.'|tlglI.vlt~'~l ( ' l t ln l l | tl / |1 td Elsevier l'uhlishing ('olnpany, Amsterdam Prmled i n l'hc Ncthcrl,tntls

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D O S A G E O X Y D I M E T R I Q U E E N M I L I E U N O N A Q U E U X D E C O M P O S E S P H E N O L I Q U E S D ' O R I G I N E V E G E T A L E

i l . O X Y D A ' I ' I O N I ) E S F L A V O N O L S

NO[Q[ . I ) E I . A P O R T E I!r J I - A N - J A C Q U E S M A C I I E I X

I .~thort t to ire d e Plo'.sitJlo~lie des O r qant 's I'(:ff(;tmt.x'. ('~'tttt'c, Ncttion~tl de ht R e c h e r c h e .S'ciettti/hlt.,. 4. ter l¢ottt(, d('.~ ( /ard( ,s . 92-~[et t t l~m ( I"rtmce )

(P, ct;u le 5 o c t 0 b r c 1971)

La c a r ac t6 r i s a t i on et le d o s a g e des f l a v o n o i d e s sont essentiellen~cnt basOs sur i ' i n t e rp r6 t a t i on des m o d i f i c a t i o n s spcc t ra lcs rOsultant dc la ch61ation de diff6rcnts m 6 t a u x pa r ¢es c o m p o s 6 s |'2. Ces r6ac t ions n6ccss i tcn t g 6 n 6 r a l c m e n t un g rand exc6s & i o n s m6ta l l iques , ce qui ne p e r m e t pas l ' app l i ca t i on des m 6 t h o d e s t i t r im6tr iques c lass iques .

Darts r 6 t u d e pr6c6dente 3. n o u s a v o n s m o n t r 6 qu ' i l est poss ib le de dose r sto- e c h i o m 6 t r i q u e m e n t d ivers c o m p o s 6 s o - d i p h 6 n o l i q u e s c o m m e I 'ac ide c h l o r o g 6 n i q u e et la ( + ) c a t 6 c h i n e en ut i l isant les p ropr i6 t6s o x y d a n t e s des ions cu ivr iques en mil ieu n o n aqucux . Ces pr inc ipes on t 6t6 app l i qu6s dans le pr6sent t rava i l au dos~|ge t i t r imd- t r i q u e de q u e l q u e s f lavonois (I) f r 6 q u e m m e n t r e n c o n t r d s d a n s les tissus v6g~taux.

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(I) Structure g~n~rale des flavonol5

M A T E R I E L ET NIf3.THOI)ES

Selon les t e chn i ques d6jft d6cr i tes 3, i ' o x y d a t i o n des f l avonols par le cu iv re ( l l ) est effectude d a n s un mi l ieu a c 6 t o n i t r i l e - a c i d e m 6 t h a n o i q u e , les ph6nona6nes &an t su iv is s i m u l t a n 6 r n e n t pa r p o t e n t i o m 6 t r i e et par s p e c t r o p h o t o m 6 t r i e . La r6versibili t6 6ven tue l l e des r6ac t ions est 6tudi6e p a r a c t i o n d e i ' ac ide a s c o r b i q u e sur les p r o d u i t s d ' o x y d a t i o n . T o u s les essais on t 6t6 effectu6s il p a r t i r de p r o d u i t s F l u k a solubil is6s d a n s du m 6 t h a n o l abso lu .

P.I~SU L T A T S

N o u s a v o n s tou t d ' a b o r d 6tudi6 i ' o x y d a t i o n pa r le cu iv re ( l I) des f lav0nols di- ou t r i h y d r o x y l 6 s en ortho sur le cycle B (querc6t ine , fis6tine, myr ic6 t ine ) ainsi que celle de

Ana l . Chim. Ac tu . 59 (1972)

280 N. DELAPORTE, J . -J . MACHEIX

plusieurs de leurs h6t6rosides en pos i t ion 3. La raise en Evidence du caract6re rEducteur des f lavonols non hydroxy l6s sur le cycle B (kaempfErol) et de q u e l q u e s f l avono ides de structure vois ine n o u s a permis ensui te de mieux interpr6ter les p h 6 n o m / m e s observes .

