Dosage comparatif des produits issus de la degradation alcaline des hexoses

Marie-France Dubois, Luc Rigal et Antoine Gaset

Introduction

RCsumC : L'analyse quantitative du glucose, du fructose, du mannose, du sorbose, du psicose, et parallklement des acides lactique, glycCrique, glycolique, formique et acCtique issus du traitement alcalin des hexoses est CtudiCe par chromatographie liquide haute performance ionique, couplCe B un dCtecteur B ampCromCtrie pulste avec deux colonnes Carbopac Dionex en sCrie pour les sucres e t a un conductimktre avec une colonne HPICE AS1 Dionex pour les acides. Cette mtthode sensible et fiable ne nkcessite aucun pretraitement des Cchantillons. Elle est comparCe B la chromatographie liquide haute performance sur colonnes Biorad HPX87C et HPX87P montCes en sCrie pour les sucres et sur colonne Interaction ORH 801 pour les acides ainsi qu'au dosage enzymatique. Elle est appliquCe B la comparaison du comportement du fructose, du glucose et du mannose en milieu alcalin.

Mots clis : hexoses, acides polyhydroxylCs, isomCrisation, degradation alcaline, chromatographie liquide haute performance ionique.

Abstract: The mixture of hexoses and carboxylic acids produced by alkaline degradation of fructose was analyzed quantitatively by high-performance liquid chromatography. A pulsed amperometric detector with two Carbopac Dionex columns in series was employed in the assay of sugars (glucose, fructose, mannose, sorbose, and psicose), while a conductimeter with an HPICE AS1 Dionex column was employed for carboxylic acids (lactic, glyceric, glycolic, formic, and acetic). This sensitive and reproducible method obviated sample pretreatment. The results were compared with those of enzymatic assays and HPLC determinations using Biorad HPX87C and HPX87P columns in series for the sugars, and an Interaction ORH 801 column for the carboxylic acids. The behaviour of fructose, glucose, and mannose in alkaline medium was compared.

Key words: hexoses, polyhydroxylic acids, isomerization, alkaline degradation, high-performance ionic liquid chromatography.

La degradation alcaline des hexoses conduit 2 un trks grand nombre de produits (1). 11 se forme essentiellement des sucres isomkres de l'hexose de dCpart (fructose, glucose, mannose, sorbose, psicose ...) (2) ainsi que des acides polyhydroxylCs (acides lactique, glycolique, glycerique, formique et acC- tique ...) (3).

L'analyse de ces composCs de degradation est trks impor- tante dans de nombreux domaines : dans l'alimentaire, car ils influencent la saveur et .la couleur des produits (4-6); dans les traitements des liqueur noires issues des procCdCs papetiers (7-9); et dans l'industrie de transformation des sucres (10-14) et en particulier pour l'optimisation de la production de l'acide lactique (15-20).

Les principales mCthodes analytiques utilistes pour le dos- age de tels milieux sont : (i) la chromatographie liquide haute

R e ~ u le 3 mars 1994.'

M.-F. Dubois, L. ~ i ~ a l ' et A. Gaset. Laboratoire de chimie agro-industrielle, Institut national polytechnique de Toulouse, Ecole nationale supCrieure de chimie de Toulouse, 118, route de Narbonne, 3 1077 Toulouse CCdex, France.

' RCvision r e p e le 26 mai 1995. * Auteur i qui adresser toute correspondance. TClCphone :

61 175722.Fax.61 175730.

performance (CLHP) sur colonne, de type silice greffte par des groupements amino propyl ou de type Cchangeurs d'ions sous forme ca2+ ou pb2+, pour les sucres (2 1-28), ou de type silice greffCe par des groupements C, ou C,, ou du type Cchangeurs d'ions sous forme Hf, pour les acides (6,29-31).

La dCtection est alors assurte par rCfractomCtrie dans le cas des sucres et des acides ou par spectrophotometrie UV, plus sensible, dans le cas des acides. Pour les sucres, la spectropho- tomCtrie visible aprks ajout-post colonne est de moins en moins utilisCe (28). Ce type d'analyse impose des prCtraite- ments de neutralisation et dCminCralisation du fait de la mise en oeuvre de solvants organiques dans le cas des colonnes type silice greffCe, ou de rCsine Cchangeuse d'ions dans le cas de la chromatographie d'Cchange.

