Dynamique du cytosquelette durant l'invasion des tissus par Entamoeba histolytica

Dynamique du cytosquelette durant l’invasion des tissus par E&amoeba histolytica

Nancy Guillen

La pathogenicit generee par Entamoeba histolytica, l’agent de l’amibiase, est caracterisee par l’invasion de l’intestin humain et par la formation d’abces hepatiques. Le cycle de virulence est base sur les capacites du parasite de lyser et phagocyter les cellules de l’hote, ainsi que de detruire les tissus. Dans ce cycle pathogene le mouvement est une composante essentielle. L’adherence de E. histolytica soit sur les cellules epitheliales soit sur la matrice extracellulaire est necessaire a la virulence. Des recepteurs a la surface des amibes participent aux interactions Ctablies ; cependant, des etudes appro- fondies sont necessaires pour permettre de comprendre les voies de signalisation que ces recepteurs activent.

Unit6 de pathogenic microbienne mol&ulai- re, lnserm U389, lnstitut Pasteur, 28, rue du Docteur- Roux, 75724 Paris cedex 15, Fran- ce. [email protected].

L ‘amibiase, ou dysenterie amibienne, est une maladie parasitaire humaine qui occupe le

troisieme rang en terme de mortalite, apres le paludisme et la bilhar- ziose. Les estimations les plus recentes evaluent a 500 millions le nombre de personnes infestees par ce parasite dans le monde, 10 % d’entre elles declarent une amibiase invasive conduisant au de&s de 50 a 100 000 personnes chaque an&e [125]. La repartition geogra- phique de l’amibiase n’est pas homogene, mais presente des zones de forte endemie oti le taux d’infestation peut parfois atteindre 40 % de la population [BO]. Les regions du globe les plus affectees sont les pays du sud et de l’ouest africain, d’Am&ique du sud et d’Amerique centrale ainsi que le sud-est asiatique. L’eau est le prin- cipal mode de contamination et il n’existe pas de reservoir animal du parasite si ce n’est l’homme lui- meme. La contamination se fait par ingestion de kystes, formes resis- tantes du microorganisme qui assurent sa survie dans le milieu environnant.

1. l’amibiase Parmi les 500 millions de personnes infestees par Entamoeba, seuls 10 % declarent la maladie. Cette discordance tient a la presence chez l’homme de differentes souches de Entamoeba. La plupart des contaminations par Entamoeba

sont dues 5 Elztamoeba dispav et Entamoeba muskkovskii, souches non pathogenes ; E&amoeba kistolytica est la seule espece pathogene, responsable de l’amibiase. La distinc- tion entre ces souches a pu etre rea- lisle apres des nombreux efforts investis dans la mise au point des techniques moleculaires ]271 et immunologiques [471 pour le typa- ge de souches de Entamoeba. Cepen- dant, toutes les personnes infestees par E. kistolytica ne developpent pas systematiquement une amibiase. A ce jour, il n’existe pas d’etudes epi- demiologiques qui permettent de preciser le pourcentage de personnes infestees par E. kistolytica qui finissent par developper la maladie. En effet, comme les autres parasites, E. kistolytica a developpe des mecanismes d’adaptation pour survivre pendant de longues periodes chez son hbte sous la forme commensale, c’est la situation dite d’infestation. Dans des conditions environnemen- tales encore tres peu definies, l’equilibre hate-parasite est rompu, les amibes envahissent l’epithelium intestinal, consequence de l’expression du pouvoir pathogene, et la maladie s’ensuit. E. kistolytica est done un pathogene car capable de donner lieu a l’amibiase, mais c’est l’expression de ce pouvoir pathogene a un moment donne qui determi- ne sa virulence. La pathogenicite peut conduire a la destruction de l’hote, ce qui n’est pas saris consequence pour la perennite de l’espece parasitaire.

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C’est en 1875 clue Fedor Aleksan- drovitch Liisch decrit en details l’agent responsable de la dysenterie amibienne. Ce microorganisme est une amibe qu’il appelle Amoeba coli, en reference a sa localisation dans le colon des patients atteints de dysenterie. En 1903, Shaudinn etablit des distinctions morphologiques entre la forme enkystee de E. histolytica, espece pathogene, et celle de Entamoeba coli, forme non pathogene. En 1919, Dobell montre que E. histolytica est associee aux abces hepatiques presents chez les malades d’amibiase. Puis, Brumpt en 1925, emet l’hypothese que Enta- moeba dysenteviae est la forme pathogene tandis que Entamoeba dispav est la forme non pathogene. Telle les autres especes connues de Entamoeba, E. histolytica existe sous deux formes cellulaires distinctes : le kyste qui est la forme infectieuse du parasite, et le trophozo’ite ou forme vegetative, responsable de l’amibiase invasive. AprPs ingestion par l’hote, la forme enkystee passe dans l’estomac : les sues gas- triques commencent a dissoudre son enveloppe externe qui finit par disparaitre dans l’ileon. Le kyste ainsi debarrasse de sa paroi gagne l’intestin oti des processus d’activation prennent place pour realiser l’exkystation. On observe alors l’apparition de la deuxieme forme cellulaire : le trophozoi’te ou forme amibienne du parasite (figure 1). 11 se presente comme une cellule mononucleee, entouree d’une membrane plasmique classique- ment rencontree chez les cellules eucaryotes. Aprils analyse de la sequence des ARN ribosomaux, les etudes phylo- genetiques on conclu que E. histolytica est un eucaryote primitif. De plus, il est depourvu de mitochon- dries et possede un appareil de Golgi t&s peu developpe [ 131. Ses caracteristiques morphologiques refletent les fonctions pathogenes : le cytoplasme renferme de nom-

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breuses vacuoles et vesicules impli- q&es dans des processus de phagocytose, d’endocytose et de secretion, particulierement actifs au tours de l’amibiase invasive. Une autre caracteristique essentielle des trophozoi’tes est leur capacite de se mouvoir. En effet, le mouvement est une propriete indispensable a la progression des amibes dans les tissus de l’hote. Residant dans le colon, E. histolytica peut etre elimi- nee dans les selles sous la forme tro-

phozoi’te ou apres avoir subi le processus d’enkystement. Les kys-tes nouvellement form& ne possedent qu’un noyau et sont a un stade immature. 11s acquierent leur matu- rite apres deux divisions nucleaires successives intervenant soit dans le colon soit dans le milieu exterieur. Cependant, une alternative est pos- sible : le trophozoi’te peut entrer en phase virulente (figure 2), et conduire a l‘amibiase invasive en franchis- sant les etapes suivantes :

Figure 7. Trophozoite de Entamoeba histolytica observe en microscopic optique B contraste de phase. Le pseudopode 6mi.s au front de migration est une structure hyaline servant d’organe locomoteur, dans lequel le cytoplasme de /a cellule se dkverse. Au p&e oppos6, I’urolde, form6 par rep/is membranaires, est associk au capping des rtkepteurs de surface. II prksente ici une concentration de bactkies Shigella flexneri, incubkes avec /es trophozoi’tes lors de cette experience [IZZ]. Le cytoplasme des amibes montre une structure v&icuk+e visible sur cette micrographic.

