Gourraud Lucas/ Mael Le drogou 29/09/20 M. Chollet-Krugler Chimie analytique

Diapo disponible mais contenu manquant / formules pas à connaitre mais à savoir exploiter

METHODE DE SEPARATIONS CHROMATOGRAPHIQUES

Plan I- Qu’est-ce que la chromatographie? II - Classification des méthodes chromatographiques III- Le chromatographe IV - Applications V- Terminologie générales

I. Qu’est-ce qu’une chromatographie ?

● Méthode de séparation, d’identification et de quantification d’espèces chimiques présentes dans un mélange complexe; (méthode très répandue et applications très générales). On a déja vu la séparation

● Séparation basée sur les différences d’affinités qui peuvent présenter deux ou plusieurs composés pour 2 phases (toujours):

○ Fixe appelée phase stationnaire/fix = PS (solide ou liquide fixé sur un support solide c’est a dire qu’on peut immobiliser sur la surface d’un solide)

○ Mobile appelée phase mobile = PM (liquide ou gaz ou fluide supercritique) ● Mise en jeu de plusieurs processus physicochimiques pour la rétention.

Dans la colonne (voir schéma) : - Phase stationnaire en verte - Phase mobile en noir - Phase stationnaire, le soluté est en rouge

Chaque soluté n’aura pas la même affinité pour la phase stationnaire et la phase mobile. Il y a 2 constituants dans le mélange, les particules noirs vont être élués moins vite car elles ont plus d’affinités pour la phase stationnaire.

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Quelques dates importantes : 1906 : Découverte de phénomène chromatographie par M. TSWETT

● Séparation de pigments végétaux colorés sur une colonne remplie de carbonate de calcium pulvérulent, les pigments sont élués avec de l’éther de pétrole;

● A donné son nom à la chromatographie (du grec chroma signifie “couleur” et graphein signifie “écrire”)

1940 : MARTIN et SYNGE développent la pratique et la théorie de la chromatographie, prix Nobel reçu en 1952

1955 : Première chromatographie gazeuse (MARTIN et JAMES) (première appareillage commercialiser)

1967 : Début de la chromatographie liquide haute performance (HUBER et HUZSMAN)

pourquoi il y a séparation ? - Auc orus d’une chromatographie, chaque constituant du melange (appélé soluté

● il y a une separation car au cours de la chromatographie chaque constituant du mélange (soluté) est soumis à une force de rétention exercée par la PS et a une force de mobilité exercée par la PM.

● Mise en jeu Cette force de rétention et de mobilité est propre à chaque constituant (on parle de constante de distribution). Chaque constituant aura sa propre constante de distribution vis à vis des deux phases.

La séparation est liée à l'affinité que le composé aura vis à vis des deux phases. ReVOIR ça

Comment identifier un soluté dans un mélange ? ● Comparaison de son niveau de migration avec celui d’une espèce chimique connue ou espèce

de référence (témoin) en se plaçant dans les mêmes conditions expérimentales, parfois aléatoire

○ 2 composés peuvent avoir le même temps de rétention donc c’est aléatoire. ● Autre manière plus sûre : couplage avec une technique d’analyse complémentaire

(spectrométrie de masse, spectrométrie infrarouge, spectrométrie RMN…)

II. Classification des méthodes chromatographiques

Plusieurs critères :

A.selon les modalités de migration

2 méthodes :

Chromatographie sur colonne ou chromatographie d’élution : PS maintenue dans un tube étroit (colonne) et PM y progresse par gravité ou sous pression. Chaque composé est récupéré (élué) en sortie de la colonne à des instants différents.

Chromatographie planaire ou de développement PS présente à la surface d’un support plat (ex : plaque de silice) et PM se déplace à travers la PS par capillarité. Pas d’étape d’élution mais il est possible de récupérer les composés par grattage de la plaque

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Rq : Le composé vert a le rapport frontal le plus élevé et le temps d’élution le plus faible

B.Selon la nature de la PM

3 catégories : ● Liquide : chromatographie en phase liquide : CPL ● Gazeuse : chromatographie en phase gazeuse : CPG ● Fluide supercritique (ex: CO2 très utilisé) : chromatographie en Fluide Supercritique : CFS

(supercritique : à la fois les propriétés d’un gaz et celle d’un liquide)

C.Selon la nature de la phase stationnaire (PS)

4 catégories :

Liquide : liquide fixé sur un support solide inerte (surface greffée) Solide :

- *adsorbant solide - *résine échangeuses d’ions - *solide poreux

D.Selon le phénomène physicochimique

6 catégories :

● Chromatographie de partage (très répandu en pharmacie) (différence de solubilité dans les 2 phases selon leur coefficient de partage)

● Chromatographie d'adsorption (formation de liaisons entre les solutés et la surface adsorbante, coefficient d’adsorption)

● Chromatographie par échanges d’ions (interactions électrostatiques avec des composants de charges opposées, coefficient d’échanges d’ions)

● Chromatographie d’exclusion diffusion (séparation en fonction de la taille des molécules, coefficient de diffusion) utilisé pour un solide poreux.

