EFFETS DE L’EXPOSITION CHRONIQUE AU PLOMB …Département de biologie Laboratoire de Biochimie appliquée THESE DE DOCTORAT D’ETAT Es - Science Option : BIOCHIMIE APPLIQUEE EFFETS

Département de biologie

Laboratoire de Biochimie appliquée

THESE DE DOCTORAT D’ETAT Es - Science Option : BIOCHIMIE APPLIQUEE

EFFETS DE L’EXPOSITION CHRONIQUE AU PLOMB SUR LE SYSTEME REPRODUCTEUR ET L’AXE HYPOTHALAMO-HYPOPHYSAIRE

CHEZ LE RAT MÂLE WISTAR. Etude histologique et biochimique.

Présenté par: Melle AIT HAMADOUCHE NADIA

Devant le jury: Président : Pr. AOUES. A (Université d’Es-senia Oran)

Examinateurs: Pr. EL KEBIR F.Z (Université d’Es-senia Oran) Pr. GAMRANI H (Université de Marrakech Maroc) Dr. BENDAHMANE M (Université de Djillali Liabess SBA) Directeur de thèse : Pr. SLIMANI M (Université d’Es-senia Oran)

A Ceux Qui Sont Partis Trot Tôt,

A la mémoire de mon père, A la mémoire de mon beau frère LAHCENE.

A Ma Mère Avec tout mon amour pour ton soutien et tes encouragements. J’espère rester à la hauteur de tes espoirs. Ta bonté n’a égal que ta sagesse. Que Dieu te protège et t’accorde santé et longue vie.

A Mes Frères et Sœurs Vous êtes toujours là pour moi. Avec toute mon affection.

A Mes belles Sœurs

Avec toute ma reconnaissance pour votre soutien moral et vos encouragements.

A Mes Neveux et Nièces Avec tout l’amour que je vous porte.

A Ceux Qui Me Manque.

Liste des figures

Figure 1 : Rôle des propriétés physico-chimiques du plomb dans sa biodisponibilité………………………… 10 Figure 2 : Biocinétique des métaux lourds après contamination interne………………………………………. 22 Figure 3 : Conséquence de l’augmentation des apports en plomb sur la quantité disponible dans les

organes………………………………………………………………………………………………. 24 Figure 4 : Transfert des métaux lourds après ingestion et leurs excrétions………………………………………27 Figure 5 : Photographie de la cavité abdominale d’un rat mâle montrant une partie des organes composant le

système uro-génital…………………………………………………………………………………....41 Figure 6 : Testicule et épididyme du rat………………………………………………………………………….41 Figure 7 : Testicule de rat en coupe transversale colorée à l’hématoxyline-éosine……………………………...43 Figure 8 : Coupe histologique du testicule montrant des sections de tubes séminifères et un espace interstitiel

occupé par des amas de cellules de Leydig (x1700)……………………………..…………………...44 Figure 9 : Phases de la spermatogenèse chez le rat et types de cellules germinales concernés………………….47 Figure 10 : Renouvellement et multiplication des spermatogonies………………………………………………48 Figure 11: Stades de l’épithélium séminifère chez le rat………………………………………………………...50 Figure 12 : Stades de l’épithélium séminifère chez le rat………………………………………………………..51 Figure 13 : Les ondes spermatogénétiques chez le rat…………………………………………………………...54 Figure 14 : Structure d’une cellule de Sertoli de rat au stade V du cycle de l’épithélium séminifère………..….55 Figure 15: Photographie obtenue par microscopie électronique montrant le noyau, le nucléole et une partie du cytoplasme d’une cellule de Sertoli.........................................................................................................................55 Figure 16 : Mise en évidence de la barrière hémato-testiculaire. Un traceur (représenté en rouge) injecté dans la

circulation sanguine permet de révéler le compartiment basal du tube séminifère.57 Figure 17 : Coupe de testicule sur laquelle figure l’espace interstitiel situé entre les tubes séminifères………...62 Figure 18 : Schéma en vue dorsale de l’appareil génital mâle..........................................................................….64 Figure 19: Mécanismes impliqués dans l’axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique…………………………..66 Figure 20: Le stress oxydant est caractérisé par un déséquilibre entre la production des espèces réactives de

l’oxygène et les capacités antioxydantes de l’organisme (enzymes antioxydantes et systèmes antioxydants non enzymatiques)...........................................................................................................69

Figure 21 : Mécanisme en chaîne de la peroxydation des acides gras polyinsaturés et nature des produits terminaux formés………………………………………………………………………………...........73

Figure 22. Lésions de l’ADN formées par attaque radicalaire. Figure centrale : mécanismes généraux. Cadres latéraux : exemples de bases modifiées..........................................................................................…...75

Figure 23 : Systèmes enzymatiques impliqués dans la défense antioxydante cellulaire………………………....81 Figure 24 : Technique de gavage des rats………………………………………………………………………..84 Figure 25 : Diagramme récapitulant le protocole expérimental………………………………………………….87 Figure 26 : Méthode de mesure des organes sexuels prélevés………………………………………...…………88 Figure 27: Procédures de microdissection de l’encéphale……………………………………………………….95 Figure 28 : Méthode de dissection et mesure de la taille du cerveau de rat..................................................…..95 Figure 29 : Prélèvement de l’hypophyse et l’hypothalamus…………………………………………………......96 Figure 30 : Synoptique du protocole de minéralisation et de dosage en Spectrophotométrie d’Absorption

Atomique à flamme (S. A. A af)…………………………………………………………………...…99 Figure 31: Cellule de Thoma observée au microscope au grossissement x100……….………………………..102 Figure 32 : Cellule de Thoma observée au microscope au grossissement x400………………………………..102 Figure 33 : Comptage cellulaire à l’aide d’une cellule de Thoma…………………………………… ..............104 Figure 34: Effet de l’acétate de plomb sur l’évolution pondérale chez les rats exposés au plomb pendant 12

semaines comparés aux témoins……………………………………………………………………..114

Figure 35: Effet du plomb sur le gain corporel moyen chez les rats exposés au plomb………………………..114 Figure 36 : Chute de poils chez les rats intoxiqués……………………………………………………...……...115 Figure 37 : L’effet du plomb sur le poids relatif des organes sexuels…………………………………………..118 Figure 38 : Effet du plomb sur la taille des organes sexuels………………………………………………...….119 Figure 39 : Structure histologique des testicules de rats témoins…………………………………………….....121 Figure 40 : Structure histologique des testicules de rats intoxiqués à 250mg/l durant 12 semaines…………....121 Figure 41 : Structure histologique des testicules de rats intoxiqués à 500 mg/l durant 12 semaines…………..121 Figure 42 : Structure histologique d’épididyme de rats témoins………………………………………………..124 Figure 43 : Structure histologique d’épididyme de rats intoxiqués à 250 mg/l durant 12 semaines…………..124 Figure 44 : Structure histologique d’épididyme de rats intoxiqués à 500 mg/l durant 12 semaines…………..124 Figure 45 : Structure histologique de la vésicule séminale de rats témoins………………………….................126

Figure 46 : Structure histologique de la vésicule séminale de rats intoxiqués à 250 mg/l……………………...126 Figure 47: Structure histologique de la vésicule séminale de rats intoxiqués à 500 mg/l………………………126 Figure 48 : Structure histologique de la prostate de rats témoins……………………………………………….128 Figure 49: Structure histologique de la prostate de rats intoxiqués à 250 mg/l...................................................128 Figure 50 : Structure histologique de la prostate de rats intoxiqués à 500 mg/l………………………………..128 Figure 51 : Structure histologique de l’hypophyse de rats témoins……………………………………………130 Figure 52: Structure histologique de l’hypophyse de rats intoxiqués à 250 mg/l………………………………130 Figure 53: Structure histologique de la prostate de rats intoxiqués à 500 mg/l………………………………...130 Figure 54: Structure histologique de l’hypothalamus de rats témoins………………………………………….132 Figure 55 : Structure histologique de l’hypothalamus de rats intoxiqués à 250 mg/l…………………………..132 Figure 56: Structure histologique de l’hypothalamus de rats intoxiqués à 500 mg/l…………………………...132 Figure 57: Effet du plomb sur le poids absolu de l’hypothalamus et l’hypophyse……………………………..134 Figure 58: Etude histochimique du testicule témoins. Aucun dépôt de plomb (x100)…………………………136 Figure 59: Etudes histochimique des testicules de rats intoxiqués au plomb. Le dépôt du plomb (Dp) est très

marqué (x 100)………………………………………………………………………………………136 Figure 60: L’effet du plomb sur le taux du plomb sanguin…………………………………………………….141 Figure 61: L’effet de l’intoxication au plomb sur sa répartition tissulaire……………………………………..141 Figure 62: pourcentage des spermatozoïdes vivants chez les animaux des différents groupes………………...145 Figure 63: Pourcentage des spermatozoïdes anormaux chez les animaux des différents groupes……………..145 Figure 64 : Effet du plomb dur la teneur plasmatique de la vitamine C………………………………………..153 Figure 65 : L’activité de la LDH chez les rats témoins et les rats intoxiqués au plomb………………………..153 Figure 66: L’effet du plomb sur la concentration tissulaire de la vitamine C testiculaire……………………...155 Figure 67 : L’effet du plomb sur la concentration tissulaire de la vitamine C épididymaire…………………...155 Figure 68 : Taux des MDA testiculaires (µmoles de MDA/g de tissu) chez les rats témoins et les rats exposés au

plomb……………………………………………………………………………………………..157 Figure 69 : Taux des MDA hypophysaire (µmoles de MDA/g de tissu) chez les rats témoins et les rats exposés

au plomb………………………………………………………………………………………….157 Figure 70 : Activité catalasique testiculaire (µmolesH2O2/min/mg protéines) chez les rats témoins et les rats

intoxiqués…………………………………………………………………………………………159 Figure 71 : Activité catalasique hypophysaire (µmolesH2O2/min/mg protéines) chez les rats témoins et les rats

intoxiqués…………………………………………………………………………………………159 Figure 72 : Activité de la SOD testiculaire (unité SOD/mg protéines) chez les rats témoins et

les rats intoxiqués…………………………………………………………………………………161 Figure 73 : Activité de la SOD hypophysaire (unité SOD/mg protéines) chez les rats témoins et lest rats

intoxiqués…………………………………………………………………………………………161 Figure 74 : L’effet du plomb administré par gavage sur la concentration des hormones sexuelles chez les rats

témoins et les rats intoxiqués……………………………………………………………………..163

Liste des tableaux Tableau 1 : Risques sanitaires associés aux métaux…………………………………..............................4 Tableau 2 : Autres usages du plomb…………………………………………………..............................6

Tableau 3 : Liste des principaux minéraux et composés de plomb…………………………………...…8 Tableau 4 : Propriétés physico-chimique de l’élément de plomb…………………………......................9 Tableau 5 : Source de pollution au plomb dans l’environnement………………………………………12 Tableau 6 : Valeurs limites pour l’alimentation humaine………………………………………………16

Tableau 7 : Composition du régime d’entretien ONAB (régime standard)….........................................83 Tableau 8: protocole de circulation et d’inclusion...……………………………………………………90 Tableau 9 : Batterie de coloration HEMALIN-EOSINE.........................................................................93 Tableau10 : Effet du plomb sur la fertilité des rats mâles…………………………………………….117 Tableau 11 : Effet du plomb sur le diamètre et l’épaisseur des tubes séminifères chez le rat……….122 Tableau 11: Effet du plomb sur le poids absolu et la taille du cerveau chez les différents groupes de

rats……………………………………………………………………………………….134 Tableau 12 : Effet de l’intoxication au plomb sur les paramètres séminologiques…………………...143

Tableau13 : Effet du plomb sur les différents paramètres biochimiques……………………………..151

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE

CHAPITRE I – ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Problématique du plomb dans l’environnement…………………………………………………………....4 1. 1. HISTORIQUE…………………………………………………………………………………....5

1. 1. 1. L’utilisation du plomb ………………………………………………………..……....5 1. 1. 2. Propriétés physico-chimiques du plomb………………..………………………….…....7

1. 2. Les sources d’exposition …………………………………………………………………………11 1. 2. 1. Sources d’exposition liées aux activités industrielles ……………………………….....11 1. 2. 2. Sources d’exposition liées aux activités domestiques et mode d’alimentation…….......11

1. 3. Le plomb dans les sols et les végétaux……………………………………………………………13 1. 3. 1. Dans les sols……………………...……………………………………………………..13 1. 3. 2. Dans les végétaux ………………………………..…………………………………......14

1. 4. Biocinétique du plomb après une contamination interne………………...…………...……....17 1. 4. 1. La voie pulmonaire…………………………...………...............................................17

1. 4. 2. L’absorption digestive….…………………………………………………………….18 1. 4. 3. Absorption cutanée……...…………………………………………………………….....21

1. 5. Transport sanguin……………………………………………………………………………..….….23 1. 5. 1. Distribution dans l'organisme…………………………………………………………....25

1. 5. 2. Excrétion du plomb…………………………………………………………………….…26 1. 6. Principaux effets toxiques du plomb sur la santé humaine………………....................................28

1. 6. 1. Toxicologie aiguë………………………………………………………………………....28 1. 6. 2. Toxicologie chronique…………………………………………………..………………...29

1. 6. 2. 1. Effets sur le système nerveux central……………………………………..……….29 1. 6. 2. 2. Effets sur le système nerveux périphérique……………………………………….31 1. 6. 2. 3. Effets hématologiques……………………………………………...………….....32 1. 6. 2. 4. Effets rénaux………………………………………………………...…………...33 1. 6. 2. 5. Effets sur le système cardio-vasculaire………………………………..………....34

1. 6. 2. 6. Autres effets………………………………………………………………….…...35 1. 7. Indicateurs biologiques………………………………………………………………………..........…..36

1.7. 1. La plombémie….....................................................................................................................37 1. 7. 2. La plomburie…………………………………………………………...…………………...37

1. 7. 3. Mesure du plomb dans les cheveux……………………………………………….............37 1. 7. 4. Mesure du plomb dans les dents……………………………………………………….…..38 1. 7. 5. Mesure du plomb dans les os…………………………………………………………….....38

1. 8. Effets sur la reproduction et le développement……………………………………………………….....39 2. Anatomie et physiologie de la reproduction chez le rat mâle……………………………………………….....40

2.1. Les testicules……………………………………………………………………………………………......40 2. 2. Les tubes séminifères………………………………………………………………………………….…..42 2. 3. Les espaces interstitiels…………………………………………………………………………………....45 2. 4. Le liquide des compartiments intratesticulaire……………………………………………………….…45

2. 5. La spermatogenèse…………………………………………………………………………………….…...46 2. 5. 1. Phases de la spermatogenèse………………………………………………………………………...46 2. 5. 2. Stades de l’épithélium séminifère…………………………………………………………………...49

2. 5. 2. 1. Cellules germinales associées à la phase proliférative……………………………….....49 2. 5. 2. 2. Cellules germinales associées à la phase méiotique………………………………….....49 2. 5. 2. 3. Cellules germinales associées à la spermiogenèse………………………………............52

2. 5. 3. Initiation de la spermatogenèse……………………………………………………………….….....53 2. 5. 4. La cellule de Sertoli……………………………………………………………………….…….…..54

2. 5. 4. 1. Fonctions de la cellule de Sertoli…………………………………………………..….....56 2. 5. 4. 2. Mise en place de la barrière hémato-testiculaire……………………………………..…56 2. 5. 4. 3. Activité de phagocytose……………………………………………………………........58 2. 5. 4. 4. Activité de sécrétion……………………………………………………………….…….58

2. 5. 4. 4. 1. Fluide testiculaire…………………………………………………………….58 2. 5. 4. 4. 2. Nutriments……………………………………………………………….…...59 2. 5. 4. 4. 3. Protéines et facteurs de croissance…………………………………………...59

2. 5. 5. Cycle de la cellule de Sertoli………………………………………………………………………..59

Table des matières

2. 5. 5. 1. Prolifération des cellules de Sertoli………………………………………………….....60 2. 5. 5 2. Etablissement du ratio cellules germinales / cellules de Sertoli……………………...61

2. 5. 6. Les espaces interstitiels………………………………………………………………………….....61 2. 5. 7. Les glandes annexes……………………………………………………………………………….62

2. 6. Régulation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique…………………………………………....64 3. Toxicologie à l’échelle moléculaire……………………………………………………………………………....68

3. 1. Effets sur le statut oxydatif cellulaire et ses conséquences…………………………………….......68 3. 1. 1. Conséquences du stress oxydant sur les protéines………………………………………...71 3. 1. 2. Conséquences du stress oxydant sur les membranes biologiques………………………....72 3. 1. 3. Conséquences du stress oxydant sur le matériel génétique……………………………..…74

3. 1. 3. 1. Les coupures de brins………………………………………………………....74 3. 1. 3. 1. 1. Les coupures simple brin (CSB)…………………………………..74 3. 1 .3. 1. 2. Les coupures double brins (CDB)…………………………….…..76

3. 1. 3. 2. Les bases modifiées……………………………………………………….…..76 3. 1. 3. 3. Pontages ADN-protéines…………………………………………………......76 3. 1. 3. 4. Altération des sucres…………………………....…………….……………...77

3. 1. 4. Conséquences du stress oxydant sur la reproduction…………………………………..….77 3. 2. Biomarqueurs de stress oxydant…………………………………………………………….……...77

3. 2. 1. L’activité superoxyde dismutase……………………………………………………….….79 3. 2. 2. L’activité catalase……………………………………………………………………...….79 3. 2. 3. L’activité glutathion peroxydase……………………………………………………….....79 3. 2. 4. Le glutathion, un antioxydant non enzymatique…………………………………...….…79

3. 3. Le système antioxydant cellulaire…………………………………………………………………...80

CHAPITRE II – MATERIELS ET METHODES

1. Matériel biologique ………………..…………………………………………………………….………...82 2. Méthodes………………………………………………………………………………………….………...82

2.1. L’exposition au plomb……………………………………………………………...………….……..82 2.2. Technique de gavage chez le rat……..…………………………………………………...….............84

2. 3. Test de fertilité……………………………………………………………………………………...…85 2.4. Sacrifice des rats……………………………………………………………………………………….85

2. 5. Observation macroscopique……………………………………………………….…….…….……..86 2.6. Etude histologique des organes …….…………………………………………………….…………..86

2.6. 1. Histologie classique (topographique)…………………………………………………….....89 2. 6. 1. 1. Fixation………………………………………………………………………...89 2. 6. 1. 2. Inclusion (circulation)…………………………….…………………………....89

2. 6. 1. 3. Coupe, étalement des coupes et coloration……………………………………..91 2. 6. 2. Histologie du cerveau (hypothalamus et hypophyse)……………………….………….....94

2. 7. La mise en évidence du plomb dans les testicules par technique histochimique………….……...97 2. 8. Mise en évidence du phénomène d’apoptose au niveau des testicules……………………..……...97

2.9. Dosage du plomb dans les organes prélevés ….te et vésicule séminale)……………………...….98 2. 9. 1. Minéralisation des organes ………………………………………………………………...98

2. 9. 1. 1. Principe………………………………………………………………..….......100 2. 9. 1. 2. Mode opératoire……………………………………………………..………..100 2. 9. 1. 3. Dosage spectrophotométrique (S. A. A à flamme)…………………….......…100

2.9. 2. Dosage du plomb dans le sang (plombémie)…………………………...…………...….....101 2. 9. 2. 1. Gamme étalon…………………………………………………………....…...101

2. 10. Etude du spermogramme………………………………………………………………………......101 2. 10. 1. Comptage des spermatozoïdes………………………………………………..…...…......101 2. 10. 2. Evaluation de la qualité des spermatozoïdes……………………………….…………...105

2.10.2.1. Test de motilité des spermatozoïde....................................................................105 2.10. 2. 2. Evaluation de la densité des spermatozoïdes.. ……………………………....106 2.10. 2. 3. Détermination du pourcentage des spermatozoïdes vivants……………..…106

2.10. 2. 4. Détermination des anomalies……………………………………………..….106 2.11. Evaluation des paramètres biochimiques……..….……………………………………………..…107

2. 11. 1. Dosage du Fer…………………………………………………………………….………107

Table des matières

2.11. 2. Dosage du magnésium…………………………………………….……..…………..…......107 2. 11. 3. Dosage de l’albumine…………………………………………………….….......................107 2. 11. 4. Dosage du calcium…………………………………………………………………….........108 2. 11. 5. Dosage de la phosphatase alcaline (ALP)………………………………………………......108 2. 11. 6. Dosage du cholestérol total dans du plasma……………………………...…………….......108 2. 11. 7. Dosage de la vitamine C (l’acide ascorbique) dans le plasma……………... ………...........109 2. 11. 8. Dosage de l’activité de lactate déshydrogénase (LDH) testiculaire ……………...……......109 2. 11. 9. Dosage de la vitamine C testiculaire et épididymaire…….………….………………..........109

2. 12. Evaluation du statut antioxydant……………………………………………………………..…………...110 2. 12. 1. Produits de peroxydation lipidiques au niveau des testicules et l’hypophyse……….…….....110 2.12. 2. Catalase au niveau des testicules et l’hypophyse....110

2. 12. 3. Superoxyde dusmutase au niveau des testicules et hypophyse.……………….……….…......111 2. 13. Dosage hormonal des hormones sexuelles (testostérone, FSH et LH………………………………….......111 2.14. Analyse statistique des résultats………………………………………………………………….....…….......111 CHAPITRE III RESULTATS

1. Effet du plomb sur l’évolution pondérale…………………………………………………………...........113 2. Effet du plomb sur la fertilité des rats mâles……………………………………………………….........116

3. Effet du plomb sur le poids relatif et la taille des organes sexuels ………………………………….….116 4. Impact du plomb sur l’architecture histologiques des organes………..………………….…….............120

4. 1. Structure des testicules………………………………………………………………..……….......120 4. 2. Structure de l’épididyme……………………………………………………………………..........123 4. 3. Structure des vésicules séminales……………………………………………….............................125 4. 4. Structure de la prostate………………………………………………………………….…….......127

4. 5. Effet du plomb sur les structures histologiques cérébrales………………………..........................129 4. 5. 1. Effet sur la structure de l’hypophyse………………………………………...........129 4. 5. 2. Effet sur la structure de l’hypothalamus…………………………..........................131

5. Mise en évidence du plomb par histochimie au niveau des testicules………...……………………...........135 6. Mise à l’évidence du phénomène d’apoptose au niveau testiculaire……………………………….….......137 7. Toxicocinétique du plomb……………………………………………………………...…………….............139

7. 1. Dosage du plomb dans le sang (PbS) ou plombémie…………………………………………..…..…139 7. 2. Dosage du plomb tissulaire (cerveau et les organes sexuels) …………………..…………....….........139

8. Etude du spermogramme (spermocytogramme…………………………………………………………….142 8. 1. Effet du plomb sur le nombre, la motilité et la densité des spermatozoïde…..…...........……....……..142 8. 2. Effet du plomb sur le taux des spermatozoïdes vivants..………………………….……………...…...144 8. 3. Effet du plomb sur l’analyse morphologique des spermatozoïdes...………………………….….…...144

8. 3. 1. Anomalies de la tête des spermatozoïdes………………………………………………..........146 8. 3. 2. Anomalies du flagelle des spermatozoïdes…………………………………………................148

9. Effet du plomb sur les paramètres biochimiques…………………………………………………...….........149 10. Effet du plomb sur la vitamine C plasmatique…………………………………………………….…....…..152 11. L’effet du plomb sur l’activité du lactate déshydrogénase (LDH) testiculaire……………………….…...152 12. L’effet du plomb sur la teneur en vitamine C testiculaire et épididymaire………………………........……....154

13. 1. Marqueurs de la peroxydation des lipides (Acide malondialdéhyde) (MDA)…………………...........155 13. 2. Effet sur l’activité catalasique testiculaire…………………………………………………….…........157

13. 3. Impact sur l’activité de la SOD testiculaire et hypophysaire…………………..……...........................160 14. Evaluation du taux des hormones sexuelles (Testostérone, FSH et LH)……………………….…….………..162

CHAPITRE IV DISCUSSION

1. Effet du plomb sur la croissance pondérale…………………………………………………………...163 2. Effet du plomb sur les structures Histologiques des organes (testicules, épididyme, 3. vésicules séminales, prostate, hypophyse et hypothalamus)………………………………..………...165 4. La bioaccumulation du plomb à l’échelle tissulaire ……………………………………………….....168 5. Effet du plomb sur les paramètres biochimiques sanguins………………………………………….170

Table des matières

6. Evaluation du pouvoir pro-oxydant du plomb……………………………………………………..172 7. Evaluation de la fertilité des rats……………………………………………………………………177 7. Interaction du plomb avec l’axe hypothalamo-hypophysaire…………………………………….…179 CONCLUSION ET PERSPECTIVES………………………………………………………………........183 REFERNENCES BILIOGRAPHIQUES………………………………………………………………..187 ANEXES

Résumé

Le plomb constitue un des problèmes importants en matière de contamination de

l’environnement. La première conséquence de cette contamination est la diminution de la fertilité. Cette étude a été réalisée dans le but d’évaluer l’effet reprotoxique du plomb chez le rat mâle Wistar. Des jeunes rats mâles ont reçu pendant 12 semaines par gavage une eau supplémentée en acétate de plomb à raison de 250 mg/l et 500 mg/l.

Au terme des 12 semaines les résultats ont montré une baisse significative de la prise

alimentaire qui s’est traduite par une diminution significative du gain corporel moyen chez les rats intoxiqués. Ces résultats montrent que le plomb a provoqué un effet anorexigène ce qui justifie l’implication du plomb dans le système de transmission dopaminergique. Cette diminution de la prise alimentaire a engendré également des répercussions sur la croissance pilaire.

Dans le même contexte, l’exposition chronique au plomb a provoqué des effets délétères sur

la structure histologique des testicules induisant une diminution et absence totale des spermatozoïdes chez les rats intoxiqués à 250 mg/l et 500mg/l respectivement, des lacunes au sein de la paroi des tubes séminifères ce qui témoigne d’une dégénérescence des cellules de Sertoli et donc l’atteinte profonde de la spermatogenèse et de la spermiogenèse. L’analyse histologique a montré également au niveau des testicules une atrophie partielle du tissu interstitiel chez les rats traités à 250 mg/l et totale chez les traités à 500 mg/l, ce qui témoigne probablement de la dégénérescence des cellules de Leydig. Ces résultats confirment que le plomb est un élément spermicide. Les résultats également ont montré des altérations histopathologiques dans les organes accessoires (épididyme, vésicule séminale et prostate) et au niveau de l’hypophyse et l’hypothalamus. L’analyse macroscopique a montré une diminution significative dans le poids relatifs et la taille des différents organes.

Le dosage du plomb dans le sang a montré une plombémie significativement élevée chez les

rats traités. L’examen toxicocinétique a permis de montrer une hétérogénéité dans la distribution de cet élément au travers l’organe, le cerveau et les testicules constituent les principaux organes de stockage du plomb alors les autres organes (épididymes vésicules séminales et prostate) sont les structures qui concentrent le moins du plomb.

L’analyse du statut oxydatif dans les testicules et l’hypophyse a indiqué que le plomb

augmente significativement la peroxydation des lipides par augmentation de la concentration en MDA entrainant des altérations irréversibles de la membrane plasmatique, diminue l’activité des enzymes antioxydants (SOD et CAT) et provoque une baisse significative des antioxydants non enzymatiques (acide ascorbique) plasmatique et tissulaire ce qui confirme les effets pro-oxydants du plomb et la vulnérabilité des organes aux effets délétères de ce métal.

En revanche, les résultats des dosages biochimiques ont montré que le plomb a induit une

hypocalcémie, une hypomagnésémie, une hypoalbuminurie, une hypercholestérolémie, une diminution du fer total et une augmentation de l’activité de l’ALP. Le dérèglement de ces paramètres biochimiques dans le sang pourrait s’expliquer par une atteinte rénale, hépatique et un dysfonctionnement de la molle osseuse.

De même, l’effet délétère du plomb a été révélé sur l’axe hypothalamo-hypophysaire par

diminution significative de la concentration sérique des hormones sexuelles (testostérone, LH et FSH) et une diminution significative de LDH testiculaire qui reflète une dégénérescence testiculaire. Ces perturbations hormonales ont conduit à la diminution des paramètres spermiologiques (numération, mobilité, vitalité et morphologie) qui ont eux même ont aboutit à l’hypofertilité des rats intoxiqués à 250 mg/l et la stérilité des rats exposés à 500 mg/l qui sont confirmés par le test de fertilité (croisement intergroupes entre mâles traités et femelle non traités). Ces résultats confirment l’effet reprotoxique du plomb. Mots clés : Acétate de plomb, Fertilité, Hormones sexuelles, L’axe hypothalamo-hypophysaire, LDH, Plombémie, Rat, Spermiogramme, Stérilité, Stress oxydatif.

Introduction générale

Les problèmes posés par la dispersion de polluants dans l’environnement ont suscité

l’intérêt de la communauté scientifique depuis maintenant de nombreuses décennies. La prise

de conscience de la nécessité de préserver l’écosystème terrestres et aquatiques a ainsi fait

émerger certaines questions notamment celles du devenir de ces polluants dans

l’environnement ainsi que de leurs effets sur les communautés animales et végétales.

Parmi les contaminants majeurs de l’environnement, les métaux lourds posent de

sérieux problèmes écologiques, tant par le caractère ubiquiste de leur présence au sein de la

biosphère que par leur forte rémanence et leur toxicité élevée (Ponthieu et al., 2002 ;

Hinsiger et al., 2005).

