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Développement d’un outil génétique pour
Brevibacterium aurantiacum et analyse génomique
comparative de souches laitières
Mémoire
Sébastien Levesque
Maîtrise en microbiologie
Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
© Sébastien Levesque, 2018
Développement d’un outil génétique pour
Brevibacterium aurantiacum et analyse génomique
comparative de souches laitières
Mémoire
Sébastien Levesque
Sous la direction de :
Sylvain Moineau, directeur de recherche
iii
RÉSUMÉ
Brevibacterium aurantiacum est une actinobactérie qui confère des propriétés
organoleptiques clés aux fromages à croûte lavée lors de l’affinage. Malgré son importance
industrielle, il n’existe aucun outil génétique disponible pour la modification génétique de
cette espèce et seulement deux génomes complets sont disponibles à l’heure actuelle.
L’acquisition de connaissances fondamentales sur le répertoire des gènes de cette espèce et
sur leurs fonctions est primordiale pour comprendre son rôle dans l’affinage des fromages à
croûte lavée.
Lors de ce projet de maîtrise, 12 plasmides et quatre vecteurs synthétiques ont été utilisés
pour transformer six souches laitières de B. aurantiacum et une souche de B. linens dans le
but d’adapter l’outil génétique CRISPR-Cas9 pour ces actinobactéries. Différents
protocoles de préparation de cellules électrocompétentes et de transformation par
électroporation ont été testés, mais il a été impossible de transformer les souches
bactériennes à l’étude. Les actinobactéries du genre Brevibacterium sont donc récalcitrantes
à la transformation génétique.
Dans un second temps, nous avons séquencé six génomes additionnels de Brevibacterium
et nous avons effectué des analyses génomiques comparatives avec les génomes publics.
Nos analyses phylogénétiques ont révélé que les souches laitières précédemment
considérées comme membres de l’espèce B. linens appartiennent en fait à l’espèce B.
aurantiacum, mettant en évidence l’importance de cette espèce dans la production
fromagère. Les génomes de B. aurantiacum sont composés de 2612 gènes de cœur et
possèdent un pangénome ouvert atteignant jusqu’à 6259 gènes. Les génomes étudiés sont
riches en éléments d’ADN mobiles et des transferts horizontaux de gènes (HGT) entre
diverses actinobactéries d’affinage des fromages ont été observés chez tous les génomes de
B. aurantiacum. Nos analyses génomiques comparatives apportent de nouvelles
informations sur l’évolution et l’adaptation de B. aurantiacum à l’écosystème des
fromages.
iv
ABSTRACT
Brevibacterium aurantiacum is an orange-pigmented actinobacterium that confers key
organoleptic properties to washed-rind cheeses during surface ripening. To date, only two
complete and assembled genomes of B. aurantiacum are available and there is currently no
genetic tool available to study this industrially relevant species. The acquisition of
fundamental knowledge on the gene repertoire of this species and their functions is
essential to understand its evolution and its role in cheese ripening.
In this study, 12 plasmids and 4 synthetic vectors were used to transform 6 B. aurantiacum
dairy strains and one B. linens strain in the aim of adapting CRISPR-Cas9 tool for these
bacterial species. Different electrocompetent cell preparation and electroporation methods
were tested to transform various Brevibacterium strains, but no transformants were
recovered with all the experiments. Therefore, it seems that Brevibacterium strains are
recalcitrant to genetic transformation.
We sequenced six additional genomes of Brevibacterium and performed phylogenetic and
pan-genome analyses. Our phylogenetic analysis revealed that cheese isolates, previously
identified as B. linens, belong to the B. aurantiacum species, making this species a key
player in cheese production. B. aurantiacum genomes are composed of 2612 core genes
with an open pan-genome reaching now 6259 genes. Horizontal gene transfers (HGT)
between cheese actinobacteria were observed in all B. aurantiacum genomes. HGT regions
involved in iron acquisition were found in five B. aurantiacum genomes, which suggests
cooperative evolution between smear-ripened cheese actinobacteria. Our comparative
genomic analysis provides novel insights into the evolution and the adaptation of B.
aurantiacum to the cheese ecosystem.
v
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ .............................................................................................................................. iii
ABSTRACT ......................................................................................................................... iv
TABLE DES MATIÈRES ................................................................................................... v
LISTE DES FIGURES ....................................................................................................... vii
LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................. viii
LISTE DES ABRÉVIATIONS ........................................................................................... ix
REMERCIEMENTS .......................................................................................................... xii
AVANT-PROPOS ............................................................................................................. xiii
1. CHAPITRE 1 : INTRODUCTION ................................................................................. 1
1.1 Fromage à croûte lavée ............................................................................................... 1
1.1.1 Ferment lactique ..................................................................................................... 1
1.1.2 Ferment d’affinage ................................................................................................. 3
1.1.3 Pression de sélection .............................................................................................. 4
1.2 Brevibacterium ............................................................................................................. 5
1.2.1 Brevibacterium aurantiacum ................................................................................. 6
1.3 Problématique ............................................................................................................. 8
1.3.1 Les bactériophages ............................................................................................... 10
1.3.2 Mécanismes de résistance aux bactériophages .................................................... 11
1.4 Outils génétiques ....................................................................................................... 14
1.4.1 Transformation et outils génétiques pour Brevibacterium spp. ........................... 14
1.4.2 Transformation et outils génétiques pour les actinobactéries .............................. 15
1.4.3 CRISPR-Cas9 ....................................................................................................... 16
1.4.4 CRISPR-Cas9 chez les actinobactéries ................................................................ 19
1.5 Génomique des bactéries laitières ........................................................................... 19
1.5.1 Éléments d’ADN mobiles .................................................................................... 21
1.5.2 Métagénomique des fromages ............................................................................. 24
1.6 Hypothèses et objectifs de recherche ....................................................................... 26
2. CHAPITRE 2 : TRANSFORMATION GÉNÉTIQUE ............................................... 28
2.1 Matériel et méthodes ................................................................................................. 28
2.1.1 Souches bactériennes et conditions de culture ..................................................... 28
2.1.2 Plasmides utilisés et extraction ............................................................................ 28
2.1.3 Séquençage du plasmide pBLA8 ......................................................................... 31
2.1.4 Tests de résistance aux antibiotiques ................................................................... 31
2.1.5 Transformation par électroporation...................................................................... 32
2.1.6 Propagation et titration des lysats de phages........................................................ 35
2.1.7 Extraction de l’ADN génomique des phages ....................................................... 36
2.1.8 Électroporation de l’ADN génomique des phages ............................................... 37
2.1.9 Construction de vecteurs par assemblage Gibson ............................................... 37
2.1.10 Optimisation des codons du gène de résistance à la kanamycine ..................... 41
2.2 Résultats et discussion .............................................................................................. 41
2.2.1 Profil plasmidique de B. aurantiacum ................................................................. 41
2.2.2 Résistance aux antibiotiques ................................................................................ 42
2.2.3 Caractérisation du plasmide pBLA8 .................................................................... 43
2.2.4 Transformation des plasmides ............................................................................. 44
vi
2.3 Conclusion ................................................................................................................. 48
3. CHAPITRE 3 : GÉNOMIQUE COMPARATIVE ..................................................... 49
3.1 Résumé de l’article scientifique ............................................................................... 49
3.2 Abstract ...................................................................................................................... 51
3.3 Importance ................................................................................................................. 51
3.4 Introduction ............................................................................................................... 52
3.5 Results ........................................................................................................................ 54
3.5.1 Taxonomic analysis of B. linens and B. aurantiacum .......................................... 54
3.5.2 General genome features and plasmid content..................................................... 56
3.5.3 Carotenoid biosynthesis ....................................................................................... 58
3.5.4 Core-genome and pan-genome ............................................................................ 58
3.5.5 Mobile genetic elements ...................................................................................... 61
3.5.6 Insertion sequences .............................................................................................. 61
3.5.7 Composite transposon .......................................................................................... 63
3.5.8 Horizontal gene transfer region ............................................................................ 64
3.5.9 Transcriptional regulators .................................................................................... 66
3.5.10 Iron uptake and siderophore synthesis ............................................................... 68
3.5.11 Brevibacterium Lanthipeptide Island (BreLI) .................................................... 69
3.6 Discussion ................................................................................................................... 71
3.7 Conclusions ................................................................................................................ 73
3.8 Materials and Methods ............................................................................................. 73
3.8.1 Bacterial strains and DNA sequencing ................................................................ 73
3.8.2 General genome features prediction..................................................................... 74
3.8.3 Phylogenetic analysis of B. linens and B. aurantiacum ....................................... 74
3.8.4 Insertion sequence and HGT identification.......................................................... 75
3.8.5 Core and pan-genome analyses ............................................................................ 75
3.8.6 PCR testing of BreLI chromosome excision ........................................................ 76
3.9 Declarations ............................................................................................................... 76
4. CHAPITRE 4 : PERSPECTIVES ................................................................................ 78
RÉFÉRENCES ................................................................................................................... 80
ANNEXE ............................................................................................................................. 99
vii
LISTE DES FIGURES
Figure 1.1 Voie métabolique de biosynthèse des caroténoïdes chez B. aurantiacum ............ 7
Figure 1.2 Fromage à croûte lavée avec et sans défaut d’affinage ......................................... 9
Figure 1.3 Morphologie du bactériophage BI2 observé par microscopie électronique.......... 9
Figure 1.4 Cycle de réplication des bactériophages ............................................................. 11
Figure 1.5 Étapes du cycle de réplication des bactériophages qui peuvent être ciblées par
divers mécanismes de défense .............................................................................................. 12
Figure 1.6 Édition génomique avec CRISPR-Cas9 .............................................................. 18
Figure 1.7 Mécanismes de transfert d’éléments d’ADN mobiles chez les procaryotes ....... 22
Figure 2.1 Assemblage Gibson de deux fragments d’ADN ................................................. 38
Figure 2.2 Représentation schématique de la construction du vecteur d’expression pBLA8-
123 ........................................................................................................................................ 40
Figure 2.3 Représentation schématique du gène synthétique de résistance à la kanamycine
aux codons optimisés développés sur mesure pour B. aurantiacum .................................... 41
Figure 2.4 Profil plasmidique des souches de B. aurantiacum ............................................ 42
Figure 2.5 Carte du plasmide natif pBLA8 de B. linens ATCC 19391 ................................ 44
Figure 3.1 Phylogenetic tree of 35 Brevibacterium spp. 16S rRNA nucleotide sequences . 55
Figure 3.2 Pan-genome analysis of B. aurantiacum. ............................................................ 59
Figure 3.3 Brevibacterium Insertion Sequences (ISBli1-ISBli35) ....................................... 62
Figure 3.4 Schematic representation of the iron uptake composite transposon identified in
B. aurantiacum SMQ-1335 and FR22 .................................................................................. 64
Figure 3.5 Schematic representation of HGT regions identified in Brevibacterium genomes
.............................................................................................................................................. 65
Figure 3.6 Functional classification of B. aurantiacum horizontally transferred genes ...... 66
Figure 3.7 PCR amplification of B. aurantiacum SMQ-1417 BreLI ................................... 71
viii
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1.1 Classification des bactéries lactiques utilisées comme ferment primaire ou
aromatique .............................................................................................................................. 3
Tableau 1.2 Sommaire des 24 principaux OTUs provenant de l’analyse métagénomique des
croûtes de 137 fromages affinés ........................................................................................... 24
Tableau 2.1 Liste des souches bactériennes utilisées lors de cette étude ............................. 28
Tableau 2.2 Liste des plasmides utilisés ............................................................................... 29
Tableau 2.3 Sommaire des modifications apportées à la méthode standard et testées pour les
transformations ..................................................................................................................... 33
Tableau 2.4 Composition minérale des eaux commerciales utilisées pour les
transformations ..................................................................................................................... 34
Tableau 2.5 Comparaison des différents protocoles de transformation ............................... 35
Tableau 2.6 Liste des amorces utilisées pour la construction de vecteurs par assemblage
Gibson ................................................................................................................................... 40
Tableau 2.7 Sensibilité des souches de Brevibacterium aux différents antibiotiques utilisés
comme marqueur de sélection lors des transformations génétiques ..................................... 43
Table 3.1 Brevibacterium sp. strains used in this study ....................................................... 56
Table 3.2 General genome features of B. aurantiacum and B. linens ................................. 57
Table 3.3 List of primers used for the amplification of BreLI ............................................. 76
ix
LISTE DES ABRÉVIATIONS
A Adénine
Abi Avortement de l’infection (Abortive Infection)
ADN Acide désoxyribonucléique
ARN Acide ribonucléique
BHI Infusion cœur-cerveau (Brain Heart Infusion)
BIM Mutant résistant au bactériophage (Bacteriophage-Insensitive Mutant)
BLAST Outil de recherche d’alignement local de base (Basic Local Alignment
Search Tool)
BreLi Îlot génomique de synthèse de lanthipeptide de Brevibacterium
(Brevibacterium Lanthipeptide Island)
BREX Exclusion des bactériophages (Bacteriophage Exclusion)
C Cytosine oC Degré Celsius
Cas Associé à CRISPR (CRISPR associated)
CDS Séquence codante (Coding Sequence)
CO2 Dioxyde de carbone
CRISPR Regroupement de courtes régions palindromiques régulièrement espacées
(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
CRISPRi Interférence par CRISPR (CRISPR interference)
crRNA ARN CRISPR (CRISPR RNA)
Dam Méthyltransférase modifiant l’adénine (DNA adenine methyltransferase)
dCas9 Protéine Cas9 ayant perdu son activité endonucléase (Dead Cas9)
Dcm Méthyltransférase modifiant la cytosine (DNA cytosine methyltransferase)
DO600 Densité optique à 600nm
EB Tampon d’élution (Elution Buffer)
G Guanine
HDR Réparation par homologie dirigée (Homology Directed Repair)
HGT Transfert horizontal de gènes (Horizontal Gene Transfer)
HR Recombinaison homologue (Homologous Recombination)
ICEs Éléments intégratifs conjugatifs (Integrative Conjugative Elements)
IS Séquence d’insertion (Insertion Sequence)
Kb Kilopaire de base
LB Bouillon de lysogénie (Lysogeny Broth)
µg Microgramme
µl Microlitre
mg Milligramme
ml Millilitre
NaCl Chlorure de sodium
NCBI Centre national pour l’information en biotechnologie (National Centre for
Biotechnology Information)
NHEJ Jonction d’extrémités non homologues (Non-homologous End Joining)
ng Nanogramme
ORF Cadre de lecture ouvert (Open Reading Frame)
OTU Unité taxonomique opérationnelle (Operational Taxonomic Unit)
x
PAM Motif adjacent au proto-espaceur (Protospacer Adjacent Motif)
pb Paire de bases
PCR Réaction en chaîne de la polymérase (Polymerase Chain Reaction)
pH Potentiel hydrogène
pmole Picomole
pre-crRNA ARN pré-CRISPR (Pre-CRISPR RNA)
RBP Protéine se liant au récepteur (Receptor Binding Protein)
R-M Modification par restriction (Restriction-Modification)
RPM Rotation par minute
RUSTI Îlot génomique de transport et d’acquisition de fer (iRon Uptake
Siderophore/Transport Island)
sgRNA ARN guide singulier (Single guide RNA)
spp. Espèce (Species)
subsp. Sous-espèce (Sub-species)
T Thymine
tracrRNA ARN CRISPR agissant en trans (Trans activating crRNA)
UFP Unité formatrice de plaque
VSC Composé sulfuré volatil (Volatile Sulfur Compound)
WGS Séquençage aléatoire « shotgun » de génome complet (Whole-Genome
Shotgun sequencing)
xi
“Success consists of going from failure to failure
without loss of enthusiasm”
- Winston Churchill
xii
REMERCIEMENTS
Complètement fasciné par l’ubiquité et l’importance des microorganismes, j’ai voulu me
spécialiser en microbiologie dès le début de mes études en biotechnologie. Ce mémoire
représente le travail effectué durant deux années passées dans le laboratoire du Professeur
Sylvain Moineau. La recherche scientifique est un domaine passionnant, certes frustrant et
difficile à l’occasion, mais c’est un domaine des plus stimulants et les défis constants nous
permettent d’évoluer à un rythme exponentiel. Les caprices de la bactérie utilisée pour la
maturation des fromages à croûte lavée, Brevibacterium aurantiacum (affectueusement
surnommée Princesse aurantiacum), m’auront définitivement permis d’acquérir une plus
grande maturité scientifique.
Ces apprentissages n’auraient pas été possibles sans les organismes subventionnaires et les
personnes qui m’ont accompagné et appuyé durant les deux dernières années.
Premièrement, je tiens à remercier le CRSNG et Agropur pour le financement du projet de
recherche et les regroupements de recherche PROTEO et Op+lait pour les bourses d’études
supérieures qui m’ont été accordées durant ma maîtrise. Je remercie chaleureusement le
Professeur Sylvain Moineau pour ses conseils, son support et la liberté scientifique qu’il
m’a accordée. Je tiens à remercier les professionnels de recherche du laboratoire, Denise,
Geneviève et Stéphanie pour leur appui constant en laboratoire. Cette expertise et cet
encadrement sont à la base du succès du laboratoire. Je tiens aussi à remercier mes
collègues étudiants qui sont devenus des amis très importants pour moi durant ces deux
dernières années. Votre présence a ensoleillé mon séjour dans le « Bacteriophage Bunker »
et sans vous, ces deux dernières années n’auraient jamais passé aussi rapidement. Si vous
lisez cet avant-propos, je tiens à souligner que malgré vos efforts d’assimilation, je vais
toujours avoir mon accent de bûcheron du Nouveau-Brunswick!
Au plaisir de tous vous revoir!
xiii
AVANT-PROPOS
Ce mémoire de maîtrise est divisé en quatre chapitres. Le chapitre 1 comprend une revue de
littérature et présente les objectifs du projet de recherche. Le chapitre 2 présente la
méthodologie utilisée pour développer un outil génétique pour Brevibacterium aurantiacum
et les résultats expérimentaux. Le chapitre 3 comprend un article scientifique rédigé en
anglais et soumis au journal Applied and Environmental Microbiology et cet article décrit
l’analyse génomique comparative de souches laitières de B. aurantiacum. Pour conclure, le
chapitre 4 présente les perspectives d’avenir du projet de recherche.
L’article scientifique inséré dans le mémoire au chapitre 3 a été soumis au journal Applied
and Environmental Microbiology le 13 Juillet 2018 (AEM01726-18). En tant qu’auteur
principal, j’ai développé le protocole de recherche, j’ai effectué les analyses en laboratoire
et les analyses bio-informatiques. J’ai analysé les données et j’ai écrit l’article scientifique.
Simon J. Labrie de la compagnie Syntbiolab (Lévis, QC) a écrit les scripts Python et R, il a
effectué les analyses du pangénome de B. aurantiacum et il a participé à l’écriture de
l’article. Le professeur Sylvain Moineau du Département de biochimie, de microbiologie et
de bio-informatique de l’Université Laval (Québec, QC) a supervisé l’ensemble du projet
de recherche, a obtenu le financement du projet et il a participé à l’écriture de l’article.
1
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION
1.1 Fromages à croûte lavée
La découverte, au Nord de l’Europe, de résidus de lait sur des poteries datant de 6000 ans
avant Jésus-Christ a fourni la première preuve de transformation laitière par l’être humain
(1). La fabrication du fromage est une excellente façon de conserver les principaux
constituants du lait et le fromage est un aliment ancien de haute importance pour
l’humanité. Plus de 1400 variétés de fromages traditionnels, présentant une gamme variée
de saveurs, d’arômes et de textures, sont actuellement produites à travers le monde (2). La
coexistence et la succession de plusieurs microorganismes permettent le développement des
caractéristiques et des propriétés organoleptiques distinctes dans les variétés de fromages
(3).
Les fromages à croûte lavée se caractérisent par le développement d’une croûte de levures
et de bactéries à la surface lors de la maturation et du vieillissement du fromage. De
l’anglais « washed-rind cheese », le nom de ces fromages provient du lavage périodique de
la surface avec une saumure inoculée avec des microorganismes. Ce traitement permet la
colonisation de la surface du fromage par une flore bactérienne qui est responsable de la
coloration orangée des fromages. Il est à souligner qu’un grand nombre de
microorganismes indigènes présents dans le lait ou dans l’environnement laitier vont aussi
croître et amplifier l’intensité des saveurs du fromage (4). Comme les consommateurs
associent l’apparence extérieure et la couleur d’un fromage à sa qualité et à sa maturité, le
développement de la flore bactérienne de surface est l’un des aspects clés de la
commercialisation d’un fromage à croûte lavée (5).
1.1.1 Ferments lactiques
La fabrication des diverses variétés de fromage nécessite quatre ingrédients essentiels, soit
le lait, le ferment lactique, la présure et le sel (6). Dans un premier temps, les bactéries
lactiques sont ajoutées au lait pour permettre l’abaissement du pH via la fermentation du
lactose en acide lactique. La présure, contenant la chymosine et la pepsine, est ensuite
ajoutée et l’activité combinée de ces enzymes protéolytiques avec le ferment lactique mène
2
à la dénaturation des caséines qui sont les principales protéines du lait. La coagulation du
lait se caractérise par la formation d’agrégats de micelles de caséines qui forment le gel
fromager. Différentes bactéries lactiques sont utilisées dans les ferments de départ en
fonction de leurs capacités à acidifier le lait, mais aussi pour les propriétés organoleptiques
qu’elles confèrent aux fromages. En somme, la croissance des bactéries lactiques est
cruciale pour le succès de la fabrication fromagère (7).
