ÉTUDE DU POLYMORPHISME ASSOCIÉ AUX RÉPÉTITIONS EN TANDEM POUR LE TYPAGE

DE BACTÉRIES PATHOGÈNES:Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus

I. G. MUniversité Paris-Sud

Laboratoire Génomes, Polymorphisme et MinisatellitesInstitut de Génétique et Microbiologie, UMR 8621

Université Paris SudOrsay

Lucie Onteniente

Université EvryVal d’Essonne

I. Introduction

II. Pseudomonas aeruginosa

III. Staphylococcus aureus

IV. Conclusions et Perspectives

I. Introduction

II. Pseudomonas aeruginosa

III. Staphylococcus aureus

IV. Conclusions et Perspectives

Typage de souches de bactéries pathogènes

Pour des études épidémiologiques à l’échelle planétaire.

Dans de nombreux domaines, une surveillance épidémiologique est nécessaire:

ex: Mycobacterium tuberculosis

Une des causes majeures de mortalité:3 millions de morts par an.

1) Préoccupations de Santé Publique:

Typage de souches de bactéries pathogènes

P. aeruginosa et S. aureus sont responsables de 30% des infections nosocomiales en France.

Pour effectuer un suivi des infections nosocomiales.

ex: Staphylococcus aureus ex: Pseudomonas aeruginosa

1) Préoccupations de Santé Publique:

Typage de souches de bactéries pathogènes

Dans le cas d’attaques bioterroristes, pour identifier l’origine de la souche employée.

ex: Bacillus anthracis

2) Préoccupations de Défense:

Nécessité d’une surveillance épidémiologique

Dans toutes ces situations, un typage au niveaude la souche est essentiel.

Passe obligatoirement par l’utilisation de techniques de typage standardisées:

Il est nécessaire de pouvoir collecter et comparer les données de typage de souches entre laboratoires.

Facilité de mise en oeuvreReproductibilitéPouvoir discriminantCoût

Principales techniques de génotypage des bactéries

- MLST (MultiLocus Sequence Typing)- SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)

- MLVA (Multiple Locus VNTR Analysis)

- PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis) - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

et Ribotypage

- RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)- AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Ce sont les techniques basées sur l’étude du polymorphisme de l’ADN:

L’approche MLVA (Muliple Locus VNTR Analysis)

- En 2001, l’approche MLVA était validée pour deux espèces bactériennes très homogènes (d’émergence récente): B. anthracis (P.Keim) et M. tuberculosis (M.Frothingham, P.Supply).

Évaluation de l’approche MLVA pourle typage de Pseudomonas aeruginosa

et de Staphylococcus aureus.

- Les répétitions en tandem polymorphes peuvent constituer des marqueurs génétiques efficaces pour distinguer les souches.

Les répétitions en tandem

AACTTTACGTTC AAATTAACGTTC AAATTAACGTTC AAATTTACCTTG

Les répétitions en tandem sont présentes dans tous les génomes, eucaryotes comme procaryotes, dans les séquences codantes comme dans les régions non-codantes.

Les répétitions en tandem sont :

Il s’agit de successions d’un motif répété (ex: 4 x 12pb)

monomorphespolymorphes

Les répétitions en tandem chez les bactéries

- Les répétitions en tandem constituent une proportion variable des génomes bactériens,de 1 à 2% en général.

Polymorphismes des répétitions en tandem

Deux types de polymorphisme possibles:

Variation du nombre de motifs d’où le terme VNTR (Variable Number of Tandem Repeats).

Variation de séquence interne aux motifs: les motifs peuvent contenir des mutations.

Approche MLVA

Séquençage d’allèles

Illustration de l’approche MLVA

Exemple: 20 VNTRs développés chez Y. pestis(Le Flèche P, BMC Microbiol. 2001;1(1):2)

Variation de séquence interne aux motifs

Les motifs d’une répétition en tandem sontplus ou moins conservés.

Conservation parfaite des motifs:pas de polymorphisme interne

Peut être observée pour des motifs plus grands, par exemple dans la famille desMIRUs chez M. tuberculosis.

