Diffusion de la Lumière et Cristallisation · Debye et Zimms de leur cotés s’intéressent à la dépendance angulaire de l’Id: cela donne la mesure de Mw, Rg, Forme et A2. (2)

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1S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007

Jean-Pierre Astier,Françoise Bonneté,Natalie Ferté,Stéphane Veesler

Diffusion de la LumiDiffusion de la Lumièère et Cristallisationre et Cristallisation


Pour Comprendre les Mécanismes de la Croissance Cristalline:Pour Comprendre les Mécanismes de la Croissance Cristalline:Même Mécanismes pour Petites et Macro MoléculesMême Mécanismes pour Petites et Macro Molécules

Bon Modèle pour les PhysiciensBon Modèle pour les Physiciens↓↓

Application:Application:Utilisation de cette Connaissance pour Concevoir des ExpériencesUtilisation de cette Connaissance pour Concevoir des Expériences

pour obtenir les Premiers Cristauxpour obtenir les Premiers Cristauxet Produire des Cristaux de Meilleurs Qualitéet Produire des Cristaux de Meilleurs Qualité

Pour la résolution Structurale (BioPour la résolution Structurale (Bio--cristallographie)cristallographie)

Une Question de Physicien:Pourquoi Etudier la Cristallisation des Protéines?


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INTRODUCTIONINTRODUCTION

Depuis 1978, où la diffusion quasi-élastique de la lumière (DQEL) a été utilisée, pour la première fois, pour étudier les premiers moments de la cristallisation des protéines, on utilise souvent l’anglicisme PRENUCLEATION pour décrire les premiers stades de la cristallisation [Kam Z., Shore H.B. and Feher G. (1978). "On the crystallization of proteins." J. Mol. Biol. 123: 539-555].

Les études des solutions de protéines par les techniques de diffusion des rayonnements (lumière, X et neutrons) couplées à des outils de simulation numérique, ont apporté une aide à la cristallisation et une compréhension du lien entre conditions de cristallisation et interactions.

Dans le but de rationaliser les essais de cristallisation on peut proposer des tests/diagnostics à partir de l'étude de l’états des molécules en solution et de leur interactions.

Dans la présentation suivante, je ferai quelques rappels sur la technique de diffusion de la lumière puis je présenterai quelques exemples.


Une Approche PhysicoUne Approche Physico--chimique:chimique:Caractérisation des Macromolécules en SolutionCaractérisation des Macromolécules en Solution→→ Diffusion de la Lumière Diffusion de la Lumière –– Statique et DynamiqueStatique et Dynamique→→ DDiffusion des RX aux Petits Anglesiffusion des RX aux Petits Angles

Besoin de Critères pour Choisir/DéterminerBesoin de Critères pour Choisir/Déterminerde Manière Rationnelle les Conditions de Cristallisationde Manière Rationnelle les Conditions de Cristallisation

«« PrédictionPrédiction » du Diagramme de Phases» du Diagramme de Phases

Approche Complémentaire à la Cristallisation à Haut Débit (HTS)Approche Complémentaire à la Cristallisation à Haut Débit (HTS)


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Macromolécule en solution, Detergent + Lipide⊕

Température, pH, Force Ionique et Nature, [PEG],...

Diagramme de Phases / Courbes de SolubilitéDiagramme de Phases / Courbes de Solubilité

Dépletion

van der Waals, Coulombienne,et Hofmeister

+

-+

+

+

+

+

+

- --

--

-


DXPA0°< 2θ <5°λ = 1.54 Å

Diffusion Lumière150°< 2θ <10°λ = 514 nm

d

d

Techniques Idéales pour Étudier les Solutions deTechniques Idéales pour Étudier les Solutions deMacromolécules, Nanoparticules…Macromolécules, Nanoparticules…

Principes de la Diffusion des RayonnementsPrincipes de la Diffusion des Rayonnements

Faisceau incident λRayon X ou lumière

s =1/d= 2sinθ/λ (Å-1)

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Diffusion de la Diffusion de la LumièreLumière1. Rappels Théoriques (de 1869 aux années 1980)

Interactions Photons-Matière: Ici Diffusion (Rayleigh ou Mie).Le Laser induit une polarisation de la molécule qui elle même ré-émet de la Lumière comme une source secondaire : c’est la Diffusion de la Lumière.

Variation de Fréquence (Δν), I(θ) et la Polarisation = f(Taille - Masse, Forme, Interactions)

Soit d<<λ diffusion des petites particules assimilées à des points (isotropes)Soit d≥λ plus complexe, il faut tenir compte de la dépendance angulaire, des

problèmes de polarisation et d’indice optique des particules.