Deux différents types de ferments lactiques sont utilisés en fonction de leurs températures
de croissance, soit les ferments mésophiles (30oC) et les ferments thermophiles (45
oC) (8).
Les ferments thermophiles sont utilisés lorsque le procédé de fabrication nécessite une
température de plus de 39oC, généralement pour la production de fromage à pâte ferme et
semi-ferme. Seulement quatre espèces bactériennes sont utilisées comme producteur
primaire d’acide lactique (ferment primaire), soit Lactococcus lactis subsp. lactis,
Lactococcus lactis subsp. cremoris, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, et Lactobacillus helveticus (7).
Les autres espèces utilisées dans les ferments lactiques ont un rendement de fermentation
inférieur, mais elles sont ajoutées pour leurs propriétés aromatiques (ferment secondaire).
Les ferments lactiques peuvent aussi être divisés en deux autres groupes, soit les ferments
définis et non-définis. Les ferments définis sont composés de quelques souches connues et
ils sont utilisés préférentiellement aux ferments non définis grâce à leur fiabilité et à leur
performance supérieure (9). Toutefois, ces ferments sont plus sensibles aux bactériophages
(10, 11). Il est donc nécessaire d’utiliser des souches résistantes à une grande variété de
bactériophages en plus d’implanter un système de rotation des souches et des ferments.
Au niveau du développement des arômes, les souches sont sélectionnées selon leur type de
fermentation lactique. Les espèces homofermentaires produisent exclusivement de l’acide
lactique à partir de lactose, tandis que les espèces hétérofermentaires, dont Leuconostoc sp.,
produisent différents produits secondaires comme le CO2, l’éthanol et l’acétate (12). Une
relation synergique entre ces deux types de bactéries lactiques a été décrite et les espèces du
genre Leuconostoc, dont la croissance est stimulée par les lactocoques, jouent un rôle de
premier plan dans le développement de plusieurs propriétés organoleptiques (13). Parmi les
3
composés aromatiques recherchés par les producteurs fromagers, Lactococcus lactis subsp.
lactis biovar. diacetylactis et Leuconostoc citrovorum métabolisent le citrate et produisent
de l’acétone (3-hydroxybutanone) et du diacétyle (2,3-butanedione), conférant ainsi des
arômes de beurre au fromage (12, 14). Ces dernières sont utilisées comme ferments
secondaires et peuvent être considérées comme ferments aromatiques. Le tableau 1.1
illustre les différentes espèces de bactéries lactiques retrouvées dans les catégories de
ferment primaire et secondaire/aromatique.
Tableau 1.1: Classification des bactéries lactiques utilisées comme ferment primaire ou
aromatique. Tableau traduit et adapté de Johnson (7).
Type de ferment Espèces
Lactocoque mésophile homofermentaire utilisé
comme ferment primaire
Lactococcus lactis subsp. lactis
Lactococcus lactis subsp. cremoris
Lactocoque mésophile homofermentaire utilisé
comme ferment secondaire
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar.
diacetylactis
Coque mésophile hétérofermentaire utilisé
comme ferment secondaire
Leuconostoc mesenteroides subsp.
cremoris
Coque thermophile homofermentaire utilisé
comme ferment primaire
Streptococcus thermophilus
Bacille mésophile hétérofermentaire utilisé
comme ferment secondaire
Propionibacterium freudenreichii
subsp. shermanii
Bacille thermophile homofermentaire utilisé
comme ferment primaire
Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis
Lactobacillus helveticus
1.1.2 Ferments d’affinage
Suite à la coagulation, le fromage peut être consommé frais ou être affiné (6). L’affinage
des fromages à croûte lavée consiste à laver ponctuellement la surface des fromages avec
une saumure contenant des levures et des bactéries d’affinage. La colonisation d’une flore
microbienne est essentielle pour permettre le développement des propriétés organoleptiques
typiques de ces fromages de haute qualité. Les levures, dont Geotrichum candidum et
Debaryomyces hansenii, débutent la maturation en produisant de l’ammoniac, ce qui élève
le pH et elles libèrent aussi des facteurs de croissance, dont l’acide pantothénique, ce qui
permet la prolifération d’une flore bactérienne halophile (15, 16). Il est important de
4
souligner que l’espèce de levure utilisée pour la désacidification du fromage peut affecter
différentes propriétés, dont le développement de la couleur des fromages (5).
La flore bactérienne halophile est principalement composée d’actinobactéries et de
protéobactéries. Les actinobactéries les plus fréquemment retrouvées sur les fromages font
partie des genres Brevibacterium, Corynebacterium et Arthrobacter en étant présent sur,
respectivement, 75%, 75% et 66% des fromages (17). Ces bactéries font partie de
l’inventaire de la fédération internationale de laiterie des microorganismes utilisés comme
ferment pour diverses applications alimentaires (18). Il est important de souligner que la
composition et l’activité des ferments d’affinage utilisés pour la production des fromages à
croûte lavée ont été peu étudiées et documentées comparativement aux ferments lactiques.
Certains producteurs fromagers utilisent la méthode traditionnelle et ils inoculent leurs
fromages non affinés avec les microorganismes présents sur les fromages matures lors des
brossages. D’autres producteurs inoculent les fromages délibérément avec des ferments
d’affinage contenant un mélange de Debaryomyces hansenii et Brevibacterium
aurantiacum obtenus de laboratoires spécialisés (19). La microflore la plus simple observée
sur un fromage à croûte lavée (Limburger) s’est avérée contenir deux espèces de levures et
deux espèces d’actinobactéries, soit Debaryomyces hansenii, Geotrichum candidum,
Arthrobacter arilaitensis, et Brevibacterium aurantiacum (19). La complexité et la
diversité de la flore microbienne varient d’un fromage à l’autre et il est nécessaire d’avoir
plusieurs espèces pour assurer l’affinage de ces fromages. Il est donc parfois essentiel
d’inoculer les fromages avec la flore des fromages matures, en plus des souches
commerciales, pour assurer une production constante de fromages de haute qualité.
1.1.3 Pression de sélection
Les principaux facteurs qui influencent les caractéristiques distinctives d’un fromage à
croûte lavée sont les paramètres physico-chimiques du fromage et de l’environnement, dont
le pH, la composition du lait, la taille du fromage, le potentiel réducteur, la température et
l’humidité (20). Traditionnellement, l’affinage de ces fromages implique le transfert d’une
microflore non définie d’un fromage mature vers un fromage non affiné. Cette façon de
faire a mené à la sélection naturelle de microorganismes bien adaptés à l’écosystème des
5
fromages (21). Les fromages à croûte lavée sont donc un exemple intéressant de
l’adaptation des microorganismes à un nouvel environnement. De plus, l’assemblage et
l’implantation des communautés microbiennes sur les fromages sont hautement
reproductibles et l’humidité s’avère être le facteur ayant le plus d’influence sur la
composition de la flore d’affinage (22).
Plusieurs autres pressions de sélection façonnent l’adaptation des bactéries d’affinage, dont
l’oxygène, la concentration en sel, les substrats énergétiques, les inhibiteurs produits par la
microflore, les bactériophages et la limitation en fer (16). Certains bactériophages virulents
peuvent infecter les bactéries utilisées par l’industrie laitière et perturber les fermentations,
causant ainsi des pertes économiques pour l’industrie (23). Même si les bactériophages
infectant les ferments lactiques sont bien documentés (24–27), les phages infectants les
bactéries d’affinage ne le sont pas. De plus, la limitation en fer semble être l’un des facteurs
critiques dans l’adaptation des bactéries à l’écosystème des fromages (28, 29). L’analyse
des génomes de deux autres actinobactéries présentes à la surface des fromages à croûte
lavée, Glutamicibacter arilaitensis (21) et Corynebacterium variabile (30), a permis
d’identifier plusieurs gènes impliqués dans l’acquisition du fer comparativement aux
espèces du même genre. Cette observation suggère que la présence de systèmes
d’acquisition du fer plus efficace confère un avantage sélectif aux espèces et aux souches
laitières.
1.2 Brevibacterium
Les bactéries du genre Brevibacterium font partie du sous-ordre des Micrococcineae, de
l’ordre des Actinomycetales, de l’embranchement des Actinobacteria. Les membres de cet
embranchement sont des bactéries à Gram positif et ils sont reconnus pour leur contenu
riche en G+C allant de 42% à 74,4% et leur capacité à produire des métabolites
secondaires, dont certains antibiotiques (31, 32). Le genre Brevibacterium est représenté
par l’espèce type Brevibacterium linens et la souche type B. linens DSM 20425/ATCC
9172 isolée d’un fromage de type Harzer. Les membres du genre Brevibacterium ont été
isolés dans une grande variété d’écosystèmes, dont les produits laitiers, le sol, le corps
humain, les algues brunes et divers environnements marins (33). Ces actinobactéries ont un
6
rôle industriel important au niveau de l’affinage des fromages à croûte lavée et pour la
production d’acides aminés à grande échelle (34). Les diverses espèces peuvent être
divisées en fonction de la pigmentation de leurs colonies, soit jaune-orange (B.
aurantiacum et B. linens), mauve (B. iodinum) ou blanc-gris (B. casei et B. epidermidis)
(34, 35). Ces actinobactéries entreprennent un cycle de bacille-coque en prenant la forme
de bacilles qui s’assemblent en « V » lors de la phase exponentielle pour ensuite prendre
une forme de coque après 3 jours de croissance (34). Les Brevibacteriaceae ont une
température optimale de croissance qui varie entre 21-28oC, elles tolèrent des
concentrations en NaCl allant jusqu’à 20% et elles arrivent à croître à partir d’un pH à 5,5
(33). Malgré l’importance industrielle de ces actinobactéries, aucun outil génétique n’est
disponible pour étudier et exploiter leur plein potentiel.
1.2.1 Brevibacterium aurantiacum
B. aurantiacum est l’actinobactérie d’affinage des fromages à croûte lavée la plus étudiée
(36, 37). Traditionnellement classifiées comme B. linens, les souches ATCC 9175, ainsi
que BL2 ont été reclassifiées comment étant B. aurantiacum à partir de caractéristiques
génétiques, physiologiques et biochimiques (38, 39). Une étude récente a démontré que B.
aurantiacum était la principale espèce bactérienne retrouvée sur les fromages à croûte lavée
(15). Il est toutefois important de noter que d’autres espèces de Brevibacterium, dont B.
antiqum (fromage à pâte ferme), B. casei (fromage cheddar) et B. linens (fromage Harzer)
ont aussi été isolées à la surface de différents fromages. Ces espèces semblent avoir le
répertoire de gènes nécessaires pour croître à la surface des fromages. La position
taxinomique des souches utilisées pour la production de fromages à croûte lavée serait donc
à revoir.
Grâce à son métabolisme strictement aérobie, sa capacité à croître à des températures de 10
à 12oC, sa résistance au NaCl et sa capacité à croître sur une grande variété de substrats, B.
aurantiacum s’est adaptée pour la croissance à la surface des fromages (37). L’industrie
laitière exploite ses capacités à produire des enzymes protéolytiques, des enzymes
lipolytiques et aussi sa capacité à produire des composés sulfurés volatils (VSC) pour la
maturation des fromages (20, 40). Aussi appelée « ferment du rouge », cette bactérie
7
produit trois pigments, appartenant à la famille des caroténoïdes, qui lui confère sa
coloration orangée (41). Un défaut au niveau de la couleur est associé à une faible
colonisation microbienne, et par conséquent, à une déficience au niveau du développement
des arômes et de la texture des fromages à croûte lavée. La voie métabolique de
biosynthèse des caroténoïdes a été décrite (41, 42) et la séquence de l’opéron est disponible
dans la base de données du NCBI (numéro d’accession: AF139916.1). Sept gènes sont
essentiels pour la synthèse des principaux pigments caroténoïdes, soit l’isorenieratène, le 3-
dihydroxy-isorenieratène et le 3,3’-dihydroxy-isorenieratène (Figure 1.1).
Figure 1.1 : Voie métabolique de biosynthèse des caroténoïdes chez B. aurantiacum.
Figure tirée de Forquin et Weimer (33).
8
La protéolyse est une étape fondamentale dans le développement des arômes et de la
texture des fromages. Une importante protéolyse peut se produire dans les fromages en
fonction de la durée et de la composition de la microflore (43). Toutefois, un niveau trop
élevé d’hydrolyse des protéines du fromage peut mener au développement de goûts amers
et par conséquent, représente une préoccupation pour l’industrie fromagère (44). Pour ce
qui est de la lipolyse, l’hydrolyse des lipides du lait produit des acides gras libres qui
peuvent être dégradés en esters, responsables de saveurs fruitées, mais aussi en
méthylcétone et en alcools secondaires (45, 46). Même si B. aurantiacum est déjà reconnue
pour ses activités protéolytiques et lipolytiques (20), le séquençage de génomes complets
apportera sans doute une meilleure compréhension du potentiel de cette espèce.
Reconnu comme étant un très bon producteur de VSC, B. aurantiacum contribue
significativement aux arômes distincts, aux odeurs et aux saveurs générales de différents
fromages (47). Cette bactérie dégrade la méthionine, qui est un acide aminé sulfuré, en
méthanethiol pour ensuite produire divers VSC comme le diméthyldisulfide, le
diméthyltrisulfide et le S-méthylthioester (48). B. aurantiacum produit aussi des
métabolites antimicrobiens qui inhibent la croissance de bactéries et de moisissures
indésirables pouvant causer des intoxications alimentaires (49). La colonisation du fromage
par cette bactérie est donc très importante pour prévenir la prolifération de la flore
d’altération et de la flore pathogène. L’ensemble de ces propriétés permet d’apprécier la
nécessité de cette espèce au sein de l’industrie laitière.
1.3 Problématique
La coopérative laitière québécoise Agropur utilise la souche B. aurantiacum SMQ-1335
(50) depuis plusieurs décennies pour la production de fromages à croûte lavée. Récemment,
cette souche n’a pas bien colonisé certains fromages, donc la couleur caractéristique et les
arômes de ces fromages ne se sont pas développés (figure 1.2). Après investigation du
problème, des bactériophages de la famille des Siphoviridae infectant B. aurantiacum ont
été retrouvés et isolés pour la première fois sur des fromages et au site de manufacture
9
(figure 1.3). Notre hypothèse principale est donc que certains bactériophages infectent les
cultures de B. aurantiacum et affectent la qualité de ces fromages. Étant donné la
complexité du procédé d’affinage des fromages à croûte lavée, il est aussi possible que
d’autres pressions de sélection soient à l’origine de la faible croissance de la microflore.
Comme l’effet de communauté est très important pour le développement de la microflore,
l’absence d’une espèce essentielle peut affecter l’ensemble de la microflore. Notre
hypothèse secondaire est donc qu’un effet synergique entre les microorganismes laitiers est
essentiel à la croissance de B. aurantiacum SMQ-1335.
Figure 1.2 : Fromage à croûte lavée avec et sans défaut d’affinage. (A) Fromage
Champfleury avec une bonne croissance de la microflore. (B) Fromage à croûte lavée avec
un défaut de développement de la microflore.
10
Figure 1.3 : Morphologie du bactériophage BI2 observé par microscopie électronique. Le
bactériophage BI2, infectant B. aurantiacum SMQ-1335, a été isolé sur un fromage à croûte
lavée.
1.3.1 Les bactériophages
Les bactériophages, ou simplement phages, sont reconnus comme étant les entités
biologiques les plus abondantes sur Terre et en étant ubiquitaire, ils assurent le maintien de
l’équilibre microbien (51, 52). Avec une population globale estimée à 1031
, les phages sont
10 fois plus nombreux que les bactéries (53). En tant que parasite obligatoire, les phages
infectent leurs hôtes bactériens et les phages virulents terminent leur cycle de multiplication
par la lyse cellulaire, libérant ainsi des centaines de particules virales prêtent à infecter les
cellules avoisinantes (54). Le cycle lytique se divise en six grandes étapes, soit l’adsorption
du phage, l’entrée de l’ADN dans la cellule hôte, la réplication de l’ADN virale, la
transcription et la traduction des protéines virales, l’assemblage des phages pour finalement
conclure le cycle avec la lyse cellulaire (figure 1.4) (55). L’extrémité de la queue des
phages joue un rôle important dans l’adsorption grâce à la reconnaissance d’un récepteur
spécifique de l’hôte, ce qui permet ensuite au phage d’injecter son matériel génétique dans
la cellule hôte (56). La spécificité des phages est donc très grande grâce à la protéine de
liaison au récepteur (RBP) et c’est pourquoi la plupart des phages ciblent, généralement,
une seule espèce bactérienne (57).
La présence de phages dans l’industrie laitière représente une menace constante, car ils
peuvent affecter les propriétés organoleptiques et la qualité du produit, réduire le rendement
de fermentation ou même mener à l’échec du procédé (25, 27). Plusieurs mesures sont
prises par l’industrie pour réduire ce risque, dont l’adaptation des designs industriels,
l’optimisation des pratiques hygiéniques et la rotation des ferments (24). Certains phages
peuvent tout de même être retrouvés sur le matériel, l’équipement, les produits et les sous-
produits d’une usine laitière (58). Toutefois, la plus grande source permanente de nouveaux
phages provient du lait brut et même si les usines utilisent la pasteurisation comme
traitement thermique, cette méthode n’est pas efficace pour tous les bactériophages (24,
59). L’industrie a donc développé diverses stratégies supplémentaires basées sur la diversité
des souches utilisées, l’utilisation de mutants insensibles aux bactériophages (BIM) et
11
l’utilisation de plasmides conférant un mécanisme de résistance pour combattre les phages
(60).
Figure 1.4 : Cycle de réplication des bactériophages. Figure traduite de Labrie et al. (55).
1.3.2 Mécanismes de résistance aux bactériophages
L’exposition constante aux bactériophages a exercé une pression sélective sur les bactéries
qui ont dû développer diverses stratégies de défense en bloquant une ou plusieurs étapes du
cycle de réplication des phages (figure 1.5) (61). Il n’est donc pas surprenant qu’une partie
substantielle du génome des bactéries et des archées soit dédiée à la défense antivirale (62).
En plus de bloquer l’adsorption ou l’entrée de l’ADN, les bactéries résistantes aux phages
utilisent des systèmes plus complexes comme l’avortement de l’infection (Abi), les
systèmes de restriction-modification (R-M) et le système immunitaire adaptatif CRISPR-
Cas (63). Il est aussi intéressant de noter que deux nouveaux mécanismes de résistance
nommés BREX pour « Bacteriophage Exclusion » et DISARM « Defense Island System
Associated with Restriction-Modification » ont récemment été découverts (64, 65). Les
mécanismes de résistance aux phages ne sont pas mutuellement exclusifs et ils peuvent être
12
divisés en deux principaux groupes, soit les mécanismes qui permettent de discriminer
l’ADN étranger et ceux qui sont basés sur la mort cellulaire programmée (66).
Figure 1.5 : Étapes du cycle de réplication des bactériophages qui peuvent être ciblées par
divers mécanismes de défense. Figure traduite de Dy et al. (61).
Les mécanismes d’avortement de l’infection Abi font partie des mécanismes de résistances
aux phages les plus efficaces (67, 68). Les mécanismes Abi les plus abondants ont été
découverts chez Lactococcus lactis et ils sont généralement codés par des plasmides (55,
69, 70). Habituellement, le système Abi cible une étape du cycle de multiplication des
phages, soit la réplication, la transcription ou la traduction pour déclencher la mort
cellulaire, mais ces mécanismes ne sont pas encore complètement connus (55). Pour ce qui
est des mécanismes qui permettent de discriminer l’ADN étranger, le système R-M se
caractérise par l’ajout de signatures de méthylation sur des motifs spécifiques du génome
de la bactérie grâce à une enzyme de type méthyltransférase. Un motif de méthylation
reconnu par l’endonucléase de restriction associée au système R-M bloque la coupure de
l’ADN, et par conséquent, protège le génome de la bactérie. Lors de l’entrée d’ADN
étranger dans la bactérie, l’endonucléase de restriction reconnaît l’absence d’une signature
13
de méthylation sur le motif spécifique et clive l’ADN étranger (71). En étant presque
universels, les mécanismes R-M sont retrouvés dans le génome de 90% des bactéries et des
archéobactéries (72).
Le système CRISPR-Cas, de l’anglais « clustered regularly interspaced short palindromic
repeats - CRISPR-associated genes », se distingue, quant à lui, par l’acquisition d’une
mémoire immunitaire pour permettre le clivage de séquences d’acides nucléiques
étrangères (73). Les systèmes CRISPR-Cas contiennent de 4 à 20 gènes cas adjacents à des
séquences répétées de 21 à 48 paires de bases espacées par de courtes séquences variables
de 26 à 72 paires de bases appelées espaceurs (55). Durant une infection virale ou
l’exposition à un plasmide, le système CRISPR-Cas intègre une séquence spécifique du
bactériophage ou du plasmide dans son locus CRISPR, développant ainsi une immunité
envers l’ADN de l’envahisseur (74). L’acquisition de cet espaceur dépend de la détection
d’un motif adjacent au proto-espaceur (PAM) par le système CRISPR-Cas (75). À la
suite de l’étape d’adaptation, cette séquence spécifique et complémentaire sert de guide
pour l’étape d’interférence, soit la reconnaissance et la dégradation des acides nucléiques
étrangers (76).