Le plomb est l’un des métaux le plus anciennement utilisé par l’homme. L’histoire de

son utilisation est très fortement liée à l’histoire de l’homme moderne. On retrouve des traces

de son utilisation comme pigments dans des sépultures préhistoriques datées de plus de 40

000 ans avant JC ainsi que des bijoux en plomb vieux de plus de 6 500 ans. Le problème de la

contamination de l’environnement par le plomb date de son utilisation massive par les

civilisations antiques.

En effet, de par ses propriétés physico-chimiques intéressantes (malléabilité, ductilité,

bas point de fusion) et sa facilité d’extraction, les Egyptiens, les Grecs et les Romains l’ont

utilisé en très grandes quantités. Le plomb a ensuite connu une utilisation constante jusqu’à ce

que sa consommation explose au cours de la Révolution Industrielle (Bertrand., 2008).

Les effets délétères du plomb sur la santé humaine et animale ont été étudiés, dès le

XIXème siècle, et de façon importante dès le début du XXème siècle, notamment en raison

des pathologies induites par le plomb comme le saturnisme (Cobbett, 2000).

Malgré tout l’intérêt porté au plomb par la communauté scientifique, les mécanismes

d’action de ce métal, de même que ceux qui conditionnent sa pénétration dans l’organisme ou

dans les cellules, sont peu connus. Les chercheurs ont mis en avant la forte affinité du plomb

pour les molécules biologiques comme raison principale de sa toxicité.

1


Il a la particularité de se fixer aux membranes biologiques ainsi qu’aux membranes

cellulaires, ce qui expliquerait la perturbation des ultra-structures. Il présente également une

forte affinité pour les protéines qui possèdent des groupements thiols ou des cofacteurs

métalliques (métallo-enzymes) (Patra et al., 2004 ; Sharma et Dubey, 2005).

La médecine de la reproduction éprouve un intérêt grandissant pour l’environnement

en raison de l’altération régulière des paramètres spermatiques des donneurs fertiles dans les

payés industrialisés, ainsi que de l’incidence croissante de l’infertilité conjugale et des cancers

du testicule dans ces payés. La diminution des paramètres du sperme, observée depuis

plusieurs décade dans les payés industrialisés, a soulevé le problème du déclin de la fertilité

des hommes. La proportion de couples en âge de procréer consultant pour infertilité atteint 15

% dans ces payés ; la moitié d’entre eux présente une infertilité d’origine masculine (Perrin,

2006). Ces notions ont été corrélées à l’accroissement des concentrations et des variétés de

toxiques dans notre environnement.

L’interférence du plomb avec la reproduction a été rapportée il y a plus d’un siècle,

principalement chez l’homme exposés en milieu professionnel. Une forte exposition au plomb

est associé à un risque d’infertilité voire de stérilité (Karadeniz et Cemek, 2006 ; Meeker et

al., 2008 ; Allouche et al., 2009).

A la lumière de ces données, notre travail de recherche a porté sur deux volets :

Un volet bibliographique qui est en étroite relation avec le thème portant sur différents axes :

les sources de contamination du plomb, sa bioaccumulation dans les organes, ses

caractéristiques physico-chimiques, sa présence dans l’environnement et ses caractéristiques

toxicologiques avec une présentation générale sur l’appareil reproducteur du rat mâle et une

synthèse bibliographique du stress oxydant.

Le volet expérimental a pour objectif de savoir si une exposition chronique (12

semaines) par gavage d’une eau supplémentée en acétate de plomb pouvait induire une

réponse reprotoxique au niveau de l’appareil reproducteur et neurotoxique via le complexe

hypothalamo-hypophysaire et dans l’affirmative d’évaluer les effets de l’acétate de plomb sur

le fonctionnement de l’appareil reproducteur du rat mâle.

2


Au niveau subcellulaire, nous nous sommes ainsi intéressés au suivi des marqueurs

enzymatiques du stress oxydatif, une enzyme impliquée dans les mécanismes de défense

antioxydant (catalase, superoxyde dismutase) et les indicateurs de stress oxydant (la teneur en

MDA). Parallèlement à cette étude, nous nous sommes intéressés à déterminer les différents

paramètres biochimiques, séminologiques et hormonaux.

Nous avons également recherché des effets histopathologiques au niveau des gonades

et les organes accessoires et au niveau de l’hypophyse et l’hypothalamus. Au travers de cette

approche multiparamétrique, nous avons ainsi tenté d’obtenir une image multidimensionnelle

des conséquences biologiques d’une interaction plomb/rat.

.

3

Chapitre I Revue bibliographique

4

1. Problématique du plomb dans l’environnement :

Différents métaux sont naturellement présents à l’état de traces dans l’environnement

sous forme organique ou inorganique. Pour les organismes vivants, certains métaux (p.ex.

cuivre, fer, zinc, manganèse, chrome, magnésium) appartiennent aux oligoéléments essentiels

à la vie. A l’inverse, d’autre métaux, également présents à la fois dans l’environnement et la

chaîne alimentaire (p.ex. mercure, plomb, cadmium, nickel, ou uranium), sont non essentiel à

la vie mais néanmoins constitutifs du vivant.

Cependant, lorsque leur concentration dans les aliments ou l’eau potable augmente, la

toxicité intrinsèque de ces métaux peut devenir un risque sanitaire pour l’Homme. Les études

toxicologiques passées ont mis en évidence que l’ensemble des systèmes physiologiques

(respiratoire, digestif, vasculaire, hématopoïétique, immunitaire, reproducteur et nerveux)

pouvait alors être concerné par les effets toxiques de ces métaux (tableau 1). De plus,

l’intensité et l’ampleur des effets de ces métaux sur la santé dépend, comme tout toxique, de

la voie de contamination, de la quantité reçue, de la répétition de l’intoxication et de la nature

chimique du contaminant (spéciation) (Seregin et al., 2004) .

Tableau (1) : Risques sanitaires associés aux métaux (Patra et Bhowmik et al., 2007).

Métal Risque sanitaire

Arsenic Sys. Hématopoïétique, vasculaire / coloration de la peau /

carcinogène

Cadmium Reins / poumons /os / foie / intestin / syst. nerveux /

carcinogène

Mercure Syst. nerveux / rein/ tératogène / poumons / carcinogène chez

l’animal

Manganèse Syst. nerveux central / syst. endocrinien (hypothalamo-

hypophysaire)

Qu’en est- il de plomb, autre métal naturellement présent dans l’environnement, dans

l’alimentation et dans les organismes vivants ?


5

1. 1. HISTORIQUE :

1. 1. 1. L’utilisation du plomb :

Le plomb est l’un des premiers métaux connu et qui fut utilisé par l’homme. Des

découvertes archéologiques ont mis en évidence la présence de plomb dans des objets et des

pigments dés début de l’Age de Bronze (Lessler, 1988).

L’histoire du plomb est liée à celle de l’argent car initialement, le plomb est un sous-produit

du travail des mines d’argent. Ce sous produit a peu de valeur et est appelé litharge,

littéralement, « «pierre d’argent » en grec. Après extraction de l’argent des galènes

argentifères et un procédé de fusion, on obtient la litharge qui contient de grandes quantités de

plomb sous forme de monoxyde de plomb. Des traces de ce processus sont retrouvées aussi

bien dans des régions orientales que méditerranéennes ou sibériennes (Bourrelier et

Berthelin, 1998).

Le plomb a été très largement utilisé du fait de ces propriétés de conductions, de

malléabilité et de très grande résistance à la corrosion. La production et l’utilisation du plomb

au temps de l’Antiquité furent sûrement à leur zénith sous l’empire romain. On extrayait alors

du plomb en Espagne, en Grande Bretagne, en Bosnie, en Allemagne et en Grèce. On ajoutait

aux vins et à certains plats du « sapa », sirop doux à base d’acétate de plomb. On utilisait

aussi le plomb pour les peintures intérieures des maisons, décorer la vaisselle, frapper des

pièces de monnaies ou fabriquer des cercueils. Le plomb pouvant facilement être mis sous

forme de grandes plaques, il a été utilisé largement dans les siphons d’aqueducs et les réseaux

de distribution d’eau très développés des romains. Compte tenu de ses propriétés

neurotoxiques chroniques, de tels usages dans la boisson et l’alimentation auraient pu

participer à la chute de l’empire romain. Le plomb a continué à être utilisé largement au

Moyen Age. En effet, l’usage du « sapa » a continué jusqu’à à cette époque, le plomb a

également servi pour des vernis céramiques, dans des travaux d’ornements, pour construire

des citernes, des statuts, des toits et des tuyaux pour le transport de l’eau (Burrows, 1983 ;

Lessler, 1988).


6

Aujourd’hui la principale utilisation du plomb est la fabrication d’accumulateurs

(environ 50% de la consommation totale), le plomb y est utilisé sous forme métallique-les

grilles et les bornes sont en plomb allié- et sous forme de matière active, mélange d’oxyde de

plomb et d’additifs divers.

Parmi les autres utilisations du plomb sous forme métallique, on trouve les bandes et les

tables de plomb laminés pour les couvertures et l’insonorisation dans le bâtiment, les plombs

de chasse, les métaux d’apport pour les soudures, essentiellement en alliage plomb étain. Les

feuilles et plaques de plomb servent dans la lute contre la corrosion (dans l’industrie

chimique) et la protection contre les rayonnements (installation utilisant des rayons X ou γ,

énergie nucléaire) (Adem, 2003.). Le plomb est utilisé dans de nombreuses autres applications

(tableau 2).

Tableau (2) : Autres usages du plomb (Ponthieu et al., 2002)

Applications Forme chimique

Impression du coton Pb (CH3COO) 2

Conservation du bois Tributylacétate de plomb

Cosmétique (teinture pour les cheveux),

désinfectant

Pb (CHOO) 2

Email, glaçure PbS

Semi conducteur PbS, PbSe, PbTe

Catalyseur lors de la polymérisation de

polyuréthanne

Céramique

PhPb (OAc) 3

Mastic, allumettes PbSi2O5

Maquillage PbO/PbO2/Pb3O4

Teinture de textiles PbS

Feux d’artifices (oxydant) Pb (NO3)2

Feux d’artifices (oxydant) PbO2


7

1. 1. 2. Propriétés physico-chimiques du plomb:

Du latin plumbum, le plomb est un élément présent naturellement dans

l’environnement, il est présent dans de nombreux minéraux et ne se rencontre que rarement à

l’état natif (tableau 3). Le plomb appartient au groupe IVB de la classification périodique. Sa

configuration électronique est [Xe] 4f145d10 6s26p2 avec deux électrons non appariés sur la

dernière couche. Cette configuration électronique autorise les degrés d’oxydation (+2) et (+4),

en plus de la forme métal (0). Dans les milieux naturels, les espèces inorganiques du plomb

incorporent cet élément sous le degré d’oxydation (+2). Le degré d’oxydation (+4) n’est

représenté que dans des conditions très oxydantes non rencontré dans les sols : il se retrouve

majoritairement dans les composés organiques dont la source est principalement anthropique

(Newland et Daum, 1986). La forme 0 (plomb natif) n’est quand à elle que rarement

représentée car elle nécessite des conditions peu courante dans un sol (conditions très

réductrices). Les propriétés physico-chimiques du plomb (tableau 4) sont très importantes pour

la compréhension des mécanismes de biodisponibilité et d'action de ce métal. L'oxydation du

sulfure en sulfate dans les particules des émissions industrielles augmente l'hydrosolubilité et

donc la biodisponibilité du plomb. Les variations de pH au niveau des sols comme au niveau

des liquides biologiques peuvent expliquer les différences de biodisponibilité ainsi, il y a

solubilisation dans l'acide chlorhydrique de l'estomac et précipitation au delà de l’estomac

(Hinsinger et al., 2005) (figure 1).


8

Tableau (3): Liste des principaux minéraux et composés de plomb (Roussel et al., 2000)

Minéraux Formule chimique

Anglésite PbSO4

Glène PbS

Boulangérite Pb5Sb4S11

Franckéite Pb5Sn3Sb2S14

Cérusite PbCO3

Crocoïte PbCrO4

Chlorure de plomb PbCL2

Bromure de plomb PbBr2

Hydroxyde de plomb Pb (OH) 2

Litharge PbO

Minium Pb2+2Pb4+O4

Pyromorphite Pb5 (PO4)3CL

Hydroxypyromorphite Pb5 (PO4)3OH

Fluoropyromorphite Pb5 (PO4)3F

Arseniate de plomb Pb3 (AsO4)2

Plumbogummite PbAl3 (PO4)2(OH) 5H2O

Raspite PbWO4

Wulfénite PbMoO4

Vanadinite Pb5 (VO4)3CL


9

Tableau (4) : Propriétés physico-chimique de l’élément de plomb (Sposito et al., 1982)

Numéro atomique 82

Masse atomique (g.mol-1) 207,2

Point de fusion 327 °C

Point d’ébullition 1740 °C

Densité 11,35

Valences 0, +2, +4

Electronégativité de Pauling 1,8

Masse volumique 11,34 g.cm-3 à 20 °C

Rayon atomique (Van der Waals) 0,154 nm

Rayon ionique 0,132nm (+2), 0,084nm (+4)

Isotopes 4

Energie de première ionisation 715,4 Kj.mol-1

Energie de deuxième ionisation 1450,0 Kj.mol.-1

Energie de troisième ionisation 3080,7 Kj.mol-1

Energie de quatrième ionisation 4082,3 Kj.mol-1

Energie de cinquième ionisation 6608 Kj.mol-1

Potentiel standard - 0,13 V (Pb2+/Pb), -1,5 V (Pb4+/Pb2+)


10


11

1. 2. Les sources d’exposition :

Tous les auteurs s’accordent pour reconnaître qu’il est souvent difficile d’identifier la

source de plomb ayant intoxiqués l’animal (Landrans et Paclot, 1994 ; Landrans et al.,

1989 ; 1999). Sur prés de 900 appels au National d’Informations Toxicologiques Vétérinaires

(France) entre 1985 et 1989 (Bellinger et al., 1991 ), environ 1/3 des causes d’intoxications

restaient inconnues (tableau 5).

1. 2. 1. Sources d’exposition liées aux activités industrielles :

Les sources de plomb sont surtout constituées par les industries d’extraction minière,

de métallurgie de métaux non ferreux, de fabrication d’accumulateurs, de récupération des

métaux (Cecchi, 2008).

1. 2. 2. Sources d’exposition liées aux activités domestiques et mode

d’alimentation :

Avant 1948 les peintures contenant des sels de plomb étaient très utilisées dans les

habitations lors de leur dégradation, ces peintures s’écaillent et engendrent la création de

poussières. Ces artefacts contiennent une grande concentration en plomb et peuvent

provoquer d’importantes contaminations surtout chez les enfants. Des poussières riches en

plomb (autres que celles provenant de la dégradation de veilles peintures) peuvent exister

dans les maisons. Elles sont dues à des apports de plomb depuis l’extérieur par un milieu

pollué, ou ramenées par des personnes en contact avec le métal durant leur travail. Elles

peuvent aussi être dues à des activités de loisirs (fabrication de plomb de chasse ou de pêche,

poteries et brûlage de veilles pentures…) (Awad et al., 1981).

La présence de plomb dans les eaux de distribution public provient tés rarement de la

ressource en eau. Cependant, en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques, ces

eaux peuvent se charger en plomb, par dissolution des tuyauteries (en plomb) ou des soudures

(contenant un alliage des tains et de plomb), les réseaux présentent ce type de structure sur les

portions public mais surtout privées sont encore largement répandus.


12


13

En fonction de l’origine des aliments consommés, l’alimentation contribue pour une

par parfois non négligeable à l’apport en plomb. Mais même en absence d’une consommation

de ce type, il existe une exposition de fond, de la population des payés industrialisée, par

accumulation du plomb dans la chaîne alimentaire et également par des techniques

inappropriées de conditionnement ou de cuisson des denrées destinées à la consommation

humaine ou animale.

Par ailleurs, le plomb issu de la combustion des cigarettes peut conduire à une

exposition des fumeurs et de leur entourage (Ernhart et al., 1981 ; De Silva, 1994 ; Huel,

1997 ; Schroder et al., 2004 ). En raison de leurs comportements de « Pica » et de « main-

bouche », les enfants sont pus fréquemment soumis aux risques engendrés par les écailles de

peintures ou les poussières chargées en plomb (Goyer et Clarkson, 2001).

1. 3. Le plomb dans les sols et les végétaux :

1. 3. 1. Dans les sols :

Il existe des fonds géologiques représentant la teneur naturelle des sols en plomb. En

matière de valeurs de seuil il n’existe pas réellement de limites officielles.

En définitive en fonction des teneurs en plomb que l’on symbolisera par "p" on a :

Si p< 100mg/Kg : le sol est considéré comme non contaminé

Si 100 mg/Kg< p< 530mg/Kg : critère de statu quo. Le niveau de contamination du sol

ne justifie pas un traitement mais simplement un suivi.

Si 530mg/Kg< p : critère d’action. Le niveau de contamination du sol implique des

investigations complémentaires pour prendre les mesures adaptées.

Les teneurs des sols en plomb ne constituent qu’un critère de l’évaluation du risque

pour l’environnement et la santé. Sa mobilité et sa biodisponibilité doivent être prise en

compte car elles déterminent l’extension spatiale de ce polluant et son intégration dans la

chaîne alimentaire. La spéciation du plomb (état physico-chimique) et sa localisation dans

différentes phases du sol déterminent cette mobilité et cette biodisponibilité.


14

La spéciation constitue donc une donnée complémentaire intéressante pour

l’évaluation. Ce métabolisme du plomb dans le sol dépend en fait de nombreux facteurs :

humidité, pH, nature et stabilité de compartiments tels que ceux des matières organiques, des

phosphates. En fonction du pH du milieu, le plomb est amené soit à se trouver sous forme

d’ion libre et à se déplacer en solution, soit à s’adsorber sur les argiles, les hydroxydes et la

matière organique du sol (Prost, 2000).

En pratique, la fuite sous forme de solution ou le transfert de ce métal est limité aux vingt

premiers centimètres du sol. Six mois à un ans après une pollution de surface le plomb y

atteint une concentration quasi homogène qui sauf réhabilitation peut persister pour plusieurs

décennies (Mench et al., 2002).

1. 3. 2. Dans les végétaux :

Certains métaux sont indispensables à la croissance des végétaux ; c’est le cas du zinc,

du fer, du cuivre, du magnésium etc….D’autres, comme le plomb, le mercure, l’arsenic n’ont

pas de fonctions biologiques reconnues pour les plantes. Cependant, qu’ils soient

indispensables ou sans rôles connus, une accumulation excessive de ces éléments est

phytotoxique. Les végétaux peuvent se contaminer par leurs racines ou par leurs parties

aériennes lors de retombées atmosphériques de poussières émises par l’activité industrielle ou

d’envols de particules de terre polluée. Ces poussières peuvent aussi persister à la surface des

végétaux ou être fixées sur la cuticule, dans les poils épidémiques de la tige ou des feuilles. Le

transfert à la plante du plomb contenu dans le sol met en jeu des processus très complexes.

Ceux-ci dépendent de la nature, de la concentration et de la spéciation du plomb (Miquel,

2001). L’accumulation dans les végétaux est variable en fonction de l’espèce et au sein d’une

même espèce, selon la variété considérée (Morel et Schwartz, 1999). De plus pour une plante

donnée, la teneur en plomb n’est pas homogène. Elle varie d’un organe à l’autre. Elle peut

donc être différente dans les racines, les tiges ou les feuilles. Toutefois il s’accumule

préférentiellement dans les racines (Nriagu et Moore, 1984).


15

De même qu’il n’existe pas vraiment de normes pour déclarer q’un sol est pollué, il

n’y a pas de normes ou de valeurs limites pour les teneurs en plomb dans les aliments destinés

à l’homme. Ici aussi d’autres payés européens tels la France ont produit des normes selon les

recommandations du Conseil Supérieur d’Hygiène Public (Cecchi, 2008). Celles- ci fixe des

limites en mg/Kg de poids frais (tableau 6). Pour évaluer la teneur en poids sec, on peut

estimer que les légumes tés hydratés contiennent 90% d’eau, les moins hydratés comme les

haricots en grains 70%. Pour garder une marge de sécurité tous les légumes sont évalués

comme ayant une hydratation de 90%. Pour les produits destinés à l’alimentation animale en

France, l’arrêté du 16 mars 1989, paru au Journal Officiel du 13 avril 1989, fixe les teneurs

maximales en plomb ; elles sont de 40mg/Kg pour des aliments à un même taux d’humidité

(soit 45mg/Kg de produit sec) (Philippon, 2000).


16

Tableau (6) : Valeurs limites pour l’alimentation humaine (Cecchi, 2008).

PLOMB Conseil Supérieur d’Hygiène Public

Proposition de valeurs limites mg/Kg

de poids frais

mg/Kg

de poids sec

Céréales et produits dérives

Légumes (sauf les exceptions suivantes

Fruits

Céleris, épinards, salades

Choux

Conserves (sauf boissons) légumes

Champignons

Conserves : céleri, épinards, salades,

Choux

Concentré de tomate

0,5

0,3 0,3 0,5 0,5 0,3 0,3 0,5 1,5

5

3 3 5 5 3 3 5 15


17

1. 4. Biocinétique du plomb après une contamination interne :

Malgré son omniprésence dans l’environnement, le plomb est considéré comme un

élément non essentiel car n’ayant pas aucune fonction métabolique ou physiologique

connue (Who, 2004). Différentes voies d'entrées peuvent être distinguées :

1. 4. 1. La voie pulmonaire :

L’absorption pulmonaire est importante pour les personnes exposées en milieu

industriel dans l’environnement des entreprises polluantes, mais également pour toutes

personnes vivant sous des rejets atmosphériques. Le plomb atmosphérique peut être

inhalé sous forme de vapeurs, de gaz ou de particules. Les vapeurs et gaz migrent

directement jusqu’aux alvéoles pulmonaires ou ils passent dans le sang. Le taux de

déposition des particules inhalées est de l’ordre de 30à 50% et dépend de la taille et de la

ventilation pulmonaire (Friberg et al., 1986).

Les particules métalliques se déposent sur les muqueuses des différents segments de

l’appareil respiratoire en fonction de leur taille. Les plus grosses restent au niveau du

rhino- pharynx et des grosses bronches souches. Les particules de taille moyennes

atteignent les bronchioles et les alvéoles. Les plus fines des particules déposées sur des

voies ciliées sont les plus souvent éliminées en 24 heures. Celles qui ont atteint des zones

profondes non ciliées sont prises en charge par le système réticulo-histiocytaire, dissoutes,

rejoignent le système lymphatique puis à terme le compartiment vasculaire sanguin. Les

résultats de l’étude de (Thompson et al., 1985) ont montré que 20à 30% du plomb inhalé

étaient absorbés. Un individu qui respire 1 µg Pb/m3 d’aire voit son taux sanguin de plomb

augmenter de 3 à 20 µg /L (Azarr et al., 1975). Indépendamment de la taille et de la

solubilité des particules la spéciation du plomb semble favoriser son absorption (les oxydes

de plomb seraient plus absorbés que les sulfures) (Wang et al., 2007b). En ce qui concerne

le plomb organique (tétraalkyl de plomb), environ 60à 80% seraient absorbées par les

poumons (Wragg et Klinck, 2005).


18

1. 4. 2. L’absorption digestive :

L’absorption du plomb par la voie digestive dépend de sa biodisponibilité variable avec

la solubilité du métal dans le tractus gastro-intestinal. Le pH des muqueuses digestives est

très variable ; de très acide au niveau de l'estomac, il devient faiblement acide dans le jéjunum

et neutre ou légèrement alcalin dans le duodénum. Le plomb doit être solubilisé pour être

absorbé. Or l'acide chlorhydrique, même concentré, l'attaque difficilement. Ainsi, le plomb

métallique ne serait assimilable au maximum qu'à 20 % (Botta et al., 1976). Des tests de

solubilisation reproduisant les conditions rencontrées aux différents niveaux du tractus gastro-

intestinal ont été réalisés in vitro par (Roy, 1977) ; à pH 1,3, dans un liquide stomacal

artificiel, la solubilité du sulfure de plomb n'est que de 0,94 %; à pH 7,2, représentant

l'alcalinité duodénale, le plomb précipite à 99,82 %, et serait donc in vivo éliminé dans les

fèces.

Par ailleurs, la formation d'ions complexes du type PbOH+, PbCI+ ou PbNO3+

augmenterait la biodisponibilité du plomb à des pH supérieurs au pH stomacal (Simons,

1986a). (Ruby et al., 1992) ont évalué la biodisponibilité du plomb contenu dans des

particules minérales provenant du sol de mines de plomb, dans des conditions gastriques

contrôlées. Ils ont montré une diminution de la biodisponibilité du plomb par rapport à du

PbSO4 (ou anglésite pur), sans doute à cause de l'encapsulation des surfaces des particules par

divers matériaux ou des phases inertes comme les silicates. Ainsi, après 2 heures de contact

avec un liquide gastrique, seulement 4 % du plomb sont dissous à partir des particules de sols

miniers.

La vitesse de dissolution du plomb de ces particules est 7 fois plus faible qu'avec le PbSO4

pur, ce qui pourrait expliquer les taux sanguins beaucoup plus faibles chez les enfants des

districts miniers que chez des enfants exposés aux mêmes concentrations de plomb dans un

environnement urbain. Le taux de dissolution du Pb de ces particules n'est pas affecté par

leur taille, sauf à 2,4um. L'ordre de biodisponibilité dans l'étude de (Ruby et al., 1992) est la

suivante ; Pb acétate > PbSO4 > Pb sols miniers.


19

Des modèles in vivo ont permis de comparer les taux tissulaires en plomb à la fin d'une

période d'ingestion aux taux obtenus par injection de la même dose par voie intraveineuse, ou

de comparer des concentrations tissulaires pour différentes doses de plomb dans des matrices

environnementales. Le pourcentage de Pb biodisponible augmente quand la dose de Pb

ingérée diminue. Pour des sols miniers, il varie ainsi de 1,6 à 0,25 % pour des doses

comprises entre 1 et 24mg/kg/jour (Polak et al., 1996). Ces données sont importantes à

considérer pour l'évaluation des risques.

Plusieurs études chez des adultes volontaires ont tenté de déterminer dans quelles

proportions le plomb ingéré est absorbé au niveau gastro-intestinal. (Kehoe, 1961) a fait

ingérer du plomb sous forme d'acétate ou de chlorure à quatre jeunes hommes volontaires,

pendant des périodes de quelques mois à 9 ans. Cette supplémentarité du régime alimentaire

s'effectuait sous forme de sel de plomb au cours des repas :

• l'ingestion totale de 0,6 mg de plomb par jour pendant un an n'a pas fait augmenter le

plomb sanguin, mais légèrement le plomb urinaire;

• l'ingestion de 1,3 mg/jour entraîne une augmentation du plomb sanguin et urinaire;

• l'ingestion de 2,3 mg/jour et 3,3 mg/jour permet de dépasser la dose de 800 ug Pb/l de

sang. Dans cette expérience, les taux d'absorption étaient de 5 à 10 %.

La plupart des autres études donnent des taux d'absorption à peu près identiques ; 5 à 10 %

pour (Hursh et Somela, 1968) avec du plomb radioactif, 6 à 14 % pour (Nriagu, 1978) et

5 à 10 % pour (Demichele, 1984) pour des quantités de 0,1 à 0,4 mg/jour En utilisant la

méthode de dilution isotopique, (Graziano et al., 1996) ont montré qu'environ 70 % du

plomb dissous à partir du cristal d'un verre dans du cherry était absorbé chez l'homme. La

concentration de plomb dans le cherry atteignait 14,2 µmol/litre, et l'absorption du liquide a

entraîné une augmentation de la plombémie des volontaires se prêtant à l'étude de 0,10 à 0,18

µmol/litre, tandis que les rapports isotopiques 206Pb/207Pb chutaient de 1,202 à 1,137, signant

ainsi l'origine du plomb.


20

A l'aide de 210Pb, (O'Flaherty et al., 1996) ont administré par voie orale au singe

macaque adulte du nitrate de plomb à la dose de 750 ou 1 500 µg/kg. Pour la dose la plus

faible, les taux d'absorption ont été de 44 %, tandis qu'il n'était que de 22 à 28 % pour la dose

la plus élevée. On dispose d'un petit nombre d'études chez les enfants, mais il est acquis que

les taux d'absorption digestive du plomb sont beaucoup plus élevés que chez l'adulte.

Alexander, (1974) a trouvé un pourcentage d'absorption de 53 % chez des enfants de 3 mois

à 8 ans et demi. Les valeurs de (Ziegler et al., 1978) en sont assez proches, en moyenne 42 %

pour des enfants de 15 jours à 2 ans.

D'après (Demichele, 1984), il y aurait deux mécanismes de transport gastroduodénal :

passif, qui nécessite une solubilité dans les lipides et une ionisation permettant la

liaison à des macromolécules; cette situation est rare dans le cas du plomb;

actif, beaucoup plus important, qui emprunte les voies d'absorption du calcium, du

magnésium et du fer. Cette composante est saturable, comme le prouve la baisse du taux

d'absorption quand la quantité de plomb présente dans l'estomac augmente.

De nombreux facteurs peuvent favoriser l'absorption du plomb :

composition du régime alimentaire en acides organiques (Demichele, 1984) ; citrate de

sodium des agrumes, acide ascorbique (vitamine C), acides aminés et protéines, graisses,

lactose; carences en fer, calcium, magnésium entraînant une diminution de la compétition

avec le plomb.

carences en vitamine B1 et en fibres (Ito et al., 1987).

D'autres facteurs interviennent dans l’absorption :

la grossesse et la lactation, qui augmentent les besoins en Ca2+, favorisent l’absorption

du plomb ainsi que sa résorption osseuse, comme l'ont montré expérimentalement

(Maldonado-Vega et al., 1996) sur des rats;

l'état de jeûne, qui augmente le taux d'absorption digestive jusqu'à 35 % chez l'adulte

(Demichele, 1984);

la fonction chlorhydrique gastrique du sujet;

la taille des particules ingérées;

la spéciation du plomb, dont dépend sa biodisponibilité.