Diffusion de la Diffusion de la LumièreLumière

Dans la cas (1) on s’intéresse aux valeurs de l’Id sans mesurer la Δν = Diffusion Statique de la Lumière (ou Élastique)Dans la cas (2) on s’intéresse à Δν = Diffusion Dynamique de la Lumière(ou Quasi-Élastique)

(1) Intensité Diffusée (Id)Théorie des fluctuations (Smoluchowski, Einstein) pour expliquer la valeur de l’Id: les Fluctuations Thermiques donnent des Fluctuations de Concentrations.Id est reliée à ces Fluctuations… Compressibilité Isotherme … Interactions.

Debye et Zimms de leur cotés s’intéressent à la dépendance angulaire de l’Id:cela donne la mesure de Mw, Rg, Forme et A2.

(2) Fréquence de l’Id, variation temporelle1964 Pecora montre que l’on peut mesurer DT (et DR dans certain cas) à partir de l’étude des Fréquences

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(1) Diffusion Statique de la Lumière (ou Élastique)d < λ/10 (≈ 50nm)

Particules isotropes assimilées à des diffuseurs ponctuels

Intensité diffusée indépendante de l’angle d’observation (θ)

KC/ΔI=1/Mw +2A2C

avec K= K’(dn/dC)2 Iref2π2/λ04 n0

On obtient Mw et A2 par la mesure Isolvant, Iref et I en Fonction de C

A2 < 0 Interactions Attractives,A2 > 0 Interactions repulsives,A2 = 0 Peu ou Pas d'Interaction.

A2 est relié à la distribution spatiale des particules

« Wilson Slot »


(1) Diffusion Statique de la Lumière (ou Élastique)

d ≥λ/10 (≈ 50nm)

Intensité diffusée dépend de l’angle d’observation (θ)

Interférences (déphasage) entre les différentes parties d’une particule

Introduction du facteur de forme P (θ).

KC/ΔI=1/Mw (1+ q2Rg23) +2A2C

On obtient Mw, Rg et A2 par la mesure Isolvant, Iref et I en f(C, θ) (Zimm Plot)

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(2) Diffusion Dynamique de la Lumière(ou Quasi-Élastique)

Les macromolécules en solution sont en mouvement (translation, rotation et vibration)donc l'Intensité Diffusée va fluctuer au cours du temps.Analyse des fluctuations = informations structurales et dynamiques

Ces fluctuations vont ressembler à du bruit.Pour sortir le signal du bruit l’outil c’est la fonction de corrélation.


Fonction d’autocorrélation G(τ) = <I(0).I(τ)>Décroît de <I(0)2> à <I(0) >2


<I(0)2>

<I(0)>2

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Fonction d’autocorrélation G(τ) = <I(0).I(τ)>

Cas d’une Solution idéale* monodisperse G(τ) ≈ exp(-D0q2/τ)Ln(G(τ)) ≈ B0- D0q2 τ

et D0 = kBT/6πη0Rh

Cas d’une Solution idéale* polydisperse G(τ) ≈ Σexp(-Di,0q2/τ)

* Sans interaction

En général particules en interactions alors on mesure un Deff



On approche G(τ) ≈ exp(-<D>zq2/τ)Et on développe Ln(G(τ)) ≈ B0- <D>zq2 τ +B2 τ2… (Cumulants)

<D>z= ΣNiMi2Di/ ΣNiMi

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B2 = variance du <D>z ou facteur de qualité ou Polydispersité


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Les Fluctuations d'Intensité Diffusée sont Reliées à la Diffusion des Macromolécules dans le Solvant

Dm , D0, KD , Rh et vDm=D0(1+KD C)

KD < 0 Interactions Attractives,KD > 0 Interactions repulsives,KD = 0 Peu ou Pas d'Interaction.

D0 = kBT/6πη0Rh

v : Facteur de Qualité ou Polydispersité.


Rq: en Général Dm ≠ D0 donc Rh ≠kBT/6πη0Dm


I(c,s) = I(0,s) ≠ S(c,s)

Facteur de Structure S(c,s)⇓

Coefficient du Viriel (A2)

I(c,s) quand c : RepulsiveI(c,s) quand c : Attractive

Dm = D0 (1 + kD. C)

kD = kH –kS

Statique (kS)+ Hydrodynamique

(kH)

kD > 0 : RepulsifkD < 0 : Attractif

Coefficient du Viriel A2

A2 > 0 : Repulsif

A2 < 0 : Attractif

AvecInteractions

Rg , MwD0 , Rh , v%Mw

Rg (> λ/10)

Sans Interaction

DXPALab. ou Synchrotron

DQELLab.

