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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE L’ENSEGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA
RECHERCHE SCIENTIFIQUE
Université Larbi Ben M’Hidi Oum El Bouaghi
Faculté des Sciences Exactes et des Sciences de la Nature et de la Vie
Département des Sciences de la Nature et de la vie
N ° de série….. N °d’ordre……
Mémoire
Présenté pour l’obtention du diplôme de
MASTER
Filière : BIOLOGIE
OPTION : MICROBIOLOGIE APPLIQUEE
Thème :
.
Présenté par
LAMRAOUI Imane KADDOUR Ilham
Devant le jury
Président : ZOUAINIA Sabrina M.C.B. Univ. Oum EL Bouaghi.
Rapporteurs : ARHAB Rabah Pr. Univ. Oum EL Bouaghi.
Examinateur : MEDJOUDJ Hacene M.C.B. Univ. Oum EL Bouaghi.
Année universitaire: 2017-2018.
Caractérisation microbiologique et biochimique
d’une eau de végétation (margine).
مثم نىره كمشكاج فها مصثاح انمصثاح ف زجاجح انسجاجح كأنها كىكة الأرضالله نىر انسماواخ و »
ىقد من شجرج مثاركح زتىنح لا شرقح ولا غرتح كاد زتها ضئ و نى نم تمسسو نار نىر عهى دري
24.35 سىره اننىر. عهم نهناش و الله تكم شءنىر هدي الله ننىره من شاء وضرب الله الأمثال »
« Dieu est la lumière des Cieux et de la Terre, et le symbole de sa lumière serait un foyer
où se trouverait une lampe qui elle-même serait nichée dans un récipient de cristal ayant
l'éclat d'un astre brillant qui tirerait sa luminosité d'un arbre béni, un olivier qui n'est
ni de l'Orient ni de l'Occident et dont l'huile jetterait sa clarté presque d'elle-même, sans
avoir été touchée par aucune étincelle, donnant ainsi lumière sur lumière. Dieu guide
vers sa lumière qui il veut et propose des paraboles aux hommes, car sa science n'a point
de limite. »
انعظم الله صدق
Dédicaces
Dédicaces
Avec l’aide de Dieu, j’ai pu réaliser ce modeste travail dédié aux :
Chers Parents ;
Mes sœurs ;
Mes nièces et neveux ;
Toute la famille lamraoui ;
Tous les amis ;
Pour leur présence dans tous les instants,
Pour le soutien qu’ils m’ont apporté.
Avec toute mon affection et ma reconnaissance
Imane
J’ai l’honneur de dédier ce modeste travail
A ALLAH : Le tout puissant, le miséricordieux créateur des terres et des
Cieux, merci de m’avoir accordé la santé et la force pour réaliser ce travail.
Au prophète Mohamed : paix et salut sur lui.
A ceux qui m’ont toujours encouragé et soutenu durant toutes mes années d’étude.
Merci pour votre amour et votre confiance totale
A vous très chère Mama et Papa.
A mes frères Mohammed, Youcef et ainsi
Mes sœurs Fatima, Khadija, Rahma
A tous mes proches et toute la famille Kaddour
A ma binôme Iman et sa famille.
A tous ce qui m’ont aidée de prés ou de loin dans la réalisation de ce travail
A tout mes amis (es) sans exception.
A la promotion de microbiologie appliquée 2017/2018
Remerciements
Remerciements
Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Microbiologie et Applications, faculté des
sciences exacte et sciences de la nature et de la vie, département des sciences de la nature et
de la vie. Université Larbi ben M’hidi oum el bouaghi. Nombreux sont qui ont contribués
d’une façon ou d’une autre à l’aboutissement de ce travail. C’est là un geste tout naturel
que de remercier ces personnes :
Je tiens tout d’abord à exprimer ma profonde gratitude, et ma vive reconnaissance à Mr.
ARHAB RABAH. Professeur à l’université Larbi ben M’hidi oum el bouaghi, pour avoir
accepté d’être notre directeur de mémoire, pour ses conseils avisés, sa rigueur scientifique
et sa grande disponibilité.
Je remercie chaleureusement Mme. ZOUAINIA SABRINA. Maitre de conférence à
l’université Larbi ben M’hidi oum el bouaghi, pour avoir accepté de présider le jury.
Un grand merci à Mr. MEDJOUDJ HACENE. Maître de conférences à l’université Larbi
ben M’hidi oum el bouaghi, pour l’honneur qu’il nous fait en participant au jury de ce
mémoire.
A tous ceux qui, à un moment ou un autre, nous ont prodiguées des conseils scientifiques,
fourni une aide matérielle et technique, ou tout simplement humaine. MERCI
Dédicace Remerciements
Liste des tableaux Liste des figures
Liste des abréviations
Introduction…………………………………………....................................................1
I. La production oléicole………………………………………………………………3
II. Les systèmes d’extraction de l’huile d’olive…………………………………….....5
III.Les sous-produits de l’oléiculture…………………………………………..….… 6
III.1 les grignons……………………………………………………………...…..… ..7
III.2.Les margine…………………………………………………………………...….7
III.2.2.Définition……………………………..…………………………..………..….7
III.2.3.L’origine des margines………………………....………………….…….….....8
III.2.4. Les caractéristiques des margines………………………………………..……8
III.2.4.1. Caractéristiques physico-chimique …………………….……………….… 8
III.2.4.2.Les caractéristiques microbiologique de les margines……………….……..12
III.2.5. L’effet environnementaux des margines………………………………..……13
III.2.6. Valorisation des margines………………………………………………...…..14
Chapitre II: Matériel et méthodes
I. Caractérisation physicochimique des margines…………………………..………..15
I.1. Echantillonnage………………………………………………..…………............15
I.2. paramètres physico-chimique des margines………….…………………………15
I.3. Paramètres biochimiques…………………………….……………...…………...16
TABLE DES MATIERES
Introduction
Chapitre I : Synthèse bibliographique
I.4.Extraction des polyphénols totaux……………..……………………………..…..17
I.5.1.Dosage des composés phénoliques des margines……………...……….……….18
I.5.1. Dosage des polyphénols totaux………………………………………………...18
II Analyses microbiologiques des margines………………...………………………..18
II.1.Traitement préalable de la margines………………….……….………………...18
II.2. Dénombrement de la FTAM………………………..………………………......19
II.2.1. Préparation des dilutions…………...………………………………………….19
II.2.2. Ensemencement par étalement sur gélose nutritive………………..….….…...19
II.2.3. les souches purifiées à partir de la GN………………………………...….…...20
II.2.3.1. Bacillus…………………………………………………………...………..…20
II.2.3. Recherche et dénombrement coliformes totaux et fécaux ………………...…...23
II.2.4.Recherche et Dénombrement des streptocoques fécaux………………….…….23
II.2.5.Recherche des staphylocoque …………………………………………….……24
II.3. Recherche des levures …………………………………………………...………25
II.4. Recherche des moisissures ……………………………………….……………. .27
III. évaluation de l’activité antibactérienne des margines ………………...………….28
1. Caractérisation physico-chimique et biochimique des margines …………………30
2. Caractérisation microbiologique……………………………………………………32
2.1. Dénombrement des micro-organismes……………………………..……….……32
2.2. Identification des microorganismes ………………………….………..…….…..33
2.2.1 Les bactéries…………………………….…………….………………………..33
a-Bacillus………………………………………………………………….…….……33
b- Staphylococcus.........................................................................................................36
Chapitre III : Résultats et discussion
2.2.2. La levure………………………………………...………………………..…… 37
2.2.3. Les moisissures…………………………………………….…...…………..…..40
2.3. Evaluation de l’activités antimicrobiennes …………………………......….……43
Conclusion et perspectives…………………………………………………….………46
Références bibliographiques…………………………………………………………..47-59
annexe
Résume
Liste des tableaux
Liste des tableaux page
Tableau 1 : Caractéristiques physico-chimiques des margine
(Amirantes., 1996)
9
Tableau 2 : Caractéristiques biologique des margines (Amirantes.,
1999).
9
Tableau 3 : Composition des margines : Sonsoucy R, 1984, FAO 9
Tableau 4 : Phénols totaux, ortho-diphénol et monomères aromatiques
contenus dans les margines (Casa et al., 2003).
11
Le tableau 5 : les Caractéristiques physico-chimiques et biochimiques
des margines prélevées du système traditionnelle à 03 phase.
30
Tableau 6: Caractérisation microbiologique des margines étudiées 32
Tableau 7: identification morphologique de Bacillus 33
Tableau 8: Identification biochimique de Bacillus galerie classique. 34
Tableau 9: Résultats de la mise en évidence de quelques activités
enzymatiques de Bacillus
35
Tableau 10: les Tests d’identification des staphylocoques 36
Tableau 11: représente l’examen macroscopique et microscopique de la
levure.
38
Tableau 12: représente les résultats des caractéristiques physiologiques
étudie chez la levure.
39
Tableau 13 : Diamètre des zones d’inhibition en (mm) montrant
l’activité antibactérienne des composés phénolique vis-à-vis les souches
à isolement clinique.
43
Listes des figures
Listes des figures page
Figure 1. les principaux pays producteurs d’huile d’olive en 2001 [Source
http://www.internationaloliveoil.org/downloads/production1.PDF].
3
Figure 2. répartition des superficies d’oliviers par wilaya. (Statistiques agricoles.
superficies et production série A 2002. Edité en janvier 2003).
5
Figure 3. les processus d’extraction de l’huile d’olive. 6
Figure 4. situation géographique du lieu d’échantillonnage. 15
Figure 5. DBO mètre. 16
Figure 6. Réacteur-DCO. 16
Figure 7. Courbe étalon correspondant aux dosages des phénols totaux. 18
Figure 8. Aspergillus ochraceus (IM1), A) observation macroscopique ;B)
Observation microscopique.
40
Figure 9. Aspergillus fumigatus (IM2),A) observation microscopique ;B)
observation macroscopique.
41
Figure 10. Aspergillus niger (IM3), A) observation macroscopique ;B)
observation microscopique.
41
Figure 11. (l’isolat IM4) Penicillium sp, A) observation macroscopique ;B)
observation microscopique.
41
Figure 12. (IM5) Penicillium chrysogenum , A) observation macroscopique ;B)
observation microscopique.
43
Figure 13. L’activité antibactérienne des polyphénols sur la levure et les bactéries
isolées.
44
Figure 14. L’activité antibactérienne des polyphénols sur les bactéries tests 45
Liste des abréviations
CE : Conductivité électrique
COI : Conseil Oléicole International
DBO5 : Demande Biologique en Oxygène pendant 5 jours
DCO : Demande Chimique en Oxygène.
DO : Densité Optique
FTAM : Flore Totale Aérobie Mésophile.
GN :Gélose Nutritive
h : heure.
OGA : Oxytétracycline Glucose Agar
NTU : Unité de Turbidité Néphélométrique
RM : Rouge de Méthyle
TSI : Triple Sugar iron Agar .
UFC: Unité Formant une Colonie.
VP: Vogue-Proskauer
Introduction
1
L'origine de l'olivier se perd dans la nuit des temps; son histoire se confond avec
celle des civilisations qui ont vu le jour autour du bassin Méditerranéen (Rayan et
Robards, 1998).il est considéré parmi les plus vieux arbres cultivés dans le monde
(Liphschitz et al., 1991).
L’industrie oléicole est une activité économique importante, concentrée principalement
dans les pays méditerranéens qui tiennent environ 95% de la production mondiale, dont
1% pour l’Algérie en 2001.
L’industrie oléicole, en plus de sa production principale qui est l’huile (l’huile d’olive
vierge et l’huile de grignon), engendre la production de deux résidus : un liquide
(margine) et l’autre solide (grignon) (Nefzaoui A. 1991).les margines sont considérées
comme l’un des effluents les plus nocifs produits par les industries agro-alimentaires
(Cardinali et al., 2010) en raison de leur charge polluante et de leur toxicité pour
l'ensemble de l'écosystème (plantes, microorganismes et organismes aquatiques et
aériens) due à leur pH acide, et leur richesse en matière organique, en particulier en
polyphénols (El-Abbassi et al., 2012b ; Dermeche et al., 2013).de ce fait, le rejet de ces
effluents dans les rivières et les égouts sans aucun traitement préalable pose de sérieux
problèmes pour le système aquatique (Levis-Menzi et al., 1992 ; Francesco, 1993 ;
Bouranis et al., 1995 ; Cabrera et al., 1996 ; Sayadi et al., 2000).Ces considérations ont
conduit plusieurs chercheurs à l’échelle nationale et internationale à choisir la voie du
traitement et de la valorisation des margines pour limiter leur pollution (Gharsallah et al.,
1999 ; Garcia Garcia et al., 2000 ; Leger et al., 2000 ; Kissi et al., 2001 ; Garrido Hoyos
et al., 2002 ; Pozo et al., 2002 ; Fenice et al., 2003). Cependant, les procédés développés
jusqu’à présent restent très limités et leur coût très élevé (Hamdi, 1993a ; Hamdi, 1993c).
Toutefois, plusieurs microorganismes se développent sur les margines et les utilisent
comme source de carbone (Vasquez et al. 1970).Des analyses microbiologiques ont
montré que les levures et les champignons sont capables de s’y développer mieux que les
bactéries (Aissam et al., 2002). Les travaux effectués sur cet axe sont rares.
Afin d’exploiter cette voie de recherche, cette étude s’intéresse à plusieurs
objectifs et pour atteindre ces derniers, nous avons suivi la démarche suivante :
1. Nous avons effectué une caractérisation physico-chimique et microbiologique c'est-à-
dire l’isolement et la purification de la microflore des margines d’olive prélevés à partir
Introduction
2
de la région du Sahara plus exactement Ghardaïa
2. Identification morphologique et biochimique des souches isolées.
3. La mise en évidence de l’impact (activité antibactérienne) d’extrait des margines que
manifestent leur composés phénoliques sur les bactéries identifiées.
Enfin, dans la conclusion générale, nous tentons de mettre en avant les points importants
apportés par notre travail, ainsi que nos perspectives
Chapitre I Synthèse bibliographique
3
I. La production oléicole
I.1.La production oléicole dans le monde :
Le patrimoine oléicole mondial compte actuellement environ 750 millions d’oliviers
cultivés sur une superficie de 9,23 millions d’hectares. Les pays méditerranéens comptent
715 millions d’oliviers sur une superficie d’environ 8.16 millions d’hectares, soit 95 % du
patrimoine oléicole mondial. (El hajjouji, 2007 ; Fiorentino et al. 2003 ; Tsagariki et al
2007). La grande majorité des olives est donc destinée à la fabrication de l’huile d’olive,
dont la production et la consommation mondiale ont triplé a atteint un record passant de 3,1
millions de tonnes pour la campagne 2011-2012, selon les estimations du Conseil Oléicole
International (COI, 2012).