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a) adhkrence & la muqueuse intestinale, stimulation de la &cretion du mucus, b) rupture des barriPres intestinales par s&&ion d’enzymes proteolytiques et de toxines ; interaction avec la matrice extracellulaire, c) adhkrence aux cellules, lyse, d&eloppement du processus inflammatoire et d’ulcQation des tissus, phagocytose des cellules, d)r&istance aux mecanismes de defense immunitaire de l’organisme, e) dissbmination secondaire et infection de parenchymes ?I distance de l’intestin.

3.1. Interaction des trophozoi’tes avec le mucus gastro-intestinal

L’invasion de la barri&-e intestinale par E. kistolytica est le signe du d&lenchement de la virulence. Elle s’accompagne d’une &&tion mas-

sive de mucus par l’h8te en rkponse 5 l/infestation. Des Ptudes rkalisbes sur des modPles d’anse intestinale de rat montrent que le mucus s&r&& lors de I’infestation par E. kistolytim diminue efficacement la motiliM des trophozoi’tes. Ces derniers sont alors rapidement agr&g& et peuvent ainsi Ptre elimi- nks [58]. Paradoxalement, le pouvoir &cr&agogue de E. kistolytica exacerbe la s&retion de mucus. 11 a etf? montrf? que ce processus peut finalement aboutir B l’kpuisement de la capacitk mucos&r4toire des cellules caliciformes [251. Les amibes peuvent alors gagner la surface de l’kpithklium et adherer & l’apex des cellules bpithkliales. Des rats immunises avec des extraits totaux d’amibes ont montrk une augmentation de la s&+tion de mucine colique en rkponse a une nouvelle infestation expgrimentale par les parasites [1151. Ceci suggPre qu’un composant du systPme immunitaire participe ti la stimulation de la &crktion du mucus. L’in-

teraction des amibes avec des cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) est inhibke en presence de mucine purifike [26]. Cette inhibition est due B la presence d’un Scepteur de type lectine de 260 kDa & la surface des amibes qui lie la mucine. En effet, on retrouve dans la mucine cinq sucres majeurs, dont le galactose et la N-a&tyl-galactosamine, qui sont capables d’inhiber l’activite de la lectine de 260 kDa, d’oti son appellation lectine Gal- GalNAc [261.

E 3.2. Adhkence des amibes aux cellules de 1’CpithClium intestinal et P la matrice extracellulaire

3.2.1. Rkepteurs intervenant duns la reconnaissance amibe-cellule t5pith8liale de I’h8te

L’invasion de l’intestin humain par E. kistolytica rappelle des processus communs aux cellules do&es de motilite, comme l’exemple des cel-

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Destruction des tissus f- SCcrCtion de protkases

Rtorganisation du cytosquelette

Migration dans l’intestin 1. Formation de? pseudopodes

Figure 2. Un m&/e de /‘invasion de I’kppith6lium intestinal par E. histolytica. Les amibes sent activkes par des signaux non encore d#inis, provenanr probablement de l%pith&um lui-m@me. La Panslocation de ces signaux vers l’inkkieur des amibes est ass&e par /a pksence de rkcepteurs 2 /a surface des frophozoi’tes : des rkcepteurs B /a matrice extracellulaire et des rkepteurs aux cellules kppithkliales (voir description dans le texte). Ces rkcepteurs assurent l’adhkrence des amibes. L’activation des rkepteurs se traduif par /‘induction d’une cascade d’&&ements A I’int&ieur des amibes, qui passe par /‘activation des kinases teelles /a PKC et /es petites GTPases de /a famille Rho. Des modifications du cytosqueletfe apparaissentpar le contours de I’activitk dynamique de I’acfine et des profkines qui lui sent associ6es. Ces modifications conduisent A /a polarisation des trophozoi’fes qui prksentent alors un pseudopode B /a partie frontale et un uroyde dans /a partie caudale. Le mouvemenf devient alors orient6 et /es amibes p&Went le tissu intestinal. Dans le m6me temps /es amibes &&tent des protkases qui concurrent au processus d’invasion par /a destruction de jonctions cellulaires et de la matrice. Le processus d’inflammafion est dkclench6, /es cellules de /a rkponse immunitaire surviennent 2 I’endroit de /‘infestation augmentant ainsi la destruction fissulaire. Enfin, /es amibes tuent et phagocytent /es cellules humaines.

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lules en metastase. De ce fait, la capacite invasive de cellules mobiles a et& consideree comme une fonction conservee a travers l’evolution des especes 161, 731. Les etapes necessaires aux metastases et a l’invasion amibienne compren- nent parmi d’autres l’attachement aux cellules cibles et a la matrice extracellulaire. Pour s’inserer entre les enterocytes et joindre la lamina basale, les trophozoi’tes doivent s’at- tacher a la surface apicale de la muqueuse composee de la bordure en brosse des enterocytes. L’observation d’amibes en microscopic electronique a balayage en presence de cellules intestinales Caco-2, obte- nues d’un carcinome de colon humain 1781 montre des nombreuses projections amibiennes [91] qui interagissent avec la monocouche de cellules. L’adherence resulte de l’activite de nombreuses proteines, en particulier des recepteurs presents a la surface des cellules. Chez E. histolytica, il existe une lectine de 220 kDa et une adhesine de 112 kDa, qui jouent un role in vitro dans l’interaction des trophozoi’tes avec les cellules epitheliales et les erythrocytes respectivement [ 7, 941. Recemment, il a ete propose que le domaine carboxy-terminal de l’adhesine de 112 kDa est necessaire a l’interaction des amibes avec les hematies1381. Neanmoins, a ce jour, la lectine Gal-GalNAc est la seule proteine reconnue comme facteur majeur dans l’interaction amibe-cellule ; elle a ainsi beneficie d’etudes detaillees.

La lectine Gal-GalNAc

L’adherence des amibes aux cellules cibles, telles les cellules epitheliales et les lymphocytes, s’exerce en partie a travers la lectine Gal-GalNAc. Cette activite est inhibee, comme pour l’adhesion a la mucine, par le galactose ou le N-acetyl-D-galactosamine. La lectine Gal-GalNAc est une glycoproteine heterodimerique composee dune sous-unite trans- membranaire de 170 kDa et d’une sous-unite de 31/35 kDa ancree a la membrane par un domaine glyco-

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syl-phosphatidil-inositol (GPI)1771. La sous unite de 170 kDa est en majorite extracellulaire, elle possede le domaine qui se fixe au mucus et aux cellules CHO et un deuxieme domaine liant le complement [671 (figure 3). Apres le domaine trans- membranaire, il a ete decrit un court segment cytoplasmique suppose @tre le lien entre le domaine extracellulaire et l’interieur cellulaire. Tres recemment, des souches qui expriment le domaine carboxy-terminal de la sous-unite de 170 kDa de la lectine ont Pte construites. Elles presentent un phenotype dominant negatif pour l’adherence aux cellules epitheliales [1231. Cependant, ces souches ne sont affectees ni dans la phagocytose ni dans la liaison des amibes au complement. De ce fait, le fragment cytoplasmique de la lectine serait le domaine specifique qui permet de relier les signaux de l’environnement aux fonctions d’adherence. 11 permet- trait l’interaction du recepteur aux cytosquelette sous-cortical et trans- porterait ainsi ces signaux vers le cytosquelete pour engendrer les structures necessaires a l’adherence des amibes aux cellules. Alternati- vement, il pourrait etre necessaire pour l’ancrage et la distribution cor- recte de la lectine Gal-GalNAc a la surface des parasites. La surexpression du domaine cytoplasmique viendrait alors perturber l’une et/au l’autre de ces fonctions. Par ailleurs, de man&e assez surpre- nante, apres le contact des amibes avec les cellules epitheliales, un transfert moleculaire de la lectine Gal-GalNAc (ou d’un fragment) s’effectue vers la region basolaterale de ces cellules 1591. La dephospho- rylation des proteines composant les jonctions serrees [60] survient par la suite. Le mecanisme moleculaire a la base de ce transfert est inconnu.