Concerne souvent les petits motifs(exemple: le locus ms10 chez P. aeruginosa).

Variation de séquence interne aux motifs

Conservation imparfaite des motifs:Par exemple la répétition Mu50_1132 (S. aureus).

Un outil d’identification des répétitions en tandem

On peut identifier les répétitions en tandem in silico : une base de données des répétitions en tandema été développée au laboratoire (F. Denoeud).

http://minisatellites.u-psud.fr/

Utilisation de la base de données de recherche de répétitions en tandem

Deux situations:

Un seul génome entièrement séquencé

Plusieurs génomes séquençés de même espèce bactérienne

P. aeruginosa (souche PAO1)

Démarche systématique (Polymorphisme testé expérimentalement)

Sélection in silico de répétitions polymorphes

S. aureus(6 génomes séquencés)

I. Introduction

II. Pseudomonas aeruginosa

III. Staphylococcus aureus

IV. Conclusions et Perspectives

Caractéristiques de Pseudomonas aeruginosa

Présente aussi dans l’environnement hospitalier humide (matériel de dialyse, robinets, éviers, siphons,

solutions désinfectantes…).

- Possède naturellement des résistances à des antibiotiques, problème des souches multi-résistantes.- Peut former des biofilms.

- Bactérie Gram négatif, ubiquitaire: Présente dans l’environnement (eau, sol, plantes…).

- 14% des infections nosocomiales en France- Première cause d’infection pulmonaire des patients atteints de mucoviscidose.

Pourquoi développer une analyse MLVA chez Pseudomonas aeruginosa?

- Manque de pouvoir discriminant du ribotypage, coût élevé.- Lourdeur de la technique du champ pulsé, problème de comparaison de résultats inter-laboratoires.

- Problème de souches non sérotypables.Limites des techniques de phénotypage:

Limites des techniques de génotypage:

Collection de souches P. aeruginosa

102 souches cliniques provenant de cette étude ont été sélectionnées pour évaluer l’approche MLVA.54 ribogroupes représentés dont 2 majoritaires:

87-S-3 : 27 souches (sérotype O12)88-S-2 : 18 souches (sérotype O11)

Évaluation de la diversité génétique par ribotypage, des souches de P. aeruginosa collectées dans des

hôpitaux européens. (Brisse S, J Clin Microbiol. 2000 Oct;38(10):3636-45)

Nécessité de combiner l’analyse par ribotypage à d’autres techniques plus discriminantes.

Peut-on améliorer par analyse MLVA, la résolution des souches des deux ribogroupes majoritaires?

P. aeruginosa : un seul génome disponible

- Le génome de P. aeruginosa est très richeen répétitions en tandem (>3000).

- Choix des répétitions en tandemselon des critères peu « stringents »:

201 répétitions en tandem à tester.Choix d’une sous-collection de 12 souches.

Taille du motif >9pb:pour des raisons d’instabilité des répétitions à petits motifs, secondairement pour des raisons techniques.

Nombre de motifs >7.

Bilan du génotypage: arbre MLVA

- Sur 201 répétitions en tandem testées par PCR:

8 polymorphes:- 2 répétitions à petits motifs, très polymorphes.- 5 répétitions moyennement polymorphes.- 1 répétition éliminée de l’analyse MLVA finale: ms194 (petit motif/grands allèles).

170 monomorphes23 abandonnées

- Sur 102 souches analysées:13 souches éliminées de l’étude.89 souches + PAO1 (46 ribogroupes)réparties en 72 génotypes MLVA.

