TABLE DES MATIERESbchgene.c.b.f.unblog.fr/files/2014/08/cm-microbio-gle.pdf · probiotique = protège contre bact patho) vibrion spirille extrémités effilées en fuseau (Fusobacrerium

Microbiologie : bactériologie 2013/2014

Prof. COULIBALY Adama 1

TABLE DES MATIERES

Chapitre 1. MORPHOLOGIE ET ULTRASTRUCTURE DES BACTERIES

I- MORPHOLOGIE DES BACTERIES1- La forme2- La taille3- Les associations

I- LES CONSTITUANTS DE LA CELLULE BACTERIENNE1- Schéma général simplifié d’une bactérie2- Eléments constants et inconstants de la structure bactérienne

II- LES ELEMENTS CONSTANTS DE LA CELLULE BACTERIENNE1- La paroi bactérienne

1. Méthodes d’étude2. Aspect en microscopie électronique3. Structure chimique de la paroi4. Les rôles de la paroi5. Quelques parois bactériennes particulières

2- Le cytoplasme3- L’appareil nucléaire

a) Techniques d’étudeb) Structure du chromosome bactérienc) Rôles du chromosome bactérien

4- La membrane cytoplasmiquea) Techniques d’étudeb) Structure et composition chimiquec) Rôles de la membrane cytoplasmique

III- Les éléments facultatifs de la cellule bactérienne1- La capsule

a) Mise en évidenceb) Morphologie et structure chimiquec) Rôles et propriétés

2- Les flagellesa) Mise en évidenceb) Morphologie et mode d’insertionc) Architecture moléculaired) Synthèse du flagellee) Fonctionnement du flagellef) Rôle des flagelles

3- Les pili ou fimbriae4- Les plasmides5- Les spores



CHAPITRE 2 : NUTRITION ET CROISSANCE DES BACTÉRIES

I- NUTRITION1 - Besoins élémentaires1-1 Couverture des besoins élémentaires non carbonés1-2 La source de carbone1-3 Sources d’énergie1-4 Sources d’Hydrogène et/ou d’électrons2 - Besoins spécifiques : facteurs de croissance

II- CROISSANCE1- Généralités1-1 la température1-2 le pH1-3 la pression osmotique et l’activité de l’eau1.4 La concentration en oxygène2- Mesure de la croissance2-1 la mesure du nombre de bactéries2.1.1 Par dénombrement direct2.2 - La mesure de la masse2.3- La mesure de l'activité2.4- Courbe de croissance3- Croissance sur milieu renouvelé : croissance continue4- Rendements la croissance et les effets d’un élément nutritif limitant



CHAPITRE 1 : MORPHOLOGIE ET ULTRASTRUCTURE DES BACTERIES

I- MORPHOLOGIE DES BACTERIES (Document 1) Formes des cellules bactériennes : les bactéries sont des organismes unicellulaires de formesvariées :- bactéries de forme arrondies ou cocci, isolées, en chaînette, en amas (nombre variable decellules) : Staphylocoques, Streptocoques …- bactéries de forme allongée ou bacilles isolés, en chaînette ou amas, de longueur et diamètrevariables : E.coli, Salmonella, Bacillus etc…- bactéries de forme spiralée spirilles, spirochètes comme Treponema- un groupe particulier de bactéries de forme filamenteuse se rapprochant des moisissures : lesActinomycètes

Taille : les bactéries les plus petites ont une taille d’environ 0,2 µm (Chlamydia) et les pluslongues certains Spirochètes peuvent atteindre 250µm de long. En moyenne la taille se situeentre 1 et 10 µm

Associations cellulaires : une espèce bactérienne peut apparaître sous forme de cellulesisolées séparées ou en groupements caractéristiques variables selon les espèces : association parpaires, en amas réguliers, en chaînette, par quatre (tétrades) etc… Cependant il faut savoir queles groupements ne sont caractéristiques qu’au sortir de l’habitat naturel de la bactérie;exemples :- Les Staphylocoques isolés d’un pus présentent des groupements caractéristiques en « grappede raisin »- Les Streptocoques isolés d’un lait forment des chaînettes

Ensuite lorsque ces bactéries sont cultivées sur milieux synthétiques les groupementscaractéristiques sont généralement perdus.

Dans la nature certaines bactéries vivent en groupes de cellules peu différenciées :

Cyanobactéries qui forment des trichomes



Les coques

Forme Mode de groupement Exemples

Formesphérique(0.5 à 2 µm)

Isolés mais le plus souventDiplocoques en grain de café

Genre Neisseria (N. meningitidis : méningitecérébrospinale)

ChaînetteGenre Streptococcus (S. pyogenes : lésionscutanées, otites, conjonctivites ; S.pneuminiae : pneumonies, otites, sinusites)

Amas réguliers, grappe deraisin

Genre Staphylococcus

tétrades Genre Sarcina (flore intestinale),Genre Deinococcus (non pathogène)

forme ovale réniformeMéningococcus Gonococcus Entérococcus{Eléments

déformés

coccus diplococcus streptococcus (Streptococcus pneumoniae) (Streptococcus pyogenes)

tétrade staphylococcus

{Eléments

réguliers

(Pediococcus cerevisiae) (Staphylococcus aureus)



Les bacilles

Forme Mode de groupement ExemplesDroits0 à 6 µm de long0.5 à 2 µm de largeextrémités plates,arrondies oucarrées

Isolés le plus souvent, enpaires (diplobacilles), enchaînes

Famille des entérobactéries (commensalesintestins), Genre Bacillus (sol, eaux, plantes ;pathogènes = anthracis (charbon), cereus etsubtilis (intox alim))

Incurvés Genre Vibrio (V. Cholerae : choléra)Autres formes :Extrémités renfléesExtrémitésfuseléesExtrémités enforme de crosse

Palissades ou lettresGenre Corynebacterium (diphtheriae)Genre Fusobacterium(infections

bronchopulmonaires)Genre Bifidobacterium (flore intestinale :probiotique = protège contre bact patho)

vibrion spirilleextrémités effilées en fuseau(Fusobacrerium nucleatum de l'angine)

en losange(Bacille de Hoffmann)

extrémités effilées en fuseau(Fusobacrerium nucleatum de l'angine)

en losange(Bacille de Hoffmann)

extrémités arrondies(Entérobactéries)

une extrémité renflée(Corynébactérie : B. de la diphtérie)

extrémités rectangulaires(Bacille du charbon)



vibrion spirille

Les bactéries spiralées

Forme Mode degroupement

Exemples

Distinction sur lenombre et l’amplitudedes spiralesTaille 5 à 500 µm

Isolés Les spirochètes :Treponema pallidum(syphilis)

Autres formes de bactéries

Forme ExemplesBactéries pédonculées Genre Caulobacter (non patho)Bactéries filamenteuses Genres Actinomyces (svt associé à des inflammations sans être

patho)Genre Streptomyces (tellurique = sol)

Formes mycéliennes très ramifiées chez les Actinomycètes.

I- LES CONSTITUANTS DE LA CELLULE BACTERIENNE

II-1- Schéma général simplifié d’une bactérie



II-2- Eléments constants et inconstants de la structure bactérienneCertaines structure sont présentes chez toutes les bactéries, ce sont les éléments « constants » ;d’autres sont retrouvés seulement chez certaines bactéries : ce sont les éléments « inconstants »ou « facultatifs ».

II- LES ELEMENTS CONSTANTS DE LA CELLULE BACTERIENNE

III-1- La paroi bactérienne

a) Méthodes d’étude- expériences de plasmolyse (cellule plongée dans un milieu hypertonique, la paroi se

« décolle »)- broyage des bactéries et lyse par ultrasons- congélation / décongélation

On sépare ensuite les différents constituants par centrifugation, lavages.On passe ensuite à l’étude en microscopie électronique ou à l’étude chimique.

b) Aspect en microscopie électronique

On distingue 2 types de parois au microscope électronique : les Gram (+) et les Gram (-).

Gram + Gram –

Espace périplasmique



Membrane plasmique 7.5 nm

Membrane externe 7 à 8nm

PeptidoglycaneDe 20 à 80 nm(80 à 90% de la paroi)

Membrane plasmique 7.5 nm

PeptidoglycaneDe 2 nm (10 % de la paroi)




c) Structure chimique de la paroi

C1) Principaux constituants chimiques présents dans la paroi des bactéries Gram positif etGram négatif :

Paroi des bactéries Gram (+) Paroi des bactéries Gram (-)Osamines : N-acétyl glucosamine (NAG) et Acide N-acétyl muramique (ANAM)Acides teïchoiques et lipoteïchoiques(polymères de polyribitol phosphate oupolyglycérol phosphate)

Pas d’acides teïchoiques nilipoteïchoiques

Acides aminés dont 4 majeurs : Ala (D et L)D-Glu, L-Lys, acide diaminopomélique (DAP)

Mêmes acides aminés(moins de L-Lys et de DAP)

Peu de lipides (1 à 2 %) Lipides en grande quantité (10 à 20 %dans la membrane externe)

2.12 - Structure moléculaire de la paroiLe peptidoglycane est un énorme polymère composé de plusieurs sous-unités liées entre

elles. L’ossature de ce polymère est constituée de l’alternance de résidus N-acétylglucosamine etde résidus d’acide N-acétylmuramique. Un tétrapeptide constitué de deux Alanines, un acideglutamique et une lysine est lié au groupe carboxyle de l’acide N-acétylmuramique.