DELLab.

0D..6k T.B Rh ηΠ= )3

Rgs4 exp( I(0) I(s)222Π−=

CΔI

K( dndC

)2Iref

2Mw+ ...CA1 +=

Techniques Techniques de Diffusion en Solutionde Diffusion en Solution

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0,1

1

10

100

1000

0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03

DXPADEL

Intensité Diffusée (a.u.)

s = 2 sinθ/λ (A-1)

Techniques ComplémentairesTechniques Complémentaires

ApoferritinRg = 55,8Å

Techniques Techniques de Diffusion en Solution:de Diffusion en Solution:DEL + DXPADEL + DXPA


Montages ExpérimentauxMontages Expérimentaux

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θ

Laser

Échantillon

Détecte

ur

q= 4π/λsin(θ/2)λ=514,5nm

Montage de Diffusion de la LumièreMontage de Diffusion de la Lumière

(1) On s’intéresse aux valeurs de l’ Intensité Diffusée (moyenne)sans mesurer la Δν = Diffusion Statique de la Lumière (ou Élastique)

(2) On s’intéresse à Δν = Diffusion Dynamique de la Lumière (ou Quasi-Élastique)Variation temporelle de Id


θ

Laser Echantillon

Photomultiplicateur

PC Correlateur

Diffusion de la LumièreDiffusion de la Lumière

q= 4π/λsin(θ/2)λ=514,5nm

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NanoSTAR

ESRF Synchrotron CRMCN

AppareillagesAppareillagesde Diffusion de la Lumièrede Diffusion de la Lumière


AppareillageAppareillagede Diffusion de la Lumièrede Diffusion de la Lumière

Banc de Mesure en Diffusion de la Banc de Mesure en Diffusion de la LumièreLumière

Système d’Acquisition des Système d’Acquisition des DonnéesDonnées

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Cellule de Cellule de MesureMesureΦΦ=8mm=8mm

Cellule de Diffusion de la LumièreCellule de Diffusion de la Lumière

Bouchon Hermétique

Cellule en Verre

SolutionVolume mini=80µl


Pratiquement:Attention aux poussièresAttention à la Diffusion Multiple (transparence)< I(t) > ou dI(t) en Fonction de C :

Attention oligomèrisation = f(C)En Diffusion Statique de la Lumière On s’intéresse à<I(t)>

Connaître dn/dC et l’indice de réfraction du milieuouverture maximale (détecteur)

En Diffusion Dynamique de la Lumière On s’intéresse à dI(t)Connaître la viscosité et l’indice de réfraction du milieuouverture minimale (détecteur)

Diffusion de la Diffusion de la LumièreLumière

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Exemples / ApplicationsExemples / Applications


αα--AmylaseAmylasev < 10%

v > 10%

Monomères

Do = 5,8 x 10¯ cm²/s

Rh = 37Å

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Veesler et al. Acta Cryst. D (1994)

PrénucléationPrénucléation par DQELpar DQELDiagnosticDiagnostic

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0

20

40

60

80

0 0.5 1 1.5 2 2.5

v < 5%

v > 15%

Concentration (mg/ml)

NaCl (M)

20°C

Lafont et al. J. Cryst. Growth (1994)

PrénucléationPrénucléation par DQELpar DQELDiagnostic Diagnostic BPTIBPTI pH 4pH 4,,55

D0 = 9,2 × 10-7 cm2/s

Rh = 23,1 Å

Oligomères de BPTIDXPA


En Résumé

- La Monodispersité* est un bon Critère

- Les Agrégats sont à Éviter

*à la Résolution de la DQEL

PrénucléationPrénucléation par DQELpar DQELDiagnosticDiagnostic

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5 10-6

6 10-6

7 10-6

8 10-6

9 10-6

1 10-5

0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01

Tris 50mM pH8

NaPhosphate 100mM pH8

Tris 50mM NaCl 100mM pH8

Kc/R90

(mol.g-1)

c (g/ml)

A2>0 repulsion

A2<0 attraction

Exemple de l’Urate Oxidase(F. Bonneté – M. Giffard)

Mexp =127000Da (Muox=135000Da)1/M

c2AM1

ΔIKc

290

+=

Interactions Moléculaires Interactions Moléculaires par DELpar DEL


0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 2 4 6 8 10

Tris 50mM pH 8

Tris50mM NaCl 100mM pH 8

% PEG 8000

Solubility uox (g/l)

Solubilité Augmente

Solubilité Diminue

A2>0 repulsion

A2<0 attraction

Exemple de l’Urate Oxidase(F. Bonneté – M. Giffard)

Interactions Moléculaires Interactions Moléculaires par DELpar DEL

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Détermination de la cmc Determination du A2

Loll et al. Mesurent les Interactions entre Micelles de Détergent (sans Protéine)

Milieu de Cristallisation de la Porine Ompf (Protein Science 2000)

Interactions Moléculaires par DELInteractions Moléculaires par DEL


Détermination du A2 Comparaison des A2


Loll et al. Mesurent et Comparent les Interactions entre Micelles de Détergent et entre Complexes Protéine-Détergent

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Interactions Moléculaires par DELInteractions Moléculaires par DEL1. Les solutions de Micelles de Détergents sans protéine ont un comportement proches de celles avec la Protéine.