(ii) les mCthodes enzymatiques : ces techniques, du fait m&me de la spCcificitC de l'enzyme employCe, permettent le dosage selectif du produit. Cependant, elles nCcessitent un essaipar produit 2 doser, et dans certains cas, un pretraitement de dtcoloration. Enfin, ces enzymes ne sont disponibles que pour quatre de nos produits (32, 33) (glucose, fructose, man- nose et acide lactique).

(iii) la chromatographie en phase gazeuse, par exemple sur colonne type OV 101, pour les sucres (34-36), CP Si l5 pour les acides (15, 37-39), couplCe 2 un dCtecteur a ionisation de flamme : les sucres et les acides doivent subir prealablement une dkrivation aprks neutralisation et lyophilisation (40). Cette dernikre est assez delicate dans le cas des melanges de

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Fig. 1. SCparation CLHP de glucose, fructose, mannose, sorbose et psicose sur les 2 colonnes Aminex HPX 87C et Aminex HPX 87P montCes en sCrie. TempCrature de la colonne : 85°C. Eluant : eau dCsionisCe. DCbit de 1'Cluant : 0,3 mL/min.

Debit d'eluant O,? m l / m i n I

Temperature (OC) dCbit (mLImin)

Temps de retention (min)

. . . .,

sucres et d'acides. Elle risque de provoquer une modification du milieu. De plus, l'acide formique et l'acide acCtique ne pourront pas &tre dosCs dans les m&mes conditions d'analyses.

Pour notre part, nous nous sommes intCressCs 2 la mise au point d'une mCthode d'analyse fiable et sensible des princi- paux hexoses et acides polyhydroxylCs rencontrCs dans les milieux issus du traitement basique du fructose, du glucose ou du mannose.

La chromatographie liquide haute performance ionique (CLHPI) couplCe 2 1'ampCromCtrie pulsCe pour les sucres (41- 44) et a la conductimCtrie pour les acides (45, 46) Climine les contraintes imposCes par les autres mCthodes analytiques (prktraitement des milieux, dCcoloration ...). Notre objectif est d'optimiser ces deux mCthodes CLHPI en vue de suivre 1'Cvo- lution en fonction du temps de neuf composCs issus de la dCgradation alcaline des sucres.

Partie experimentale

Reactifs et etalons Tous les produits sont de puretC ClevCe, pour analyse :

Sucres e'talons : D-fructose (Fluka 47 739), D-glucose (Prolabo 24 379-294), D-mannose (Aldrich 11 285-5), D-sorbose (Roquette Frkres 80078), D-psicose (Sigma P-1275), D-galac- tose (Prolabo 24 333 183), Cellobiose (Prolabo 22 558 120), Arabitol (Sigma A 3381).

Acide e'talons : acide DL-lactique (sodium salt) (Fluka 7 1 720), acide acktique (sodium salt) (Merck 6268), acide formique (Fluka 06 440), acide glyckrique (calcium salt) (Fluka 50 036), acid glycolique (Fluka 50 590), acid pimelique (Fluka 80 500), acide propionique (Fluka 81 910).

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Fig. 2. Separation CLHPI de glucose, fructose, mannose, sorbose et psicose avec deux colonnes Carbopac montkes en strie. Temptrature : 20°C. Dtbit d'tluant : 1 mLlmin, tluant E, : NaOH 100 mM, E2 : H20, gradient CtagC : 0 4 min : 15% E,; 4-100 min : 100% E2; 100-125 min : 100% E,; 125-145 min : 15% E,. Ajout post-colonne : 300 mM de soude.