La production de l’huile d’olive se concentre principalement dans les pays du pourtour
méditerranéen : Espagne, Grèce, Italie, Turquie, Syrie, Tunisie et Maroc avec 94 % de la
production mondiale (Benyahia et zien, 2003).
Figure 1 : les principaux pays producteurs d’huile d’olive en
2001. [Source :
http://www.internationaloliveoil.org/downloads/production1.PDF]
L’Europe est un acteur important de ce marché avec l’Espagne, premier producteur
mondial, et la Grèce, premier pays consommateur. Face à la baisse de la production
européenne, due aux mauvaises conditions climatiques (sécheresse de l’été et douceur de
l’hiver), la Tunisie est devenue le premier exportateur mondial en
Chapitre I Synthèse bibliographique
4
2015(COI, 2016). Paradoxalement à la production d’huile d’olive, ces pays rejettent des
eaux usées appelées margines qui posent actuellement un vrai problème environnemental
pour toute la région méditerranéenne (Zimbalatti, 1995 ; Levis-Menzi et al. 1995). En effet,
plus de 30 106 m3 de margines sont produits annuellement dans le bassin méditerranéen par
rapport au volume mondial inférieur à 40 millions de m3/an (Fiestas Ros de Ursinos, 1981 ;
Sayadi et Ellouz, 1995 ; Borja et al. 1995a).
On estime que 10 à 30 millions de m3 de margines sont générés chaque année à partir de la
production d’huile d’olive (Niaounakis, 2006). Sachant qu’en moyenne 100 kg d’olives
traitées engendrent 100 litres de margines, la production mondiale de margine serait de 8,4
millions de mètres cubes (Boucherba, 2014).
I.2.La production oléicole dans l’Algérie
L’oliveraie occupe 45% du verger arboricole total et compte 32 millions d’arbres
dont 80% sont destinés à la production d’huile d’olive (Mendil, 2009), estimée à 55.000-
70.000 tonnes/an (Vossen, 2013).L’Algérie fait partie des principaux pays méditerranéens
dont le climat est des plus propices à la culture de l’olivier. Elle se positionne après
l’Espagne, l’Italie, la Grèce et la Tunisie qui sont par ordre d’importance, les plus gros
producteurs d’huile d’olive (Tsagariki E., Harris N., Lazarides., Konstantinos B. P. 2007).
Le patrimoine oléicole algérien est estimé à 32 millions d’oliviers, ce qui représente 4,26%
du patrimoine mondial. La production annuelle en huile a atteint 35.000 tonnes et celle de
l’olive de table 80.000 tonnes (Bensemmane A. 2009).
Selon les statistiques de l'Institut Technique des Arbres Fruitiers et de la Vigne
Algérien (ITAFV, non daté), l'oléiculture Algérienne a enregistré, entre 1999 et 2014, une
croissance de 130% en termes de superficie passant de 165.000 hectares à 380.000 ha, tandis
que la production d'huile d’olive est passée de 19.000 tonnes à 45.000 tonnes, avec des pics
atteignant 74.000 tonnes. L'entrée en production des nouvelles plantations (215.000 ha)
devrait hisser la production à 120.000 tonnes d'huile à l'horizon 2020.
La production d'huile d’olives est une activité traditionnelle en Algérie. L'activité
compte près de 1650 huileries, dont seulement 165 huileries modernes (Vossen, 2013).
L’Algérie vise à moderniser le secteur de l’huile d’olive afin d’améliorer la qualité et la
quantité du produit.Actuellement cette filière se concentre dans certaines willayas comme
Bejaia, Tizi –Ouzou et Bouira qui ont produit, à elle seules en 2008, 179180 hectolitres sur
une superficie de 102893 ha soit 51% de la production nationale et environ 44% de verger
national oléicole.ces trois willayas sont spécialiser beaucoup plus dans la production de
Chapitre I Synthèse bibliographique
5
l’huile.Durant la campagne 2009/2010, la production oléicole algérienne était de 50000
tonne d’huile soit 1,7% de la production mondiale. (Conseil oléicole international. 2009a).
Figure 2 : Répartition des superficies d’oliviers par wilaya (Statistiques agricoles, 2003).
II. Les systèmes d’extraction de l’huile d’olive
Trois systèmes d’extraction sont à présent utilisés (fig. 3) : procédés discontinus ou
systèmes à presses et procédés continus ou systèmes à centrifugation. Ce dernier se déroule
soit selon un procédé continu à trois phases ou en un procédé continu à deux phases (procédé
écologique). (Morillo et al., 2009).
II.1. Système d’extraction par centrifugation à trois phases
Il s'agit d'un système de type mouture/centrifugation à trois phases. Le broyage est
réalisé par des broyeurs mécaniques à marteaux, couteaux ou disques. Ces broyeurs, placés
sur un axe entraîné par un moteur électrique à une vitesse de 1000 à 3000 tours par minute,
fonctionnent en continu et la pâte est alors obtenue instantanément. Les broyeurs métalliques
ont tendance à augmenter l’émulsion entre l’huile et l’eau, par conséquent le temps de
malaxage et/ou le nombre de bacs de malaxage sont plus importants que pour les systèmes à
meule de granit. Le malaxage se fait par rotation lente d’une vis sans fin qui va retourner
continuellement la pâte. Le temps de malaxage varie en général entre 15 et 30 minutes. Les
systèmes métalliques sont particulièrement adaptés pour des systèmes de production en
continu. Dans ce cas, le moulinier n’a jamais à manipuler directement la pâte d’olive car
celle-ci est convoyée automatiquement d’un appareil à un autre. Une fois la pâte d’olive est
homogénéisée et la coalescence est effectuée, l’étape suivante consiste en la séparation de la
phase solide et de la phase liquide. La pâte est donc injectée par une pompe dans une
centrifugeuse dont l'axe est horizontal appelée décanteur. Il permet la séparation de la pâte en
trois phases : les grignons, l’huile avec un peu d’eau et les margines avec un peu d’huile.
Les deux phases liquides n’étant pas bien séparées, elles sont regroupées et envoyées dans une
Chapitre I Synthèse bibliographique
6
centrifugeuse verticale. A la sortie de la centrifugeuse, on retrouve d’un côté des grignons très
humides et de l’autre une émulsion huile/eau et le principal inconvénient de ce type de
système est qu’il requiert un grand ajout d’eau pour fonctionner. L’eau ajoutée va se mélanger
aux margines et donc grandement augmenter le volume de coproduits à éliminer. Le volume
d'eaux résiduaires est 2 à 3 fois supérieur à celui produit par le système en discontinu, les
margines sont, par conséquent moins concentrées (Aggoun, 2016). Dans ce système la
quantité d’eau ajoutée est supérieure à celle du système traditionnel, par conséquence La
production des margines est très importante (une tonne d’olives génère de 600 à 1200 litres de
margines) (CAR/PP, 2000 ; Martinez-Garcia et al., 2006 ; Ben Rouina, 2014)
Figure 3 : les processus d’extraction de l’huile d’olive. ( Morillo et al., 2009)
III. Les sous-produits de l’oléiculture
Ces dernières années, le développement de l’activité agro-industrielle a engendré une large
production de déchets qui sont notamment issus de la transformation des matières première de
Chapitre I Synthèse bibliographique
7
l’agriculture. Comme toutes les industries agro-alimentaire, l’opération d’extraction nécessite
des grandes quantités d’eau, par conséquent elle engendre des quantités importantes de
déchets solides (grignons d’olive) et liquide (des margines) estimes a environ 3 millions de
m3 /an (zenjari et al., 2006).
III.1. Les grignons
C’est un sous-produit du processus d’extraction de l’huile d’olive, issus de la première
pression ou centrifugation (Nefzaoui, 1987). C’est un résidu solide composé des peaux, des
résidus de la pulpe et des fragments des noyaux. Il est composé par une fraction riche en
lignine provenant des fragments de noyaux, et l’autre renfermant principalement des glucides,
comme la cellulose et l’hémicellulose et, dans une moindre mesure, des protéines et de l’huile
résiduelle qui dépend de la technique d’extraction (Nefzaoui, 1984). Selon Sansoucy (1984),
les grignons se divisent en trois types, selon le procède d’extraction subit :
III.1.1. Le grignon brut
C’est le résidu de l’extraction de l’huile d’olive entière. Ses teneurs relativement élèves en eau
et en l’huile favorisent son altération rapides lorsqu’il est laissé à l’air libre (Nefzaoui, 1987).
III.1.2. Le grignon épuisé
C’est le résidu obtenus après déshuilage du grignon brut par solvant, l’hexane généralement
(Nefzaoui, 1987).
III.1.3. Le grignon partiellement dénoyauté
Il résulte de la séparation partielle des débris de noyau de la pulpe par tamisage ou
ventilation. Il dit "gras" si son l’huile n’est pas extraite par solvant et "dégraisses" ou
"épuises" si son l’huile est extraite par solvant.
III.2. Les margines
III.2.1. Définition
Les déchets liquides dénommés "margines" (aqua reflue en Italie, alpechin en Espagne,
katsigaros en Grèce, zebar dans les pays arabe) (Kapellakis et al., 2008) obtenus lors de
l’extraction de l’huile d’olive, constituent un important facteur de pollution du fait qu’ils
renferment une fraction organique
importante (des protéines, lipides, glucides et polyphénols) et aussi par leur acidité
moyennement élevée et leur concentration élevée de matière solide totale (Camurati et al.,
1984). Elles se présentent comme un liquide résiduel aqueux, de couleur brune rougeâtre à
Chapitre I Synthèse bibliographique
8
noir due de la présence de polyphénols (Aissam, 2003) et est fonction de l’état de dégradation
des composés phénoliques et des olives dont ils dérivent (Hamdi et Ellouz, 1993 ; Zahari et al,
2014), nauséabond, d’aspect trouble et une odeur spécifique d’huile d’olive (Ranalli et al.,
1991). Son goût est amer.
La qualité et la quantité des margines dépendent de l’opération d’extraction d’huile d’olive,
elles sont aussi influencées par la variété d’olive, la saison de cueillette, le taux de maturation
des fruits et les conditions climatiques (Fiorentino et al., 2003).
III.2.3. L’origine des margines
Les olives contiennent environ 20% d’huile, 30% de grignons et 50% d’eau de
végétation (Di-Giovacchino et al., 1988 ; Hamdi et al., 1992). Les margines sont obtenues lors
de l’extraction de l’huile d’olive à partir de l’eau contenue dans le fruit et de l’eau ajoutée au
cours du broyage et des étapes de trituration (Galanakis et al., 2010). Les différentes
techniques d’extraction d’huile d’olive aboutissent à la formation des margines en quantités
variables, allant de 400 à 500 L/tonne d’olives pour les unités traditionnelles et une tonne de
margines /tonne d’olives pour les unités modernes (Achak et al., 2009).
III.2.4. Caractéristiques des margines
III.2.4.1. Caractéristiques physico-chimique
Les margines présentent une composition chimique très complexe et hétérogène. Elles
contiennent une variété de composés organiques et minéraux, de nature et de concentration
très différentes. Cette variation est due essentiellement aux procédés d’extraction d’huile
d’olive qui représente l’élément le plus important, au stade de la maturité des olives, à la
variété de l’olivier, aux conditions climatiques, à la durée de stockage des olives avant la
trituration, au système de culture, à la situation géographique, au temps de stockage des olives
avant la trituration, à la nature de conservation des olives et aux techniques et lieu de stockage
(Karapinar et Worgan, 1983 ; Bambalov et al., 1989 ; Annaki et al.1996b).
Les margines sont caractérisées par un pH compris entre 4,2 et 5,9 (Eroglu et al., 2008) et une
salinité élevée exprimée en conductivité électrique (18 à 50 mS/cm) (Levi-Minzi et al., 1992)
due surtout aux ions potassium, chlorure, calcium et magnésium.
Chapitre I Synthèse bibliographique
9
Tableau 1 : Caractéristiques physico-chimiques des margine (Amirantes., 1996)
Caractéristiques biologiques
Il existe plusieurs paramètres biologique intervenir dans la caractérisation des
margines tel que la demande chimique en oxygène et la demande biologique en oxygène.
Tableau 2 : Caractéristiques biologique des margines (Amirantes., 1999).
Composition des margines
Les analyses menées sur les margines peuvent nous renseigner sur les intervalles de variation
de leurs différents composants chimiques (Fiestas Ros de Ursinos et Borja, 1992 ; Lutwin et
al., 1996).
Tableau 3 : Composition des margines : Sonsoucy R, 1984, FAO.
Les glucides sont essentiellement représentés par les composants pariétaux, en particulier la
cellulose et les pectines, ces dernières jouent un rôle important dans la texture des olives où ils
Paramètres Valeurs
pH 4,2 à 5,9
Turbidité (NTU) 140
Couleur coloration brun-rougeâtre
Conductivité 18 et 50 ms.cm-1
Température ambiante
Paramètres Valeurs
DCO
100 à 220 kg/m
DBO5
100 kg/m
Polyphénols 1,2 g/l
Composant Teneur en %
Eau 83-88%
Matières organiques 10-15 %
Matières minérales 1.5-2%
Matières azotées totales 1,25-2,4%
Matières grasses 0,08-1%
poly phénols 1-1,5%
Chapitre I Synthèse bibliographique
10
représentent environ 0,6 % du poids de la pulpe fraîche (Obied. H et al. ,2005). Les sucres
représentent entre 4,1 et 4,8 % du poids total des margines pouvant se répartir comme suit :
arabinose (62-71%), galactose (17-25%), rhamnose (2-3%), xylose (12%), glucose (1%)
(Dermeche et al. 2013)
Les composés azotés
La fraction azotée est représentée principalement par les protéines avec une
concentration variant entre 1,2 et 2,4% (p/v). Tous les acides aminés contenus dans les
margines ont été identifiés. Les plus abondants sont l’acide aspartique, l’acide glutamique, la
proline et la glycine (Salvemini, 1985 ; Ranalli, 1991 ; Capasso et al, 2002 ; Jail et al, 2010).
Les vitamines
Plusieurs vitamines ont été identifiées .Les plus fréquentes sont les vitamines du groupe
et la vitamine PP avec une concentration de124 mg.kg-1 de teneur qui peut être exploitée a
l’échelle industrielle (Salvemini, 1985).
Les acides organiques
La proportion des acides organiques présente dans les margines varie entre 0,5 et 1,5%
(p/v). Les principaux acides organiques rencontrés sont les acides fumarique, glycérique,
lactique, malique et malonique (Fiestas Ros De Ursinos, 1981 ; Salvemini, 1985 ; Tsioulpas et
al, 2002).