La strucutre de base du mucopeptide de la paroi peut donc être schématisé comme suitN-acetylgucosamine - Acide N-acetylmuramique

│L-Ala

│D-Glu

│L-Lysine

│D-Ala

D’autres bactéries possèdent un autre acide diaminé, l’acide méso-diaminopimélique à laplace de la lysine en position 3.

Les chaines de peptidoglycane sont reliées entre elles par des liaisons interpeptidiques :L'acide N-acetyl-muramique apparaît donc comme le ciment du peptidoglycane, un

polymère organisé en réseau comme on peut le voir sur le schéma suivant :



Cette structure en réseau donne une rigidité à la cellule. Le peptidoglycane est donc caractérisépar:

- des liaisons glycosidiques (14) entre N.A.G. et A.N.A.M.- l'ordre invariable des acides aminés qui se succèdent dans le chaînon tétrapeptidique- une liaison -glycosidique qui unirait l'acide téichoïque au résidu N.A.G. chez les G+

- le pontage*soit direct entre la D-alanine d’un tétrapeptide et l’acide diaminopimélique d’un autretétrapeptide,*soit par l’intermédiaire d’un pentapeptide de glycine entre la D-Ala d'un tétrapeptide et la L-Lys d'un autre tétrapeptide.

D-Ala

DAP

D-Glu

L-Ala

—NAM—NAG—

—NAM—NAG—

L-Ala

D-Glu

DAP

D-Ala

L-Ala

D-Gln

L-Lys

D-Ala

—NAM—NAG—

D-Ala

L-Lys

D-Gln

L-Ala

—NAM—NAG—

GlyGly

GlyGlyGly

(a) (b)Les pontages du peptidoglycane.

(a) : Peptidoglycane de E coli(b) : Peptidoglycane de S. aureus



C3) La coloration de Gram : Les différences de constitution et de structure chimique des paroisGram (+) et Gram (-) permettent d’établir le principe de la coloration élaborée par ChristianGRAM (1884) :

Bactérie Gram positif étapes Bactérie Gram négatif1- coloration par le violetde gentiane du cytoplasmedes cellules

2- fixation du violet par lelugol (réactif iodo-ioduré) =formation de complexesviolet-lugol

3- Décoloration parl’alcool (solubilise leslipides de la mbr ext desgram(-) et décolore le cplxeviolet-lugol ; pas d’effet surles gram(+) car ne pénètrepas dans leur cytoplasme)4- Coloration par lafuschine (ou safranine) quirecolore le cytoplasme desgram(-) en rose

g) Les rôles de la paroiAfin d’étudier les rôles de la paroi, on utilise un enzyme lytique, le lysozyme.Le lysozyme clive les liaisons 1-4 glycosidiques entre le NAG et le ANAM. Il en résulteune destruction totale du peptidoglycane chez les bactéries Gram(+), et une fragmentationde celui-ci chez les Gram (-) car le peptidoglycane est moins accessible à cause de lamembrane externe.

Expérience :1- On place une souche de Bacillus subtilis (bacille Gram+) en milieu hypotonique : la

bactérie se comporte normalement.2- Si on ajoute du lysozyme à cette suspension, les bactéries gonflent et éclatent.



3- On fait la même expérience en milieu isotonique, les bactéries n’éclatent pas enprésence de lysozyme, mais elles prennent une forme sphérique appellée :PROTOPLASTE. Les protoplastes ne possèdent plus les propriétés antigéniques dela bactérie, ne se divisent plus, ne fixent plus les bactériophages et sont incapables demobilité.

4- On fait la même expérience avec Escherichia coli (bacille Gram-) : en milieuisotonique + lysozyme, les bactéries prennent une forme sphérique appelée :SPHEROPLASTE. Les sphéroplastes conservent toutes les propriétés initiales de labactérie.

Rôle 1 de la paroi : assurer le maintien de la forme de la bactérieRôle 2 de la paroi : assurer une protection contre la pression osmotique intracellulaire (carforte concentration en métabolites à l’intérieur de la cellule >> l’eau rentre)Rôle 3 de la paroi : propriétés antigéniquesRôle 4 de la paroi : permettre la fixation des bactériophages. Ils reconnaissent des récepteurslocalisés sur le peptidoglycane des Gram (+) ou la membrane externe des Gram (-). Cettepropriété est utilisée pour l’identification de certaines bactéries : c’est la lysotypie.Rôle 5 de la paroi: participer à la mobilité. En effet, les flagelles sont implantés dans lamembrane cytoplasmique mais ne peuvent pas fonctionner en absence de peptidoglycane (d’oùimmobilité des protoplastes)Rôle 6 de la paroi : toxicité. Chez les Gram(-), le LPS est une endotoxine (effet toxique portépar le lipide A) qui peut donner fièvres et lésions.Rôle 7 de la paroi : perméabilité. La paroi laisse passer de petites molécules comme l’eau, lessels minéraux ou des métabolites simples. Par contre elle est plus ou moins perméable à certainssolvants (exemple l’alcool. cf coloration de Gram)

RemarqueCertains groupes bactériens possèdent des parois très différentes de celles des Gram (+) et

(-). C’est le cas notamment des Mycobactéries.Les mycobactéries sont des bacilles légèrement incurvés, se multipliant très lentement.Leur paroi est très riche en lipides et contient des cires : acides gras en C60 (acides mycoliques),qui empêchent de « prendre » la coloration de Gram.Ces bactéries sont dites : BAAR : bacilles acido-alcoolo-résistants. On les appelle aussi« bactéries sans paroi ».

Ex : Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprea



III-2- Le cytoplasmeDélimité par la membrane cytoplasmique.Sorte de gel contenant de l’eau et : Des ribosomes: interviennent dans la synthèse des protéines. Sont associés en chapelets

sur l’ARNm sous forme de polysomes. Sont composés de 2 sous-unités de tailledifférente (diamètre de 10 à 30 nm ; constante de sédimentation de 70S). Sont composésde protéines et d’ARNr (particules ribo-nucléiques). On peut les colorer par du bleu deméthylène.

Des substances de réserve = inclusions cytoplasmiques : en général, chaque groupe debactéries synthétise une seule catégorie de substances de réserve qui forment desagrégats, parfois de grande taille. Cela peut être des glucides (amidon et surtoutglycogène), des lipides (poly-hydroxy-butyrate) et parfois des minéraux (fer, soufre).

- réserves polysaccharidiques : amidon ou glycogène qui se forment en réponse àun excès de source de C alors que la source d’azote ou de S ou de P est limitante.Inclusions trouvées notamment chez les bactéries des genres Bacillus,Micrococcus, Neisseria…..

- granules de PHB ( = poly-béta-hydroxybutyrate ) réservoirs de C et d ‘énergie quis’accumulent quand les éléments nutritifs autres que la source de C deviennentlimitants. Elles sont trouvées notamment chez les Vibrio et les Pseudomonas.

- Granules de polyphosphates inorganiques ou volutine chez la plupart desbactéries ; ce sont des réserves de phosphate.

- Des lipides et des esters d’acides gras à longues chaînes sont stockés dans desvacuoles chez les Mycobactéries notamment.

Des organites spécialisés : différents de ceux trouvés dans les cellules eucaryotes. Ontrouve des chromatophores (organites spécialisés dans la photosynthèse), des vacuoles àgaz (permettant aux bactéries aquatiques de flotter à la surface de l’eau).

Des pigments : (= molécules colorées). On trouve des bactériochlorophylles (couleurverte) ou des caroténoïdes (couleur jaune de l’espèce Staphylococcus aureus).

Le pH du cytoplasme se situe autour de 7 – 7.2.

III-3- L’appareil nucléaire

a) Techniques d’étudeElles nécessitent de distinguer l’ADN des ARN, très nombreux dans le cytoplasme, quimasquent le chromosome bactérien.



Coloration de FEULGEN : traitement à l’acide chlorhydrique (HCl) dilué qui libèrele désoxyribose et ses fonctions aldéhyde. En présence de réactif de Schiff (colorantbasique), les résidus aldéhydiques se colorent en rouge foncé.