7 répétitions en tandem pour l’analyse MLVA

nombre d'allèles 16 10 7 2 7 8 10

Indice de polymorphisme 0,91 0,87 0,61 0,45 0,68 0,75 0,82

Approche MLVA: basée sur le polymorphisme de longueur

Soucheinconnue

génotypage

Identification de la souche la plus

proche

ABCDEFGH IJK

Matrice des distances

Reconstruction d’un arbre

Génotypes

Représentation des données sous forme d’arbres

Représentation des données sous forme d’arbresArbre « minimum spanning tree » MLVA (5 locus), 40 génotypes:

111111111

111111111

111111111

111111111

111111111111111111

111111111

111111111

111111111

111111111

222222222

111111111111111111

222222222111111111 111111111

222222222

222222222

222222222

222222222 222222222222222222

222222222222222222

222222222

222222222222222222

222222222 111111111 222222222 222222222 111111111

222222222

222222222

222222222

222222222

222222222

222222222

333333333

11

16

14

8

9

6

18

2326

2722

17

15

10

12

13

2429 30

19

7

31

1

28

34 334

20

32

2

2135

39

5

36

40 25

38

3

37

27

Ribogroupe 87-S-3Ribogroupe 88-S-2

111111111

111111111111111111111111111

111111111111111111

111111111

111111111

111111111

111111111

111111111

222222222222222222

222222222222222222

222222222

222222222

111111111

222222222

222222222

222222222

333333333 333333333

222222222222222222

333333333

333333333

333333333

333333333333333333333333333

333333333 333333333111111111

222222222 111111111 111111111111111111

111111111

111111111

111111111111111111

111111111222222222

111111111

222222222

222222222

333333333

222222222

333333333

222222222333333333

333333333

222222222333333333

333333333

222222222

333333333

333333333

333333333

333333333

444444444444444444

333333333

444444444

222222222

444444444

222222222

444444444

444444444

444444444

16

16

1616

16

16

2626

26

26

26

26

26

2616

1616

16

15

26

22

27 26

26

27

22

16

3431

22

14

1728

27

8

12

9

13

20

24

32

2

17

29

21

30

35

27

11

31

19

33

10

33

14

6

3916

5

10

3628

7

40

18

25

1

23

38

3

37

Arbre « minimum spanning tree » MLVA (7 locus), 72 génotypes:

Ribogroupe 87-S-3Ribogroupe 88-S-2

Bilan du génotypage: arbre MLVA

1) Comparaison résolution MLVA/ribotypage:meilleure résolution du MLVA pour les souches

des deux ribogroupes majoritaires.

Données MLVA en accord avec:

- 27 souches 87-S-3: 14 génotypes MLVA - 18 souches 88-S-2: 15 génotypes MLVA

L’hypothèse d’une origine clonale pour le sérotype O12.La plus grande diversité génotypique observée pour le sérotype O11.2) Comparaison résolution MLVA/PFGE: équivalente pour les deux techniques testées sur 17 souches 87-S-3 testées (7 génotypes).

Conclusions de l’étude MLVA P. aeruginosa

Ex: ms127 (2 allèles) semble un bon marqueur épidémiologique: distingue les 2 ribogroupes majoritaires.

1) Développement d’un premier jeu de 5 marqueurs:

ms10 et ms61 très polymorphes.2) Développement de 2 marqueurs à petits motifs de 6pb:

D’autres marqueurs de ce type pourraient également être développés pour constituer un jeu de marqueurs dédié à l’étude de situations épidémiques.

Ce jeu de marqueurs peut être élargi à d’autres nouveaux marqueurs.

Génotypes ms77

111111111

111111111111111111111111111

111111111111111111

111111111

111111111

111111111

111111111

111111111

222222222222222222

222222222222222222

222222222

222222222

111111111

222222222

222222222

222222222

333333333 333333333

222222222222222222

333333333

333333333

333333333

333333333333333333333333333

333333333 333333333111111111

222222222 111111111 111111111111111111

111111111

111111111

111111111111111111

111111111222222222

111111111

222222222

222222222

333333333

222222222

333333333

222222222333333333

333333333

222222222333333333

333333333

222222222

333333333

333333333

333333333

333333333

444444444444444444

333333333

444444444

222222222

444444444

222222222

444444444

444444444

444444444

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

33

3

3

3

3

3

32.5

2.5

2.5

2.5

2.5

3

2.5

3 3

3

3

2.5

2.5

32

2.5

22.5

2.53

3

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

4

1.5

2.5

5

2.5

5

6

3

2.5

2

2.5

3

2.5

3

2.5

2.5

52.5

2.5

2.5

43

2.5

3

2.5

2

2

2.5

5

2.5

4

Séquençage du locus ms77

14 motifs différents:

motif particulier expliquant les

tailles intermédiaires (1,5U et 2,5U)

Connaître l’agencement des allèles va permettre de se faire une opinion sur la pertinence de la proximité dans l’arbre d’allèles de tailles très différentes.