L’huile
La concentration d’huile résiduelle contenue dans les margines est très variable selon le
procédé d’extraction utilisé. Elle varie entre 0,02 et 1% (v/v) (Fiestas Ros De Ursinos et
Borja, 1992). L’acide oléique est l’acide gras le plus abondant avec un pourcentage de 65%
par rapport à la totalité d’huile (Ranalli, 1991a).
Les composés phénoliques
Les composés phénoliques des margines sont très divers et leur structure est très
variable. Plus de 50 différents composés phénoliques ont été identifiés dans les margines
(Obied et al., 2005 ; Dermeche et al., 2013). Ils proviennent de l’hydrolyse enzymatique des
glucides et des esters de la pulpe d’olive au cours du processus d’extraction. Leur
solubilisation dans l’huile est cependant bien inférieure à celle dans les eaux de végétation, ce
Chapitre I Synthèse bibliographique
11
qui explique leur concentration élevée détectée dans les margines. Les caractéristiques
organoleptiques de l’huile d’olive vierge dépendent de la présence des composés phénoliques
et des substances volatiles (Vazequez, 1978).
La teneur en composés phénoliques dans les margines varie entre 3 et 5 g.l-1
(Balice et al.,
1997 ; Al-Malah et al., 2000 ; Oukili et al., 2001 ; Garrido Hoyos et al., 2002 ; Tsioulpaet al.,
2002 ; Casa et al., 2003 ; Fenice et al., 2003) et elle peut même dépasser les 9 g.l-1
(Klibanov
et al., 1983 ; Borja et al., 1992 ; Sayadi et Ellouz, 1993 ; Kissi et al., 2001 ; Aissam et al.,
2002).
Les monomères phénoliques
Les acides phénoliques sont les monomères les plus abondants dans les margines, ce
qui explique leur acidité. Plusieurs acides phénoliques ont été identifiés dans différents types
de margines. BORJA et al. (1995) ont identifiés par (HPLC ou CPG). Ils sont représentés
essentiellement par des alcools et des acides phénoliques. Ils sont représentés essentiellement
par des alcools et des acides phénoliques.
Tableau 4 : Phénols totaux, ortho-diphénol et monomères aromatiques contenus dans les
margines (Casa et al., 2003).
Composés phénoliques Teneur
Phénols totaux (g.l-1) 3,7 0± 0,1
Ortho-diphénol (g.l-1) 1,20 ± 0,02
Acide 3 ,4-dihydroxybenzoique (mM) 0,35 ± 0,01
Catéchol (mM) 2,28 ± 0,1
Acide 4-hydroxybenzoique (mM) 0,12 ± 0,004
Tyrosol (mM) 2,47 ± 0,07
Acide syringique (mM) 0,196 ± 0,04
Acide caféique (mM) 1,53 ± 0,1
4-Methylcatechol (mM) 4,12 ± 0,3
Acide 3-hydroxyphénylpropionique (mM) 0,06
Acide para-coumarique (mM) 0,19
Acide vératrique (mM) 0,227 ± 0,21
Acide 3,4,5-trimethoxybenzoique (mM) 0,03
Acide trans-cinnamique (mM) 0,33 ± 0,08
Chapitre I Synthèse bibliographique
12
Les polymères phénoliques
Les polyphénols identifiés dans les margines sont essentiellement :
Les anthocyanes (Tanchev et al., 1980).
Les tannins : leur structure est très complexe, leur concentration peut atteindre 12 g.l-1
(Balice et al., 1982) . Ils sont classés conventionnellement en tanins hydrolysables et
tanins Condensés (Monties, 1980).
Les tannins hydrolysables renferment trois groupes :
Esters d’acides phénoliques,
Esters d’acides phénoliques et sucres,
Glucosides
Les tanins condensés, appelés aussi flavotanins.
Autres composés phénoliques
D’autres composes phénoliques monomères ont été identifiés Capasso R. (1997) :
l’oleuropéine, L-caféyl-glucose, l’apégine et la lutéoline
III.2.4.2. Caractéristiques microbiologique des margines
Les études microbiologiques effectuées sur plusieurs échantillons de margines ont
confirmé l’absence totale de micro-organismes pathogènes. Donc, ces effluents ne posent
aucun problème hygiénico-sanitaire (Ranalli, 1991a). Toutefois plusieurs microorganismes
arrivent à se développer, ce sont essentiellement des levures et des moisissures sur les
margines et les utilisent comme source de carbone (Vazquez et al. 1970). Ces
microorganismes supportent la salinité élevée et le pH acide caractéristiques de ces effluents,
et résistent plus que les bactéries aux substances phénoliques.
Le pouvoir antimicrobien des margines est lié essentiellement à l'action exercée par les
phénols monomériques et les pigments bruns catéchol-mélaninique (Hamdi et Ellouz,
1993). Ces effluents agissent sur les bactéries en dénaturant les protéines cellulaires et en
altérant les membranes (Ranalli, 1991). 130 espèces de microorganismes lipolytiques (56
champignons, 22 levures et 52 bactéries) ont été rapportées dans les margines
les champignons
La flore fongique se compose essentiellement d’Aspergillus flavius, Aspergillus
candidus, Penicillium negricans, et Alternaria sp possèdent la capacité de dégrader les
phénols à faible concentration.
les bactérie
La flore bactérienne regroupe les bactéries qui résistent aux polyphénols particulièrement les
bactéries à Gram-négatif. Le genre Pseudomonas sp. ainsi que Bacillus megaterium ont été
Chapitre I Synthèse bibliographique
13
décrits. Les espèces de ce genre sont dotées d’une grande activité métabolique (protéolyse,
lipolyse et dégradation des substances carbonées) (Thierru, 1997).
les levures
Parmi les levures, on trouve Trichosporium cutaneium, Cryptococcus albidius ainsi
que les genres Rhodotorula sp., Candida sp. et Saccharomyces sp. (Ramos-Cormenzana, 1986
; Gharsallah, 1993 ; Aissam et al., 2002 ; Fadil et al., 2003).
III.2.5. L’effet environnementaux des margines
III.2.5.1. Pollution des sols
L’épandage directe des margines sur le sol est l’origine de nuisances diverses, leur pH
acide, leur salinité élevée ainsi que leur abondance en composés phénoliques provoquent la
destruction de la microflore du sol et induisent des effets toxique aux cultures végétales.
(Fiestas, 1981). Ceci entraine la stérilisation du sol et le déséquilibre de la symbiose entre la
microflore du sol et les plantes (Marisot et Tournier, 1986). Les composés phénoliques
peuvent agir en tant que composants phytotoxiques, inhibant la croissance ainsi que la
germination des plantes et la croissance végétative (Morillo et al., 2009).
III.2.5.2.Pollution d’air et du paysage
La décharge des margines dans les bassins d’évaporation à ciel ouvert, sur les terres ou
dans les eaux naturelles génère des processus de fermentation et l’émission de plusieurs gaz,
notamment le méthane, le dioxyde de carbone et le sulfure d’hydrogène (Niaounakis et
Halvadakis, 2004). Ces derniers conduits aux dégagements d'odeurs désagréables qui
possèdent un effet négatif sur les activités économiques en zones touristiques et
archéologiques.
III.2.5.3.Pollution de l'eau
Les margines sont rejetées le plus souvent dans des récepteurs naturels, des cours d’eau,
sans aucun contrôle préalable et nuisent fortement à la qualité de ces eaux de surfaces; la très
forte charge en matières organiques empêche ces eaux de s'auto-épurer et la pollution peut
s'étendre sur de très longues distances (Mébirouk et al., 2002). Le contenu organique des
margines contribue à la consommation de l’oxygène dissous des fleuves (CAR/PP, 2000) et
empêche l’autoépuration des eaux, et la pollution peut s’étendre sur très longues distances
Chapitre I Synthèse bibliographique
14
(Benyahia & Zein, 2003),
III.2.6.Valorisation des margines
Jusqu’à maintenant, le traitement des margines constitue un problème complexe vue la
qualité et la quantité des substances chimiques qu’elles renferment. Donc, l’application d’un
traitement simple s’avère insuffisant (Ranalli, 1991a ; Hamdi, 1993a). Toutefois, les procédés
de traitement envisageables pour l’élimination de la charge polluante des margines peuvent
être classés selon quatre catégories, et peuvent être utilisés seuls ou combinés : procédés
thermique, procédés physique, procédés chimique et procédés biologiques. Le choix du
système de traitement approprié est lié à plusieurs facteurs locaux, à savoir le système utilise
pour l’extraction d’huile, la possibilité de stockage et le rapport entre la charge produite par
les huileries et la population locale (Francesco, 1993).
Chapitre II Matériels et méthodes
15
I. Caractérisation physicochimique des margines
I.1. Echantillonnage
Les margines utilisées sont de la variété Sigoise proviennent d’une unité industrielle
moderne de trituration d’olives par centrifugation à trois phases, située dans la région de
Ghardaïa au sud de l’Algérie, pendant la compagne oléicole 2017/2018. Les échantillons ont
été prélevés le mois de décembre 2017 à partir du bassin de stockage des margines et
transportés dans des flacons stériles de 2 litres, puis ont été conservés à l’abri de la lumière à
4°C pour une utilisation ultérieure (caractérisation physicochimique et microbiologique).
Fig 4 : situation géographique du lieu d’échantillonnage (www.google.dz).
I.2. paramètres physico-chimique des margines.
I.2.1. Détermination du pH
Le pH est déterminé par un pH-mètre à affichage électronique à partir de 100 ml des
margines.
I.2.2. Determination de la conductivité
La conductivité électrique a été mesurée par un conductimètre Les résultats sont
exprimés en mS/cm à 20°C.
I.2.3. La turbidité
Elle est mesurée à l’aide d’un multi-paramètre de marque HACK-lange modèle
sensionTM+MM150 est exprimée en g/l.
I.2.4. La demande biologique en oxygène (DBO)
Chapitre II Matériels et méthodes
16
La demande biochimique en oxygène (DBO) est mesurée par la consommation
d'oxygène à 20°C à l'obscurité pendant 5 jours d'incubation d'un échantillon
préalablement ensemencé, temps nécessaire à l'oxydation biologique des matières
organiques carbonées (Allouchef et al., 1999 ; Tekfi, 2006 ; BOTTA, 2001).
La mesure de la DBO5 de notre échantillons a été faite par une méthode respirométrique
(Rodier et al., 2009) à l’aide d’un DBO-mètre (DBO Sensor 6,VELP Scientifica). Les
résultats sont exprimés en mg d’O2/l.
I.2.5. Détermination de la demande chimique en oxygène (DCO)
La DCO est la mesure de la quantité d’oxygène nécessaire pour la dégradation
chimique de toute la matière organique biodégradable ou non contenue dans une eau. Elle a
été effectuée par la méthode à petite échelle en tubes fermé (Rodier et al., 2009 ; Metahri,
2012). A 2 ml d'échantillon en tube sont ajouté le réactif DCO chauffé deux heures à 150 °C.
La lecture de la DCO est faite directement avec spectrophotomètre DR 930. Elle est exprimée
en mg d’O2/L.
Fig. 5 DBO-mètre. Fig.6 Réacteur-DCO.
I.3. Paramètres biochimiques
I.3.1. Détermination de taux d’humidité et de la matière sèche
Elle est déterminée en calculant la différence entre le poids de l’échantillon humide et
celui de l’échantillon séché (Tovar et al., 2002). Un échantillon de 1g a été séché à 105
Chapitre II Matériels et méthodes
17
C° pendant 24h, puis refroidi dans un dessiccateur. La teneur en eau est exprimée en
pourcentage de masse
Humidité (%) = (P-Ps)/ (P-Po) MS(%) = 100 - Humidité(%)
P: poids du creuset + échantillon avant séchage.
Ps: poids du creuset + échantillon après séchage.
P: poids du creuset vide.
L’analyse est effectuée en triple.
I.3.2. Matière organique et minérale
Les cendres (matières minérales) sont déterminées par incinération d’1g d’échantillon
sec dans un four à moufle à 550°C pendant 5 heures. La matière organique correspond à la
différence entre la prise d’essai et les cendres qui en résultent.
(%) cendre totale = M cendre × 100/M (prise d’essai)
I.4. Extraction des polyphénols totaux
L’acétate d’éthyle est confirmé être un solvant convenable pour la récupération des
composés phénoliques contenus dans les margines (Visioli et al., 1999; Bcherrawi, 2000).
4 ml d’acétate d’éthyle sont ajoutés à 4 ml de margines (v:v), l’ensemble est homogénéisé à
l’aide d’un vortex durant une minute, puis centrifugé pendant 5 min à 10000 rpm.
Une séparation en deux phases permet d’aspirer le surnageant d’acétate d’éthyle riche en
polyphénols à l’aide d’une micropipette. Le récupérât est ensuite filtré à travers un entonnoir
qui porte un papier de cellulose rempli du sulfate de sodium (≈ 10 g). Ce dernier a pour rôle
l’absorption d’une éventuelle humidité.
L’extraction a été répétée cinq fois, en ajoutant un volume similaire d’acétate d’éthyle
à chaque extraction, afin de récupérer les phénols totaux de notre échantillon de margines. Un
lavage du sulfate de sodium avec 70 ml d’acétate d’éthyle a été effectué à la fin de
l’extraction afin de récupérer les CP qui y restent attachés (Brenes et al., 2000).
L’acétate d’éthyle est évaporé sous vide à l’aide d’un évaporateur rotatif à 45°C jusqu’à
l’obtention d’un dépôt jaune foncé de polyphénols. Enfin, le dépôt jaune est récupéré dans 4
ml de DMSO à l’aide d’une micropipette.
Chapitre II Matériels et méthodes
18
I.5. Dosage des composés phénoliques des margines
I.5.1 Dosage des polyphénols totaux
Le réactif Folin Ciocalteu, consiste en une solution Jaune acide; contenant un
complexe polymérique d’ions formés à partir d’hétéropolyacides phosphomolybdiques
(H3PMO12O40) et phosphotungstiques (H3PW12O40). Il oxyde les phénols en ions
phénolates en milieu alcalin et réduit partiellement ces hétéropolyacides d’où la formation
d’un complexe molybdotungstene bleu La coloration bleuâtre obtenue est proportionnelle à la
quantité de phénols présente (Ribéreau Gayon , 1968). Les polyphénols sont dosés par la
technique colorimétrique de Folin ciocalteau .Un aliquote de 10 μl de la dilution 10-2 de
l’extrait phénolique est mélangé à : 990 μl d’eau distillée, 250 μl de solution de Folin
Ciocalteau (1N) et 1,25 ml de carbonate de sodium (Na2 CO3 20%). Le développement d’une
couleur bleue est obtenu après incubation à l’obscurité et à température ambiante pendant 40
min. L’absorbance est mesurée à 725 nm. La concentration en composés phénoliques d’extrait
est déterminée en se référant à la courbe d’étalonnage obtenue en utilisant l’acide gallique
comme standard.