3.2.2. RBcepteurs amibiens intervenant dons la reconnaissance de la matrice extracellulaire

Lors de la progression des amibes dans l’intestin humain, la matrice

extracellulaire est detruite. L’etude de l’interaction des amibes avec les proteines de la matrice extracellulaire a permis d’identifier plusieurs proteines participant a cette liaison. Un recepteur a la fibronectine de 37 kDa 11211, et un recepteur a la laminine qui de plus presente une activite alcool deshydrogenase fer- dependante 11301. Une proteine de 140 kDa a ete egalement immuno- revelee avec un anticorps anti-integrine l31 11111. Chez les leucocytes humains, les integrines sont impliquees dans les processus d’adherence a la matrice extracellulaire et dans les voies de signalisation [2]. Une proteine de 30 kDa, recepteur au collagene I, a ete isolee 1931. De plus, une proteine qui lie l’acide hyaluronique et qui presente des homologies avec le recepteur CD44, un recepteur actif durant la metastase de cellules humaines, a ete trouvee a la surface de E. histo- Iytica 1891. L’heterogeneite structurale et fonctionnelle de ces recepteurs atteste des interactions multiples des amibes avec la matrice ; cependant, les voies de signalisation engendrees par l’interaction de ces recepteurs avec leur ligands sont encore peu etudiees.

W 3.3. Invasion et destruction des tissus par E&amoeba histolytica

La phase suivante de l‘amibiase invasive se caracterise par la desor- ganisation et la destruction massive de l’epithelium intestinal, activites qui ont don& le nom de E. histolytica a ce parasite. Le pouvoir cytotoxique des amibes sur l’intestin est associe a l’activite mecanique des amoebopores et aux activites enzymatiques des pro-teases et phospholipases.

3.3.1. Protkolyse du tisso intestinal et des Blhments de la rbponse immune

Pendant l’invasion de l’epithelium une intense activite proteolytique exprimee par les trophozo’ites inva- sifs s’exerce sur les proteines de la matrice extracellulaire et sur celles activees lors de la reponse immune

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[881. Ces proGases sont impliqukes dans la degradation des prot&nes de la matrice extracellulaire et des prot&nes qui permettent d’ancrer les cellules kpitheliales & cette matrice 11031. Parmi les cystkines protkases caractQis&es, une prot&- ne de 56 kDa, homologue de la cathepsine B et s&Me par les amibes, est capable de dkgrader, in vitro, la fibronectine, la laminine et le collagGne de type I. Elle induit bgalement le d&ollement de cellules kpithkliales en culture, et active le plasminogPne des cellules cibles 1531. De plus, cette protkase est impliquee dans l’activation de la voie alterne du complkment [87]. Des ktudes recentes ont permis d’isoler six genes codant des cys- t&nes protkases qui diffPrent entre elles de 40 2 80 % dans leur &quence [201. Trois de ces gGnes, ehcpl, ehcp2 et ehcp5 codant respectivement l’amoebapai’ne, l’hystolysai’ne et la cysteine protease 5 sont responsables de 90 % de l’activite cys- t&ne protease chez E. histolytica. 11 est ?I remarquer que la sequence en acides amin& deduite du gPne ehcpl montre que cette protGase est homologue aux cysteines protkases lib&es par les macrophages et par les cellules can&reuses, suggerant ?I nouveau un mkcanisme commun d’invasion des tissus A ces diff& rents types cellulaires. L’utilisation d’inhibiteurs specifiques des cys- t&nes protkases inhibe la formation d’abcPs du foie dans les modGles animaux [ 1091. D’autres activit& protkolytiques ont et6 d&rites chez E. histolytica : (-) une activite collagenase activee lors du declenche- ment de la virulence et associke ZI des granules de &&tion [lo61 et (- ) une cysteine protease de 60 kDa qui dkgrade le compl@ment et semble impliquke dans l’erythro- phagocytose [1081.

3.3.2. Pouvoir cytolytique de E. histolytica

Les amibes exercent un effet cytolytique contact-dkpendant sur les cellules 4pithfYiales [821 et sur les cellules effectrices de la rkponse

NH2

milieu extracellulaire n

+- tryptophane et cysttine

l-l f sans cystkine

+- riche en cydine

cytoplasme COOH

domaine carboxy-terminal

Figure 3. Repr&entation schbmafique de /a lecfine Gal-GalAJAc. Cetfe prot&ne est composbe de deux sous-unit& de 170 kDa et 35 kDa respectivement. f//es sent likes par des ponfs disulfure. La sous-unit4 de 35 kDa est ancrbe B /a membrane par du GH et sa fonction est inconnue. La sous- unit6 de 170 kDa, composee de 1275 acides amin& [68] esf divisBe en plusieurs domaines : (-) un domaine extracellulaire dont /a rkgion riche en cy.st&ne parficipe g /‘adb&ence de E. histolytica aux cellules .4pitMales et au comp@ment, (-) un court domaine fransmembranaire et (-} un domaine cytoplasmique (reprbsentk dans /a parfie encadrke). La surexpression du domaine cyfoplasmique rend /es amibes dkficientes pour /es fonctions d’adhkrence. Des mutations simulfan@es dans /es acides amin& marquees d’une Bfoile [convertis en alanine) restaure le ph&ofype sauvage [123].