Technique de BOIVIN : destruction de l’ARN par une ribonucléase, puis colorationclassique de l’ADN par un colorant basique (réactif de Schiff, bleu de méthylène…)

Autoradiographie : on fait incorporer aux bactéries de la thymidine tritiée (base Tspécifique de l’ADN) pendant leur croissance. La radioactivité résultante impressionneun film photographique.

b) Structure du chromosome bactérienLe chromosome bactérien est une unique molécule d’ADN circulaire fermée et très longue(environ 1000 fois plus longue que la bactérie : 1360 µm chez E.coli ) libre et pelotonnée dansle cytoplasme. L’absence de membrane nucléaire conduit à parler d’appareil nucléaire ou denucléoide plutôt que de noyau. Cet ADN est associé à des protéines notamment destopoisomérases qui interviennent dans le repliement de la molécule d’ADN, par contre on netrouve pas d’histones comme chez les eucaryotes.

c) Rôles du chromosome bactérienIl est le support des caractères héréditaires, de l’information génétique.Il va se répliquer à l’identique pour que une cellule fille hérite du même potentiel génétiqueque la cellule mère (voir cours de BIOCHIMIE sur la REPLICATION)

III-4- La membrane cytoplasmique

a) Techniques d’étude- Expériences de plasmolyse en milieu hypertonique.- Microscopie électronique

b) Structure et composition chimiqueElle possède le même type de structure que celle d’une cellule eucaryote (bicouchephospholipidique) mais avec beaucoup moins de glucides et jamais de stérols (sauf lesmycoplasmes).Elle est composée de 60 à 70 % de protéines et 30 à 40 % de lipides.Voir Document

c) Rôles de la membrane cytoplasmiqueC1) Rôle de barrière semi-perméable (ou semi sélective): elle permet le passage de moléculeslipophiles et empêche le passage des molécules hydrophiles.



On distingue 2 grands types de transport :

Le transport passif : il se fait dans le sens du gradient de concentration etne nécessite pas d’énergie.

Le transport actif : il se fait en sens inverse du gradient de concentrationdes molécules, ce qui nécessite l’utilisation d’énergie (généralement fourniesous forme d’ATP)

C2) Site de fixation des flagelles (voir « les flagelles » plus loin)

C3) Possède des protéines membranaires ayant pour rôles : Enzymes responsables de la biosynthèse et de l’excrétion dans l’espace

périplasmique de molécules nécessaires à la synthèse de la paroi Enzymes de la chaîne respiratoire permettant la synthèse d’ATP Transporteurs de diverses molécules (ions, sucres, …) dans les 2 sens.

De plus la membrane joue un rôle important dans la détection de composés présents dans lemilieu environnant grâce à la présence de protéines transmembranaires du chimiotactisme. Cecipermet aux bactéries dotées de flagelles de « nager » vers les endroits qui leur sont les plusfavorables, les plus riches en nutriments par exemple et de s’éloigner des endroits défavorablescomme ceux qui contiennent des substances toxiques. Ces protéines interviennent dans le sens derotation des flagelles.

IV- Les éléments facultatifs de la cellule bactérienne

IV-1- La capsulePour qu’elle existe il faut que :- la bactérie possède les gènes codant pour sa fabrication- que la bactérie ait à sa disposition dans le milieu de culture les éléments nécessaires à safabrication (principalement des glucides.

a) Mise en évidence Etat frais à l’encre de chine : les bactéries apparaissent sur fond sombre avec un halo

clair autour du corps bactérien qui correspond à la capsule. Microscopie électronique Techniques immunochimiques : des Ac anti-capsulaires se fixent sur les Ag capsulaires.

Le complexe Ag-Ac précipite et augmente l’épaisseur de la capsule qui devient visible aumicroscope. Cette réaction est appelée : Réaction de gonflement de la capsule deNEUFELD.



b) Morphologie et structure chimiqueDe nombreuses bactéries sont capables de synthétiser des polyosides de surface. Parmi cespolyosides de surface, on distingue de façon quelque peu arbitraire, la capsule et les couchesmuqueuses ou slime.

- soit une couche gélatino-muqueuse, bien définie, entourant un ou plusieurs corpsbactériens (ex : Pneumocoques (Streptococcus pneumoniae) encapsulés en diplocoques ;Klebsielle pneumoniae encapsulée seule)

- soit une couche diffuse et visqueuse

Sur milieu solide, les colonies donnent un aspect caractéristique : type M (exemple : Klebsiellapneumoniae)

La capsule est en général de nature polysaccharidique, et quelquefoispolypeptidique (Bacillus anthracis ou megatherium).

Couche muqueuse ou slime : couche diffuse, facilement séparable du corpsbactérien. La production de slime est fréquente chez les bactéries aquatiques etparticulièrement importante chez les bactéries du genre Zooglea qui produisentdes masses gluantes. Certains polyosides produits par des bactéries ont un intérêtindustriel et sont produits comme gélifiant notamment en industries alimentaires :Leuconostoc mesenteroides produit des dextrans, Xanthomonas des xanthanes …

Couche S : couche de surface cristalline de découverte relativement récente carelle ne peut être mise en évidence que par microscopie électronique. Elle estconstituée de sous unités protéiques organisées de façon cristalline selon unsystème géométrique carré, hexagonal ou oblique (ressemble à la cotte de mailledes armures) . Elle a été trouvée chez des Archeobactéries ( Methanococcus parex) et chez des Bactéria ( Chlamydia, Treponema, Helicobacter, BacillusClostridium …). La couche S joue un rôle en tant que squelette mais elle pourraitaussi être impliquée dans l’adhésion, dans la résistance aux protéases desmacrophages et dans la protection vis à vis des bactériophages.

c) Rôles et propriétésLa capsule n’a pas un rôle vital pour la bactérie (sans elle, elle peut vivre et se multiplier), maiselle peut être utile à la bactérie grâce à ses rôles : De protection : contre les UV, la dessiccation, les agents physiques et chimiques Dans le pouvoir pathogène : Elle s’oppose à la phagocytose en diminuant l’adhésion de bactéries aux macrophages Elle exerce un chimiotactisme négatif sur les leucocytes Elle empêche la pénétration des antibiotiques

Ainsi pour certains germes (ex : pneumocoques), une perte de la capsule correspond à une pertede la virulence. Antigénique : les Ag capsulaires sont responsable de la spécificité sérologique (Ag K). A

partir de cette propriété, une classification peut être établie (ex : 70 types sérologiquesdifférents chez Streptococcus pneumoniae).



IV-2- Les flagellesCe sont des organes locomoteurs spécialisés. Ils sont très rares chez les coques.

a) Mise en évidence Indirecte : état frais (bactéries en mouvement) ou en milieu semi-gélosé (MM) Directe : en microscopie optique après avoir épaissi les flagelles par des colorations

spéciales (Rhodes, Leifson : fuschine basique) ; ou en microscopie électronique.

b) Morphologie et mode d’insertionIls mesurent en moyenne 16 à 20 μm (beaucoup plus que la bactérie) et sont très fins (300 Åd’épaisseur).Il existe différents modes d’insertion des flagelles, selon le nombre et la position de ceux-ci :

Ils sont fixés à la bactérie par insertion dans la membrane cytoplasmique.Ils sont mobiles par rotation, comme une hélice, grâce à un mécanisme similaire à un « rotor »fonctionnant grâce à l’énergie fournie par un gradient de protons.Le mécanisme de rotation s’effectue grâce à un complexe situé dans la paroi.

c) Architecture moléculaireLe flagelle bactérien est constitué de 3 parties :

- le filament hélicoïdal- le crochet- le corpuscule basal

Insertionspolaires

Insertionpéritriche



c1) Le filamentC’est un cylindre creux constitué d’une seule protéine multimérique : la flagelline (PM : 30.000à 60.000 g/mol).La flagelline, protéine fibreuse, se positionne en hélice rigide qui tourne à la manière de l’héliced’un bateau.

c2) Le crochetIl lie le filament au corpuscule basal. Il a la même composition que le filament, mais à cetendroit, la flagelline ne possède pas le même pas d’hélice, ce qui permet la formation d’uncoude.Le crochet est plus court que le filament, mais plus large. Très flexible, il permet d’induire lemouvement de la bactérie.La jonction crochet-filament est assurée par des « protéines associées au crochet » = protéinesHAP (Hook Associated Proteins).

c3) Le corpuscule basalEnfoui dans la cellule, il insère le flagelle dans le corps cellulaire.Son architecture, assez complexe, peut être simplifié en 3 parties :

- une partie mobile = le rotor- une partie fixe = le stator- un inverseur qui déclenche le mouvement soit dans le sens des aiguilles d’une montre

(CW) soit dans le sens inverse (CCW)Sa composition est différente chez les bactéries Gram (+) et Gram (-).

d) Synthèse du flagelle20 à 30 gènes sont impliqués dans la synthèse des flagelles.La synthèse du flagelle se fait par un assemblage séquentiel des différents composants : disques,du corps basal, puis du crochet et enfin du filament.

e) Fonctionnement du flagelle C’est une force « proton motrice » qui est responsable de la rotation (mécanisme pas

totalement élucidé).C'est-à-dire qu’un gradient de protons se dispersant au travers des 2 anneaux fournit l’énergienécessaire à la rotation.L’ATP ne semble pas être impliqué dans la rotation du flagelle. Selon le sens de rotation du flagelle, la bactérie ne se comporte pas de la même manière :

1 2



1 : Dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (CCW), la bactérie avance en tournantlégèrement sur elle-même2 : Dans le sens des aiguilles d’une montre (CW), la bactérie culbute et change alors dedirection pour repartir en avant avec les flagelles tournant CCW.