Il est important de souligner que les systèmes CRISPR-Cas sont très diversifiés chez les
bactéries et les archées au niveau des protéines qui les composent, de la structure de leur
complexe, de l’architecture de leur locus génomique, en plus de leurs mécanismes
d’adaptation, de génération de l’ARN pré-CRISPR et d’interférence (77). Pour l’instant, les
systèmes CRISPR-Cas sont séparés dans deux classes (1 et 2) englobant six types (I à VI)
et plus de 16 sous-types en fonction de leur phylogénie et leur mécanisme d’action (78, 79).
Les systèmes de classe 1, comprenant les types I, III et IV, utilisent un complexe composé
de plusieurs protéines Cas pour reconnaître et cliver l’ADN étranger. Les systèmes de
classe 2, comprenant les types II, V et VI, utilisent une seule protéine Cas pour reconnaître
et cliver l’ADN étranger. Cette dernière classe comprend les protéines Cas9 (type II), Cpf1
(type IV) et Cas13 (Type VI) à l’origine d’une révolution en biologie moléculaire grâce à
leur efficacité comme système d’édition de l’ADN (80, 81) et même, plus récemment, de
l’ARN (82).
14
Il est toutefois important de souligner que les bactériophages arrivent à déjouer les
systèmes de défense grâce au réarrangement génomique, aux mutations simples dans
certains gènes spécifiques, à l’échange entre génomes viraux et même grâce à la synthèse
de protéines anti-CRISPR (83, 84). Récemment, cinq protéines anti-CRISPR (AcrIIA1-
AcrIIA5) inhibant l’activité de Cas9 de type IIA ont été découvertes chez des prophages de
Listeria monocytogenes (85) et chez un phage virulent de Streptococcus thermophilus (86).
Les protéines anti-CRISPR semblent répandues chez les bactériophages et elles jouent un
rôle significatif dans l’évolution des protéines Cas (87, 88). Il a été proposé que la diversité
des systèmes CRISPR-Cas pourrait avoir été partiellement conduite par la présence d’une
quantité autant diversifiée de protéines anti-CRISPR, ce qui pourrait expliquer la présence
de plusieurs types/sous-types de systèmes CRISPR-Cas dans une seule souche (77, 78). En
somme, il est préférable d’utiliser une combinaison de mécanismes de défense pour fournir
une défense efficace contre les bactériophages (68).
1.4. Outils génétiques
1.4.1 Transformation et outils génétiques pour Brevibacterium spp.
L’utilisation de vecteurs comme outil génétique faciliterait l’étude des facteurs de l’hôte
impliqués dans la résistance aux bactériophages, mais peu sont disponibles pour les
Brevibacterium (40). À ce jour, quelques plasmides natifs de B. linens ont été décrits dans
la littérature, dont pBL100 (89), pBL33 (90), pRBL1 (91), pBLA8 (92) et pLIM (40). Dans
une collection génétiquement diversifiée de 11 souches de B. linens et B. aurantiacum, Des
chercheurs ont aussi trouvé deux souches possédant, respectivement, deux et cinq
plasmides. La présence de plasmides chez B. linens n’est donc ni fréquente ni
exceptionnelle (37). Avec un pourcentage de G+C de 62,6 à 64,8%, il est nécessaire
d’utiliser des outils génétiques riches en G+C et compatibles avec la souche utilisée.
La transformation génétique de B. linens et B. aurantiacum par électroporation a été décrite
dans deux études publiées en 1998 (92) et en 2005 (37). Leret et al. ont séquencé le
réplicon du plasmide natif pBLA8 de B. linens ATCC 19391 et ils l’ont utilisé pour
construire un vecteur navette capable de se répliquer chez B. linens et E. coli avec un gène
15
de résistance à la kanamycine (92). Nardi et al. ont aussi utilisé ce vecteur, en plus des
vecteurs à large spectre pour bactéries à Gram positif pGhost9 et pILnew, pour transformer
11 souches différentes de B. linens et B. aurantiacum. Les plasmides pGhost9 et pILnew
possèdent, respectivement, les réplicons pWVO1 et pAMβ1 et leur marqueur phénotypique
est un gène de résistance à l’érythromycine. Pour ce qui est des rendements de
transformation, de 10 à 10
5 transformants/µg d’ADN ont été obtenus par Leret et al. (92) et
de 20 à 107 transformants/µg d’ADN par Nardi et al. (37). Les rendements de
transformation observés varient donc grandement en fonction des souches et des plasmides
utilisés. Étrangement, des rendements de transformation plus faible ont été observés avec le
vecteur pA2209 (réplicon pBLA8) spécialement construit pour B. linens (37).
1.4.2 Transformation et outils génétiques pour les actinobactéries
Étant donné l’importance industrielle des actinobactéries, plusieurs outils génétiques ont
récemment été développés pour manipuler efficacement leurs génomes et ces outils
pourraient être adaptés pour B. aurantiacum. Il est toutefois important de souligner que la
transformation génétique de plusieurs actinobactéries représente encore un défi de taille.
Ces bactéries sont difficiles à manipuler génétiquement à cause de leur machinerie
génomique et biochimique très diversifiée et leur paroi cellulaire complexe (32). Des
systèmes de restriction-modification (R-M) agissent aussi comme barrière pour la
transformation de diverses espèces à Gram positif et ces systèmes affectent l’efficacité de
transformation des actinobactéries, tels que les Corynebacterium, avec de l’ADN isolé
d’espèces différentes (93–95). De plus, la méthylation de l’ADN par l’adénine
méthyltransférase (Dam) et la cytosine méthyltransférase (Dcm) affecte aussi l’efficacité de
transformation de certains genres bactériens, dont Corynebacterium (93, 95–100). Des
rendements de 10 à 50 transformants/µg d’ADN ont été observés lors de la transformation
de B. linens ATCC 19391 avec de l’ADN extrait d’une espèce différente, comparativement
à des rendements de 5x104-1x10
5 transformants/µg d’ADN avec de l’ADN provenant de la
même espèce (92). La méthylation de l’ADN joue donc un rôle important dans la
transformation génétique de diverses actinobactéries et il est parfois nécessaire d’extraire
l’ADN d’une souche mutante E. coli dam-/dcm- pour transformer ces espèces (32).
16
Des plasmides et outils génétiques sont disponibles pour diverses actinobactéries (101–108)
et il est possible que ces systèmes soient fonctionnels chez B. aurantiacum. Des protocoles
de transformation par électroporation ont été optimisés pour Corynebacterium glutamicum
(109) et différentes espèces du genre Arthrobacter (110). Étant donné la proximité
phylogénétique de ces espèces avec les Brevibacterium, ces protocoles pourraient être
adaptés et utilisés pour augmenter les rendements de transformation de B. aurantiacum.
1.4.3 CRISPR-Cas9
Le système CRISPR-Cas9 a déclenché une révolution dans le domaine de l’édition de
génome grâce à sa simplicité et son efficacité (111). Cet outil jouera un rôle clé dans le
développement de bactéries industrielles de nouvelle génération (112), dans l’augmentation
de la productivité des cultures agricoles (113) et dans le développement de thérapies pour le
cancer et diverses maladies génétiques (114, 115). Au niveau du mécanisme d’action, Cas9
forme un complexe ribonucléoprotéique avec deux petits ARN non codant, soit l’ARN
CRISPR (crRNA) et l’ARN transactivateur (tracrRNA) (116). Une fois transcrit, le
précurseur du crRNA (pre-crRNA) se lie au tracrRNA par complémentarité. À l’aide de
Cas9, l’ARNase III reconnaît et clive la région double brin nouvellement appariée (80). Ces
clivages permettent la maturation du pre-crRNA en plusieurs crRNA, chacun spécifique à
une séquence d’ADN cible. Ces deux ARN (crRNA et tracrRNA) peuvent aussi être
fusionnés pour générer un ARN guide singulier chimérique (sgRNA), dont les 20 premiers
nucléotides sont complémentaires à l’ADN cible et adjacents au PAM (117). En étant
reconnue par l’espaceur et le complexe CRISPR-Cas9, la région PAM permet l’interaction
et l’ancrage de l’ARN guide avec la séquence cible (112). Il est aussi important de
souligner que la séquence « seed », qui correspond aux 10 à 12 pb directement en amont
du PAM, détermine la spécificité de Cas9 et elle est la région la plus importante de l’ARN
guide (117). Toutes les enzymes de type Cas9 possèdent une région conservée riche en
arginine pour la liaison à l’ADN, un domaine HNH pour cliver le brin d’ADN
complémentaire à l’ARN guide et un domaine nucléase RuvC pour cliver le brin non
complémentaire (118). Il est donc possible d’induire une coupure bicaténaire dans un gène
cible à partir d’un système CRISPR-Cas9 ayant un ARN guide développé sur mesure. La
17
coupure d’une séquence spécifique de l’ADN permet l’édition précise des génomes de
divers organismes.
Ce système a été utilisé avec succès pour l’édition génomique de cellules humaines (119),
de souris (120, 121), de plantes (122, 123), du poisson-zèbre (124), de la drosophile (125),
de nématodes (126), de la levure (127) et de bactériophages (128–130). Chez les
eucaryotes, la machinerie enzymatique des deux principaux mécanismes de réparation de
l’ADN, soit la jonction d’extrémités non homologues (NHEJ) et la recombinaison
homologue (HR), est recrutée suite à la coupure bicaténaire (111). Habituellement, le bris
bicaténaire est réparé via la voie sujette à l’erreur NHEJ qui introduit des insertions et des
délétions dans le gène cible, causant l’inactivation du gène (figure 1.6) (131). Le gène peut
aussi être réparé par la voie HR s’il est présent en plusieurs copies. Ce mécanisme peut
donc être exploité pour effectuer des recombinaisons homologues dirigées (HDR) à partir
d’ADN donneur ayant une homologie avec la séquence adjacente du gène cible pour
permettre l’insertion d’un gène (figure 1.6) (131). Ce dernier mécanisme permet
l’introduction de mutations simples, la fusion d’étiquettes d’affinités, de marqueurs de
sélection et l’ajout de gènes hétérologues (111).
18
Figure 1.6 : Édition génomique avec CRISPR-Cas9. Figure traduite et adaptée de Ding et
al. (131).
Chez la plupart des procaryotes, l’absence de voie efficace de réparation NHEJ complique
l’utilisation de CRISPR-Cas9 et ralentit le développement d’outils génétiques (132).
L’édition des génomes des bactéries est généralement basée sur la recombinaison
homologue d’ADN linéaire avec une recombinase de phage avec une efficacité allant de
0,1-10% pour les mutations simples à 10-5
-10-6
% pour les modifications plus complexes
(133). Avec une très faible efficacité, il est crucial d’utiliser une méthode de criblage pour
sélectionner les mutants ayant la modification désirée. Le système CRISPR-Cas9 a été
utilisé pour la première fois en 2013 pour assister l’édition génomique des bactéries
Escherichia coli et Streptococcus pneumoniae (133). À l’heure actuelle, CRISPR-Cas9 est
principalement utilisé comme outil de criblage chez les procaryotes pour sélectionner les
mutants ayant la modification désirée suite à la recombinaison homologue.
L’induction d’un bris bicaténaire par CRISPR-Cas9 est toxique pour les bactéries et
différentes approches sont entreprises pour contrer cette toxicité (111). Par exemple, un
19
système basé sur l’utilisation d’une « nickase » qui cible un seul brin d’ADN et un
plasmide ayant une séquence homologue pour la voie de réparation HDR a été développé
pour Clostridium cellulolyticum (134). Il est aussi possible de générer une version inactive
« dead endonuclease » (dCas9) en mutant le site actif des deux domaines nucléases HNH et
RuvC (135). L’utilisation de dCas9 a permis le développement de la technologie
d’interférence CRISPR (CRISPRi). Au lieu de cliver l’ADN cible, dCas9 se lie et bloque la
progression de l’ARN polymérase, inhibant ainsi la transcription d’un gène cible. Ce
système a été utilisé chez Corynebacterium glutamicum et il a permis d’augmenter la
production de L-lysine et de L-glutamate via la modulation de voies métaboliques (104).
1.4.4 CRISPR-Cas9 chez les actinobactéries
Le système CRISPR-Cas9 a été adapté et utilisé avec succès pour l’édition génomique de
différentes espèces du genre Streptomyces (106–108). Il est intéressant de souligner qu’à la
suite de la coupure bicaténaire de l’ADN, les voies de réparation NHEJ et HR peuvent être
utilisées chez les Streptomyces pour inactiver et insérer des gènes (108). Toutefois, cette
méthode ne s’applique pas aux autres actinobactéries. Le système d’interférence CRISPR
avec l’endonucléase dCas9 a été adapté et utilisé avec succès pour moduler l’expression de
divers gènes chez Mycobacterium tuberculosis et Corynebacterium glutamicum (104, 105).
L’expression optimale de gènes hétérologues chez les actinobactéries représente aussi un
défi étant donné leur pourcentage G+C élevé et il est parfois nécessaire d’optimiser les
codons des gènes hétérologues. Par exemple, les codons de l’endonucléase Cas9 de
Streptococcus pyogenes ont été optimisés pour permettre une expression optimale chez
Streptomyces (106, 107) et Mycobacterium (105). En somme, les avancés récentes
effectuées au niveau de la manipulation génétique des actinobactéries offrent un répertoire
potentiel d’outils pour transformer et manipuler génétiquement B. aurantiacum.
1.5 Génomique des bactéries laitières
Plusieurs études génomiques comparatives ont été menées pour comprendre l’adaptation
génétique des bactéries laitières à l’écosystème des fromages, dont Streptococcus
thermophilus (136), Lactococcus lactis (137), Corynebacterium variabile (30),
Glutamicibacter arilaitensis (21) et Propionibacterium freudenreichii (138). Ces études ont
20
apporté des informations importantes sur l’adaptation de ces bactéries à leur niche
écologique en plus de leur rôle dans le développement des propriétés organoleptiques des
fromages. La prévalence de gènes provenant de transferts horizontaux (HGT) entre les
bactéries de la microflore de différents fromages a été récemment décrite. En cherchant
pour des séquences d’ADN similaires entre 165 bactéries laitières, Bonham et al. (29) ont
identifié 4733 gènes dans 264 régions génomiques ayant probablement été transférées
horizontalement. Parmi les régions génomiques HGT, les gènes les plus souvent retrouvés
étaient impliqués dans l’acquisition du fer, un trait communément retrouvé chez les
pathogènes. Il est possible que ces gènes proviennent, à l’origine, d’un organisme
pathogène et que l’acquisition de systèmes efficaces d’utilisation du fer soit essentielle ou
confère un avantage compétitif dans cette niche écologique (139).
Très récemment, la première analyse génomique comparative de diverses espèces
appartenant au genre Brevibacterium a été effectuée pour comprendre les déterminants
génétiques impliqués dans l’adaptation de certaines espèces à l’environnement laitier (140).
Lors de cette étude, les génomes complets de 23 souches de Brevibacterium, dont cinq
souches de B. aurantiacum, ont été obtenus par séquençage aléatoire « shotgun » (WGS)
(140). Le répertoire de gènes de ces souches a été étudié en profondeur et différents
déterminants génétiques impliqués dans l’adaptation des souches laitières à la surface des
fromages ont été décrits, dont la sécrétion de protéases, de triacylglycérol lipase, la
production de bactériocines, la synthèse et l’acquisition de sidérophore de fer (140). La
différence au niveau du répertoire génétique des espèces du genre Brevibacterium peut être
expliquée par leur position phylogénétique et les transferts horizontaux de gènes. Toutefois,
les génomes n’ont pas été assemblés en un seul contig et l’architecture génomique de B.
aurantiacum n’a pas encore été étudiée. De plus, le mobilome de B. aurantiacum n’a pas
encore été étudié en profondeur malgré la prévalence des HGT retrouvés chez les
actinobactéries d’affinage. Le séquençage de plusieurs génomes complets de souches
industrielles de B. aurantiacum permettra de mieux comprendre son évolution et
l’importance des HGT dans son adaptation à la surface des fromages à croûte lavée.
21
Malgré l’importance des mutations spontanées et des réarrangements génétiques dans
l’évolution des bactéries, les HGT assurent une adaptation plus rapide à de nouvelles
pressions environnementales, permettant même la colonisation de nouvelles niches
écologiques (141). L’être humain produit du fromage depuis environ 8000 ans (1) et la
domestication des actinobactéries d’affinage est relativement récente, ce qui pourrait
expliquer la prévalence d’HGT entre ces bactéries qui ont dû s’adapter rapidement à leur
nouvel environnement. Nous émettons l’hypothèse que les génomes des souches laitières de
B. aurantiacum possèdent des régions HGT qui permettent de surmonter diverses pressions
de sélection présentes à la surface des fromages. De plus, il est probable que des éléments
d’ADN mobiles soient à l’origine de la diversité génétique de B. aurantiacum.
1.5.1 Éléments d’ADN mobiles
En 1948, Barbara McClintock observe un phénomène de « gènes sauteurs » chez le maïs
qui ne répond pas aux lois de la génétique mendélienne. Plusieurs années plus tard, les
innovations en biologie moléculaire lui permettent d’élucider ce phénomène qui est causé
par des éléments d’ADN transposables. La découverte d’éléments d’ADN mobiles chez le
maïs lui valut finalement le prix Nobel de physiologie et de médecine en 1983 (142). Cette
découverte a bouleversé la doctrine suggérant que les gènes sont fixés sur une position
spécifique du chromosome. Les éléments d’ADN mobiles sont des séquences d’ADN qui
peuvent être mobilisées entre des organismes ou au sein d’un même organisme. La
sélection naturelle a poussé les procaryotes à utiliser divers moyens élégants pour s’adapter
à des écosystèmes en constante évolution. Bien que certains génotypes compétitifs soient
transmis de façon verticale au sein d’une même espèce, plusieurs gènes sont aussi transmis
de façon horizontale à différentes espèces. Ces transferts horizontaux de gènes jouent un
rôle crucial dans l’évolution des génomes procaryotes et leurs effets sont parfois considérés
comme plus importants et plus répandus que les mutations ponctuelles (143). Divers
mécanismes de mobilisation de l’ADN utilisés par les bactéries sont présentés à la figure
1.5.
22
Figure 1.7 : Mécanismes de transfert d’éléments d’ADN mobiles chez les procaryotes
(144). (A) Un plasmide conjugatif est transféré d’une cellule donatrice à une cellule
réceptrice par contact physique direct via la formation d’un pilus de conjugaison. (B) Un
phage lysogène infecte une cellule et intègre son génome dans le chromosome de la
bactérie. Le génome du prophage est répliqué en même temps que le chromosome
bactérien. (C) Un élément transposable code pour des protéines qui catalysent sa
mobilisation et il est flanqué par deux courtes séquences d’ADN répétées et inversées. Dans
cette figure, l’élément transposable provenant du prophage s’excise et s’intègre dans un
nouveau site du chromosome bactérien. Figure traduite de Bordenstein et al. (144).
Certains éléments d’ADN mobiles, tels que les transposons et les séquences d’insertion
(IS), sont mobiles au sein d’un même organisme, mais ils ne sont pas nécessairement
mobiles entre organismes (145). Les ISs ont généralement une taille de 0,7 à 2,5 kb, elles
sont flanquées par des séquences d’ADN inversées et répétées et elles contiennent un ou
deux gènes essentiels pour leur mobilisation (146). La coupure de l’ADN et le transfert de
brin nécessaire à la transposition sont catalysés par une transposase. La spécificité du site
d’intégration peut être aléatoire ou très spécifique en fonction de l’IS et la structure de
l’ADN est importante pour certains ISs (147). Une fois acquis, les ISs se propagent dans un
génome et créent des variations génétiques (148). En s’intégrant dans une région codante
ou une région promotrice, les ISs peuvent inactiver certains gènes. Toutefois, les ISs
peuvent aussi fournir un promoteur lorsqu’elles s’intègrent en amont d’un gène qui n’est
23
pas exprimé. De cette façon, les ISs modulent l’expression de certains gènes impliqués dans
la résistance aux antibiotiques, aux métaux lourds et dans le métabolisme des sucres (147).
De plus, deux ISs flanquant une région génomique peuvent former un transposon
composite et mobiliser différents gènes, tels que des gènes de résistance aux antibiotiques
(147, 149). En somme, ces éléments d’ADN mobiles jouent un rôle crucial dans la
plasticité et l’évolution des génomes procaryotes (146, 147, 149).
Chez les bactéries, trois mécanismes sont utilisés pour échanger des séquences d’ADN, soit
la transformation, la transduction et la conjugaison (145). Certaines bactéries, comme
Streptococcus thermophilus, sont naturellement compétentes à la transformation, donc
capables d’acquérir des fragments d’ADN de l’environnement et de l’intégré à leur génome
par recombinaison homologue (150). Pour ce qui est de la transduction et de la conjugaison,
ces mécanismes sont médiés par des éléments d’ADN mobiles qui peuvent médier leur
propre transfert d’une cellule à l’autre. La transduction se produit lorsqu’un phage lysogène
s’excise d’un chromosome bactérien et acquiert une séquence d’ADN non viral lors de sa
réplication. Le phage lysogène peut ensuite infecter des cellules avoisinantes et s’intégrer
au génome bactérien (figure 1.5b), transférant ainsi de nouveaux gènes tels que des gènes
de résistance aux antibiotiques (151). La conjugaison se caractérise, quant à elle, par un
transfert d’ADN via un contact direct entre deux cellules. Deux éléments peuvent être
transférés par conjugaison, soit les plasmides conjugatifs et les éléments intégratifs
conjugatifs (ICEs) qui se distinguent par leurs modes de réplication. Les plasmides
conjugatifs se répliquent de façon autonome et demeurent dans un état extrachromosomale
tandis que les éléments ICEs, les plus répandus chez les procaryotes, s’intègrent au
chromosome de l’hôte et se répliquent avec celui-ci (152). Ces éléments conjugatifs
contiennent les gènes nécessaires à leur mobilisation permettant la formation du pilus de
conjugaison et le transfert de l’ADN (figure 1.5a) en plus de contenir des gènes conférant
un avantage évolutif pour l’hôte (153–155). L’expression des gènes de transfert et la
mobilisation des éléments conjugatifs peuvent être stimulées par la présence
d’antibiotiques, par réponse à un stress ou par détection du quorum (quorum-sensing)
(153).