Fig 7 : Courbe étalon correspondant aux dosages des phénols totaux.
II. Analyses microbiologiques des margines
II.1Traitement préalable des margines
Les margines ayant fait l’objet de notre travail ont subi les opérations de
prétraitements suivantes, afin d’éliminer les matières en suspensions et la matière grasse. La
Chapitre II Matériels et méthodes
19
délipidation a été faites par décantation à l’aide d’une ampoule à décanter et la fiiltration à
l’aide d’un papier de filtre wattman (Yahiaoui Moussaoui, 2013).
II.2 Dénombrement de la FTAM (flore totale aérobie mésophile)
Elle consiste à dénombrer la microflore existante dans l’échantillon des margines ;
Nous avons procédé à une culture sur gélose nutritive. Pour se faire, une série de dilution
variant de 10-1
au 10-4
qui a été préparée selon les étapes suivantes:
II.2.1 Préparation des dilutions :
Dans un tube à essai contenant 9 ml d’eau distillée stérile, est ajouté 1 ml de la solution
mère, c’est la dilution à 10-1
.1 ml de cette dilution est introduit dans 9 ml d’eau distillée
stérile, correspondra à la dilution 10-2
. On continue ainsi jusqu'à l'obtention de la dilution 10-4
.
II.2.2 Ensemencement par étalement sur gélose nutritive:
Le milieu gélosé préalablement fondu est réparti dans des boites de pétri à une hauteur
d'environ 3 à 4 mm qu’on laisse ensuite refroidir. 0.1 ml de chaque dilution est prélevé à
l’aide d'une pipette Pasteur puis déposé sur la gélose, ensuite étalé sur toute la surface du
milieu.
Après 24h à 48h d'incubation à 30°C, les colonies développées sont dénombrées à l'aide
d'un compteur de colonies (Djerbaoui Amina Nesrine, 2011).
Le nombre de germes par ml est déterminé en calculant la moyenne des résultats obtenus et en
tenant compte des facteurs de dilution, selon la formule:
N = n / d. v
Où :
N : nombre des microorganismes en UFC/ ml.
n : nombre des colonies dénombrées.
v: Volume prélevé (0.1ml).
d : Dilution (Marchal et Bourdon, 1982).
Isolement et purification
À partir d'un échantillon de les margines, des dilutions variant de 10-1 à 10-4 sont
réalisées, Ensuite, 0.1 ml de chaque dilution est ensemencé sur le milieu GN (milieu
d’isolement de toutes la flore microbienne qui s’installe dans les margines). L’incubation se
fait à 30°c pour une durée de 24 Heures.
Après 24 h d’incubation, l’étape de purification des cultures permet d’obtenir des
cultures pures à partir des différentes souches obtenues.
Chapitre II Matériels et méthodes
20
La sélection est basée sur l'aspect macroscopique des colonies : la couleur, la forme, le
diamètre, l’opacité…etc. Un échantillon de chaque type de colonie est prélevé et ensuite
purifié par repiquage successif selon la méthode de stries (Martinneau, 1996).
II.2.3.Les souches purifiées à partir de la GN
II.2.3.1.Bacillus
Le genre Bacillus, très hétérogène, comprend des espèces anaérobies facultatives ou aérobies
(P. Roger et J.L. Garcia, 2001). Elle est purifie et repiqué successivement sur milieu GN à
partir de ce dernier milieu. L'identification de Bacillus isolées est réalisée en se basant sur les
études morphologique et biochimique
a. Etude morphologique
L’étude morphologique a été réalisée pour tous les genres de bactéries, qui ont les
purifient et elle subdiviser en deux partie macroscopique et microscopique qui repose sur la
préparation du frottis et la coloration de Gram pour les différents germes bactérien ou une
coloration simple pour les levures :
Aspect macroscopique
L’observation de l'aspect macroscopique des colonies permet d'effectuer une
Première caractérisation, avec une orientation possible des résultats au cours de
l'identification.D’après Singleton(1999), les éléments d’identifications macroscopiques sont:
La forme , La taille , La Chromogenèse , L'élévation , L'opacité , La surface…etc
Aspect microscopique
L’observation microscopique consiste à observer les cellules bactériennes à l’état frais
et après une coloration de GRAM :
*Etat frais : permet de déterminer la forme, l'arrangement et la mobilité des bactéries. Il
consiste en l'observation d'une goutte de suspension bactérienne, préparée avec de
l'eau physiologique et placée entre lame et lamelle. L’observation se fait au
microscope photonique à grossissement X 100 (Singleton, 1999).
Chapitre II Matériels et méthodes
21
*Coloration de GRAM : est une double coloration qui nous permet de connaître forme,
l'arrangement, la pureté ainsi que la nature biochimique de la paroi des cellules purifiées.
Cette coloration permet de classer les bactéries selon leur capacité à fixer le cristal violet.
Celles qui possèdent une couche de peptidoglycane mince sont décolorées lors du lavage à
l’éthanol (GRAM-), alors que celles qui possèdent une couche de peptidoglycane épaisse vont
retenir le colorant (GRAM+). La consistance et la valeur de la coloration de Gram correspond
à des différences biochimiques entre la paroi des bactéries Gram positif et les bactéries Gram
négatif (Marchal et Bourdon, 1982).
b.Etude biochimique
Les épreuves biochimiques permettent en général de distinguer les espèces, même
Etroitement apparentées entre elles (Tortora et al., 2003).
b.1.test de catalase
b.2.Utilisation du citrate comme source de carbone
Le milieu utilisé ne contient que le citrate comme seule source de carbone. Seules les
bactéries possédant une citrate perméase seront donc capables de se développer sur ce milieu
en provoquant la libération des OH qui alcalinisent le milieu, donc il y aura virage au bleu
(Singleton, 1999).
b.3.Production d'indole
La production d’indole est mise en évidence par utilisation de tryptophane exempt
d'indole (Joffin et leyral ,2006).par une réaction complexe, le tryptophane est décomposé en
présence d’une tryptophanase en indole et d’autre produits après incubation, l’ajout de réactif
de kovacs permet de mettre en évidence l’indole formé la lecture se traduit par une couleur
rouge si le test est positive (indole +) et elle est de couleur jaune (couleur de réactif) si le test
(indole -) (Camille D. 2014).
b.4.Test Voges-Proskauer (vp) et Rouge de Méthyl (RM) :
La mise en évidence des voies fermentaires, est de grande utilité pour le diagnostic des
microorganismes. Ce test est opéré à partir d’une culture sur milieu Clark et Lubs qui servira
à la détermination des réactions de Voges Proskauer (VP) et Rouge de Méthyl (RM). Un tube
Chapitre II Matériels et méthodes
22
contenant le milieu Clark et Lubs est ensemencé à l’aide de quelques gouttes de la bactérie,
puis incubé à 37°C pendant 24h. Le lendemain, la moitié du tube est transvasée dans un autre
tube stérile :
- L’un servira à la recherche de la réaction VP, après adjonction des réactifs VP I, puis VP II,
attende environ 15 minutes puis noter la couleur ; si elle vire au rouge orangé, il s’agit d’une
réaction positive.
- L’autre servira à la recherche de la réaction RM, après adjonction du réactif RM ; s’il y a
virage de la couleur au rouge, il s’agit d’une réaction positive (Joffin et al., 2006)
b.5.Test TSI : (Tri-Sugar-Iron) :
Ce milieu solide, incliné, renferme un indicateur de pH coloré (rouge de phénol), trois
sucres (glucose avec une forte concentration au culot saccharose et lactose au niveau de la
pente), des peptones, des thiosulfates et du fer. Il nous renseigne sur trois caractéristiques:
- La production de gaz pendant la consommation du glucose se manifeste par un décollement
de la gélose au fond du tube.
- L’utilisation ou non du lactose qui se manifeste par un jaunissement de la pente sinon, la
pente reste légèrement rose.
- La production ou non d’H2S qui se traduit par un noircissement.
À partir du milieu TSI on fait ensemencer la pente par une strie longitudinale et
ensuite une piqure centrale à l’aide d’une pipette pasteur, et à partir d’une suspension de la
culture en eau distillée stérile, enfin on fait étuver ce tube à 37°C pendant 24 heures.
b.6.Hydrolyse de l’amidon :
L’amidon est un polysaccharide, polymère du glucose α, constitué d’amylose et
d’amylopectine Camille D. (2014). En cultivant la souche à caractériser sur milieu nutritive
additionnée de 1% d’amidon de pomme de terre puis incuber à 30°C, pendant 24 h .la lecture
est se fait comme suite :
*l’hydrolyse de l’amidon s’exprime par un halo d’éclaircissement autour de chaque colonie
(point d’ensemencement) l’observation est plus nette en inondant la surface du milieu avec du
lugol et
*si la zone reste bleue l’amidon dans ce cas n’est pas hydrolyser.
Chapitre II Matériels et méthodes
23
b.7.Hydrolyse de la gélatine :
La souche est ensemencer dans un tube content de la gélatine nutritive puis incuber à
30°C, pendant 24 h ensuite le tube est placé pendant 2heures environ au réfrigérateur
*si la gélatine devient solide cela implique qu’elle n’a pas été attaquée
* si elle reste liquide une enzyme extracellulaire la gélatinase l’a hydrolysée (Larpent et
Larpent -Gourgaud .1985).
b.8.Hydrolyse de la caséine :
L’hydrolyse de la caséine est étudiée selon la méthode de Gordon et Smith (1953) et
williams et cross (1971) sur un milieu gélose contenants5% de lait écrémé. Après 24h
d’incubation à 30°C, l’apparition de la zone d’éclaircissement du milieu autour des colonies
témoigne de l’hydrolyse de la caséine (Camille D. 2014).
b.9.Action sur le lait écrémé :
D’après williams et cross (1971) Un tube contenant une solution de lait écrémé en
poudre à 10%dans l’eau distillée est ensemencés et incubés à 30°C .une observation après
24h permettent de noter la coagulation ou la peptonisation du lait provoquée par la bactérie.
b.10. Mannitol mobilité :
Le mannitol est un produit de réduction du D-mannose. Il permet de rechercher
simultanément la fermentation du mannitol et la mobilité. On a ensemencé les souches
étudiées dans le milieu semi-solide mannitol-mobilité par piqûre centrale, et incubé à
37°C±1°C pendant 18 à 24h. Le virage au jaune du milieu indique la fermentation du
mannitol (Gerhard et al., 1994), une diffusion dans la gélose indique la mobilité des bactéries
(Marchal et al., 1991).
II.2.3.Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux
Le dénombrement des coliformes est réalisé en milieu de culture Désoxycholate (DCL).
Le milieu est ensemencé en masse et incubé à 37°C pendant 48 heures pour les coliformes
totaux alors que les coliformes fécaux ensemencé en surface et incubé à 44°C.
II.2.4.Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux
La recherche et le dénombrement comporte deux tests :
Test présomptif:
Chapitre II Matériels et méthodes
24
A partir de la solution mère introduire 1 ml dans trois tubes de milieu ROTHE (BIO-RAD,
France) double concentration.
1 ml dans une série de 3 tubes de milieu ROTHE (BIO-RAD, France) simple concentration.
Bien homogénéiser et incuber à 37°C pendant 24 à 48heures.
Test confirmatif:
Tous les tubes qui présentent un trouble microbien, sont repiqués dans des tubes de
milieu LITSKY (BIO-RAD, France) et incubés à 37°C pendant 48heures.
II.2.5. Recherche des Staphylocoque
Les staphylococcus sont des coques Gram positif, immobile, isolés par 2 ou groupés
en amas caractéristique (grappes de raisin), de 1um de diamètre, réguliers, catalase positif. Ils
présentent des capacités importantes de thermorésistance .leur caractère saprophyte de la peau
et des muqueuses des êtres vivants en fait des agents de contamination par manipulation. Les
espèces de staphylococcus ne sont pas pathogènes, sauf quelques espèces qui sont coagulase
+, sont pathogènes (Leyral et Vierling, 2007 et Mardigan M et al.,2007).
II.2.5.1.Isolement par Méthode d’ensemencement en surface
A partir de la solution mère, porter aseptiquement à l’aide d’une pipette neuve 0.1 ml
et l’ensemencer à la surface du milieu Chapman (faire un étalement par râteau) puis incuber à
37 C pendant 24 heures
II .2.5.2.Purification des souches isolées
Les colonies sont ensemencées, sur le milieu adéquat (milieu Chapman). Celles qui
présentent un aspect caractéristique de celui des staphylocoques, sont réensemencées à l’aide
d’une pipette Pasteur, en stries selon la méthode des quatre cadrant à fin d’obtenir des
colonies bien isolées. Une coloration de Gram est refaite chaque fois pour contrôler la pureté
des souches.La conservation est réalisée dans des tubes de gélose de conservation par piqure
centrale. Les tubes sont ensuite conservés au réfrigérateur à 4°C, les repiquages sont effectués
tous les 15jours (Stephen et al., 2006).
II .2.5.3.Identification du genre
a. Identification biochimique
En plus des caractères morphologiques, l’identification est aussi effectuée sur la base de
quelques caractères biochimiques (Guiraud; 1998 ; Freney et al., 2007) :
Chapitre II Matériels et méthodes
25
a.1.Test de catalase
La catalase est une oxydoréductase intervenant dans le mécanisme de résistance à la
bactéricidie. Ce test permet de différencier les staphylocoques des streptocoques. À partir d'un
isolement, une petite quantité de culture bactérienne est prélevée à l’aide d’une pipette Pasteur
;on fait réagir la colonie dans 1 goutte de peroxyde d’hydrogène (H2O2) (10 volume) déposée
sur une lame. Une réaction positive se traduit par le dégagement de bulles de gaz (oxygène).
Ce test peut être réalisé en tube contenant 0.5 ml de H2O2 ; à l’aide d’une pipette
Pasteur des colonies sont prélevées et introduites dans le tube. Le résultat et identique à celui
obtenu lors du test sur lame (Denis et al., 2007).
II.2.5.4.Identification de l’espèce
1- Test de la staphylocoagulase
Ce teste a pour but de déterminer la pathogénicité d’un staphylocoque, les espèces de ce
type secrètent une enzyme qui est la staphylocoagulase qui a la propriété de coaguler le
plasma. Dans un tube d’hémolyse stérile, on introduit 0.5 ml de plasma humain qui
correspond au surnageant issus de la centrifugation du sang humain. Ajouter 0.5 ml d’une
suspension bactérienne de la souche étudiée (S. aureus).Placer le mélange à 37°c dans l’étuve
pendant 6 heures.