Remarques : pour les ciliatures péritriches :1 : tous les flagelles sont regroupés à l’arrière du corps bactérien (comme les tentacules d’unpoulpe)2 : les flagelles se dispersent autour du corps bactérien et la bactérie culbute.

f) Rôles des flagellesf1) La locomotionMises en évidence sur des milieux semi-gélosés (diffusion dans la gélose) ou sur milieu solide(envahissement de la surface de la boîte. Ex : Proteus).f2) Rôle antigéniqueLes antigènes flagellaires (Ag H) déterminent différents sérotypes (exemple : sérotypage desSalmonella. Voir TP). En présence de l’anticorps correspondant à leur Ag H, les bactériesagglutinent et les bactéries s’immobilisent.La spécificité antigénique repose sur le nombre et la séquence des acides aminés de laflagelline.f3) Fixation des bactériophagesLes flagelles sont le lieu de fixation de certains bactériophages.f4) Le chimiotactismeCertaines substances attirent les bactéries mobiles, d’autres les repoussent.

IV-3- Les pili ou fimbriae(Fimbriae = « filament » ou « fibre » en latin ; pili = « cheveu » ou « structure chevelue » enlatin)Ce sont des structures filiformes, différentes des flagelles, qui sont quasi systématiques chez lesGram (-) et rares chez les Gram (+). Ils sont de nature protéique. On distingue 2 sortes de pili : Les pili communs ou de type I : ils sont nombreux autour de la bactérie, courts (de

l’ordre de 1µm) et rigides (on les appelle également des cils). Ils sont impliqués dans lespropriétés d’adhésion des bactéries aux tissus. Ils constituent donc un facteur devirulence pour les bactéries pathogènes.

Les pili sexuels ou de type II : ils sont plus longs (10 µm environ) et se terminent par unrenflement. Leur nombre varie entre 1 et 4. Ils ont un rôle dans la conjugaisonbactérienne (un des 3 modes de transfert de matériel génétique d’une bactérie à uneautre).



IV-4- Les plasmidesCe sont des molécules d’ADN bicaténaire, extra-chromosomiques, plus petites que lechromosome bactérien (environ 1.000 à 3.000 pb soit 1/100 du chromosome), capablesd’autoréplication. Certains plasmides peuvent s’intégrer au chromosome bactérien : on lesappelle des épisomes.Les plasmides apportent du matériel génétique supplémentaire à la bactérie, qui code pour descaractères additionnels, mais non indispensables au métabolisme normal de la cellulebactérienne. Non indispensables à la survie de l’espèce, ces plasmides confèrent aux bactériesqui les hébergent des avantages sélectifs importants : ils portent des gènes codant desrésistances aux antibiotiques, à des métaux lourds, des gènes codant des voies métaboliquesnouvelles comme la possibilité d’utiliser des hydrocarbures et des dérivés organiques complexes(très fréquents chez les bactéries du genre Pseudomonas ). Certaines bactéries portent aussi desgènes codant la synthèse de substances comme des antibiotiques, des toxines et des facteurs devirulence.

Remarque : importance des plasmides portant des gènes de résistance aux antibiotiques dansl’augmentation des cas d’infections nosocomiales.Ces plasmides peuvent se transférer d’une bactérie à une autre par différents mécanismes (voircours de génétique bactérienne).Les plasmides sont des outils très utiles en génie génétique : on introduit dans une bactérie desgènes non bactériens portés par des plasmides, afin de lui faire acquérir de nouveauxcaractères (exemples : synthèse d’insuline, d’hormone de croissance, vaccin HBV…).

IV-5- Les sporesCe sont des structures de résistance formées par certaines bactéries lorsque les conditionsdeviennent défavorables (carence en éléments nutritifs …).Trois genres bactériens sont caractérisés par des endospores : Bacillus, Clostridium etSporosarcina. Ce sont toutes des bactéries Gram (+).

a) Mise en évidence Les spores sont visibles à la coloration de Gram où elles apparaissent comme des

espaces vides à l’intérieur des bactéries : seul le contour de la spore apparaît coloré. A l’état frais, elles apparaissent comme de petites masses réfringentes au sein de la

bactérie, ou libres dans le milieu. Il existe des colorations spéciales basées sur le caractère acido-alcoolo-résistant des

spores. Exemple : coloration au vert de malachite = coloration de Benito-Trujillo.Après une contre coloration par la fushine, les spores apparaissent verte dans la bactérierose.



b) Morphologie et structureLes spores sont de petites unités ovales ou sphériques.Elles peuvent déformer ou non le corps bactérien. Leur position dans la cellule est variable :centrale, terminale, subterminale.La spore peut-être libre ou nonLa recherche de tous ces caractères se fait dans un but taxonomique.

c) Composition chimiqueLa spore possède de nombreuses enveloppes. La spore se différentie de la cellule végétative par : une faible teneur en eau (d’où résistance à la dessiccation) une faible teneur en enzymes (activité métabolique réduite) la présence de dipicholinate de calcium dans une enveloppe particulière : le cortex une diminution du nombre de liaisons entre NAM et NAG la présence de protéines de type kératine dans les tuniques

d) Le cycle sporal

Il représente le passage de la forme végétative à la forme sporulée et inversement :

SPORULATIONForme végétative Forme sporulée

GERMINATIONAfin que la spore germe, elle doit se trouver dans des conditions favorables : eau, nutriments,pH, force ionique, température convenable, pas d’agents antimicrobiens.Inversement, des conditions défavorables de croissance entraînent la sporulation ou l’absence degermination de la spore.

e) Les étapes de la sporulationLa sporulation dure environ 7 heures.

La sporulation :Elle est provoquée par l’épuisement du milieu en substrat nutritif et elle peut nécessiter desconditions particulières : absence d’oxygène pour les Clostridium, présence d’oxygène aucontraire pour Bacillus anthracis .Le processus de sporulation débute à la fin de la phase exponentielle et se déroule en 6 étapes :

a. stade 1 formation du filament axial : la division nucléaire n’étant pas suivied’une division cellulaire , les deux génomes fusionnent donnant un filamentchromatique axial



b. stade 2 : les deux génomes se séparent et en même temps la membranecytoplasmique s’invagine près d’un pôle de la cellule pour former un septumde sporulation qui partage la cellule en deux parties inégales.

c. Stade 3 : Ce septum va envelopper le cytoplasme de la plus petite partie pourformer une préspore caractéristique

d. Stade 4 : entre les deux membranes limitant la préspore se forme la paroisporale puis apparaît rapidement le cortex

e. Stades 5 et 6 : apparition des tuniques et après maturation, la cellule végétativese lyse et libère la spore.

f) Propriétés de la sporeLa spore possède de nouvelles propriétés par rapport à la cellule végétative : Thermo résistance :

La spore résiste en général à des températures de 70-80°C pendant 10 minutes, parfois plus.Cette propriété est due à la présence de l’acide dipicholinique et à la déshydratation de laspore. (Les protéines et les acides nucléiques à l’état déshydratés sont très résistants à ladénaturation thermique).

Cette propriété entraîne des problèmes importants dans les hôpitaux, les salles de chirurgie etles industries alimentaires (Clostridium tetani >> tétanos ; C. botulinum >> botulisme) Résistance aux agents physiques et chimiques :

La spore résiste aux rayons UV, X, ultrasons, antiseptiques, désinfectants, ATB (un ATBbactéricide pour une bactérie peut s’avérer simplement sporostatique pour les spores de la mêmebactérie). Cela pose également des problèmes dans les hôpitaux. Résistance à la dessiccation et au vieillissement :

Ces phénomènes semblent dus à la faible teneur en eau et au métabolisme ralenti : on parled’état de dormance. Synthèse d’antibiotiques :

Certaines bactéries synthétisent des ATB au début de la phase de sporulation. Exemple : Bacilluslicheniformis synthétise ainsi la Bacitracine ; Bacillus polymyxa le polymyxineMais aussi des toxines (entérotoxine de Clostridium perfringens) ou des substances à activitébiopesticide ( toxines létales pour des insectes) comme le corps parasporal de Bacillusthuringiensis et de Bacillus sphaericus .

b) La germination ;Placée dans des conditions favorables (eau glucose acides aminés) la spore redonne naissance àune cellule végétative. On distingue 3 stades dans le processus de germination :

a. l’activation : correspondant à une lésion des enveloppes sporales par desagents physiques (choc thermique ) ou chimiques ( acides , lysozyme …) ou



mécaniques ( abrasion, choc ) . Remarque : l’activation thermique est mise àprofit au cours de la tyndallisation qui consiste à chauffer 3 fois le produit àstériliser : 30 min à 60°C ( destruction des formes végétatives et induction dela germination d’éventuelles spores ) , le deuxième chauffage à 60°C 30minutes tue les spores issues da la germination et induit la germination desspores résiduelles et le troisième chauffage dans les mêmes conditions détruitles dernières formes végétatives.

b. L’initiation débute en présence de conditions favorables d’hydratation et demétabolites effecteurs (alanine , magnésium adénosine …) qui pénètrent àtravers les enveloppes endommagées. Des enzymes hydrolytiques dégradentles constituants de la spore ; il y a libération du dipicolinate de calcium . lecortex détruit la pore s ‘imbibe d’eau et gonfle.

c. L’émergence de la nouvelle cellule végétative : grâce à l’altération desenveloppes



CHAPITRE 2 : NUTRITION ET CROISSANCE DES BACTÉRIES

L'objectif de ce chapitre est d'étudier dans quelles conditions la cellule bactérienne seforme, se développe, croît, vit et se reproduit, puis meurt.