immunitaire que sont les macro- intracellulaire associke A un chan- phages, les lymphocytes et les leu- gement de permgabilitk membra- cocytes polymorphonuclkaires [96, naire [84]. La cytolyse est associee A 971. L’observation de tissus intesti- l’activitk de prot&nes &crSes par naux d’animaux qui ont d&eloppe les amibes qui sont capables de for- une amibiase invasive illustre bien mer des pores regulant la circula- la capacitk destructrice des amibes. tion d’klectrolytes dans la membra- Les l&ions ulc&+es crfSes par les ne des cellules cibles. Une proteine trophozoi’tes engendrent la n&rose cytoplasmique de 13 kDa est s&r& des tissus ; les amibes vghiculent de t&e, elle est capable de crker des nombreux debris cellulaires prove- pores dans des modPIes membra- nant en particulier de la lyse des naires in vitro et d’engendrer une kosinophiles, tandis que les macro- depolarisation membranaire chez phages et les lymphocytes restent A les macrophages et les lympho- la p&iph&ie de la l&ion [15]. La cytes 132, 661. Trois isoformes d’un mort des cellules-cibles s’accom- peptide de 5 kDa ont t?te kgalement pagne de l’augmentation irrever- caractQi&es. Ce peptide est un sible de la concentration en calcium amoebopore ou ionophore dont


l’activite est a la fois bactericide sur les batteries phagocytees par les amibes, et cytotoxique sur les cellules eucaryotes [561. Deux autres proteines de 23,5 et 25 kDa ont ete caracterisees ; elles sont membranaires et possedent une activite hemolytique sur des erythrocytes de rat [951. Exprimees dans un sys- teme bacterien, ces hemolysines conduisent a la lyse des cellules intestinales 1521. E. hisfolytica renferme egalement deux phospholipases A [641 : la premiere, localisee a la surface des amibes a une activite calcium- dependante tandis que la deuxieme est associee a des vesicules intracellulaires et a une activite calcium-independante. L’utilisation d’antagonistes du calcium ou d’inhibiteurs des phospholipases A inhibe la cytotoxicite des amibes sur les cellules CHO [851. La destruction du tissu est accen- t&e par l’activation des cellules de la reponse inflammatoire. En effet, les amibes exercent sur les leucocytes polymorphonucleaires humains un pouvoir chimio-attrac- tant : leur migration a travers les tissus puis leur lyse, entrainant la liberation d’enzymes proteolytiques, concourent a la destruction des tissus [21,96,971. En plus de la progression des amibes a travers l’epithelium intestinal, leur dissemination, par l’intermediaire des vaisseaux sanguins, leur permet de gagner d’autres organes tel le foie. L’amibiase hepatique est la mani- festation la plus courante de la dissemination des amibes. Elle s’accompagne de la formation d’abces hepatiques, la cause la plus commune de mortalite par amibiase.

3.4. ActivitC phagocytaire de E. histolytica

La phagocytose des cellules est tres active dans le processus pathogene de E. histolytica. Des cellules tels les erythrocytes humains [116], des batteries 1181 et des cellules epitheliales lysees ou non lors du contact amibes-cellules [81] sont phagocy-

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tees. L’etude de mutants de E. histolytica, deficients pour la phagocytose, a montre qu’ils etaient moins virulents in vivo, ce qui illustre l’importance de ce processus dans la pathogenicite des tro- phozdites. Chez ce mutant, l’adhesine de 112 kDa est absente ou alteree 1921. La phagocytose represente une suite d’evenements qui conduisent a l’ingestion des cellules. AprPs leur adhesion a la surface des amibes, les cellules sont envelop- pees par deux pseudopodes qui se referment pour former une vacuole qui est internalisee. Les vacuoles de phagocytose fusionnent avec des vesicules assimilees a des lyso- somes contenant des cysteines pro- teases [loll et au moins une proteine lysosomale [141. De plus, des proteasomes, complexes proteiques impliques dans les processus intracytoplasmiques de degradation des proteines, ont ete mis en evidence chez E. Izistolyticn 11021 et peuvent participer a la degradation du materiel phagocyte. Les recepteurs specifiques a la surface de E. histolyfica sont des elements importants pour la reception et la transmission des signaux qui engendrent l’adherence a la matrice et aux cellules-cibles. La consequence la plus drastique de leur interaction est la destruction tissu- laire, la mort de cellules humaines et leur phagocytose.

La physiopathologie de l’amibiase repose sur les capacites mobiles du parasite qui lui permettent de penetrer dans l’epithelium intestinal. Cette fonction, ainsi que celles d/adherence a la matrice et aux cellules, repose sur la dynamique du cytosquelette d’actine. En effet, l’adherence de E. histolytica aux erythrocytes augmente la polymerisation de l’actine aux sites de contacts entre les deux cellules [91.

De plus, la phagocytose, le mouvement, et la formation de plaques d’adherence sont inhibes apres traitement des amibes par la cytochalasine D, une drogue qui inhibe la polymerisation de l’actine [74, 831. Nous passerons en revue les faits les plus marquants parmi un nombre croissant de donnees expe- rimentales qui confirment le role du cytosquelette d’actine dans la pathogenicite de E. Izisfolytica.

7% 4.1 Le mouvement chez Entamoeba histolytica

Les capacites invasives de E. Izisto- Iyticn sont likes a la possibilite pour le parasite de subir une translocation depuis le site de declenche- ment de la virulence, a travers I’epithelium. La dissemination du pathogene est done assuree par sa motilite. De ce fait, ce parasite est un modele de choix pour l’etude du mouvement, d’autant qu’il survient dans le contexte de l’invasion d’un organisme eucaryote par un pathogene eucaryote. E. lzistolytica est une cellule particulierement mobile dont la vitesse de deplacement in vitro est de l’ordre de 1,4 urn par seconde [51. Sous l’action d’agents chemoattractants, les trophozoi’tes adoptent un mouvement orient4 et plus rapide [ll]. In vitro, la reponse chimiotactique peut etre induite par la presence de certaines especes bacteriennes ou par des gradients de concentration de composants du milieu de culture [ll]. L’acide sialique, un composant du mucus colique, accroit la motilite des trophozoi‘tes [57], de m@me que des extraits lytiques d’erythrocytes [117] et de fibronectine [37]. Bien que la stimulation du mouvement chez E. histolytica n’ait pas ete demontree in vivo, les resultats experimentaux decrits ci- dessus suggerent qu’une stimulation chimiotactique et/au hapto- tactique initie l’invasion de l’epithelium intestinal [42]. La stimulation du mouvement chez E. histolytica se caracterise par la polarisation des amibes en deux structures morphologiquement

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distinctes : le pseudopode, qui se forme au pole anterieur, constitue l’organe locomoteur et s’accompagne d’un flux cytoplasmique dirige vers l’avant de la cellule ; simul- tanement, un appendice membranaire, appele uroide, apparait au pole posterieur. L’uroide se forme par replis membranaires et joue un role encore ma1 defini. 11 est cependant associe au processus de capping de recepteurs conduisant a la concentration de complexes recepteurs-ligand a un pole de la cellule. Le mouvement amiboi’de est un exemple d’activite mobile qui engendre le deplacement d’une cellule adhesive. 11 est une succession synchronisee de trois &tapes : a) l’initiation du mouvement com- mence par l’emission d’une projection membranaire a un pole de la cellule qui definit le front de migration et qui forme le pseudopode ; b) cet organe locomoteur va etablir de nouveaux points d’ancrage permettant aux forces de traction de s’exercer ; c) le corps cellulaire est alors projete vers l’avant et en meme temps le pole posterieur se retracte. Ce cycle se repete et assure ainsi la progression de la cellule [55]. De plus, dans certaines cellules mobiles telles les lymphocytes ou les amibes, le d&placement est lie au capping de recepteurs a la surface cellulaire.