Lecture:
- Coagulation du plasma coagulase +
- Pas de coagulation du plasma coagulase - (Diamonet F., 2002.)
II.3. Recherche des levures :
Pour assurer la purification de la souche, fait appel à des isolements successifs sur
milieu OGA. Après l’incubation, l’observation des caractères culturaux permet de désigner la
Pureté de la souche.
Identification de la levure qui a été purifie :
L’identification ne peut être effectuée que sur une souche pure préalablement isolée sur
un milieu gélosé pour levure. Elle est basée sur l'analyse des caractères morphologiques et
sexuels, et sur l'étude de certains critères physiologiques.
Chapitre II Matériels et méthodes
26
1. caractéristiques morphologiques
1.1. Etude le mode de reproduction
La reproduction végétative chez les levures se fait par trois modes : Bourgeonnement,
fission ou par cloisonnement du mycélium (anse d’anastomose). Le mode de reproduction par
bourgeonnement est largement répondu chez les levures. La souche à examiner est mise en
culture en milieu OGA et incubées à 25°C pendant 3 jours. L’observation microscopique
portera sur la forme et la taille des cellules, et sur le mode de reproduction asexuée.
2. caractéristiques physiologiques
2.1. Fermentation des sucres
La souche est testée pour leur capacité à fermenter le glucose, galactose,
Saccharose, maltose et le lactose selon la méthode de Durham. Le milieu comporte
0,45% d’extrait de levures, 0,75% de peptone et 2% de sucre approprié. Pour la boite de Pétri
d’isolement de culture pure, 5 tubes à essai remplis sur une hauteur de 5 cm environ sont
utilisés. Il faut ensemencer en profondeur chaque souche de levure sur une gamme de cinq
tubes Il faut incuber les tubes à l’étuve à 25°C. Après 24 heures au moins constater les
résultats. La mesure de la partie vide dans la cloche de Durham donne une estimation du
volume du gaz formé par fermentation.
2.2. Recherche de nitrate réductase
L'étude de la réduction des nitrates se fait par la mise en évidence des nitrites
formés. Ces derniers en milieu acétique ou sulfurique, donnent une coloration rose.
L’enzyme nitrate réductase B catalyse la réduction des nitrates en nitrites
(réduction assimilatrice). Les nitrates peuvent aller également jusqu’au stade azote (N2).
à une culture de 24 à 48h d'incubation à 30°C en bouillon nitraté, cinq gouttes de réactif de
Griess sont ajoutés. Après agitation, la lecture est immédiate et elle se fera comme suit :
- Lorsque la coloration est rose ou rouge ; les nitrates sont réduits en nitrites, on parle de
nitrate réductase positive (NR+).
- Lorsque le milieu reste incolore ; on ajoute un peu de la poudre de zinc (réducteurs des
nitrates) ; après cinq minutes les tubes sont de nouveau observés :
- si le milieu devient rose ou rouge, il reste des nitrates, donc ces derniers n'ont pas été réduits
par la bactérie: nitrate réductase négative NR- .
-si le milieu reste incolore, il ne reste plus de nitrates, les bactéries les ont réduit au delà
du stade nitrites : nitrate réductase positive NR+ (Tortora et al., 2003).
Chapitre II Matériels et méthodes
27
II.4.Recherche des moisissures
II.4.1.Isolement sur milieu sabouraud
L’ensemencement et fait en surface par l’étalement de 0.1 ml de l’échantillon dans des
boites de pétri contenant le milieu sabouraud.
II.4.2.incubation
L’incubation a été réalisée à 25°C, température considérée comme optimale pour la
croissance des champignons jusqu’à l’apparition d’un mycélium de 48 h à 4 jours.
II.4.3.Purification des isolats
Après incubation, des repiquages de manière aseptique sont effectués jusqu’à
l’obtention des colonies pures sur milieu gélosé sabouraud.
II.4.4.Identification des isolats.
La détermination mycologique se fait , par observationmacroscopique et
microscopique des moisissures isolés. L’identification des espèces fongiques isolées est
effectuée en utilisant la clé de détermination de (Botton, 1990).
Observation macroscopique.
Les observations macroscopiques portent sur les critères culturaux, indispensables à la
détermination de l’espèce. L’aspect du mycélium aérien (dense, poudreux, floconneux…), la
couleur des colonies, la sporulation, la diffusion ou non d’un pigment dans la gélose…etc
Examen microscopique
on prend un fragment de scotch (technique de drapeau), que l’on colle sur le bord de la
colonie du moisissures, puis qu’on décolle délicatement. On le recolle ensuite sur une lame
sur laquelle est préalablement étalée une goutte de bleu de méthylène. On peut observer au
microscope les spores et le mycélium (N.GUEZLANE-TEBIBEL et al.,2015).
II.4.5.Conservation des isolats.
Dans des tubes inclinés contenant le milieu sabouraud incliné et après
une incubation de 7 jours, les tubes sont conservés à 4° C (les basses températures
augmentant considérablement la longévité des cultures).
Chapitre II Matériels et méthodes
28
III. Evaluation de l’activité antibactérienne des margines :
III.1.souches testées:
Les souches qui subissent une activité antibactérienne sont des souches isolées à partir
de nos échantillons de margines ; Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis ,Saccharomyces cerevisiae , Bacillus subtilus. Et nous avons ciblé troix
microorganismes (originaire d’isolement clinique)
Tableau 5 : Souches d’isolement clinique testées.
Les bactéries (souche ATCC) Le code Le lieu
Staphylococcus aureus. 43900 EPH Constantine
Escherichia coli. 25925 EPH Constantine
Pseudomonas aeruginosa. 27853 EPH Constantine
III.2. Préparation de l’inoculum
III.2.1. Préparation de pré-cultures :
Les tests antimicrobiens doivent être réalisés à partir des cultures jeunes (de 18 à 24
heures) en phase de croissance exponentielle. Repiquage des souches est effectuée par
ensemencement des bactéries dans des boites de Pétri contenant de la gélose nutritive (GN)
pour Pseudomonas aeruginosa, Bacillus, le milieu Chapman pour Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis le milieu Hekteon pour Escherichia coli et Sabouraud pour la
levure. Les souches bactériennes ont été incubées à 37°C pendant 18 heures, alors que la
levure et Bacillus a été laissée à température ambiante de 30°C pendant 24h.
III.2.2. Préparation de la suspension microbienne
A partir d’une culture jeune de 18 h, et à l'aide d'une anse de platine, on prend
quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques et on le dépose dans 10 ml d'eau
physiologique stérile à 0,9% de NaCl. La suspension microbienne est homogénéisée pendant
5min dans le vortex.
La lecture de la transmittance est effectuée par un spectrophotomètre réglé à une
longueur d’onde de 625 nm, et la densité optique lue est justifiée à 0.08 à 0.10 nm. Ce qui
correspond à une concentration de 107 à 10
8 CFU /ml (Hazzit, 2008).la suspension
microbienne peut être ajusté soit en ajoutant de la culture s'il est moins concentré ou de l'eau
physiologique stérile dans le cas contraire.
III.2.3. Préparation des disques
Chapitre II Matériels et méthodes
29
Les disques sont fabriqués à partir du papier Wattman №02, par un perforateur à 2 trous
du papier, avec un diamètre de 6mm. Ensuite, ces disques sont mis dans un tube à essai,
stérilisés à l'autoclave, puis stockés à une température ambiante.
III.2.4.Activité antibactérienne :
L'évaluation de l’activité antibactérienne a été réalisée par la méthode de diffusion en milieu
gélosé (ou méthode des disques). On fait couler la gélose de Mueller-Hinton dans les boites
de pétri à environ de (4 mm) après solidification des milieux de culture. L’ensemencement est
réalisé par écouvillonnage sur boites Pétri, Un écouvillon est trempé dans la suspension puis
étalé sur la totalité de la surface gélosée, de haut en bas en stries serrées en tournant la boite à
chaque fois jusqu'à ensemencement de la totalité de la surface. On laisse sécher de 3 à 5
minutes. Dans des conditions aseptiques et à l’aide d’une pince stérile, des disques de papier
Wattman № 01 (2 disques/boite) imbibés avec 10 μl de l’extrait de composes phénolique, et
10 μl de DMSO sur un autre disque (les disques trempés de DMSO sont utilisés comme
contrôle négatif ou comme un témoin et l’autre disque est utilisés comme contrôle positif).
Sont déposés délicatement sur la surface de la gélose. Les boites de pétri sont maintenues à
4ºC pendant une heure pour que l’extrait puisse diffuser (Rožman et Jeršek, 2009 cité par
Kehal (2013)). L’incubation se fait à 37°C pendant 24h alors que la levure et Bacillus a été
laissée à température ambiante de 30°C pendant 24h.
III-2.5. Expression des résultats :
L’effet des extraits se traduit par l’apparition autour de disque d’une zone circulaire
transparente correspondant à l’absence de la croissance. Les résultats sont exprimés par la
mesure du diamètre de la zone d’inhibition à l’aide d’une règle en mm et sont Interprétés en
trois catégories : S= sensible (ɸ > 13mm), R= résistant (ɸ < 6mm), et I=intermédiaire (6mm <
ɸ <13mm).
Chapitre III Résultats et discusion
30
1. Caractérisation physico-chimique et biochimique des margines
Tableau 5: les Caractéristiques physico-chimiques et biochimiques des margines prélevées
du système traditionnelle à 03 phase.
Paramètres Valeurs
pH 4.8
Conductivité 1711us/cm
Turbidité 666.66 NTU
DBO5 1200 mg O2/ml
DCO 1300 mg O2/ml
%d’humidité 89.5%
%de la matière sèche 10.5%
%de la matière organique 9.5%
%de la matière minérale 1%
Polyphénols 2.2 ug/ml
Les margines présentent un rejet fortement pollué sous forme de liquide résiduel dont
la composition est variable. Cette variabilité dépend du type d’olives ; du degré de leur
maturation (selon la période de collecte), des systèmes de culture, de la pratique de salage
pour la conservation des olives, des conditions climatiques et du procédé utilisé pour
l’extraction d’huile d’olive (De Felice, B et al 1997). Les margines se caractérisent aussi par
une odeur nauséabonde qui s’accentue au fur et à mesure de leur stockage. On a constaté
qu’ils représentent une coloration brune à brune-rougeâtre, qui devient de plus en plus sombre
au cours de leur stockage, avec un aspect trouble et une odeur forte qui rappelle celle d’huile
d’olive.
Le pH
La mesure du pH effectuée donne une valeur de l’ordre de 4,8. Les margines sont donc
des effluents acides, en raison de la présence des acides organiques (acides phénoliques,
acides gras). La valeur enregistrée dans notre étude se trouve dans la limite inférieure de la
fourchette citée dans la littérature (4,5 à 6).
Chapitre III Résultats et discusion
31
La conductivité électrique
Les margines étudiées ont une conductivité électrique faibles (1711us/cm)
comparativement à celles trouvées pour les margines par Sbai et Loukli (2015) (7890
μS/cm) et Di Serio et al. (2008) (1800 et 5000 μs/cm). La faible conductivité de nos
margines pourrait s’expliquer par leur grand teneur en composés organiques que les sels.
En effet, les sels minéraux dissouts en solution sont de bons conducteurs. Par contre, les
composés organiques sont de mauvais conducteurs (De villers, 2005). Ce résultat est
corroboré à la richesse de nos margines en matières organiques exprimés en terme de
DBO5 (demande biologique en oxygène) et DCO (demande chimique en
oxygène).DBO5=1200 mg O2/l et DCO=1300 mg O2/l. Ces rejets sont aussi caractérisés par
la prédominance de substances toxiques notamment les composés phénoliques (2.2 ug/ml)
qui leur confèrent un pouvoir antimicrobien.
La turbidité
Ces margines présentent une turbidité de l’ordre de 666.66 NTU en raison des teneurs
élevées en substances organiques.
La matière sèche
Le taux de matières sèches totales (en g/l) est déterminé (109.3g/l). Il est nettement
plus élevé que celui des margines prises comme échantillon par STEEGMANS et
FRAGEMAN (1992) (19,2 g/l), par contre, la valeur enregistrée dans notre étude est plus
proche à celle trouvée par EL ABBASSI et al. (2011) ayant trouvé que leur échantillon de
margines contenait 90 g/l de MST. Ces variations peuvent être dues à des paramètres
climatiques et géologiques, à des variations botaniques, au stade de maturation de l’olive et
au procédé d’extraction d’huile.
Chapitre III Résultats et discusion
32
2.Caractérisation microbiologique
Peu de travaux ont été réalisés sur la caractérisation de la microflore des margines.
C’est pour cela nous avons fait une étude microbiologique (dénombrement, identification des
microorganismes) pour établir l’effet des composés phénoliques sur la microflore de ces
effluents et aussi pour une mise en évidence des microorganismes capables de survire dans
ces conditions (leur résistance à ces composés phénolique).
2.1. Dénombrement des micro-organismes
Tableau 6: Caractérisation microbiologique des margines étudiées :
Les résultats du dénombrement des germes présentés dans le tableau 5.Montre que
notre étude microbiologique effectuées sur les margines ont confirmé l’absence totale de
micro-organismes pathogènes. Cette valeur est similaire à celles rapportées par l’auteur
(Ranalli, 1991a). Par conséquence, l’absence totale de ces germes dans les margines ne
pourrait être expliquée que par une inhibition de leur croissance par les composés phénolique
(polyphénols, tannins, acides gras…) (Ranalli, 1991a).
La charge microbienne totale est évaluée par le dénombrement de la flore totale
aérobie mésophile (FTAM).elle est relativement faible de (6.35 104 UFC.ml
-1) par rapport à
celle enregistrée dans les effluents d’abattoir (1,23 106 UFC.ml
-1) (Aissam et al, 2001). Elle
est lié aux caractéristiques physico-chimiques des margines qui gênent la croissance des
micro-organismes notamment la présence des substances antimicrobiennes (composés
phénoliques, tanins, acides gras).
Flore microbienne UFC.ml-1
FMAT 6.35 104
Champignons 1.08 105
Levures 1.4 104
Coliformes fécaux 0
Coliforme totaux 0
Streptocoques fécaux 0
Chapitre III Résultats et discusion
33
Les levures et les champignons représentent la flore majoritaire des margines Ils sont
d’environ 1.08 105
UFC.ml-1
et 1.7 104
UFC.ml-1
respectivement. Ce résultat sont en accord
avec les celle obtenus par d’autres auteurs qui ont montré que dans les margines, les levures
et les champignons sont capables de s’y développer mieux que les bactéries (Aissam et al.,
2002). Pour ce qui concerne les résultats de dénombrement des germes de contamination
fécaux coliformes totaux (CT), des coliformes fécaux (CF) et des streptocoques fécaux (SF)
montrent l’absence totale de ces germes les résultats qui a été obtenus pour nos margines est
accord à celle de Taza et Marrakech (Mouncif et al. 1993a).