Oxydation desJlavonols prt;sentant au moins une fonction o-diph6nol sur le cycle B L'enregistrement p o t e n t i o m 6 t r i q u e r6alis6 au cours de r o x y d a t i o n de la

querc6t ine (5, 7, 3', 4 ' - t6 trahydroxyf lavonol ) prbsente d e u x pies ; le premier correspond ~l deux 6quivalents de cuivre par molbcu le et le s e c o n d 'h une c o n s o m m a t i o n suppl& menta ire de 0.75 6quiva lent (Fig. IA). L'6volut ion spectra le au cours de l ' oxydat ion traduit la disparit ion des bandes d 'absorpt ion vers 260 et 370 n m et I 'apparit ion d 'une bande nouve l l e vers 290 n m (Fig. 2A). Quel que soit le s tade d ' o x y d a t i o n de la mol6 - cule, la rbaction n'est pas r6versible. Par contre , dans les m E m e s cond i t i ons , r o x y d a t i o n

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Fig. 1. Courbes potentiom(:triques obtenues au cours de I 'oxydation par le cu ivre( l l ) de la querc6tine (A) et de la myric6tine (B).

Fig. 2. Evolut ions spectrophotom6tr iques au cours de la t itration par le cuivre(II) de la querc6tine (A), de la quercitrine (B) et de la d ihydroquerc6t ine (C). D a n s les deux dern'iers cas, les o - q u i n o n e s form6es sont r6ductibles par racide ascorbique avec retour au spectre initial.

Anal. Chim. Acta, 59 {1972)

DOSAGE OXYDIME'TRIQUE DES FLAVONOLS 281

de deux h6t6rosides de la querc6tine, ia querci t r ine (querc6tine 3-rhamnoside) (Fig. 2B) et la rut ine (querc6tine 3-rutinoside), n6cessite deux 6quivalents de cuivre(l l) par mol6- cule et est to ta lement r6versible.

Pour mettre en 6vidence i ' influence de l'6tat d 'hydrog6na t ion de l'h6t6rocycle des f lavonols sur leurs propri6t6s r6ductrices, nous avons fait agir le cuivre(ll) sur un dihydrof lavonoi , dihydroxyl6 sur ie cycle B : ia 2, 3-dihydroquerc6tine. L 'oxydat ion de ce compos6 (Fig. 2C) n6cessite deux 6quivalents cuivriques et le ph6nom6ne est ent i~rement r6versible. L 'oxydat ion de la fis6tine (7, 3', 4 ' - t r ihydroxyflavonol) qui est I ' homoiogue non hydroxyl6 en pos i t ion 5 de la querc6tine, s'effectue en deux 6tapes : une 6tape non r6versible, co r respondan t it la c o n s o m m a t i o n d 'un 6quivalent cuivre(II) par mol6cule et une seconde 6tape r6versible, par act ion de l 'acide ascorbique, corres- pond a n t au transfert d 'un 61ectron par mol6cule (Fig. 3).

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Fig. 3. Evo lu t ion spec t ropho tom6t r ique au cours de la t i t ra t ion de la fis6tine par le cuivre( l l ) .

L'oxydat ion de la myric6tine (5, 7, Y, 4', 5 ' -pentahydroxyflavonol) rapelle celle de la querc6tine : l 'enregistrement po ten t iom6t r ique ne montre qu 'un seul pic (Fig. 1 B) cor respondan t "h la fin de r6volut ion spectrale (Fig. 4A) et fi ia consommat ion de 3 6quivalents de cuivre(l l) par mol6cule ; le produi t de la r6action n'est par r6ductible.

Oxydation des flavonois ne prdsentant pas de fonction o-diphdnol sur le cycle B Bien que n¢ poss6dant pas de g roupemen t r6ducteur sur lo cycle B, le kaemp-

f6rol (5, 7, 4 '- tr ihydroxyflavonol) , le kaempfOride (5, 7-dihydroxy-4 ' -methoxyflavonol) et la galangine (5, 7-dihydroxyflavonol) sont oxyd6s par le cuivre(II) avec une consom- mat ion de 1.5 6quivalent par mol6culo. L '6volut ion spec t rophotom6t r ique (Fig. 4B) ost scmblable ~ celle obsorv6e pour los f lavonols don t le cycle Bes t polyhydroxyl6. Ce- pendant , dans ie cas de la galangine, l 'oxydat ion est beaucoup plus lente que pour 10s deux autres compos6s et, fi la tempOrature ambiante , la r6action n'est pas assez rapide pour permet t re dans ces condi t ions lo dosage volum6tr ique de cett¢ substance. Un dih6t6rosid¢ du kaempf6rol, la rob in ine (kaempfOrol 7-rhamnosido 3-galactorham- noside), n'est pas oxyd6 par les ions cuivriques et il on est de m6me pour une flavon¢

Anal. Chim. Acta, 59 1,19727

282 Y. D E L A P O R T E , J . - J . M A ( ' H E I X

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Fig. 4. | : . vo lu t ion spec t ropho tom~St r ique au t o u r s de la t i t r a t i o n , p a r le c u i v r e ( | | ) , d e |:t m y r i c ~ t i n e (A) el du k a e m pfdro | (B).

m o n o h y d r o x y l d e c o m m e le kaempfd ro l sur le cycle B, r a p i g a n i n e (5, 7, 4 ' - t r ihydro- xyl lavon¢) .