Pour faciliter la comparaison de l’agencementdes allèles, un codage des motifs est réalisé.

Résultats du séquençage du locus ms77

Les 7 allèles selon l’analyse MLVA se distinguent en 15 allèles séquencés, l’égalité de taille observée est une

coïncidence (homoplasie).

EFL

EFL

ALM ALM(3U)

EFL(2.5U)

CM(2U)AF(2U)

EIM(2.5U)

AFGM(4U)

EK(1.5U)

ALGMN(5U)

BLFGN(5U)

AFFFGM(6U)

CM(2U) AHM(3U)

AHM(3U)

EFL

AFGMN(5U)

ALF(3U)

DL(2U)

AF(2U)ALKKL(5U)

AFGJ(4U)

Résultats du séquençage du locus ms77

• Le motif E est propre à une zone de l’arbre. EF ->D (expliquant EFL-> DL):E: GCCCATCCTGGAGTGGTCCATGCC---------------F: GGCCATCTTGGAGTGGTCCATGCCGTTCATGTCCATGCC

D: GCCCATCCTGGAGTGGTCCATGCCGTTCATGTCCATGCC

Délétion d’un demi motif

A: GCCCATCCTGGAATGGTCCATGCCGTTCATGTCCATGCCF: GGCCATCTTGGAGTGGTCCATGCCGTTCATGTCCATGCCG: GGCCATCTTGGAGTGGTCCATGCCGCTCATGTCCATGCC

C: GCCCATCCTGGAATGGTCCATGCCGCTCATGTCCATGCC

Délétion de 2 motifs

• AFG->C (expliquant AFGM -> CM):

Conclusions de l’étude de séquençage de P. aeruginosa

Marqueur reflétant des phénomènes d’homoplasie: ms77 résolution d’analyse des souches supérieure lorsque ce locus est séquencé.

Le marqueur ms77 est globalement cohérent. Les quelques anomalies de distribution des allèles sont résolues par un degré supplémentaire d’analyse.

Développement possible du séquençage de ms142, allèles dispersés (conservation 66%), pour augmenter la résolution du typage en complément du séquençage de ms77.

I. Introduction

II. Pseudomonas aeruginosa

III. Staphylococcus aureus

IV. Conclusions et Perspectives

Caractéristiques de Staphylococcus aureus

- Responsable d’infections nosocomiales(15% des infections en France).-Problème de multi-résistance des souches hospitalières (MRSA et GISA).- Émergence de souches MRSA acquises dans la communauté.

- Bactérie Gram positif, présente dans:- la flore cutanée normale (15-30% de la population)- flore des mains- fosses nasales- flore normale de l’intestin

Collections de souches S. aureus

Ces souches sont de différentes origines géographiques, années de prélèvement, profils de résistances aux antibiotiques et profils PFGE.

Problème de comparaison entre les profils PFGE des différentes études, le MLVA pourrait permettre de faire le lien entre ces études.

- 107 souches du Centre National de Référence des Staphyloccoques à l’Institut Pasteur (N. El Sohl).- 30 souches du HIA Val de Grâce (JL. Koeck).