2.2. Identification des microorganismes
2.2.1 Les bactéries
A. Bacillus
Les bactéries du genre Bacillus sont des grands bacilles à Gram positif, groupés en chaînettes,
sporulantes, et généralement mobiles avec des flagelles péritriches. Ce genre est aérobie, ou
parfois facultatif et catalase positive (Klein et al., 1998).
Tableau 7: identification morphologique de Bacillus
examen macroscopique et
microscopique
Résultats
L’aspect macroscopique de Bacillus
sur gélose nutritive représente des
colonies rugueuses avec un halo clair
de précipité blanchâtres.
L’aspect microscopique de Bacillus
par coloration de GRAM apparaît
comme des bacilles isolés (2 µm de
long, 1 µm de large), Gram +,
Formant une spore ovalaire centrale
non déformante.
Chapitre III Résultats et discusion
34
Tableau 8: Identification biochimique de Bacillus -galerie classique-.
Les tests Résultats
Catalase L’observation du test
catalase a montré que la bactérie
catalase positive Elle est donc
aérobies ou anaérobies
facultatives.
VP :positif
RM :négatif
Indole :négatif
TSI : virage
au jaune dans
la pente
lactose positif
production de
gaz : négatif
H2S : négatif
Manitole
mobilité :
positif
Le virage au
jaune du
milieu
indique la
fermentation
du mannitol
Citrate
simons :
négatif
la bactérie
ne
possèdent
pas une
citrate
perméase
La bactérie à fermentation
butanediolique :
RM (-) VP (+)
Chapitre III Résultats et discusion
35
Tableau 9: Résultats de la mise en évidence de quelques activités enzymatiques de Bacillus
Les tests Les résultats
Hydrolyse de la caséine : positif
l’apparition de la zone
d’éclaircissement du milieu autour
des colonies témoigne de
l’hydrolyse de la caséine.
avant et après incubation à 30°C pendant 24h
Hydrolyse de l’amidon : positif
l’apparition d’un halo
d’éclaircissement autour de chaque
colonie témoigne de l’hydrolyse de
l’amidon.
Avant et après l’ajout de lugol
Avant et après incubation à 30°C pendant 24h
Hydrolyse de la gélatine : Le milieu reste
liquide une enzyme extracellulaire la gélatinase
l’a hydrolysée c’est à dire résultats positif.
Action sur le lait écrémé : coagulation et la
peptonisation du lait provoquée par la bactérie
donc résultats positif.
Chapitre III Résultats et discusion
36
D’après les résultats exprimés dans les tableaux 7,8 et le tableau 9 il apparait une grande
biodiversité métabolique remarquable chez cette souche ces caractéristiques indiquent que la
souche étudiée semble être Bacillus subtilis.
B.Staphylococcus
Sur milieu Chapman, les colonies de Staphylococcus apparaissent souvent pigmentées
et entourées d’une aréole jaune dans le cas où le mannitol est fermenté, sinon les colonies sont
de couleur blanche. Ces colonies sont arrondies à bords réguliers de 1 à 2 mm de diamètre
après 24 heures d’incubation à 37°C (Carbonnelle et al., 1990) .
Tableau 10 : les Tests d’identification des staphylocoques
Les souches
Les tests
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis
Isolement et
purification
Coloration de
GRAM
Chapitre III Résultats et discusion
37
Coagulase
catalase
2.2.2. La levure :
Pour situer la souche de levures sur le plan taxonomique au niveau de l’espèce, nous
Avons fait appel à quatre tests critiques : la morphologie de l’appareil végétal (mycélium ou
Pseudomycélium), le mode de reproduction et un test physiologique basé sur l’assimilation
des nitrates et la fermentation des sucres.
+ -
+ +
Chapitre III Résultats et discusion
38
Tableau 11 : représente l’examen macroscopique et microscopique de la levure.
L’aspect Résultats
L’aspect macroscopique de la levure sur
gélose de l’OGA représente
des colonies de couleur
crème légèrement convexes et lisses avec
striation lumineuses brillantes.
L’aspect microscopique de la levure par
coloration au bleu de méthylène représente
des cellules cylindriques, singulières ou en
paires le pseudo mycélium n’est pas formé.
Leur mode de reproduction par
bourgeonnement
L’aspect de la levure à l’état frais
La levure est immobile
Chapitre III Résultats et discusion
39
Tableau 12: représente les résultats des caractéristiques physiologiques étudie chez la levure.
Les tests Les résultats
Assimilation de nitrate
(Nitrate réductase)
le milieu devient rouge et ça après
l’ajout de la poudre de zinc , il reste
des nitrates, donc ces derniers n'ont
pas été réduits par la levure nitrate
réductase négative NR- .
Donc la levure n’assimile pas les
nitrates.
Fermentation des sucres
Résultats positif apparait par virage de la couleur et production de gaz
les différents sucres testés dont le glucose, le saccharose, le maltose, le lactose et le
galactose, seul le lactose est non fermentescible. Il apparaît que la souche de levure étudiée
peut fermenter quatre sucres dont le glucose, le saccharose, le maltose et le galactose.
Chapitre III Résultats et discusion
40
D’après les résultats obtenus dans les tableaux 12 et 13 il est à remarquer que cette
espèce de levure fait l’assimilation des quatre sucres sauf le lactose, mais n’assimile pas le
nitrate.
Ces caractéristiques fermentaires indiquent que la souche étudiée semble être
Saccharomyces cerevisiae. Parallèlement, l’étude de la discrimination des espèces du genre
Saccharomyces, leur faculté d’assimilation des sucres et celle des nitrates montre que l’espèce
étudiée est Saccharomyces cerevisiae.
2.2.3. Les moisissures
Le diagnostic macroscopique de l’isolat (IM1) révèle des colonies jaunes, ocre jaunes
ou chamois. D’après les clés d’identification de Botton (1990), peuvent être affiliés à l’espèce
d’Aspergillus ochraceus, leur caractère microscopique est : un mycélium cloisonné portant de
nombreux conidiophores dressés, non ramifiés, terminés en vésicule. Des phialides formées
directement sur la vésicule ou sur des métules, et des têtes conidiennes unisériées ou bisériées
; les conidies en chaîne unicellulaire (Figure 8).
Figure 8 : l’isolat (IM1) Aspergillus ochraceus.
A) Observation macroscopique, B) Observation microscopique.
Le diagnostic macroscopique de l’isolat (IM2) ; L’espèce Aspergillus fumigatus se
caractérise par un thalle à croissance rapide de couleur bleu-vert (Figure 9). Avec
l’observation microscopique il apparait des vésicules sub-hémisphériques et conidiophores
courts avec des conidies sub- globuleuses à globuleuses échinulées. Selon les
recommandations de Botton et al. (1990) cet isolat (IM2) peut être affilié à l’espèce
Aspergillus fumigatus.
A B
Chapitre III Résultats et discusion
41
.
Figure 9 : (IM2) Aspergillus fumigatus ,
A) observation microscopique, B) observation macroscopique.
Le diagnostic macroscopique de l’isolat (IM3) révèle des colonies noires sur milieu
sabauraud. L’observation microscopique au grossissement (X 40) des conidiophores qui se
terminent par une vésicule sphérique, portant deux rangs de phialides produisant des chaines de
conidies globuleuses. D’après l’aspect microscopique et macroscopique de cet isolat peut être
affilié Aspergillus niger (Figure 10), selon les clés d’identification Botton et al. (1990), Rémi
(1997).
Figure 10 : (IM3) Aspergillus niger,
A) observation macroscopique ;B) observation microscopique.
B A
A Bb
Chapitre III Résultats et discusion
42
Sur Sabauroud : les colonies de l’isolat (IM4) sont plates, couleur blanchâtre au début
puis elle tourne vers le beige un revers incolore. L’observation microscopique montre un
mycélium septé, et présente une forme fructifère spécifique (pénicille). Le conidiophore est
aussi septé et porte des phialides, aux quels sont attachés des conidies. Les conidies sont
globuleuses, lisses, et forment de longues chaînes irrégulières. À partir de l’ensemble de ces
informations recueillies la souche S1 peut être attribuée au genre Penicillium sp (Figure11).
D’après Botton et al. (1990), Rémi (1997).
Figure 11 : (l’isolat IM4) Penicillium sp,
A) observation macroscopique ;B) observation microscopique.
Le diagnostic macroscopique de l’isolat (IM5) révèle des colonies à croissance
rapide ; vert jaune, sillonné radialement, velouté ou un peu floconneux et leurs caractères
microscopiques présentent un mycélium cloisonné pénicillé et ramifié avec des conidiophores
lisses, et des phialides ampulliformes. Les conidies sont sub-globuleuses, disposées en longues
colonnes irrégulières cet isolat peut être affilié Penicillium chrysogenum (Figure 12), selon
les clés d’identification Botton et al. (1990), Rémi (1997).
A B
Chapitre III Résultats et discusion
43
Figure 12 : (IM5) Penicillium chrysogenum ,
A) observation macroscopique ;B) observation microscopique.
2.3. Evaluation de l’activité antimicrobienne
Le pouvoir antibactérien de notre extrait phénolique contre les souches isolées
(Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Saccharomyces cerevisiae et Bacillus
subtilis) montrent qu’il n’existe aucun effet de ces composés sur ces souches donc elles
résistent aux composés phénolique par contre il y’a un effet très efficace à remarquer chez
les souches testes ayant montré des sensibilités différentes vis-à-vis ces composés phénolique
donc ces derniers inhibent d’une manière leur croissance efficace . Ces résultats concordent
avec les travaux de plusieurs auteurs qui ont montré que les champignons et les levures sont
capables de se développer plus que les bactéries dans les margines.
Tableau 13 : Diamètre des zones d’inhibition en (mm) montrant l’activité antibactérienne des
composés phénolique vis-à-vis les souches à isolement clinique.
Groupe microbienne Souches testées Diamètres d’inhibition en
(mm)
GRAM +
Staphylococcus aureus
26
GRAM -
Escherichia coli
14
Pseudomonas aeruginsa
22
A B
Chapitre III Résultats et discusion
44
Figure 13. L’activité antibactérienne des polyphénols sur la levure et les bactéries isolées.
Bacillus subtilis Staphylococcus aureus
Saccharomyces cerevisiae Staphylococcus epidermidis
Chapitre III Résultats et discusion
45
Figure 14. L’activité antibactérienne des polyphénols sur les bactéries tests.
Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Conclusion et perspectives
46
Conclusion
Cette étude avait pour objectifs la caractérisation physico-chimique et microbiologique
des margines, l’isolement des souches Staphylococcus, Bacillus, moisissures et levure à
partir des margines, ainsi que l’étude du profil de résistance des souches isolées vis-à-vis de
l’extrait phénolique.
La caractérisation microbiologique nous a permis de dévoiler une charge microbienne
importante des margines. L’étude physico-chimique effectuée sur ces margines a montré une
forte pollution organique manifestée particulièrement par les composés phénoliques. Nos
margines sont caractérisées, également par une forte acidité et une valeur de conductivité
électrique plus faible avec une forte charge polluante déterminée par la DCO et la DBO5. La
teneur du contenu phénolique obtenu par une extraction liquide-liquide en utilisant l’acétate
d’éthyle comme solvant concorde avec celle de la littérature. Le profil de résistance montre
que les souches isolées à partir des margines sont résistantes alors que les souches exogènes
sont sensibles aux composés phénolique.
Perspectives
Recherche de la flore totale présente dans les margine comme les bactéries lactique,
les levures, les champignons et les bactéries contaminants (bactéries pathogènes).
une identification génotypique par les méthodes moléculaires est devenue
indispensable pour compléter l’identification phénotypique.
recherche des gènes responsables de la résistance en vue de la production d’enzymes
capables de dégrader les composés phénoliques.
Références bibliographique
47
Aggoun M., 2016. Caractérisation de la composition en micro- constituants des
marginesissues de la production oléicole et utilisabilité comme complément dans la ration
chez lavache laitière. Thèse doctorat sciences. Institut de la Nutrition, de l'Alimentation et
desTechnologies Agro-alimentaires INATAA. Université Frères Mentouri-Constantine.,12-
13p.
AFNOR (1983). Recueil de normes françaises : eau, méthodes d’essai, 2éme édition, Paris,
France, 621p.
Allouchef. F, Lamri. D, et Zahf, F, 1999, « Surveillance de la qualité bactériologique
etphysico-chimique des eaux de contamination au niveau des trois communes : Ali
Boussid,Saby, Ben Badis, wilaya de sidi bel abbés » ; mémoire d'ingénieur d'état en
biologie.Université de sidi bel abbés.
Abbassi E. A., Kiai H. and Hafidi A. (2012).Phenolics profile and antioxidant activities of
olive mill waswater. Food chemistry, 132 :406-412p.
Achak A., Ouazzani N., Yaacoubi A., MANDI L. 2008. Caractérisation des margines issues
d’une huilerie moderne et essai de leur traitement par coagulation-floculation par la chaux et
le sulfate d’aluminium. Eau, 21 : 53-57p. Aissam H., Errachidi F., Merzouki M.,
Benlemlih M. (2002) Identification des levuresisolées des margines et étude de leur activité
catalase. Cahiers de l'Association ScientifiqueEuropéenne pour l'Eau et la Santé, 7, 23-30p.
Aissam H. (2003). Etude de la biodégradation des effluents des huileries (margines) etleur
valorisation par production de l’enzyme tannase. Thèse de doctorat. Université SidiMohamed
ben abdellah (Maroc), Fès, 94p.
Al-Malah K., Azzam M.O.J., Abu-Lail N.I. (2000) Olive mills effluent (OME)
wastewaterpost-treatment using activated clay. Separation and Purification Technology, 20,
225-234p.
Références bibliographique
48
Amirante P., Montervino A. (1996) Epuration par concentration thermique des effluents
deshuileries d’olives et compostage du concentré. Une expérience appliquée dans les
pouilles,Olivea, 63, 64-69p.
A.Morisot, J.P.Tournier ; Répercutions agronomique de l’épandage d’effluents et déchets
de moulins à huile d’olive ; Agronomie : 6 (1986), 235-241p.
Annaki A, chouch, M et Rafiq, M. (1996b).Influence de la duré du stockage des olivessur
L’évolution de la composition des margines .l’eau .l’industrie .les nuisances .218, 24-28p.
Balice V., Boari G., CERA O., Abbaticchio P. (1982) Indagineanaliticasulleacque di
vegetazione. Nota 1.,Inquinamento, 7, 49-53p.