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Los r6sultats pr6c6dcnts font r e ssor t i r r i n f l u e n c e de 1'6tat d ' o x y d a t i o n de rh6 t6 rocyc l e des f lavonols a insi q u e du d e g r 6 de s u b s t i t u t i o n des cycles A et B sur lc ca rac t6 re r6duc t eu r des mol6cules .

Impor tance de l'c;ta t d 'oxydat i(m de l'h¢;tProcycle Le kaempf6 ro l est fac i lement et i r r 6 v e r s i b l e m e n t oxyd6 pa r le cu iv r e ( l l ) avec

t ransfer de deux 61ectrons p o u r trois mol6cu les . P a r con t re , les 3-h6t6ros ides de ce c o r p s ( robinine) o u son h o m o l o g u e non h y d r o x y l 6 en 3 (apig6nine) ne le sont pas. La pr6sence de la fone t ion h y d r o x y l e libre, s u r r h 6 t 6 r o c y c l e oxyg6n6, conf6re d o n c un ca rac t6 re r6duc teu r cer ta in a la mol6cu le f l a v o n o l i q u e et ce t te p ropr i6 t6 est ind6pen- d a n t e de r ex i s t ence 6ventuel le d ' u n e f o n c t i o n o - d i p h 6 n o l su r le cycle B. La s toechio- m6t r ie des r6act ions d ' o x y d a t i o n i m p l i q u e a u m o i n s une d im6r i s a t i on d e la mol6cu le d a n s le cas du kaempf6ro l o u u n e t6 t r am6r i sa t ion , n o t a m m e n t lors du s e c o n d s tade d ' o x y d a t i o n de la querc6t ine . Ce l a p o u r r a i t e x p l i q u e r r i r r6vers ib i l i t6 des r6act ions. Les t r a n s f o r m a t i o n s spect ra les enregis t r6es au c o u r s de l ' o x y d a t i o n de la que rc6 t ine (Fig. 2A), de la fisetine (Fig. 3), de la m y r i c e t i n e (Fig. 4A) et du k a e m p f 6 r o i (Fig. 4B) t r a d u i s e n t la d i spa r i t i on des effets de c o n j u g a i s o n d u g r o u p e r n e n t C O d e l 'h6t6rocycle avec le cycle B (bande vers 370 nm) et avec le cycle A (bande vers 260 n m ) signal6s pa r Geissman '* et J u r d 5. Lo r sque les effets t au tona6res d e la m o l e c u l e sont s u p p r i m 6 s pa r

A hal. C h i m . A eta. 59 (1972)

DOSAGE OXYDIMI~TRIQUE DES FLAVONOLS 283

b l o c a g e d e l ' h y d r o x y l e e n pos i t i on 3 ( q u e r c i t r i n e ) o u p a r h y d r o g 6 n a t i o n de la d o u b l e l i a i son en 2, 3 { d i h y d r o q u e r c 6 t i n e ) , la f o n c t i o n o - d i p h 6 n o l du cycle B est a lo rs n o r m a - l e m e n t o x y d a b l e en o - q u i n o n e , avee a p p a r i t i o n d ' u n e b a n d e d ' a b s o r p t i o n d ' i n t ens i t6 p l u s fa ib le e n t r e 400 et 450 n m (Fig. 2B et C). Ces o - q u i n o n e s s o n t r6duc t ib les p a r I 'ac ide a s c o r b i q u e . La c o m p a r a i s o n des spec t r e s de la q u e r c 6 t i n e et de la d i h y d r o - q u e r c 6 t i n e (Fig. 2A et 2C) m e t d ' a i l l e u r s en 6 v i d e n c e la d i s p a r i t i o n d u car. 'lct~re a r o m a t i q u e de l ' h6 t6 rocyc l e d a n s le cas d u s e c o n d c o m p o s 6 .