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● Chromatographie par formation de paires d’ions (interactions électrostatiques + effets hydrophobes)

● Chromatographie d’affinité (interactions spécifiques avec le ligand) stérique par exemple.

Le choix du procédé de séparation chromatographique dépend de : - la structure - la masse molaire - des propriétés physico-chimique ou du caractère ionique de la molécule à séparer

(juste à lire dont worry)

III. Le chromatogramme Si détecteur en sortie de colonne ; l’enregistrement appelé chromatogramme traduit la variation de la concentration en soluté au cours du temps.

Ce que l’on observe : ● On a déposé trois constituants en haut de la colonne et en sortie de colonne on observe 3 pics

correspondant aux 3 constituants. Chacun de ces pics possède un pic qui lui est propre et est défini par un temps de rétention qui lui est propre. On va pouvoir donc déterminer le temps de rétention de chaque pic et grâce à ce temps de rétention, on va pouvoir effectuer de l’analyse qualitative.

● La deuxième information importante est qu’on a aussi accès à la surface des pics et l’air des pics sera exploité pour pouvoir faire de l’analyse quantitative.

*Série de pics :

- Position des pics (Tr) sur l’axe permet l’analyse qualitative - Aire des pics exploitée pour l’analyse quantitative

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IV. Domaines d’applications

● Très répandues car couvrent tous les domaines de l’analyse (pharmaceutique, toxicologique, biochimique, agroalimentaire,...)

● 45% chiffre d’affaires de l’instrumentation de l’analyse moléculaire

V. Terminologie générale de la chromatographie

Soluté : toute substance constituant d’un mélange, séparée par chromatographie

Phase mobile ou éluant : le vecteur, liquide ou gazeux, qui déplace le soluté au travers de la PS Phase stationnaire : le produit, qui par ses affinités avec les solutés va permettre leur séparation quand la PM les déplace.

Support : une particule inerte, de diamètre variable qui porte la PS

Remplissage : l’ensemble des produits (adsorbant , support, PS …) qui garnissent une colonne de chromatographie

Colonne chromatographique : tube de diamètre et longueur variable, en verre, en métal, ou autre substance à l’intérieure duquel s’opèrent les séparations chromatographiques. 2 types:

➔ Colonne remplie : l’ensemble des produits garnissent entièrement la colonne ➔ Colonne capillaire : la PS tapisse la paroi interne de la colonne sous forme d’un film (surtout pour

la chromatographie en phase gazeuse) ➔ Elles ont des propriétés différentes

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THEORIE DE LA CHROMATOGRAPHIE

Questions : - Pour quelle raison les composés sont-ils séparés

en sortie de colonne ? - Pour quelle raison les pics s’élargissent-ils ? - Comment améliorer une séparation

chromatographique ?

Conclusion : 2 paramètres primordiaux en chromatographie : rétention et largeur du pic

I. Paramètres caractérisant la rétention

A.Temps de rétention tR (indice) (figure 2, tRA = 3 min)

● TRa : temps écoulé entre l’introduction du composé A sur la colonne et le moment ou la substance sort à sa concentration maximale

● TR : dépend du composé et des conditions expérimentales (colonne, t°, débit PM, etc) 6

B.Volume de rétention ou volume d’’élution VR (fig 2, VRA = 3 x 2 = 6mL)

● VRa : volume de la PM nécessaire pour éluer le composé A à sa concentration maximale. (mL) ● Si D est le débit de la PM :

C.Temps mort : Tm (fig 2, Tm = 1 min)

● Tm: temps que met la PM (ou un soluté non retenue sur la PS) pour traverser la colonne

En CPG, le Tm correspond au temps de rétention de substances non retenues comme l’air ou le méthane.