24
1.5.2 Métagénomique des fromages
Les technologies de séquençage de dernière génération permettent le séquençage à haut
débit de l’ADN d’un échantillon sans culture préalable, assurant une détection potentielle
de tous les microorganismes présents (156). La méthode la plus utilisée en métagénomique
alimentaire consiste à amplifier et séquencer l’ARN ribosomique des microorganismes
présents dans un échantillon afin d’identifier et mesurer les unités taxinomiques
opérationnelles (OTUs) (157). Le nombre de lectures de séquences identifiées avec la
même OTU est calculé, ce qui permet de grouper et quantifier l’abondance des
microorganismes dans un échantillon donné. Cette approche permet d’avoir une
représentation plus juste de la composition des communautés microbiennes dans
l’écosystème de divers fromages.
Deux études récentes ont décrit la présence d’un microbiote de « coeur » bien adapté à la
surface des fromages affinés (2, 158). Une analyse métagénomique à grande échelle des
communautés microbiennes présentes à la surface de 137 fromages de différentes variétés
et provenant de 10 pays a révélé la présence de 24 genres de bactéries et de mycètes
répandus et dominants dans les croûtes des fromages (Tableau 1.2) (22). Les bactéries du
genre Brevibacterium et les mycètes du genre Debaryomyces sont les membres les plus
abondants de leur groupe respectif parmi l’ensemble des OTUs identifiés sur ces 137
croûtes de fromage affiné (tableau 1.2). À noter qu’en moyenne, 60% des bactéries et 25%
des mycètes identifiés sur les croûtes de fromage proviennent de l’environnement et non
des ferments. Cette étude avant-gardiste a permis d’identifier des modèles de communautés
microbiennes s’assemblant indépendamment de leur localisation géographique en plus des
interactions positives/négatives répandues entre les bactéries et les mycètes à la surface des
fromages (22).
Tableau 1.2 : Sommaire des 24 principaux OTUs provenant de l’analyse métagénomique
des croûtes de 137 fromages affinés. Les bactéries et les mycètes sont présentés en ordre
d’abondance moyenne à travers tous les échantillons et seulement les OTU ayant une
abondance moyenne >1% sont présentés. La fréquence indique le pourcentage
d’échantillons contenant l’OTU. Tableau traduit et tiré de Wolfe et al. (22).
25
Bactéries
Embranchement Genre Abondance
moyenne (%)
Fréquence (%)
Actinobacteria Brevibacterium 20,086 78,5
Firmicutes Staphylococcus 14,988 66,9
Proteobacteria Halomonas 13,360 50,8
Actinobacteria Corynebacterium 9,703 47,2
Proteobacteria Psychrobacter 7,416 42,5
Actinobacteria Brachybacterium 7,270 68,8
Actinobacteria Arthrobacter 3,683 33,1
Proteobacteria Pseudomonas 3,599 10,8
Proteobacteria Pseudoalteromonas 3,504 14,9
Bacteroidetes Sphingobacterium 2,186 21,8
Actinobacteria Nocardiopsis 1,665 13,0
Proteobacteria Hafnia/Serratia 1,202 10,5
Proteobacteria Vibrio 1,140 10,8
Actinobacteria Yaniella 1,019 6,6
Mycètes
Embranchement Genre Abondance
moyenne (%)
Fréquence (%)
Ascomycota Debaryomyces 24,640 56,4
Ascomycota Galactomyces 23,075 35,4
Ascomycota Scopulariopsis 18,207 42,5
Ascomycota Fusarium 10,742 19,1
Ascomycota Penicillium 9,276 30,4
Ascomycota Candida 3,265 14,6
Ascomycota Aspergillus 2,409 14,9
Ascomycota Sporendonema 2,265 4,1
Ascomycota Chrysosporium 1,881 6,9
Ascomycota Acremonium 1,298 6,6
Des analyses métatranscriptomiques ont aussi été réalisées pour étudier l’activité des
microorganismes lors de l’affinage des fromages. Il a été démontré qu’une augmentation de
la température d’affinage stimule l’expression des gènes liés à la protéolyse et à la lipolyse,
augmentant directement le taux de maturation des fromages (159). De plus, un haut taux de
transcription de gènes liés à l’acquisition du fer est fréquemment observé lors de la
maturation en surface des fromages, suggérant la nécessité de mobiliser le fer à l’intérieur
des communautés microbiennes du fromage (160). L’influence des conditions
26
environnementales sur la croissance de la flore peut être analysée afin de mieux contrôler la
qualité et la constance de production des fromages affinés.
Ces études nécessitent toutefois une grande quantité de données génomiques pour identifier
l’ensemble des microorganismes dans un échantillon. Almeida et al. ont récemment
construit un catalogue de génomes bactériens laitiers de référence contenant 137 espèces
(161). Le séquençage de nouveaux génomes de bactéries d’affinage facilitera assurément
les études métagénomiques subséquentes. À long terme, ces données génomiques et
transcriptomiques apporteront une compréhension sans précédent de la complexité des
communautés microbiennes et des facteurs biotiques et abiotiques liés à la maturation des
fromages affinés.
1.6 Hypothèses et objectifs de recherche
Les actinobactéries d’affinage du genre Brevibacterium jouent un rôle clé dans le
développement des propriétés organoleptiques des fromages à croûte lavée. Cependant, des
problèmes de maturation ont récemment été observés avec deux fromages québécois. La
découverte de phages infectant B. aurantiacum SMQ-1335 sur les fromages et le site de
manufacture suggère que des infections virales modifient la communauté bactérienne sur la
croûte des fromages. Nous émettons l’hypothèse qu’il serait possible d’adapter le système
CRISPR-Cas9 comme outil génétique pour étudier les facteurs de l’hôte impliqués dans la
résistance aux phages. Dans un premier temps, un plasmide capable de se répliquer chez
Brevibacterium aurantiacum devra être identifié ou construit synthétiquement et transformé
dans la bactérie. Les codons de la séquence du gène cas9 et des gènes accessoires seront
optimisés et ces gènes synthétiques seront clonés sur le vecteur construit sur mesure pour
Brevibacterium. Cet outil sera ensuite utilisé pour inactiver ou complémenter des gènes
suspectés d’être impliqués dans la résistance aux phages chez Brevibacterium.
La position taxonomique des souches du genre Brevibacterium utilisées comme ferment
d’affinage serait aussi à revoir. Étant donné la prévalence et la dominance de B.
aurantiacum sur certains fromages affinés, nous émettons l’hypothèse que les souches
27
utilisées comme ferment d’affinage correspondent à cette espèce. Dans un second temps,
les génomes complets de six souches de Brevibacterium seront séquencés et une analyse
génomique comparative sera effectuée pour apporter une meilleure compréhension des
facteurs génétiques impliqués dans l’adaptation à l’écosystème des fromages à croûte lavée.
Plusieurs autres pressions de sélection, telles que la limitation en fer, pourraient être à
l’origine des problèmes de maturation des fromages en plus de la présence de
bactériophages. Les données génomiques acquises apporteront une compréhension de
l’adaptation génétique de ces actinobactéries aux fromages à croûte lavée. À long terme, les
connaissances acquises lors de ce projet de maîtrise devraient permettre une meilleure
sélection des souches pour maintenir une production constante et de haute qualité de
fromages québécois renommés.
28
CHAPITRE 2 : TRANSFORMATION GÉNÉTIQUE
2.1 Matériel et méthodes
2.1.1 Souches bactériennes et conditions de culture
Les souches bactériennes utilisées lors de cette étude sont présentées dans le tableau 2.1.
Les souches de Brevibacterium ont été cultivées dans trois milieux de culture, soit le milieu
Elliker supplémenté de 0,5% NaCl, le milieu Lysogeny Broth (LB) et le milieu Brain Heart
Infusion (BHI) à 30oC sous une agitation de 200 rotations par minute (RPM). Les souches
de C. glutamicum et A. arilaitensis ont été cultivées dans le milieu BHI à 30oC sous une
agitation de 200 RPM. Les souches d’E. coli ont été cultivées dans le milieu LB à 37oC
sous une agitation de 200 RPM. De l’agar a été ajoutée à une concentration de 1% pour les
milieux solides. Les souches ont été conservées à -80oC dans leur milieu de culture
respectif supplémenté de 15% glycérol.
Tableau 2.1 : Liste des souches bactériennes utilisées lors de cette étude.
Espèce Souche Milieu de
culture
Fournisseur Références
Brevibacterium
aurantiacum
SMQ-1335
SMQ-1417
SMQ-1418
SMQ-1419
SMQ-1420
SMQ-1421
Elliker +
0,5%NaCl
BHI
LB
Agropur (50)
Brevibacterium
linens
ATCC 19391 Elliker +
0,5%NaCl
BHI
LB
American Type
Culture Collection
(ATCC)
(92)
Corynebacterium
glutamicum
ATCC 21086 BHI American Type
Culture Collection
(ATCC)
(94)
Arthrobacter
arilaitensis
LMA-1184 BHI Université Laval
(Prof. Steve Labrie)
Escherichia coli NEB® 5-alpha
NEB® dam-/dcm-
LB
BHI
New England Biolabs
(NEB)
(162)
2.1.2 Plasmides utilisés et extraction
Tous les plasmides utilisés et les vecteurs construits sont présentés dans le tableau 2.2. Les
plasmides ont été extraits des cellules bactériennes à partir des trousses QIAprep Spin
29
Miniprep (#catalogue : 27104) et Maxiprep (#catalogue : 12163) de la compagnie QIAGEN
en suivant les instructions du manufacturier. La souche Escherichia coli NEB® 5-alpha
(#catalogue : C2987H) a été utilisée pour les clonages et la production de plasmides. Les
plasmides non méthylés ont été extraits d’E.coli NEB® dam-/dcm- (#catalogue : C2925H).
Pour ce qui est du profil plasmidique des souches de B. aurantiacum, les souches étudiées
sont résistantes au lysozyme, mais sensibles à la mutanolysine et le protocole d’extraction
de plasmides a été adapté en conséquence. Les cellules bactériennes ont été incubées dans
le tampon de lyse (tampon TE, pH 8,0, 30 U/ml mutanolysine, 0,6 mg/ml lysozyme)
proposé par Amarita et al. (47) pendant 60 minutes à 37oC avant l’extraction des plasmides
pour permettre une lyse cellulaire complète. Les extraits provenant des souches de B.
aurantiacum ont ensuite été observés sur un gel d’agarose 0,8% coloré au bromure
d’éthidium. Les plasmides ont été dosés et leur pureté a été déterminée à partir d’un
spectrophotomètre DeNovix DS-11. Les plasmides pL2Cas9 (129) (#Addgene : 98841),
pCRISPomyces-2 (106) (#Addgene : 61737), pKCcas9DO (107) (#Addgene : 62552), pZ8-
Ptac et pZ8-T-dCas9 (104) (#Addgene : 74064 et 74062) ont été utilisés pour l’édition
génomique de diverses espèces bactériennes et de bactériophages à partir de la technologie
CRISPR-Cas9 et ils proviennent de la collection de plasmides d’Addgene.
Tableau 2.2 : Liste des plasmides utilisés
Plasmide Réplicon Résistance Hôte Souches de
Brevibacterium
testées
Réf.
pCRISPom
yces-2
OriT-
RP4
Apramycine Streptomyces sp. SMQ-1335,
SMQ-1417,
SMQ-1421
(106)
pKCcas9
DO
OriT-
RP4
Apramycine Streptomyces sp. SMQ-1335,
SMQ-1417,
SMQ-1421
(107)
pGhost4 pWVO1 Érythromycine Gram +
E. coli
SMQ-1335,
ATCC 19391,
SMQ-1417,
SMQ-1418,
SMQ-1419,
SMQ-1420,
SMQ-1421
(163)
pL2Cas9 pAMβ1 Érythromycine L. lactis SMQ-1335, (129)
30
E. coli SMQ-1417,
SMQ-1421
ATCC 19391
pMIG3 - Chloramphénicol
L. lactis
E. coli
SMQ-1335,
SMQ-1417,
SMQ-1421
(164)
pNZ123 pWVO1 Chloramphénicol
L. lactis
E. coli
SMQ-1335,
SMQ-1417,
SMQ-1421
(165)
pNZ8010 pSH71 Chloramphénicol
L. lactis
E. coli
SMQ-1335,
SMQ-1417,
SMQ-1421
(166)
pSA3 pACYC
pGB305
Chloramphénicol
Érythromycine
L. lactis
E. coli
SMQ-1335,
SMQ-1417,
SMQ-1421
(167)
pTRKH2 pAMβ1 Érythromycine
L. lactis
E. coli
SMQ-1335,
ATCC 19391,
SMQ-1417,
SMQ-1418,
SMQ-1419,
SMQ-1420,
SMQ-1421
(168)
pTRKL2 pAMβ1 Érythromycine
L. lactis
E. coli
SMQ-1335,
SMQ-1417,
SMQ-1421
(168)
pZ8-Ptac - Kanamycine C. glutamicun SMQ-1335,
ATCC19391
(104)
pZ8-T-
dCas9
- Kanamycine C. glutamicun SMQ-1335,
ATCC19391
(104)
Plasmides construits par assemblage Gibson
pBL1-123 pWVO1
pBL1
Chloramphénicol L. lactis,
E. coli
C. glutamicum
SMQ-1335,
ATCC 19391
pBLA8-123 pWVO1
pBLA8
Chloramphénicol L. lactis
E. coli
B. linens
SMQ-1335,
ATCC 19391
pBLA8-
123-KanR
pWVO1
pBLA8
Chloramphénicol
Kanamycine
L. lactis
E. coli
B. linens
SMQ-1335,
ATCC 19391,
SMQ-1417,
SMQ-1418,
SMQ-1419,
SMQ-1420,
SMQ-1421
31
pUC57-Z1 pMB1
pBLA8
Ampicilline
Kanamycine
(codons
optimisés)
E. coli
B. linens
SMQ-1335,
ATCC 19391
2.1.3 Séquençage du plasmide pBLA8
Le plasmide pBLA8 natif de la souche B. linens ATCC 19391 a été extrait comme
mentionner dans la section 2.1.2 à partir de la trousse Maxiprep (#catalogue : 12163) de la
compagnie QIAGEN. Le séquençage du plasmide a été effectué à partir de la trousse
Nextera XT DNA library preparation (Illumina) selon les instructions du manufacturier. La
librairie a été séquencée à partir des réactifs de la trousse MiSeq reagent kit v2 (Illumina;
500 cycles) sur un système MiSeq. L’assemblage de novo a été effectué avec la version
2.2.0 de Ray assembler (169) et la couverture des nucléotides a été calculé avec à partir de
SAMtools (170). Le plasmide a été assemblé avec une couverture minimale de 3 700x
pouvant aller jusqu’à plus de 20 000x. Les cadres de lecture ouverts (ORF) ont été
identifiés à partir de GeneMark.hmm (171). Les fonctions des ORFs ont été attribuées à
partir de RAST (172) et des résultats d’alignement des séquences d’acides aminés avec la
base de données de protéines du NCBI à partir de BLASTp (173). La position 1 du
plasmide a été placée au niveau de l’origine de réplication du plasmide.
2.1.4 Tests de résistance aux antibiotiques
Les tests de résistances aux antibiotiques ont été effectués sur milieu solide (BHI, 1%
Agar). Les différentes souches ont été inoculées et incubées durant 96 heures à 30oC avec
différentes concentrations de chloramphénicol (5 µg/ml - 20 µg/ml), d’érythromycine (5
µg/ml - 50 µg/ml), de kanamycine (25 µg/ml - 50 µg/ml) ou d’apramycine (25 µg/ml - 50
µg/ml). Les souches ont été considérées sensibles lorsqu’aucune colonie n’était observée
après 48 heures d’incubation. La concentration minimale d’antibiotique permettant
d’inhiber la croissance des bactéries pendant 48 heures a été utilisée pour la sélection des
transformants à la suite des électroporations.
32
2.1.5 Transformation par électroporation
Un électroporateur Gene Pulser® II de la compagnie BIO-RAD a été utilisé pour
l’ensemble des transformations de B. aurantiacum et B. linens. La méthode de
transformation des Brevibacterium proposée par Leret et al. (92) et adaptée par Nardi et al.
(37) a été utilisée comme méthode standard pour l’ensemble des transformations. Les
bactéries ont été incubées dans un milieu LB ou BHI supplémenté de 2% glycine et 10%
succinate de sodium à 30oC sous une agitation de 200 RPM jusqu’à l’atteinte d’une DO600
de 0,5. Une concentration de 1 µg/ml de pénicilline a été ajoutée et les bactéries ont été
incubées à 30oC sous agitation jusqu’à l’atteinte d’une DO600 de 1,0. Les cellules ont été
lavées de deux à trois reprises avec une solution de 0,8M saccharose à 4oC et conserver sur
glace. Les cellules ont été suspendues dans la solution de lavage pour obtenir une DO600
finale de 60 et conserver sur glace jusqu’à l’électroporation.
Pour l’électroporation, 40 µl de cellules compétentes ont été mélangés avec 1 µg d’ADN
(1-5 µl) dans une cuvette froide. L’électroporation a été effectué avec les paramètres
électriques de 25 µF, 2,5 kV et 400 Ω. Les cellules ont ensuite été suspendues rapidement
dans le milieu de récupération (LB ou BHI supplémenté de 0,5M saccharose) et conserver
sur glace durant 5 minutes. Après avoir incubé les cellules à 30oC sous une agitation de 200
RPM pendant 120 minutes, les cellules ont été étalées sur un milieu de culture solide avec
et sans antibiotique pour la sélection des clones positifs.
À partir de cette méthode standard, différents paramètres ont été testés en parallèle pour
transformer les souches de B. aurantiacum et B. linens. Les modifications apportées au
protocole standard sont présentées dans le tableau 2.3. Ces paramètres ont été testés avec
les souches B. aurantiacum SMQ-1335 et B. linens ATCC 19391. Les paramètres
électriques de l’électroporateur ont été modifiés afin d’obtenir des constantes de temps
variant de 3,8 à 7,6 ms. La composition des milieux de culture, des solutions de lavage et
de récupération a été modifiée en parallèle pour étudier leurs effets sur la transformation de
B. aurantiacum et B. linens. Différents agents d’affaiblissement de la paroi cellulaire, tel
que la glycine, la DL-thréonine et la pénicilline ont été testés à différentes concentrations.
De plus, les milieux de culture et les solutions ont été préparés avec différentes sources
33
d’eau, dont les eaux minérales de marque Evian et Eska, l’eau de source Naya et l’eau de la
ville de Québec pour étudier l’effet de la composition minérale de l’eau sur la
transformation de B. aurantiacum et B. linens. Le pH et la composition minérale des eaux
commerciales utilisées ont été tirés des sites internet des manufacturiers et ils sont présentés
dans le tableau 2.4.
Tableau 2.3 : Sommaire des modifications apportées à la méthode standard et testée pour
les transformations
Étapes Méthode standard Modifications
Affaiblissement de la
paroi cellulaire
- Incubation dans LB (ou
BHI), 2% glycine, 10%
succinate de sodium jusqu’à
DO600 de 0,5
- Ajout de 1 µg/ml pénicilline
et incubation jusqu’à DO600
de 1,0
- LB, 0,5M saccharose, 3%
glycine
- LB, 10% succinate de sodium,
2% glycine, 1% DL-thréonine
- LB, 10% succinate de sodium,
3% glycine, 1% DL-thréonine
- LB, 10% succinate de sodium,
3% glycine
- Traitement avec 5 µg/ml ou 10
µg/ml pénicilline
- Traitement avec 10 U/ml
mutanolysine (37oC, 30 minutes)
Lavage des cellules 2 à 3 lavages avec 0,8M
saccharose (4oC)
- 0,8M saccharose, 10% glycérol
- 10% glycérol
Paramètres électriques
de l’électroporateur
25 µF, 2,5 kV et 400 Ω - 25µF, 2,5 kV et 200 Ω
- 25µF, 1,8 kV et 200 Ω
- Double électroporation
Récupération des
cellules
Récupération des cellules
dans LB (ou BHI), 0,5M
saccharose et incubation
durant
2 h
- LB, 0,5M saccharose, 20 mM
CaCl2, 0,4 mM MgSO4
- LB, 10% succinate de sodium,
20 mM CaCl2, 0,4 mM MgSO4
Sélection des clones
positifs
LB (ou BHI), 1% agar,
antibiotique
- LB, 1% agar, 0,5M saccharose,
20 mM CaCl2, 0,4 mM MgSO4, antibiotique
Modifications générales au protocole
ADN plasmidique - Extraction d’E. coli
- Utilisation de 1 µg
d’ADN pour les
électroporations
- Extraction d’E. coli NEB®
dam-/dcm- pour produire des
plasmides non méthylés
- Utilisation de 100 ng à 10 µg
d’ADN pour les électroporations
Eau utilisée pour la
préparation des milieux de
- Eau distillée - Eau du robinet
- Eau en bouteille Eska
34
culture et des solutions - Eau en bouteille Naya
- Eau en bouteille Evian
Tableau 2.4 : Composition minérale des eaux commerciales utilisées pour les
transformations
Minéraux et pH Eau commerciale
Volvic Eska Naya Evian
pH 7,0 7,8 7,8 7,2
Calcium (mg/l) 12 25 48 80
Magnésium (mg/l) 8 4 26 26
Sodium (mg/l) 12 3 7,9 6,5
Potassium (mg/l) 6 1 2,3 1
Bicarbonate (mg/l) 74 82 260 360
Sulfates (mg/l) 9 8 24,3 14
Chlorures (mg/l) 15 0 3,3 10
Nitrates (mg/l) 7,3 0 0 3,8
Les protocoles de transformation optimisés pour Corynebacterium glutamicum (109) et
Arthrobacter sp (110) ont aussi été testés. Les étapes de ces protocoles sont présentées dans
le tableau 2.5. Le protocole optimisé pour C. glutamicum se distingue par ses différents
milieux de culture et l’utilisation de la DL-thréonine en plus de la glycine pour affaiblir la
paroi cellulaire et du Tween 80 pour augmenter la fluidité de la membrane cellulaire (109).