Importance du Milieu de Cristallisation

2. La valeur du A2 est un bon Critère de Cristallisation


Etude du Milieu de Cristallisation sans Protéine:Detergent + Lipide

⊕Température, pH, Force Ionique et Nature, [PEG],...


Attention Contre-Exemple:J. Blouwolff JCG 303 (2007)

« Crystallization conditions of membrane protein CLC-ec1:An example outside the crystallization slot »

N-octyl-β-maltoside / PEG 400 /pH=4,5

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5

6

7

8

9

0 20 40 60

1.4 M NaCl1.7M NaCl2M NaCl0.35M KSCN

D 10 7 (cm2/s)×

C (mg/ml)

= 1.25M (NH4)2SO4

Interactions Moléculaires Interactions Moléculaires par DQELpar DQEL

Rh = 23,1 Å

D=D0(1+KDC)

BPTIBPTIpH 4pH 4,,55

En Conditions de En Conditions de CristallisationCristallisation les Interactions les Interactions sontsont AttractivesAttractives


0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6

Solubilités (mg/ml)

Force Ionique (M)

KSCN

NaCl

(NH4)2SO4

-40

-30

-20

-10

0

10

0 1 2 3 4 5 6Force Ionique (M)

NaClKSCN

(NH4)2SO4

ΚD

Solubilités Solubilités Interactions MoléculairesInteractions Moléculaires

Lafont et al. J. Cryst. Growth (1997)

BPTIBPTIpH 4pH 4,,55

Très Bonne Très Bonne CorrelationCorrelation entre l’Intensité des Interactionsentre l’Intensité des Interactionset la Solubilité:et la Solubilité:

Plus les Interactions sont Fortes, Plus la Solubilité est FaiblePlus les Interactions sont Fortes, Plus la Solubilité est Faible

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SiSi les Interactions les Interactions sontsont trop trop IntensesIntensesDemixtionDemixtion

cas ducas du BPTIBPTI--KSCNKSCN

Grouazel et al. Acta Cryst. 2002, D58, 1560.


Concentration

Températureou[Cristallisant]-1

Cc

Tc

Séparation de Phases ThermoSéparation de Phases Thermo--InduiteInduiteFacile à RéaliserFacile à Réaliser

Séparation de PhasesSéparation de Phases par Variation de Compositionpar Variation de CompositionBalayage IsothermeBalayage Isotherme

Séparation de Phases LiquideSéparation de Phases Liquide--LiquideLiquide

MeilleursConditions

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En Résumé

-En Conditions de Cristallisation les Interactions sont Attractives

-Très Bonne Corrélation entre l’Intensité des InteractionsAttractives et la Solubilité

--Interactions Attractives Trop Intenses =Précipitation ou Démixtion

Interactions Moléculaires Interactions Moléculaires par DLpar DL


Caractérisation des Macromolécules en SolutionCaractérisation des Macromolécules en Solution

Besoin de Critères pour Choisir/Déterminer de Manière RationnellBesoin de Critères pour Choisir/Déterminer de Manière Rationnelle les e les Conditions de CristallisationConditions de Cristallisation

La La MonodispersitéMonodispersité est un bon Critère est un bon Critère -- Les Les AgrégatsAgrégats sont à Évitersont à Éviter

«« PrédictionPrédiction » du Diagramme de Phases» du Diagramme de PhasesTrès Bonne Corrélation entre les InteractionsTrès Bonne Corrélation entre les Interactions et les Conditions de et les Conditions de CristallisationCristallisation

Approche PhysicoApproche Physico--chimiquechimique Complémentaire à la Cristallisation à Haut Débit Complémentaire à la Cristallisation à Haut Débit (HTS(HTS))


En Conclusion:En Conclusion:

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Diffusion de la Lumière et Cristallisation

Jean-Pierre Astier,Françoise Bonneté,Natalie Ferté,Stéphane Veesler

A Tester/Valider sur les Protéines Membranaires

Documents

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