I - NUTRITIONLorsqu'on introduit un petit nombre de bactéries dans un milieu liquide neuf, ce dernier,

s'il est placé dans de bonnes conditions, se trouble en quelques heures suite à la formation demilliards de bactéries identiques.

Une cellule bactérienne de E. coli se multiplie, en effet, toutes les 20 minutes, parfoismoins. Cette multiplication se fait à partir des nutriments présents dans le milieu de culture.

Pour les bactéries il faut distinguer 2 catégories de substances :- les premières dont toutes les bactéries ont besoin ; ce sont l'eau, une source de carbone, unesource d'azote et des éléments minéraux. Ces besoins de base sont appelés besoinsélémentaires ;- les secondes exigées par certaines bactéries pour le développement desquelles les besoinsélémentaires ne suffisent pas ; ces besoins spécifiques sont appelés facteurs de croissance.Les facteurs de croissance sont des métabolites devant nécessairement leur être fournis pour lasynthèse d’un constituant indispensable.Selon la nature de ces besoins on sera amené à définir des catégories de micro-organismes quel'on appelle des types trophiques.

1 - Besoins élémentairesL’analyse de la cellule microbienne montre que 95% du poids sec de la cellule sont composés dequelques éléments (C, H, O, N, P, S, K, Cl, Na, Ca2+, Mg2+, Fe2+ ou Fe3+) dits macro-éléments.Les six premiers (C, H, O, N, P et S) apportés par les glucides, les lipides et les protides, sontrequis en quantités importantes (quelques g/l de milieu de culture). Les autres quant à eux sontrequis à des concentrations de l’ordre du mg/l de milieu de culture. Tous les micro-organismesont également besoin de quelques oligo-éléments (Mn, Zn, Co, Mo, Ni, Cu) mais en quantitéstrès faibles (quelques µg/l ou quelques traces).

1-1 Couverture des besoins élémentaires non carbonésUne solution saline de composition adéquate suffit dans la plupart des cas pour couvrir

les besoins en éléments non carbonés.Cette base minérale fournit en quantité suffisante N, P, S, Mg, K, Cl, Fe et Mn. H et O

sont apportés par l'eau et les différents sels. Les oligoéléments sont présents en quantitésuffisante dans les impuretés des réactifs, du verre, des récipients, ou de l'eau de dissolution.



PO4HK 10,5 gPO4H2K 3,5 gClNH4 0,5 gSO4Mg, 7H2O 0,05 gSO4Fe, 7H2O 0,005 gNaCl, 2H2O 0,05 gMnCl2, 4H2O 0,005 gEau distillée 1 litre

Deux macroéléments importants doivent également être apportés : l'azote et le soufre.* L'azote est en général fourni et assimilé sous forme d'ions NH4

+ (ammonium). D'autrescomposés minéraux peuvent dans certains cas convenir : les nitrates, l'azote atmosphérique(N2). Ce sont donc presque toujours des ions NH4

+ qui sont assimilés.* Le soufre

La plupart des micro-organismes savent utiliser les ions sulfates SO4- - pour produire les

deux acides aminés soufrés présents dans les protéines (Cys et Met) mais aussi les coenzymescontenant du soufre : biotine, thiamine, acide lipoïque.La couverture des besoins en éléments non carbonés peut aussi être assurée par un extrait deviande ou son équivalent. La viande de bœuf contient tous les éléments précédemment cités ; sacomposition élémentaire est voisine de celle de la bactérie. L'extrait de viande contient aussi unequantité appréciable d'acides aminés libres qui sont absorbés sous cette forme et intégrésdirectement aux protéines.

1-2 La source de carboneLes besoins en C, H et O sont souvent satisfaits ensemble car les molécules sources de

carbone sont également sources d’O2 et d’H2.Selon la source de carbone, on distingue :

* des micro-organismes autotrophes utilisant le CO2 comme unique et principale source decarbone en milieu inorganique. Les bactéries photosynthétiques et la plupart deschimiolithotrophes font partie des autotrophes.* des micro-organismes hétérotrophes exigeant des molécules organiques préformées(provenant d’autres organismes) réduites comme source de carbone et d’énergie.

Escherichia coli par exemple pousse sur un milieu minimum ayant la même compositionque celui donné plus haut, mais auquel est incorporé 1 g de glucose comme source de carbone. E.coli ne peut donc produire tous ses constituants carbonés à partir du CO2. Il est capable de lefaire à partir d'une seule source de carbone organique : c'est une bactérie hétérotropheprototrophe.



1-3 Sources d’énergieSelon le type d’énergie utilisée, on peut reconnaître 2 catégories de bactéries :* les phototrophes ou photosynthétiques utilisant l’énergie lumineuse comme source d’énergie ;* les chimiotrophes ou chimiosynthétiques, tirant leur énergie de l’oxydation de composéschimiques organiques ou minéraux.

1-4 Sources d’Hydrogène et/ou d’électronsDe même, les microorganismes ont seulement 2 sources d’électrons ou d’hydrogène, ce

qui permet de distinguer :* lithotrophes, utilisant des substances inorganiques (minéraux) comme source d’électrons ;* les organotrophes qui extraient les électrons et l’hydrogène de composés organiques.

Sources de carbone Sources d’énergie Sources d’hydrogène/e-

Autotrophes Hétérotrophes Phototrophes Chimiotrophes Lithotrophes OrganotrophesCO2 seule ouprincipalesource decarbone

Moléculesorganiquespréforméesréduitesprovenantd’autresorganismes

LumièreOxydation decomposésorganiques etinorganiques

Moléculesinorganiquesréduites

Moléculesorganiques

Malgré la grande diversité métabolique observée chez les micro-organismes, ils peuventêtre classés pour la plupart, en 4 catégories nutritionnelles sur la base de leurs sources primairesen énergie, en hydrogène et/ou électrons et en carbone comme indiqué dans le tableau ci-dessous:

Principaux typesnutritionnels

Autotrophesphotolithotrophes

Hétérotrophesphotoorganotrophes

Autotropheschimiolithotrophes

Hétérotropheschimioorganotrophes

Sourcesd’énergied’H/e- et de C

-Energie lumineuse-Donneurinorganique d’H/e-

-Source de C : CO2

-Energie lumineuse-Donneur organiqued’H/e-

-Source organique deC (CO2 peut aussi êtreutilisé)

-Source chimiqued’énergie(inorganique)-Donneurinorganique d’H/e-

-S ource de C : CO2

- Source chimiqued’énergie (organique)-Donneur organiqued’H/e-

-Source organique de C

Micro-organismesreprésentatifs

Algues, Bactériessulfureuses pourpreset vertes,Cyanobactéries

Bactéries nonsulfureuses pourpres,Bactéries nonsulfureuses vertes

Bactéries oxydant leSBactéries oxydantl’H2Bactéries nitrifiantesBactéries du fer

ProtozoairesMycètesLa plupart des bactériesnon photosynthétiques



* les autotrophes photolithotrophes (ou photoautotrophes), utilisant l’énergie lumineuse et leCO2 comme source de carbone ;* les hétérotrophes chimioorganotrophes (ou chimiohétérotrophe), utilisant des composésorganiques comme sources d’énergie, d’hydrogène, d’électrons et de carbone pour leursbiosynthèses ; la grande majorité des bactéries appartiennent à ce groupe : bactéries pathogènesou ayant un intérêt médical, bactéries de contamination alimentaire, bactéries utilisées dansl’industrie pour leur synthèse d’antibiotiques, de vitamines, d’acides aminés, etc.;

Les deux autres classes comprennent moins de micro-organismes mais jouent un rôleécologique prépondérant (participent à différents cycles de la matière vivante dans le sol et leseaux) ; ce sont :* les hétérotrophes photoorganotrophes utilisant l’énergie lumineuse et exigeant de la matièreorganique comme source de carbone et d’électrons ;* les autotrophes chimiolithotrophes utilisant le CO2 comme source de carbone et oxydant lescomposés réduits inorganiques tels que le fer, l’azote ou le soufre pour produire à la fois del’énergie et des électrons.