Ce protocole utilise le milieu NCM (17,4 g/l K2HPO4, 11,6 g/l NaCl, 5 g/l glucose, 5 g/l
tryptone, 1 g/l extrait de levure, 0,3 g/l citrate de sodium, 0,05 g/l MgSO4·7H2O, 91,1 g/l
sorbitol) pour préparer les cellules électrocompétentes, le milieu BHIS (18,5 g/l BHI, 91 g/l
sorbitol) pour la récupération des cellules et le milieu LBHIS (5 g/l tryptone, 5 g/l NaCl,
2,5 g/l extrait de levure, 18,5 g/l BHI, 91 g/l sorbitol, 18 g/l agar) avec antibiotique pour la
sélection des transformants (109). Pour ce qui est du protocole optimisé pour la
transformation des espèces du genre Arthrobacter, cette méthode se distingue par l’absence
de glycine pour affaiblir la paroi cellulaire. Ce protocole utilise un court traitement (1 h)
avec une concentration élevé de pénicilline (30 µg/ml) et il se distingue aussi par un plus
long temps de récupération des cellules (8 h au lieu de 2 h) à la suite des électroporations
(109).
35
Tableau 2.5 : Comparaison des différents protocoles de transformation
Étapes Méthode standard
(37, 92) Protocole optimisé
pour C. glutamicum
(109)
Protocole optimisé
pour Arthrobacter sp.
(110)
Affaiblissement de
la paroi cellulaire
- Incubation dans
BHI, 2% glycine,
10% succinate de
sodium jusqu’à
DO600 de 0,5
- Ajout de 1 µg/ml
pénicilline et
incubation jusqu’à
DO600 de 1,0
- Incubation dans
NCM, 3% glycine,
1% DL-thréonine,
0,1% Tween 80
jusqu’à DO600 de 1,0
- Incubation dans LB
jusqu’à DO600 de 0,3-
0,5
- Ajout de 30 µg/ml de
pénicilline et
incubation durant 1h
Lavage des
cellules
2 à 3 lavages avec
0,8M saccharose
(4oC)
4 lavages avec 10%
glycérol (4oC)
3 lavages avec 10%
glycérol, 0,5M
sorbitol
Paramètres
électriques de
l’électroporateur
25 µF, 2,5 kV et
400 Ω
25 µF, 1,8 kV et
200 Ω
25 µF, 2,5 kV et
400 Ω
Récupération des
cellules
Récupération des
cellules dans BHI,
0,5M saccharose et
incubation durant 2 h
Récupération des
cellules dans BHIS
et incubation durant
2 h
Récupération des
cellules dans LB,
0,5M sorbitol et
incubation durant 8 h
Sélection des
clones positifs
BHI, 1% agar +
antibiotique
LBHIS, 1% agar +
antibiotique
LB + antibiotique
Liste des plasmides et des souches testées avec les différentes méthodes
Plasmides Tous les plasmides
(tableau 2.2)
pBLA8-123-KanR
(Dam+ et Dam -)
pL2Cas9
pMIG3
pNZ123
pNZ8010
pSA3
pBLA8-123-KanR
pUC57-Z1
pZ8-Ptac
Souches Toutes les souches
de B. aurantiacum et
B. linens
(Tableau 2.1)
SMQ-1335
ATCC 19391
SMQ-1335
ATCC 19391
LMA-1184
2.1.6 Propagation et titration des lysats de phages
Les phages de B. aurantiacum ont été amplifiés, dans un premier temps, en inoculant un
bouillon de 10 ml Elliker, 0,5% NaCl, 20 mM CaCl2, 0,4 mM MgSO4 avec 100 µl d’une
36
culture de B. aurantiacum SMQ-1335 et en ajoutant un petit volume d’un lysat de phage
conservé à -80oC dans un milieu Elliker, 0,5% NaCl supplémenté de 15% glycérol. Le
mélange a ensuite été incubé à la température pièce sous agitation durant une nuit complète.
Les lysats ont ensuite été filtrés avec des filtres 0,45 µm (Sarstedt) et conservés à 4oC. Afin
d’obtenir un titre de phages plus élevé, une deuxième amplification a été effectuée de la
même façon en incubant 100 µl d’une culture de B. aurantiacum SMQ-1335 jusqu’à
l’obtention d’une DO600 de 0,2 avant d’ajouter 50 µl du lysat de phage provenant de la
première amplification et ensuite incubé toute la nuit à la température pièce. Le lysat a
ensuite été filtré et conservé comme mentionné ci-haut.
Les phages ont ensuite été titrés à partir de la méthode d’ensemencement dans une gélose
molle. Le lysat a été dilué en série par des facteurs de 10 dans un tampon de phage 1X (50
mM tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 8 mM MgSO4) jusqu’à une dilution finale de 10-7
. Les
géloses molles (Elliker, 0,5% NaCl, 20 mM CaCl2, 0,15% Tween 80, 0,75% agar),
préalablement fondues, ont été conservées à 55oC. Les géloses molles ont ensuite été
inoculées rapidement avec 300 µl d’une culture de B. aurantiacum SMQ-1335 et 100 µl de
l’une des dilutions 10-4
à 10-7
et le tout a été versé sur des géloses solides Elliker-NaCl-
CaCl2-Tween 80 (1% agar). Les boîtes de Pétri ont été incubées à la température pièce pour
48 heures à 72 heures.
2.1.7 Extraction de l’ADN génomique des phages
Des titres de phages égaux ou supérieurs à 109 UFP/ml ont été utilisés pour les extractions
d’ADN. Un volume de 1 ml de chloroforme a été ajouté à 1 ml de lysat de phages, mélangé
au vortex et centrifugé à 34 500 G, 4oC. La phase supérieure a ensuite été transférée dans
un nouveau tube et 5 µl de RNase (10 mg/ml), 5 µl DNase (1 mg/ml) et 10 mM MgSO4 ont
été ajoutés au mélange. Le mélange a été incubé à 37oC durant 30 minutes et 100 µl du
mélange SDS (0,25 M EDTA, 0,5 M tris-HCl pH 9,0, 2,5% SDS), préalablement incubé à
65oC, ont été ajoutés et le mélange a été incubé à 65
oC durant 30 minutes. À la suite de
l’incubation, 125 µl d’acétate de potassium (8 M) ont été ajoutés et le mélange a été placé
sur glace pour 30 minutes. Le mélange a été centrifugé à 34 500 G, 4oC durant 10 minutes
et le surnageant a été transféré dans deux microtubes (500-600 µl/tube). À deux reprises, un
37
volume de 500 µl de phénol-chloroforme (1 :1) a été ajouté dans chaque tube, mélangé au
vortex et centrifugé à la température pièce à 18 500 G. Les phases supérieures des deux
tubes ont ensuite été mélangées dans le même tube avec un volume de 0,7 isopropanol et
centrifugées à 34 500 G, 4oC durant 10 minutes. Le culot d’ADN a ensuite été lavé à 3
reprises avec de l’éthanol 70%. Après les lavages, le culot a été séché et resuspendu dans
20 µl de tampon EB (10 mM tris-HCl, pH 8,5).
2.1.8 Électroporation de l’ADN génomique des phages
Le protocole de transformation de B. aurantiacum par électroporation avec des plasmides a
été adapté pour transformer les cellules avec de l’ADN génomique de phages et permettre
l’amplification de ceux-ci. Cette approche a précédemment été utilisée pour récupérer des
particules virales d’E. coli à partir de leur ADN génomique (174). Pour ce faire, la méthode
standard de transformation (section 2.1.5) a été modifiée pour permettre l’amplification des
phages. Les cellules électrocompétentes ont été préparées et transformées par
électroporation avec 1 µg d’ADN génomique de phages. Les cellules ont ensuite été
récupérées dans une solution de récupération avec les composantes essentielles à la
prolifération des phages de B. aurantiacum SMQ-1335, soit le milieu Elliker, 0,5% NaCl,
20 mM CaCl2 et 0,4 mM MgSO4 et incubées, en parallèle, durant 2 heures et toute la nuit
sous agitation à température pièce. Après une récupération de 2 heures, les cellules ont été
inoculées sur boîte de Pétri à partir d’une gélose molle et incubées durant 48 heures à la
température pièce (section 2.1.6). Les bouillons de récupération incubée durant toute la nuit
ont ensuite été filtrés avec un filtre de 0,45 µm et des titrations ont été effectuées pour
observer la présence de phages et confirmer/réfuter l’entrée de l’ADN et la propagation du
phage.
2.1.9 Construction de vecteurs par assemblage Gibson
Développé en 2009 par Daniel Gibson, l’assemblage du même nom permet de joindre deux
fragments d’ADN ou plus à partir d’une réaction isotherme à 50oC. Cet assemblage est
catalysé par trois enzymes, soit une exonucléase, une ADN polymérase et une ADN ligase
(figure 2.1). Simple et rapide, cette technique permet le clonage de plusieurs fragments
38
d’ADN de taille allant jusqu’à 583 kb, et ce, sans dépendre de la disponibilité de sites de
restriction (175).
Figure 2.1 : Assemblage Gibson de deux fragments d’ADN. Figure traduite de Gibson et
al. (175).
Les assemblages Gibson ont été effectués selon les instructions du manufacturier (NEB –
Gibson Assembly® Cloning Kit) pour construire les vecteurs pBLA8-123, pBL1-123,
pBLA8-123-KanR et pUC57-Z1 (tableau 2.2). Dans un premier temps, les vecteurs utilisés
ont été digérés par une enzyme de restriction ayant un site de restriction unique. En
parallèle, l’insert a été amplifié par PCR avec des extensions de 20 à 30 pb correspondantes
aux extrémités du vecteur digéré (figure 2.1). Les fragments d’ADN ont ensuite été purifiés
à partir de la trousse QIAquick PCR Purification (QIAGEN #catalogue : 28104) et dosés sur
gel après coloration au bromure d’éthidium. Les réactions ont été réalisées en mélangeant
10 µl de mélange d’assemblage Gibson (2X) avec 100 ng de vecteur et 2-3 fois plus
d’inserts (ratio picomolaire) et le volume final a été ajusté à 20 µl avec de l’eau
39
déminéralisée. Les concentrations picomolaires (pmole) des fragments d’ADN ont été
calculées à partir de la formule suivante :
pmole =(ng d′ADN) 𝑥 1000
nombre de pb x 650 daltons
Les réactions ont ensuite été incubées dans un thermocycleur à 50oC durant 60 minutes.
Après incubation, les mélanges ont été conservés sur glace jusqu’à la transformation ou
congelés à -20oC jusqu
’à utilisation ultérieure. Les cellules compétentes d’E. coli NEB® 5-
alpha ont été transformées par choc thermique selon les instructions du manufacturier. Les
cellules chimiocompétentes ont été décongelées sur glace durant 10 minutes et incubées
avec 2-5 µl de produits d’assemblage Gibson durant 30 minutes sur glace. Le choc
thermique a ensuite été réalisé à 42oC durant exactement 30 secondes et les cellules ont été
remises sur glace pour 5 minutes. Après le choc thermique, 950 µl de milieu SOC ont été
ajoutés et les transformants ont été récupérés à 37oC sous une agitation de 200 RPM
pendant 60 minutes. Les cellules ont ensuite été sélectionnées sur LB avec antibiotique
selon le plasmide utilisé, soit 20 µg/ml chloramphénicol pour pBLA8-123 et pBL1-123, 50
µg/ml de kanamycine pour pBLA8-123-KanR et 150 µg/ml ampicilline pour pUC57-Z1.
Le criblage des clones ayant intégré la construction Gibson a été effectué par PCR sur
colonie et les insertions présentes dans les clones positifs ont été séquencés pour confirmer
l’absence de mutations.
Au niveau des différents vecteurs construits par assemblage Gibson, le plasmide pNZ123 a
été linéarisé avec l’enzyme EcoR1. Les réplicons du plasmide pBLA8 (92) natif de B.
linens ATCC 19391 et du plasmide pBL1 (94) natif de C. glutamicum ATCC 21086 ont été
amplifiés par PCR et clonés parallèlement dans pNZ123 linéaire, générant les vecteurs
pBLA8-123 (figure 2.2) et pBL1-123. Le gène de résistance à la kanamycine du plasmide
pZ8-T-dCas9 (104) a été amplifié et cloné dans le vecteur pBLA8-123 linéarisé par XhoI
pour générer le vecteur pBLA8-123-KanR. Pour ce qui est de pUC57-Z1, le réplicon de
pBLA8 (figure 2.2) a été cloné dans le vecteur pUC57-KanR (section 2.1.10) linéarisé par
XbaI. L’ensemble des amorces utilisées pour les assemblages Gibson est présenté dans le
tableau 2.6.
40
Figure 2.2 : Représentation schématique de la construction du vecteur d’expression
pBLA8-123. Les extrémités chevauchantes des amorces et des extrémités du vecteur digéré
sont identifiées de la même couleur.
Tableau 2.6 : Liste des amorces utilisées pour la construction de vecteurs par assemblage
Gibson. Les séquences en lettre minuscule correspondent aux extensions complémentaires
aux extrémités des vecteurs digérés respectifs.
Nom des amorces Séquence (5’ → 3’)
pBLA8-123 Fwd gaagcttgagctctctagagGACCTTCATGTCTTCGAGTG
pBLA8-123 Rev cagctccagatccagtactgGCTAGGAGTACCCAATGAAC
pBL1-123 Fwd gaagcttgagctctctagagCGGTGTGCAATCTATTCACG
41
pBL1-123 Rev cagctccagatccagtactgCTAGGTATCGGACACGTAAC
pBLA8-KanR Fwd ctcattgagaagattgccgaaaatatgcacCTGCATCTTTGAGCGCTGAG
pBLA8-KanR Rev catgaaggtcctctagagagctcaagcttcCAGTGCCAACATAGTAAGCC
pUC57-Z1 Fwd attcgagctcggtacctcgcgaatgcatCAAGCATGACCCAGCGACAC
pUC57-Z1 Rev ccgtctgcggcgaatggggatccgatatGATCCTGCTGTCGTCATTGG
2.1.10 Optimisation des codons du gène de résistance à la kanamycine
Les codons du gène de résistance à la kanamycine du plasmide pZ8-T-dCas9 de C.
glutamicum ont été optimisés avec le programme Codon Optimization On-Line (COOL)
(176). Les régions codantes du génome de B. aurantiacum SMQ-1335 (numéro
d’accession: NZ_CP017150) ont été extraites et utilisées comme table de codons pour
l’optimisation. L’index d’utilisation des codons individuels, le contexte d’utilisation des
codons, le pourcentage de G+C et l’instabilité de la région 5` de l’ARN ont été utilisés
comme paramètres pour l’optimisation de la séquence du gène de résistance à la
kanamycine. La séquence du promoteur natif du gène NADH déshydrogénase, identifiée
dans le génome de SMQ-1335, a été insérée en amont du gène de résistance à la
kanamycine. Le terminateur du bactériophage Fd du plasmide pCRISPomyces-2 de
Streptomyces sp. a été ajouté en aval du gène de résistance (figure 2.3). La séquence
développée a été synthétisée et clonée dans le plasmide pUC57 par la compagnie Bio Basic.
Figure 2.3 : Représentation schématique du gène synthétique de résistance à la kanamycine
aux codons optimisés développés sur mesure pour B. aurantiacum.
2.2 Résultats et discussion
2.2.1 Profil plasmidique de B. aurantiacum
Les souches de B. aurantiacum étudiées sont résistantes au lysozyme, mais sensibles à la
mutanolysine. Le protocole d’extraction de plasmides a donc été optimisé en utilisant le
tampon de lyse (tampon TE, pH 8,0, 30 U/ml mutanolysine, 0,6 mg/ml lysozyme) proposé
par Amarita et al. (47). Plusieurs extractions de plasmides ont été effectuées avec les six
42
souches de Brevibacterium aurantiacum fournies par la coopérative laitière Agropur, mais
aucun plasmide n’a été retrouvé chez ces souches (figure 2.4).
Figure 2.4 : Profil plasmidique des souches de B. aurantiacum sur gel d’agarose 0,8%
après 45 minutes de migration des acides nucléiques à 110 volts. De gauche à droite : (1)
échelle ADN 1kb Plus (Invitrogen™), (2-8) différentes souches de B. aurantiacum, (9)
contrôle positif Lactococcus lactis PJ401, (10) Échelle ADN supercoiled (Invitrogen™)
2.2.2 Résistance aux antibiotiques
Des tests de croissance ont été effectués avec les souches de Brevibacterium en présence de
divers antibiotiques utilisés comme marqueur de sélection pour les différents plasmides
utilisés lors de ce projet de recherche. B. aurantiacum est sensible à l’érythromycine, au
chloramphénicol, à la kanamycine et à l’apramycine (tableau 2.7). Des plasmides arborant
des gènes de résistance à ces différents antibiotiques peuvent donc être utilisés pour
transformer cette espèce. B. linens ATCC 19391 est aussi sensible à l’érythromycine, au
chloramphénicol et à la kanamycine, mais cette souche est résistante à l’apramycine. Les
vecteurs pCRISPomyces-2 (106) et pKCcas9DO (107) construits pour les actinobactéries
du genre Streptomyces possèdent un gène de résistance à l’apramycine et ils ne peuvent
donc pas être utilisés avec cette espèce. De plus, B. linens est moins sensible que B.
aurantiacum aux antibiotiques testés (tableau 2.7), il est donc nécessaire d’utiliser des
43
quantités plus élevées d’antibiotiques pour prévenir la croissance de faux positifs à la suite
des transformations. Il est important de souligner que les concentrations d’antibiotiques
utilisées sont relativement faibles et elles permettent seulement d’inhiber la croissance des
souches utilisées pendant 48 heures. Certaines colonies peuvent croître après 72 heures et
plus d’incubation et elles représentent des faux positifs à la suite des transformations.
Tableau 2.7 : Croissance des souches de Brevibacterium en présence d’antibiotiques
utilisés comme marqueur de sélection lors des transformations génétiques. Les souches sont
considérées résistantes (+) lorsqu’une croissance est observée en moins de 48 heures
d’incubation à 30oC avec l’antibiotique. Les souches sont considérées sensibles (-)
lorsqu’aucune colonie n’est observée après 48 heures d’incubation à 30oC avec
l’antibiotique.
Souches Antibiotiques
Érythromycine
(5 µg/ml)
Chloramphénicol
(5 µg/ml)
Kanamycine
(30 µg/ml)
Apramycine
(25 µg/ml)
B. aurantiacum
SMQ-1335
- - - -
B. aurantiacum
SMQ-1417
- - - -
B. aurantiacum
SMQ-1418
- - - -
B. aurantiacum
SMQ-1419
- - - -
B. aurantiacum
SMQ-1420
- - - -
B. aurantiacum
SMQ-1421
- - - -
B. linens
ATCC 19391
+
(Sensible à 25
µg/ml)
- +
(Sensible à 50
µg/ml)
+
2.2.3 Caractérisation du plasmide pBLA8
La souche B. linens ATCC 19391, possédant le plasmide de 7,59 kb pBLA8, a été
commandée et le plasmide a été séquencé (figure 2.5). Un fragment de 3,159 kb du
plasmide natif pBLA8 a préalablement été utilisé pour la construction d’un vecteur pour B.
linens (92). Appartenant à la famille des plasmides de type ColE2, ce plasmide possède 16
ORFs, dont deux codant pour les protéines essentielles à la réplication, RepA et RepB, et
44
une protéine de réplication non essentielle impliquée dans le système de partage du
plasmide. L’origine de réplication du plasmide a été identifiée en amont de l’opéron repAB.