Le facteur le plus important est le mécanisme de compétition avec le calcium. Toute carence

ou tout besoin supplémentaires en Ca 2+ favorise l'absorption du plomb.


21

1. 4. 3. Absorption cutanée :

L’absorption cutanée est négligeable, sauf pour le plomb organique qui est très

liposoluble (Botta et al., 1976). Des tests in vitro réalisé sur de la peau humaine ont permis

de classer différents composés de plomb selon leur taux d’absorption par ordre décroissant :

tétrabutyl de plomb>naphtalène de plomb>acétate de plomb>oxyde de plomb. Après une

application de crème ou de solution contenant de l’acétate de plomb (9 nmol/Kg ou 6

nmol/L) pendant 12 heures chez 8 volontaires sains, les travaux de (Moore et al., 1980) ont

montré que le taux d’absorption de l’acétate de plomb était compris entre 0 et 0,3% (Craft

et al., 2004) (figure 2).


22

Figure (2) : Biocinétique des métaux lourds après contamination interne (Craft et al., 2004

Cerveau

Ingestion

Poumons

Blessure

Autres tissus mous

Os Reins

Tractus digestif

Gonades

Ganglions Lymphatiques

Inhalation

Muscles

Excrétion


23

1. 5. Transport sanguin :

Après absorption pulmonaire ou digestive, le plomb passe dans le sang où il se répartit

entre forme fixée aux hématies (95%) non diffusible et une forme plasmatique qui sera

stockée dans les tissus ou éliminée dans les urines (figure 3) (Ong et Lee, 1980). Le plomb

sanguin représente environ 2% du pool total de l’organisme et sa demi vie chez l’adulte est en

moyenne de 20à 30 jours (Nillson et al., 1991). Il correspond à un équilibre entre le plomb

absorbé, le plomb stocké et le plomb éliminé par voie urinaire (Cezard et Haguenoer, 1992).

Dans certains cas particulier, comme les très jeunes enfants, la part qui revient à

l’absorption sera plus importante dans cet équilibre, alors que chez les femmes enceintes ou

en cas maladies osseuses de sujets tous anciennement exposés, le plomb sanguin reflètera

majoritairement la résorption du plomb stocké.

Ceci explique en moins en partie, que la demi-vie du plomb sanguin a été estimée à

des 10 mois chez des enfants exposés à un risque important d’intoxication ou par ingestion

(Mushak, 1993). En utilisant le dosage des isotopes stables du plomb, une étude a montré

chez l’homme faiblement exposé (10à 60µg/l) et avec des taux osseux faibles (0,6à 7µg

Pb/g), que le squelette contribue pour 40 à 70% du plomb sanguin (Smith, 1989).


24

Figure (3) : Conséquence de l’augmentation des apports en plomb sur la quantité disponible

dans les organes (Barton, 1989).

Des apports de plomb

Plomb du sang

Plomb plasmatique diffusible

Plomb tissulaire


25

1. 5. 1. Distribution dans l'organisme :

Les sels de plomb se fixent dans les différents tissus et en particulier au niveau de l’os

où entrant en compétition avec les ions calcium (Ca2+) ils sont majoritairement stockés (80à

90% du plomb total) (Wedeen, 1988). Cela peut représenter un total de 40à 50 mg pour un

individu soumis à une exposition environnementale, et plus de 200 mg dans le cas

d’expositions professionnelles (Wittmers et al., 1988). Indépendamment de l’activité

professionnelles, les quantités de plomb accumulées sont en moyenne plus élevées chez

l’homme que chez la femme (Yoshinaga et al., 1989 ; Kurttio et al., 2005).

La demi-vie du plomb osseux est très différente selon qu’il est présent dans l’os

trabéculaire (2,4 ans) ou l’os cortical (en moyenne 9,5 ans et très variable selon les os

(Christofferson et al., 1986 ; Miller et al., 2001a). Les échanges avec le plomb fixé sur les

tissus mous (rein, molle osseuse, foie, rate et cerveau) sont plus rapides, et sa demi-vie y est

d’environ 40à 60 jours. Par ingestion, l’absorption du plomb au niveau du foie et des reins est

trois fois plus importantes que par inhalation (Barthelemy et al., 1975 ; Taulan et al., 2004).

Les autopsies réalisées sur des travailleurs ont révélé une accumulation du plomb, par ordre

décroissant, dans le foie>les reins>les poumons>le cerveau. De plus, l’accumulation sélective

du plomb notamment dans certaines zones du cerveau (l’hippocampe) et des rein (cortex) a

pu être observée chez l’homme (Amdur et al., 1996; Paquet et al., 2005).

Le plomb s’accumule également dans les dents, les ongles et les cheveux. L’utilisation

des dents de lait comme marqueurs rétrospectifs de l’exposition cumulée au plomb a

progressivement été abandonnée dans les enquêtes épidémiologiques. Les derniers travaux

semblent montrer que le plomb présent dans la dentine est d’avantage lié aux expositions

précédant la chute de la dent de lait, et seul le taux sanguin à 57 mois peut être corrélé au taux

de plomb da la dentine (Rabinowitz et al., 1993 ; Phillipon, 2000).

Le plomb passe facilement la barrière placentaire par simple diffusion et l’exposition

prénatale constitue un risque important d’imprégnation du plomb par les tés jeunes enfants.

Plusieurs études ont en effet montré qu’à la naissance, les plombémies maternelles et fœtales

sont fortement corrélées (Goyer et al., 2001; Seregin et al., 2004).


26

De même, les teneurs dans le lait maternel sont supérieures à celles du plasma de la

mère, probablement en raison d’une mobilisation du plomb dans les os liés aux besoins

augmentés en calcium (Gulson et al., 1997 ; Lestaevel, 2005a).

En effet, dans des situations particulières (grossesse, allaitement, ménopause) les

modifications du métabolisme osseux peuvent entraîner une augmentation ponctuelle du

relargage endogène de plomb. De même, certaines pathologies (hyperthyroïdie, ostéoporose,

fracture) pourrait entraîner une mobilisation intense du plomb osseux et favoriser la

réapparition de divers manifestations neurophysiologiques ou le développement de

perturbations de la fonction rénale (Berlin et al., 1995 ; Thymen et al., 2000).

1. 5. 2. Excrétion du plomb :

La principale voie d’excrétion du plomb est urinaire, au moins 75% du plomb absorbé

sont éliminés par cette voie (Haguenenoer et Furon, 1982 ; Orloff et al., 2004). Le plomb se

retrouve dans les urines à partir de l’ingestion quotidienne d’au moins 1 mg d’acétate dd

plomb, essentiellement sous forme ionisée libre lorsque les plombémies sont dans des limites

normales (Kehoe, 1987). Pour des expositions modérées observées en milieu professionnel

les taux de plomb urinaire sont compris entre 0,05 et 0,2 mg/L (Robinson, 1974). La

cinétique d’excrétion urinaire serait bien plus lente chez l’enfant que chez l’adulte (Who,

2004). Le plomb non absorbé par le tractus gastro-intestinal est éliminé par les fèces. Pus de

85% du plomb ingéré dans l’eau de boisson par des adultes volontaires (0,3 à 3 mg de

plomb/j/16 à 28 semaines) sont excrétés et ce majoritairement dans les fèces (90%) (Kehoe,

1987).

Le plomb peut également s’éliminer par la salive, la sueur, les cheveux et les ongles.

Négligeable dans des conditions normale, l’exposition à la chaleur peut entraîner chez

l’homme une excrétion sudorale supérieure à l’élimination urinaire (Asayama et al., 1975 ;

Piechalak et al., 2008). Des travaux ont récemment confirmé l’élimination d’une quantité

appréciable de plomb par les cheveux (Watt et al., 1995 ) (figure 4).


27

Figure (4) : Transfert des métaux lourds après ingestion et leurs excrétion (Craft et., 2004).

Ingestion

Sang

Tractus digestif

Reins

Excrétion

Os

Cerveau

Tissu mous


28

1. 6. Principaux effets toxiques du plomb sur la santé humaine :

1. 6. 1. Toxicologie aiguë :

L’intoxication aiguë ne se rencontre plus que très rarement aussi bien dans l’industrie

qu’en milieu non professionnel, mais elle peut néanmoins se produire par inhalation ou par

absorption dans des situations accidentelles. L’essentiel des données rapportées dans

littérature concerne l’absorption de plomb ou ses dérivés par voie orale.

Les troubles digestifs sont parmi les symptômes les plus précoces. Ils se traduisent par

l'apparition de fortes coliques associées à des douleurs et crampes abdominales, ainsi qu'à des

vomissements (Awad et al., 1 986 ; Haguenoer et Furon, 1982 ; Pollock et Ibels, 1986 ;

Schneitzer et al., 1990). Ces effets apparaissent en général pour des taux de plombémie

compris entre 1 000 et 2 000 μg/l, mais peuvent se déclarer chez certains sujets à des taux

bien plus faibles compris entre 400 et 600µg/l. En plus des coliques, les enfants présentaient

des signes de constipations sévères, souffraient d’anorexies de vomissements par phases

intermittentes.

L'atteinte rénale a été décrite par différents auteurs, et plusieurs s'accordent à

mentionner l'apparition de lésions tubulaires caractérisées par une oligurie, une albuminurie,

une glycosurie et une hyperphosphaturie (Malcom, 1970 ; Abed et al., 1973 ; Cramer et

al.,1974 ; Bennett, 1985). La sévérité des lésions peut aller jusqu'à entraîner la mort des sujets

exposés, mais l'administration rapide d'un traitement rend en principe les effets réversibles

(Cézard et Haguenoer, 1992).

En cas d’atteinte sévère, les lésions au niveau du système nerveux central se

manifestent cliniquement par une encéphalopathie convulsive et un coma pouvant conduire à

la mort. Plutôt rares chez l’adulte et uniquement pour des plombémies extrêmement élevées

(4600 μg/l) (Kehoe, 1961), ces manifestations sont plus fréquemment rencontrées chez

l’enfant pour des intoxications conduisant à des plombémies pouvant varier de 900 à 8000

μg/l. Des séquelles neurologiques ou psychomotrices graves (retard psychomoteur, épilepsie,

cécité, hémiparésie) ont été décrites.


29

Plus récemment, des encéphalites aiguës ont également été observées sur des enfants

d’environ 4 mois intoxiqués par voie médicamenteuse et présentant des plombémies

comprises entre 490 et3310 μg/l (Al Khayat et al., 1997).

Des atteintes hépatiques ont parfois été observées chez des enfants présentant des

signes d’intoxication aiguë par le plomb. Elles se manifestent par la réduction de la

métabolisation de certains médicaments (antipyrine, EDTA) qui serait liée à la diminution du

contenu en cytochrome P450 (Alvares et a., 1975 ; Saenger et al., 1984).

Selon Sibergeld et al. (1991), seule une exposition aiguë serait responsable de tels effets sur le

métabolisme hépatique, par ailleurs parfaitement normalisé en situation d’exposition

chronique.

1. 6. 2. Toxicologie chronique :

Si l’exposition par ingestion prédomine dans la population générale, et l’inhalation

en milieu professionnel, ces deux voies sont le plus souvent indiscernables l’une de l’autre.

Pour pallier la difficulté qui consiste à identifier ces différentes voies et sources d’exposition,

les effets du plomb sur l’homme sont identifiés à partir de la dose interne de plomb mesurée

dans le sang (plombémie).

1. 6. 2. 1. Effets sur le système nerveux central :

Chez l’adulte, les intoxications chroniques sévères (plombémies > 1 500 μg/l) se

traduisent par une encéphalopathie saturnique grave, heureusement devenue très rare en

milieu professionnel (Gilioli et Grazia-Cassitto, 1978 ; Lauwerys, 1998).

Pour des intoxications moins importantes (plombémies < 1 000 μg/l) des troubles d'ordre

neurologique ont été observés chez l’adulte comme chez l’enfant : irritabilité, troubles du

sommeil, anxiété, perte de mémoire, confusion, sensation de fatigue (Awad et al., 1981 ;

Pasternak et al., 1989 ; Haenninen et al., 1979). Chez des travailleurs dont la plombémie

oscillait entre 260 et 660 μg/l, les auteurs ont décelé des perturbations de la mémoire, du

temps de réaction et de l’habileté manuelle (Hogstedt et al., 1983).


30

A partir de symptômes similaires, des relations de type dose-réponse ont pu être

observées sur des travailleurs répartis en fonction de leur taux de plombémies en trois groupes

correspondant à de faibles (environ 200 μg/l), moyennes (de 210 à 400 μg/l) ou fortes

expositions (de 410 à800 μg/l) (Stollery et al., 1991).

Les sujets les plus exposés ont de plus montré de fortes perturbations neurocomportementales

et psychomotrices, avec notamment une réduction des capacités de raisonnement et des

performances visuo-motrices.

Si la plupart des études réalisées en milieu professionnel mentionnent l'apparition

fréquente de ces troubles subjectifs d'ordre neurologique pour des taux de plombémie compris

entre400 et 800 μg/l, d'autres auteurs estiment qu'il n'existe pas de niveau seuil pour l'action

toxique du plomb sur le système nerveux central (Betta, 1983).

Enfin, de fortes corrélations ont été obtenues entre l'altération des fonctions

psychologiques et l'absorption cumulée de plomb, qui constituerait un meilleur indicateur que

la mesure ponctuelle de la plombémie effectuée en même temps que l'examen psychologique

(Lindgren et al., 1996). L'implication du plomb sur la fonction cognitive des personnes âgées

a récemment été étudiée (Payton et al., 1998). Les moins bons scores aux tests (mémoire,

orientation spatiale, concentration, dextérité) ont été obtenus par les personnes les plus

exposées, présentant cependant des plombémies assez faibles sans doute voisines de 200 μg/l.

Les taux de plomb mesurés dans le tibia par fluorescence X se sont également assez

bien apparentés aux résultats des différents tests malgré une assez grande imprécision de la

mesure signalée par les auteurs. Sur la base de ces mêmes tests, des différences significatives

en terme de performance ont été observées sur deux groupes de femmes ayant des

plombémies > à 80 μg/l ou <à 30 μg/l.

Chez l’enfant, on observe un effet sur le développement cérébral et les fonctions

cognitives. A la différence des intoxications aiguës, la symptomatologie d’une intoxication à

long terme est subtile et peu spécifique chez l’enfant. Ce sont les études épidémiologiques qui

ont mis en évidence les conséquences à long terme de l'intoxication chronique par le plomb

(plombémie inférieure à 400 μg/l) sur le développement psychomoteur ou intellectuel et sur le

comportement scolaire des enfants.


31

Les études transversales portant sur des enfants d'âge scolaire entre 6 et 12 ans

montrent dans leur majorité un effet de l'exposition au plomb sur la baisse du QI qui peut

varier selon les auteurs de 4 à 7 points (Lansdown e t al., 1986 ; Dudek et Merecz, 1997).

Des troubles du comportement portant en particulier sur l’hyperactivité, l’inattention,

l’impulsivité sont également souvent associés à des plombémies supérieures à 110 μg/l ou

taux de plomb dentaire >8μg/g (Fulton et al., 1987 ; Thomson et al., 1989).

Des études longitudinales ont mis en exergue le lien entre l'exposition prénatale,

consécutive à la mobilisation du plomb contenu dans l’os de la mère, et le développement

psychomoteur des enfants de 3 mois à 2 ans (Wasserman et al., 1994). Ce type d’études

confirme également les effets à long terme d’une exposition au plomb en période postnatale

sur le développement psychomoteur, la fonction cognitive et l’intégration visuomotrice de

l’enfant (Baghurst et al., 1995).

L’étude récente de Tong et al. (1998) a montré que les diminutions de plombémie les

plus importantes, enregistrées chez les enfants suivis entre l’âge de 2 ans et l’âge de 11-13

ans, ne sont associées qu’à une amélioration partielle des fonctions cognitives.

Ce résultat illustre la grande vulnérabilité du système nerveux en développement et

des conséquences à long terme des atteintes précoces. Certaines études suggèrent que pour

éviter les effets sur le système nerveux central de l’exposition in utero, la plombémie des

femmes en âge de procréer ne devrait pas dépasser 100 μg/l (Sciarillo et al., 1992).

L’existence ou non d’un seuil de plombémie est encore très discutée et la toxicité

neurologique du plomb reste particulièrement préoccupante chez l’enfant (Thacker et al.,

1992).

1. 6. 2. 2. Effets sur le système nerveux périphérique :

L’exposition à des niveaux très élevés (plombémie à 1200 μg/l) peut provoquer des

paralysies partielles, en particulier au niveau des membres supérieurs. Ces effets sont devenus

rares, compte tenu des niveaux d’intoxication actuels.


32

Plus souvent il s’agit d’atteintes mineures représentées par une symptomatologie

essentiellement subjective, paresthésie, faiblesse musculaire, crampes, etc. Pour des

plombémies moyennes de 630 μg/l, 26 des 31 personnes examinées présentaient une faiblesse

des muscles extenseurs du poignet et 6 des muscles péroniers, entraînant une chute du pied

(Yeh et al., 1995).

Les méthodes de détection relatives aux effets du plomb sur le système nerveux

périphérique se sont dans la grande majorité des études focalisées sur la mesure de la vitesse

de conduction nerveuse. Sur la base d’une revue de nombreuses études publiées jusqu’en

1986, Ehle arrive à la conclusion que la modification de la vitesse de conduction et les

altérations électromyographiques sont exceptionnelles lorsque la plombémie reste inférieure à

600 μg/l (Ehle, 1986). Cette analyse ne tient pas compte des résultats de l’étude de

Seppalainen qui montrent une réduction de la vitesse de conduction des nerfs médian et

ulnaire sur des hommes après 1 an d’exposition professionnelle au plomb (plombémies entre

300 et 480 μg/l). L’observation de ce groupe après 2 ou 4 ans d’exposition montre une atteinte

neurologique persistante au niveau du nerf médian (Davis et al., 1990).

1. 6. 2. 3. Effets hématologiques :

Un des effets classiques du plomb est l’anémie liée, d’une part, à l’inhibition de la

synthèse l'hème et, d’autre part, à la réduction de la durée de vie des érythrocytes.

L’inhibition de l’activité de l’acide δ amino-lévulinique (ALAD) (enzyme intervenant dans la

synthèse de l’hème) a pu être corrélée de manière inversement proportionnelle aux taux de

plombémies compris entre 30 et 340 μg/L aussi bien chez l’adulte, chez l’enfant, ou encore

sur les mères à l’accouchement et les nouveau-nés (adultes- Roels et Lauwerys ,1987 ; enfant-

Roels et Lauwerys, 1994 ; mères- Lauwerys et al., 1978).

La diminution de la biosynthèse de l’hème entraîne l’augmentation de produits

intermédiaires tels que l’acide delta aminolévulinique (ALA), les protoporphyrines

érythrocytaires, généralement mesurées sous forme de protoporphyrine-zinc (PPZ) ou sous

forme protoporphyrine IX libre (FEP).


33

Plusieurs types de corrélations ont pu être établies entre ces différents paramètres :

relation exponentielle entre plombémie et ALA sanguin (Meredith et al., 1978), corrélation

entre plombémie > à 400 μg/l et log ALA ou log PPZ urinaires chez l’adulte (Gennart et al.,

1992), corrélation linéaire entre les taux de plombémie compris entre 250 et 750 μg/l et le log

ALA urinaire chez des enfants âgés de 1 à 5 ans (Weiss, 2000).

L’élévation de protoporphyrine urinaire est perceptible lorsque la plombémie atteint

300 à400 μg/L chez l’homme, 200 à 300 μg/L chez la femme et environ 150 μg/l chez

l’enfant (Roels et Lauwerys, 1987; 1994).

L’anémie, qui résulte de l’effet du plomb sur la lignée érythrocytaire, est en générale

peu sévère et les taux d’hémoglobine tombent rarement en deçà de 100 g/l. Elle est de plus

assez tardive, et souvent non décelable pour des niveaux d’exposition assez faibles

correspondant à des plombémies en moyenne inférieures à 400 μg/l (Solliway et al., 1996 ;

Gennart et al., 1992). Deux études ont montré que l’enfant présenterait des signes d’anémie

de type microcytaire pour des taux de plombémie voisins de 200 μg/l (Schwartz, 1991).

La microcytose serait entre autre liée à la carence en fer habituellement associée au

saturnisme. Les anémies plus sévères s’accompagnent le plus souvent de l’apparition

fréquente de granulations basophiles dans les hématies (Pagliuca et al., 1990).

1. 6. 2. 4. Effets rénaux :

Plusieurs enquêtes épidémiologiques en milieu professionnel, où prédomine

l’exposition par inhalation, ont mis en évidence un excès de mortalité par insuffisance rénale

chez les sujets qui avaient subi des expositions chroniques intenses au plomb (Selevan et al.,

1985). Les lésions qui se développent se caractérisent notamment par la présence de tissu

interstitiel fibrotique, une atrophie glomérulaire et tubulaire qui conduisent à une altération

irréversible de la fonction rénale (Albahary et al., 1965).

Pour des expositions plus modérées, les signes cliniques ne sont pas toujours très

visibles. L’étude des paramètres biochimiques d’exploration de la fonction rénale associés ou

non à des tests d’épreuves fonctionnelles ne met pas toujours en évidence l’existence d’une

néphrite interstitielle d’évolution lente.


34

C’est peut être notamment le cas des travaux de Roels qui, à partir de l’étude de

nombreux paramètres biochimiques de la fonction rénale et de la filtration glomérulaire, n’ont

pas mis en évidence d’anomalies chez les travailleurs exposés entre 3 et 30 ans au plomb et

présentant en moyenne des taux de plombémie compris entre 330 et 610 μg/l (Roels et

Lauwerys., 1994). Quoi qu’il en soit, de nombreuses autres études épidémiologiques en

milieu professionnel montrent que les altérations de la fonction glomérulaire et/ou tubulaires

du rein ne semblent pas associées à des niveaux de plombémie inférieurs à 600 μg/l (Gennart

et al., 1992).

Cependant, dans l’étude de Verschoor, un coefficient de corrélation significatif a été

obtenu entre plombémies et activité de la NAG (N-acétyl ß-Dglucosaminidase) urinaire dans

une cohorte dont les plombémies étaient comprises entre 207 et 1030 μg/l (Verschoor et al.,

1987). Pour la population générale, certaines études suggèrent que le plomb, même à des

faibles niveaux de plombémie, pourrait exercer un effet négatif sur la fonction rénale.

Chez les enfants vivant à proximité de fonderies de plomb, plusieurs marqueurs de

toxicité rénale (protéine de liaison à la vitamine A, ß2-microglobuline, NAG) ont pu être

associés avec des taux de plombémie compris entre 300 et 3 500 μg/l (Verberk et al., 1996).

L’implication du plomb dans l’origine d’une perturbation de la fonction tubulaire chez

l’enfant est donc très probable, et certains auteurs ont même récemment établi, à partir d’une

étude transversale, un seuil de toxicité rénale chez l’enfant de 100 μg/l.

1. 6. 2. 5. Effets sur le système cardio-vasculaire :

Pour les faibles niveaux d'exposition, l'implication possible du plomb dans la

pathologie de l'hypertension artérielle reste un sujet controversé.

Plusieurs études réalisées en milieu professionnel font apparaître des corrélations positives

entre plombémies (à des taux dépassant 300 μg/l) et l’augmentation de la pression artérielle

systolique. Ces résultats sont largement contredits par des études aussi nombreuses qui ne

montrent aucune augmentation du nombre de sujets hypertendus parmi les salariés manipulant

des composés inorganiques du plomb (Wu et al., 1996).


35

1. 6. 2. 6. Autres effets :

Des études réalisées en milieu professionnel ont montré que le plomb peut exercer un

effet dépresseur sur la glande thyroïde pour des niveaux d'exposition élevés (Tuppurainen et

al., 1988). Les auteurs ont en effet noté une corrélation négative entre la durée d’exposition et

le taux sérique de thyroxine totale et libre chez les sujets ayant des plombémies supérieures à

la moyenne du groupe soit 560 μg/l. Il semblerait par ailleurs que l’atteinte thyroïdienne soit

peu probable lorsque l’exposition au plomb est maintenue à un niveau tel que la plombémie

ne dépasse pas 600 μg/l (Gennart et al., 1992).

Par contre, des résultats surprenants montrent l’absence d’effet du plomb sur la

thyroïde chez les enfants, y compris pour des plombémies supérieures à 600 μg/l (Siegel et

al., 1989).

Les enfants ne seraient donc pas plus (voire même moins) sensibles que les adultes à

cet effet Les enfants sont par contre à fortiori la cible privilégiée des effets du plomb sur la

croissance de l’os. Plusieurs études mettent en évidence une corrélation négative entre plomb

d’une part, poids, taille et périmètre thoracique des enfants d’autre part, y compris pour des

expositions très faibles (plombémie < 100 μg/l) (Frisancho et Ryan, 1991).

Sur des enfants de 18 à 36 mois, la mesure du périmètre crânien a également pu être

négativement corrélée à un apport de plomb alimentaire de 4,95 μg/jour ou un taux moyen de

plombémie de 64 μg/l (Stanek et al., 1998).

Les effets du plomb sur le système immunitaire se manifestent essentiellement par une

réduction du pourcentage et de la valeur absolue des cellules T (CD3+) et cellules T helper

(CD4+) observée sur des sujets ayant des plombémies supérieures à 250 μg/l et pouvant

atteindre 1 000 μg/l (Undeger et al., 1996). En ce qui concerne l’immunité à médiation

humorale, la diminution du taux de certaines immunoglobulines (IgA) n’est pas

systématiquement observée dans les diverses études et les personnes exposées ne semble pas

présenter de susceptibilité particulière aux infections (Pinkerton et al., 1998).


36

La comparaison de deux groupes de femmes avec des plombémies moyenne de 190 et

6 μg/l confirme l’absence de lien entre la durée de gestation, le poids à la naissance et

l’exposition prénatale au plomb (Factor-Litvak et al., 1991). Le suivi de ces enfants pendant

4 années après leur naissance soulève comme de très nombreuses autres études, le problème

des conséquences de l’exposition à de faibles doses de Plomb sur le développement neuro-

comportemental dans la petite enfance (Wasserman et al., 1994 ).

Enfin, des malformations du tube neural ont récemment pu être associées à la consommation

d’eau contenant 10 μg/l, ou plus, de plomb et à une déficience en acide folique et en zinc

(Bound et al., 1997).

1. 7. Indicateurs biologiques :

Quelle stratégie peut-on utiliser pour estimer l’intensité de l’intoxication des

populations ? En effet en cas d’intoxication à faible dose, qu’elle soit aigue ou chronique,

la symptomatologie clinique est peu spécifique alors que les effets pathogènes sont déjà

présents.

Une première approche consiste à déterminer par les moyens analytiques et degré de

contamination du toxique dans l’ensemble des composantes de l’environnement général (air,

eau, aliment, logement). Cette démarche à l’avantage de permettre de quantifier et de

hiérarchiser le risque selon son origine. Cependant, la multiplicité des sources de pollution par

le plomb constitue l’une des difficultés évidentes de l’évaluation de degré d’imprégnation

individuelle.

Une deuxième approche plus invasive permet d’estimer l’exposition individuelle en

dosant le plomb lui-même dans différents échantillons biologiques. Ces indicateurs

biologiques présentent l’avantage d’intégrer l’ensemble des sources auxquelles l’individu est

exposé et dévaluer ainsi plus précisément l’imprégnation individuelle. Ils ont par contre

l’inconvénient majeur d’être d’une précision encore insuffisante (fluorescence X) ou d’être de

réalisation sanglante (Phillipon, 2000).


37

1. 7. 1. La plombémie :

La demi-vie du plomb dans le sang est d’environ 30 jours. Le sang peut donc être un

matériel biologique satisfaisant en tant qu’indicateur individuel d’exposition à court terme. La

plombémie a d’ailleurs été largement utilisée dans beaucoup d’études épidémiologiques

(Hedrich, 2000).

En effet la plombémie donne un reflet du taux de plomb sanguin le jour du prélèvement, ce

taux dépend des entrées et sorties mais aussi du stocke interne et externe de plomb (os, tissu

mous) (Squinazi, 1991). Cependant, elle peut la surévaluer lors de contamination récentes et

d’événement intercurrent (grossesse, fracture osseuse, etc…).

Techniquement le dosage de la plombémie est délicat, surtout en milieu susceptible

d’être contaminé par du plomb. Le prélèvement doit être réalisé de façon rigoureuse pour

éviter toute contamination de l’échantillon.

Chez l’adulte, il est toujours possible de recourir au volontariat, mais avec comme

inconvénient un biais statistique de représentativité. Par contre, la nécessité d’une compagne

de dépistage du saturnisme, par plombémie chez l’enfant, doit dûment motivée (Matsuda,

2000). La plombémie constitue, malgré ses inconvénients, un indicateur de référence assez

standardisé.

1. 7. 2. La plomburie :

En épidémiologie, la concentration de plomb urinaire est d’un intérêt assez limité. Elle

est cependant encore parfois utilisée pour la surveillance des individus professionnellement

exposés (Weiss, 2000).

1. 7. 3. Mesure du plomb dans les cheveux :

Le plomb, comme tous les métaux lourds, se concentre dans tous les poils des

mammifères. Les poils particuliers que sont les cheveux peuvent être recueillis sans porter

grand préjudice au donneur. Faciles à conserver, ils ont été utilisés en tant qu’indicateurs

épidémiologiques d’exposition (Wright et al., 2007).