4.1-l La formation du pseudopode

La reconnaissance par des recepteurs de surface du signal stimulant la motilite induit l’activation de voies de signalisation qui entrainent une reorganisation rapide du cytosquelette d’actine sous-cortical 128, 1101. Cela se traduit localement par l’emission d’une projection membranaire riche en actine filamenteuse et depourvue d’organelles : le pseudopode. En dehors des fonctions de mobilite les pseudopodes sont egalement form& dans les pre- mieres etapes de la phagocytose, ils permettent d’enrober la cellule qui sera par la suite incluse dans la vacuole de phagocytose.

4.1.2. l’actine et les prot&nes qui hi sont associbes duns la formation des pseudopodes

Lactine est une proteine qui a ten- dance a s’autoassembler en filaments helicoidaux (actine F). Le changement conformationnel de l’actine soluble (actine G) en actine F est reversible et appele transition sol-gel 1100, 1101. Les mecanismes qui maintiennent l’equilibre entre l’actine soluble et l’actine filamenteuse sont complexes et reposent sur l’activite des proteines liant l’actine. De nombreuses proteines impliquees dans la regulation du processus de polymerisation/ depolymerisation de l’actine, dans la regulation de la longueur des filaments ainsi que dans leur organisation en structures stables, ont ete identifiees puis caracterisees biochi- miquement ]39, 48, 691. Elles peuvent @tre classees en trois grandes familles selon leur mode d’interaction avec I’actine. a) La famille des proteines telles la thymosine B4 et la profiline qui sequestrent l’actine G et regulent la polymerisation de filaments [24,49,112] ; b) La famille des proteines telles la gelsoline, la CapZ, ou l’ADF/cofiline qui s’associent aux filaments d’actine et regulent leur polymerisation ainsi que leur croissance ]1271. Ce sont les proteines dites coiffantes qui masquent l’extremite barbee des filaments empechant ainsi leur elongation, elles possedent en plus une activite de fragmentation des filaments, impliquee dans les changements de rigidite du gel d’actine [281 et dans l’augmentation du nombre de sites de polymerisation de l’actine. D’autres proteines appartenant a cette meme famille comme, par exemples, la fimbrine/plastine, la villine, l’a-actinine, le facteur de gelation ABP120, assurent l’organisation architecturale des filaments entre eux ; elles possedent generale- ment deux sites de liaison a l’actine qui entrecroisent les filaments pour former les reseaux observes dans les lamellipodes et les pseudopodes [29, 30, 721. Enfin, c) la famille des proteines telles la ponticuline, la

taline et l’histophiline qui sont impliquees dans la liaison des filaments d’actine avec la membrane plasmique [65,991.

4.1.3. l’actine et /es prothnes qui lui sont associbes iors de la formation de pseudopodes chez E. histolytica

L’ensemble des processus lies a la motilite depend du cytosquelette d’actine et des proteines associees qui regulent son activite et son organisation structurale. Chez E. histolytica, l’actine a ete purifiee et caracterisee [701. C’est une proteine de 42 kDa, homologue a l’actine d’autres cellules eucaryotes. Cependant, l’etude comparee des proprietes de l’actine de E. kistolytica et de l’actine musculaire de lapin montre qu’elle est insensible a l’action de la DNase I et presente une sequence pepti- dique modifiee a son extremite amino-terminale, suggerant des proprietes biochimiques differentes chez ce parasite [41]. La localisation d’une concentration intense d’actine a la peripherie du pseudopode suggerent un role du cytosquelette d’actine dans sa formation ]121. Chez E. kistolytica, trois proteines qui lient l’actine ont ete d&rites dans le pseudopode : la profiline, l’ABP120 et la myosine IB.

4.1.3.1. La profiline

Les deux isoformes, acide et basique, de la profiline ont ete iso- lees et caracterisees 1161. Le gene codant la forme basique a ete clone et sequence. La sequence proteique deduite presente certaines diver- gences avec celle d’autres profilines connues, notamment dans le site de liaison a l’actine, ce qui suggere que l’activite de cette proteine peut etre differente de celle observee chez les cellules d’eucaryotes superieurs [112]. Un anticorps specifique dirige contre la forme basique de la profiline de E. kistolytica a montre qu’elle est enrichie dans le pseudopode des amibes en mouvement (N. Guillen et M. Duchene, resultats non publies).

ANNALES DE L’INSTITUT PASTEUR / actualit& (19%) 10,1 127

4.1.3.2. ABP720

Recemment, le gene codant le facteur de gelation ABP120 a et6 isole et sequence [ 1181. La proteine ABP120 a et6 localisee au front de migration et dans la region de l’uroi’de, forme lors de l’induction du cupping 11181. De plus, la sequence d’ABP120 n’a revel6 que quatre des six domaines organises en feuillet B au centre de la molecule, et un domaine supplementaire a et6 localise dans la region carboxy-terminale de la proteine. Ce dernier presente une structure repetitive de courts motifs constitues de residus acides et basiques, possedant des homologies avec ceux des proteines qui lient les microtubules. L’ensemble de ces caracteristiques suggere qu’ABP120 presente une activite specifique chez E. histolytica differente de celles qui lui sont attri- b&es pour d’autres cellules.

4.7.3.3. La myasine IB

Les myosines sont des mecano- enzymes qui hydrolysent l’ATP et transforment l’energie chimique ainsi lib&e en energie mecanique. Elles ont la propriete de lier l’actine pour assurer de multiples fonctions cellulaires. Les myosines sont divi- sees en treize classes, definies selon leurs homologies de sequence et leurs activites specifiques ; parmi elles, la myosine de type I participe a la formation de pseudopodes [113]. Le gene codant la chaine lourde de la myosine IB chez E. histolyfica a et6 identifie et isole. 11 code une proteine de 130 kDa possedant deux sites de liaison a l’actine dont le dernier, ATP-independant, est trois fois plus court que celui de la myosine IB de Dictyosteliunz discoideurn ; cependant, ce site est tout a fait fonctionnel [119]. La myosine IB est concentree dans le pseudopode des amibes en mouvement, autour des vesicules, de la vacuole de phagocytose et de quelques phagosomes. Un resultat recent montre que la surexpression de 2 a 3 fois du gene codant la myosine IB de E. histolytica a pour effet de diminuer le taux de phagocytose, apparemment par un dys-

128

fonctionnement du cytosquelette d’actine. C’est la premiere fois qu’un role dans la pathogenicit parasitaire est attribue a la myosine IB [124]. Cependant, dans ces cellules qui portent deux fois plus de myosine IB aucun changement dans la vitesse de mouvement n’a et6 decele. Ce resultat revele des differences d’activite de la myosine IB lors la motilite par rapport a la phagocytose, et souleve la question de savoir si les pseudopodes form& dans ces deux processus sont equi- valents en structure et fonction. 11 est done interessant de determiner la nature des interactions des proteines d&rites ci-dessus avec l’actine et avec les autres proteines qui lient l’actine lors de la formation de pseudopodes soit pendant le mouvement, soit pendant la phagocytose. Les elements communs a la formation de differents types de pseudopodes pourront alors etre definis.