D.Volume mort : Vm (fig , Vm = 2 mL)

● Vm : Volume de la PM nécessaire pour traverser la colonne pendant le temps tm, correspondant au volume occupé par la phase mobile dans une colonne (volume interstitiel)

● Vm peut être aussi calculé à partir de la porosité epsilon qui caractérise une colonne chromatographique et du volume interne de la colonne V int

(formules pas à apprendre par coeur MAIS seulement à savoir les exploiter et utiliser) elle n’a pas dit si il fallait les apprendre ou pas cette année …..

E. Vitesse linéaire de la PM (fig 2, u = 15cm/min)

La Pm est caractérisée par sa vitesse linéaire u : distance parcourue dans la colonne de longueur L par unité de temps :

L et VM sont des caractéristiques de la colonne, si on augmente le débit on augmente la vitesse.

F. Volume et temps de rétention réduits V’r ET t’R (fig 2, t’Ra = 2 min et V’Ra = 4 mL)

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● t’RA : temps passé par le composé A dans la PS, ne tient pas compte du temps TM que met le composé pour parcourir les interstices de la colonne :

G.Coefficient (constante) thermodynamique de distribution (partage) K

Toutes les séparations chromatographiques sont basées sur les différences de répartition des solutés entre la PM et la PS

Pour le soluté A, le coefficient de distribution K caractérise l’équilibre suivant :

H.Facteur de rétention k ou k’ (facteur de capacité) elle préfère k’

k’ : rapport de la quantité d’un même soluté entre la PS et la PM :

Paramètre beta = rapport de phases = constante qui caractérise une colonne

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Détermination expérimentale à partir du chromatogramme

k’ : aussi rapport du temps passé par une espèce dans la PS sur le temps passé par cette même espèce dans la PM.

k’ < 1 : le composé sort trop tôt k’ = 1 - 5 : idéal k’ > 20 : durée d’élution trop longue

A partir des relations (1) et 2) : nouvelle expression qui relie les paramètres expérimentaux au coefficient thermodynamique de distribution K, expression valable pour une chromatographie idéale (rapport Cs / Cm constant durant toute l'élution)

(formules pas à apprendre mais a savoir exploiter) elle a bien dit à la fin que toutes les formules sont à savoir exploiter mais pas à apprendre.

II. Largeur des pics en chromatographie Pics d’élution ressemblent beaucoup aux courbes d’erreurs de Gauss : étalement symétrique des vitesses d’élution autour d’une valeur moyenne.

Paramètres caractéristiques d’un pic gaussien :

On prend différentes largeurs à différentes hauteurs du pic.

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A.Asymétrie de pic - En théorie : pic d’élution = courbe de Gauss - En réalité : asymetrié de pic observée

B.Modèle des plateaux théoriques - notion d’efficacité

● Efficacité d’une colonne dépend du degrés d’élargissement du pic. ● Différentes théories avancées pour modéliser la chromatographie mais aucune strictement valable ● N : chiffre l’efficacité d’une colonne :

○ + N est élevé + la colonne est efficace (et donc pic étroit) Théorie de Martin et Synge en 1952 :

● Colonne de N plateaux théoriques = colonne divisée en N petits disques cylindriques successifs.

● Chaque plateau théorique représente une étape pendant laquelle se produit des échanges du composé entre les PS et PM

● Cela suppose que l’état d’équilibre du soluté est atteint entre la PM et la PS avant le passage au plateau suivant, et qu’il n’y a pas de diffusion longitudinale

N déterminé à partir d’un chromatogramme, selon les formules (1), (2) ou (3)

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● 2σ = largeur du pic au point d’inflexion

ATTENTION : Tr, ω, δ et σ doivent être exprimés avec la même unité Pour calculer N, on choisit généralement le pic correspondant au composé le plus retenu. Si on remarque que le N d’une colonne diminue, on doit penser à changer cette colonne car elle devient moins efficace.

C.Hauteur équivalente à un plateau théorique H (ou HEPT)

Connaissant la longueur de la colonne L et le nombre de plateaux théoriques N, on définit H= hauteur équivalente à un plateau théorique

H = L / N (H et L = même unité)

Pic chromatographique d’allure gaussienne :

Relation (1) et (2) : N = L2 / σ2 —> toujours pas à apprendre

Plus H est faible, plus la dispersion est faible, plus l’étalement de la bande est réduit, plus le pic est étroit.

Valeurs de H : - 0,1 à 1 mm en CPG - Environ 10 microns en CLHP

Exemple : comparaison schématique de 2 colonnes d’efficacité différente :

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Pics extrêmements fins quand il y a un nombre de plateaux importants (plus le nb de plateaux est importants dans la colonne plus le pic est étroit).