Temps de retention (min)

I Rkactifs pour les kluants : soude (Baker 7067), acide octane Elmer Isocratique 250, une vanne RhCodyne 7 125 (boucle I sulfonique (Dionex 35 362), tCtrabutylammonium hydroxyde d'injection 20 pL), un rkfractomktre Perkin Elmer LC25, un I

I (Janssen 17 6610), acide sulfurique (Fluka 84 720), propanol- chauffe-colonne Croco CilTM et un intkgrateur LDC, Milton I 2 (Chromasol SDS). Roy CI 10B ont CtC utilisks.

Pour les sucres, les colonnes sont de type tchangeur de cat- M6thodes de dosage ion forte sous forme ca2+ ou pb3+ (Bio-Rad Aminex HPX 87C

and HPX 87P; 300 mm x 7,8 mm i.d.) montt avec une prCcol- Chromatographie liquide haute performance (CLHP) onne (cartouche Biorad Microguard). L'tluant est l'eau Un chromatographe liquide CquipC avec une pompe Perkin dbioniste. L'Ctalon interne est le cellobiose.

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Tableau 1. Comparaison du dosage du glucose, du fructose, du mannose et de l'acide lactique par les methodes CLHP, enzymatique et CLHPI.

Dosage Dosage Dosage Dosage CLHP aprbs enzymatique aprbs enzymatique sans CLHPI sans prktraitement pretraitement pretraitement pretraitement

Compose (gL) (gL) (gL)

Glucose 1,41 Fructose 0,88 Mannose 1,08 Acide lactique 7,24

Fig. 3. Chromatogramme d'un milieu rkactionnel de degradation alcaline du fructose sur la colonne Interaction ORH 801. Temperature de la colonne : 35°C. Eluant : H2S04 0,01 N. Dtbit d'eluant : 0,6 mLlmin.

E

- 6, 58 - - 7 s 37 7. 83 8, 58

11, 29 r, P

'0 V) 1 5, 4 1 h a l o n interne

I

Pour les acides, la colonne est de type Cchangeur de cation ammoniumhydroxyl (TBAOM), ttalon interne acide propion- forte sous forme H+ (300 mm x 6,5 mm id.) montC avec une ique, conductimktre sensibilitt 30 yS. prtcolonne (cartouche Interaction Ionguard). L'tluant est I'acide sulfurique 0,01 N. L'ttalon interne est l'acide Enzymologie pimtlique. Les dosages sont rtalists suivant les tests de Boehringer et

Mannheim (1 112 821,139 106, 131 229).

Chromatographie liquide ionique haute pelformance (CLHPI)

Le systkme de chromatographie ionique utilisC est le BioLC Dionex avec une boucle d'injection de 50 y L et Cquipt de deux manikres differentes pour les analyses de sucres et pour celles des acides. Pour les sucres : Les stparations sont rCalisCes sur une ou deux colonnes Carbopac (250 mm x 4 mm id . ) commercial- istes par la Socittt Dionex, monttes en strie, relites % une prt- colonne Carbopac PA1 Dionex. Les deux types d'tluants utilists sont de l'eau dCsioniste, avec une rCsistivitt de 18 M a et une solution de soude 2 150 mM.

Dans le cas de la rkalisation d'un gradient ou d'un gradient t tagt % l'aide de ces deux tluants, un ajout post-colonne de soude 300 mM juste avant la cellule du dttecteur par amptromttrie pulsCe (PAD) est ntcessaire afin d'Cviter de trop grands changements de pH lors de la detection, et de sta- biliser ainsi la ligne de base.

L'ttalon interne utilisC est I'arabitol. Les caracttristiques du PAD sont : tlectrode en or; potentiels appliquCs : E, = 0,05 V , E, = 0,60 V, E3 = -0,60 V ; durtes d'application : t , = 480 ms, t, = 120 ms, t3 = 60 ms. Pour les acides : Les conditions d'analyse pour les acides sont : colonne HPICE AS 1 (250 mm x 8 mm id . ) de la SocittC Dionex, Cluant solution d'acide octane sulfonique 1 mM et de propanol-2 2 2% dans l'eau dtsioniste, rtgCnCrant tttrabutyl-

PrCparation des Cchantillons

Obtention de me'langes re'actionnel type Dans un ballon de 500 mL muni d'un agitateur mtcanique, d'un rCfrigtrant et d'un thermomktre, le sucre en solution dans l'eau (100 mL) est thermostat6 % la temptrature choisie, sous agitation. La base (NaOH) en solution dans 100 mL d'eau est alors additionnte. En fin de reaction (9 h) le milieu rtactionnel est refroidi dans un bain d'eau et de glace pilCe.