Souches MSSA.Souches MRSA.Souches GISA.

n° ADN n° souche génotype PFGE Année Hôpital - Ville MRSA,

MSSA, GISA1 BM12846 1 1999 Broussais- Paris MSSA2 BM12451 2 1997 Grenoble MSSA3 BM 10675 29 1993 Broussais- Paris MRSA4 2001042 30a 1999 Toulouse MSSA5 BM 9520 30b 1988 Broussais- Paris MSSA6 99135 31 1999 St Louis-Paris MSSA7 BM 12828 16a 1999 Broussais- Paris MRSA8 BM 12830 16b 1999 Broussais- Paris MRSA9 BM 12174 17b 1996 Grenoble MRSA

10 BM 3364 13 1981 Broussais- Paris MRSA11 BM 10215 18 1990 Broussais- Paris MSSA12 BM 12942 19 1999 Broussais- Paris MRSA13 97233 24h 1997 Broussais- Paris MRSA14 2001045 24a 1998 Toulouse MRSA15 93184 26 1993 Laennec- Paris MRSA16 BM 12286 36a 1996 Beaujon-Clichy MRSA17 BM 12287 36a 1996 Beaujon-Clichy MRSA18 IPF 556 I -1 1999 Broussais - Paris GISA19 IPF 555 I -1 1999 Broussais - Paris GISA20 IPF 557 I -1 1999 Broussais - Paris GISA21 IPF 562 I -1 1999 Broussais - Paris GISA22 BM 10828 I -1 1993 Bordeaux GISA24 BM12612 I - 1 1998 Villiers St Denis GISA26 Harmony 26 I - 1 1989 Espagne GISA23 HM10 XXIV 2000 Henri Mondor-Créteil GISA28 Harmony 9 I - 5 1990 Finlande GISA29 BM 10829 I - 5 1993 Bordeaux GISA30 HM 9 XX 2000 Henri Mondor-Créteil GISA31 97130 I - 18 1997 Toulouse GISA32 96145 I - 17 1996 Blois GISA33 BM 12632 40e 1998 Hôpital pédiatrique Tunisie MSSA34 BM 12634 36a 1998 Hôpital pédiatrique Tunisie MSSA35 BM12975 45c 1999 Hôpital pédiatrique Tunisie MSSA36 IPF160 38c 2000 Hôpital pédiatrique Tunisie MSSA37 IPF489 42a 2001 Hôpital pédiatrique Tunisie MSSA38 IPF518 22a 2001 Hôpital pédiatrique Tunisie MSSA39 IPF 509 57 2001 Hôpital pédiatrique Tunisie MSSA40 IPF 510 37a 2001 Hôpital pédiatrique Tunisie MSSA41 IPF 511 3 2001 Hôpital pédiatrique Tunisie MSSA42 IPF 512 48a 2001 Hôpital pédiatrique Tunisie MSSA43 IPF641 B 2000 Centre Hospitalier Nimes MRSA44 IPF642 A1 2000 Centre Hospitalier Nimes MRSA45 IPF643 C 2000 Centre Hospitalier Nimes MRSA46 IPF644 A2 2000 Centre Hospitalier Nimes MRSA47 IPF735 * juin-01 Centre Hospitalier Calais MSSA48 IPF736 * juin-01 Centre Hospitalier Calais MSSA49 IPF738 * juin-01 Centre Hospitalier Calais MSSA50 IPF741 * juin-01 Centre Hospitalier Calais MSSA51 IPF743 * juin-01 Centre Hospitalier Calais MSSA