38

La concentration de plomb dans les premiers centimètres du cheveu permet d’obtenir

le degré moyen d’exposition des deux à trois derniers mois. En effet, un cheveu pousse

d’environ 1cm par mois, mais avec un temps de latence d’un mois entre la formation du

cheveu dans les cellules du bulbe pileux en contact avec le sang et sa sortie cutanée

(Weicherding, 1997). Le prélèvement de cheveux sur les trois premiers centimètres à ras du

cuir chevelu, permet d’obtenir le degré moyen d’exposition entre le début et le deuxième mois

et la fin du quatrième mois précédant le prélèvement. Les résultats des mesures du plomb

dans les cheveux sont ainsi moins variables aux variations sanguines de court terme. Mais au

delà des huit premiers centimètres la contamination exogène du cheveu devient importante

(Huel et al., 1992).

Aucune technique ne permettant de différencier le plomb interne au cheveu du plomb

exogène, la mesure peut induire une surestimation de l’imprégnation saturnine. Au-delà du

dixième centimètre les quantités mesurées peuvent atteindre deux à trois fois les valeurs

initiales mesurées à proximité du cuir chevelu (Sterling et al., 1999).

1. 7. 4. Mesure du plomb dans les dents :

L’interprétation des mesures dépend du type de dent et de la fraction analysée : dent

totale, dentine, dentine circumpulpaire. Ces tissus ont en effet la propriété de concentrer les

métaux lourds, le plomb en particulier, et constituent par la même un matériel biologique

attrayant et pertinent. L’analyse des dents offre l’avantage de refléter une exposition encore

plus lointaine que les analyses effectuées sue les cheveux ou le sang, elles pourraient donc

être complémentaires (Stoklov et al., 1985).

1. 7. 5. Mesure du plomb dans les os :

Le plomb stocké dans les os peut être mesuré par une technique non invasive : « La

fluorescence X». Toutefois la sensibilité de la méthode parait encore un peu limitée avec un

coût d’appareillage élevé (Kim et al., 1996). A l’échelle épidémiologique, la mesure de la

quantité de plomb osseux pourrait se révéler particulièrement intéressante. On évaluerait alors

l’imprégnation cumulative réelle (Hoppin et al., 1997).


39

1. 8. Effets sur la reproduction et le développement :

Chez l'homme, les études suggèrent qu'une exposition à long terme au plomb de

plusieurs années, de l'ordre de 6 à 10 ans (plombémie supérieure à 400 μg/l), provoque une

réduction de la production des spermatozoïdes et, donc, un risque d'hypofertilité (Alexander

et al., 1996).

L’étude de Lin et al. (1996), réalisée sur plus de 4000 sujets exposés

professionnellement a pu mettre en évidence une diminution significative du nombre des

naissances par comparaison au groupe témoin (5000 personnes) dans toutes les catégories

d’âges étudiées hormis le groupe de 51 à 55 ans (Lin et al., 1996 ;Neal et al., 2005 ).

Par ailleurs, le plomb perturbe la sécrétion d'hormones sexuelles. Ainsi, la

concentration de testostérone est diminuée chez l'homme pour des plombémies supérieures à

600 μg/l (Rodamilans et al., 198 ; Parenteau, 2007 ).

Pour des plombémies inférieures à 5000 μg/l, aucune des deux études réalisées

récemment en milieu professionnel n'a pu mettre en évidence une diminution de la

production, de la mortalité ou de la morphologie des spermatozoïdes (Kuo et al., 1997 ). La

fertilité semble être affectée par l'exposition paternelle au plomb (Guzick et al., 2001).

Chez les femmes ayant une plombémie moyenne de 150 μg/l, plusieurs études n’ont

montré aucune augmentation du risque d'avortement spontané comparativement à un groupe

témoin (Murphy et al., 1990). Cependant, une baisse de fécondité a pu être associée à un

groupe de femmes qui présentait des plombémies comprises entre 290 et 500 μg/l (Sallmen et

al., 1995 ; Greenlee, 2003).

Par ailleurs, contrairement aux résultats d'une étude qui suggérait que le plomb

entraînait une réduction du poids de naissance, des accouchements prématurés et une

altération de la croissance et du développement fœtal, une étude plus récente ne retrouve pas

d'effet sur le poids de naissance ou la durée de la grossesse pour les mères dont les

plombémies sont inférieures à 150 μg/l (Bellinger et al., 1991).


40

2. Anatomie et physiologie de la reproduction chez le rat mâle:

Chez l’adulte, l’appareil reproducteur assure la production, le stockage et le transport

du matériel génétique contenu dans les gamètes mâles, ou spermatozoïdes.

Les organes principaux sont les testicules, les épididymes, les canaux déférents, le canal

éjaculateur, l’urètre et le pénis. Les organes auxiliaires sont la prostate, les glandes bulbo-

urétrales, et les vésicules séminales (figure 5 ).

2. 1. Les testicules :

Les testicules assurent une double fonction : la production des spermatozoïdes et la

sécrétion d’hormone sexuelle male, la testostérone (Dadoune et Démolin, 1991). Ils descendent

entre le 30ème et 40ème jour, sont de forme ovoïdes et mesurent jusqu’à 2 cm de long. Ils

atteignent un poids légèrement supérieur à 1 gramme lorsqu’ils sont dépourvus de leur

épididyme. Les testicules sont reliés à un épididyme. L’épididyme est une structure allongée

composée d’une tête, d’un corps et d’une queue. La tête se situe au sommet du testicule et le

corps longe le bord postérieur du testicule.

La queue de l’épididyme se prolonge ensuite par le canal déférent qui débouche dans

l’urètre. Ce dernier est destiné à évacuer les urines et le sperme. Les testicules sont logés dans la

bourse, dont le revêtement cutané est le scrotum. Ce dernier est nettement visible en position

ventro-latérale par rapport à l’anus. La distance ano-génitale est plus grande chez le male par

rapport à la femelle. La peau du scrotum est mince et couverte de poils fins. En effet, le canal

inguinal, dont le diamètre peut atteindre jusqu’à 8-12 mm, reste ouvert tout au long de la vie de

l’animal, ce qui permet aux testicules de prendre une position soit scrotal soit inguinale. Le

scrotum a pour fonction de maintenir les testicules à une température permettant la production

des spermatozoïdes (figure 6).

Quand il se contracte, les testicules montent vers la cavité abdominale et récupèrent de

la chaleur corporelle. Au contraire, quand il se détend, les testicules se refroidissent (Bouchon,

2007). Chaque testicule est revêtu par une capsule fibreuse, l’albuginée, tapissée à l’extérieur

par la tunique vaginale, feuillet du diverticule péritonéal et, à l’intérieur, par la tunique

vasculaire riche en vaisseaux sanguins.


41

1- Glande coagulante 2- Vessie 3- Canal déférent Epididyme 5- Intestin grêle 6- Vésicule séminale 7- Prostate 8- Pénis 9- Testicule 10- Scrotum

Figure (5) : Photographie de la cavité abdominale d’un rat mâle montrant une partie des

organes composant le système uro-génital (Bennett et Mullen, 2004).

Figure (6) : Testicule et épididyme du rat (Bihun, 2004).

Mis en forme : Droite


42

L’albuginée est constituée de trousseaux de fibres de collagènes et renferme des

cellules musculaires lisses. Elle est énervée par des terminaisons nerveuses adrénergiques et

quelques terminaisons cholinergiques. La tunique albuginée se contracte spontanément et

rythmiquement. Ces contractions contribuent à propulser les spermatozoïdes et le liquide

testiculaire hors des testicules. L’albuginée s’enfonce dans la profondeur du testicule pour

constituer le corps de Highmore, perforé par des vaisseaux et le rete testis. Entre l’albuginée

et le corps de Highmore sont tendues des cloisons ou septa, qui délimitent des lobules

testiculaires, chacun contenant des tubes séminifères (Dadoune et al., 2000). Les testicules

sont irrigués grâce à une grande vascularisation provenant de l’artère testiculaire et dont les

branches cheminent dans l’albuginée, puis dans l’espace interstitiel.

2. 2. Les tubes séminifères :

Les spermatozoïdes sont formés dans les tubes séminifères. Ils sont ensuite propulsés

dans la lumière du tube séminifère et sortent du testicule en passant par le rete testis (Dym,

1976). Le rete testis est un regroupement particulier de tubes où convergent les tubes

séminifères. Les spermatozoïdes continuent alors leurs processus de maturation le long de

l’épididyme où ils acquièrent leur mobilité et deviennent fécondant (Soler et al., 1994) (figure

7). La paroi des tubes est formée de dedans en dehors par :

une lame basale, constituée principalement de la laminine, de collagène de type IV.

Une ou plusieurs assises de cellules myoïdes riches en myosine, actine et en

fibronectine. Elles ne paraissent pas innervées et leurs contactions résultent d’un

contrôle endocrine-paracrine. Les contractions jouent un rôle essentiel dans l’évacuation

des spermatozoïdes des tubes séminifères.

Une couche de fibrilles de collagène de type I et IV, revêtue par l’assise de cellules

endothéliales qui délimite les capillaires lymphatiques du tissu interstitiel (Setchell et al.,

1994).


43

Figure (7) : Testicule de rat en coupe transversale colorée à l’hématoxyline-éosine (Vernet,

2006).

Les tubes séminifères contournés (une section de tube est encerclée) sont entourés d’un

espace interstitiel (une partie est coloriée en jaune). Les tubes se rejoignent dans le rete testis.

Le testicule est entouré par l’albuginée dans lequel viennent se loger des prolongements de

l’artère testiculaire.

Les tubes séminifères contiennent des cellules germinales à différents stades de leur

développement ainsi que des cellules somatiques, les cellules de Sertoli (Dadoune et

Demolin, 1991). Cette association de cellules germinales et de cellules de Sertoli forme

l’épithélium séminifère.

Les cellules germinales sont hautement organisées dans l’épithélium séminifère. Les

cellules les moins différenciées sont situées du coté basal du tube séminifère (vers la lame

basale). Et les cellules les plus matures sont situées du coté apicale du tube séminifère (vers la

lumière) (figure 8).


44

Figure (8) : Coupe histologique du testicule montrant des sections de tubes séminifères et un

espace interstitiel occupé par des amas de cellules de Leydig (x 1700) (Raymond, 2005).

Cellules de Sertoli

Spermatides

Spermatocytes

Spermatogonies

Cellules de Leydig

Gaine péritubulaire


45

2. 3. Les espaces interstitiels :

Les espaces compris entre les tubes séminifères sont occupés par du tissu conjonctif

lâche, riche en vaisseaux sanguins et lymphatiques et en nerfs, au duquel sont réparties des

petits amas de cellules interstitielles ou cellule de Leydig et diverses cellules libres

(fibroblaste, macrophage, mastocytes). La quantité du tissu interstitiel varie suivant l’espèce,

environ 25-30% chez l’homme (Holstein et Davidoff, 1997).

Les voies spermatiques intra testiculaires sont formées par un court segment tubulaire

de calibre réduit dont la paroi est constituée par des cellules de Sertoli qui pourraient jouer un

rôle de valvules. Les testicules renferment un complexe vasculaire constitué par l’artère

testiculaire et les veines testiculaires et épididymaires. L’artère, très pelotonnée à son

extrémité distale se divise en branches terminales qui parcourent l’albuginée. Les veines se

regroupent au pôle dorsal du testicule pour former le plexus pampiniforme étroitement

appliqué sur l’artère testiculaire. Des vaisseaux lymphatiques en provenance du testicule et de

l’épididyme sont disposés à la périphérie du complexe vasculaire. Le réseau lymphatique des

espaces interstitiels est particulièrement développé chez les rongeurs Le sang veineux

testiculaire véhicule de la testostérone et des stéroïdes sulfates en quantité élevées.

Chez l’homme les différences entre les concentrations (ng/ml) dans le sang veineux et

le sang artériel sont de l’ordre de 200 à 680 (testostérone), de 96 à 155 (sulfate de dehydr-

épiandrostérone), de 34 à 102 (sulfate d’androsténediol).

Les testicules sont innervés par des rameaux qui accompagnent l’artère testiculaire. De

nombreuses terminaisons adrénergiques innervent les vaisseaux, dont elles contrôlent la

vasomotricité, les cellules musculaires lisses de la gaine péritubulaire (Waites et Setchell,

1990).

2. 4. Le liquide des compartiments intratesticulaire :

Les tubes séminifères et les cellules interstitiels sont baignés par le liquide interstitiel.

Il joue un rôle déterminant dans la fonction endocrine et paracrine du testicule.

Le liquide contenu dans les tubes séminifères assure le transport des spermatozoïdes relargués

dans la lumière. Il contient environ dix fois plus de potassium que le sang.


46

Le magnésium et le phosphore total sont également plus abondants, alors que la

concentration en chlore et en calcium est semblable à celle du sang. La concentration en

protéines est nettement plus basse que celle du sang et du liquide interstitiel. Le liquide du

rete testis (débit de 4 à 20 µg/gr de testicule/heure véhicule des spermatozoïdes immobiles, ne

serait qu’une sécrétion tubulaire remaniée, probablement du fait d’échanges avec les veines

testiculaires superficielles (Setchell et al., 1994).

2. 5. La spermatogenèse :

La spermatogenèse est le processus par lequel les cellules germinales se différencient

pour former les spermatozoïdes. Elle se déroule à l’intérieure des tubes séminifères (Faure,

2007).

2. 5. 1. Phases de la spermatogenèse :

Le cycle spermatogénique est défini comme la succession chronologique des différents

stades de maturation d’une génération de cellules germinales, en un point fixe du tube. Sur le

plan fonctionnel, la spermatogenèse peut être décomposée en trois phases : la phase

proliférative (a), la phase méiotique (b) et la spermiogenèse (c) (Bellve et al., 1977 ; Jégou,

1995). Ces trois phases sont représentées dans la figure 9 avec les différents types de cellules

germinales impliquées dans chacune des phases. La première phase de la spermatogenèse est

une phase proliférative portant sur les spermatogonies (type A, In ou B) qui se divisent par

des mitoses classiques.


47

Figure (9) : Phases de la spermatogenèse chez le rat et types de cellules germinales concernés (Cayrouse, 2005).


48

La seconde phase est une phase méiotique portant sur les spermatocytes primaires et

secondaires dans lesquels on assiste à une recombinaison du matériel génétique et à une

ségrégation chromosomique. La troisième et dernière phase est une phase de différenciation

ou spermiogenèse. Une réorganisation cytoplasmique majeure et un remodelage chromatinien

complexe se déroulent pendant la spermiogenèse au niveau des cellules haploïdes que sont les

spermatides rondes et allongées. Cette différenciation permet alors la formation des cellules

germinales les plus matures : les spermatozoïdes.

La phase proliférative est largement simplifiée sur la figure 10. Elle met en jeu de

nombreux stades intermédiaires de différenciation des spermatozoïdes de type A de (de Rooij,

2002 ; Dym, 1994).

Figure (10) : Renouvellement et multiplication des spermatogonies (de Rooij, 2002).


49

Les spermatogonies indifférenciées et isolées de type Asingle (As) se divisent d’une

manière asymétrique. Cette division donne naissance d’une part à des spermatogonies de type

As qui permettent de renouveler l'épithélium séminifère, et d'autre part à des spermatogonies

indifférenciées de type appariées (Apr). Ces dernières subissent ensuite des divisions

mitotiques successives formant ainsi des alignements de spermatogonies de type Aal

(Aal-4 : 2 divisions ; Aal-8 : 3 divisions ; Aal-16 : 4 divisions). Ces dernières spermatogonies

vont se diviser et se différencier en spermatogonies de type A1 à A4, puis en spermatogonies

de type intermédiaire (In). Enfin, elles atteignent le stade spermatogonie de type B (B).

2. 5. 2. Stades de l’épithélium séminifère :

Tous les types de cellules germinales sont présents dans l’épithélium séminifère, à

savoir, les spermatogonies, les spermatocytes et les spermatides.

Les cellules germinales sont hautement organisées : elles forment une série d’associations

cellulaires ou stades de l’épithélium séminifère de telle manière qu’un même stade donné

occupe la totalité d’une section transversale d’un tube séminifère (Russell et al.,

1993). La Figure 11 et 12 représente les quatorze stades (I à XIV) du cycle de l’épithélium

séminifère chez rat.

2. 5. 2. 1. Cellules germinales associées à la phase proliférative :

Les spermatogonies de type A sont représentées sur la figure et sont réparties dans la

totalité des stades. Les spermatogonies de type intermédiaires (In) sont présentes aux stades

II-III et IV. Les spermatogonies de type B sont quant à elles localisées aux stades V et VI. De

plus, toutes les cellules germinales associées à la phase proliférative sont situées du côté basal

du tube séminifère. Elles sont en contact étroit avec la lame basale.

2. 5. 2. 2. Cellules germinales associées à la phase méiotique :

Il existe différents types de spermatocytes primaires. Les spermatocytes préleptotènes

(PR) sont présents aux stades VII-VIII, les spermatocytes leptotènes (L) aux stades IX-X-XI,

les spermatocytes zygotènes (Z) aux stades XII-XIII, les spermatocytes pachytènes (P) aux

stades I à XII et enfin, les spermatocytes diplotènes (D) au stade XIII uniquement.


50

Figure (11): Stades de l’épithélium séminifère chez le rat. Les cellules les moins différenciées

sont représentées en bas du schéma et sont localisées du coté basale du tube séminifère. Les

cellules les plus différenciées apparaissent en haut du schéma et sont localisées du coté apical

(lumière) du tube séminifère.

La figure décrit de gauche à droite les changements qui surviennent avec le temps, un points

donné du tube séminifère durant 53,2 jours (soit environ 6.1 cycles de l’épithélium séminal)

nécessaire au déroulement complet de la spermatogenèse.

As = spermatogonies, As-pr = spermatogonies appariées, As-pr-al = alignement des

spermatogonies appariées, Aal-n = alignement de spermatogonies en nombre n de cellules, An

= spermatogonie de type A différenciées In =spermatogonies de type intermédiaires, B =

spermatogonies de type B qui subissent une division mitotique finale avant la réplication et la

division méiotique I, Pl = preleptotène, L = leptotène, Z = zygotène, P = pachythène, m =

méiose, In = intermédiaires, et Sc = cellules de Sertoli (Dym et Clermont, 1970).


51

Stage 1

Stage 2

Stage 3

Stage 4

Stage 5

Stage 6

Stage 7

Stage 8

Stage 9

Stage 10

Stage 11

Stage 12

Stage 13

Stage 14

Stage 14

Stage 14

Figure (12) : Stades de l’épithélium séminifère chez le rat (Dym et Clermont, 1970).

http://www-personal.umich.edu/%7Eakc/CycleSE/01stage-C19L73%2850%29.htm

































52

Ensuite, les spermatocytes secondaires (m2om) sont présents au stade XI et sont

facilement reconnaissables car elles enchaînent les deux divisions méiotiques.

Les spermatocytes préleptotènes, leptotènes et zygotènes sont situés du côté basal du tube

séminifère. Contrairement aux spermatogonies, ils sont moins excentrés et ne sont pas en

contact avec la lame basale. Les autres spermatocytes forment la seconde couche qui se situe

plus au centre du tube séminifère (Dadoune, 2006).

2. 5. 2. 3. Cellules germinales associées à la spermiogenèse :

La spermiogenèse est divisée en 19 étapes. Chaque étape est associée à un aspect

caractéristique de l’acrosome des spermatides. L’acrosome est une structure qui recouvre

l'extrémité antérieure du spermatozoïde et qui produit des enzymes facilitant la pénétration

dans l’ovocyte lors de la fécondation. Les spermatides associées aux étapes 1 à 8 sont rondes

et toutes les autres spermatides (étapes 9 à 19) sont en voie d’élongation. Les spermatides

apparaissent à tous les stades de l’épithélium séminifère. A la fin de leur différenciation, les

spermatides matures (ou spermatozoïdes) sont larguées dans la lumière du tube séminifère

(spermiation).

Dans l’épithélium séminifère, les spermatides des étapes 1 à 14 forment la cinquième

couche de l’épithélium séminifère alors que les spermatides des étapes 15 à 19 forment la

sixième et dernière couche, à savoir la couche la moins excentrée.

Le même stade de l’épithélium séminifère occupe la totalité d’une section transversale du tube

séminifère. Il est alors possible de distinguer les stades en fonction de l’état de différenciation

des types cellulaires présents. Les spermatides peuvent être différenciées grâce à des

colorations comme la coloration au bleue de toluidine ou la coloration de Schiff utilisant

l’acide périodique. Ces méthodes colorent spécifiquement l’acrosome qui coiffe

progressivement les spermatides en différenciation.

La spermatogenèse est un processus cyclique (Zhao et Garbers, 2002). Le temps

nécessaire à la maturation des gamètes mâles, c'est-à-dire pour passer d’une spermatogonie de

type A à un spermatozoïde (ou spermatide étape 18) correspond à la durée de la

spermatogenèse. Elle est de 53,2 jours chez le rat.


53

La durée d’un cycle de l’épithélium séminifère correspond au temps nécessaire à une

cellule germinale pour devenir une cellule plus différenciée du même stade du cycle de

l’épithélium séminifère. Cette durée est de 13,3 jours environ chez le rat.

2. 5. 3. Initiation de la spermatogenèse :

Durant la période foetale, on assiste à une multiplication des cellules germinales

primordiales qui se différencient en gonocytes (Nagano et al., 2000; Vergouwen et al., 1993).

Les gonocytes se multiplient constamment et sont localisés au centre du cordon séminifère qui

est le précurseur du tube séminifère (dépourvu de lumière). A seize jours de vie in utero, la

prolifération des gonocytes s’arrête en phase G1 du cycle cellulaire pendant environ quatre

jours. A dix huit jours et demi du stade embryonnaire (durée de gestation de la ratte : 20

jours), les gonocytes commencent à migrer en périphérie des cordons séminifères. Un jour et

demi après la naissance, la prolifération des gonocytes recommence. De plus, leur migration

vers la périphérie du cordon séminifère, qui avait commencé à la fin du stade embryonnaire,

se poursuit (Nagano et al., 2000).

Cinq jours après la naissance, les gonocytes achèvent leur migration vers la membrane basale

et commencent à se différencier en spermatogonies de type A. Si les gonocytes n’arrivent pas

à se localiser vers la membrane basale vers l’âge de 10-13 jours, ils meurent par apoptose

(Werner et DeLuca, 2001).

La première vague de la spermatogenèse se déroule suivant les mêmes étapes que

celles décrites précédemment pour l’adulte. L’initiation de la méiose s’effectue à l’âge de dix

jours (Bellve et al., 1977). Enfin, les spermatozoïdes apparaissent pour la première fois dans

la lumière du tube séminifère 35 jours après la naissance. C’est la fin de la première vague de

la spermatogenèse, le testicule peut être considéré comme pubère (Aitken et al., 2006) (figure

13).


54

Figure (13) : Les ondes spermatogénétiques chez le rat (Dym et Clermont, 1970)

2. 5. 4. La cellule de Sertoli :

Tout au long de la spermatogenèse, les cellules germinales sont dépendantes d’une

population de cellules somatiques : les cellules de Sertoli. La cellule de Sertoli est de forme

pyramidale et repose sur la lame basale du tube séminifère (Russell et Griswold, 1993). Elle

constitue un véritable squelette pour les cellules germinales. Ses faces latérales sont en

contact étroit avec environ cinq autres cellules de Sertoli et avec trente à cinquante cellules

germinales (Weber et al., 1983). La forme et le volume de la cellule de Sertoli varient au

cours du cycle de l’épithélium séminifère de manière à optimiser l’adhérence des cellules

germinales avec lesquelles elle est en contact.

La figure 14 illustre la structure d’une cellule de Sertoli au stade V de l’épithélium séminifère.

Les points d’encrage où viennent se loger les cellules germinales sont indiqués par des

flèches.


55

Figure (14) : Structure d’une cellule de Sertoli de rat au stade V du cycle de l’épithélium

séminifère (Russell et Griswold, 1993).

Le noyau de la cellule de Sertoli est situé du côté basal du tube séminifère (Russell et

Griswold, 1993). Il a une forme irrégulière avec une invagination bien marquée (Figure 15).

De plus, son nucléole est très volumineux. Ces caractéristiques permettent de distinguer le

noyau de la cellule de Sertoli des noyaux des cellules germinales qui sont arrondis

Figure (15): Photographie obtenue par microscopie électronique montrant le noyau, le nucléole et

une partie du cytoplasme d’une cellule de Sertoli (Sharpe et al., 2003).


56

2. 5. 4. 1. Fonctions de la cellule de Sertoli :

En plus de la fonction de maintien de l’architecture de l’épithélium séminifère, la

cellule de Sertoli assure d’autres fonctions. Elle sépare tout d’abord l’intérieur du tube

séminifère de la circulation sanguine, fournissant ainsi un environnement adéquat pour la

méiose et la spermiogenèse. Elle contrôle également, à l’intérieur du tube séminifère, la

production ou l’élimination de facteurs de croissance, de nutriments et d’autres produits

chimiques.

2. 5. 4. 2. Mise en place de la barrière hémato-testiculaire :

Le contact entre les faces baso-latérales des cellules de Sertoli forme un complexe de

jonctions continues essentiellement composé de jonctions serrées. Ces jonctions serrées

apparaissent entre 10 et 16 jours après la naissance (Russell et Griswold, 1993). Elles créent

une véritable barrière entre l’épithélium séminifère et le flux sanguin : c’est la barrière

hémato-testiculaire.

Cette barrière sépare le tube séminifère en deux compartiments, le compartiment basal

et le compartiment apical. Les cellules du compartiment basal sont en contact avec le milieu

extérieur du tube séminifère alors que les cellules du compartiment apical en sont isolées.

La Figure 16 représente la barrière hémato-testiculaire en fonction du stade de l’épithélium

séminifère. Un traceur (le nitrate de lanthane par exemple) injecté dans la circulation sanguine

permet de mettre en évidence le compartiment basal et le compartiment apical et permet de

vérifier ainsi la fonctionnalité de la barrière hémato-testiculaire. Le traceur est représenté en

rouge sur la figure.

Les spermatogonies de type A et B ainsi que les spermatocytes préleptotènes et

leptotènes sont localisés dans le compartiment basal (Figure 16 a et b). Ensuite, entre les

stades X et XII, les jonctions serrées s’ouvrent pour que les spermatocytes leptotènes

rejoignent le compartiment apical. Enfin, toutes les autres cellules plus matures sont localisées

dans le compartiment apical, dont par exemple les spermatocytes zygotènes (Thibault et

Levasseur, 2001) (figure 16 c).


57

Figure (16) : Mise en évidence de la barrière hémato-testiculaire. Un traceur (représenté en

rouge) injecté dans la circulation sanguine permet de révéler le compartiment basal du tube

séminifère (Thibault et Levasseur, 2001).

La mise en place des jonctions serrées formant la barrière hémato-testiculaire permet

de maintenir un environnement adéquat pour assurer le développement des cellules

germinales. Elle sépare par exemple les cellules germinales haploïdes de tout contact avec la

circulation sanguine. Enfin, la dynamique de ces jonctions serrées est en étroite relation avec

les stades de l’épithélium séminifère : les jonctions s’ouvrent et se ferment entre les stades X

et XII. Ce mécanisme est essentiel à la migration des spermatocytes du compartiment basal

vers le compartiment apical du tube séminifère.

Stades XI à XIV


58

2. 5. 4. 3. Activité de phagocytose :

La cellule de Sertoli assure une triple fonction de phagocytose (Russell et al., 1990).

Tout d’abord, elle élimine les cellules germinales qui ont dégénéré au cours de la

spermatogenèse. Ensuite, elle phagocyte les reliquats de cytoplasme (corps résiduels) perdus

par les spermatozoïdes lors de la spermiation (correspond au largage des spermatozoïdes dans

la lumière du tube séminifère). Enfin, elle élimine les complexes de jonctions (un complexe

de jonctions adhérentes permet de maintenir les cellules germinales au contact de la cellule de

Sertoli. Sans ce dernier, les cellules germinales se décrocheraient de l’épithélium séminifère

et seraient larguées dans la lumière du tube séminifère trop précocement) qui sont sans cesse

renouvelés (Vernet, 2006).

2. 5. 4. 4. Activité de sécrétion :

L’activité de sécrétion de la cellule de Sertoli est essentielle au bon déroulement de la

spermatogenèse (Jégou, 1995; Russell et Griswold, 1993). Elle permet à la cellule de Sertoli

de communiquer directement et simultanément avec toutes les autres cellules de l’épithélium

séminifère, à savoir les cellules germinales. Ceci lui donne un rôle prépondérant dans le

contrôle de l’activité de l’épithélium séminifère. La cellule de Sertoli sécrète en particulier le

fluide testiculaire, des nutriments, des protéines ainsi que différents facteurs de croissance.

2. 5. 4. 4. 1. Fluide testiculaire :

Le fluide testiculaire est tout d’abord nécessaire à la formation de la lumière des tubes

séminifères. Il permet également le transport des spermatozoïdes dans la lumière du tube

séminifère ainsi que le transit, à l’intérieur du tube séminifère, des différentes molécules

(nutriment, protéines ou facteurs de croissance) produites par la cellule de Sertoli (Russell et

al., 1989).


59

2. 5. 4. 4. 2. Nutriments :

Les cellules de Sertoli fournissent aux cellules germinales du compartiment apical leur

substrat énergétique préférentiel qu’est le lactate. Pour cela, elles captent le glucose dans le

sang, le transforment en pyruvate par glycolyse, puis en lactate grâce à une enzyme spécifique

: la lactate déshydrogénase (LDH) (Boussouar et Benahmed, 2004).

2. 5. 4. 4. 3. Protéines et facteurs de croissance:

La cellule de Sertoli est la cellule pivot autour de laquelle s’organise toute l’activité

fonctionnelle du testicule. Elle sécrète de nombreuses protéines et facteurs de croissance

nécessaires à la spermatogenèse (Jégou, 1995; Russell et Griswold, 1993).