Traitemelzt des milieux re'actionnels Pour l'analyse des Cchantillons par CLHPI ou enzymologie, les Cchantillons sont simplement dilut dans l'eau dCsioniste (dosages enzymatiques et des sucres par CLHPI) ou dans 1'Cluant (dosages des acides en CLHPI). Dans ce dernier cas le pic ntgatif qui correspondrait a l'eau injectCe, de conductivitt plus faible que celle de l'tluant est supprimC.

Dans le cas de l'analyse par CLHP, pour le dosage des acides, les milieux rCactionnels sont prCtraitCs sur rCsines tchangeuses d'ions Hf (Lewatit S100) afin d'tliminer les cat- ions prtsents dans la solution, puis diluts dans l'eau dCsion- isCe. Pour le dosagedes sucres, les milieux rtactionnels sont neutralisCs et dtminCralisCs par percolation sur rtsine acide (Lewatit SlOO forme H') puis basique (Lewatit MP62 forme OH-). 11s sont ensuite diluts si nCcessaire dans l'eau dCsioniste.

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Fig. 4. Stparation CLHPI des acides lactique, glycolique, glyctrique, formique et acttique sur la colonne Dionex HPICE AS1. Temptrature : 21°C. Eluant : solution d'acide octane sulfonique 1 mM et de propanol-2 i 2% dans l'eau dtsioniste. Debit d'tluant : 0,3 mL1min.

RT acide lactlque

A RT acide glycolique

O RT adde formique

RT adde acetique

debit (mL/min)

t m

&4

m - 0' -. " S 0 a m - = ,O 0' m W m-. 3

U U E

0*-

Temps de r6tention (min)

Resultats et discussion

1. Analyse des sucres L'analyse des sucres en CLHP sur colonne calcium ou plomb ne permet pas la sCparation satisfaisante du glucose, fructose, mannose, sorbose et psicose. Par contre, avec les deux col- onnes ca2+ et pb2+ montCes en sCrie, une diminution de la tempCrature et du dCbit de 1'Cluant amCliore la sCparation (figure 1). Cependant cette technique nCcessite le traitement prCalable des milieux rCactionnels (neutralisation et dCminCra- lisation).

La chromatographie liquide haute performance ionique par Cchange d'ion permet de rCsoudre cette difficultC. Cette tech- nique prCsente l'avantage de mettre en ceuvre des rCsines sta- bles de pH = 0-14 et de ne nCcessiter que des temps d'kquilibrage trks court. La dCtection ampCromCtrique pulsCe

Tableau 2. Comparaison du comportement du fructose, du glucose et du mannose en milieu basique concentrt.

Sucre de dCpart

Produit Fructose" Glucose" Mannose"

Fructose 0,OO 1 0,OO 1 0,036 Glucose 0,007 0,013 0,033 Mannose 0,O 1 0,014 0,116 Galactose 0 0 0 Sorbose 0 Trace Trace Psicose 0 Trace Trace

Acide lactique 1,292 0,816 0,73 Acide glyctrique 0,107 0,086 0,069 Acide glycolique 0,030 0,085 0,073 Acide formique 0,179 0,176 0,23 Acide acttique 0,03 0,036 0,045

"Mole de produit formUrnole de sucre introduit. Conditions opiratoires : concentration en sucre = 25 g/L; NaOH = 2 M; 9 h; 40°C.

est spkcifique, sensible et compatible avec un gradient d'Clu- tion, gr2ce B l'ajout post-colonne de soude concentrke (41, 42). La sensibilitk autorise de grandes dilutions de 1'Cchantil- lon ce qui Climine de nombreux problkmes d'interfkrences avec la matrice. Les milieux rtactionnels, dans le cas du trait- ement alcalin des hexoses peuvent donc Ctre inject& sans prktraitement, aprks simple dilution.