52 IPF646 $ Fev.2000 Centre Hospitalier Abbeville MRSA53 IPF647 #$ Janv.2000 Centre Hospitalier Abbeville MRSA54 IPF648 $ Janv.2000 Centre Hospitalier Abbeville MRSA55 IPF654 ^ Juil.1999 Fécamp (clinique privée) MRSA56 IPF657 ^ Dec.1999 Fécamp (clinique privée) MRSA57 IPF659 ^ Janv.2000 Fécamp (clinique privée) MRSA58 IPF658 #^ Fev.2000 Fécamp (clinique privée) MRSA59 IPF667 ##^ Mar.2000 Fécamp (clinique privée) MRSA60 IPF308 ~ mai-01 CH Intercommunal Créteil MSSA61 IPF309 ~ juin-01 CH Intercommunal Créteil MSSA62 IPF310 ~ mai-01 CH Intercommunal Créteil MSSA63 IPF311 ~ Juil.2001 CH Intercommunal Créteil MSSA64 IPF323 ~ Oct.2001 CH Intercommunal Créteil MSSA65 IPF92 & Juil.2000 Rotschild- Paris MRSA66 IPF54 & Aout2000 Rotschild- Paris MRSA67 IPF55 & Sept.2000 Rotschild- Paris MRSA68 IPF56 & Sept.2000 Rotschild- Paris MRSA69 IPF57 & 2000 Rotschild- Paris MRSA70 IPF66 & Sept.2000 Rotschild- Paris MRSA71 IPF65 #& Aout2000 Rotschild- Paris MRSA72 166 Ia 1995 Beaujon - CLICHY MRSA73 165 Ia 1995 Beaujon - CLICHY MRSA74 97386 Ib 1996 Broussais - PARIS MRSA75 97381 VIIb 1996 Broussais - PARIS MRSA76 97383 VIIa 1996 Broussais - PARIS MRSA77 97379 VIIa 1996 Broussais - PARIS MRSA78 97117 VIId 1997 TOULOUSE MRSA79 95035 VIId 1995 CH - NIMES MRSA81 96164 VIId 1996 CH BLOIS MRSA80 162 VIId 1995 Beaujon - CLICHY MRSA82 920 VIb 1995 St Germain MRSA84 12072 VIb 1995 Hop. L. Mourrier- MRSA85 12068 VIb 1995 CH - EVRY MRSA83 1625 VIb 1995 Beaujon - CLICHY MRSA86 97120 VIb 1997 TOULOUSE MRSA87 97373 XVIII 1996 Broussais - PARIS MRSA88 BM9290 A 1987 Hôtel Dieu - PARIS MRSA89 BM9586 A Jan.1987 Broussais - PARIS MRSA90 BM12184 A Avr.1997 Broussais - PARIS MRSA91 BM9591 A Juil.1987 Broussais - PARIS MRSA92 BM12188 A Dec.1987 Broussais - PARIS MRSA93 BM10761 A 4 mai-93 TOULOUSE MRSA94 BM10759 A 4 mai-93 TOULOUSE MRSA96 BM9343 A 7 1987 TOULOUSE MRSA97 BM10872 A 8 Dec.1992 Aalst - BELGIQUE MRSA98 BM10888 A 8 Aout 1993 Aalst - BELGIQUE MRSA100 BM10914 A 9 Ma1991 Broussais - PARIS MRSA101 BM10896 A 9 Dec.1994 Ghent -BELGIQUE MRSA102 BM10138 A 10 Oct.1989 Barcelone - ESPAGNE MRSA

Stratégie de comparaison de génomes S. aureusSouches

séquencées N315 Mu50 MW2 NCTC8325 MRSA252 MSSA476

Taille du génome 

2.8Mb 2.9Mb 2.8Mb 2.9Mb 2.9Mb 2.8Mb

Résistance vis à vis de la

méthicilline 

MRSA (SCCmec

type II)

MRSA (SCCmec type II) +

VRSA

MRSA (SCCmec type

IVa)

MSSA MRSA MSSA

Caractéristiques  souche hospitalière

souche hospitalière

souche hyper- virulente

acquise dans la

communauté

vieille souche de laboratoire

souche hospitalière épidémique

souche hyper-virulente

acquise dans la

communauté

5

Distribution du nombres d'allèles parmi les 6 génomes S. aureus pour les 122 répétitions en

tandem

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

70,00%

1 2 3 4

Nombre d'allèles dans les 6 génomes

2 3 4 5

Bilan du génotypage, arbre MLVA S. aureus

Sur 122 répétitions en tandem polymorphes, 33 ont été choisies pour typer 137 souches:

14 répétitions sélectionnées pour l’analyse MLVA, sur des critères de faisabilité technique et d’analyse.

Les 137 souches se distinguent en68 génotypes MLVA.

- Le polymorphisme observé parmi les 6 génomes.- La taille du motif.- Choix d’amorces s’hybridant dans les 6 génomes.+ choix de quelques répétitions déjà connueschez S. aureus (spa, coa, sdr…).