lt!/luence de rt;tat d'hydroxylation du cycle A La c o m p a r a i s o n de s r6sul ta ts , o b t e n u s d ' u n e p a r t avec la q u e r c 6 t i n e et d ' a u t r e

p a r t a v e c l a fis6tine, i n d i q u e q u e I ' h y d r o x y l e en p o s i t i o n 5 sur le cycle A ac t ive I 'h6t6ro- cyc le au d 6 t r i m e n t d u p o u v o i r r 6 d u c t e u r d e la f o n c t i o n o - d i p h ~ n o l d u cycle B. En effet, r o x y d a t i o n est t o t a l e m e n t i r r eve r s ib l e p o u r la q u e r c 6 t i n e , a i o r s qu 'e l l c l 'est p a r t i e i l e m e n t d a n s le c a s d e la fis6tine. P o u r ce d e r n i e r c o m p o s 6 , ap r6 s u n s t ade irr6- vers ib le , li6 v r a i s e m b l a b l e m e n t fi la f o r m a t i o n d ' u n d im~re , on o b s e r v e un s e c o n d s t a d e r6vers ible , ce qu i i m p l i q u e su r le d i m ~ r e l ' ex i s tence d ' u n e seu le f o n c t i o n o-di- p h 6 n o l act ive . L ' i n f l u e n c e 6ven tue i l e d e I ' h y d r o x y l e en p o s i t i o n 7 res te fi pr6ciser .

lt!Jluence de r6tat d'hydroxylation du cycle B L'effet a c t i v a t e u r des h y d r o x y l e s d u cyc le B est mis en 6 v i d e n c e i o r sque I 'on

c o m p a r e les r6su l t a t s o b t e n u s e n o x y d a n t le k a e m p f 6 r o l , le k a e m p f 6 r i d e et la ga l ang ine , ce d e r n i e r c o r n p o s 6 se r6v61ant n e t t e m e n t m o i n s r 6 d u c t e u r q u e les deux a t t t res . L o r s q u e le cycle B de s f l a v o n o l s est d i h y d r o x y l 6 (querc6 t ine ) o u t r i h y d r o x y l 6 (rnyric6- t ine) , les f o n c t i o n s p h 6 n o l i q u e s de ce cyc le s e m b l e n t i n t e r v e n i r d , ' tvan tage p a r l eur effet a c t i v a t e u r su r l ' h6 t6 rocyc le q u e p a r leur p o u v o i r r 6 d u c t e u r p r o p r e . Ceci cxpl i - q u e r a i t le fait q u e ces c o m p o s 6 s ne d o n n e n t p a s d e f o r m e s q u i n o n i q u e s lors de l ' o x y d a - t ion . Ce s p h 6 n o m ~ n e s s o n t m i s en 6 v i d e n c e p a r la s i m i l i t u d e des 6 v o l u t i o n s s p e c t r o - p h o t o m 6 t r i q u e s d u k a e m p f 6 r o l et d e la m y r i c 6 t i n e . D a n s ces d e u x cas, les effets o p t i q u e s , s e n s i b l e m e n t les m6mes , s o n t d a v a n t a g e li6s au caract / : re a r o m a t i q u e pa r t i - cu l i e r d e l ' h6 t6 rocyc le q u ' a u degr6 d e s u b s t i t u t i o n d u cycle B. I1 fau t c e p e n d a n t n o t e r q u e l ' o x y d a t i o n d e la m y r i c 6 t i n e et d e la q u e r c 6 t i n e c o n d u i t "fi la f o r m a t i o n i m r n 6 d i a t e d e d6r iv6s q u i n o n i q u e s i n t e r m 6 d i a i r e s de c o l o r a t i o n rouge , qu i d i s p a r a i s s e n t au fur et il m e s u r e d e leur f o r m a t i o n . U n e r~ac t i on p l u s l en te c o n d u i t e n s u i t e aux f o r m e s o x y d 6 e s f inales, s t ab l e s et n o n r6duc t ib l e s .

CONCLUSION

Le t y p e d e r 6 a c t i o n r6vers ib le p r 6 c 6 d e m m e n t 6tudi63 lors d e r o x y d a t i o n d e c e r t a i n s o - d i p h 6 n o l s , n e p e u t pas 6 t r e g6n6ra l i s6 "/t i ' e n s e m b l e de s c o m p o s 6 s n a t u r e l s p r 6 s e n t a n t ce t t e s t r u c t u r e . E n effet, i n d 6 p e n d a m m e n t de l ' ex i s t ence d e f o n c t i o n s o - d i p h 6 n o l su r le cyc le B, les f l a v o n o l s p r 6 s e n t e n t u n caract/~re r 6 d u c t e u r pa r t i cu l i e r dfi il la s t r u c t u r e c a r a c t 6 r i s t i q u e d e l e u r h6 t6 rocyc le .