Certaines de ces protéines, comme l’activine où l’inhibine, permettent de contrôler la

prolifération des spermatogonies ainsi que les productions hormonales. D’autres sont des

protéines de transport responsables de l’acheminement de nutriments, vitamines et hormones

vers les cellules germinales. Parmi ces protéines de transport, la cellule de Sertoli sécrète des

protéines liant les métaux (transferrine, ceruloplasmine), les lipides (clusterine, saposine) ou

les hormones (protéines de liaison aux androgènes ou à l’acide rétinoïque). La cellule de

Sertoli sécrète aussi des protéases (cathepsine-L, métalloprotéases), peut-être nécessaires à la

migration des cellules germinales vers la lumière du tube séminifère. Pour cela, les protéases

digèreraient les complexes de jonctions formées entre les cellules de Sertoli et les cellules

germinales. A la fin de la spermatogenèse, les protéases permettraient la spermiation

puisqu’elles interviendraient dans la digestion des complexes de jonctions reliant les

spermatides matures aux cellules de Sertoli. Enfin, la cellule de Sertoli sécrète des facteurs de

croissance tels que les facteurs de croissance transformant (TGF) ou les interleukines.

2. 5. 5. Cycle de la cellule de Sertoli :

La cellule de Sertoli a une activité cyclique (Russell et Griswold, 1993). En effet, sa

morphologie, son volume, ses activités de phagocytose et de sécrétion varient de manière

cyclique.


60

Il est vraisemblable que le cycle de la cellule de Sertoli soit synchronisé avec celui de

l’épithélium séminifère pour permettre un bon déroulement de la spermatogenèse. On peut se

demander comment se met en place cette synchronisation. Deux expériences permettent

d’apporter des éléments de réponse à cette question.

La production de l’interleukine IL-1α par les cellules de Sertoli est augmentée in vitro

par la présence de corps résiduels que perdent les spermatides lors de la spermiation (Gerard

et al., 1992). La phagocytose de ces corps résiduels serait donc à l’origine de la production

cyclique de différents facteurs comme ici l’IL-1α.

Les modifications cycliques de la cellule de Sertoli apparaissent très tôt (Timmons et

al., 2002). Timmons et al. ont montré qu’à 18 jours du développement embryonnaire, l’ARN

messager de la lectine galectin 1 est exprimé dans les cellules de Sertoli de façon cyclique. En

d’autres termes, certains cordons séminifères expriment la galectin 1 et d’autre pas. Les

gonocytes sont à ce stade embryonnaire arrêtés en phase G1 du cycle cellulaire (Nagano et

al., 2000).

A la vue de la première expérience, le cycle de la cellule de Sertoli se synchronise sur

le cycle de l’épithélium séminifère. A la vue de la seconde expérience, le cycle de la cellule

de Sertoli apparaît avant même le début de la différenciation morphologique des

spermatogonies. En conclusion, on peut suggérer que le cycle de l’épithélium séminifère

influence le cycle de la cellule de Sertoli chez l’adulte. Par contre, dans les testicules Pré

pubères, les cellules germinales ne semblent pas jouer un rôle dans la mise en place du cycle

de la cellule de Sertoli. La cellule de Sertoli joue assurément un rôle important dans la mise

en place du cycle de l’épithélium séminifère, mais les mécanismes moléculaires mis en jeu

n’ont pas encore été découverts.

2. 5. 5. 1. Prolifération des cellules de Sertoli :

A la naissance, les cellules de Sertoli représentent 80% des cellules du tube séminifère

(Bellve, 1993). Elles sont morphologiquement différentes de celles des souris adulte. En effet,

elles ont des formes irrégulières et leur noyau contient un à deux nucléoles.


61

Au cours des 10-12 premiers jours après la naissance, les cellules de Sertoli se divisent par

mitose (Vergouwen et al., 1993).

Cette prolifération atteint un pic juste après la naissance. A l’âge de 10-12 jours, les cellules

de Sertoli ont obtenu leur structure définitive. Elles deviennent alors incapables de proliférer

(Clermont et Perey, 1957).

Dans le tube séminifère adulte, les cellules de Sertoli post-mitotiques représentent

approximativement 3% des cellules du tube séminifère et sont les seules cellules somatiques

en contact direct avec les cellules germinales (Bellve, 1993).

2. 5. 5 2. Etablissement du ratio cellules germinales / cellules de Sertoli :

Une vague d’apoptose des cellules germinales, indispensable pour le bon déroulement

de la spermatogenèse chez l’adulte (Rodriguez et al., 1997), se produit au cours de la

première vague de la spermatogenèse (Wang et al., 1998).

Elle atteint un pic à l’âge de 10 à 13 jours après la naissance (Wang et al., 1998), période

pendant laquelle les cellules de Sertoli cessent de proliférer.

Cette apoptose s’explique par le fait que le nombre de cellules germinales est fonction

du nombre de cellules de Sertoli. L’établissement du ratio cellules germinales / cellule de

Sertoli reflète le fait que les cellules de Sertoli ne peuvent « soutenir » qu’un nombre limité de

cellules de la lignée germinale. Un argument en faveur de cette explication est que la

réduction expérimentale du nombre de cellules de Sertoli dans les testicules de rat pré-pubères

entraîne une diminution proportionnelle du nombre de spermatides rondes chez l’adulte sans

affecter pour autant la spermatogenèse (Orth et al., 1988).

2. 5. 6. Les espaces interstitiels : Les tubes séminifères dans lesquels se déroule la spermatogenèse sont séparés par un

tissu conjonctif lâche : l’espace interstitiel (Figure 17).


62

Figure (17) : Coupe de testicule sur laquelle figure l’espace interstitiel situé entre les tubes

séminifères (Lécureuil et al., 2007).

L’espace interstitiel contient des nerfs, une vascularisation lymphatique et une

vascularisation artério-veineuse (Dadoune et Démolin, 1991). L’ensemble de ces structures

permet d’alimenter les tubes séminifères en nutriments et en facteurs de croissance essentiels

à la spermatogenèse. L’espace interstitiel contient également des cellules spécialisées

dispersées entre les tubes séminifères : les cellules de Leydig. Ces dernières sont des cellules

glandulaires endocrines qui sécrètent des androgènes essentiellement sous la forme de

testostérone.

La testostérone agit à différents niveaux. Tout d’abord, elle joue un rôle important

dans le développement des organes reproducteur mâles comme les vésicules séminales, la

prostate ou le pénis. Ensuite, elle active le développement et le maintien des caractères

sexuels secondaires. Par exemple, elle stimule la fonction des glandes sébacées et

sudoripares et influe sur les comportements sexuels. Enfin, elle agit sur la spermatogenèse

au travers de son rôle dans la régulation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique.

2. 5. 7. Les glandes annexes :

Les glandes génitales accessoires sont très développées chez le male. Elles produisent

un bouchon copulatoire gélatineux qui est visible dans le vagin après l’accouplement et qui

est supposé empêcher les fuites de sperme.


63

Ces glandes génitales accessoires rassemblent les vésicules séminales, la prostate, les glandes

ampullaires et les glandes bulbo-urétrales. Les vésicules séminales s’étendent dorso-

latéralement à la vessie, au-delà des crêtes iliaques, et sont dorsalement en contact avec

rectum. Leurs extrémités supérieures sont brutalement recourbées vers l’arrière du corps.

Elles sont grandes, lobulés et s’ouvrent dans l’extrémité inférieure du canal différent.

Chacune est entourée d’une capsule de même que le lobe dorsal de la prostate.

La prostate se compose de trois paires de glandes appelées lobe dorsal, lobe ventral et

lobe latéral. La partie crânio-dorsal aussi appelée glandes coagulante est la plus volumineuse.

Elle est intimement associée à la vésicule séminale. Elle s’étend le long de sa face interne tout

en partagent la même gaine de fascia. Elle mesure 14 à 18 mm de long sur 3 à 6 mm de large.

Les glandes ampullaires sont les glandes du canal déférent qui se situent à coté de la

vessie. Les glandes bulbo-urétrales se rencontrent à coté de l’urètre, à sa sortie du bassin.

Elles forment un haricot de 5 mm de long et se drainent dans la face dorsale de l’urètre près

de son fléchissement. L’urètre présente un sinus urétral au niveau de la région du bulbe

urétral.

Les glandes préputiales se logent dans le tissu graisseux sous cutané à côté du pénis et

s’ouvrent dans le prépuce. Ce sont des glandes sébacées qui sécrètent une phéromone utilisée

pour le marquage odoriférant. Celles-ci régressent avec l’âge et peuvent se remplir de sébum

stagnant. Une glande analogue est aussi présente chez la femelle (Harayama et al., 2000).

Le pénis a la forme d’un 7 avec un angle antéro-ventral. Il est pourvu de 1 à 2 petits os

péniens. Le gland pénien, rugueux du fait de la présence de papilles épidermiques, se situe

dans le sac préputial. Une paire de glandes préputiales de grande taille, aplaties et en forme de

feuille, est présente juste à proximité du gland pénien. Elles sont étroitement adhérentes au

gland pénien. Leurs longs conduits excréteurs s’ouvrent dans la cavité préputiale près de

l’extrémité du prépuce. Il existe aussi de minuscules glandes anales (Dacheux et Dacheux,

2001) (figure 18).


64

Figure (18) : Schéma en vue dorsale de l’appareil génital mâle (Popesko et al., 1992).

2. 6. Régulation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique :

La spermatogenèse est régulée par des interactions endocriniennes entre l’hypothalamus,

l'hypophyse, les cellules de Sertoli et les cellules de Leydig (Dohle et al., 2003). Ce système

endocrinien est désigné sous le nom d'axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique. Il englobe

une série de mécanismes de signalisation schématisés (Figure 19).

Ces mécanismes sont impliqués entre autres dans le contrôle de la quantité de

testostérone qui va se lier dans la cellule de Sertoli à son récepteur (récepteur des

androgènes). Cette liaison est essentielle au bon déroulement de la spermatogenèse. Elle

permet notamment le déclenchement et l’entretien de la spermatogenèse et inhibe l’apoptose

des cellules germinales (Singh et al., 1995).


65

D’une part, l’hormone lutéinisante (LH), qui est une gonadotrophine sécrétée par

l’hypophyse, contrôle la production de testostérone en se liant à un récepteur membranaire sur

les cellules de Leydig. A la fin de la puberté, un taux suffisant de LH déclenche le

fonctionnement des cellules de Leydig.

D’autre part, les fonctions de la cellule de Sertoli sont contrôlées par deux hormones. La

première hormone, sécrétée par l'hypophyse, est une gonadotrophine, l'hormone

folliculostimulante (FSH). La FSH agit en se liant à son récepteur cytoplasmique FSHR et

amène la cellule de Sertoli à sécréter une protéine de transport fixant les androgènes : ABP

(Androgene Binding Globulin). Cette protéine est sécrétée grâce à un peptide signal de

sécrétion (Joseph et al., 1987).

La seconde hormone, synthétisée par les cellules de Leydig, est la testostérone. Cette

hormone est liposoluble, et va se lier avec une forte affinité à la protéine ABP. ABP permet

tout d’abord de concentrer la testostérone dans le tube séminifère. Cette dernière va alors agir

sur les récepteurs des androgènes localisés dans la cellule de Sertoli et stimuler la maturation

des cellules germinales (De Gendt et al., 2004). ABP permet ensuite de transporter la

testostérone via le fluide testiculaire vers l’épididyme ou elle va induire l’expression de gènes

spécifiques (Dufaure et Drevet, 1998). ABP (avec ou sans ligand) peut également se lier à des

récepteurs situés sur la membrane cytoplasmique des cellules germinales (Frairia et al., 1992;

Porto et al., 1992).


66

Figure (19): Mécanismes impliqués dans l’axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique.

L’hypothalamus sécrète la gonadolibérine (GnRH) qui régule les sécrétions de l’hypophyse.

L’hypophyse sécrète deux gonadotrophines, l’hormone folliculostimulante (FSH) et

l’hormone lutéinisante (LH) qui vont agir sur les cellules de Sertoli et les cellules de Leydig

respectivement. Dans la cellule de Sertoli, FSH stimule la synthèse de son propre récepteur

(FSHR) et active la sécrétion d’une protéine liant les androgènes (ABP). La cellule de Sertoli

sécrète également l’hormone peptidique inhibine, qui inhibe la sécrétion de FSH. Dans la

cellule de Leydig, LH stimule la sécrétion de testostérone qui va agir dans la cellule de Sertoli

en se liant à la protéine ABP. La testostérone circulant dans le sang inhibe en retour la

sécrétion de LH par un rétrocontrôle négatif (Petrusz et al., 2005).


67

Les récepteurs pourraient alors activer en cascade un second messager comme il a été

démontré dans d’autres tissus (Fortunati et al., 1996; Nakhla et al., 1997) et réguler ainsi

l’expression de gènes cibles (Della-Maria et al.,2002; Petrusz et al., 2005). Enfin, ABP peut

être internalisée (Gerard et al., 1991; Gerard et al., 1994). Une fois dans la cellule, ABP

pourrait interagir avec des cofacteurs cytoplasmiques et aller dans le noyau de la cellule où

elle pourrait interagir avec des protéines nucléaires ou l’ADN.

Différents mécanismes de rétrocontrôle exercent leurs effets sur l’axe hypothalamo-

hypophysaire- gonadique (Denolet et al., 2006). D’une part, la LH sécrétée par l’hypophyse

stimule la production de testostérone par les cellules de Leydig. En réponse, l’augmentation

du taux de testostérone circulant dans le sang va inhiber la synthèse de LH par l’hypophyse.

D’autre part, la FSH stimule la cellule de Sertoli qui va sécréter l’hormone peptidique

inhibine qui va en retour inhiber la sécrétion de FSH. Les régulations de FSH et de LH sont

aussi dépendantes de la gonadolibérine appelées GnRH qui est relâchée par l’hypothalamus

de façon pulsatile.


68

3. Toxicologie à l’échelle moléculaire :

3. 1. Effets sur le statut oxydatif cellulaire et ses conséquences :

Le stress oxydant est défini comme un déséquilibre entre les systèmes antioxydants et

les systèmes prooxydants en faveur de ces derniers impliquant la production d’espèces

réactives de l’oxygène, source d’effets toxiques potentiels (Aït-Aïssa et al., 2003) (figure 20).

Le terme d’espèces réactives de l’oxygène (communément appelées ERO, ou ROS en

anglais) inclut les différentes formes actives de l’oxygène (comme le radical hydroxyle (OHº)

ou l’anion superoxyde (O2º-)) et le peroxyde d’hydrogène (H2O2), ainsi que les espèces

radicalaires qui peuvent en être les initiateurs. Leur réactivité peut être à l’origine d’effets

biologiques néfastes.

Toutefois, la formation d’espèces réactives ne s’accompagne pas systématiquement de

phénomènes de toxicité. En particulier, certaines espèces réactives sont des intermédiaires de

processus physiologiques normaux (respiration cellulaire ou les phénomènes inflammatoires).

Ainsi, dans des conditions physiologiques normales, des radicaux libres sont formés dans

l’organisme du fait de certains phénomènes biologiques. La formation de ces radicaux libres

s'effectue au niveau de divers organites cellulaires. Par exemple dans les mitochondries, lors

de la respiration cellulaire, la réduction de l'oxygène moléculaire par les cytochromes

respiratoires peut être réalisée de façon incomplète et s'accompagner ainsi d'une formation

parallèle d'environ 2 % d’espèces extrêmement réactives de l’oxygène (ERO). De même, au

sein du cytosol, diverses réactions chimiques peuvent produire ces dérivés de l’oxygène. Par

ailleurs, au sein de certaines cellules immunitaires, des enzymes interviennent dans la

production de radicaux libres pour détruire les microorganismes, des macromolécules

étrangères ou les cellules en décomposition de tissus nécrotiques (Wilson et Salamatian,

2003).


69

Figure (20): Le stress oxydant est caractérisé par un déséquilibre entre la production des

espèces réactives de l’oxygène et les capacités antioxydantes de l’organisme (enzymes

antioxydantes et systèmes antioxydants non enzymatiques). BER : « base excision

repair »; ERN : espèces réactives de l’azote ;

ERO : espèces réactives de l’oxygène ; GPx : glutathion peroxydase ; GSH : glutathion

réduit ; NER : « nucleotide excision repair » ; SOD : superoxyde dismutase ; vit C : vitamine

C; vit E : vitamine E (Bonnefont-Rousselot, 2007).

SYSTEMES ANTIOXYDANTS • Enzymatiques : SOD ; catalase ; GPx

• Non enzymatiques : vit E ; vit C ; GSH Cqroténpoides

ERO et ERN • O2; OH ; H2O2 ; NO ; HOCL ;

ONOO ;……

STRESS OXYDANT

OXYDATION DES CONSTITUANTS CELLULAIRES • Lipides : hydroperoxydases . • Acides aminés : sulfoxyde de méthionine.

• Protéines : protéines carbonylées.

• Acides nucléiques : 8‐hydroxy 2‐déoxyguanosine

SYSTEMES DE DEGRADATION ET DE REPARATION

• GPx membranaire

• Méthionine sulfoxyde réductase

• Protéosome

• Systèmes BER ; NER


70

Ainsi, les cellules des êtres aérobies, en état d'oxydoréduction normal, ont une

concentration basale en radicaux libres de l'oxygène non nulle. Du fait de leur très grande

réactivité, ces dérivés de l’oxygène peuvent réagir avec la plupart des composés cellulaires

(Bouaïcha, 2003). Le contrôle rigoureux de leur formation et de leur élimination par le biais

de différents systèmes antioxydants préserve donc les cellules de leurs effets délétères (Braut-

Boucher et Plantin-Carrenard, 2003 ; Gharbi et Moussa, 2003).

Cependant, ces dérivés de l’oxygène peuvent également être induits par la présence de

composés exogènes à l’organisme comme c’est notamment le cas pour les métaux (Stohs et

Bagchi, 1995 ; Cossu et al., 1997a). De plus, les métaux peuvent altérer le fonctionnement

des systèmes de contrôle.

Si ces effets (surproduction de prooxydants et/ou dysfonctionnements des

antioxydants) sont à l’origine d’une rupture de l’équilibre oxydatif, il peut alors survenir un

stress cellulaire appelé “stress oxydant” (Jensen, 2003) dont les conséquences pour la cellule

peuvent prendre la forme de dommages irréversibles. (Taqui Khan et Martell (1969) ont

décrit très tôt le fait que le plomb soit capable d’induire la formation de radicaux hydroxyles

en présence de peroxyde d’hydrogène. Les résultats de cette étude ont ensuite été corroborés

par les travaux d’Hamilton et al. (1997). Le schéma réactionnel de ce phénomène a

récemment été décrit, basé sur un mécanisme d’oxydoréduction de type Fenton.

En effet, tout comme certains métaux de transition (notamment Fe2+ et Cu2+), le

plomb serait susceptible d’induire une réduction du peroxyde d’hydrogène intracellulaire,

induisant ainsi la formation d’un ion hydroxyde (OH-) mais également d’un radical hydroxyle

(Miller et al., 2002a). Cette réaction d’oxydoréduction est alors tout à fait similaire à la

réaction de Fenton qui, dans le cas du fer, se décompose ainsi : H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- +

OHº+ Fe3+ + O2º- → Fe2+ + O2-H2O2 + O2º- → OH- + O2- + OHº.

Il s’établirait donc un cycle d’oxydoréduction du plomb, à l’origine de la libération

dans le milieu intracellulaire d’espèces réactives de l’oxygène telles que le peroxyde

d’hydrogène ou le radical hydroxyle.


71

Cette surproduction d’espèces réactives de l’oxygène pourrait donc être à l’origine

d’un stress oxydant cellulaire dont pourraient résulter des réactions d’oxydation,

d’hydroxylation, de désamination, de réduction, de rupture de chaînes carbonatées, de

polymérisation, etc. dont les macromolécules telles que les protéines, les phospholipides

membranaires et les acides nucléiques sont les cibles principales (Ribera et al., 1996).

Ainsi, la perturbation d’enzymes telles que la catalase et la glutathion peroxydase ainsi

que l’induction d’un marqueur direct de peroxydation lipidique (le malondialdéhyde) ont été

mesurées sur des fractions post mitochondriales obtenues à partir d’homogénats d’organismes

entiers.

3. 1. 1. Conséquences du stress oxydant sur les protéines :

Les protéines les plus sensibles aux attaques radicalaires sont surtout celles qui

comportent un groupement sulfhydryle (SH).

C’est le cas de nombreuses enzymes cellulaires et protéines de transport qui vont ainsi être

oxydées et inactivées (Levine, 1983 ; Rokutan et al., 1990 ; Davies, 2003).

D’autres lésions irréversibles conduisent à la formation d'un intermédiaire radicalaire.

Les protéines peuvent alors soit subir des réticulations par formation notamment de ponts bi-

tyrosine, soit subir des coupures en cas d'agression forte, soit des modifications de certains

acides aminés en cas d'agressions modérées par des phénomènes de carbonylation (=C=O)

notamment. Les protéines modifiées par oxydation perdent leurs propriétés biologiques

(enzyme, récepteur...) et deviennent beaucoup plus sensibles à l'action des protéases. Elles

deviennent aussi très hydrophobes, soit par suppression de groupements amines ionisables,

soit par extériorisation de zones hydrophobes centrales. Elles peuvent alors former des amas

anormaux dans ou autour des cellules.


72

3. 1. 2. Conséquences du stress oxydant sur les membranes biologiques :

Les membranes étant constituées d’un double feuillet phospholipidique, les radicaux

générés (en particulier les radicaux hydroxyles) sont susceptibles de réagir avec les chaînes

d’acides gras insaturés au niveau des doubles liaisons. Le radical hydroxyle, HOº, initie une

cascade de réactions en extrayant un atome hydrogène (réaction d’oxydation) par exemple à

un groupement méthylène d'un acide gras insaturé (RH + OHº → Rº + H2O). L'atome de

carbone muni d'un électron célibataire, va alors capturer une molécule d'O2 donnant naissance

à un radical peroxyle (Rº + O2 →ROOº). Cette réaction de peroxydation va ensuite pouvoir se

propager de proche en proche par création d'un nouveau radical carboné, selon la réaction

ROOº + RH → ROOH + Rº (figure 21).

Les acides gras ainsi modifiés, altèrent l’intégrité membranaire. Or, toute altération de

la membrane peut être responsable de la modification des flux calciques, lesquels sont

impliqués dans les mécanismes apoptotiques (Stark, 2005).

Outre l’altération de la membrane, les peroxydes formés par cette réaction ou les

produits de dégradation de ces dérivés (comme le malondialdéhyde ou le 4-hydroxynonenal)

peuvent également s’avérer toxiques pour le matériel génétique cellulaire (Breton et al.,

2003).

Une étude menée in vitro par Cadet et al. (2005) a ainsi permis de montrer que le

plomb absorbé par phagocytose au sein des macrophages alvéolaires pour y être stocké au

sein de vacuoles formées lors de leur passage dans le milieu intracellulaire (lysosomes) peut

induire des dommages membranaires conduisant à la destruction de ces organites.


73

Figure (21) : Mécanisme en chaîne de la peroxydation des acides gras polyinsaturés et nature

des produits terminaux formés (Favier, 2003).


74

Des phénomènes d’oxydoréduction des phospholipides membranaires seraient à

l’origine de cette désagrégation membranaire. D’autres études menées sur les mammifères

indiquent également que le plomb est un agent très efficace d’endommagement membranaire

(Schmuck et al., 1996 ; Gardet-Albert et al., 2003 ; Thérond et Bonnefont-Rousselot, 2005).

Parmi celles-ci, l’étude menée par Del Rio et al. (2005) sur des hépatocytes en culture a

permis de confirmer l’altération des structures membranaires lysosomales ainsi qu’une chute

du potentiel membranaire des mitochondries.

3. 1. 3. Conséquences du stress oxydant sur le matériel génétique :

L’ADN se présente sous la forme d’un polymère constitué par l’enchaînement de

nucléotides. Le nucléotide est lui-même une entité constituée d’un phosphate relié à un sucre

(le 2- désoxyribose) lui même relié par une liaison N-glycosidique à une base (purique ou

pyrimidique).

Outre les effets toxiques des peroxydes et autres dérivés formés par l’altération oxydative des

membranes, les espèces radicalaires OHº et Hº peuvent réagir directement avec les bases

azotées ou le sucre (2-désoxyribose) constitutifs de la molécule d’ADN (Marnett, 2000 ;

Dizdaroglu et al., 2002 ; Favier, 2003 ; Breton et al., 2003).

Le produit de ces réactions conduit à la formation de coupures simples ou doubles brins, de

bases modifiées, de sites abasiques et de pontages ADN - protéines (figure 22).

3. 1. 3. 1. Les coupures de brins :

3. 1. 3. 1. 1. Les coupures simple brin (CSB) :

Elles sont essentiellement dues à la rupture des liaisons phosphate-sucre à la suite

d’un arrachement d’un atome d’hydrogène du sucre par le radical OHº. Il s’agit de lésions

relativement vite réparées (en moins d’1 h) et qui ont peu d’impact en matière de létalité

cellulaire. Elles peuvent également résulter de défaut de réparation par excision/resynthèse.

(Stearns et al., 2005).


75

Figure (22) : Lésions de l’ADN formées par attaque radicalaire. Figure centrale : mécanismes

généraux. Cadres latéraux : exemples de bases modifiées (Favier, 2003).


76

3. 1 .3. 1. 2. Les coupures double brins (CDB) :

Il s’agit sans doute d’une catégorie de lésions parmi les plus délétères. Elles

correspondent à une rupture des deux chaînes en des sites proches l’un de l’autre. Deux

mécanismes sont avancés pour expliquer leur formation. Le premier suppose l’action d’un

seul radical OHº sur le 2-désoxyribose avec transfert du radical sur le deuxième brin. Le

deuxième implique l’attaque de l’ADN par plusieurs radicaux hydroxyle dans des zones

rapprochées (Calmet et al., 2003).

3. 1. 3. 2. Les bases modifiées :

La nature des produits obtenus dépend des propriétés redox des espèces mises en jeu et

de leur environnement (présence d’oxygène ou non).

Les modifications des bases pyrimidiques résultent essentiellement de l’attaque des radicaux

hydroxyles au niveau de leur cycle aromatique. Les radicaux OHº étant très électrophiles, leur

attaque s’effectue préférentiellement en position 5 du cycle de la thymine et de la cytosine.

Les bases puriques peuvent subir quant à elles l’addition de radicaux OHº en position 4 ou 8

(Blakely et al., 1990 ; Kawanishi et al., 2001 et 2002). Il a été montré qu’une altération de

l’ADN par la formation de thymine glycol et de 8- hydroxy-désoxyguanosine (spécifiques

d’un stress oxydatif) peut être induite en présence d’uranium appauvri, de peroxyde

d’hydrogène et d’ascorbate (Miller et al., 2002a).

3. 1. 3. 3. Pontages ADN-protéines :

Des pontages intra-chaînes, inter-chaînes ou entre l’ADN et les protéines

environnantes peuvent aussi se former sous l’effet d’un stress oxydant. Dans ce cas, le radical

hydroxyle peut être impliqué. Ces pontages peuvent se former lorsque deux radicaux sont

générés à la fois sur l’ADN et au niveau des acides aminés constitutifs des protéines proches

de l’ADN. Des travaux (non spécifiques à l’uranium) ont ainsi mis en évidence la formation

de pontage entre la tyrosine et la thymine mais aussi entre d’autres acides aminés et la

thymine ou la cytosine (Pouget, 2000).


77

3. 1. 3. 4. Altération des sucres :

L’attaque du 2-désoxyribose par les radicaux OHº qui se traduit initialement par un

arrachement d’un atome d’hydrogène, peut conduire à :

une libération du sucre (formation d’une coupure de brin).

une altération du sucre n’affectant pas ses liaisons en 3’ et 5’ au squelette phosphodiester

(site abasique).

une altération du sucre réduisant sa liaison au squelette phosphodiester à l’un ou l’autre

des sites de fixation, 3’ ou 5’ (formation d’une coupure de brin) (Petropoulos et

al.,2005).

3. 1. 4. Conséquences du stress oxydant sur la reproduction :

Les lésions causées par le plomb des organes de la reproduction peuvent entraîner deux

types d’effets : la mort cellulaire, avec une diminution transitoire ou définitive de la fertilité,

ou des mutations dans les cellules germinales pouvant être transmises lors de la fécondation et

se manifester en tant que désordre héréditaire chez les descendants de l’individu exposé.

Certaines études font état de dommages chromosomiques sur les spermatogonies de

rongeurs exposés à l’acétate de plomb. En effet, l’induction d’aberrations chromosomiques

dans les cellules germinales a également été observée chez des souris mâles exposées par

injection intratesticulaire (Hu et Zhu, 1990 ; Calmet et al., 2003 ).

Dans les gonades, les lésions peuvent conduire à une mutagénèse accrue, à une altération des

fonctions hormonales ou de la fertilité (Calmet et al., 2003).

3. 2. Biomarqueurs de stress oxydant :

Le caractère ubiquiste des processus oxydants et leur implication possible en tant que

facteurs de toxicité ont suscité des recherches dans le domaine de toxicologie. La formation

d’oxydants et le déficit en antioxydants étant des signes avant-coureurs potentiels de toxicité,

ces paramètres constituent des indicateurs précoces d’une agression toxique, ce qui rejoint la

définition donnée d’un biomarqueur.


78

L’intérêt majeur des paramètres antioxydants en tant que biomarqueurs réside dans le

caractère aspécifique de leur réponse qui se traduit, en général, dans une première phase par

une augmentation de l’activité des enzymes impliquées (Livingstone, 2001 ; Barillet, 2005).

