) en culture pour les mêmes injections

(pas d'injection, vecteur vide, vecteur avec photo-senseur).

Enregistrement ex vivo de la réponse des cellules ganglionnaires par patch clamp

Les tests fonctionnels par patch clamp seront réalisés sur les souris C57BL/6 (n = 3) et

Cnga3–/–; Rho–/– (n = 3) : Les animaux recevront une injection intravitréenne d’AAV2/8

contenant le transgène « photo-senseur/eYFP » dans un œil, et une injection contrôle (transgène

« eYFP ») dans l’œil controlatéral. Dans les deux cas, l’eYFP est nécessaire pour détecter les

régions au sein de la rétine où il y a eu transduction par les AAVs. En effet, le signal eYFP sera

détecté via microscopie « 2-photon » : L’excitation du fluorophore sera réalisée par un pulse

laser réglé sur 920 nm (Mai Tai HP two-photon laser / Spectra Physics), où l’absorption

simultanée de deux photons infrarouges par l’eYFP est assez énergétique pour amener celui-ci

à l’état excité. L’enregistrement du signal eYFP se fera via une caméra CCD (Diagnostic

Instruments).

Tel que décrit par Busskamp et al. 2014, les rétines de souris transduites par AAVs seront

montées sur un morceau de papier-filtre (MF-membrane, Millipore) avec les cellules

ganglionnaire vers le haut, puis placées dans un milieu Ringer (en mM: 110 NaCl, 2.5 KCl, 1

CaCl2, 1.6 MgCl2, 10 D-glucose, 22 NaHCO3) à 36°C et enrichi à 5% CO2 ; 95% O2. Après

détection des cellules ganglionnaires infectées par les AAVs (signal eYFP), les enregistrements

patch clamp seront réalisés sur cellule entière (Whole-cell patch clamp) à l’aide d’un

amplificateur Axon Multiclamp 700B, et d’électrodes en verre de borosilicate (BF100-50-10,

Sutter Instruments). La résistance d'étanchéité des électrodes patch devra être de l’ordre de 7 –

9 MΩ. Lors de l’enregistrement, la stimulation des cellules ganglionnaires sera réalisée par une

19

lumière plein champ (cf. figure 15).

Enregistrement in vivo des potentiels évoqués visuels (PEV)

Le potentiel évoqué visuel (PEV) est la réponse électrique du cortex qui est provoquée

par une stimulation visuelle. Des souris (C57BL/6 n = 3 ; Cnga3–/–; Rho–/– n = 3) recevront

une injection intravitréenne d’AAV2/8 à P60 contenant : le photo-senseur dans un œil et le

vecteur vide dans l’œil controlatéral (modèle RP); aucun transgène dans un œil et le vecteur

vide dans l’œil controlatéral (modèle WT). On mesurera le PEV sur les souris 10 jours après la

transfection soit à P70. Les souris sont anesthésiées par des injections sous-cutanées de 8%

d’hydrate de chloral. Des gouttes d’atropine (1%) et d’Oculotec (Novartis) sont déposées sur

l’œil pour dilater et protéger la pupille. Après localisation du cortex visuel primaire (V1), les

électrodes d’enregistrements d’irridium-platine (taille 0.0035, California Fine Wire Company)

sont insérées en sous-cutané en regard du cortex visuel occipital. Deux électrodes sur le nez et

la queue ont servi respectivement de référence et de masse (Depeyre et al., 2006). Les réponses

sont d’abord mesurées à différentes profondeurs corticales, et la profondeur avec la réponse

maximum est choisie pour faire les enregistrements. Des stimuli de 500 ms sont délivrés dans

l’œil controlatéral toute les 3 secondes, 30 fois, en utilisant un câble optique attaché à une source

lumineuse (EXFO XI120PC-XL, 120W, Photonic Solutions). La distance du câble optique à

l’œil est de 1cm. L’intensité de la lumière est à la surface de l’œil de 1016 photons cm-2 s-1.

(Busskamp et al., 2014)(Busskamp et al., 2014).

Ainsi, les tests fonctionnels in vivo et ex vivo permettrons d’observer l’efficacité de la

thérapie optogénétique développée tout au long de ce projet. En revanche, de nombreuses

vérifications seront nécessaires et de nombreuses perspectives se dessineront.

20

Conclusion et Perspectives

La rétinite pigmentaire touche près de deux millions de personnes dans le monde, ceci en fait

la première cause de cécité hors pathologies liées à l'âge. Cependant, les thérapies géniques

classiques ne sont pas envisageables au vue des multiples gènes impliqués.

Une alternative nous permettrai de contourner cette complexité phénotypique, il s'agit de la

stratégie d'optogénétique décrite par Busskamp (Busskamp et al., 2011). L'optogénétique

consiste à apporter une molécule ectopique appelée photo-senseur, afin qu'il soit exprimé dans

les cellules de la rétine et ainsi qu'il restaure la photo-réaction des cellules.

Notre projet a donc pour but d'exprimer eNpHR (Natronomonas pharaonis HaloRhodopsin) de

manière ciblée dans les cellules ganglionnaires. Le ciblage est possible grâce à l'utilisation

d'AAVs (Adéno-associated virus) présentant un sérotype de capside 8 (AAV2/8) et une cassette

d'expression sous le contrôle d'un promoteur spécifique des cellules ganglionnaires.

Cependant, eNpHR est une pompe à chlores, il entraîne donc une hyperpolarisation des cellules.

Or nous savons qu'il existe deux types de cellules ganglionnaires, les ON qui se dépolarisent

quand l'intensité lumineuse augmente, et les OFF qui s'hyperpolarisent lorsqu'elle diminue. La

réponse des cellules à la lumière n'est donc pas complètement physiologique.

Dans la suite des travaux, il serait donc intéressant d'utiliser un autre photo-senseur afin de

complémenter l'action d'eNpHR. Nous connaissons par exemple ChR2 (Channelrhodopsine-2),

canal ionique qui permet la dépolarisation des cellules (Busskamp et al., 2011).

Pour cela, il nous faudrait donc séparer les cellules ganglionnaires ON des OFF par FACS en

utilisant leur différence morphologique. Puis l'identification d'un promoteur spécifique pour

chacun des deux types cellulaires, permettra l'expression ciblée de ChR2 dans les cellules ON

et de eNpHR dans les cellules OFF.

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