4.1.4. Interaction et adherence aux cellules et d la matrice extraceliulaire

Le deplacement dune cellule repose aussi sur sa capacite a etablir des points d’ancrage suffisamment solides avec le substrat pour d’une part, stabiliser la protrusion formee et d’autre part, permettre aux forces contractiles de s’exercer 1.551. De fait, l’observation en video-microscopic a trois dimensions de la migration de leucocytes et de D. discoidem, montre que des pseudopodes peuvent se former au-dessus du substrat, mais que seuls ceux qui interagissent avec ce dernier sont aptes a initier le deplacement de la cellule [71, 1291. L’interaction avec le substrat se fait a travers des recepteurs specifiques ; parmi eux, les integrines jouent un role preponderant chez les cellules d’eucaryotes superieurs [3]. En effet, ces glycopro- teines heterodimeriques transmembranaires constituent l’element cen- tral des plaques d/adherence, complexes multi-proteiques qui assurent la liaison entre le cytosquelette d’actine sous-cortical et la matrice extracellulaire [45]. Les

sous-unites B des integrines, qui interagissent avec la matrice, trans- mettent un signal dans la cellule afin de reguler leur adherence au substrat. Celui-ci conduit au recru- tement ordonne des proteines for- mant les plaques d’adherence et a la stimulation de l’activite tyrosine kinase. La phosphorylation de proteines comme la tensine, la paxilline et FAK (focal adhesion kinase) inter- vient alors [44,51]. Diverses proteines a la surface de E. Izistolytica ont et6 identifiees pour leur capacite a interagir avec la matrice extracellulaire (cf. supra). Cependant, aucune de ces proteines n’est une integrine ce qui pose la question de la nature des interactions des amibes avec la matrice. En effet, E. kistolytica est un organisme unicellulaire protozoaire ; dans son evolution, il a rencontre et parasite des organes d’un metazoaire, chez lequel la matrice extracellulaire assure l’architecture des tissus. Puisque E. lzistolyticn est tres mobile, ses interactions avec la matrice sont necessairement transitoires et de ce fait la presence des integrines ne semble pas indispensable : elles sont done absentes ou tres faiblement representees parmi les proteines de surface amibienne, un trait qui a change dans l’evolution car chez les eucaryotes superieurs, les integrines sont des proteines t&s abondantes. Quoiqu’il en soit de la presence des integrines amibiennes, il reste a comprendre la synergie des divers facteurs deja decrits dans l’adherence de E. histolyica a la matrice extracellulaire. L’adherence des amibes a la fibronectine, au collagene ou a la matrice extracellulaire entiere, conduit a la formation de structures adhesives, similaires a celles observees chez les eucaryotes superieurs. Uisolement des plaques d’adherence formees apres contact des amibes avec la fibronectine a montre que ces structures renferment non seulement des recepteurs a la matrice, mais egalement des proteines du cytosquelette [41, 1201. L’etude biochimique a permis d’identifier : l’cx-actinine, la vinculine, la myosine de type I, la


myosine II et la tropomyosine. Des elements des voies de signalisation telles la PKC, FAK et la MAP kinase p42 ont ete egalement identifies [76, 1201. Chez les cellules d’eucaryotes superieurs, ces kinases sont impli- q&es dans la formation des plaques d’adherence focales [98] et dans la cascade de phosphorylation conduisant a l’accroissement de l’activite mitogene [33]. De plus, l’activation de la PKC par les esters de phorbol stimule le pouvoir cytotoxique des amibes sur les cellules et l’adherence a la fibronectine [1281. Les roles respectifs de ces proteines dans l’interaction de E. kistolyticu avec la fibronectine et dans la formation des plaques d’adherence restent a determiner. 11 n’existe pas encore de donnees definitives qui attestent du role du cytosquelette d’actine dans l’adherence de E. kistolyticu. Cependant, l’idee de ce role est renforcee par l’obtention d’un mutant resistant a la cytochalasine D, souche BG3, dont l’activite du cytosquelette d’actine est alteree 1311. Ce mutant presente une diminution de l’adherence sur le collagene de type I et de l’activite de secretion des granules renfermant la collagenase. 11 est par ailleurs affecte dans sa capacite a generer des abces du foie chez les hamsters nouveaux-n&s, par rapport a la souche sauvage [105]. Ces donnees montrent qu’il existe chez E. kistolytica des recepteurs specifiques aux proteines de la matrice extracellulaire capables de trans- mettre des signaux vers le cytosquelette et de stimuler son activite proteolytique. 11s mettent en evidence le role du cytosquelette d’actine dans les mecanismes d/adherence et de secretion chez E. kistolytica.

4.1.5. Mouvements rbtrogrades et capping ci la surface des cellules

Pendant le mouvement amibo’ide, le capping de recepteurs a la surface des cellules est observe. Les cellules en migration presentent un mouvement retrograde des particules likes a leur surface [ll, couple au deplacement, vers l’arriere des cellules,

des filaments d’actine form& au front de migration [107]. L’etude du role de la translocation des particules de surface dans le mouvement cellulaire a permis l’elaboration de deux modeles expliquant comment une cellule presente des mouvements de surface opposes au sens de la migration (figure 4). Le premier de ces modeles suppose l’existence d’un flux lipidique orient& dans la cellule [191.11 repose sur le couplage de l’endocytose, observee a la surfa-

ce des cellules, a l’exocytose des vesicules, dirigee vers le front de migration. Le processus d’endocytose/ exocytose induit un flux net de la membrane cytoplasmique et des particules associees a la surface dorsale. Les particules qui interagissent avec le substrat resistent a ce flux et creent en retour une force de traction qui propulse la cellule en avant. Le deuxieme modele, &aye par de nombreux arguments experimentaux, suggere que le mouve-

I Bntamoeba histolytica

2

Figure 4. Prksentation des deux modiles intkgrant /es mkanismes de mouvement r&rograde des particules, observk B /a surface des cellules en mouvement. (1) Mod&/e de flux lipidique. Les v&s+ w/es d’endocytose sont transportbes au front de migration des cellules oti e//es fusionnent avec la membrane plasmique. Cela g&&e un flux membranaire dirigk vers l’arrihre de la cellule qui entraine /es complexes rtkepteurs-ligands de /a surface, comme lors du capping. Dans le mt+me temps, /es rkepteurs de /a surface ventrale, immobi/is& par leur interaction avec le substraf, crbent en retour une force qui propulse /es cellules en avant. (2) Activifk du complexe actine-myosine I/ sous- cortical. Les complexes rkcepteurs-ligands interagissent avec le cytosquelette sous-cortical. La contraction du complexe actine-myosine /I crke un flux ktrograde qui entrahe le cytosqueletfe et /es complexes rkcepteurs-ligand de /a surface dorsale vers le pi/e postkrieur des cellules. Si /es rkcep teurs sont fix& B un substrat immobile, le transport rkfrograde exerce alors une force sur ce dernier qui propulse /a cellule vers /‘avant. Entamoeba histolytica au centre (20 pm) ihstre I’organisation polarisee de /a cehle en mouvement.