Balice V., Carrieri C., Carrieri G. (1997) Trattamentochimico-fisicoseguito dal
biologicodelleaque di vegetazionedelle olive, Ricerca, 2, 50-53p.
Bambalov G, Israilides C, Tanchev S, (1989). Alcohol fermentation in olive oil Extraction
Effluents, Biological Wastes, 27, 71-75p.
Benyahia N et Zein K. (2003).Pollution and developement issues in the Mediteranean basin,
2nd conference international Swiss environmental Solution for emerging Countries
(SESECII), Lausane, Swiss, 28-29p.
Borja R., Martin M.A., Duran Barrantes M.M. (1992) Kinetic study of biomethanizationof
olive mill wastewater previously subjected to aerobic treatment with Geotrichumcandidum.
Grasas y Aceites, 43, 82-86p.
Borja R., Banks C.J. and Alba J. (1995). A simplified method for determination of kinetic
parameters to describe the aerobic biodegradation of two important phenolic constituents of
olive mill waste water treatment by a heterogeneous microbial culture.Environ. Sci. Health
A., 30: 607-626p.
Références bibliographique
49
Bouranis D.L., Vlyssides A.G., Drosopoulos J.B., Karvouni G. (1995) Somme
characteristics of new organic soil conditioner from the co-composting of olive oil processing
wastewater and solid residue. Soil. Sci. Plant. Annal.,26, 2461-2472p.
Bressan,A, Liberator,L,D'alessandro,N, Tonucci,L,Belli,CetRanalli;G(2004)/ Improved
combined chemical and biological treatments ofolive mill wastwaters.Journal of agricultural
and food chemistry ,52,p1228-1233p.
Ben Rouina B. (2014).L’épandage des margines sur les terres agricoles : résultats etgestion
pratique, 7èmes Journées Méditerranéennes de l’Olive, Meknès, Maroc.21-23Octobre, 3.
BOTTA A., Avril 2001, « Laurence BELLON. Pollution de l'eau et santé humaine
»Laboratoire de biogénotoxicologie et mutagenèse environnementale. Université
EuroméditerranéenTEHYS.
Balice V., Boari G., CERA O., Abbaticchio P. (1982) Indagineanaliticasulleacque
divegetazione. Nota 1.,Inquinamento, 7, 49-53p.
Balice V., Carrieri C., Carrieri G. (1997) Trattamentochimico-fisicoseguito dal
biologicodelleaque di vegetazionedelle olive, Ricerca, 2, 50-53p.
Bambalov G, Israilides C, Tanchev S, (1989). Alcohol fermentation in olive oil Extraction
Effluents, Biological Wastes, 27, 71-75p.
Benyahia N et Zein K. (2003).Pollution and developement issues in the Mediteranean basin,
2nd conference international Swiss environmental Solution for emerging
Countries(SESECII), Lausane, Swiss, 28-29p.
Borja R., Martin M.A., Duran Barrantes M.M. (1992) Kinetic study of biomethanizationof
olive mill wastewater previously subjected to aerobic treatment with Geotrichumcandidum.
Grasas y Aceites, 43, 82-86p.
Borja R., Banks C.J. and Alba J. (1995). A simplified method for determination of kinetic
parameters to describe the aerobic biodegradation of two important phenolic constituents of
olive mill waste water treatment by a heterogeneous microbial culture.Environ. Sci. Health
A., 30, 607-626p.
Références bibliographique
50
Bouranis D.L., Vlyssides A.G., Drosopoulos J.B., Karvouni G. (1995) Somme
characteristics of new organic soil conditioner from the co-composting of olive oil processing
wastewater and solid residue. Soil. Sci. Plant. Annal.,26, 2461-2472p. Bressan,A,
Liberator,L,D'alessandro,N, Tonucci,L,Belli,CetRanalli;G(2004)/ Improved combined
chemical and biological treatments ofolive mill wastwaters.Journal of agricultural and food
chemistry ,52,p1228-1233p.
Botton B., Breton A., Févre M. Gauthier S., Guy Ph., Larpent J-P., Reymond P.,
Sanglier J-J., Vayssier Y. and Veau R. (1990). Moisissures utiles et nuisibles :
importance industrielle. Édition Masson, Paris.
Cabrera F., Lopez R., Martinez-Bourdiu E., Dupuy De Lome E., Murillo J.M. (1996)
Land treatment of olive oil mill wastewater.International Biodegradation and
Biodeterioration, 38, 215-225p.
Camille D. (2014). Pratique en microbiologie de laboratoire : Recherche de bactéries etde
levures-moisissures. 3 Ed : Lavoisier, Paris. ISBN : 978-2-7430-1565-7. P 610-597p.
Capasso R. (1997). The chemistry, biotechnology and ecotoxicology of the
polyphénolsnaturally occurring in vegetable wastes.Curr.Top.Phytochem., Res. Trends, 1,
145-156p.
Capasso R., De Martino A., Cristinzio G. (2002b) Production, characterization, and
effectson tomato of humic acid-like polymerin metal derivatives from olive oil mill waste
waters. JAgric Food Chem., 50 (14), 4018-24p.
Cardinali A., Cicco N., Linsalata V., Minervini F., Pati S. &Pieralice M.
(2010).Compounds in the phenolic fraction of olive oil.Clinical Chemistry, 46, 976-988p.
Casa R., D'Annibale A., Pieruccetti F., Stazi S.R., GiovannozziSermanni G.,Lo Cascio B.
(2003) Reduction of the phenolic components in olive-mill wastewater by anenzymatic
Références bibliographique
51
treatment and its impact on durum wheat (Triticum durum Desf.) germinability.Chemosphere,
50 (8), 959-66p.
COI. (2015). Statistique de la production d’huile olive. Novembre 2015.
Dermeche S., Nadour M., Larroche C., moulti-mati F. andMichaud P. (2012). Olive
mill wastes : Biochemical characterizations andvalorisatio strategies. Process
Biochemistry.,48 :1532-1552p.
Dermeche, S., Nadour, M., Larroche, C., Moulti-Mati, F. & Michaud, P. (2013).Olive
millwastes: Biochemical characterizations and valorization strategies. Process Biochemistry,
48,1532-1552p.
Di-Giovacchino L., Mascolo A., Seghitti L. (1988) Sullecaractteristiche telle delle acque
divegetazione delle olive. La Rivista delle Sotanze Grasse. 65p.
De Felice, B., Pontecorvo, G., Carfagna, M., Acta Biotechnol 17(1997) 231p.
De Villers Juliette., Squilbin Marianne., Yourassowsky Catherine. 2005. Fiche 2
del'IBGE(Institut Bruxellois pour la Gestion de l'Environnement ) : "L'eau à Bruxelles"
DiamonetF., 2002.- Dictionnaire Larousse médicale. pp : 831p.
Di Serio M. G., Lanza B., Mucciarella M. R., Russi F., Iannucci E., Marfisi P. etMadeo
A., 2008. Effects of olive millwastewaterspreading on the physico-chemical
andmicrobiologicalcharacteristics of soil. International Biodeterioration and Biodegradation.
62:403-407p.
El Hajjouji H, Fakharedine N, Baddi G.A, Winterton P, Bailly J.C, Revel J.C et Hafidi
M. (2007). Treatmentof olive mill waste water by aerobic biodegradation: an analytical study
using gel permeation chromatography, ultraviolet-visible and fourier transforme infrared
spectroscopy. Bioresource Technology. 98: 3513-3520p.
Eroglu E., Eroglu I., Gunduz U. &Yucel M. (2009). Treatment of olive mill
Références bibliographique
52
wastewater by different physicochemical methods and the utilization of their liquid effluents
for biological hydrogen production. Biomass Bioenerg, 334, 701–5p.
Fadil K., Chahlaoui A., Ouahbi A., Zaid A., Borja R. (2003) Aerobic biodegradation and
detoxification of wastewaters from the olive oil industry. International biodeterioration&
biodegradation, 51, 37-41.
Fenice M., GiovannozziSermanni G., Federici F., D'Annibale A. (2003) Submerged and
solid-state production of laccase and Mn-peroxidase by Panustigrinuson olive mill
wastewater-based media. J Biotechnol, 100 (1), 77-85
Fiestas Ros de Ursinos J.A., Borja R. (1992). Use and treatment of olive mill
Wastewater : Current situation and prospects in Spain. Grasas y Aceites, 2 : 101-106.
Fiorentino F., Garofalo A., De Santi G., Bono., G.B.GiustoG.Norrito (2003) Spatio-
temporel distribution of recruits (o group) of Merluccius and Phycisblennoides (Pisces ;
Gadiformes) in the Strait of Sicily (Central Mediterranean). Hydrobiologie 503 :223-236p.
Francesco G.L. (1993). Evaluations économiques sur l’innovation technologique.
Lesproblèmes de l’environnement dans le lecteur oléicole en Italie. Olivae, 47, 15-20p.
Galanakis C.M., Tornberg E. & Gekas V. (2009). Dietary fiber suspensions from olive
millwastewater as potential fat replacements in meatballs. LWT- Food SciTechnol, 1–
8.GalanakisC. M.., Tornberg E. and Gekas V. (2010). A study of therecovery of the dietary
fibres from olive mill wastewater and the gelling ability ofthe soluble fibre fraction. LWT -
Food Sci. and Techn., 43 : 1009-1017.
Garcia Garcia I, Jimenez Pena PR, Bonilla Venceslada JL, Martin Martin A, Martin
Santos MA, Ramos Gomez E.(2000) Removal of phenol compounds from olive
Références bibliographique
53
millwastewater using Phanerochaetechrysosporium, Aspergillusniger, Aspergillusterreusand
Geotrichumcandidum. Process Biochem, 1, 35 (8), 751-758p.
GarridoHoyos S.E., MartinezNieto L., CamachoRubio F., RamosCormenzana A.
(2002)Kinetics of aerobic treatment of olive-mill wastewater (OMW) with Aspergillusterreus.
Pro.Biochem.,37, 1169-1176p.
Gharsallah N. (1993) Production of single cell protein from olive mill wastewater by
yeasts.Environ. Technol., 14, 391-395p.
Gharsallah N., Labat M., Aloui F., Sayadi S. (1999) the effect of
Phanerochaetechrysosporium pretreatment of olive mill wastewaters on anaerobic digestion.
RessourcesConservation and recycling, 27, 187-192p.
Guezlane-Tebibel N., Kahlouche B.,Athmani- Guemouri S .(2015) Microbilogie travaux
pratique 7 éme
édition 34p .
Hamdi M. (1991a) Nouvelle conception d’un procédé de dépollution biologique des
margines, effluents liquides de l’extraction de l’huile d’olive, Thèse de l’université de
Provence. Marseille, France.
Hamdi M. (1993a) Future prospects and constraints of alive mill waste waters use
andtreatment : A. Review. Bioprocess Engineering, 8, 209-214p.
Hamdi M. (1993c) Valorisation et épuration des effluents des huileries d’olives: l’utilité de
lamicrobiologie industrielle. Olivae, 46, 20-24p.
Hamdi M., Garcia J.L., Ellouz R. (1992) Integrated biological process for olive millWaste
waters treatment. Bioprocess.Eng., 8, 79p.
Hamdi M., Ellouz P. (1993) Treatment of detoxified olive mill wastewater’s by
anaerobicfilter and aerobic fluized bed processes. Environ. Technol., 14, 183-188p.
Hazzit, M. (2008). Etude de la composition chimique des huiles essentielles de différentes
Références bibliographique
54
espèces de thym et d’origan poussant en Algérie. Thèse de doctorat, Université des Sciences
etde la Technologie Houari Boumediene, Faculté de Chimie, Algérie, 204 p.
J.A.Fiestas Ros de Ursinos ; Différentes utilisations des margines. Actes du Séminaire
International sur la valorisation des sous-produits de l’olivier. Organisation des Nations Unies
pour l’Alimentation et l’Agriculture (FAO), Tunisie (1981), 93-110p.
JOFFIN J. N. et LEYRAL G., (2006). Microbiologie technique, Tome1 : Dictionnaire des
techniques, 4ème édition. Edition CRDP d’aquitaire. 368p.
Kapellakis L. E., Tsagarakis K. P., Crowther J. C. (2008). Olive oil history,production
and by-product management. Review in enviremental science biotechnology, 7(1),1-26p.
Karapinar M, Worgan M.J.T, (1989). Bioprotein production from the waste products
ofolive oil extraction,J. Chem. Tech. Biotechnol, 33, 185-188p.
Kissi M., Mountadar M., Assobhei O., Gargiulo E., Palmieri G., Giardina P., Sannia G.
(2001) Roles of two white-rot basidiomycete fungi in decolorisation and detoxification of
olive mill waste water. ApplMicrobiolBiotechnol., 57 (1-2), 221-6p.
Klibanov A.M., Tu T.M., Scott K.P. (1983) Peroxidase catalysed removal of phenols from
coal-conversion waste water’s. Science, 22, 259-261p.
Leger C.L., Kadiri-Hassani N., Descomps B. (2000) Decreased superoxide anion
production in cultured human promonocyte cells (THP-1) due to polyphenol mixtures from
olive oil processing wastewaters. J Agric Food Chem., 48 (10), 5061-7p.
Références bibliographique
55
Levy E., Eyal Z., Chet I etHochman A. (1992).Resistance mechanisms of Septoriatritici to
antifungal products of Pseudomonas. Physiol. Mol. Plant Pathol. 40:163-71p.
Levis-Menzi R., Raffaldi R., Saviozzi A., Cardelli R. (1995) Decomposition
ofanaerobically digested olive mill sludge, Environmental. Science, 7, 1411-1422p. Lutwin
B, Fiestas Ros De Ursinos J A, Geissen K, Kachouri M, Klimm E, DeLadordeMonpezat
G, Xanthoulis D, (1996). Les expériences méditerranéennes dans letraitement et
l’elimination des eaux residuaires des huileries d’olives, Edition (GTZ) Gmbh,Eschborn,
RepubliqueFederale d’Allemagne.
Morillo J. A., Antizar-Ladislao B., Monteoliva-Sánchez M., Ramos-Cormenzana A.,
Russell N. J. 2009.Bioremediation and biovalorisation of olive-millwastes.
AppliedMicrobiololgyBiotechnolology, 82 : 25–39p.
Martinez-Garcia G., Bachmann R.T., Williams C.J., Burgoyne A., Edyvean
R.G.J.(2006).Olive oilwaste as a biosorbent for heavymetals.InternationalBiodeterioration
etBiodegradation, 58, 231-238p.
Metahri M.S. (2012). Elimination simultanée de la pollution azotée et phosphatée des
eaux usées Traitées, par des procédés mixtes. Cas de la STEP Est de la ville de Tizi-Ouzou.