Bilan du génotypage, arbre MLVA S. aureus

I – 1 (GISA), VilliersXX (GISA), CréteilA (MRSA), Paris

Créteil

Broussais

Toulouse

111111111

111111111111111111111111111

111111111111111111

111111111

111111111

222222222

111111111111111111 111111111

111111111 111111111111111111

222222222

111111111111111111

333333333

888888888

222222222

888888888 888888888 111111111222222222

222222222

888888888

111111111 777777777

888888888 333333333 888888888

999999999

101010101010101010

VIb

I -1I -1

VIIb

I - 5

$VIIa

VIb

VIb

*

^

~

I -1

I -1

I -1

I - 17

37a

~

#&

VIId

XXIV

40e

36a

45c

38c

42a

22a

:57

:348a

#^

~

I – 1 (GISA), BordeauxI – 5 (GISA), FinlandeI –12 (GISA), ToulouseA (MRSA), Paris

Tunisie

Fécamp

Calais

Créteil

Tunisie

Tunisie

Tunisie

Tunisie

Créteil

Espagne

Broussais

BloisBroussais

Rotschild

Fécamp Clichy

Clichy

Abbeville

B, A1, C, A2 Nimes$, #$ Abbeville##^ Fécamp& RotschildVIIa Broussais VIId ToulouseVIId NimesVIId Blois

GISAMRSAMSSA

Conclusions de l’étude MLVA S. aureus

Validation de 14 VNTRs pour l’analyse MLVA:- 2 déjà étudiés (spa et coa).- 12 nouveaux.

Difficile de se prononcer sur la résolution du MLVA par rapport au PFGE: absence de comparaison de la reproductibilité des deux techniques sur une grande collection de souches.

Faut-il développer d’autres marqueurs? Il faudrait étendre l’analyse MLVA 14 locusà d’autres collections de souches.

Séquençage spa et Mu50_1132

Séquençage du locus spa, déjà connu pour son intérêt pour des études épidémiologiquesde S. aureus (Shopsin B, Clin Microbiol. 1999 Nov;37(11):3556-63)

Séquençage d’un nouveau locus : Mu50_1132- un des plus polymorphes parmi les 14 sélectionnés- répartition des tailles d’allèles dans plusieurs branches.

Objectifs:Faire le lien avec les données existantes dans la littérature pour le typage de souches MRSA.Comparer la résolution de l’analyse MLVA avec celle du séquençage de deux locus.

Séquençage spa et Mu50_1132

- Combinaison spa/Mu50_1132: 27 génotypes.- Données MLVA: en 28 génotypes.

BAMH2GJAABB

BMDUKGJBHI

WGKAKAOMQQQ

HIWGAKBMQ

bXKAKBBEMEKB

bA2AKEEMBKB

dA2AKEEMBKB

dXKB

JRMQSDZGGM

BOPQKUJGFMB

BAALMMNNNYC2FMBQBLOO

BACDEFTJMBMDMGMK

BGUJFKBPE

BGUKJFKBPE

BUJJFKBPE

UREKKMMNUJGBBBGGJ

fREKKMMN UJGBBBGGJV WWW

H2M2EGMMJK2M

JYHGFO

JKYHGGFMBQBLO

JK YHFGFMBQBLO (ibérique)

JK YFGFMBQBLO

codage Mu50_1132codage spa

JYHGFMBQBLO

eYHGFMBQBLO

34 souches séquencées:

Mu50

N315

NCTC8325

b ou dXKAKBMB

dA2AKBEMBKB

MW2MSSA

MRSA

Conclusions de l’étude de séquençage de S. aureus

Séquençage des locus spa et Mu50_1132:combinaison de locus pourrait constituer un autre schéma possible de typage de S. aureus.

Ces deux locus semblent présenter un déséquilibre de liaison.

Séquençage à tester sur le reste de la collectionde souches.