ANNALES DE L’INSTITLJT PASTEUR / actualit& (1999) 10,l 129

ment retrograde de particules a la surface des cellules est correle au processus de translocation/ contraction ou flux cortical du cytosquelette 1341. La contraction du cytosquelette mediee par la myosine II tire les filaments d’actine vers l’arriere de la cellule et entraine des recepteurs transmembranaires asso- ties au cytosquelette d’actine. De meme, les proteines interagissant avec le substrat sont tirees vers l’arriere et, par reaction, propulsent la cellule en avant [54]. Le cytosquelette accumule a l’arriere de la cellule subit alors une contraction qui redistribue ses composants et propulse le cytoplasme vers l’avant. Le complexe serait tres actif dans la region sous-corticale et a l’arriere des cellules, et absent ou inactif dans le pseudopode. Lobservation par immuonofluorescence de l’actine polymerisee et de la myosine II, montre une colocalisation avec les cups au pole posterieur des cellules. L’etude du mutant myosine II nul de D. discoideum montre, en plus d’une locomotion alteree, une inhibition totale du cupping des recepteurs [751. Ce mecanisme de translocation et de contraction du cytosquelette est a la base du processus de capping qui est accompli en deux &apes : apres stimulation par leur ligands, les recepteurs sont group& en amas ou patches, et subissent ensuite une translocation a un pole de la cellule pour former le cap [171.

4.1.5.1. Processus de capping et formation de l’uroible chez E. histolytica

Le capping des rbcepteurs

Le cupping des recepteurs se presente comme un des mecanismes permettant aux trophozoi’tes d’echapper a la reponse immune de l’hote [B, 231. Des experiences realisees in vitro montrent que le cupping peut @tre induit par l’incubation des amibes avec des serums de malades atteints d’amibiase. Les immuno- globulines et les molecules du complement sont adsorbees a la surface

130

des trophozo’ites puis concentrees au pole posterieur des cellules pour y etre soit endocytees [Bl soit reje- tees dans le milieu via la liberation de l’uro’ide [23,1141. En effet, le processus de capping chez E. histolytica est etroitement associe a la formation de l’uroi’de [23]. Lobservation en microscopic electronique des trophozo’ites pourvus d’un uroi’de montre que cette structure se forme par replis membranaires, a la base desquels une constriction apparait, aboutissant a sa liberation dans le milieu [4, 22, 231. L’elimination de l’uroi’de permet aux trophozoi’tes d’eliminer de leur surface les complexes recepteurs-ligands ayant subi le cupping et d’echapper a l’action cytotoxique des anticorps et des molecules du complement. C’est done un phenomene necessaire a la reponse adaptative des amibes conduisant a leur survie vis-a-vis de la reponse immune de l’hote. Les profils electrophoretiques des proteines purifiees a partir d’urdides, montrent la presence de recepteurs specifiques aux ligands ayant servi a induire le capping [351 ; parmi ces recepteurs, la lectine Gal-GalNAc a ete identifiee [4].

Lo myosine II

La presence de l’actine et la myosine II au pole posterieur des amibes en mouvement [lo, 36, 791 suggere que l’activite contractile du complexe actine-myosine II est requise lors des processus de capping 1361 et lors de la liberation de l’uroi’de (figure 5). La myosine II ou myosine conventionnelle a ete decouverte a l’origine dans les muscles squelet- tiques et est impliquee dans la contraction musculaire avec l’actine. C’est une proteine ubiquitaire, egalement presente dans la plupart des cellules non-musculaires, chez lesquelles elle joue un role preponderant dans les fonctions contractiles et mobiles [1261. Les myosines II sont des hexameres constituees de deux chaines lourdes d’environ 220 kDa, chacune associee a deux chaines leg&es d’environ 20 kDa appelees respective-

ment chaine leg&-e regulatrice et chaine leg&e essentielle. L’activite des molecules de myosine II est lice a leur capacite de former des filaments. Cette propriete specifique est portee par le domaine carboxy- terminal en a-helice super-enroulee ou meromyosine leg&e (LMM) [126]. Les filaments de myosine II interagissent avec les filaments d’actine et assurent les proprietes contractiles du complexe forme. Chez E. histolytica, le gene codant une chaine lourde de myosine II a ete isole, clone et sequence ]861. La sequence en acides amines deduite predit une proteine de 250 kDa, presentant 38,4 % de similarite avec la myosine II de D. discoidem et 39,4 % avec la chaine lourde de Acanthamoeba castellanii. Plus speci- fiquement, la comparaison de sequences entre ces trois chaines lourdes a permis de definir le domaine de la t&e de la myosine II de E. histolytica. 11 Porte les domaines specifiques impliques dans l’interaction avec l’actine, l’ATP et les chaines leg&es qui ne sont pas encore identifiees. Lanaly- se de la queue de la myosine II de E. histolytica montre une plus gran- de divergence de sequence avec celles des myosines II des microor- ganismes precedents. Cependant, la structure secondaire predite de ce domaine montre l’organisation en a-helice super-enroulee attendue au niveau de la LMM. La phosphorylation de la chaine lourde de la myosine II participe a la regulation de l’assemblage des filaments et a leur localisation intracellulaire. La chaine lourde de la myosine II chez E. histolytica presente deux sites, potentiels de phosphorylation de la PKC et de la caseine kinase II (Ser- 2034/Asp-2035 et Ser-2092/Leu- 2093) ; ces sites ont ete definis comme tels chez les myosines II de muscles lisses et de cellules non- musculaires [50, 1041.

R8le de la myosine II dans le capping chez E. histolytica

La localisation in vivo de la myosine II au pole posterieur des amibes


en mouvement, et plus sp&ifique- ment dans la rkgion de l’urdide, a PO& la question de son r61e dans la polarisation des amibes et dans le cupping [791. La premiPre approche utilisge pour ktudier les fonctions du complexe actine-myosine II dans le capping chez E. kistolytica a et6 d’inhiber la phosphorylation de la chaine lourde de la myosine II par l’utilisation des inhibiteurs sp&i- fiques de la PKC et de la cas&ne kinase II, et la polym&isation de l’actine par la cytochalasine D [4]. Les amibes ainsi traitkes et induites pour le cupping du rkcepteur Gal- GalNAc, ont prksentb une perte de polarit& associke 2 une diminution significative du processus de capping et de formation de l’uroi’de [4]. Les complexes recepteurs-ligands ne sont plus concentr& g un p81e des amibes mais presents sous forme de (( patches )), repartis 6 la surface de la membrane cytoplasmique, et la myosine II est observee dans la region sous-corticale, tout autour du corps cellulaire. Une autre approche ciblant specifi- quement la myosine II a &S d&e- loppke pour analyser le rale de cette prot&ne dans le capping des r&ep- teurs chez E. kistolytica. Elle consiste & surproduire le domaine LMM qui g&&e une souche avec un phenotype dominant negatif pour les fonction de la myosine II [51. C’est le premier mutant obtenu par gknie gknetique chez ce parasite. En effet, les methodes de g&+tique inverse et de d&%ion de gPnes ne sont pas encore performantes chez E. kistolytica. Nkanmoins, la surexpression du gPne mkcA tronquk a permis d’obtenir une souche synthetisant quatre fois plus de LMM que de myosine II endogene ce qui conduit SI des al&ations phenotypiques s&&es. 11 a et6 observg un defaut dans la division cellulaire et dans le mouvement. Le processus de capping a &k induit chez les amibes sur- exprimant LMM : les amibes per- dent leur capacitk de se polariser et restent rondes. La localisation du recepteur lectine Gal-GalNAc par immunomarquage a r&f%? sa pr& sence sous la forme de c( patches )),