L’intérêt majeur des paramètres antioxydants en tant que biomarqueurs réside dans le

caractère aspécifique de leur réponse qui se traduit, en général, dans une première phase par

une augmentation de l’activité des enzymes impliquées. L’induction d’activité est en général

transitoire, relativement modérée et aspécifique. Ce phénomène traduit l’adaptation des

organismes à un nouvel environnement.

L’inhibition de certaines composantes des systèmes antioxydants peut également

survenir, en liaison avec l’altération de l’état des individus et la perte de l’homéostasie

cellulaire. Ce phénomène d’inhibition est souvent associé à des effets de peroxydation

lipidique qui constitue alors un indice de toxicité relatif à un état de non compensation des

lésions cellulaires initiales. Il semble donc que le suivi de l’induction ou de l’inhibition des

systèmes antioxydants en tant que biomarqueurs apparaît pertinent du fait qu’elles traduisent

un état de souffrance cellulaire et de toxicité précoce (Aït-Aïssa et al., 2003).

La grande diversité des modèles animaux aquatiques ou terrestres, des types de

polluants testés, des conditions d’exposition, et des organes étudiés rend difficiles les

comparaisons d’une étude à l’autre. Ainsi, divers scénarios (induction, inhibition ou absence

d'effet) sont observés d'une étude à l'autre. Ces observations suggèrent que la mesure de ces

paramètres donnera des informations sur la physiologie de l'organisme à un temps donné et

pour des conditions d'expositions données. L'utilisation de ce type de paramètres en tant que

biomarqueurs sera donc associée à un certain nombre de contraintes liées aux propriétés

même des effets oxydants et des paramètres de défenses associés : durée de vie très courte des

radicaux libres, action très localisée à un type de tissu ou à un organe, aspect transitoire de la

réponse biochimique, systèmes de défenses multienzymatiques complexes.

La validation de biomarqueurs de stress oxydant nécessite donc, pour un organisme et

un type de polluant donnés, d’identifier les organes cibles potentiels des toxiques et de

caractériser la cinétique des réponses des paramètres biochimiques étudiés. De même, du fait

de la complexité des systèmes antioxydants et de leurs nombreuses interactions au sein du

métabolisme cellulaire.


79

3. 2. 1. L’activité superoxyde dismutase :

Le catabolisme des espèces réactives de l’oxygène est assuré en premier lieu par les

superoxyde dismutases (SOD). Ces enzymes catalysent la réaction de dismutation de l'anion

superoxyde (O2º-) en peroxyde d’hydrogène et en oxygène, selon la réaction suivante :

2 O2º - + 2 H+ → H2O2 + O2

D’autres systèmes enzymatiques tels que les catalases ou les peroxydases doivent alors

intervenir pour compléter cette action par la prise en charge du peroxyde d’hydrogène formé

(Finkel, 2003).

3. 2. 2. L’activité catalase :

Les catalases (CAT) sont des enzymes héminiques localisées dans les peroxysomes

d’un grand nombre de tissus, essentiellement le foie et les globules rouges où elles catalysent

la décomposition de H2O2 en eau et en oxygène selon la réaction :

2 H2O2 → O2 + 2 H2O (Beaudeux et Vasson, 2005).

3. 2. 3. L’activité glutathion peroxydase :

Les glutathion-peroxydases (GPx) utilisent le glutathion comme substrat pour

catalyser la réduction du peroxyde d'hydrogène. Cependant, ces peroxydases sont également

capables de réduire les peroxydes membranaires issus de l'oxydation des acides gras et du

cholestérol, selon le schéma réactionnel suivant :

ROOH + 2 GSH → ROH + H2O + GSSH (Kirkwood, 2005).

3. 2. 4. Le glutathion, un antioxydant non enzymatique :

Le glutathion est un tripeptide (L-γ-glutamyl-L-cystéinyl glycine) qui représente l’un

des antioxydants majeurs chez les vertébrés parmi les agents non enzymatiques du système

antioxydant cellulaire. Le glutathion est le composé réducteur soufré le plus abondant dans le

compartiment intracellulaire.


80

En interceptant un radical hydroxyle, le glutathion génère un radical superoxyde

(schéma réactionnel ci dessous) qui doit être pris en charge par une SOD, ce qui témoigne, là

encore, de l'importance de la coopération entre les différents systèmes de défense anti-

radicalaire.

GSH + HOº → H2O + GSº GSº + GSH → GSSGº- + H+ bilan réactionnel : 2GSH + HOº + O2 → H2O + H+ + GSSG + O2º- GSSGº- + O2 → GSSG + O2º- Outre son rôle essentiel d'agent réducteur, le glutathion intervient également à un second

niveau dans la défense anti radicalaire par son implication dans les réactions de détoxication

catalysées par la glutathion-S-transférase (Desaint et al., 2004).

3. 3. Le système antioxydant cellulaire :

Afin d’éliminer les espèces radicalaires et de limiter les dommages provoqués par le stress

oxydant, les cellules disposent de trois mécanismes de défense antioxydant. On pourra ainsi

citer :

l’élimination des espèces réactives et des catalyseurs de leur formation.

l’induction de la synthèse d’antioxydants.

l’augmentation de l’activité des systèmes de réparation et d’élimination des molécules

endommagées.

Une vue d’ensemble des mécanismes enzymatiques de défense qui contribuent à la

détoxication des espèces réactives est proposée dans la figure 23. Ce schéma illustre la

complexité des réactions qui coexistent au sein de la cellule lors d’un stress oxydant

(Bakouri, 2006).


81

Figure (23) : Systèmes enzymatiques impliqués dans la défense antioxydante cellulaire

(Gardèt-Albert et al., 2003).

Chapitre II Matériels et méthodes

1. Matériel biologique :

Dans notre protocole expérimental, le modèle animal choisi est le rat blanc de

laboratoire, espèce Rattus norvegicus, souche Wistar. Les expériences sont réalisées sur des

jeunes rats mâles âgés de 23±3 jours (après sevrage), d’un poids corporel moyen de 45 ±3 g.

Les animaux séjournent dans l’animalerie du Laboratoire de Biochimie Appliquée, à une

température ambiante, dans des cages conventionnelles, menues d’une mangeoire et d’un

biberon. Ils ont libre accès à une nourriture standard, correspondant à un aliment pour rongeur

commercialisé par l’ONAB (tableau 7).

2. Méthodes :

Notre étude est réalisée selon un ordre chronologique de techniques.

2.1. L’exposition au plomb :

Nous avons répartis 90 rats (30 rats/groupes) en trois groupes :

Groupes 1 : constitue le lot de témoins (T) reçoit de l’eau de boisson.

Groupes 2: constitue le lot des rats exposés au plomb, reçoit chaque jour par gavage de

l’acétate de plomb (C4H6Pb2H2O) solubilisé dans de l’eau de boisson (1ml/J) à raison de

250mg/l durant les 12 semaines.

Groupes 3 : constitue le lot des rats exposés au plomb, reçoit chaque jour par gavage de

l’acétate de plomb (C4H6Pb2H2O) solubilisé dans de l’eau de boisson (1ml/J) à raison de

500mg/l durant 12 semaines.

82


Tableau (7): Composition du régime d’entretien ONAB (régime standard).

Composition

Quantité (%)

Protéines 14,5

Lipides 7,5

Glucides 55,8

Cellulose 5,4

Humidité 11

Matière minérale 9,5

Energie métabolisable (KJ/g) 14,60

83


2.2. Technique de gavage chez le rat :

Pour le gavage des rats intoxiqués nous avons suivi les recommandations standards de

la Bio méthodologie des rats (Marcel et Perret-gentil, 2003).

La distance du cathéter est mesurée du nez à la dernière côte. La seringue est remplie avec

une quantité appropriée de la solution à injecter (1ml/jour de l’acétate de plomb dilué dans

l’eau de boisson). Le rat est retenu verticalement. Il est important que le cou soit étendu

pour faciliter le passage du tube de gavage.

La pointe du cathéter est placée dans la bouche. La pointe du cathéter est glissée vers le bas

arrière de la bouche par un seul mouvement ce qui facilite le passage dans l'estomac. Toute

résistance de l’animal indique un mauvais placement du cathéter (figure 24).

Figure (24) : Technique de gavage des rats (Marcel et Perret-gentil, 2003).

84


Le suivi quotidien de la période expérimentale nécessite les opérations suivantes :

Une pesée hebdomadaire du poids corporel des rats de chaque lot exprimé en

g/semaine.

Calcul du gain corporel moyen en fonction du poids des rats exprimé en g/semaine

(gain corporel moyen =poidsS moyen- poids(S-1) moyen (s= semaine).

L’enregistrement des transformations morphologiques (perte de poils) et

comportement (stress, anorexie).

2. 3. Test de fertilité :

Dans le but de tester la fertilité des mâles, les animaux des trois groupes sont cohabités

avec des rats femelles de même âge et du même poids à raison d’un mâle et trois femelles (1:

3). Après une semaine de cohabitation les femelles sont séparées des mâles et le nombre de

femelles gravides, le taux de naissance, le poids corporels des nouveau-nés et le taux de

survie jusqu’à sevrage est enregistré. .

2. 4. Sacrifice des rats :

Au terme des 12 semaines d’expérimentation, les animaux sont sacrifiés le matin après

un jêune de 12 heurs par injection intrapéritoniale d’une solution de chloral (C2H3Cl3O2) à

10% (4mg/Kg de poids corporel). Après incision de l’abdomen et écartement des viscères, le

sang est prélevé par ponction de l’aorte abdominale dans des tubes héparinés puis centrifugé

à 3000tours/10mn. Le plasma est stocké à 4C°, il servira pour les dosages biochimiques.

Le sang total destiné pour la plombémie est stocké à 4 C° pendant 24 heures.

Les différents organes (testicules, épididymes, prostate et vésicules séminales) sont

soigneusement prélevés, rincés avec du Nacl à 0,9% froid, séchés puis pesés.

Après le prélèvement des différents organes, les rats sont décapités et les cerveaux sont

rapidement extraits de la boite crânienne rincés avec du NaCl à 9% froid, séchés puis pesés.

85


Pour la réalisation de ce travail, nous avons utilisé plusieurs techniques (figure 25) :

Techniques macroscopiques

Techniques microscopiques

Techniques biochimiques et hormonales

2. 5. Observation macroscopique :

Les organes prélevés destinés à l’étude histologique (HE) (cerveau et organes sexuels

(testicules épididyme vésicule séminale et prostate) sont pesés et mesurés (figure 26).

Les organes (hypophyse et testicule) destinés à la mesure du marqueur de la peroxydation des

lipides Malondialdéhydes (MDA) et l’activité des enzymes anti oxydantes sont congelés à -

80°C

2.6. Etude histologique des organes:

Elles sont réalisées au niveau du Laboratoire de Cytologie et d’Anatomie Pathologique

du docteur Merad Boudia Tabet Hellal B d’Oran.

86


Elevage

Rats témoins (Groupes 1

Rats 250 mg/l (Groupes 2)

Rats 500 mg/l (Groupes 3)

Test de fertilité

Dosage du plomb

Prise de sang

Sang total

Sacrifice

Prélèvement d’organes

Testicules et hypophyse

Testicules et Epididymes

Sérum Plasma

Dosage hormonal

Plombémie

Dosages biochimiques

Spermogramme Stress oxydant

Figure (25) : Diagramme récapitulant le protocole expérimental.

87


TESTICULES

EPIDIDYMES

PROSTATES

VESICULES SEMINALES

Figure 4 : Méthode de mesure des différents organes prélevés.

500 mg/l 250 mg/l Témoins

88


2.6. 1. Histologie classique (topographique) :

Les organes prélevés sont soumis préalablement aux différentes étapes qui sont :

2. 6. 1. 1. Fixation :

Les organes sexuels prélevés sont rincés à l’eau physiologique (Na Cl 0,9%) puis fixés

dans du formol à 1/10ème salé et tamponné à pH 7 par le sulfite de sodium (Na2So3).

La fixation a pour but essentiel d’assurer une immobilisation des constituants cellulaires ou

tissulaires dans un état aussi voisin que possible de l’état vivant (Nzelof, 1972).

La fixation est immédiate après le prélèvement pour empêcher une putréfaction (altération

microbienne) du tissu par autolyse (destruction tissulaire par les enzymes qu’il contient en lui-

même). Le volume du fixateur doit être 20 à 50 fois celui du prélèvement. Les organes

séjournent 24 à 48 heures dans le fixateur et y seront totalement immergés.

2. 6. 1. 2. Inclusion (circulation) :

L’inclusion a pour but d’empêcher la fragmentation des tissus et d’enfermer le

prélèvement dans une substance qui le pénètre et l’infiltre. Les tissus acquièrent ainsi une

consistance qui permet d’obtenir des coupes minces au microtome. La substance d'inclusion,

généralement la paraffine, est une substance liquide à chaud, solide à température ambiante,

insoluble dans l’eau : il n’est pas possible d’y plonger un tissu fixe, toujours très chargé

d’eau : il est donc nécessaire d’effectuer au préalable une déshydratation que l’on réalise le

plus souvent par l’alcool absolu.

La paraffine n’ayant pas davantage soluble dans les alcools, il faut ensuite passer le

fragment déshydraté dans un milieu intermédiaire, soluble à la fois dans l’alcool et la

paraffine (par exemple acétone, toluène, xylène, chloroforme…) (tableau 8).

La déshydratation permet l’élimination d’eau d’organes en les plongeant dans l’alcool choisi

(acétone) pendant un temps suffisant à degré croissant : alcool à 70° (acétone I) pendant 45

minutes, 90° (acétone II) pendant 45 minutes et alcool absolu 100° (acétone III) pendant 45

minutes

89


Tableau (8): protocole de circulation et d’inclusion (Hould, 1984).

Etapes Réactions Produits Durée

Poste fixation Formol 1/10eme 45 minutes

Acétone I 45 minutes

Acétone II 45 minutes

Acétone III 45 minutes

Toluène I 45 minutes

Toluène II 45 minutes

Toluène III 45 minutes

Paraffine I 1 Heure

Circulation

Déshydratation

(à température

ambiante)

Paraffinage (à 56C°) Paraffine II 1 nuit

INCLUSION Paraffine à l’aide de moules métalliques.

Toutes les réactions ont lieu dans des bacs fermés hermétiquement dans un lieu bien aéré ou

sous haute aspirante à une température ambiante sauf le paraffinage à 56 C° ensuite les blocs

sont refroidis au congélateur.

90


La duré de la déshydratation est en fonction du volume des fragments tissulaires.

Un solvant de la paraffine est destiné à chasser l'alcool par trois bains successifs de toluène ou

de xylène pendant 45 minutes.

L’imprégnation par la paraffine est effectuée dans un premier bain de paraffine à l’état

liquide par séjour dans une étuve dont la température est réglée légèrement au dessus de son

point de fusion, 56°C durant une heure. Chimiquement la paraffine est un mélange

d’hydrocarbure solide satiné à poids moléculaire élevé (parum affinis: faible affinité; cette

substance est en effet caractérisée par son indifférence aux agents chimiques).

Elle se présente sous forme de substance blanche, légèrement translucide, inodore, onctueuse

au touché.

On imprègne les organes coupés dans deux bains successifs de paraffine; le premier

bain durant une heure et le deuxième bain durant toute une nuit. Ces bains doivent être

fréquemment changés car ils se chargent progressivement de solvant. La persistance de

toluène abaisse le point de fusion de la paraffine rendant donc celle-ci plus molle et moins

propre à la coupe. A la sortie du dernier bain de paraffine, l’échantillon est déposé dans la

paraffine fondue vierge que l’on coule dans des moules (cassettes d’inclusions ou moules

d’inclusion); puis on laisse refroidir la paraffine dans le congélateur.

Le refroidissement de cette paraffine amène sa solidification en un bloc prêt à être

coupé. La durée totale de l'opération d'inclusion est de 24 à 48 heures suivant l'épaisseur du

prélèvement.

2. 6. 1. 3. Coupe, étalement des coupes et coloration (nucléaire et

topographique générale) :

Le microtome permet d’obtenir des coupes dont l’épaisseur est de 3 à 5µm. La coupe

proprement dite s’obtient par passage régulier de la pièce à couper devant la lame du

microtome.

91


A chaque passage, celui-ci enlève une tranche d'épaisseur réglable. On peut effectuer

des coupes isolées ou bien pour la reconstitution totale d'un prélèvement, réaliser des coupes

sériées, disposées s en forme de ruban. Les rubans de paraffine obtenus sont plissés et doivent

être étalés sur un milieu liquide légèrement chauffé afin que les plis disparaissent et que la

coupe acquière une planéité parfaite. Le collage des coupes se fait sur une lame de verre qui

est recouverte d’une solution d’albumine (2g d’albumine + 50ml de glycérine dans 1000 ml

d’eau distillée) qui maintient la coupe sur la lame. Sur chaque lame de verre porte-objet est

gravé le numéro d’identification du bloc.

L’étalement de la coupe se fait sur une platine chauffante réglée à une température de

40°C; inférieure à celle du point de fusion de la paraffine (56°C). Les coupes égouttées et

mises dans des portoirs sont ensuite séchées à température ambiante jusqu’au moment de la

coloration.

La paraffine est hydrophobe tandis que les colorants sont hydrophiles. C'est pourquoi

la coloration des coupes comporte une étape de déparaffinage et de réhydratation. Cette étape

est assurée par une succession de bains, d’abord dans deux bains d’un solvant permettant

l’élimination de la paraffine (toluène ou xylène) et ceci durant 10 minutes à chaque bain. Puis

dans des alcools (éthanol) de titre décroissant, de 96° jusqu’à 50°durant 30secondes à chaque

bain, enfin rinçage à l’eau courante (1 minute) assurant la réhydratation finale.

Après réhydratation, la coupe est colorée (tableau 9), le but de la coloration est de

renforcer le contraste et de rendre plus évidents les différents constituants cellulaires et

tissulaires ainsi que les substances extrinsèques. Les lames ont été colorées à la coloration de

l’émalun-éosine, c’est la plus simple des colorations « combinées.

La coloration du noyau est bleu foncé et le cytoplasme rose à rouge. La coloration des

lames a été réalisée comme suit : plonger les lames dans l’hymalun de Harris pendant 5

minutes, rincer les lames dans de l’eau courante pendant une minute, mettre les lames, dans

un bain d’eau acide pendant 1 minute et dans un bain de bicarbonate de Lithium pendant 1

minute, colorer les lames à l’éosine alcoolisée (2 g d’éosine dans 100ml d’alcool) pendant 1

minute.

92


Tableau (9) : Batterie de coloration HEMALIN-EOSINE (Hould, 1984)

Réactions Produits

Toluène I 10 minutes Déparaffinage

Toluène II 10 minutes

Ethanol 96 ° 30 secondes



Réhydratation

Eau courante 1 minute

Hémalun de HARIS 5 minutes

Eau courante 1 minute

Eau acide 1 minute

Bicarbonate de Lithium 1 minute


Coloration

Eosine alcoolique 1 minute




Déshydratation

Acétone 5 minutes

Toluène III 10minutes Eclaircissement

Toluène IV 10 minutes

Montage Lamelle montée sur lame avec la

résine (l’Ekitt)

Il faut alors procéder à la déshydratation, opération inverse de celle menée au début, avant de

pouvoir faire le montage, la déshydratation (éclaircissement) est réalisée en plongeant

successivement les lames dans deux bains de toluène pendant 10 minutes.

93


Après coloration une goutte d’Eukitt de montage est disposée sur la coupe, une

lamelle est appliquée de façon à ce que la résine recouvre l’ensemble de la coupe. Lors de la

manipulation, aucune bulle d’air ne doit s’insérer entre la lame et la mamelle. L Eukitt

polymérise en une vingtaine de minutes mais on peut accélérer le processus en plaçant la lame

sur une plaque chauffante à 50°C ou simplement sur un radiateur.

Après le montage, les lames sont rangées dans des boites spécifiques à l’abri de la

poussière. L’observation des lames se fait au microscope optique. Pour mesurer le diamètre

et l’épaisseur des tubes séminifères, nous avons utilisés un oculaire gradué au grossissement

x100.

2. 6. 2. Histologie du cerveau (hypothalamus et hypophyse) :

Pour la préparation des coupes au niveau de l’hypothalamus et l’hypophyse nous

avons suivi la méthode décrite par (Glowinski et Iversen, 1966) (figure 26) et (figure 27).

Le cerveau est placé sur sa face ventrale, l’avant vers le manipulateur puis les bulbes olfactifs

sont ôtés et les hémisphères sont écartés à l’aide d’un bistouri.

Pour détacher l’hypothalamus et l’hypophyse l’encéphale est retourné parti antérieur

rostral toujours dirigé vers l’expérimentateur puis coupé centralement, mais superficiellement

ainsi, l’hypothalamus est ôté, en 2 parties (qui sont assez superficielles et ont la forme de

petites poires) et l’hypophyse. Les organes sont pesés (figure 28).

Les mêmes étapes suivies pour l’étude histologiques des organes sexuels sont suivies pour

l’étude histologique de l’hypothalamus et l’hypophyse.

94


Figure (27): Procédures de microdissection de l’encéphale, adaptée de la méthode de

Glowinski et Iversen 1966.

500 mg/lTémoins 250 mg/l

Figure (28) : Méthode de dissection et mesure de la taille du cerveau de rat.

95


Hypophyses

Hypothalamus

500 mg/l

250 mg/l

Témoins

Figure 29 : Prise du poids de l’hypophyse et l’hypothalamus (X 10).

96


Observation : Durant la réalisation des coupes histologiques des organes de rats intoxiqués

nous avons remarqué que les tissus s’effritent notamment ceux des rats intoxiqués à 500mg/l.

2. 7. La mise en évidence du plomb dans les testicules par technique

histochimique :

Selon la technique décrite par (Gabe, 1968), met à profit la transformation des dépôts

de plomb sous l’action des chromates ou bicarbonates en chromate de plomb, jaune.

Les lames sont déparaffinées par deux bains successifs de toluène (toluène I et toluène II)

pendant 10 minutes pour chaque bain.

Les lames sont trempées dans des bacs contenant du Bicarbonate de potassium

(K2Cr2O2) à 3% pendant 3 jours. Les lames sont lavées à l’eau courante et séchées à

température ambiante ensuite colorées au bleu de toluidine à 0,1%. Après coloration, les

lames sont montées au glycérol (observation des dépôts jaunes sur les tissus).

2. 8. Mise en évidence du phénomène d’apoptose au niveau des testicules:

Selon la méthode décrite par (Chakroun et al., 2000) la condensation de la chromatine

est l’un des premiers signes de l’apoptose. Le bleu de toluidine boraté (bleu de toluidine 1%

et tétraborate de sodium Na2BB4O7 à 1%) permet de mettre en évidence cette condensation.

Pour cela la solution colorée est diluée au 1/10 dans l’alcool à 70°C, puis elle est déposée

sur les coupes placées sur une plaque chauffante à 45 °C pendant 45 à 60 secondes.

ème

Après rinçage à l’eau distillée, les coupes sont déshydratées en les plongeant successivement

dans un bain d’acétone suivi de deux bains de toluène pendant 2 minutes puis montées à

l’Eukitt. Les cellules apoptotiques montrent des noyaux denses de couleur bleu foncée.

97


2. 9. Dosage du plomb dans les organes prélevés (cerveau, testicules, épididymes,

prostate et vésicule séminale):

2. 9. 1. Minéralisation des organes :

Toute recherche d’un toxique minéral fixé dans les organes, exige toujours une

minéralisation qui aboutit à une dégradation complète de la matière organique (Amiard et al.,

1982) (figure 30).

Les buts de la minéralisation sont donc :

Eliminer l’action perturbatrice du substrat protéique.

Ioniser les métaux.

Assurer leur concentration (puisque le métal n’existe qu’à une infime concentration).

Nous avons opté la méthode décrite par (Amiard et al., 1987).

98


Echantillon (organes

prélevés)

Minéralisation (1g)

+H2O Bidistillée 4ml QSP

1ml HNO3+T 95°C

Lecture au S.A.A af

Figure (30) : Synoptique du protocole de minéralisation et de dosage en Spectrophotométrie

d’Absorption Atomique à flamme (S. A. A af) (Amiard et al., 1987).

99


2. 9. 1. 1. Principe :

Le principe de la combustion par voie humide est la mise en solution de l’échantillon.

C’est une dégradation complète de la matière organique, les métaux organiquement liés, sont

transformer en ions métalliques libres en présence d’acide nitrique concentré, par un

chauffage (95°C), sous reflux.

2. 9. 1. 2. Mode opératoire :

Dans un matras en verre, nous déposons 1g de poids frais de chaque échantillon l avec

1ml d’acide nitrique (HNO3) à 65% de pureté, nous portons la température à 95°C pendant

une heure, après refroidissement, nous complétons le contenu jusqu’à 4ml d’eau bidistillée. Si

l’analyse ne se fait pas instantanément l’échantillon est mis dans un flacon bien fermé,

étiqueté et conservé à basse température pour éviter toute évaporation et toute contamination

extérieure.

2. 9. 1. 3. Dosage spectrophotométrique (S. A. A à flamme) :

Nos dosages ont été réalisés à la Sonatrach au niveau du complexe GNL1/Z : gaz

Naturel Liquéfié 1 Arzew. L’appareil mis à notre disposition pour l’analyse de nos

échantillons est un S. A. A de marque Perkin Elmer : AAnalyst 100-version 1,10 5s70 piloté

d’un copteur calculateur pour traiter des résultats. I est doté de lampe de type H. C. L. Hallow

Cathod Lamp (lampe à cathode creuse).

2. 9. 1. 4. Etalonnage :

L’étalonnage a été réalisé avec une gamme relative à la concentration des échantillons.

Les échantillons standards ont été préparés à partir des solutions mères. Une courbe étalon

relative à la concentration de nos échantillons a été tracée à partir des solutions standards ainsi

nous pouvons faire la lecture correctement de nos dosages au S. A. A f. Les résultats sont

exprimés en µgPb/g.

100


2.9. 2. Dosage du plomb dans le sang (plombémie):

Dans des tubes à hémolyse en polystyrène de 5 ml, nous déposons dans l'ordre : 1,4 ml

d’eau distillée, 0,6 ml HCl, 0,1 ml HClO4, 0,4 ml du sang total, ensuite les tubes sont

centrifugés pendant 5 min à 3 000 tr/min. Nous Préparons aussitôt la solution de mesure dans

un gobelet en polyéthylène : 0,25 ml solution de chlorure mercurique, 2 ml surnageant,

11,75 ml eau distillée. L'appareil peut calculer la plombémie à partir des résultats de la

gamme étalon, en tenant compte des dilutions effectuées. Les mesures sur sang total ont été

effectuées sur la solution suivante : eau distillée 12,95 ml, HCl 0,48 mL, solution de chlorure

mercurique 0,25 ml, sang total 0,32 ml.

2. 9. 2. 1. Gamme étalon :

La solution mère de plomb est obtenue en diluant à 100 ml d'étalon Titrisol Merck

dans une fiole jaugée en polypropylène, avec HCl 2 N. Sa concentration est de 10 mg/ml de

plomb. La solution de travail est préparée extemporanément par deux dilutions successives au

1/100e avec HCl 2 N. La concentration finale est de 1 µg/ml. Pour obtenir une gamme étalon,

nous ajoutons successivement à la solution du « blanc » 20, 30, 50 et 100 µl de la dernière

dilution, en effectuant les mesures. La réponse est linéaire dans cette plage de concentrations.

Nos dosages ont été réalisés toujours à la Sonatrach au niveau du complexe GNL1/Z : gaz

Naturel Liquéfié 1 Arzew. Les résultats sont exprimés par µg/100

2. 10. Etude du spermogramme :

2. 10. 1. Comptage des spermatozoïdes :

Selon la technique décrite par (Shinshi, 2004), les testicules et les épididymes de

chaque lot de rats sont décongelés, puis sont pesés et coupés avec un ciseau et homogénéisés

dans 10à 20ml de NaCl 0,9% contenant 0,05% de Triton X-100. Les homogénat sont

placédans le réfrigérateur à 4°C pendant une heure. 400 µl de chaque homogénat de rat sont

dilués dans du NaCl à 0,9% contenant 0,05% de Triton X-100 et 500 µl de bleu de Trypan à

4%.

101


Du mélange ainsi obtenu, 10µl d’échantillon prélevé sont déposés sur une cellule de Thoma

(figure 31 et 32).

Figure (31) : Cellule de Thoma observée au microscope au grossissement x100.

Figure (32) : Cellule de Thoma observée au microscope au grossissement x 400.

102


La concentration est mesurée de la manière suivante :

Nous avons additionné le nombre de spermatozoïdes contenu dans 5 grands carreaux

de la grille pour obtenir le nombre A (figure 33).

En divisant A pare le volume des cinq grands carreaux (1/250 mm3 x 5) et en

multipliant par la dilution (10), nous avons obtenu B= A x 500 qui est la concentration

en spermatozoïdes par mm3.

Enfin, nous avons obtenu le nombre C de spermatozoïdes totaux contenus dans le

prélèvement par l’opération suivante : B x 1000 x volume recueilli en ml.

Nous avons visualisés les spermatozoïdes au grossissement x 400 du microscope.

Pour estimer la production journalière des spermatozoïdes (production/jour/gr

/testicule) nous nous sommes basés sur le facteur 6.1 qui représente la durée du cycle séminal

durant lequel les spermatides passent par plusieurs stades pour se développer en

spermatozoïdes (Jian Ying et al., 2007).

103


La cellule de Thoma présente 16 grands carreaux. A est obtenu en additionnant le nombre de

spermatozoïdes contenus dans 5 grands carreaux.

Les spermatozoïdes situés à cheval sur les cotés du grand carré doivent n’être comptés que sur

deux cotés (toujours les mêmes) pour éviter de les comptabiliser deux fois. Ici, en choisissant

le coté vertical gauche et le coté horizontal le plus bas, seuls les spermatozoïdes coloriés en

noir sont comptabilisés.