Dans le cas d'une seule colonne Carbopac, la sCparation des differents sucres ?i doser n'est pas satisfaisante en dCpit des changements de force Cluante, de gradient et de dCbit. Afin d'augmenter l'efficacitt de sCparation, deux colonnes Carbo- pac ont CtC montCes en drie. La rCalisation d'un gradient CtagC dans le cas de l'utilisation de ces deux colonnes a permis d'obtenir une siparation correcte de l'ensemble des sucres (figure 2). Dans ces conditions, l'analyse quantitative de ces hexoses est obtenue avec une bonne precision (x + 0,02 x). La gamme de concentration utilisCe pour nos essais aprks ajout de 1'Ctalon interne est de 10 B 200 ppm. Cependant, la limite de dttection pour les sucres avec le PAD est largement infkrieure puisqu'elle se situe autour de quelques picomoles injectCes (42).

La cornparaison des rCsultats obtenus selon les mCthodes, CLHP, enzymatique et CLHPI dans le cas du dosage de glu- cose, fructose et mannose contenus dans un milieu rkactionnel (tableau 1) montre que : le prktraitement de neutralisation et de dCminCralisation impCratif pour l'analyse CLHP conduit B une sous-estimation des sucres; et lorsque le milieu rCaction- nel est peu colork, les concentrations en sucre obtenues par la voie enzymatique sans prktraitement et par CLHPI sont voisines. Cependant, dans le cas de milieux riactionnels trop colorCs, le dosage enzymatique n'est plus fiable sans prCtrait- ement de dCcoloration. Celui-ci constitue une source d'erreur.

Cette mCthode de dosage par CLHPI permet donc de doser de faqon fiable sensible et directe, le glucose, le mannose, le fructose, le sorbose et le psicose. De plus, cette mCthode B per- mis de mettre en Cvidence la prCsence de galactose dans les milieux rkactionnels issus du traitement alcalin du fructose, du glucose ou du mannose.

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Fig. 5. Cinttique d'isomtrisation du fructose. Concentration initiale en fructose : 100 g/L; NaOH : 0.3 M; temptrature : 40°C.

temps (min)

A acide glycolique

O acide forrnique

temps (min)

2. Analyses des acides carboxyliques polyhydroxylCs L'analyse des acides en CLHP sur colonne Cchangeuse sous forme H+ nkcessite le pretraitement des milieux rkactionnels afin deliminer les cations presents dans la solution. Sur ce type de colonne on peut dttecter les sucres et les acides. Cependant, leurs temps de rttention sont trks voisins et l'analyse d'un milieu rCactionne1 issu de la dtgradation alcaline du fructose ne permet pas de les doser de f a ~ o n satisfaisante dans le melange (figure 3).

De plus, la comparaison du dosage de l'acide lactique par cette mCthode et la mCthode enzymatique avant et aprks

pretraitement de dkcationisation sur resines Cchangeuses mon- tre que ce dernier est 9 l'origine d'une sous-estimation des concentrations (tableau 1).

Le dosage par chromatographie liquide ionique haute per- formance rCsoud cette difficultk. En effet, comme dans le cas des sucres, le prttraitement n'est plus ntcessaire. Dans les conditions d'utilisations standards (debit d'Cluant 0,8 mL/ min), les acides sont ma1 sCpar6s. La diminution du debit per- met d'ameliorer cette separation (figure 4).

Les rksultats obtenus pour les concentrations en acide lac- tique sont comparables 9 ceux obtenus par dosage enzyma-

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Fig. 6. Cinetique d'isomkrisation du glucose. Concentration initiale en glucose : 100 g/L; NaOH : 0,3 M; temperature : 40°C.

temps (min)

galactose acide glyctrique acide lacrique

A acide glycolique

1 O acide fonnique X acide acCrique

temps (min) tique sans prktraitement (tableau 1). De plus, cette mkthode chromatographique permet de doser les acides glyckrique, gly- colique, acktique et formique, ce qui n'Ctait pas le cas des autres mkthodes. L'analyse quantitative de ces cinq acides est obtenue avec une bonne prkcision (x + 0,025 x). Grdce au systkme de suppression chimique, le bruit de fond est diminuk et la sensibilitk augmentCe. Nous avons travail16 dans une gamme de concentration aprks dilution de 10 a 20 ppm. Celle- ci pourra &tre dkplacke vers des concentrations plus faibles sans difficultk.