Figure 5. Localisation du cytosquelette riche en actine pendant /‘activation du capping de rkcepteurs A /a surface de E. histolytica. Le capping de rkepteurs est induit par /‘incubation de trophozoftes avec /a concanavaline A. Les amibes son fixbes par /a paraformaldkhyde B 3,7 %, trait&es B /‘a&tone, et I’actine filamenteuse est ensuite dkorbe par la phallordine-FIX Les cellules sont alors analys&es par microscopic confocale. La micrographic reprksente /a reconstruction en trois dimensions des 15 coupes optiques de 0, 5 pm visua/i&es B /a fois en contraste de phase et en fluorescence. L’actine F (fluorescente en vert) est pr&ente sous /a membrane sous-corticale et enrichie dans la rkgion de I’uroide. La barre correspond B 5 PM.

tandis que la myosine II est retrou- vke dans la rkgion sous-corticale des amibes. Ce phenotype est similaire a celui dkcrit lors des expkriences d/inhibition de l’activitk du cytosquelette actine-myosine II par des drogues. Les dkfauts du cytosquelette chez la souche LMM ont conduit ZI la perte de la virulence de ces amibes sur des cellules epith& liales. En effet, apres contact avec une monocouche de cellules Caco-2, le tapis cellulaire reste intact au bout de 3 h, alors que la destruction du m$me tapis est obtenue avec la souche sauvage de E. kistolytica.

4.7.5.2. Autres prothes nkessoires au capping de rkepteurs

Protbines IEes aux cytosquelettes

Au tours du capping du r&epteur lectine Gal-GalNAc chez E. kistolytica, en plus du complexe actine-myosine II, il a &Z observk le recrute- ment, ti l’urdide, de protkines pr& sentant des epitopes communs avec

la spectrine, l’a-actinine, la plastine et l’ezrine [6]. Le fait que ces protkines apparaissent diffuses dans le cytoplasme des cellules non stimu- lees et soient recrutees avec la lectine lors du capping, suggitre qu’une voie d’activation est mise en place lors de l’interaction du rkcepteur lectine-ligand permettant & ces pro- t&nes de s’associer au cytosquelette sous-cortical. Chez les cellules eucaryotes, la spectrine, l’a-actinine, l’ankyrine ou encore l’ezrine sont recrutes pendant le cupping de Scepteurs de surface ; cependant, les mkcanismes qui relient les r&epteur 6 ces proteines du cytosquelette restent encore peu connus.

Protbines rkgulatrites

L’adhQence des cellules au substrat induit une signalisation qui passe par l’activation des protkines G de la famille Rho, liant le GTP 1461. Des protkines de la famille Rho liant le GTP ont kgalement et& caract&i&es chez E. kistolytica 143, 62, 631. Leur activite dans les voies de signalisa-


tion, et notamment dans la reorganisation du cytosquelette d’actine a ete suggeree. Rat A interviendrait dans la phagocytose [401 et Rat G est necessaire a la polarite de E. histolytica et a la regulation du cytosquelette pendant la formation de l’uro’ide. Lorsqu’une souche qui sur- exprime la forme active de RacG (RacG-Vall2) est induite pour la formation de l’uro’ide, une reorganisation massive du cytosquelette se produit, elle est refletee par la presence de concentrations discretes d’actine filamenteuse a la membrane plasmique. Ces amibes montrent la presence de deux ou trois urdides a la fois [43]. Ces resultats suggerent un role regulateur de la proteine RacG dans le capping et la formation de l’uro’ide. Parmi les cibles de l’activation de RacG, des kinases capables de phosphoryler et d’acti- ver des proteines du cytosquelette ont ete d&rites chez des cellules fibroblastiques [901. Des proteines kinases dependantes de l’activation par RacG et impliquees dans le capping restent encore a decrire chez E. histolytica.

Conclusion

Les reponses des amibes aux stimu- li du milieu environnant sont selec- tives et temporairement regu-lees car elles induisent une cascade d’evenements qui rend compte des differents stades de l’invasion de l’intestin. Cette regulation induit la polarisation des amibes, exprimee par l’apparition d’une morphologie asymetrique. Letablissement et le maintien de la polarite est a la base de la motilite et de l’expression du pouvoir pathogene amibien. Les resultats comment& ici montrent que le cytosquelette et son association avec les recepteurs de surface jouent un role determinant dans cette reponse et par consequent dans le processus invasif des amibes. Les avancees recentes dans la mise en evidence de recepteurs specifiques impliques dans les interactions amibe-cellule ou amibe- matrice ont ouvert des voies nou- velles pour l’etude de l’amibiase.

132

Ces recepteurs de surface, dont le fonctionnement reste a etablir, sont des cl& fonctionnelles de l’expression du pouvoir pathogene ; de ce fait, nous devons comprendre les mecanismes responsables de leur activation et de la mise en route des voies regulatrices qu’ils engendrent. Concernant l’etude du role de la lectine Gal-GalNAc dans l’induction d’une reponse cytolytique, plusieurs questions sont ainsi posees : comment, apres contact avec les cellules, ce recepteur induit-il la cascade de signaux qui aboutissent a la secretion des facteurs cytolytiques ? Par quels mecanismes le cytosquelette assure-t-i1 l’adherence aux cellules et a la matrice extracellulaire et joue-t-i1 un role dans la secretion amibienne ? Une reponse chimiotactique des amibes se produit lors de l’invasion de l’epithelium. 11 devient alors necessaire d’identifier les recepteurs impliques dans cette reponse et de determiner leur fonctionnement ainsi que leurs liens avec la reponse inflammatoire de l’hote. Ces recherches permettront de comprendre les mecanismes de defense que l’intestin met en route pour ten- ter de repondre a la pathogenicite amibienne. A plus long terme, des perspectives pharmacologiques pour le traitement de l’amibiase sont attendues par ces approches. En effet, les recepteurs sont des proteines qui ont un domaine expose a la surface de la cellule, qui peut done etre une cible potentielle pour des molecules pharmacologiques ayant une activite amebicide. Une perspective d’application de ces recherches sera d’identifier des molecules interagissant avec ces recepteurs et d’evaluer leurs quali- tes therapeutiques.

Remerciements Je tiens a remercier filisabeth Labruyere-Dadaglio et Paulo Ta- vares, pour leur remarques stimu- lantes durant la preparation de ce manuscrit. Heike Voigt et Raymond Hellio pour l’analyse de l’actine F en microscopic confocale, et Philippe

Sansonetti pour le soutien perma- nent a notre projet de recherche. Ce travail est finance par des credits du ministere de l’Education nationale, de I’Enseignement superieur, de la Recherche et par des credits du pro- gramme Nord-Sud Inserm (N” 4N0016). Le microscope confocal utilise dans ce travail est un don de Marcel et Liliane Pollack.

Rbfkrences [II

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Dynamique du cytosquelette durant l'invasion des tissus par Entamoeba histolytica