2 - Besoins spécifiques : facteurs de croissanceCertains microorganismes, en particulier la plupart des autotrophes photolithotrophes se

développent sur milieu minimum contenant les facteurs nutritionnels élémentaires. D’autres aucontraire exigent pour leur développement la présence de substances organiques qu’ils sontincapables de synthétiser et qu’on appelle facteurs de croissance, et qui englobent troiscatégories de substances : acides aminés, bases puriques et pyrimidiques et vitamines.Les facteurs de croissance sont caractérisés par leur action à des concentrations infimes et leurétroite spécificité. En fonction de leurs besoins nutritionnls, on peut classer les micro-organismesen 2 groupes :* les prototrophes qui ne nécessitent pas de facteurs de croissance ;* les auxotrophes qui en exigent.Exemple : Escherichia coli se développe normalement dans un milieu contenant une source decarbone comme le glucose, une source d’azote et des sels minéraux ; Proteus vulgaris, une autreentérobactérie, en est totalement incapable en l’absence d'acide nicotinique. L'acide nicotiniqueest un métabolite essentiel pour les deux espèces et un facteur de croissance pour le seulProteus vulgaris. Proteus vulgaris est dit auxotrophe vis-à-vis de l'acide nicotinique.

Un facteur de croissance est un constituant de la bactérie que celle-ci ne peut produire àpartir de ses sources de carbone. Il doit être obligatoirement ajouté au milieu minimum adapté àla culture de la souche prototrophe.



Les auxotrophes sont dépourvus d’une ou de plusieurs enzymes essentielles et parconséquent ne peuvent pas fabriquer tous les constituants indispensables ; ils doivent les obtenirde leur environnement.

Remarque : les besoins en facteurs de croissance d’une espèce microbienne peuvent quelquefoisêtre satisfaits par la présence d’une autre espèce qui précisément synthétise ledit facteur. Cephénomène d’interaction métabolique est connu sous le nom de syntrophie (repas avec) ousatellitisme.

II- CROISSANCE

1- GENERALITÉSLes bactéries se multiplient par scissiparité et une des étapes préliminaires à leur

l’identification passe par l'obtention d'une culture pure, c'est-à-dire une population bactérienneissue d'une même et seule cellule.1-1 la température

Les températures minimale, maximale et optimale de croissance des microorganismessont dites températures cardinales.

La croissance des micro-organismes a pu être observée à des températures variant de-20°C à plus de 100 °C, avec des optima s’échelonnant de 0 °C jusqu’à 75 °C. De façongénérale, l’échelle des températures permettant la croissance d’un micro-organisme s’étend sur30 °C.

Quelques espèces dites sténothermes (Neisseria gonorrhoeae) ont une gamme plusétroite de température, alors que d’autres comme Enterococcus faecalis, dites eurythermes, sedéveloppent dans une gamme très large de températures.

Selon la température optimale de croissance, on distingue 3 principaux groupes de micro-organismes : les psychrophiles, les mésophiles et les thermophiles.

Dans cette classification il peut y avoir des chevauchements d'un groupe à l'autre, ce quifait reconnaître d'autres groupes plus tolérants dans leur optimum thermique de croissance : lespsychrotrophes et les thermotrophes.

Températures cardinalesCatégories minimale optimale maximalePsychrophiles -15 15 - 20 25Psychrotrophes 0 - 5 25 - 35 37Mésophiles 10 - 20 37 45Thermophiles 25 - 45 50 - 55 65 - 90Thermotrophes 30 - 50 55 - 65 > 100



Naturellement, les températures élevées sont inhibitrices pour les psychrophiles comme lesont pour les thermophiles les températures basses.

Récemment des bactéries vivant au fond de la mer en contact de souches chaudes etsupportant une température de 250°C sous une pression de 265 atmosphères (Pyrodictiumoccultum) ont été découvertes.

1-2 le pHChaque espèce microbienne se développe dans une gamme définie de pH avec un pH

optimum de croissance. Selon ce pH optimum on distingue :* des espèces acidophiles, avec un pH optimum compris entre 1 et 5,5.Exemple : Thiobacillus thiooxydans ;* des espèces neutrophiles : 5,5 < pH optimum < 8,0 ; exemple : Staphylococcus aureus ;* des espèces alcalophiles : 8,5 < pH optimum < 11,5 ; exemple : Vibrions, Bacillusalcalophilus.

A l’opposé des moisissures et des levures qui sont acidophiles (pH 4 à 6), la majorité desbactéries sont neutrophiles, et se multiplient en milieu neutre ou légèrement alcalin (pH 7,0 à7,5).

Les micro-organismes modifient fréquemment le pH de leur propre habitat en produisantdes déchets métaboliques acides ou basiques. Aussi des tampons sont-ils souvent inclus dans lesmilieux pour empêcher une inhibition de la croissance due à des modifications importantes depH.

1-3 la pression osmotique et l’activité de l’eauLa plupart des bactéries sont pratiquement insensibles aux variations de pression

osmotique. Elles sont protégées par leur paroi rigide. Cependant de nombreuses bactériesmarines adaptées à un milieu contenant 35 g de NaCl/L et dites de ce fait halophiles, doiventêtre cultivées dans des solutions contenant au moins 10% de sel.

Quant aux micro-organismes cultivant dans ou à la surface d'un milieu à concentrationosmotique élevée, ils sont dits osmophiles.

La concentration osmotique de l’habitat ayant des effets importants sur les micro-organismes, il est utile de pouvoir exprimer quantitativement le degré de disponibilité de l’eau.Le paramètre utilisé pour cela par les microbiologistes est l’activité de l’eau (Aw).

Par définition l’activité de l’eau est le rapport de la pression de vapeur de la solution sur lapression de vapeur de l’eau. Elle est également déterminée par la loi de Raoult, par le rapport dunombre de moles de soluté sur le nombre de moles de solvant + le nombre de moles de soluté.



Aw =

P(sol )

P(eau )

n2

n1 n 2

n1 = nombre de moles de solvant ; n2 = nombre de moles de soluté

La baisse de l’activité de l’eau entraîne une rétraction de la membrane plasmique parplasmolyse. Cela déshydrate la cellule et endommage la membrane cellulaire ; la cellule devientmétaboliquement inactive et ne se développe plus. Cependant, certains microorganismes ontdéveloppé des mécanismes d’adaptation à des habitats à faible activité de l’eau. Ils sont de ce faitdits osmotolérants. Staphylococcus aureus par exemple, peut être cultivé dans des milieux enabsence ou en présence de chlorure de sodium jusqu’à une concentration de 3M.Saccharomyces rouxii se développe dans des solutions de sucre à des valeurs de Aw aussi faibleque 0,6. Toutefois, bien que quelques micro-organismes soient vraiment osmotolérants,beaucoup ne se multiplient bien qu’à des Aw≥ 0,98. Cela explique pourquoi le salage ou lesucrage sont utilisés comme moyens de conservation des denrées alimentaires.

1.4 La concentration en oxygèneLes exigences des bactéries vis-à-vis de l’oxygène permettent de définir les types respiratoiressuivants :* Type aérobie strictCe type ne cultive qu’en présence d’air et ne respire qu’en aérobiose par phosphorylationoxydative.* Type anaérobie strictLa plupart des bactéries de ce type sont capables de supporter l’atmosphère normale pendant uncertain temps. En effet en présence d’oxygène elles peuvent utiliser la voie oxydative directe,mais elles sont dépourvues de catalases et de péroxydases actives, l’eau oxygénée quis’accumule devient bactéricide au bout d’un certain temps ; par contre d’autres dites extrêment(E.O.S.) sont immédiatement tuées par l’oxygène.* Type anarobie facultatif ou anaérobie-aérotolérantLes bactéries aérobies facultatives (anaérobie aérotolérantes) peuvent utiliser toutes les voiesénergétiques (oxydative et fermentative), alors que les anaérobies facultatives ne peuvent utiliserque les fermentations. Accessoirement certaines espèces peuvent utiliser la voie oxydativedirecte en présence d’oxygène. Celles qui n’ont pas cette possibilité apparaissent totalementinertes vis-à-vis de l’oxygène qui n’est pour elles ni utile ni nuisible : elles sont ditesanoxybiotiques (Streptococcus).



* Type microaérophileCe type rassemble des bactéries des 2 types anaérobie stricte et aéro-anaérobie, dont les enzymes(catalase en particulier) ne fonctionnent correctement que sous une faible pression d’oxygène (de2 à 10 %).La culture des aérobies ne présente pas de difficultés majeures alors que celle des anaérobiesnécessite des précautions spéciales. Les méthodes en usage pour la culture de ces dernièresbactéries font intervenir l’une des approches suivantes :

- utilisation de milieu anaérobie spécial contenant des agents réducteurs tels que lethioglycolate ou la cystéine, qui éliminent l’oxygène dissous ;

- élimination de l’air à l’aide d’une pompe à vide et expulsion de l’O2 résiduel avecl’azote ;

- utilisation de l’H2 et du palladium catalyseur pour éliminer l’O2 par formation d’H20.

2- Mesure de la croissanceLes techniques de mesure de la croissance sont fondées sur l’étude de l’évolution du nombre

de cellules ou de leur masse par unité de volume ou de poids de milieu. Ces deux paramètresaugmentent parallèlement tous les deux dans une population microbienne dont la croissance n’estpas synchronisée. Quelles sont donc les techniques les plus courantes utilisées ?