Figure (33) : Comptage cellulaire à l’aide d’une cellule de Thoma.

104


2. 10. 2. Evaluation de la qualité des spermatozoïdes :

2. 10. 2. 1. Test de motilité des spermatozoïdes au niveau de la queue des

épididymes :

Selon la technique décrite par (Mitsuhashi et al., 2004) une goutte de sperme a été

collectée à partir de la queue de l’épididyme par perforation et à partir des testicules par

incision, puis met en suspension dans 2 ml de solution saline (NaCl 9‰ complété par 1.0%

w/v de la sérum albumine bovine (Sigma) et 100µl de bleu de trypan à 1% maintenue à 37°C.

Du mélange ainsi obtenu, 20µl d’échantillon prélevé sont déposés sur une cellule de Thoma

pour l’observation au microscope optique au grossissement x 400. Nous avons apprécié le

pourcentage de mobilité en comptant les spermatozoïdes immobiles sur le fond de la lame par

rapport aux spermatozoïdes mobiles évoluant à coté (Smith, 1989).

Au faible grossissement, le sperme de bonne qualité a un aspect tourbillonnant évoluant par

vagues.

Au fort grossissement, les mouvements des spermatozoïdes sont notés de 0 à 5 selon la grille

de notation suivante (Platz et Seager, 1978) :

1=petits mouvements sur place, de côté, sans progression.

2=mouvements sur place, rapides, sans progression encore.

3=mouvements, sur place, rapides. Progression intermittente, par à-coups.

4=nette progression mais lente.

5=progression franche et rapide.

0=immobile.

Chez l’Homme, l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé) propose la classification

suivante :

_type a : spermatozoïdes mobiles et progressifs dits flêchants ;

_type b : spermatozoïdes mobiles progressifs inefficaces dits lents ;

_type c : spermatozoïdes mobiles non progressifs ;

_type d : spermatozoïdes immobiles ;

_type e : spermatozoïdes hyperactifs.

105


2.10. 2. 2. Evaluation de la densité des spermatozoïdes :

La même solution en suspension utilisée pour la détermination de la motilité des

spermatozoïdes est utilisée pour déterminer la densité des spermatozoïdes. Selon la méthode

décrite par Deepak et al., 1986, la solution en suspension est chauffée dans de l’eau bouillante

pendant 30 seconde (tuer les spermatozoïdes) ensuite compter par la cellule de Thoma.

2. 10. 2. 3. Détermination du pourcentage des spermatozoïdes vivants :

La même solution en suspension utilisée pour la détermination de la motilité des

spermatozoïdes est utilisée pour déterminer le taux des spermatozoïdes vivants. Nous avons

mélangé 5 µl de prélèvement avec 5 µl d’éosine-nigrosine pendant 1 minute. Puis nous avons

étalé le mélange étalé sur une lame délicatement et nous l’avons séché.

Composition de la solution éosine-nigrosine :

• 5 % w/v de nigrosine

• 0,6 % w/v éosine

• 3 % w/v de citrate de sodium dihydraté. La solution est ajustée à pH 7 par addition

de 0,1 M de NaH2PO4 ou 0,1 M de Na2HPO4. La solution est filtrée par papier

filtre.

Au microscope à immersion au grossissement x 1000, nous avons compté 100

spermatozoïdes en les classant en mort ou vivant : les spermatozoïdes morts ont leur

membrane perméable et prennent une coloration rosée alors que les spermatozoïdes vivants

ont une membrane imperméable et apparaissent donc incolores. Nous avons converti les

chiffres obtenus en pourcentage.

2.10. 2. 4. Détermination des anomalies :

Nous avons utilisé la même lame que pour le dénombrement des spermatozoïdes vivants

et nous avons comptés 100 spermatozoïdes sous microscope à immersion au grossissement x

1000.

106


Nous les avons classés selon les catégories suivantes :

normaux ;

anomalies de tête (malposition, tête piriforme ou ronde, allongée ou étroite,

microcéphalique ou macrocéphalique, tete double, acrosome anormal ;

décapités ;

anomalies de la pièce intermédiaire (coudée, double, inexistante) ;

anomalies du flagelle (enroulé, double, inexistant) ;

présence de cellules autres (cristaux de spermine, cellules épithéliales, leucoxytes,

érythrocytes).

Nous avons converti les chiffres en pourcentage.

2. 11. Evaluation des paramètres biochimiques :

2. 11. 1. Dosage du Fer :

La méthode utilisée pour le dosage du fer, est une technique colorimétrique (Kit Fer-

BioSyems). L’ion ferrique présent dans l’échantillon et uni à la transferrine est libéré par

l’action du guanidinium, puis réduit à ferreux par l’acide ascorbique. L’ion ferreux forme un

complexe coloré avec la ferrozine qui est quantifié par spectrophotométrie à une longueur

d’onde de 560 nm.

2.11. 2. Dosage du magnésium:

Le dosage du magnésium est effectué par la méthode colorimétrique (Kit BioSystems)

Le magnésium présent dans l’échantillon réagit avec le calmagite en milieu alcalin, pour donner

un complexe coloré quantifiable par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 520 nm. La

présence d’EGTA dans le réactif l’interférence du calcium.

107


2. 11. 3. Dosage de l’albumine :

Le dosage de l’albumine est effectué par la méthode colorimétrique (Kit BioSystems).

La réaction de l’albumine avec le vert de bromocrésol en milieu acide, en donnant lieu à un

complexe coloré quantifiable par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 630 nm.

2. 11. 4. Dosage du calcium :

La méthode utilisée pour le dosage du calcium est une méthode colorimétrique (Kit

Randox Ca 590). En milieu alcalin les ions de calcium forment un complexe violacé avec le

complexon o-crésolphtaléine. L’intensité de la coloration est mesurée à 570 nm, elle est

directement proportionnelle à la concentration de l’échantillon.

2. 11. 5. Dosage de la phosphatase alcaline (ALP) :

La méthode pour la phosphatase alcaline est basée sur les recommandations de la

Fédération Internationale de Biochimie. Cette méthode utilise du 4-nitrophenylphosphate (4-

NPP) comme substrat. En condition optimisée, l’ALP présente dans l’échantillon catalyse la

réaction de transphosphorylation suivante :

ALP

4-NPP+H2 4-nitrophénoxide (NPO) +Phosphate

Mg/Alcalin pH Au pH de la réaction, le 4-nitrophenoxide à une couleur jaune intense. Le réactif contient

également un système de tampon d’ion métallique qui garantit la conservation des

concentrations optimales en zinc et en magnésium. Le tampon d’ion métallique peut

également chélater d’autres ions potentiellement inhibiteurs pouvant être présents. La réaction

se suit en mesurant le taux d’augmentation de l’absorbance à 405 nm qui est proportionnelle à

l’activité de l’ALP dans le sérum.

108


2. 11. 6. Dosage du cholestérol total dans du plasma :

La concentration en cholestérol total du plasma est estimée par une méthodes

enzymatique (kits Boehringer, Manneheim, Allemagne).

2. 11. 7. Dosage de la vitamine C (l’acide ascorbique) dans le plasma :

Le taux de la vitamine C est déterminé par la technique décrite par McGown et

al.,1982. Le plasma est dilué à ½ (v/v) avec la solution de l’acide trichloracétique (TCA) à

10% ensuite centrifugé à 3000 tours/15 mn. 300 ml de surnageant est ajouté à 750 ml de

ferrozine (32 mM). Les échantillons sont conservés à une température ambiante pendant 15

secondes. L'absorbance est lue à 562 nm.

2. 11. 8. Dosage de l’activité de lactate déshydrogénase (LDH) testiculaire :

L’activité de la LDH testiculaire est mesurée par le réactif du LDH-P (Thermo

Scientific Kit). Les testicules sont homogénéisés dans du tampon Tris EDTA glacé à 0,1 mol,

pH 8. La concentration du tissu est de 10 mg/ml. L’homogénat est centrifugé à 10000

tours/30min à 4°C. Le surnagent est utilisé pour le dosage de l’enzyme. L’activité de la LDH

se mesure en utilisant le pyruvate ou le lactate comme substrat, ce réactif utilise le pyruvate et

se base sur la procédure de Henry et al., 1960.

Pyruvate + NADH lactate + NAD. LDH

La LDH catalyse la réduction du pyruvate en lactate en oxydant la nicotinamide adénine

dinucléotide réduite (NADH) en NAD. L’activité de la LDH peut être déterminée par le taux

de diminution de l’absorbance à 340 nm pendant la production de la NAD.

2. 11. 9. Dosage de la vitamine C testiculaire et épididymaire :

Testicules et épididymes sont homogénéisés chacun dans 5 ml de tampon phosphate

salin. Le taux de la vitamine C est estimé par la méthode décrite par Lardy et al., 1945. 0,5

ml de l’homogénat du testicule et épididyme sont additionnés à 2 ml de l’acide

109


métaphosphorique préparé extemporanément, agités à l’aide du vortex, centrifugés à 2500

tours pendant 10 minutes. 1,2 ml du surnageant limpide a été prise. Des solutions standard

sont préparées dans sept d’autres tubes 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 0,1 et 1,2 ml qui sont ajustés avec

l’acide métaphosphorique à un volume de 1,2 ml. Pour le blanc 1,2 ml de l’acide

métaphosphorique est ajouté.

0,4 ml d'hydrazine dinitrophénol-thiourée, sulfate de cuivre a été ajouté aux homogénats des

testicules et l’épididyme, ensuite incubés dans un bain marie à 37°C avec l’acide

glucuronique et ascorbate-2-sulfate. Les tubes sont retirés du bain marie et réfrigérés pendant

10 minutes dans un bain m d’eau glacée. 2 ml de l’acide sulfurique glacial (12 mol/l) est

ajouté à chaque tube ensuite agité à température ambiante. L’absorbance est lue à 520 nm

contre le blanc. Les résultats sont exprimés en mg/dl.

2. 12. Evaluation du statut antioxydant :

2.12. 1. Produits de peroxydation lipidiques au niveau des testicules et

l’hypophyse:

Les produits sont estimés par la méthode décrite par (Hiroshi et al., 1979). Des

homogénats des différents tissus isolés (10%) sont préparés dans une solution de chloride de

potassium à 1,5%. 1 ml de l’homogénat est ajouté à 2,5 ml de l’acide trichloracétique (TCA)

à 20%.

Le mélange est centrifugé à 3500tours/10minutes à 4°C, ensuite le culot est dissout dans

l’acide sulfurique à 0,05M et 3 ml de l’acide 2 M-thiobarbiturique. Les tubes sont incubés

dans un bain d’eau bouillante pendant 30 minutes. Le contenu des tubes est refroidi et la

couleur est mise en évidence par l’addition de 4 ml de n-butanol. L’intensité de la coloration

est déterminée par spectrophotomètre à 530nm. Les résultats sont exprimés en micromoles de

malondialdéhydes (MDA) formés/g de tissu.

2.12. 2. Catalase au niveau des testicules et l’hypophyse :

L’activité de l’enzyme est déterminée par (Aebi et Packer, 1984). Les différents tissus

sont homogénéisés séparément dans du tampon phosphate 0,05 M à pH 7 contenant 0,1 mM

110


d’EDTA. L’homogénat de chaque tissu est centrifugé à 4000tours/15 minutes à 4 °C. Le

surnageant est décanté puis centrifugé à 1600tours/60à 4 °C. Le mélange réactionnel est

composé de 100µl de surnagent et 10µl d’éthanol absolu. Le mélange est agité puis gardé

dans un bain d’eau glacé pendant 10 minutes ensuite, les tubes sont portés à une température

ambiante, puis 10µl de Triton X-100 sont ajoutés et vortéxés jusqu’à la dissolution complète

des tissus.

Puis, 0,66 de peroxyde d’hydrogène (H2O2) est préparé extemporanément dans du tampon

phosphate et 100μl du tampon contenant H2O2 est ajouté au mélange réactionnel ci-dessus.

L’absorbance est lu au spectrophotomètre à 240 nm. Toutes les réactions sont préparées dans

l’obscurité (flacons opaques). Les résultats sont exprimés en micromoles de H2O2

métabolisé/mg de protéines/minutes.

2. 12. 3. Superoxyde dusmutase au niveau des testicules et hypophyse :

L’activité enzymatique est déterminée par la méthode décrite par (Beauchamp et

Fridovich, 1971). Les différents tissus sont homogénéisés (10%) dans du tampon phosphate

(10mm) à pH 7,5 ensuit centrifugé à 4000tours/10 minutes à 4°C.Le surnagent est décanté

puis centrifugé à ,16000 tours/60 minutes à 4 °C et le surnagent obtenue au est utilisé pour le

dosage. Le mélange réactionnel contient 1,5 mL du tampon phosphate (100mM) à pH 7,5, 3,5

de méthionine (130mM), 0,3 d’EDTA (10 MM) et 0,1 ml du surnageant qui contient

l’enzyme. La réaction est stoppée par l’addition de 0,1 ml de riboflavine (60mM) préparée

extemporanément. Après l’addition de la riboflavine, les tubes sont laissés au contact de la

lumière pendant 30 minutes. La densité optique est lue à 560nm. Les résultats sont exprimés

par unités/mg de protéines.

2. 13. Dosage hormonal des hormones sexuelles (testostérone, FSH et LH) :

Le dosage des hormones sexuelles est réalisé au niveau du laboratoire Pasteur d’Oran.

La concentration de la testostérone, FSH et LH est mesurée dans le sérum des différents

groupes de rats par utilisation de Kit Abott AxSYM (USA).

111


2.14. Analyse statistique des résultats :

L’analyse statistique des résultats a été réalisée par le test Student (Fisher et Yates,

1993). Ce test statistique paramétrique était adapté à une analyse comparative entre deux

groupes (groupe témoin et groupe intoxiqué).

Le risque α est de 5%, les différences statistiquement significatives sont signalées dans les

tableaux et les figures par une étoile (*), les différences statistiquement très significatives sont

signalées par deus étoiles (**) et les différences statistiquement hautement significatives

sont signalées par trois étoiles (***). Les moyennes des résultats sont exprimées ± erreur

standard.

112

Chapitre III Résultats

1. Effet du plomb sur l’évolution pondérale :

L’effet de l’intoxication chronique au plomb sur l’évolution du poids

corporel constitue un bon indicateur de la croissance des rats. La prise alimentaire de

chaque rat a été contrôlée durant toute la période d’expérimentation (12 semaines) par

une prise de poids hebdomadaire. Le gain corporel moyen a été calculé en fonction des

poids enregistrés durant toute l’expérimentation pour l’ensemble des rats.

Les résultats présentés dans la figure (34) montrent des différences

remarquables entre les rats exposés au plomb et les rats témoins. A la fin de la première

semaine (S1) nous avons observé que le poids des rats témoins s’accroît d’une manière

significative par rapport aux intoxiqués. A partir de la 3ème semaine (S3) nous avons

observé une diminution de la croissance des rats intoxiqués comparativement aux rats

témoins jusqu’à la fin de la durée d’intoxication (12 semaines).

Le plomb induit une diminution significative de la croissance des rats (p<0,05)

exposés au plomb. Leur poids a évolué de 47,2±10g à 205,7± 13,4g pour les témoins,

de 46,3±8,8g à 173,2±7,8g pour les rats exposés à 250 mg/l et de 46,4±5,4g à

46,4±5,4g à 135,4±3,7g pour les animaux exposés à 500 mg/l. Les gains de poids

corporel moyens ont évolué de 18,5±3,47 pour les témoins contre 9,79±2,56g pour les

intoxiqués à 250 mg/l et 5,46±1,47g pour les intoxiqués à 500 mg/l ce qui représente le

reflet d’une chute pondérale progressive durant les 12 semaines (figure 35).

L’analyse statistique de ces résultats met en évidence une différence significative par

rapport aux valeurs témoins (p<0,05).

Au cours des 12 semaines de contamination chronique par gavage, nous avons

constaté que les animaux intoxiqués ont manifesté plusieurs troubles tels que chute de

poils (figure 36), anorexie, agressivité, excitation, épuisement et incapacité motrice.

113


0

50

100

150

200

250

S1 S2 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12

Semaines

Poid

s cor

pore

l en

(g)

Groupes 1 Groupes 2Groupes 3

*

**

Figure (34): Effet de l’acétate de plomb sur l’évolution pondérale chez les rats exposés

au plomb pendant 12 semaines comparés aux témoins.

Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), * différence significative

(p<0,05), **différence très significative (p<0,01).

0

5

10

15

20

25

Goupes 1 Groupes 2 Groupes 3 Rats

Gai

n co

rpor

el m

oyen

(g/se

mai

ne)

*

**

Figure (35): Effet du plomb sur le gain corporel moyen chez les rats exposés au plomb.


(p<0,05), **différence très significative (p<0,01).

114


Rats témoins

Figure (36): Chute de poils chez les rats intoxiqués.

115


2. Effet du plomb sur la fertilité des rats mâles :

Le test de fertilité réalisé permet de mettre en évidence l’impact de

l’intoxication au plomb sur la fertilité des rats mâles. Les résultats du tableau (10)

montrent l’existence d’une relation dose effet entre la dose administrée et la fertilité des

rats.

En revanche, le croisement des trois groupes de rat mâles avec des femelles non

traitées conduit à l’observation de la fertilité des rats intoxiqués comparativement aux

rats témoins.

Les résultats du tableau (10) montrent que les femelles accouplées avec les mâles

intoxiqués à 500mg/l (groupes 3) n’étaient pas gravides (0% de femelles gestantes).

Ces résultats confirment la stérilité des rats intoxiqués à 500mg/l. Par contre les

femelles accouplées avec les mâles traités à 250mg/l présentent un taux de gestation

réduit par rapport aux femelles accouplées avec des rats témoins qui est passé de 95%

(♂Tx♀T) à 45% (♂250mg/lx♀T).

Nous avons constaté durant l’expérimentation que la durée de gestation n’était

pas modifiée par rapport aux témoins ni le sex-ratio des nouveau-nés. Une diminution

très significative (p<0,01) du nombre d’embryons implantés chez les femelles

accouplées avec les mâles exposés à 250mg/l a été observée par rapport aux témoins et

une réduction très significative (p<0,01)du nombre d’implants vivants. Les résultats du

tableau montrent aussi une diminution très significative (p<0,01) du nombres

d’implants vivants et du nombre des nouveau-nés. L tableau montre également que le

poids corporel des nouveau-nés et leurs survie au sevrage diminuent d’une façon très

significative (p<0,01) par rapport aux témoins.

3. Effet du plomb sur le poids relatif et la taille des organes sexuels (testicules,

épididymes, vésicules séminales et prostate) :

Les résultats de la figure (37) montrent que le poids relatif des testicules, de

l’épididyme, de prostate et des vésicules séminales diminue en fonction de la dose

administrée.

116


Chez les rats intoxiqués à 500mg/l le poids relatif des organes sexuels diminue

d’une manière très significative (p<0,01) par rapport aux témoins. Chez les rats

intoxiqués à 250mg/l le poids relatif diminue de façon significative (p<0,05)

comparablement aux témoins durant les 12 semaines.

.

Tableau(10) : Effet du plomb sur la fertilité des rats mâles.

Nombre de

femelles

gestantes

(%)

Nombre

d’implantations

Nombres

d’implants

viables

Nombre de

nouveau-

nés

% de survie au

sevrage

Groupe 1

(T)

9/10 (95%) 13,48±3 11,88±2,95 12±2 95 %

Groupe 2

(250 mg/l)

4/10 (45%) 5,5±1,95** 3,21±0,26** 4±1** 49 %**

Groupe 3

(500 mg/l)

0/10 (0%) 0*** 0*** 0*** 0***

Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), **différence très significative

(p<0,01) ; *** différence hautement significative (p<0,001).

117


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Testicules Epididymes vésiculesséminales

Prostate

Organes sexuels

Poids (mg)Groupes 1Groupes 2Groupes 3

*

*

*

*******

**

Figure (37) : L’effet du plomb sur le poids relatif des organes sexuels. Les valeurs sont

exprimées en moyenne (±SD ; n=10), **différence très significative.

118


Pour ce qui est de l’effet de l’intoxication chronique au plomb sur la taille des organes

sexuels, la (figure38) montre une diminution significative (p<0,05) de la taille des organes

sexuels des rats intoxiqués à 250mg/l et une diminution très significative (p<0,01) chez les

rats intoxiqués à 500mg/l par rapport aux rats témoins. Ceci atteste donc la diminution du

poids relatif des organes sexuels.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Testicules Epididymes Vésiculesséminales

ProstateOrganes sesuels

Taille (cm)Groupes 1Groupes 2Groupes 3

* **

*

****

****

Figure (38) : Effet du plomb sur la taille des organes sexuels. Les valeurs sont

exprimées en moyenne (±SD ; n=10), **différence très significative.

119


4. Impact du plomb sur l’architecture histologique des organes:

L’observation microscopique des tissus gonadiques a permis de révéler certaines

altérations suite à l’exposition au plomb.

4. 1. Structure des testicules :

L’étude histologique réalisée au niveau du testicule révèle une architecture normale chez

les animaux témoins (groupe 1) (figure 39). La figure montre des tubes séminifères serrés et

des espaces interstitiels faibles avec une lumière remplie de spermatozoïdes ainsi qu’une

succession cellulaire représentant une évolution normale de la spermatogenèse et de la

spermiogenèse. Nous observons facilement les différents stades de la spermatogenèse qui se

déroulent d’une façon centripète au niveau de la paroi des tubes. Les spermatogonies de

petites tailles sont situées à proximité de la membrane basale. Les spermatocytes I et II de

plus grandes tailles sont à noyaux volumineux et parfois en phase de division. Les

spermatides plus petites sont situées vers l’intérieur des tubes.

Les spermatozoïdes murs remplissent la totalité de la lumière des tubes séminifères par

leurs flagelles. Alors que l’analyse des coupes histologiques des testicules de rats intoxiqués

au plomb montre que ces différents stades sont touchés. Parmi les perturbations signalées :

Chez les rats traités à 250mg/l (figure 40), l’histologie du testicule montre une diminution

du taux des spermatozoïdes dans la lumière des tubes séminifères. L’action cytotoxique

testiculaire du plomb s’accompagne aussi de la présence de lacunes ou méats au sein de la

paroi de la gonade et atrophie partielle du tissu interstitiel ce qui témoigne probablement de

la dégénérescence des cellules de Sertoli.

Chez les rats intoxiqués à 500 mg/l les altérations histologiques semblent être plus

sévères (figure 41), nous observant une atrophie des tubes séminifères avec une lumière

totalement vide en spermatozoïdes et atrophie du tissu interstitiel entre les tubes séminifères

(absence des cellules de Leydig) ce qui signifie absence totale de la spermatogenèse et de la

spermiogenèse.

120


X 100 X 400

Sg

Sp Sz

PS

TS

TI TI

Figure (39) : Structure histologique des testicules de rats témoins. TS : Tubes

séminifères, TI : Tissu interstitiel, Sg : Spermatogonies, PS : Spermatocytes I et II, Sp :

Spermatides, Sz : Spermatozoïdes H&E.

Méats

Sz

X 100 X 400

Figure (40) : Structure histologique des testicules de rats intoxiqués à 250mg/l durant 12

semaines, montrant différents types d’altérations H&E.

Absence totale des Sp

Atrophie totale du TC

Méats

X 100 X 400

Figure (41) : Structure histologique des testicules de rats intoxiqués à 500 mg/l durant

12 semaines, montrant différents types d’altérations H&E.

121


A la différence de ces altérations histologiques microscopiques du tissu testiculaire,

nous avons constaté que l’exposition au plomb induit une diminution significative du

diamètre et de l’épaisseur des tubes séminifères chez les rats intoxiqués par rapport aux

rats témoins (tableau 11).

Tableau (11) : Effet du plomb sur le diamètre et l’épaisseur des tubes séminifères chez

le rat (µm).

Diamètre Epaisseur

Groupe 1 (T)

259,9±1,05 52,04±0,25

Groupe 2 (250 mg/l)

245,4±1,32* 47,45±0,59*

Groupe 3 (500 mg/l

199,8±2,01** 39,48±0,62**

Les valeurs sont exprimées en moyenne (± SD ; n=10), * différence significative

(p<0.05) ; ** différence très significative (p<0,01) par rapport aux témoins.

122


4. 2. Structure de l’épididyme :

L’étude histologique de l’épididyme chez les animaux témoins révèle une

architecture normale (figure 42). La figure montre des canaux épididymaires avec une

lumière pleine de spermatozoïdes tapissés par un épithélium prismatique simple

pseudostratifié à stéréocils avec les deux types cellulaires les cellules basales et les

cellules principales. Les canaux épididymaires sont entourés par un tissu conjonctif.

Alors que chez les rats intoxiqués à 250 mg/l, cette même étude révèle une

structure assez homogène avec suppression partielle du tissu conjonctif, réduction du

nombre de spermatozoïdes au niveau de la lumière des canaux épididymaires et

diminution de l’épaisseur de la paroi épithéliale qui tapisse les canaux épididymaires

(figure 43).

L’action Cytotoxique épididymaire du plomb est plus importante chez les

animaux intoxiqués pendant 12 semaines à raison de 500 mg/l. La figure (44) montre

des effets histopathologiques sévères de l’épithélium qui tapisse les canaux

épididymaires avec dégénérescence des cellules épithéliales (cellules basales et les

stéréocils) et atrophie totale du tissu conjonctif. L’exposition au plomb induit aussi chez

les animaux traités à 500 mg/l absence totale des spermatozoïdes dans la lumière des

canaux épididymaires.

123


X 400

DE

BC

PC

CT

Sc

X 100

DE Sz

Figure (42) : Structure histologique d’épididyme de rats témoins. DE : Canal

épididymaire, CT : tissu conjonctif, BC : Cellules basales, PC : Cellules principales,

Sc : Stéréocils, Sz : Spermatozoïdes H&E.

Diminution des Sp

Atrophie du tissu conjonctif

X 100 X 400

Figure (43) : Structure histologique d’épididyme de rats intoxiqués à 250 mg/l durant


Absence totale de Sp

Dégénérescence des cellules de l’épithélium

Absence totale du TC

X 100 X 400

Figure (44) : Structure histologique d’épididyme de rats intoxiqués à 500 mg/l durant


124


4. 3. Structure des vésicules séminales :

L’observation microscopique de la coupe histologique réalisée au niveau des

vésicules séminales de rats témoins montre une structure normale (figure 45).

La muqueuse des vésicules séminales qui forme de nombreux replis comporte un

épithélium pseudostratifié et un axe de tissu conjonctif. Les replis de la muqueuse sont

anastomosés, délimitant de petits espaces dans la lumière. L’épithélium des vésicules

séminales comporte de grandes cellules qui sont les cellules principales et quelques

petites cellules qui sont les cellules basales.

L’analyse des coupes histologiques des vésicules séminales de rats traités

montre des plusieurs altérations histomorphologiques.

Nous observons chez les rats exposés à 250mg/l une désorganisation avec une

hyperplasie de l’épithélium pseudostratifié, le fort grossissement nous permet de

distinguer des cellules qui présentent des noyaux plus denses (hyperchromatique).

Alors que chez les rats traités à 500 mg/l, cette même étude révèle une atteinte

sévère de l’épithélium avec hyperplasie atypique et une dystrophie glandulaire très

marquée avec un chevauchement des noyaux.

125


CT

BC CC

X 100 X 400

Figure (45) : Structure histologique de la vésicule séminale de rats témoins. CT : Tissu

conjonctif, BC : Cellules basales, CC : Cellules principales H&E.

Hyperplasie

Noyaux denses

X 100 X 400

Figure (46) : Structure histologique de la vésicule séminale de rats intoxiqués à 250

mg/l durant 12 semaines, montrant différents types d’altérations H&E.

Dystrophie glandulaire

Chevauchement des noyaux

X 100 X 400

Figure (47): Structure histologique de la vésicule séminale de rats intoxiqués à 500

mg/l. durant 12 semaines, montrant différents types d’altérations H&E.

126


4. 4. Structure de la prostate :

L’analyse histologique au niveau de la prostate montre une structure normale

chez les rats témoins (figure 48). La prostate est formée par plusieurs glandes tubulo-

alvéolaires entourées un stroma conjonctif. Les glandes sont revêtues par un épithélium

simple de cellules prismatiques. Le produit de sécrétion est stocké sous forme de masse

amorphe, les corps amylacés (CA).

L’examen microscopique de la prostate de rats exposés au plomb montre des

changements histomorphologiques avec altérations locales de la surface des cellules

épithéliales.

L’action cytotoxique du plomb sur la prostate chez les rats intoxiqués à 250 mg/l

s’accompagne avec une modification dans l’architecture des glandes (architecture

lobulaire) avec atrophie totale du tissu conjonctive et hyperplasie de l’épithélium qui

tapisse les glandes. L’observation histologique montre aussi une hypersécrétion

glandulaire (figure 49).

L’analyse histologique de la prostate chez les rats intoxiqués à 500 mg/l montre

également la persistance de l’architecture lobulaire des glandes avec une hyperplasie de

l’épithélium qui s’accompagne d’un épaississement de l’épithélium qui devient frangé,

responsable de l’augmentation du volume des glandes.

L’exposition au plomb chez les intoxiqués à 500 mg/l induit également une atrophie

totale du tissu conjonctif et une hyposécrétion glandulaire (figure 50).

127


TC

AC CB

CC

X 100 X 400

Figure (48): Structure histologique de la prostate de rats témoins. TC : tissu conjonctif, CC : cellules basales, CB : cellules cylindriques, AC : corps amylacé H&E.

Hyperplasie

Hypersécrétion

Atrophie du TC

X 100 X 400

Figure (49): Structure histologique de la prostate de rats intoxiqués à 250 mg/durant 12

semaines, montrant différents types d’altérations H&E.