Thèse de Doctorat. Université Mouloud Mammeri. 148p.
Minzi, R., Saviozzi A., Riffaldi R., Falzo L. (1992). Lo smaltimento in
campodelleacquedivegetazione. Effettisulleproprieta` de l terreno.Olivae. 40: 20-25p.
Mébirouk M. (2002) Rejets des huileries, développement d'un procédé intégré pour la
biodégradation des polyphénols dans les margines .CMPP NEWS n°1.
Mendil, M., 2009. L’oléiculture: Experiences algériennes. Filaha Innove 4, 6, 23p.
Michaud P. (2012). Olive millwastes : Biochemicalcharacterizations and
valorisatiostrategies. ProcessBiochemistry., 48 :1532-1552p.
Monties B. (1980) Les polymères végétaux. Gautier-Villars (eds).
Références bibliographique
56
MorilloJA ,Antizar-Ladislao B., Monteoliva-Sa´Nchez M., Ramoscormenzana A.,
Russell NJ. (2009). Bioremediation and biovalorisation of olive mill wastes.
ApplMicrobiolBiotechnol, 82:25–39p.
Mouncif M., Tamoh S., Faid M., Achkari-Begdouri A. (1993a). A study of chemicaland
microbiological characteristics of olive mill waste water in Morocco.Grasas y Aceites,44,
335-338p.
Madigan M., Martinho J. (2007). Brock : Biologie des micro-organismes. 11ème édition,
Pearson Education, Paris.
Nefzaoui A. (1984). Importance de la production oléicole et des sous-produits del'olivier. In
: Etude de l'utilisation des sous-produits de l'olivier en alimentation animale enTunisie. Étude
FAO production et santé animales 43, Rome. Nefzaoui A. (1987).
Contribution à la rentabilité de l’oléiculture par la valorisationoptimale des sous-produits,
séminaire sur l’économie de l’olivier. Tunis, 20-22 Janvier.Science et Technique, Olivaen° :
19.
Nefzaoui A. (1991). Valorisation des sous produits de l’olivier. Optionméditerranéennes.
Série n 16 : 101-108p.
Niaounakis M, Halvadakis CP (2004) Olive millwaste management. Literature
ReviewandPatent Survey.Typothito-George Dardanos. Athens, Greece, pp xiv, 430p.
Niaounakis M., Halvadakis C.P. 2006. Olive processing waste management: literature
review and patent survey, second ed. Elsevier, Amsterdam.
ObiedH., Allen M., Bedgood D., Prenzler P., Robards K. andStockmannR. (2005).
Bioactivity and analysis of biophenols recovered fromolive mill waste. J. of agrical. Food
Chem., 53: 823-837p.
Références bibliographique
57
Oukili O., Chaouch M., Rafiq M., Hadji M., Hamdi M., Benlemlih M. (2001) Bleaching
of olive mill wastewater by clay in the presence of hydrogen peroxyde. Ann. Chim. Sci. Mat.
26, 45-53p.
Pozo C., Martinez-Toledo M.V., Rodelas B., Gonzalez-Lopez J. (2002) Effects of culture
conditions on the production of polyhydroxyalkanoates by AzotobacterchroococcumH23 in
media containing a high concentration of alpechin (wastewater from olive oil mills) as
primary carbon source. J. of Biotechnology, 97, 125-131p.
Rodier J. (1984). L’analyse de l’eau eaux naturelles, eaux de mer, 7éme édition
Dunod,Rordas Paris, France, 1365p.
Rodier J., Legube B., Merlet N. (2009). L’analyse de l’eau, 9ème Ed, DUNOD, Paris.
1525p.
Ribéreau-Gayon P. (1968). Les composés phénoliques des végétaux, Facultad de
Agronomía. Dunod. París.254p.
Rodier J., 1959, « L'analyse de l'eau », édition DUNOD, Paris.
Ramos-Cormenzana A. (1986) Physical, chemical, microbiological and biochimical
characteristics of vegetation water. In: Inter. Symp.: On olive by-products valorization.
Sevilla-Spain.41-60p.
Ranalli A. (1991a) The effluent from olive mills: Proposals for re-use and purification with
reference to Italian legislation. Olivae, 37 , 30-39p.
Ranalli A. (1991). The effluent from olive mills: Proposals for re-use and purification with
reference to Italian legislation. Olivae, 39, 26-40p.
Rožman,T., Jeršek, B.(2009).Antimicrobial activity of rosemary extracts (Rosmarinusofficinalis
L).against different species of Listeria. ActaagriculturaeSlovenica, 93(1), pp.51-58.In Kehal, F.
2013. Utilisation de l’huile essentielle de Citrus limon comme agent conservateur et aromatique
dans la crème fraîche. Mémoire de magister. Université Mentouri Constantine.Algérie, 93p.
Références bibliographique
58
SALVEMINI F. (1985) Composizionechimica e valutazionebiologica di
unmangimeottenutoessicandotercamente le acque di vegetazionedelle olive. Riv. Delle
SostanzeGrasse, 112 : 559-564p.
SANCOUCY R. (1984). Utilisation des sous-produits de l'olivier en alimentation
animaledans le bassin Méditerranéen. Étude FAO Production et santé animale Synthèse no.
43FAO Pub Rome.
Sayadi S., Ellouz R. (1992) Decolouration of olive mill wastewaters by the white-rot
fungusPhanerochaetechrysosporiuminvolvement of the lignin-degrading system. Appl.
Micrbiol.Biotechnol.,37, 813-817p.
Sayadi S., Ellouz R. (1995) Role of lignin peroxidase and manganese peroxidase
fromPhanerochaetechrysosporiumin the decolorization of olive mill waste-waters. Applied
andEnvironmental Microbiology, 61, 1098-1103p.
Sayadi S., Allouche N., Jaoua M., Aloui F. (2000) Detrimental effects of high
molecularmass polyphenols on olive mill wastewater biotreatment, Process Biochemistry, 35
(7), 725-73p5.
SINGLETON P., (1999), Bactériologie, Edition Duonod 4ème édition Paris. 415p.
Sbai G., Loukli M.,2015. traitement électrochimique des margines et identification
descomposes avant et apres traitement par chromatographie en phase gazeuse couplée
parspectroscopie de masse. Larhyss Journal. 22 : 139-152p.
Tekfi K, 2006, « étude des performances épuratoires d’une station d’épuration des boues.
activées », mémoire pour l’obtention de diplôme de DEUA. Option traitement et épuration de
l’eau, département hydraulique, université Tlemcen.
Tanchev S., Joncheva N., Genov N., Codounis M. (1980) Identification of anthocyanins
contained in olives. GeorgikeEreuna, 4, 5-73p
Références bibliographique
59
Thierry E. (1997). Les infections microbiennes. Eds. Nathan, Paris, (1), P : 128. -
TORTORA G .J., FUNKE B.R. et CASE C. L., (2003).Introduction à lamicrobiologie. Ed.
de Renouveau pédagogique Inc. pp : 157- 355p.
Tsagariki E., Harris N., Lazarides et Konstantinos B. P. (2007). Olive mill wastewater
treatment.Sprigerlink, 133-157p.
Tsioulpas A., Dimou D., Iconomou D., Aggelis G.(2002) Phenolic removal in olive
millwastewater by strains of Pleurotus spp. In respect to their phenol Oxidase (laccase)
activity.BioresourceTechnology, 84, 251-257p.
Vazequez R.A. (1978) Les polyphénols de l’huile d’olive et leur influence sur les
caractéristiques de l’huile, Revue française des corps gras, 25 (1), 21-26.
www.google dz.com
ZahariA., Tazi A., Azzi M. (2014). Optimisation des conditions de traitement desmargines
par un superoxydant K3FexMnyO8 [Optimization of treatment conditions ofOlive Oil Mill
Wastewater by superoxidant K3FexMnyO8] .J. Mater. Environ. Sci., 5 (2)484-489p.
Zenjari B., Hafidi M., El Hadrami Bailly J.P., Nejmeddine A. (1999). Traitement
aérobie des effluents d’huilerie par les micro-organismes du sol. Agrochimica, 43(5/6), 277p.
Annexe
Milieux de cultures utilisées pour l’étude microbiologique
● Gélose nutritive ordinaire
- Peptone 10 g/l
- Extrait de viande 5 g/l
- Chlorure de sodium 5 g/l
- Agar-agar 15 g/l
- pH 7,2
Le milieu est stérilisé à 120 °C pendant 20 min
● Gélose Chapman.
- Tryptone 5g/l
- Extrait de levure 3g/l
- Extrait de viande 3g/l
- Chlorure de sodium 70g/l
- Peptone Bactériologique 10g/l
- Mannitol 10g/l
- Rouge de Phénol 0,05g/l
- Agar: 7,4±0,1
Stérilisé à 120°C pendant 20 min.
● Milieu mannitol mobilité
- Peptone 20g
- Gélose 4g
- Mannitol 2g
- Rouge de phénol 0,04g
- Nitrate de potassium 1g
- pH 8,1
Le milieu est réparti dans des tubes à essais, stérilisé à 120 °C durant 15 min.
● Milieu Clarck et Lubs
- Peptone thropsine de caséine 5g/l
- Glucose 5g/l
- Phosphate bipotassique 5g/l
Répartir en tube à raison de 5 ml par tube.
Stériliser à 115° C pendant 20 mn.
Annexe
● Bouillon Nitrate réductase
- Infusion coeur-cervelle 25,0 g/l
- Nitrate de sodium 10,0 g/l
● Milieu TSI
- Agar 12g/l
- Extrait de boeuf 3g/l
- Extrait de levure 3g/l
- Peptone 20g/l
- Lactose 10g/l
- Saccharose 10g/l
- NaCl 5g/l
- Glucose 1g/l
- Citrate ferrique 3g/l
- Thiosulfate de sodium 3g/l
- Rouge de phénol 0.025g/l
- pH 7.4
Stériliser à 120°C pendant 20min.
● Citrate de Simmons
- Chlorure de sodium 5g/l
- Sulfate de magnésium7420 0.2 g/l
- Phosphate d’ammonium PO2H2 1g/l
- Phosphate dipotassique PO4HK2 2g/l
- Citrate trisodique 2 g/l
- Solution de bleu bromothymol 8g/l
- Agar 15 g/l
- pH 7-7,2.
Répartir en tube à raison de 7 ml par tube et Stériliser à 120°C pendant 30 min.
● Muller Hinton
- Extrait de viande 3g/l
- Hydrolysat acide de caséine 17,5g/l
- Amidon 1,5g/l
- Agar 16g/l
- pH 7,3
Stérilisé à 120°C pendant 20 min.
Annexe
● Milieu Oxytétracycline Glucose Agar (O.G.A)
-Extrait de levure 5g
-Glucose 20 g
-Agar 16g
-Eau distillée 1000ml
-pH 6,8-7
Stériliser 20 min à 120°C
Ajouter au milieu refroidi à 50°C une solution d’Oxytétracycline (terramycine). La
concentration en Oxytétracycline doit être de 0 ,10 mg/ml de milieu de culture. Incubation ;
20à 25°C pendant 2 à 5 jours.
Milieu d’identification de levure
● Milieu eau de levure
-Extrait de levure 5g
-Eau distillée 1000 ml
Ajuster à pH 7
Stériliser 20min à 120°C
● Eau physiologique :
-Chlorure de sodium 8,5g
-Eau distillée 1000ml
Stériliser après mélanger à l’autoclave pendant 15 minutes à 120 °C
● Eau peptone exempte d’indole
-Chlorure de sodium 5g
-Peptone exempte 10g
-PH 7.2
Résumé
Abstract
The physicochemical characterization of the vegetable waters, which comes from the
modern industrial unit of trituration of olives by three-phase centrifugation, of the region of
Ghardaia, has shown that this effluent is too much loaded with organic matter evaluated in
terms of COD (1300 mg O2 / 1). It is also characterized by an acidic pH (4.8) and a high level
of phenolic compounds (2.2 μg / ml).
The microbiological study of these vegetable waters has made it possible to isolate three
Gram-positive bacterial strains (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and
Bacillus subtilis) and five types of fungi (Penicillium sp, Aspergillus niger, Aspergillus
ochraceus, Aspergillus fumigatus and Penicillium chrysogenum), and a single species of yeast
Saccharomyces cerevisiae.
Liquid-liquid extraction was performed using ethyl acetate. Assays for total polyphenols
were determined by the Folin-Ciocalteu method. Antibacterial activity was determined by the
agar diffusion method against strains isolated from vegetable waters. Unlike clinically
sensitive bacteria that were sensitive to varying degrees of phenolic extracts, we were able to
show that our strains are resistant to phenolic compounds.
Key words: Margines, 3-phase extraction, polyphenols, antibacterial activity, molds, yeasts,
isolation.
Nom et Prénom : Lamraoui Imane
Nom et Prénom : Kaddour Ilham
Date de soutenance : 18/06/2018
Diplôme de master en microbiologie appliquée
Intitulé
Caractérisation microbiologique biochimique d’une eau de végétation (margine)
Résumé :
La caractérisation physico-chimique des margines qui provient de l’unité industrielle
moderne de trituration d’olives par centrifugation à trois phases, de la région de
Ghardaïa, a montré que cet effluent est trop chargé en matières organiques évaluées
en terme de DCO (1300 mg O2/l.). Il est caractérisé aussi par un pH acide (4.8) et un
taux élevé en composés phénoliques (2,2 ug/ml).
L’étude microbiologique de ces margines a permis d’isoler trois souches
bactérienne Gram positif (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis et
Bacillus subtilis) et cinq types de champignons (Penicillium sp , Aspergillus niger,
Aspergillus ochraceus , Aspergillus fumigatus et penicillium chrysogenum), et une
seule espèce de levure Saccharomyces cerevisiae.
Une extraction liquide-liquide a été effectuée, en utilisant l’acétate d’éthyle. Les
dosages des polyphénols totaux ont été déterminés par la méthode de Folin-Ciocalteu.
L’activité antibactérienne a été déterminée par la méthode de diffusion sur gélose vis-
à-vis des souches isolées à partir des margines. Contrairement aux bactéries d’origine
clinique qui étaient sensibles aux extraits phénoliques à des degrés variables, nous
avons pu montrer que nos souches sont résistantes aux composés phénoliques.
Mots clés : Margines, extraction à 3-phases, polyphénols, activité antibactérienne,
moisissures, levures, isolement
Devant les membres de jury :
Président : ZOUAINIA Sabrina M.C.B. Univ. Oum EL Bouaghi.
Rapporteurs : ARHAB RABAH. Pr. Univ. Oum EL Bouaghi.
Examinateur :MEDJOUDJ Hacene. M.C.B. Univ. Oum EL Bouaghi.