2-1 la mesure du nombre de bactéries

2.1.1 Par dénombrement direct- en comptant au microscope le nombre d'individus contenu dans un petit volume connu deculture.- en comptant à l’aide d’un compteur de particules (compteur Coulter) les particules ou lescellules en suspension dans une solution d’électrolyte. Cette méthode est d’usage courant enmilieu hospitalier pour le comptage des cellules sanguines.

Ce procédé tout comme le précédent, a l’inconvénient de compter indistinctement lescellules et les particules inertes de même taille.- par épifluorescence, ce qui permet de compter sélectivement les bactéries vivantes quifluorescent dans le vert (lumière UV) après coloration par un fluorochrome comme l’orangéd’acridine, alors que les cellules mortes fluorescent dans le rouge suite à la combinaison dufluorochrome avec le DNA dénaturé.

2.1.2 Par dénombrement indirect- en comptant le nombre de colonies apparues sur un milieu de culture solide inoculé avec unvolume déterminé de suspension bactérienne.



Mais que ce soit un dénombrement en milieu liquide ou en milieu solide, il est presquetoujours nécessaire de faire des dilutions (généralement au 1/10) de la suspension selon la

technique suivante :

9 mlde diluant

9 mlde diluant

9 mlde diluant

dilution 10 10 10 100 -1 -2 -3

1 ml

La technique de numération en milieu solide dans la pratique se fait en ensemençant 2boîtes de pétri avec 1 mL de chaque dilution et en ne prenant en compte que les boîtes où lenombre N de colonies est tel que 30 ≤ N < 300 pour une culture sur milieu non sélectif.Supposons que les résultats du tableau ci-dessous sont obtenus lors d'une telle expérience :

Inoculum (1 ml de chaquedilution)

N Moyenne Nombre de bactéries par ml deproduit pur

1ère boîte tropdilution 100 2ème boîte nombreuses

1 ère boîte 289dilution 10 -1 2 ème boîte 291 290 290x10 = 2900

1 ère boîte 28dilution 10 -2 2 ème boîte 30 29

1 ère boîte 3 -dilution 10 -3 2 ème boîte 4 - colonies trop rares

Nombre de microorganismes/mL de produit pur = nombre de colonies / dilutionConcernant la technique de numération en milieu liquide, on a souvent recours, pour

déceler la présence d'un micro-organisme donné, à sa mise en évidence par un de ses caractères,comme par exemple virage d'indicateur de pH lors de la fermentation d'un glucide. Ainsi un tubeétant ensemencé par un volume donné d'inoculum, on regarde si le caractère recherché estapparu (résultat +) ou non (résultat -).

Un résultat + indique qu'il y a au moins un micro-organisme recherché dans le volumeinitial d'inoculum.

Un résultat - indique qu'il y a moins d’un micro-organisme recherché dans le volumeinitial d'inoculum



Supposons que les résultats suivants soient obtenus :

Inoculum (1 mL) 10 0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4

Résultats + + + - -

On ne tiendra compte que de la dernière dilution ayant donné un résultat + et de lapremière ayant donné un résultat -. Ainsi, on peut dire que :* pour 10 -2 on a au moins 1 bactérie par mL, soit plus de 100 bactéries/mL de suspension mère ;* pour 10 -3 on a moins de 1 bactérie par mL, soit moins de 1000 bactéries/mL de suspensionmère d'où 100 ≤ nombre de bactéries/mL de produit pur < 1000

Mais pour une interprétation statistique des résultats, on a recours à la méthode dunombre le plus probable (NPP), et qui consiste à noter le nombre de résultats positifs obtenusavec 2,3 ou 5 tubes ensemencés pour chaque dilution, soit 0, 1, 2 ou 3 pour 3 tubes.

On compose alors une combinaison caractéristique formée par les chiffres correspondantà 3 dilutions successives, la dilution correspondant au premier chiffre du nombre étant la dilutionla plus grande ayant donné un résultat positif pour tous les tubes. Ainsi donc si on obtient letableau suivant :

10 0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5

Résultats + + + + + + + + + + - - - - - - - -nombre derésultats +

3 3 3 1 0 0

Le nombre caractéristique sera 310. Des tables élaborées par Mac Grady donnent pourchaque combinaison caractéristique le nombre N de cellules le plus probable dans 1 mL de ladilution correspondant au premier chiffre de la combinaison retenue.La concentration de la suspension mère est calculée en tenant compte des dilutions effectuées.

Dans l'exemple considéré la lecture des tables donne un nombre probable N de 4,5cellules par mL de la dilution 10 - 2.

D'une façon générale, on peut écrire que la concentration de cellules par ml de suspensionmère est :

C = N/valeur de la dilution correspondant au premier chiffre de la combinaison retenue

2.2 - La mesure de la masse* Soit par détermination du poids sec, en pesant un volume donné de suspension, aprèsdessication dans des conditions précises ;* Soit par dosage de l'azote total de la suspension par la méthode classique du KJEDAHL car ilexiste un rapport constant (14%) entre la teneur en azote total et le poids sec ;



* Soit par turbidimétrie, qui consiste à mesurer le trouble bactérien à l'aide d'unspectrophotomètre, la densité optique étant proportionnelle à la masse de bactéries pour desconcentrations inférieures à 10 7 bactéries/ml.

2.3- La mesure de l'activitéOn choisit une modification spécifique produite sur l'un des constituants du milieu, par

exemple l'acidification du glucose. Il y a un rapport entre la quantité d'acide produite et la massemicrobienne.

2.4- Courbe de croissanceQuelle que soit la technique de mesure utilisée, on obtient en milieu non renouvélé

(culture en bacth), une courbe de croissance représentée schématiquement comme ci-dessus.

Taux de croissance

log DO Temps

Temps

A B C D E F

Signalons tout de suite que la croissance d'une bactérie, placée dans des conditionsidéales de culture, est définie par 2 paramètres :* le temps de génération, qui est l'intervalle de temps séparant 2 divisions successives d'unecellule ;* le taux de croissance, qui est le nombre de générations (divisions) par unité de temps.

Si pendant le temps t, il se produit n générations, on peut écrire :temps de génération G = t / n ;taux de croissance µ = n / t = 1 / G.



D'après la courbe de croissance on a plusieurs phases:

Phase Taux de croissanceA de latence, période d'adaptation des germes, au cours de laquelle ils

élaborent des enzymesnul

B d'accélération augmente

Cde croissance exponentielle ou logarithmique au cours de laquelleles germes se multiplient et leur nombre augmente selon uneprogression logarithmique

constant etmaximum

D de diminution du taux de croissance, le milieu devenant de moinsen moins favorable

diminue

Estationnaire, au cours de laquelle le nombre de cellules viables resteconstant (équilibre entre le nombre de cellules provenant de lamultiplication et le nombre de cellules disparaissant par autolyse)

nul

Fde déclin ou de décroissance, au cours de laquelle les cellules ne sedivisent plus ; beaucoup d'entre elles meurent et ne sont pascompensées par la formation de nouvelles.

négatif

* Phase de latenceQuand les micro-organismes sont introduits dans un milieu de culture frais, il n’y a pas

d’augmentation immédiate du nombre ou de la masse cellulaire. Il faut attendre 2 à 3 heures pourconstater un trouble. Cette période d’adaptation est dite phase de latence. La durée de la phase delatence varie en fonction :- du germe étudié, ce facteur étant d’ordre génétique ;- de l’âge du germe : la phase de latence peut être extrêmement courte lorsqu’on utilise descellules jeunes ; elle est par contre longue ou prolongée pour des cellules âgées récoltées enphase stationnaire ou en phase de déclin. Pour cette dernière catégorie, les cellules peuvent êtredépourvues d’ATP, de cofacteurs essentiels et de ribosomes. Ces cellules peuvent avoir étéendommagées et requérir un certain temps de réparation ;- de la taille de l’inoculum de départ N0 : plus N0 sera élevé, plus la phase de latence seraréduite;- de la composition du milieu : une culture jeune non refroidie, en phase exponentielle,transférée dans un milieu frais de même composition, se multiplie intensément sans aucunephase de latence. En revanche si les constituants nutritifs du nouveau milieu sont différents, lescellules doivent s’adapter et on observe à nouveau une phase de latence, car les cellules ontbesoin de nouvelles enzymes pour utiliser les nouveaux nutriments.



* Phase d’accélération : les microorganismes se multiplient de plus en plus vite et le taux decroissance augmente.

* Phase de croissance exponentielle ou logarithmiquePendant cette phase de croissance exponentielle, chaque micro-organisme se divise à

intervalles de temps constants. On peut écrire que la vitesse de croissance est :

dNt

dt Nt

, soitdNt = µNtdt Avec N= concentration cellulaire, µ= vitesse spécifique de croissance,fonction du germe et des conditions de cultureL’intégration de cette équation donne :Si µ= constante, on peut écrire N= N0eµt

D’où LogNt = LogN0 + µt,N0 = nombre de micro-organismes au temps t = 0 ;Nt = nombre de micro-organismes au temps t ;µ = vitesse spécifique de croissance, appelée aussi taux népérien de croissance dépendant dugerme et des conditions de culture.