La région minimale nécessaire à la réplication du plasmide, contenant l’Ori, repA et repB,
est retrouvée entre les sites de restriction KpnI et EcoRV (92). Les séquences d’acides
aminés des 13 autres ORFs ont été alignées à partir de BLASTp (173) et des similarités
entre les ORFs 11 et 13 avec respectivement, une recombinase (38% d’identité, Rothia sp.)
et une alpha-mannosidase (52% d’identité, Rothia sp.) ont été notées. Toutefois, les
séquences ne partagent pas un pourcentage d’identité assez élevé pour que ces protéines
soient considérées orthologues avec des protéines connues et leurs fonctions demeurent
putatives. Les 11 autres ORFs ne partagent pas d’identité significative avec aucune protéine
ayant une fonction connue et leurs fonctions demeurent inconnues.
Figure 2.5 : Carte du plasmide natif pBLA8 de B. linens ATCC 19391.
2.2.4 Transformation des plasmides
Puisqu’aucun plasmide natif n’a été retrouvé chez six souches laitières de B. aurantiacum
(section 2.2.1), nous avons utilisé d’autres plasmides. Le réplicon du plasmide pBLA8 a été
45
cloné dans le plasmide pNZ123 par assemblage Gibson (figure 2.2) (175). Différents
protocoles et plusieurs paramètres de transformation par électroporation ont été testés afin
d’introduire ce vecteur dans B. linens et B. aurantiacum, mais il a été impossible d’obtenir
des transformants. Un gène de résistance à la kanamycine, provenant du plasmide pZ8- T-
dCas9 de C. glutamicum, a ensuite été cloné sur le vecteur pBLA8-123 pour obtenir
pBLA8-123-KanR, mais il a été impossible de transformer les sept souches de
Brevibacterium du laboratoire même avec le réplicon du plasmide natif pBLA8 et un
marqueur phénotypique provenant d’une autre actinobactérie. Le réplicon pBLA8 a été
séquencé sur les vecteurs construits pour confirmer l’intégrité de la séquence et l’absence
de mutations. Parallèlement, 12 plasmides à large spectre pour bactéries à Gram positif,
pour Corynebacterium glutamicum et pour Streptomyces ont aussi été testés avec les
souches de Brevibacterium (tableau 2.2) en utilisant les protocoles précédemment utilisés
pour transformer B. linens et B. aurantiacum (37, 92). Aucun transformant n’a été obtenu
avec l’ensemble des plasmides testés, et ce, même avec trois plasmides ayant les mêmes
origines de réplication, protéines de réplication Rep et marqueurs phénotypiques que les
plasmides utilisés par Nardi et al. (pBLA8-123-KanR, pTRKH2 et pGHOST4) (37). En
résumé, il a été impossible de reproduire les résultats obtenus précédemment dans les deux
seuls articles scientifiques mentionnant la transformation génétique de B. linens (37, 92).
Comme mentionné précédemment, des systèmes R-M peuvent agir comme barrière pour la
transformation des bactéries à Gram positif et ces systèmes affectent l’efficacité de
transformation des Corynebacterium avec de l’ADN isolé d’espèces différentes (93–95).
L’analyse du génome de B. aurantiacum SMQ-1335 a révélé la présence de plusieurs
systèmes R-M putatifs, dont un nouveau système R-M de type I (50). Il est donc possible
que ces systèmes agissent comme barrière pour la transformation de cette espèce. De plus,
la méthylation de l’ADN par l’adénine méthyltransférase Dam et la cytosine
méthyltransférase Dcm peut aussi affecter l’efficacité de transformation des
Corynebacterium (93, 95–100). En somme, la méthylation de l’ADN par E. coli lors de la
production des plasmides pourrait interférer avec l’efficacité de transformation des
Brevibacterium. Les plasmides pTRKH2 et pBLA8-123-KanR ont donc été transformés et
extraits de la souche E. coli dam-/dcm- (NEB) pour produire des plasmides non méthylés.
46
L’utilisation de plasmides non méthylés n’a pas permis l’obtention de transformants avec
les souches de Brevibacterium.
À la suite de discussions avec les auteurs/chercheurs des deux seuls articles mentionnant la
transformation génétique de Brevibacterium (37, 92), il a été suggéré que la source d’eau
utilisée pourrait être à l’origine des échecs de transformation. Selon Carlos Blanco, il a été
nécessaire d’utiliser leur eau (Rennes, Bretagne, France) ou l’eau de source de marque
Volvic pour arriver à transformer B. linens ATCC 19391. Différentes eaux de source
commerciales (Evian, Naya et Eska) ayant un pH et une composition minérale similaire à
l’eau de marque Volvic ont donc été testées en parallèle pour préparer l’ensemble des
milieux de culture et des solutions. Cependant, aucune transformation n’a fonctionné avec
les différentes eaux de source.
Différents paramètres électriques de l’électroporateur et milieux de culture ont aussi été
testés en parallèle lors de l’ensemble des transformations. Des kilovolts de 1,8 à 2,5 ont été
testés avec des ohms (Ω) allant de 200 à 400 afin d’obtenir des constantes de temps variant
de 3,8 à 7,6 ms. Des tests de résistance à la glycine et à la pénicilline ont été effectués pour
s’assurer que les concentrations utilisées étaient adéquates et assez élevées pour permettre
l’affaiblissement de la paroi cellulaire de B. linens et B. aurantiacum. D’après la faible
croissance (ou l’absence de croissance) observée avec des concentrations plus élevées de
glycine (5%), les concentrations utilisées (2 à 3% glycine) semblaient adéquates. Des
transformations ont aussi été effectuées en utilisant la DL-thréonine avec ou sans glycine
comme agent d’affaiblissement de la paroi cellulaire. Le protocole optimisé de
transformation de C. glutamicum a aussi été testé (109). Ce protocole utilise une
concentration de 3% glycine pour affaiblir la paroi cellulaire et 0,1% Tween 80 pour
augmenter la fluidité de la membrane cellulaire. En parallèle, différents milieux de culture
(Elliker, BHI, LB et NCM), solutions de lavage (0.8M saccharose ou 10% glycérol) et
solutions de récupération avec ou sans CaCl2 et MgSO4 (LB 0,5M saccharose; LB 10%
succinate de sodium; BHI 0,5M saccharose; BHI 10% succinate de sodium; SOC) ont aussi
été testés. Il a été impossible de transformer les sept souches de Brevibacterium du
47
laboratoire avec l’ensemble des conditions, des milieux de culture, des solutions tampons et
des paramètres électriques testés (Tableau 2.3).
Avec l’ensemble des conditions et paramètres de transformation testés ainsi que
l’utilisation d’un vecteur ayant un réplicon provenant d’un plasmide natif de B. linens, il est
possible que le problème soit au niveau de l’expression du marqueur phénotypique, soit le
gène de résistance à la kanamycine. Avec 45% G+C, il est possible que ce gène de
résistance ne soit pas exprimé de façon optimale chez les souches de Brevibacterium qui
possèdent un %G+C variant de 62,6 à 64,8%. Les codons du gène de résistance à la
kanamycine du plasmide pZ8-T-dCas9 de C. glutamicum ont donc été optimisés avec le
programme Codon Optimization On-Line (COOL) (176). Le promoteur natif du gène
NADH déshydrogénase, du génome de SMQ-1335, a été inséré en amont du gène de
résistance à la kanamycine. En étant essentiel pour la survie cellulaire, ce promoteur fort
pourrait permettre l’expression constitutive du gène de résistance à la kanamycine. Le
terminateur du bactériophage Fd du plasmide pCRISPomyces-2 de Streptomyces sp. a aussi
été ajouté en aval du gène de résistance (figure 2.3). La séquence développée a été
synthétisée et clonée dans le plasmide pUC57 par la compagnie Bio Basic.
Le réplicon de pBLA8 a ensuite été cloné par assemblage Gibson dans le plasmide pUC57-
KanR pour être transformé chez B. linens. Le plasmide pUC57-Z1, construit par
assemblage Gibson, a été utilisé pour transformer les souches SMQ-1335 et ATCC19391
avec différents paramètres et milieux de culture. Encore une fois, il a été impossible de
transformer ces souches avec la nouvelle construction. Avec un vecteur spécifiquement
construit pour Brevibacterium, il est possible que les problèmes de transformation soient
liés à l’entrée de l’ADN et non à la réplication de l’ADN. Pour tester cette hypothèse, le
protocole de transformation utilisé a été adapté pour transformer B. aurantiacum SMQ-
1335 avec l’ADN génomique de cinq différents phages (OK13II; P1DII; P2DI; OK22I;
OK22II). Cette approche a été décrite et utilisée pour récupérer des bactériophages d’E. coli
à partir de leur ADN génomique (174). Avec l’ensemble des conditions, paramètres et
bactériophages testés, aucune plage de lyse n’a été observée. En somme, ces résultats
suggèrent que l’ADN n’arrive pas à entrer dans les cellules par électroporation.
48
2.3 Conclusion
Le développement d’un outil génétique pour Brevibacterium aurantiacum est crucial pour
étudier cette bactérie, incluant les facteurs de l’hôte impliqués dans la résistance aux
bactériophages. La construction d’un vecteur capable de se répliquer chez cette espèce
permettrait d’effectuer des tests de complémentation génétiques et d’adapter le système
CRISPR-Cas9. L’adaptation de cette technologie permettrait d’inactiver certains gènes
présents chez B. aurantiacum, mais aussi chez ses bactériophages, apportant ainsi des
preuves expérimentales de l’importance de certaines protéines dans l’interaction entre cette
actinobactérie d’affinage et ses phages. Toutefois, il a été impossible de transformer sept
souches du genre Brevibacterium en testant différents vecteurs, marqueurs phénotypiques
et conditions de transformation.
Lors de cette étude, la méthode standard de transformation génétique de B. linens et B.
aurantiacum a été utilisée avec plusieurs variations/adaptations et plusieurs plasmides, mais
aucun transformant n’a été observé avec l’ensemble des expérimentations réalisées. De
plus, il a été impossible de reproduire les résultats obtenus par Leret et al. (92) en 1998 à
l’Université de Rennes (France) et Nardi et al. (37) en 2005 à l’Institut National de la
Recherche Agronomique (France). De toute évidence, les actinobactéries du genre
Brevibacterium sont récalcitrantes à la transformation génétique et les résultats publiés dans
ces deux articles scientifiques ne sont pas reproductibles avec nos conditions. À l’avenir, il
sera important de développer un nouveau protocole de transformation pour les
Brevibacterium afin d’étudier ces actinobactéries de haute importance industrielle.
49
CHAPITRE 3 : GÉNOMIQUE COMPARATIVE
3.1 Résumé de l’article scientifique
Titre : Mobilome of Brevibacterium aurantiacum sheds light on its genetic diversity and its
adaptation to smear-ripened cheeses
Résumé : Brevibacterium aurantiacum est une actinobactérie qui confère des propriétés
organoleptiques clés aux fromages à croûte lavée lors de l’affinage en surface. Nous avons
séquencé six génomes additionnels de Brevibacterium par PacBio RSII et nous avons
effectué des analyses phylogénétiques et pangénomiques. Nos analyses phylogénétiques ont
révélé que les souches laitières précédemment considérées comme B. linens appartiennent
à l’espèce B. aurantiacum. Des séquences d’insertion (IS) et des transferts horizontaux de
gènes (HGT) entre diverses actinobactéries d’affinage ont été observés chez tous les
génomes de B. aurantiacum. Entre autres, des régions HGT impliquées dans l’acquisition
de fer ont été retrouvées chez cinq génomes de B. aurantiacum, ce qui suggère une
coopération évolutive entre les actinobactéries d’affinage. Notre analyse génomique
comparative apporte des informations importantes sur la position taxonomique des souches
commerciales de B. aurantiacum et leur adaptation génétique à l’écosystème des fromages.
Abstract : Brevibacterium aurantiacum is an actinobacterium that confers key organoleptic
properties to washed-rind cheeses during surface ripening. We sequenced the genomes of
five Brevibacterium dairy strains and one non-dairy strain using PacBio RSII. Then, we
performed phylogenetic and pan-genome analyses. Our phylogenetic analysis revealed that
these five dairy strains, previously identified as B. linens, belong to the B. aurantiacum
species. Insertion sequences (IS) and horizontal gene transfer (HGT) between cheese rind
actinobacteria were observed in all B. aurantiacum genomes. Interestingly, genes involved
in iron acquisition were found in five B. aurantiacum strains. Low iron availability in milk
is likely a driving force in the adaptation to this ecosystem and the exchange of iron uptake
systems suggests cooperative evolution between cheese rind actinobacteria. Our
comparative genomic analysis sheds light on the taxonomic position of commercial B.
aurantiacum strains and its genetic adaptation to cheese ecosystem.
50
Mobilome of Brevibacterium aurantiacum sheds light on its genetic
diversity and its adaptation to smear-ripened cheeses
Sébastien Levesquea, Simon J. Labrie
b and Sylvain Moineau
a,c#
a Département de biochimie, de microbiologie, et de bio-informatique, Faculté des
sciences et de génie, Groupe de recherche en écologie buccale, Faculté de médecine
dentaire, Université Laval, Québec City, QC, G1V 0A6, Canada
b Syntbiolab, Lévis, QC, G6W 0L9, Canada
c Félix d'Hérelle Reference Center for Bacterial Viruses, Faculté de médecine dentaire,
Université Laval, Québec City, QC, G1V 0A6, Canada
Running Title: Mobilome of dairy Brevibacterium aurantiacum strains
# Correspondence to [email protected],
Tel: +1 418 656 3712
51
3.2 Abstract
Brevibacterium aurantiacum is an actinobacterium that confers key organoleptic properties
to washed-rind cheeses during surface ripening. The genome plasticity of this industrially
relevant species is understudied due to the lack of complete genomic sequences. We
sequenced the genomes of five Brevibacterium dairy strains and one non-dairy strain using
PacBio RSII. Then, we performed phylogenetic and pan-genome analyses, including
comparisons with other publicly available Brevibacterium genomic sequences. Our
phylogenetic analysis revealed that these five dairy strains, previously identified as B.
linens, belong to the B. aurantiacum species. A high number of transposases and integrases
were observed in the Brevibacterium spp. strains. In addition, we identified 14 new
insertion sequences in B. aurantiacum genomes and 12 in B. linens genomes. Several
stretches of homologous DNA sequences were also found between cheese rind
actinobacteria and seven B. aurantiacum genomes, suggesting recent horizontal gene
transfer (HGT). An HGT region from the iRon Uptake/Siderophore Transport Island
(RUSTI) and an iron uptake composite transposon were found in five B. aurantiacum
genomes. Low iron availability in milk is likely a driving force in the adaptation of this
bacterial species to this ecosystem and the exchange of iron uptake systems suggests
cooperative evolution between cheese rind actinobacteria. We also demonstrate that the
Brevibacterium Lanthipeptide Island (BreLI) integrative conjugative element is active and
can excise from the B. aurantiacum SMQ-1417 chromosome. Our comparative genomic
analysis suggests that mobile genetic elements played an important role into the adaptation
of B. aurantiacum to cheese ecosystems.
Key words : Brevibacterium aurantiacum, smear-ripened cheeses, comparative genomics,
mobile genetic elements, iron acquisition
3.3 Importance
Only two complete B. aurantiacum genomes are currently available in public databases. B.
aurantiacum genomes contain a high number of transposable elements and their genome
sequences remain at the draft level when sequenced with short-read sequencing
technologies, which precludes in-depth analysis of mobile genetic elements and genome
52
plasticity. Here, we used long-read sequencing technology to provide six new complete
Brevibacterium genomes. We identified a high number of mobile genetic elements that
could be involved in the growth fitness of B. aurantiacum on the surface of smear-ripened
cheeses. These genetic traits are shared between cheese rind actinobacteria and they are
involved in iron acquisition and antimicrobial peptide synthesis. Our study shows that
mobile genetic elements are widespread in B. aurantiacum and contribute to its genomic
diversity.
3.4 Introduction
The coexistence and succession of diverse microorganisms over time lead to the
development of distinct organoleptic properties in a wide variety of aged cheeses. The
surface of bacterial smear-ripened cheeses are regularly washed with a microbial-rich brine
during the ripening period, which allows the colonization of an orange microbial mat
composed of various species of yeasts and bacteria. The early surface microflora of
washed-rind cheeses is primarily composed of yeasts that release growth factors and
alkalinize the cheese surface by metabolizing lactic acid produced by lactic acid bacteria
starter culture (177). These processes promote the growth of an acid-sensitive, salt-tolerant
bacterial microflora primarily composed of actinobacteria from the Micrococcaeae and
Corynebacteriaceae families (15). The combined metabolic activities of this complex
microbiota are responsible for the typical texture, color, and aroma of this type of cheeses
(30).
Strains of Brevibacterium linens are widely used for washed rind cheese ripening as they
produce volatile sulfur compounds (VSCs) (47, 48), carotenoids (5, 42), lipolytic and
proteolytic enzymes (20), which drive the development of aroma, color and texture of
smear-ripened cheeses. The dairy strains B. linens ATCC 9175 and B. linens BL2 were
reported to produce VSCs and carotenoids (41, 47, 48) but they were separated from the
type strain B. linens ATCC 9172 and reclassified as B. aurantiacum according to their
genetic, physiological, and biochemical characteristics (38, 39). A recent study also
identified B. aurantiacum as the dominant bacterial species in five different smear-ripened
cheeses (19), suggesting that the taxonomic position of industrial Brevibacterium cheese
53
isolates may need to be revisited. The first complete genomes of B. linens (strains BS258
and SMQ-1335) were deposited in public database in September 2016 (50, 178). Moreover,
because B. linens BS258 and B. linens SMQ-1335 have been respectively isolated from
marine sediment in China (178) and smear-ripened cheese in Canada (50), comparative
genome analysis may provide insights into the genetic determinants involved in their niche
adaptation.
Traditionally, the cheese ripening process involved the transfer of an undefined microflora
from mature cheeses to fresh unripened cheeses, thereby selecting for microorganisms well
adapted to the surface of this ecosystem (21). Hence, smear-ripened cheese is an interesting
model to study the adaptation of microorganisms to a new habitat. The prevalence of
horizontal gene transfer (HGT) in cheese rind microbiomes has recently been described
with 4,733 protein coding genes identified in over 200 putative horizontally transferred
genomic regions (29). Genes involved in iron siderophore acquisition were shown to be
widespread in cheese rind microbiomes in Europe and in the USA (29). Interestingly, the
low iron concentration found in cheese rinds appears to be one of the major metabolic
bottlenecks for growth of ripening bacteria (28, 179). Thus, iron acquisition is a significant
driving force in the microbial adaptation to the cheese surface. Taken together, these
observations suggest a cooperative evolution between cheese rind actinobacteria to colonize
the cheese surface.
Recently, the comparative analysis of 23 genomes from strains of Brevibacterium spp.,
including 12 strains isolated from cheeses, was performed to identify the genetic
determinants involved in adaptation to the cheese habitat (140). The gene repertoire
involved in iron acquisition, osmotic tolerance, bacteriocin production and the ability to use
the energy compounds present in cheeses, such as carbohydrates, amino acids, proteins and
lipids, has been described (140). However, all Brevibacterium strains isolated from cheeses
were sequenced using short-read sequencing and their genome sequences remained at the
draft level. As such, in-depth investigation of the mobile genetic elements could not be
performed because for example the analysis of transposon-rich genome critically depend on
long read sequencing technology (180, 181).
54
Here, we report the complete genome sequences of five industrial dairy strains of B.
aurantiacum and one strain of B. linens using the PacBio RSII platform. Then, we
performed 16S rRNA and core-genome phylogenetic analyses, which led to the
reclassification of many dairy B. linens strains into the species B. aurantiacum. We also
carried out a comparative analysis to describe the mobile genetic elements involved in the
genome plasticity and adaptation of B. aurantiacum to smear-ripened cheese surfaces.
Finally, in addition to the recent description of the gene repertoire necessary for
Brevibacterium spp. to thrive in cheeses (140), we identified other key features responsible
for the quality of smear-ripened cheeses, such as carotenoid production.
3.5 Results
3.5.1 Taxonomic classification of B. linens and B. aurantiacum
First, we performed 16S rRNA phylogenetic analysis with 29 Brevibacterium sequences
from GenBank database (NCBI) and our six strains. With less than 97% identity, we
observed a significant separation between our dairy strains and the other B. linens strains
(Fig. 3.1). All dairy strains analyzed in this study were identified as B. aurantiacum. Of the
eight 16S rRNA complete B. linens sequences available in GenBank, six representatives
were mostly isolated from marine sediments, coral, soil, or contaminated water (38, 178,
182, 183). Only B. linens Mu101 and the type strain ATCC 9172 were isolated from cheese
(Fig. 3.1). The results obtained from our dataset suggest that B. linens representatives are
mainly environmental isolates while the strains used for commercial cheese ripening belong
to the B. aurantiacum species.
55
Figure 3.1 : Phylogenetic tree of 35 Brevibacterium spp. 16S rRNA nucleotide sequences.
The phylogenetic tree was constructed with MEGA 7.0.26 using the maximum likelihood
method with 1,000 bootstraps (only bootstrap values >50 are shown next to the nodes).
Dairy strains are in orange. Strains used in this study are in bold. C. casei LMG S-19264
was used as an outgroup.