D.facteurs d’élargissement des pics

Élargissement des pics : reflète une perte d’efficacité de colonne.

Exemple : + la vitesse de transfert de masse du soluté pendant la progression dans la colonne est faible, + la bande s’élargit

3 facteurs responsables de l'élargissement des pics : ● Diffusion turbulente (A) ● Diffusion longitudinale (B/u) ● résistance au transfert de masse (C.u)

Contribution symbolisé par l’équation de Van Deemter : relie H à la vitesse d’écoulement u de la PM :

où A, B et C : constantes pour une colonne donnée et une PS donnée

Représentation graphique de l’équation (combinaison des 3 facteurs) = hyperbolique avec un minimum qui donne u ou D optimal pour H le plus faible :

Diffusion turbulente ou diffusion de Eddy (terme A) = ● A est fonction du diamètre moyen des particules qui garnissent la colonne ● Suivant la taille et la forme des particules, il existe pour la PM plusieurs trajets possibles, ce qui

contribue à l’élargissement des pics

12Les lignes bleues représentent les trajets

● + les particules sont petites, plus le remplissage est homogène et plus l’efficacité de la colonne augmente.

Rq : la contribution de A est nulle pour une colonne capillaire chromatographique en phase gazeuse car pas de remplissage

Diffusion longitudinale (terme B/u) : fig 9 ● B/u traduit la dispersion du soluté de la diffusion du soluté dans la colonne ● Plus U augmente plus le facteur B/u diminue ● Terme B en phase gazeuse environ = 1000 fois + élevée qu’en phase liquide

Résistance au transfert de masse (terme C.u) : fig 10 - C.u traduit l’empêchement de l’établissement de l’équilibre entre le soluté et les PM et PS. - Ce phénomène se produit pour des grandes valeurs de u mais aussi lorsque certaines

molécules stagnent dans les pores de la phase stationnaire

III. Conclusion

● Colonnes remplies les plus efficaces = celles régulièrement remplies bien tassées où le diamètre des particules est le plus faible possible.

● Colonne capillaires les + efficaces = diamètre de la colonne réduit (le plus petit possible)

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METHODE DE SEPARATIONS CHROMATOGRAPHIQUES

(SUITE) I. Qualité de la séparation

‘ici :

- Le pic A est le composé le moins retenu - Le pic B est le composé le plus retenu.

A-Facteurs de séparation alpha (ou sélectivité) fig 11, α = 1,14

Kb = valeur du composé le plus retenu : Kb soit t’RB > t’RA et donc α toujours > à 1 C’est aussi le facteur de rapport des capacités K’ (ou rétention).

T’RB = temps de rétention réduit du composé le plus retenu. Donc alpha=1,14 sur la figure plus haut. Cela permet de rendre compte (mesure) de la proximité des pics sans tenir compte de leur

forme La sélectivité va comparer le positionnement d’un pic par rapport a l’autre.

Il faut une valeur supérieur à 1 donc t'RB toujours > a t'RA. La sélectivité permet de juger de la proximité des deux pics. Si la valeur est égale à 1 c'est que les deux pics se chevauchent. La sélectivité concerne uniquement des pics voisins et non des pics séparés.

B-La résolution R

R indique la distance entre 2 pics voisins par rapport à leur largeur et leurs temps de rétention, représente la mesure de la qualité effective de la séparation : !On se base sur la valeur de la résolution pour savoir si la séparation est bonne ou pas.

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Les formules dépendent uniquement de la largeur des pics. On aura forcément une valeur positive. Il faut tout exprimer dans la même unité car R n'a pas d'unité. tRB sera toujours supérieur a tRA

Ou formule de Purnell : on l’obtient en faisant des hypotheses

Où k’B est calculé sur le composé le plus retenu

Relation de Purnell applicable s pics très analogues (ω A = ω B) et N identiques pour A

et B. Il ne faut pas apprendre les formules par cœur, il faut juste savoir les utiliser

Influence d la résolution R sur la séparation de 2 pics :

● R < 1 : résolution insuffisante ● R = 1 séparation incomplète, chaque pic contient environ 4% du second ● R>= bonne séparation mais durée d’analyse + grande ● R= 1,5 séparation optimale

Toute séparation est donc un compromis entre une bonne résolution et une durée d’analyse raisonnable (donc pas trop longue).

L’exercice 1 est fait dans le cours du 30/09

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