L ' u t i l i s a t i o n d e ces p rop r i6 t6 s p e r m e t d e d o s e r v o l u m 6 t r i q u e m e n t un f l a v o n o l d 6 t e r m i n 6 , p a r u n e s o l u t i o n t i t r6e d e c u i v r e ( I I ) d a n s l ' ac ide p r o p a n o i q u e . I1 suffit, p o u r cela, de d 6 t e r m i n e r a u p r6a l ab l e la s t o e c h i o m 6 t r i e de la r6ac t ion , s t o e c h i o m d t r i e qu i v a r i e a v e c l '6tat d ' h y d r o x y l a t i o n des c y c l e s A et B d u f l avono l cons id6r6 . La n o n r6vers i - bi l i t6 d e la r 6 a c t i o n d ' o x y d a t i o n d e la p l u p a r t des f l avono ls , p e u t 6 t re utilis6e, si c e s

Anal. Chim. Acta. 59 (1972)

284 N. DELAPORTE, J . - J . MACHEIX

compos6s sont en pr6sence d 'autres polyph6nols, don t les produits d 'oxydat ion sont r6ductibles par l 'acide ascorbique. L 'appl icat ion de ces principes aux extraits v6g6taux, nous a permis de doser s61ectivement certains polyph6nols, en exploi tant les modifi- cations spectrales r6sultant de roxyda t ion de ces compos6s par le cuivre(ll) .

RI~'SUMI~

Dans un milieu anhydre , i lest possible de doser vo lum6t r iquement les f lavonols en les oxydant par les ions cuivriques. Dans ces condi t ions , les funct ions o-diph6iaol 6ventuel lement pr6sentes sur le cycle B ne m o n t r e n t plus de caract6re r~ducteur sp6cifique. L 'hydroxyla t ion des cycles A e t B en posi t ions 5 et 4 ' augmente , par activation de I'h6t6rocycle, le caract~re r6ducteur de la moi6cule. Ces ph6nom6nes n 'on t plus lieu lorsque l 'hydroxyle, en posi t ion 3 sur I'h6t6rocycle, est 1i6 "hun glucide ou Iorsque cet h6t6rocycle est hydrog6n6 en posit ions 2 et 3. Par contre, dans ces con- ditions, si le cycle Best por teur d ' u n e funct ion o-diph6nol, on peut ob ten i r i ' o -quinone cor respondante , quant i t a t ivement r6ductible par l 'acide ascorbique.

SUMMARY

Flavonols can be t i trated in non-aqueous med ium by oxidat ion with copper( l l ) ions. Under these condit ions, possible o-diphenol ic functions present on ring B no longer show specific reducing character . Hydroxyla t ion of rings A and B, in the 5 and 4' positions, increases the reducing character of the molecule by act ivat ion of the heterocycle. These p h e n o m e n a do not occur when the hydroxyl g roup in posi t ion 3 on the heterocycle is glucosided, or when the heterocycle is hydrogena ted in posit ions 2 and 3. However , under these condi t ions, if ring B bears an o-phenol ic function, one can obtain the cor responding o-quinone , which is quant i ta t ively reducible by ascorbic acid.

ZUSAMMENFASSUNG

Flavonole k/bnnen in wasserfreiem Med ium mit Kupfe r ( I I ) - Ionen oxydime- trisch titriert werden. U n t e r diesen Bedingungen zeigen die am Ring B m/bglicherweise vorhandenen o-diphenol ischen F u n k t i o n e n keinen spezifischen Reduk t ionscha rak te r mehr. Die Hydroxyl ie rung der Ringe A und B in Stelle 5 und 4" steigert durch Akti - vierung des Heteror inges die reduz ie renden Eigenschaften des Molekii is . Dies trifft nicht m e h r zu, wenn die Hydroxy lg ruppe in Stelle 3 am Heteror ing glukosidier t wird oder wenn dieser He te ro r ing in Stelle 2 und 3 hydrier t wird. Jedoch kann man unter diesen Bedingungen, wenn der Ring B eine o-diphenol ische F u n k t i o n aufweist, das en tsprechende o-Chinon erhal ten, alas durch Ascorbinsi iure quant i ta t iv reduzier- bar ist.

B I B L I O G R A P H I E

! L. JURD ET T. A. GEISMAN, J. Org. Chem., 21 (1956) 1395. 2 B. MON'rlws ~rr R. DOUILLARD, Ann. Physiol. Veg., 11 (1969) 187. 3 N. DELAi'ORTE ET J.-J. MACHEIX, Anal. Chim. Acta, 59 (1972) 273. 4 T. A. GEISSr~IAN, in K. PAECH AND M. V. TRACEY, Modern Methods o f PItmt Analysis. Vol. 3, Spr inger-

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Ana~-,Chim. Acta, 59 (1972)