3. Application au cas de mClanges rCactionnels L'kvolution des constituants de milieux riactionnels issus de

traitements alcalins du fructose, du glucose et du mannose a kt6 suivie grice la mCthode de dosage par CLHPI. L'Ctude cinktique de la transformation du fructose en glucose et en mannose, et inversement, en solution alcaline a Ctk menke par de nombreux auteurs (2 1,24,34, 35,47-52). Cependant, si la formation du psicose a kt6 prise en considkration par quelques auteurs (21,49, 52, 53), celles due sorbose et du galactose ne l'ont ttk que plus rarement (2, 21, 54-56). Les rCsultats obte- nus par nos soins confirment la diffkrence de comportement des trois hexoses vis-i-vis de l'action de la soude :

(i) Dans des conditions opkratoires de faible concentration en base, I'isomCrisation du fructose en glucose et mannose (figure 5) est plus rapide que celle du glucose (figure 6) et

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Fig. 7. CinCtique d'isomkrisation du mannose. Concentration initiale en mannose : 100 g/L; NaOH : 0,3 M; tempCrature : 40°C.

temps (min)

0 . . o i'oo 200 300 400 500

temps (min)

acide glycCrique

A acide glycolique 0 acide formique

surtout du mannose (figure 7) (24). L'apparition du sorbose, du psicose et du galactose, qui mettent en jeu des mtcanismes plus complexes (2, 21) est nettement plus lente. Cependant, 2 partir du fructose ou du glucose, le sorbose et le psicose atteignent aprks quelques heures de rtaction, des concentra- tions i peine plus faibles que celle du mannose. L'apparition du galactose, dans ces deux cas, est retardte et il ne se forme qu'en proportion plus faible que les acides. A partir du mannose, le psicose n'est obtenu qu'en concentration trks faible, et les formations du galactose et du sorbose sont trks retardtes.

(ii) Dans ces mCmes conditions de faible concentration en base, la formation de l'acide lactique est nettement dtfavoriste

par rapport a celle des autres acides. Par contre, 2 forte concen- tration en soude, et pour une faible concentration initiale en monosaccharide, c'est l'acide lactique qui devient majoritaire (tableau 2). Ici aussi, l'ordre de rCactivitC vis-a-vis de l'action des bases est fructose > glucose > mannose.

Conclusion

L'analyse quantitative des sucres issus de la dtgradation d'un hexose en milieu alcalin est obtenue avec les meilleurs rtsul- tats par la mtthode chromatographique liquide ionique. Bien que cette stparation soit relativement longue, elle permet de doser exactement glucose, fructose, mannose, surbose, psi-

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case sans prttraitement. En outre, elle permet de mettre en Cvi- dence la pr6sence de galactose. L'augmentation de la capacitC des resines utiliskes dans les colonnes Carbopac devrait per- mettre de diminuer les durtes d'analyses. La chromatographie liquide haute performance sur les colonnes plomb et calcium en sCrie a confirm6 la prCsence de ces sucres et le dosage enzy- matique des trois principaux sucres (glucose, fructose et man- nose) a permis une verification quantitative. Les acides issus de ce m&me traitement sont Cgalement dos6s grdce une sec- onde analyse par chromatographie liquide ionique et le dosage de l'acide lactique est confirm6 par enzymologie. Cette mCth- ode d'analyse permet donc d'envisager 1'Ctude de l'optimisa- tion de l'obtention de l'acide lactique par traitement alcalin des monosaccharides en milieu concentrC.

Remerciements Les auteurs remercient la SociCtC Applexion rCdaction complkte.

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