Le temps de génération étant l’intervalle de temps au bout duquel la population double,soit N0, le nombre de microorganismes au temps t0 on aura :- après 1 génération : N1 = 2 N0

- après 2 générations : N2 = 2 N1 = 2 x 2 N0 = 22 N0

- après n générations : Nn = 2n N0

Cette équation peut être exprimée en fonction du taux horaire de croissance (r =nt , d’où

n = rt), soit Nn = 2rt N0

D’où log Nn = rtlog 2 + log N0, soit r =

logNn logN0

t log2

G =

tlog2logNn logN0

Ces équations sont applicables lorsque la phase de latence est nulle. Dans le cas contraireon prendra deux valeurs de logN (logN1 et logN2) en phase exponentielle et on écrira :

r =

logN2 logN1

(t2 - t1) log2 1G



Si N1 = N0 et N2 = N on aura : r =

logN logN0

t log2 et µ = t0logNlogN

r (taux horaire de croissance) et µ (taux népérien de croissance) diffèrent donc d’un facteur log2 :µ = r log2.

* Phase stationnaireLa phase exponentielle ne dure que quelques heures. La croissance de la population finit

par s’arrêter et la courbe de croissance de la population devient horizontale. La phasestationnaire est habituellement atteinte par les bactéries à une concentration d’environ 10 9

cellules/ml.La phase stationnaire peut résulter d’un équilibre entre division et mort cellulaire, ou bien

la population peut simplement cesser de se diviser et rester métaboliquement active.Les populations microbiennes entrent en phase stationnaire pour plusieurs raisons :

- la limitation en éléments nutritifs ou épuisement du milieu ;- les micro-organismes aérobies sont souvent limités par la disponibilité en oxygène ;- l’accumulation de déchets toxiques ou l’évolution défavorable de l’environnement physique(pH) ; exemple des streptocoques et autres bactéries lactiques qui entraînent une inhibition de lacroissance par abaissement du pH.

* Phase de déclin ou de mortalitéL’épuisement en nutriments et l’accumulation de déchets toxiques conduisent à une

diminution du nombre total de cellules viables, caractéristique de la phase de mortalité. La mortd’une population microbienne comme sa croissance durant la phase exponentielle, esthabituellement logarithmique. Bien que la population bactérienne meure de façon logarithmique,le taux de mortalité peut diminuer après une réduction drastique de la population. Ceci est dû à lasurvie de cellules particulièrement résistantes qui peut amorcer une nouvelle phase demultiplication aux dépens des substances libérées par lyse (cannibalisme). Ce phénomène estconnu sous le nom de croissance cryptique.

REMARQUES* Dans un milieu synthétique contenant un mélange de deux substrats carbonés, on peut observerun courbe anormale diphasique comme si deux croissances se succédaient. Ce phénomène a étédécrit par MONOD sous le nom de diauxie



A

B

CLog N

t

Phénomène de diauxie chez E. coli cultivé sur un milieuavec fructose et arabinose comme seule source de carboneA : utilisation du fructose seulB : phase d'adaptation à l'arabinoseC : utilisation de l'arabinose

La même double croissance est obtenue avec le mélange glucose-sorbitol. On peut ainsiclasser les sucres en deux catégories :- G1 : glucose, saccharose, fructose, mannose ;- G2 : maltose, sorbitol, arabinose, inositol.

Dans une population bactérienne, les cellules, qui ont des potentialités différentes (ce qui setraduit par des temps de latence différents), ne se divisent pas toutes au même moment. Si lacroissance était synchrone, la courbe montrerait des paliers successifs exprimant les doublementsde la population.

La synchronisation de la croissance peut être obtenue par :- filtration sélective, en récoltant les plus petites cellules, les premières apparues, et en lesinoculant sur un milieu neuf ;- choc thermique, les bactéries étant incubées alternativement à des températures contrastées (parexemple + 25 °C et + 37 °C) sur un milieu favorable.

3- Croissance sur milieu renouvelé : croissance continueIl est possible de cultiver des micro-organismes dans un système ouvert où les conditions

de cultures sont maintenues constantes par l’apport continu de nutriments et l’élimination desdéchets. Ces conditions sont réalisées au laboratoire dans des systèmes de culture continue oùune population microbienne peut être maintenue longtemps en phase exponentielle de croissanceet à une concentration constante de la biomasse.Deux principaux types de culture continue sont généralement utilisés : le chémostat et leturbidostat.

- Le chémostatUn chémostat est construit de telle façon que le milieu stérile soit introduit dans la

chambre de culture à la même vitesse que le milieu contenant les micro-organismes en est



éliminé. Le milieu de culture d’un chémostat contient un élément nutritif essentiel en quantitélimitante, ce qui fait que la vitesse de croissance est déterminée par la vitesse à laquelle le milieufrais est ajouté dans la chambre de culture. La vitesse d’échange du nutriment est exprimée sousforme de vitesse ou taux de dilutionD = f/V, avec f = vitesse d’écoulement (ml/h) ; V = volume du récipient (ml)

Dans un tel système où la culture microbienne reste sous un volume constant (Vml) touten recevant un débit de milieu neuf, la concentration cellulaire varie en fonction du taux decroissance de l’espèce.dNdt ( D)N

N = concentration cellulaire initiale ; µ = taux de croissance ;Dans le cas où µ est maximale et constante, on peut considérer 3 éventualités :

* µmax < D : l’effet de la dilution est supérieur à l’incidence de la croissance. Dans ces

conditions, la population tend vers 0, car

dNdt 0

* µmax = D : le taux de dilution est calculé pour que la population reste constante :

dNdt 0

;

* µmax > D : l’effet de dilution est moins important que celui de la croissance :

dNdt 0

; lapopulation tend à augmenter ; elle peut être autorégulée dans des appareils comme le bactogèneimaginé par MONOD ou le chémostat de NOVICK et SZLARD.

- Le turbidostatCe dispositif équipé d’une cellule photoélectrique afin de mesurer l’absorbance ou la

turbidité dans la chambre de culture, assure une culture continue à un taux de croissancemaximal et une population constante.

Le turbidostat diffère du chémostat de plusieurs façons. La vitesse de dilution dans unturbidostat varie au lieu de rester constante et le milieu de culture ne contient pas de nutrimentlimitant. Le turbidostat fonctionne mieux à des vitesses de dilution élevées, alors que lechémostat est plus stable et plus efficace à des vitesses de dilution réduites

Les systèmes de cultures continues sont très utiles car ils produisent une quantitéconstante de cellules en phase exponentielle tout en se multipliant à une vitesse connue. Ilspermettent l’étude de la croissance microbienne à des concentrations en nutriments très faibles,proches de celles présentes dans un environnement naturel. Ces systèmes sont essentiels à larecherche dans de nombreux domaines.



4- Rendements la croissance et les effets d’un élément nutritif limitantQuand la croissance microbienne est limitée par la faible concentration d’un élément

nutritif essentiel, la croissance nette finale ou rendement en cellules, augmente avec la quantitéinitiale de nutriment limitant. C’est la base des dosages microbiologiques des vitamines et desfacteurs de croissance. La vitesse de croissance augmente aussi avec la concentration en facteursnutritifs, mais d’une façon hyperbolique. A un niveau de nutriments suffisamment élevé, lavitesse de croissance n’augmente plus d’avantage avec l’élévation de concentration ennutriments.

La masse microbienne produite à partir d’un nutriment s’exprime quantitativementcomme le rendement de croissance (Y)

Y =masse de micro-organismes formés

masse de substrat consommé

La valeur de Y est souvent donné en grammes de cellules formées par gramme desubstrat utilisé ou comme le rendement de croissance molaire (grammes de cellules par mole denutriment consommé). C’est un indice de l’efficacité de conversion des éléments nutritifs enmatériel cellulaire. Les micro-organismes aérobies en milieu riche, peuvent assimiler de 20 à50% des sucres absorbés. En milieu dilué, quelques bactéries semblent être capablesd’augmenter leur efficacité et assimilent jusq’à 80 % des sucres absorbés.

. Quand les bactéries fermentantes se développent dans un milieu riche, elles utilisent lafermentation des glucides uniquement pour produire de l’énergie. L’efficacité d’utilisation del’ATP pendant la fermentation se traduit en valeur de YATP

YATP =grammes de cellules formées

moles d’ATP produites

YATP = 10,5 g mol-1 chez la plupart des bactéries aux concentrations de sucres élevées contre unevaleur théorique de 32. Une grande partie de l’ATP est en effet consommé dans le transport, letravail mécanique et probablement d’autres voies.

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TABLE DES MATIERESbchgene.c.b.f.unblog.fr/files/2014/08/cm-microbio-gle.pdf · probiotique = protège contre bact patho) vibrion spirille extrémités effilées en fuseau (Fusobacrerium