56
3.5.2 General genome features and plasmid content
To shed light on the evolution and genomic diversity of this industrially relevant
actinobacterium, we used PacBio RSII to sequence the genome of six Brevibacterum
strains including five dairy strains used in Canada and one strain from the American Type
Culture Collection (ATCC) (Table 3.1). We also added three other genomes (B.
aurantiacum SMQ-1335 and JB5 as well as B. linens BS258) to our analyses as they were
previously sequenced with the same technology (Table 3.1). The genome length of B.
aurantiacum strains ranged from 4.035 to 4.424 Mbp with a high G+C content of 62.63%
to 62.79% (Table 3.2). The two B. linens strains had a smaller genome (3.807 and 3.862
Mbp) and a higher G+C content (64.79% and 64.16%). The number of coding sequences
(CDS) predicted in B. linens genomes was lower than in B. aurantiacum, correlating with
the smaller genome sizes. Four rRNA operons were observed in all Brevibacterium strains
analyzed in this study. The average number of predicted CDS per B. aurantiacum genome
was 3,805, of which 79.3% could be assigned a function based on in silico predictions.
Table 3.1 : Brevibacterium spp. strains used in this study.
Strain GenBank numbers Source Sequencing
technology
Year Status References
B. aurantiacum
SMQ-1417 CP025330 Commercial
dairy strain
PacBio SMRT 2017 Complete
genome
This study
SMQ-1418 CP025331 Commercial
dairy strain
PacBio SMRT 2017 Complete
genome
This study
SMQ-1419 CP025333 Commercial
dairy strain
PacBio SMRT 2017 Complete
genome
This study
SMQ-1420 CP025334 Commercial
dairy strain
PacBio SMRT 2017 Complete
genome
This study
SMQ-1421 CP025332 Commercial
dairy strain
PacBio SMRT 2017 Complete
genome
This study
JB5 NZ_NRGX01000001.1 Dairy isolate PacBio SMRT 2017 Complete
genome
(29)
SMQ-1335 NZ_CP017150.1 Commercial
dairy strain
PacBio SMRT 2016 Complete
genome
(50)
B. linens
ATCC 19391 CP026734 Unknown PacBio SMRT 2017 Complete
genome
(92)
BS258 NZ_CP014869.1 Marine PacBio SMRT 2016 Complete (178)
57
sediment genome
Additional B. aurantiacum draft genomes used for the pan-genome analysis
Strain WGS
accession numbers
Source Sequencing
technology
Year Status References
ATCC 9175 FXZB01000001:
FXZB01000070
Camembert
cheese
Illumina
MiSeq
2017 Permanent draft
(70 contigs)
(140)
CNRZ 920 FXZG01000001:
FXZG01000073
Beaufort cheese Illumina
MiSeq
2017 Permanent draft
(73 contigs)
(140)
6(3) FXZI01000001:
FXZI01000097
Langres cheese Illumina
MiSeq
2017 Permanent draft
(97 contigs)
(140)
8(6) FXYZ01000001:
FXYZ01000091
Reblochon
cheese
Illumina
MiSeq
2017 Permanent draft
(91 contigs)
(140)
Table 3.2 : General genome features of B. aurantiacum and B. linens.
Strain
Genome
length (Mb)
G+C
content
(%)
Predicted
CDS
Hypothetical
protein (%)
Assigned
function (%)
rRNA tRNA
B. aurantiacum
SMQ-1335 4.210 62.63 3 807 21.4 78.6 12 49
SMQ-1417 4.424 62.76 3 990 21.2 78.8 12 49
SMQ-1418 4.193 62.77 3 751 19.7 80.3 12 50
SMQ-1419 4.039 62.71 3 668 21.2 78.8 12 49
SMQ-1420 4.329 62.73 3 874 21.1 78.9 12 49
SMQ-1421 4.085 62.76 3 687 20.1 79.9 12 49
JB5 4.311 62.79 3 859 20.1 79.9 12 49
B. linens
ATCC19391 3.807 64.79 3 377 23.7 76.3 12 48
BS258 3.862 64.16 3 364 19.1 80.9 12 47
We searched for the presence of plasmids and only one was found in B. linens ATCC
19391. The 7,590 bp plasmid pBLA8 has been previously described and partially
sequenced (92). The presence of plasmids in B. linens is rare with only a few described in
the literature (37, 40, 89–91). We completed the sequence of the theta-replicating plasmid
pBLA8 (GenBank CP026735) using Illumina MiSeq and identified 16 Open Reading
Frames (ORFs). Two replication proteins and one protein involved in plasmid partitioning
were identified while the 13 other ORFs have unknown function. Pairwise alignment of
pBLA8 and pLIM (7,610 bp), the only other fully sequenced B. linens plasmid (40),
revealed that both plasmids are significantly different since the alignment covers only 60%
of the longest sequence (88% identity). Interestingly, different regions from the B. linens
plasmid pBLA8 were found in five B. aurantiacum genomes (≥99% identity), suggesting
58
genetic exchange between these two closely-related species. Up to 80% of the plasmid was
integrated into different regions of the genomes of B. aurantiacum SMQ-1417 and SMQ-
1335. The only plasmid region absent in the bacterial genomes was the origin of replication
(ori) and a non-essential replication protein.
3.5.3 Carotenoid biosynthesis
The carotenoids produced by actinobacteria are responsible for the typical color of smear-
ripened cheeses. A defect in color development is often associated with inadequate
microbial colonization and poor flavor development. All Brevibacterium spp. described in
this study produce orange colonies when cultivated on agar plates. The B. aurantiacum
ATCC 9175 carotenoid biosynthesis pathway has been previously described (41, 42) as
well as its gene cluster (GenBank AF139916.1). This biosynthesis gene cluster was
identified in all B. aurantiacum genomes, but not in B. linens. However, seven genes
essential for the production of the orange carotenoids isorenieratene, 3-hydroxy-
isorenieratene, and 3,3’-dihydroxy-isorenieratene (41) were still identified in both B. linens
genomes. These genes were found in a smaller carotenoid biosynthetic gene cluster (7.5 kb
as compared to 14.4 kb) and their amino acid sequences share 60-77% identity with B.
aurantiacum carotenoid biosynthesis proteins (Table S1).
3.5.4 Core-genome and pan-genome
To determine the genetic diversity of B. aurantiacum, we performed a pan-genome
analysis. In addition to the seven B. aurantiacum complete genomes now available, we
added four draft genomes of other B. aurantiacum strains recently sequenced (140). The B.
aurantiacum core genome for the 11 strains is composed of 2,612 genes and an open pan-
genome reaching 6,259 genes (Fig. 3.2A). We also analyzed the number of genes present in
different number (k) of genomes and the two major groups were the core genome (k = 11
genomes) with 2,612 genes and the orphan genes (k = 1 genome) with 1,790 genes (Fig.
3.2B). Hence, several B. aurantiacum genes are either conserved in all genomes or specific
to one strain (Fig. 3.2B). The orphan genes/proteins, also called ORFans, significantly
increase the pan-genome size of B. aurantiacum and they likely play an key role in its
evolution.
59
Figure 3.2 : Pan-genome analysis of B. aurantiacum. (A) Accumulated number of new
genes in the pan-genome and genes attributed to the core-genome are plotted against the
number of added genomes. (B) Accumulated number of genes in k genomes are plotted
against the number of k genomes. The number of core genes present in all 11 B.
aurantiacum genomes can be observed with k = 11 genomes. (C) Functional classification
60
of B. aurantiacum orphan genes in RAST subsystem categories. Similar metabolic
subsystem categories are fused together and only categories with >5 gene counts are
shown. Proteins with hypothetical and putative function are not shown.
To explore the functions of these orphan genes, we annotated and classified them into
subsystem categories using Rapid Annotation using Sub-system Technology (RAST) (172)
(Fig. 3.2C). Manual curation was also performed for some proteins that were not classified
by RAST (Additional file 1). Of 1,790 ORFans, 886 (49.5%) were hypothetical proteins,
125 (7.0%) had putative functions, 100 were considered miscellaneous, and 679 proteins
(37.9%) were classified into RAST subsystem categories (Fig. 3.2C). With 112
representatives, phage and mobile element proteins represent the main functional categories
of ORFans, suggesting that B. aurantiacum contains a vast and diverse array of mobile
genetic elements. Genes coding for proteins involved in membrane transport (104 genes),
DNA and RNA metabolism (99 genes) and transcriptional regulators (83 genes) also
accounted for a significant number of ORFans. Numerous ABC transporters, such as iron
siderophore transport system components, were also observed among B. aurantiacum
ORFans. In the iron-depleted cheese environment, these genes could improve growth on
cheese rinds. Restriction-modification (R-M) systems were prevalent in the DNA and RNA
metabolism category. A total of 20 Type I R-M system components and 6 Type III R-M
methylation subunits were identified, perhaps offering broad protection against phage
infection.
We analyzed the genomic positions of the ORFans and found that these genes were
disperse into B. aurantiacum genomes (Fig. S1). A slightly higher concentration of ORFans
was observed 2.5 Mbp downstream of the ori region (upstream dnaA) in all B. aurantiacum
genomes suggesting that this chromosomal region is less conserved. Overall, the prevalence
of ORFans in B. aurantiacum suggests a high rate of HGT and considerable intraspecies
genetic diversity.
61
3.5.6 Mobile genetic elements
After observing parts of pBLA8 and several mobile elements in the B. aurantiacum pan-
genome, we analyzed the B. aurantiacum mobilome. In the largest B. aurantiacum genome
(SMQ-1417), we identified 116 transposases and 68 integrases suggesting that this species
contains numerous mobile genetic elements such as prophages, and insertion sequences
(IS). We used PHASTER (184) to detect prophages, but none were found in B.
aurantiacum or B. linens genomes. However, few genes coding for putative phage proteins
(holin, portal, major capsid protein, tail tape measure protein) were observed in all
Brevibacterium strains, suggesting the presence of prophage remnants.
3.5.6 Insertion sequences
IS elements play an important role in the evolution of bacteria by spreading into a genome
and creating genetic variations (148). They can inactivate genes when integrated into a
coding region or a promoter region or they can activate gene expression by providing an
alternative promoter (147). Moreover, neighbouring genes can be translocated by two
flanking ISs in a so-called composite transposon (146, 147). Using the ISFinder database,
we detected five ISs (ISBli1-ISBli5) in B. aurantiacum genomes, often with several copies
of each IS. Manually curating the annotated genomes led to the identification of 14
additional types of ISs in B. aurantiacum and 12 distinct in B. linens (ISBli6-ISBli35).
Therefore, a total of 26 identified ISs were validated by the ISFinder database and four ISs
(ISBli18, ISBli20, ISBli22, and ISBli27) were not validated.
We observed a dichotomy in the abundance and the type of ISs detected in B. aurantiacum
and B. linens genomes (Fig. 3.3A), suggesting a role in the diversification of these two
closely-related species. While a total of 56 copies of ISBli2 were identified in all B.
aurantiacum genomes (5 to 13 copies/genome), only one copy was identified in B. linens
ATCC 19391. Interestingly, we found ISBli2 integrated into a gene coding for a putative
abortive phage resistance protein in four B. aurantiacum genomes, namely SMQ-1417,
SMQ-1419, SMQ-1421, and SMQ-1335 (Fig. 3.3B). This putative anti-phage gene was
identified in all B. aurantiacum genomes but was intact only in B. aurantiacum SMQ-1418,
SMQ-1420 and JB5. ISBli4 was also integrated into the abortive phage resistance protein
62
of B. aurantiacum SMQ-1335. Therefore, we hypothesize that ISBli2 and ISBli4 may have
inactivated this phage resistance protein in four of the seven B. aurantiacum genomes.
Bacteriophages (or simply phages) infecting dairy cultures are well documented (24, 185)
and the presence of an intact abortive phage infection protein could provide protection
against Brevibacterium phages during cheese ripening. Although, it should be noted that B.
aurantiacum phages have not been reported yet.
Figure 3.3 : Brevibacterium Insertion Sequences (ISBli1-ISBli35). (A) Abundance of ISs
in B. aurantiacum and B. linens genomes. ISBli1-ISBli5 were identified with the ISFinder
database and ISBli6-ISBli35 were identified manually. (B) Schematic representation of the
63
integration of ISBli2 and ISBli4 in the coding region of an abortive phage resistance protein
CDS in B. aurantiacum genomes.
3.5.7 Composite transposon
We found ISs from two other actinobacteria species used for cheese production in B.
aurantiacum genomes. We identified ISPfr2, from Propionibacterium freudenreichii, in all
B. aurantiacum strains as well as ISAar24, ISAar39 and ISAar42 from Glutamicibacter
arilaitensis but only in B. aurantiacum SMQ-1335 and SMQ-1420. The presence of these
ISs strongly suggests genetic exchange between cheese rind actinobacteria (29). In-depth
analysis of the 11,797 bp region containing the G. arilaitensis ISs also revealed an iron
uptake gene cluster between ISAar24 and ISAar39 (Fig. 3.4) in the two B. aurantiacum
strains. This iron uptake gene cluster shares 99% nucleotide identity with the one found in
the strain G. arilaitensis RE117.
The 11,797 bp genomic region is flanked by ISAar39 and ISAar42, both containing ISL3
family transposases sharing 65% amino acid sequence identity. The right inverted repeats
of these two ISs share 73.2% nucleotide sequence identity. Therefore, this region could be a
composite transposon. Of note, the three integrase genes between ISAar24 and ISAar42 in
B. aurantiacum SMQ-1335 and SMQ-1420 are absent in G. arilaitensis RE117, suggesting
that their presence in B. aurantiacum occurred after the integration of the composite
transposon (Fig. 3.4).
Interestingly, the iron uptake/siderophore operon was also identified in Corynebacterium
variabile DSM 44702 (99% identity), but without the ISs (Fig. 3.4). We hypothesize that
this operon originated from this species before being mobilized between other cheese rind
actinobacteria.
64
Figure 3.4 : Schematic representation of the iron uptake composite transposon identified in
B. aurantiacum SMQ-1335 and SMQ-1420. The homologous iron uptake gene clusters
found in Glutamicibacter arilaitensis RE117 and Corynebacterium variabile DSM 44702
are also illustrated. Genes involved in iron transport are shown in red and the AraC family
transcriptional regulator is shown in yellow. Mobile element proteins are shown in green
and the ISs from G. arilaitensis are shown in blue. Coding sequences correspond to locus
tags BLSMQ_RS13730 - BLSMQ_RS13785 of B. aurantiacum SMQ-1335 (GenBank:
NZ_CP017150.1).
3.5.8 Horizontal gene transfer regions
While performing BLAST analysis, we noticed that all B. aurantiacum genomes contained
homologous nucleotide sequences (92-99% identity) with cheese rind actinobacteria (Fig.
3.5). Genomic positions, description, and gene annotations of these putative HGT regions
are provided in supplementary files (Table S2, additional files 2 and 3). An HGT region
from the iRon Uptake/Siderophore Transport Island (RUSTI) previously described (29) was
identified in four B. aurantiacum genomes (Fig. 3.5). The largest HGT region (99,628 bp)
was observed in B. aurantiacum SMQ-1417 (Fig. 3.5) and shared 99% identity over 96% of
65
its length with a region found in Corynebacterium casei LMG S-19264. This region has
been previously described as the Brevibacterium Lanthipeptide Island (BreLI) (140, 186).
Figure 3.5 : Schematic representation of HGT regions identified in Brevibacterium
genomes. Homologous DNA sequences present in different species were identified with
BLAST alignments. Identical HGT regions present in different genomes are linked
together. HGT region sizes are increased 10x for presentation purposes and only regions
with >90% identity are shown. The phylogenetic tree was generated with the concatenated
protein sequences of the core-genomes of B. aurantiacum and B. linens.
We extracted annotations from all HGT regions identified in B. aurantiacum genomes and
clustered them into functional groups based on the RAST subsystem categories (Fig. 3.6)
(172). For representation purposes, we combined similar metabolic subsystem categories.
The hypothetical proteins category contains the highest number of genes (89). The mobile
elements (transposases, integrases, etc) and plasmid protein category contains 22 genes. A
total of 34 genes involved in membrane transport and 24 genes involved in iron acquisition
and metabolism were also identified. Moreover, 7 of the 20 transcriptional regulators
observed in the HGT regions correspond to the AraC family of transcriptional regulators
often found in the iron uptake gene clusters. This observation suggests that efficient
66
transport systems confer a selective growth advantage to B. aurantiacum strains by helping
them to efficiently acquire nutrients and minerals from the cheese environment. Of note,
genes involved in DNA mobilization, membrane transport and iron acquisition were also
the most prevalent horizontally transferred genes previously observed in 165 cheese rind
bacteria (29). Taken altogether, these observations suggest high rates of HGT between
cheese rind actinobacteria and cooperative adaptation to the cheese surface.
Figure 3.6 : Functional classification of B. aurantiacum horizontally transferred genes.
Similar metabolic subsystem categories are fused together and the percentage of HGT
genes in each RAST subsystem category is shown.
3.5.9 Transcriptional regulators
Because a high number of transcriptional regulators were observed in the above B.
aurantiacum HGT regions, we explored their repertoire in Brevibacterium genomes. Using
67
gene annotations, we grouped the predicted transcriptional regulators into 19 main regulator
families. We also compared the repertoire of B. aurantiacum and B. linens. The average
number of predicted genes assigned to each transcriptional regulator family for both species
are shown in Fig. S2. In general, more transcriptional regulators were identified in B.
aurantiacum than in B. linens, which coincides with their relative genome sizes. TetR/AcrR
is the most frequent transcriptional regulator family found in Brevibacterium spp., with an
average of 31 regulators per genome, followed by LysR and GntR with an average of 23
regulators per genome. The TetR family of regulators (TFR) control numerous aspects of
bacterial physiology and actinobacteria encode the highest number of TFR (187). The
MerR transcriptional regulator family is involved in metal ion homeostasis, general stress
response (188) and light-induced carotenoid production (189, 190). No significant
differences were observed between the average number of MerR regulators in B.
aurantiacum (7 to 11 genes) and B. linens (8 genes). The average number of ArsR family
regulators, which are also involved in metal ion homeostasis and general stress response
(191, 192), was slightly higher in B. aurantiacum with an average of 12 regulators per
genome compared to 9 in B. linens (Fig. S2).
Others have observed a remarkably higher number of AraC regulators in the cheese
actinobacterium Corynebacterium variabile DSM 44702 compared to other species of the
same genus (30). Interestingly, we also observed almost identical numbers of AraC
regulators in B. aurantiacum genomes (11 to 13 genes) and C. variabile DSM 44702 (13
genes), which has a slightly smaller genome (3.4 Mbp). AraC regulators are involved in
many biological processes, such as catabolism of various sugars (187), adaptative
responses, stress responses and virulence (191). Members of this transcriptional regulator
family were observed upstream of iron uptake gene clusters in all B. aurantiacum genomes.
AraC family transcriptional regulators also likely play a role in the iron homeostasis of B.
aurantiacum, which could explain their prevalence. An iron-dependent repressor,
IdeR/DtxR (Metal-dependent transcriptional regulator: BLSMQ_RS16105), is present in all
Brevibacterium genomes. The expression of iron acquisition genes is repressed when iron
is present in excess (28, 193) and the IdeR/DtxR gene is probably responsible for the
regulation of these genes in Brevibacterium spp.
68
3.5.10 Iron uptake and siderophore synthesis
In the iron-depleted cheese environment, efficient iron acquisition systems are a driving
force in adaptation to the cheese surface (28, 29). Iron acquisition is mediated by
siderophores which act as chelating agents to scavenge iron. These siderophores are
secreted by bacteria in response to iron depletion. In gram-positive bacteria, iron uptake is
mediated by three components, a membrane-anchored binding protein, permease proteins
and ATP-binding cassette proteins (193). Different patterns of siderophore production and
utilization in Brevibacterium spp. were previously described and some strains were shown
to be auxotrophic for iron siderophores (179). Hence, the addition of iron siderophores or
co-cultivation of a siderophore-producing strain with a siderophore-auxotrophic strain can
stimulate the growth of the latter (179).
We analyzed the pool of predicted genes involved in iron siderophores synthesis and
acquisition to determine the influence of this metabolic bottle neck on the evolution and
adaptation of B. aurantiacum. In comparison to the other investigated genomes, we
identified more iron ABC transporter components in strains B. aurantiacum SMQ-1418,
SMQ-1419, SMQ-1420 and JB5. The genome of B. aurantiacum JB5 harbors 26 genes
linked to iron uptake, the highest number of iron uptake-related genes observed in the set of
genomes analyzed in this study.
Three iron ABC transporter components are clustered together in B. aurantiacum and B.
linens genomes. Three different iron uptake gene clusters were identified in our B.
aurantiacum genomes in addition to the two clusters originating from the RUSTI region
and the iron uptake transposon. A putative hydroxamate-type siderophore biosynthesis
cluster encoding a siderophore synthetase, a lysine N6-hydroxylase and a L-2,4-
diaminobutyrate decarboxylase was recently described (140). This siderophore gene cluster
was identified in B. linens BS258 and all the B. aurantiacum genomes, but not in B. linens
ATCC 19391. An additional putative catecholate siderophore gene cluster (140) was also
observed in B. aurantiacum SMQ-1420 and JB5. Thus, all dairy strains from our dataset
69
seem to be able to produce iron siderophore in response to iron depletion on the surface of
smear-ripened cheeses.