I. Introduction

II. Pseudomonas aeruginosa

III. Staphylococcus aureus

IV. Conclusions et Perspectives

Recherche de répétitions en tandem polymorphes

- projet très prometteur initialement.- finalement très peu de répétitions polymorphes.

P. aeruginosa (riche en répétitions):

- Actuellement pas de critères prédictifs du polymorphisme des répétitions en tandem dans les génomes bactériens.Sujet à explorer pour faciliter le développement de marqueurs polymorphes lorsqu’un seul génome est disponible.

Recherche de répétitions en tandem polymorphes

S. aureus:

- bénéfice évident de la comparaison de génomes pour identifier les répétitions polymorphes.- très dépendant du choix des génomes comparés.

génomes comparés:

% homologie entre les flanquantes:

nombres de répétitions en tandem polymorphes:

Mu50/N315 99.95% 11

Mu50/MW2 98.68% 58

Mu50/NCTC8325 98.75% 57

Mu50/MRSA252 98.68% 63

Mu50/MSSA476 98.71% 54

Les 6 génomes122 polymorphes dans au

moins 2 des 6 génomes

- Un certain nombre d’espèces pathogènes dont plusieurs génomes ont été entièrement séquencés, pourraient être étudiées selon cette démarche de comparaison.

Comparaison des différentes techniques de génotypage

méthode de typage

"typabilité" reproductibilitépouvoir

discriminant

facilité de mise en œuvre

facilité d'interprétation

accessibilité de la

méthodecoût

PFGE excellente bonne excellent bonne bonne variable élevé

RAPD / AP-PCR

excellente faible faible bonne faible bonne moyen

AFLP excellente bonne excellent bonne passable faible élevé

RFLP excellente variable variable bonne passable variable moyen

Ribotypage automatisé

excellente excellente bon bonne bonne variable élevé

MLST (séquençage)

optimale excellente excellent bonne excellente faible élevé

SNPs (séquençage)

Excellente excellente faible bonne excellente faible élevé

GENOTYPAGE

- Il n’y a pas de technique « idéale » répondant à l’ensemble des critères de choix d’une technique de typage.

Le choix d’une technique dépend avant tout de la question épidémiologique posée!

MLVA excellente excellente excellent excellente excellente bonne FaibleMLVA

Conclusions de cette première phase de développement du MLVA

Cette technique, dans sa forme utilisée au laboratoire, est une bonne façon de développer des marqueurs.

Elle est accessible à tous les laboratoires même modestement équipés:important pour le suivi épidémiologique dans des pays touchés fortement par des maladies infectieuses.

Perspectives du MLVA

Nécessité de:- Développer des essais de typage multicentriques.- Tester les outils accessibles en ligne permettant les comparaisons de données MLVA entre laboratoires.

Une fois la phase de développement de marqueurs achevée, la technique doit évoluer vers une automatisation:

- PCR multiplexe- Séparation sur séquenceur capillaire (gain de

temps et de dimension du projet).

Conclusion analyses de séquences

Il est possible de compléter les données de typage MLVA par du séquençage d’allèles.

Le séquençage de quelques locus pourrait permettre d’atteindre une résolution de typage équivalenteà celle d’une analyse MLVA (à confirmer sur un plus grand nombre de souches).

Le codage d’allèles pourrait constituer un outil d’étude des répétitions pour essayer de comprendre l’évolution de ces séquences chez les bactéries.

I. G. M

Université Paris-Sud

Laboratoire Génomes, Polymorphisme et MinisatellitesInstitut de Génétique et Microbiologie, UMR 8621

Université Paris SudOrsay

Lucie Onteniente

Université EvryVal d’Essonne

ÉTUDE DU POLYMORPHISME ASSOCIÉ AUX RÉPÉTITIONS EN TANDEM POUR LE TYPAGE

DE BACTÉRIES PATHOGÈNES:Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus

Séquençage spa

57 souches réparties en 45 génotypes MLVA et 26 codages spa différents.

Séquençage Mu50_1132

42 souches réparties en 32 génotypes MLVA et 20 codages 1132 différents.