3.5.11 Brevibacterium Lanthipeptide Island (BreLI)
Another factor that can influence the microbial community is the production of
antimicrobials. For example, lanthionine-containing peptides (lanthipeptides) can inhibit
the growth of undesirable microorganisms on the surface of cheese, conferring a selective
advantage to ripening cultures. A probable Integrative Conjugative Element (ICE) coding
for a lanthipeptide synthesis gene cluster has been previously identified in six cheese-
associated Brevibacterium strains (B. antiquum CNRZ 918 and P10, B. aurantiacum ATCC
9174 and CNRZ 920, B. linens ATCC 9172 and Mu101) (140). This 96-100 kbp genomic
island, called Brevibacterium Lanthipeptide Island (BreLI) (140), was also observed in C.
casei LMG S-19264 (186). The integration of this ICE occurred at the 3′ end of a gene
encoding a class Ib ribonucleotide reductase beta subunit, resulting in a perfect 12 bp repeat
sequence (5’-AGAAGTCCCAGT-3’) flanking each side of BreLI (140).
ICE elements can be identified by the presence of signature genes/proteins associated with
the core conjugation functions of (i) integration and excision from the host genome, (ii)
replication as an extrachromosomal element, and (iii) conjugation between host and
recipient cells (194). Genes involved in all three core functions were identified in B.
aurantiacum SMQ-1417 BreLI region. An integrase (CXR23_14705) and a site-specific
integrase (CXR23_15110) were observed at the two borders of BreLI, directly beside the
repeats. Two other integrases (CXR23_14820, CXR23_14825) and one excisionase
(CXR23_14930) were also identified and these five genes are likely involved in the
integration and excision of BreLI. In terms of DNA replication, B. aurantiacum SMQ-1420
BreLI contains two helicases (CXR23_14715, CXR23_15070), a DNA polymerase III
subunit alpha (CXR23_14790) and a DNA primase (CXR23_14925). The majority of
actinobacterial ICEs utilizes a FtsK homolog-based conjugative DNA-translocation system
to exchange double-stranded DNA (195). A conjugal transfer protein (CXR23_14800), a
chromosome partitioning protein ParB (CXR23_14945), a conjugal transfer protein TrbL
(CXR23_14995), a type VI secretion protein (CXR23_15060), and a single-stranded DNA-
70
binding protein (CXR23_15075) are also present in BreLI, which suggest that BreLI uses a
single-stranded DNA (ssDNA) transfer system. Interestingly, the G. arilaitensis JB182
RUSTI, observed in four B. aurantiacum, is also believed to use a ssDNA transfer
mechanism (29).
As to our knowledge, no experiment had been performed to determine whether this ICE
element is active. We designed PCR primers to amplify different regions of the B.
aurantiacum SMQ-1417 ICE element to observe its excision from the genome (Fig. 3.7).
We detected and sequenced PCR products that confirmed the excision of BreLI and its
presence in a circular form (Fig. 3.7). Thus, this ICE element from the B. aurantiacum
SMQ-1417 chromosome could still be active and transferred to other cheese rind
actinobacteria during cheese ripening.
Figure 3.7 : PCR amplification of B. aurantiacum SMQ-1417 BreLI. (A) Schematic for
PCR primer design. (B) PCR testing for the presence of BreLI and for the excision of the
ICE from the chromosome of B. aurantiacum SMQ-1417. PCR products were migrated on
a 2% agarose gel for 35 minutes at 110 volts and the gel was stained with ethidium bromide
before UV observation.
71
3.6 Discussion
Abundant milk residues in pottery vessels provided the earliest evidence of milk processing
in the sixth millennium BC in northern Europe (1). Because it allowed conservation of milk
nutrients, cheese is an ancient food of special importance for humanity. Worldwide, there
are more than 1400 traditional cheese varieties displaying a diverse range of flavors,
aromas, and textures (2). Scientific advances have led to a better understanding of the
microbiology and biochemistry of cheese ripening. The diversity of cheese organoleptic
properties can be attributed, among others, to the diverse, facility-specific, "house"
microbiota. Recent findings also suggest the presence of a core microbiota that has adapted
to the cheese surface (17). Interestingly, the assembly and establishment of cheese rind
communities is highly reproducible and moisture was found to be the best predictor of rind
community composition (22).
Comparative genomic studies have led to a better understanding of the genetic adaptation
of dairy bacteria, such as Streptococcus thermophilus (136), Lactococcus lactis (137), C.
variabile (30), G. arilaitensis (21) and Propionibacterium freudenreichii (138), to cheese.
A recent comparative analysis of mostly draft genomes of 23 Brevibacterium strains also
provided insights into their adaptation to the cheese habitat (140). Overall, these studies
shed light on the evolution and role of each bacterium in the development of cheese aromas
and flavors.
Given the prevalence of mobile genetic elements in Brevibacterium spp. and other cheese
actinobacteria (29, 140), we used PacBio long read sequencing technology to obtain six
new complete Brevibacterium genome sequences. Our phylogenetic analysis shows that
Brevibacterium strains used for cheese production belong to the B. aurantiacum species,
making this species a key player in the dairy industry. Therefore, the taxonomic position of
commercial Brevibacterium strains should be revisited.
72
We used environmental B. linens strains as models to compare with B. aurantiacum dairy
strains to understand the cheese domestication of B. aurantiacum. Despite being the most
prevalent Brevibacterium species found on cheese (2, 19), B. aurantiacum is not the only
Brevibacterium species able to grow on cheese. For example, B. antiquum, B. casei and B.
linens have been isolated from cheeses (16, 140). However, certain genetic traits may
explain the prevalence of B. aurantiacum in the dairy ecosystem. Multiple horizontal gene
transfers have been documented between cheese rind bacteria (29) and between
cheesemaking fungi (196), suggesting a complex network of gene exchanges that are
shaping the evolution and adaptation of cheese-associated microorganisms. Our
comparative analyses found significant differences between the mobilome of dairy B.
aurantiacum strains and environmental B. linens strains. The B. aurantiacum strains
investigated in this study seem to have acquired heterologous genes from dairy
actinobacteria, such as G. arilaitensis, C. variabile, and C. casei. The high percentage
identity between these DNA sequences suggests that these genes were recently transferred.
Mobile genetic elements are expanding the B. aurantiacum pan-genome and they play a
crucial role in its genetic diversity. It is noteworthy that B. aurantiacum pan-genome is still
open and more genomes should be analyzed to appreciate the diversity of its gene
repertoire.
PCR amplifications of BreLI confirmed that this ICE was still active in B. aurantiacum
SMQ-1417. The synthesis of the antimicrobial peptide lanthipeptide likely confers a
selective advantage for the producing host. Also observed in C. casei LMG S-19264, BreLI
is likely to have been mobilized from a Brevibacterium spp., perhaps during cheese
ripening (186). The use of commercial ripening cultures containing microorganisms with
active mobile genetic elements could explain the prevalence of nearly identical DNA
sequences between cheese rind actinobacteria (29). Commonly used in commercial
ripening cultures, B. aurantiacum is likely a player in the widespread distribution of mobile
genetic elements.
Horizontally transferred regions involved in iron uptake were observed in five out of seven
B. aurantiacum genomes. Bonham et al. (29) previously showed that genes associated with
73
iron uptake were the most common genes exchanged between cheese actinobacteria. Strains
with efficient iron uptake systems are probably more adapted to the iron-depleted cheese
surface. Further studies could be done to explore the capacity of different Brevibacterium
strains to grow, alone or in combination, in iron-depleted environments. Some B.
aurantiacum strains with high aromatic potential could be auxotrophic for iron
siderophores and dependent on other strains or species to grow well on cheese.
Cheesemakers are sometimes faced with unstable ripening activity or the growth of
undesirable microorganisms (197). The optimization of ripening cultures while addressing
these issues may improve the production of high-quality smear-ripened cheeses.
3.7 Conclusions
The addition of six complete genomic sequences of Brevibacterium spp. allowed an in-
depth analysis of the mobilome of commercial B. aurantiacum strains. Our phylogenetic
analysis demonstrated that the industrial strains used for cheese production belong to the B.
aurantiacum species. Our study also revealed that mobile genetic elements are widespread
and they are responsible for the genetic diversity of B. aurantiacum. Moreover, low iron
availability is a driving force in adaptation to the cheese surface and iron uptake HGT
demonstrates the cooperative evolution of cheese rind actinobacteria. B. aurantiacum
appeared to be well adapted to the strong selective pressures exerted on the surface of
smear-ripened cheeses. This comprehensive genomic information will serve as a tool to
continue improving our understanding of the complex interactions taking place in smear-
ripened cheese microbial communities.
3.8 Materials and Methods
3.8.1 Bacterial strains and DNA sequencing
The B. linens and B. aurantiacum strains used in this study are listed in Table 1. They were
routinely cultivated in Luria Bertani (LB) or Brain Heart Infusion (BHI) medium at 30oC.
Genomic DNA was purified using a QIAGEN Genomic tip 20/G kit. Single Molecule,
Real-Time (SMRT) sequencing was performed on a PacBio RSII sequencer (Génome
Québec Innovation Centre, Montréal, QC, Canada). Basic Local Alignment with
Successive Refinement (BLASR) (198) was used to align and preassemble the sequences
74
using the longest reads as seeds to which the other subreads were recruited and mapped to
correct random errors. Celera assembler (199) was used to assemble long and corrected
reads into contigs. The sequences were refined using Quiver and the genomes were then
assembled into one contig using the Hierarchical Genome Assembly Process (HGAP)
(200).
The native plasmid pBLA8 from B. linens ATCC 19391 was purified using a QIAGEN
Plasmid Maxi kit according to the manufacturer’s instructions. Genome libraries were made
using the Nextera XT DNA library preparation kit (Illumina) and the libraries were
sequenced using a MiSeq reagent kit v2 (Illumina, 500 cycles) on a MiSeq system. De novo
assembly was performed with Ray assembler version 2.2.0 (169). Nucleotide coverage,
ranging from 3,700x to more than 20,000x for each nucleotide, was calculated with
SAMtools (170).
3.8.2 General genome features prediction
The Ori regions were set upstream of the gene coding for the chromosomal replication
initiator protein DnaA, as previously described (50). Gene prediction and annotation were
performed with the NCBI prokaryotic genome annotation pipeline (201, 202). Gene
annotation was also performed with the RAST server (172) and BLASTp (173). For
pBLA8, open reading frames were identified with GeneMark.hmm (171) while BLASTp
(173) was used to predict ORF function.
3.8.3 Phylogenetic analysis of B. linens and B. aurantiacum
We used a broad phylogenetic distribution of 35 Brevibacterium spp. 16S rRNA nucleotide
sequences from the NCBI database and the strains described in this study to perform a
phylogenetic analysis using MEGA 7.0.26 software (203). We aligned the sequences with
Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation (MUSCLE) (204) and the
phylogenetic tree (Fig. 3.1) was constructed using the Maximum Likelihood method based
on the Tamura-Nei model (205). We performed the analysis with 1,000 bootstraps and the
percentage of trees in which the associated taxa clustered together is shown next to the
75
branches. The tree is drawn to scale with branch lengths measured in the number of
substitutions per site. All positions containing gaps and missing data were eliminated and
there were a total of 1,317 positions in the final dataset.
3.8.4 Insertion sequence and HGT identification
ISFinder database was used to identify ISBli1-ISBli5 in the genomes while ISBli6-ISBli35
were identified manually. We searched for transposase and mobile element annotations
with identical lengths, and the corresponding CDS were extracted with 1000 bp upstream
and downstream, as previously described (21, 206). These sequences were aligned to
Brevibacterium spp. genomes using BLASTn to confirm the presence of multiple IS copies.
When multiple IS copies were identified, inverted repeats were manually annotated. ISs
identified manually were submitted to the ISFinder database under the accession name
ISBli6 to ISBli35. Four ISs (ISBli18, ISBli20, ISBli22, and ISBli27) were not validated.
The other IS elements were validated by the ISFinder database. Complete IS, transposase
and repeat sequences are available in the ISFinder database. To identify putative HGT
regions, whole Brevibacterium spp. genomes were aligned against the NCBI database using
BLASTn. Alignment hits were considered as probable HGT regions when nucleotide
sequences larger than 2,000 bp shared more than 90% identity with other bacterial species.
3.8.5 Core and pan-genome analyses
The protein sequences of the seven complete B. aurantiacum genomes were extracted from
the GenBank files. The protein sequences of four B. aurantiacum draft genomes (140) were
also extracted and added to the pan-genome analyses. The clustering of the protein
sequences in orthologous groups was conducted with USEARCH (207), requiring greater
than 60% identity with alignment over more than 75% of the protein sequence. In-house
Python scripts were used to extract the pan- and the core-genome of the 11 B. aurantiacum
strains. Figure 3.2 illustrates the core- and pan-genome generated with in-house R scripts
using ggPlot2 (208). Genes present in only one genome (ORFans) were classified into
RAST subsystem categories (172) (Fig. 3.2C). A total of 279 genes were classified into
subsystem categories by the RAST server and 393 were classified manually. The genomic
position of the ORFans from complete genomes were extracted and used to generate Figure
76
S1 (additional file 2). The concatenated protein sequences of the core-genomes of B.
aurantiacum and B. linens complete genomes were used to generate the phylogenetic tree
(Fig. 3.6). The concatenated sequences of core proteins were aligned using MAFFT (with
the flag-auto for the best alignment) (209), the alignment was divided into partitions using
the Alignment Manipulation and Summary (AMAS) tool (210) and the best amino-acid
substitution model and tree were determined for each partition using IQ-Tree software
(211).
3.8.6 PCR testing of BreLI chromosome excision
B. aurantiacum was cultivated on BHI containing 1% (w/v) agar for 48 hours at 30oC and
one colony was used for each PCR reaction. PCR was performed using Taq polymerase
Mastermix (Feldan) according to the manufacturer’s instructions. All primers used are
listed in Table 3. PCR reactions were optimized by adding 10% (v/v) DMSO to the PCR
reaction mix. An annealing temperature of 56oC was used to obtain PCR products with a
minimum of non-specific bands. Primers 2 and 5 should only form a PCR product if BreLI
is excised from the chromosome and is present in a circular form. Sanger sequencing
(Plateforme de séquençage et de génotypage des génomes, Québec, QC, Canada) was
performed to confirm BreLI excision.
Table 3.3: List of primers used for the amplification of BreLI.
Primer name Sequence (5’ → 3’)
1. BreLi1 Fwd AGTCAGTTGAGATGAGCAGCTG
2. BreLi1 Rev CTCGATTCTGGTGTTCATGG
3. BreLi2 Fwd GAACGACCCGATCAACCTGTTC
4. BreLi2 Rev CTTCTTCAGACTCGGGAATCAG
5. BreLi3 Fwd CATCGACCGGATGGGAGCTT
6. BreLi3 Rev ACGTACCTGCAACTTGGAAG
3.9 Declarations
Availability of data and materials
B. aurantiacum strains with a SMQ number are available upon request to the corresponding
author. All IS elements were validated by the ISFinder database under the name ISBli6-
77
ISBli35. Genomes have been deposited in the NCBI genome database (See Table 1 for
accession numbers). The complete sequence of pBLA8 was deposited under GenBank
accession number CP026735. A list of locus tag identifiers and predicted functions for B.
aurantiacum ORFans are provided in Additional file 1. A list of genes in the HGT regions
described in this study is provided with their genomic positions and predicted functions in
Additional file 3. All in-house Python and R scripts used in this study are available upon
request to the corresponding author.
Conflict of interest
The authors declare they have no conflict of interest.
Acknowledgements
This work was supported by Agropur Cooperative and the Natural Sciences and
Engineering Research Council of Canada (CRD Program). SL is recipient of scholarships
from Op+Lait and PROTEO. SM holds a Tier 1 Canada Research Chair in Bacteriophages.
We thank Barb Conway for editorial assistance and Alessandra Gonçalves de Melo for
insightful discussion.
78
CHAPITRE 4 : PERSPECTIVES
La fabrication du fromage permet d’allonger la durée de vie des composantes nutritives du
lait, expliquant l’importance de ce procédé alimentaire pour l’humanité. L’affinage des
fromages est une brillante façon de conserver les nutriments laitiers pendant de très longues
périodes tout en améliorant la qualité organoleptique. C’est pourquoi il existe une grande
variété de fromages affinés produits via diverses méthodes traditionnelles à travers le
monde. La microflore bénéfique retrouvée à la surface des fromages est essentielle pour le
développement des propriétés organoleptiques, mais elle est aussi cruciale pour prévenir la
prolifération de la microflore pathogène. Malgré la diversité des communautés
microbiennes présentes sur les fromages affinés, la présence d’un microbiote « coeur » a
récemment été décrite par des études de métagénomiques des populations microbiennes sur
divers fromages affinés produits à travers le monde. Ces études ont révélé que les bactéries
du genre Brevibacterium sont les plus abondantes sur ces fromages affinés et B.
aurantiacum est l’espèce la plus dominante de ce genre bactérien, suggérant une forte
adaptation à l’écosystème des fromages à croûte lavée. Nos analyses phylogénétiques ont
démontré que les souches laitières, précédemment classifiées comme étant B. linens,
utilisées pour la production de fromages à croûte lavée appartiennent à l’espèce B.
aurantiacum. Il serait donc nécessaire de réviser la position taxinomique des souches
commerciales du genre Brevibacterium utilisées par l’industrie laitière.
Récemment, la souche B. aurantiacum SMQ-1335, soigneusement sélectionnée et utilisée
au Québec, n’a pas bien colonisé certains fromages à croûte lavée, causant un mauvais
développement de la couleur et des arômes de ces fromages. Des phages infectant la souche
SMQ-1335 ont été récemment découverts sur ces fromages et aux sites de manufacture et il
est possible qu’ils soient à l’origine du problème observé. Malgré la prévalence de B.
aurantiacum dans l’affinage des fromages à croûte lavée, peu de séquences génomiques
complètes sont disponibles et aucun outil génétique n’est disponible pour étudier les gènes
impliqués dans la résistance aux phages et l’écologie des fromages. Le but initial de ce
projet de maîtrise était donc d’identifier ou construire un plasmide capable de se répliquer
chez cette espèce. Toutefois, il a été impossible de transformer sept différentes souches du
genre Brevibacterium avec l’ensemble des vecteurs et des conditions testés. Les deux
79
seules publications scientifiques mentionnant la transformation génétique de B. linens et B.
aurantiacum par électroporation ne sont pas reproductibles dans nos conditions. Ces
actinobactéries sont donc réfractaires aux plasmides hétérologues et difficiles à manipuler
au niveau génétique.
Puisque d’autres facteurs exercent une pression de sélection à la surface des fromages, il est
possible que les phages ne soient pas les seules responsables de la piètre croissance de B.
aurantiacum. La composition de la microflore exerce un effet significatif sur la croissance
de divers microorganismes présents à la surface des fromages. Ces effets peuvent être
positifs ou négatifs, il est donc possible que la présence ou l’absence d’un microorganisme
empêche la croissance de B. aurantiacum SMQ-1335. Certaines souches de B. aurantiacum
ne sont pas autotrophes pour la synthèse de sidérophores de fer. Même si elles possèdent
des systèmes d’acquisition efficaces, ces souches dépendent d’une autre souche/espèce
pour la production de sidérophores. Peu de gènes impliqués dans la synthèse de
sidérophores de fer ont été identifiés chez B. aurantiacum SMQ-1335 et il est possible que
cette souche soit dépendante d’une autre souche/espèce produisant des sidérophores de fer
pour coloniser les fromages à croûte lavée.
Les données génomiques apportées par ce projet de maîtrise faciliteront les prochaines
études métagénomiques et métatranscriptomiques des microbiotes présents à la surface des
fromages à croûte lavée. La croûte des fromages affinés représente un très bon modèle pour
l’étude des interactions et de l’assemblage des communautés microbiennes. Les interactions
bénéfiques entre les actinobactéries d’affinage devront être étudiées en profondeur pour
prévenir les problèmes de colonisation microbienne de la croûte des fromages. Par
exemple, la production de sidérophores de fer par les différentes actinobactéries d’affinage
devra être analysée pour mieux prédire la performance des ferments d’affinage. À long
terme, les connaissances acquises lors de ce projet de maîtrise faciliteront la sélection des
espèces et des souches utilisées dans les ferments d’affinage. Cette compréhension
fondamentale des communautés microbiennes permettra une production plus constante de
ces fromages québécois de grande renommée.
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99
ANNEXE
Résultats supplémentaires – Article Applied and Environmental Microbiology
Figure S1 : ORFans distribution in B. aurantiacum genomes. ORFans genomic positions
and abundance are presented. Diamond colors correspond to RAST subsystem categories.
Table S1 : Carotenoid biosynthetic gene cluster identity between B. aurantiacum SMQ-
1335 and B. linens ATCC 19391 using BLASTp.
Genes Query coverage (%) Identity (%)
Octaprenyl diphosphate synthase (BLSMQ_RS15560) 98 60
Cytochrome P450 (BLSMQ_RS15565) 96 65
Lycopene cyclase (BLSMQ_RS15570) 82 67
Lycopene cyclase (BLSMQ_RS15575) 86 77
Gamma-carotene desaturase (BLSMQ_RS15580) 96 62
Phytoene dehydrogenase (BLSMQ_RS15600) 97 69
Phytoene synthase (BLSMQ_RS15605) 98 65
100
Figure S2 : Average number of predicted transcriptional regulators in B. aurantiacum and
B. linens.
0
5
10
15
20
25
30
35
Nu
mb
er o
f g
enes
Transcriptional regulator families
B. aurantiacum
B. linens
![[tel-00479671, v1] Adaptation d'un algorithme génétique](https://img.pdfslide.fr/doc/110x75/62b4ad49b65d5e31fe65d3df/tel-00479671-v1-adaptation-dun-algorithme-gntique-.jpg)