Hyperplasie

Hyposécrétion

Epaississement

Atrophie du TCX 100

X 400

Figure (50): Structure histologique de la prostate de rats intoxiqués à 500 mg/l durant


128


4. 5. Effet du plomb sur les structures histologiques cérébrales :

4. 5. 1. Effet sur la structure de l’hypophyse :

L’étude histologique réalisée au niveau de l’hypophyse révèle un e architecture

normale chez les animaux témoins (figure 51).

La figure montre que le tissu est constitué de cellules présentant de longs

prolongements cytoplasmiques et probablement de nature gliales, les pituicytes (P),

nous distinguons aussi les cellules glandulaires (sécrétoires) (CS) et les corps de

Herring (HB) qui représentent des dilatations de l’extrémité des axones.

Cependant, cette même étude révèle chez les rats intoxiqués à 250 mg/l une

architecture anormale. Nous observons une raréfaction des cellules sécrétoires avec

apparition des vacuoles (figure 52).

De même, ces altérations histologiques sont plus marquées chez les rats

intoxiqués à 500mg/l puisque nous observons une atrophie totale des cellules sécrétrices

avec l’apparition de plusieurs travées (figure 53).

129


HB

P CS

X 100 X 400

Figure (51): Structure histologique de l’hypophyse de rats témoins. HB : corps de Herring, P : pituicytes, CS : cellules sécrétrices H&E.

Raréfaction des CS

Vacuoles

X 100 X 400

Figure (52): Structure histologique de l’hypophyse de rats intoxiqués à 250 mg/l durant


Atrophie totale des CS

Travées

X 100 X 100

Figure (53): Structure histologique de la prostate de rats intoxiqués à 500 mg/l durant


130


4. 5. 2. Effet sur la structure de l’hypothalamus :

L’observation microscopique des coupes histologiques réalisées au niveau de

l’hypothalamus révèle une architecture normale chez les animaux témoins (figure 54).

Les coupes montrent que l’hypothalamus est composé de noyaux volumineux qui sont

les noyaux des cellules neuro-sécrétrices et les cellules gliales.

L’exposition au plomb induit chez les rats intoxiqués une atrophie des cellules

neuro-sécrétrices avec apparition de plusieurs grandes vacuoles chez les rats traités à

250 mg/l (figure 55).

En revanche, l’architecture tissulaire de l’hypothalamus chez les rats intoxiqués à 500

mg/l montre une atteinte sévère avec hypoplasie des noyaux des cellules sécrétrices et

une vacuolisation très importante (figure 56).

131


Cg

NS

X 100 X 400

Figure (54): Structure histologique de l’hypothalamus de rats témoins. Cg : cellules gliales, NS : noyaux des cellules neuro-sécrétrices H&E.

Atrophie des NS

Vacuoles

X 100 X 400

Figure (55): Structure histologique de l’hypothalamus de rats intoxiqués à 250 mg/l

durant 12 semaines, montrant différents types d’altérations H&E.

Hypoplasie des NS

Vacuoles

X 100 X 400

Figure 56: Structure histologique de l’hypothalamus de rats intoxiqués à 500 mg/durant


132


En plus de l’effet histopathologique de l’acétate de plomb administré à raison de

250 mg/l et 500mg/l pendant 12 semaines, l’effet cytotoxique de ce métal

s’accompagne aussi macroscopiquement par une baisse très significative de la taille et

du poids absolu du cerveau par rapport aux témoins (tableau 11). En effet, le poids

passe de ± à ± chez les intoxiqués à 250 mg/l et de ± à ± chez les intoxiqués à

500mg/l.

D’autre part, l’administration du plomb entraîne également une diminution

significative du poids absolu des structures cérébrales (l’hypophyse entière et

l’hypothalamus) chez les rats exposés au plomb comparablement aux rats témoins

(figure 57).

133


Tableau (11): Effet du plomb sur le poids absolu et la taille du cerveau chez les

différents groupes de rats.

Poids (g) Hauteur (cm) Largeur (cm)

Groupes 1 1,088±0,09 20±3,75 7±3,67

Groupes 2 0,727±0,07* 17±2,63* 5±2,47*

Groupes 3 0,427±0,08** 14±1,87** 4±1,58**

Les valeurs sont exprimées en moyenne (± SD ; n=10), * différence significative


0

20

40

60

80

100

Hypothalamus Hypophyse Organes

(mg) Groupe 1Groupe 2Groupe 3*

**

* **

Figure (57) : Effet du plomb sur le poids absolu de l’hypothalamus et l’hypophyse.



134


5. Mise en évidence du plomb par histochimie au niveau des testicules :

L’observation microscopique des coupes histologiques réalisées au niveau des

testicules montre chez les rats témoins une architecture normale sans l’apparition de

dépôts jaunâtres du plomb (figure 58).

Alors que chez les rats traités, cette même étude révèle une coloration beaucoup

plus intense jaunâtre ce qui confirme le dépôt du plomb au niveau des testicules. Ce

dépôt de plomb est plus intensifié chez les rats du groupe 3 (rats intoxiqués à 500 mg/l)

(figure 59 A et B).

135


Figure (58): Etude histochimique du testicule témoins. Aucun dépôt de plomb (x100).

Dp Dp

B A

Rats traités à 250 mg/l Rats traités à 500 mg/l

Figure (59): Etudes histochimique des testicules de rats intoxiqués au plomb. Le dépôt

du plomb (Dp) est très marqué (x 100).

136


6. Mise à l’évidence du phénomène d’apoptose au niveau testiculaire :

L’un des premiers signes d’apoptose est la condensation de chromatine. Le bleu

de Toluidine boraté permet de mette en évidence cette condensation. Chez les rats

témoins les noyaux prennent une coloration claire (figure 59 A). Après traitement au

plomb, les coupes histologiques au niveau des testicules montrent des cellules

apoptotiques avec des noyaux denses vers la lumière des tubes séminifères (figure 59 B

et C).

En effet, la condensation de la chromatine est l’un des premiers signes de la mort

cellulaire. L’effet cytotoxique du plomb semble donc s’exercer par un phénomène

d’apoptose qui touche les derniers stades de la spermatogenèse.

137


A

B

Condensation de la chromatine

Noyaux non condensés

C

Figure (59): Mise en évidence histologique de cellules apoptotiques au niveau des testicules de rats. (A): témoins. L’apoptose n’est pas marquée. (B) : intoxiqués à 250 mg/l et (C) : intoxiqués à 500 mg/l. L’apoptose est marqués chez les rats intoxiqués par la condensation des noyaux.

138


7. Toxicocinétique du plomb :

7. 1. Dosage du plomb dans le sang (PbS) ou plombémie : La plombémie est le meilleur indicateur de l’exposition récente au plomb, c’est

un bon témoin de la dose interne du métal, elle est donc utilisée comme marqueur

biologique de l’intoxication par le plomb.

Les mesures de concentration sanguine du plomb en fonction de la dose à

laquelle sont exposés les animaux sont présentés en figure 60.

Le dosage du plomb effectué au niveau sanguin par spectrophotométrie d’absorption

atomique à flamme reflète l’effet dose.

Les résultats de la figure (60) montre que l’exposition chronique à l’acétate de

plomb par gavage pendant 12 semaines induit une augmentation très significative

(p<0,01) du taux de plomb dans le sang des animaux intoxiqués par rapport aux

témoins.

7. 2. Dosage du plomb tissulaire (cerveau et les organes sexuels) :

L’étude de l’effet du plomb sur sa répartition tissulaire en fonction de la dose

administrée aux animaux est présentée en figure (61).

Le dosage du plomb par spectrophotométrie d’absorption atomique à flamme indique

que tous les rats intoxiqués ont une concentration très supérieure à celle retrouvée chez

les rats témoins.

Pour les rats traités au plomb à raison de 250 mg/l, le plomb se distribue dans

l’ordre décroissant : cerveau (0,87 µgPb/g)>testicules (0,79 µgPb/g)>prostate (0,38

µgPb/g)>épididymes (0,22 µgPb/g)>vésicules séminales (0,20 µgPb/g).

139


Pour les rats traités à 500 mg/l, la distribution est : cerveau (1,66 µgPb/g)>testicules

(0,97 µgPb/g)>prostate (0,79 µgPb/g)>épididymes (0,75 µgPb/g)>vésicules séminales

(0,71 µgPb/g).

L’observation des concentrations tissulaires en plomb montre que le cerveau, les

testicules et la prostate sont des sites d’accumulation préférentiels.

De plus, l’analyse statistique montre des différences hautement significative par rapport

aux valeurs témoins (p<0,001) aussi bien pour le cerveau et les organes sexuels chez les

animaux exposés au plomb à raison de 250 mg/l et 500 mg/l.

140


0

20

40

60

80

100

120

140

Groupes 1 Groupes 2 Groupes 3 Rats

BPb µg/lGroupes 1Groupes 2Groupes 3

**

****

Figure (60): L’effet du plomb sur le taux du plomb sanguin.

Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), ** différence très significative

(p<0.01) ; ** * différence hautement significative (p<0,001) par rapport aux témoins.

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

Cerveau Testicules Epididymes Prostate Vésiculesséminales Tissues

µgPb/gGroupes 1Groupes 2Groupes 3

**

****

**

**

***

************

Figure (61): L’effet de l’intoxication au plomb sur sa répartition tissulaire. Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), ** différence très significative

(p<0.01) ; ** * différence hautement significative (p<0,001) par rapport aux témoins.

141


142

8. Etude du spermogramme (spermocytogramme): 8. 1. Effet du plomb sur le nombre, la motilité et la densité des spermatozoïdes :

Les résultats du spermogramme réalisé sur le sperme récolté par dissection de

l’épididyme et du testicule sont notés dans le tableau12.

Les résultats obtenus révèlent une diminution importante et hautement significative

(p<0,001) du nombre des spermatozoïdes testiculaire et épididymaires chez les rats

intoxiqués à 500 mg/l et une diminution très significative chez les rats intoxiqués à 250

mg/l.

Les résultats obtenus indiquent que les rats traités à 500 mg/l présentent une

azoospermie (absence totale des spermatozoïdes) et ceux intoxiqués à 250 mg/l

représentent une oligospermie (présence de spermatozoïdes en quantité anormalement

faible) par rapport aux rats témoins.

De même, les résultats du tableau 12 montrent que la motilité des spermatozoïdes

épididymaires et testiculaires a été aussi affectée par l’exposition chronique au plomb

puisque nous observons que les animaux exposés à 500 mg/l présentent une

asthénospermie (absence de mobilité des spermatozoïdes).

Le pourcentage des spermatozoïdes épididymaires mobiles a diminué de 74,40

% chez les témoins à 42,0% et 10,98% pour les traités à 250 mg/l et 500 mg/l

respectivement.

En revanche, les résultats du tableau 12 montrent une diminution hautement

significative (p<0,001) et dose dépendante de la densité des spermatozoïdes

testiculaires et épididymaires entre le groupe témoin et les groupes intoxiqués.

La densité des spermatozoïdes testiculaires passe de 9,38 x 106/ml chez les

témoins à 4,25 x 106/ml et 1,75 x106/ml chez les intoxiqués à 250 mg/l et 500 mg/l

respectivement.

Résultats

143

Densité des spermatozoïdes (x 106)

Spermatozoïdes

totaux/testicule (x

10 6)

Spermatozoïdes

/testicule/jour (x 106)

Spermatozoïdes

totaux/queue

d’épididyme (x 106)

Motilité des spermatozoïdes (%) queue d’épididyme

Testicules Queue d’épididymes

Groupes 1

110,00±6,55 18,03±1,17 185,00±5+66 74,40±2,70 9,38±0,36 58,20±3,52

Groupes 2

70,00±8,45** 11,47±1,75** 90,00±8,49** 42,0±4,47** 4,25±0,18** 30,94±1,31

Groupes 3 25,00±8,49*** 4,91±1,98*** 45,00±11,42*** 10,98±1,57*** 1,75±0,12***

10,13±0,50

Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), ** différence très significative (p<0.01) ; *** différence hautement significative

(p<0,001) par rapport aux témoins.

Tableau (12): Effet de l’intoxication au plomb sur les paramètres séminologiques.

Chapitre III


En parallèle, la densité des spermatozoïdes épididymaires passe de 58,20 x 106/ml chez

le groupe témoins à 30,94 x 106/ml et 10,13 x 106/ml chez les rats traités à 250 mg/l et

500 mg/l respectivement.

Ces résultats pourraient refléter une plus grande sensibilité au plomb de la

spermatogenèse des rats intoxiqués comparativement aux rats témoins.

8. 2. Effet du plomb sur le taux des spermatozoïdes vivants :

La figure 63 présente le pourcentage des spermatozoïdes vivants dans les trois

groupes de rats témoins et intoxiqués au plomb à raison de 250 mg/l et 500 mg/l.

Les résultats de la figure montrent une relation dose-réponse entre la dose administrée

et la vitalité des spermatozoïdes qui semble être altéré par l’intoxication au plomb.

Le pourcentage des spermatozoïdes vivants passe de 80,5% chez les rats témoins à

50,4% et 9% chez les rats traités à 250 mg/l et 500 mg/l respectivement.

Ces résultats confirment que le pourcentage des spermatozoïdes morts à

tendance à être plus élevé chez les animaux intoxiqués notamment ceux du groupe 3

(intoxiqués à 500 mg/l). Les rats du groupe 3 présentent donc une nécrospermie qui

signifie la présence d’un très grand nombre de spermatozoïdes morts.

8. 3. Effet du plomb sur l’analyse morphologique des spermatozoïdes :

La morphologie dernier paramètre analysé du spermogramme ne semble pas

échapper aux effets néfastes du plomb.

Les résultats de figure 64 montrent que le pourcentage de la tératozoospermie (anomalie

morphologique des spermatozoïdes) est plus important chez les rats intoxiqués. Le

pourcentage des anomalies morphologiques des spermatozoïdes anormaux est plus

fréquent chez les rats traités à 500mg/l (figure 64).

Le pourcentage des spermatozoïdes anormaux passe de 5% chez les rats du groupe 1

(témoins) à 25% et 75% chez les rats du groupe 2 (intoxiqués à 250 mg/l) et groupes 3

(intoxiqués à 500 mg/l) respectivement.

144


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3

Rats

Sper

mat

ozoi

des v

ivan

ts (%

)

*

***

Figure 62: pourcentage des spermatozoïdes vivants chez les animaux des différents

groupes.


(p<0.05) ; *** différence hautement significative (p<0,001) par rapport aux témoins.

0102030405060708090


Rats

% d

es sp

erm

atoz

oide

s ano

rmau

x

**

***

Figure (63): Pourcentage des spermatozoïdes anormaux chez les animaux des différents

groupes.

Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), ** différence très significative


145


Ces résultats sont confirmés par l’étude morphologique des spermatozoïdes, nous avons

constaté que les rats intoxiqués au plomb présentent plusieurs anomalies

morphologiques au niveau de la tête et du flagelle.

La figure suivante montre la morphologie d’un spermatozoïde normal (x 1000).

Tête

Flagelle

Pièce intermédiaire

Les anomalies de la tête des spermatozoïdes constatés sont :

Spermatozoïde décapité (l’acéphale) : ce spermatozoïde n’est composé que

d’une pièce intermédiaire et d’un flagelle. La tête est absente.

Spermatozoïde avec tête aplatie : le spermatozoïde présente une réduction de la

courbure de la tête.

Spermatozoïde avec tête d’épingle : la tête du spermatozoïde ressemble à une

tête d'épingle ou oblique.

Spermatozoïde à tête courbée : le spermatozoïde à une tête enroulée avec un

degré de flexion à plus de 180°.

146


Spermatozoïde décapité (x 1000) Spermatozoïde avec tête aplatie (x 1000)

Spermatozoïde à tête d’épingle(x 1000) Spermatozoïde à tête courbée (x 1000)

147


Les anomalies du flagelle révélées sont :

Le spermatozoïde à flagelle angulé : le spermatozoïde présente un flagelle tordu.

Le spermatozoïde à flagelle court : le spermatozoïde présente un flagelle court.

Spermatozoïde à flagelle court x 1000 Spermatozoïde à flagelle angulé x 1000

148


149

9. Effet du plomb sur les paramètres biochimiques :

Les résultats des différents paramètres biochimiques (albumine, ALP, Calcium,

Magnésium Fer total et le cholestérol total) sont présenté dans le tableau 13.

Les résultats concernant le dosage de l’albumine montrent qu’il y’a une diminution

remarquable et progressive en fonction de la dose d’acétate de plomb administrée par

gavage chez les rats intoxiqués par rapport aux rats témoins. Cette hypoalbuminie

reflète un dysfonctionnement hépatique.

De même, l’analyse un des marqueurs de la fonction hépatique indique qu’au

niveau plasmatique l’activité de l’ALP est significativement diminuée (p<0,01) chez les

rats traités comparativement aux témoins.

Le dosage de l’ALP montre que l’exposition au plomb pendant 12 semaines induit

également des lésions au niveau du foie.

De plus, les résultats du tableau 13 montrent que le plomb induit chez les

animaux intoxiqués durant 12 semaines une hypocalcémie et une diminution

significative (p<0,01) du taux du magnésium (Mg) et du taux du calcium (Ca) par

rapport aux rats témoins.

En revanche, l’administration de l’acétate du plomb par gavage pendant 12

semaines induit chez les rats intoxiqués une augmentation très significative (p<0,01) du

taux de cholestérol comparativement aux rats témoins.

Résultats

150

Albumine

(g/dl)

ALP (µmol/ml) Fer total (mg/l) Cholestérol total

(mg/100 ml)

Mg (µg/100 ml) Ca (mg/l)

Groupes 1 (Témoins

5,16±0,16 202±12 5,67±0,16 49,96±4,68 44,32±2,76 135,2±0,93

Groupes 2 (250 mg/l)

4,1±0,28* 147±8* 2,75±0,39* 65,2±3,69* 30,82±2,38* 129,1±0,56*

Groupes 3 (500 mg/l)

2,01±0,18** 130±5** 1,22±0,42** 129,3±9,37** 25,56±1,59** 122,3±0,49**

Tableau (13) : Effet du plomb sur les différents paramètres biochimiques.

Chapitre III


10. Effet du plomb sur la vitamine C plasmatique :

Etant donné que la vitamine C est connue comme étant un composé antioxydant

non enzymatique qui empêche la peroxydation des lipides du plasma, nous avons

déterminé la teneur en vitamine C chez les différents groupes de rats.

Les résultats présenté dans la (figure 65) montrent une diminution très

significative (p<0 ,01) de la vitamine Chez les rats intoxiqués.

La teneur en vitamine C passe de 45,33±5,44 µmol/l chez les rats témoins à 31,16±3,67

µmol/l et 24,65±2,48 µmol/l chez les rats intoxiqués à 250 mg/l et 500 mg/l

respectivement.

Ces résultats indiquent l’effet oxydatif induit par l’intoxication chronique au plomb.

11. L’effet du plomb sur l’activité du lactate déshydrogénase (LDH) testiculaire :

L’activité de la LDH est le principal indice sensible dans la recherche de la

toxicité reproductive. L’analyse de l’activité de la LDH est significativement augmentée

(p<0,01) après l’exposition au plomb pendant 12 semaines chez les rats des groupes

intoxiqués comparativement aux rats du groupes témoins (figure 66).

Ces résultats reflètent l’effet cytotoxique du plomb sur les testicules par

détérioration de l’épithélium germinal. La LDH joue un rôle majeur dans la glycolyse

anaérobique et fournit la plupart de l’énergie nécessaire à la motilité des

spermatozoïdes.

151


0

10

20

30

40

50

60


Rats

Aci

de a

scor

biqu

e (µ

mol

/l

*

**

Figure (64) : Effet du plomb dur la teneur plasmatique de la vitamine C.


(p<0.05) ; **différence très significative (p<0,01) par rapport aux témoins.

05

10152025303540

Groupes 1 Groupes 2 Groupes 3Rats

Uni

tés/m

g de

pro

téin

es

*

**

Figure (65) : L’activité de la LDH chez les rats témoins et les rats intoxiqués au plomb.


(p<0.05) ; **différence très significative (p<0,01) par rapport aux témoins.

152


12. L’effet du plomb sur la teneur en vitamine C testiculaire et épididymaire :

Les mesures de concentration tissulaire de la vitamine C testiculaire en fonction

de la dose de l’acétate de plomb administrée par gavage pendant 12 semaines sont

présentés en figure (67).

Les résultats de la figure 67 montrent une diminution hautement significative (p<0,001)

de la teneur en vitamine C au niveau testiculaire chez les rats intoxiqués au plomb par

rapport aux rats témoins.

En revanche, cette même analyse au niveau de l’épididyme montre aussi une

diminution hautement significative (p<0,001) de la teneur en vitamine C chez les rats

traités à 250 mg/l et 500 mg/l comparativement aux témoins (figure 68).

Les résultats confirment encore l’effet oxydatif direct du plomb sur les testicules et

l’épididyme.

153


0

0,5

1

1,5

2

2,5


(mg/

g tis

sues

)

*****

Figure (66): L’effet du plomb sur la concentration tissulaire de la vitamine C testiculaire. Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), **différence très significative


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Groupes 1 Groupes 2 Groupes 3

Rats

mg/

g ti

ssue

s

*****

Figure (67) : L’effet du plomb sur la concentration tissulaire de la vitamine C épididymaire. Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), ** différence très significative


154


13. Paramètres d’effet sur le stress oxydant :

13. 1. Marqueurs de la peroxydation des lipides (Acide malondialdéhyde) (MDA) : Le taux de MDA est un produit des réactions de peroxydation lipidique qui se

forme lors de l’attaque des lipides polyinsaturés (de la famille n-6) par des espèces

réactives de l’oxygène générées par certains contaminants (métaux lourds). Les

hydroperoxydes ainsi formés se décomposent en intermédiaires radicalaires et en

aldéhydes dont un des représentants les plus réactifs est le malondialdéhyde (MDA). Le

MDA est un agent alkylant puissant capable de réagir avec les macromolécules

biologiques. Le dosage de ce composé présente donc un intérêt certain chez les soumis

à des contaminations multiples.

Les graphiques décrivant l’effet du plomb sur le taux des MDA au niveau

testiculaire et hypophysaire sont présentés dans les figures (69) et (70). Les résultats

obtenus montrent que l’exposition chronique au plomb induit une importante

augmentation significative (p<0,001) des MDA au niveau testiculaire et hypophysaire

chez les rats intoxiqués par rapport aux rats témoins, cette augmentation étant

grossièrement dépendante de la dose administrée

Pour les rats intoxiqués à raison de 250 mg/l les MDA se produit dans l’ordre

décroissant hypophyse entière (3,99±0,78 µmoles de MDA/g de tissu)> testicules

(3,8±0,78 µmoles de MDA/g de tissus).

Pour les rats intoxiqués à 500 mg/l les MDA se produit également dans l’ordre

décroissant hypophyse entière (7,76±0,82 µmoles de MDA/g de tissu)> testicules

(6,9±0,84 µmoles de MDA/g de tissu).

Toutefois, il semble que l’intoxication au plomb induit un stress oxydatif via une

production des MDA tissulaires.

155


012345678

Groupes 1 Groupes 2 Groupes 3 Rats

µmol

es d

e M

DA

/g d

e tis

sus

**

***

Figure (68) : Taux des MDA testiculaires (µmoles de MDA/g de tissu) chez les rats témoins et les rats exposés au plomb. Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), **différence très significative


0

2

4

6

8

10


µmol

es d

e M

DA

/g d

e tis

sus

**

***

Figure (69) : Taux des MDA hypophysaire (µmoles de MDA/g de tissu) chez les rats témoins et les rats exposés au plomb. Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), **différence très significative


13. 2. Effet sur l’activité catalasique testiculaire :

156


Les catalases catalyses la réduction du peroxyde d’hydrogène en eau et en

oxygène moléculaire. Ce sont des enzymes peroxysomales dont le rôle est de prévenir

les peroxidations des molécules biologiques induites par l’eau oxygénée.

Le suivi de l’activité testiculaire et hypophysaire de la catalase est présenté en

figure (71) et (72). Les figures nous permet de visualiser l’effet dose sur l’activité

catalasique. Comme le montre les figures, le plomb provoque une très forte induction de

l’activité catalasique testiculaire et hypophysaire chez les rats intoxiqués

comparativement aux rats témoins. Cette activité est bien marquée au niveau des

testicules des rats exposés au plomb.

Après 12 semaines, une activation significative de la catalase est observée chez

les animaux exposés au plomb (p<0,001). Les niveaux d’activation testiculaire observés

sont de 5,58±0,59 µmolesH2O2/min/mg protéines et 15,25±1,98 µmolesH2O2/min/mg

protéines chez les rats exposés à 250 mg/l et 500 mg/l respectivement.

De même, les niveaux d’activation hypophysaire observés sont de 1,75±0,57

µmolesH2O2/min/mg protéines et 10,72±1,99 µmolesH2O2/min/mg protéines chez les

rats exposés à 250 mg/l et 500 mg/l respectivement.

Nous pouvant donc retenir qu’à la suite d’une exposition au plomb, l’activité

catalasique se révèle un bon marqueur du stress oxydatif imputable au plomb.

157


02468

1012141618


Rats

CA

T µ

mol

es H

2O2/

min

/mg

prot

éine

s)

**

***

Figure (70) : Activité catalasique testiculaire (µmolesH2O2/min/mg protéines) chez les rats témoins et les rats intoxiqués. Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), **différence très significative


0

2

4

6

8

10

12


Rats

CA

T (µ

mol

es H

2O2/

min

/mg

prot

éine

s)

**

***

Figure (71) : Activité catalasique hypophysaire (µmolesH2O2/min/mg protéines) chez les rats témoins et les rats intoxiqués. Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), **différence très significative

(p<0.01) ; *** différence hautement significative (p<0,001) par rapport aux témoin.

13. 3. Impact sur l’activité de la SOD testiculaire et hypophysaire :

158


Le suivi de l’activité testiculaire et hypophysaire de la SOD est présenté en

figure (27) et (73). L’analyse statistique montre que l’administration de l’acétate de

plomb induit une augmentation hautement significative de l’activité de la SOD. Plus la

dose augmente plus l’activité de cette enzyme augmente.

Les niveaux d’activation testiculaire observés sont de 22,4±2,3

µmolesH2O2/min/mg protéines et 33,8±2,6 µmolesH2O2/min/mg protéines chez les rats

exposés à 250 mg/l et 500 mg/l respectivement.

De même, les niveaux d’activation hypophysaire observés sont de 18,3±1,7

µmolesH2O2/min/mg protéines et 29,6±2,2 µmolesH2O2/min/mg protéines chez les rats

exposés à 250 mg/l et 500 mg/l respectivement.

Ces résultats montrent que l’intoxication au plomb a généré chez les rats

traités un stress oxydant pendant12 semaines de traitement, une induction de l’activité

de la SOD. Ceci met en évidence les effets oxydants du plomb.

159


05

10152025303540


Rats

SOD

(uni

tés S

OD

/mg

prot

éine

s)

**

***

Figure (72) : Activité de la SOD testiculaire (unité SOD/mg protéines) chez les rats

témoins et lest rats intoxiqués.



0

5

10

15

20

25

30

35


Rats

SOD

(uni

té S

OD

/mg/

pro

téin

es)

**

***

Figure (73) : Activité de la SOD hypophysaire (unité SOD/mg protéines) chez les rats

témoins et lest rats intoxiqués.



14. Variation du taux des hormones sexuelles (Testostérone, FSH et LH) :

160


La figure (73) montre une variation importante du taux des hormones sexuelles

sériques chez les rats traités par rapport aux rats témoins. Ce taux baisse d’une façon

très significative (p<0,01) chez les rats intoxiqué comparativement aux rats témoins.

Le taux de la testostérone passe de 12,9±2,02ng/l chez les témoins à 9,1±1,4 et

6,5±0,47 ng/l chez les rats exposés au plomb à raison de 250 mg/l et 500 mg/l

respectivement.

De même pour le taux de FSH, passe de 74,9±10,6 ng/l chez les témoins à

45,3±7,3 et 29,6±3,74 ng/l chez les rats traités à raison de 250 mg/l et 500 mg/l

respectivement.

La même chute du taux de LH est constatée chez les rats intoxiqués pendant 12

semaines puisque le taux de l’hormone passe de 8,25±3,64 ng/l chez les témoins à

5,34±1,72 et 2,88±0,93 ng/l chez les rats exposés au plomb à raison de 250 mg/l et 500

mg/l respectivement.

161


Rats0

20

40

60

80

100

Testostérone FSH LH

ng/l Groupes 1Groupes 2Groupes 3

* *

*

** **

**

Figure (74) : L’effet du plomb administré par gavage sur la concentration des hormones

sexuelles chez les rats témoins et les rats intoxiqués.

Les valeurs sont exprimées en moyenne (±SD ; n=10), *différence significative


162

Chapitre IV Discussion

La physiologie de la fertilité chez les mammifères est très sensible aux

perturbations de l’organisme par les agents exogènes. De nombreuses études indiquent une

diminution du nombre et de la qualité des cellules sexuelles mâles humaines au cours de

ces dernières années (Jegou, 1996). Il semble que les perturbations de l’appareil sexuel

humain mâle se multiplient. La pollution de l’environnement est incriminée en grande

partie dans cette infertilité faisant partie d’un problème posé : l’impact de l’environnement

sur la santé (Bujan, 1998). Bien que les mécanismes biochimiques de la toxicité de ses

agents exogènes ne soient encore bien compris, ils sont considérés comme de véritables

agents toxiques touchant la fertilité (Xie, 1995 ; El Feki et al., 2000 ; Morrison, 2001).

4. 1. Effet du plomb sur la croissance pondérale:

Les résultats obtenus au terme des 12 semaines d’intoxication chronique à l’acétate

de plomb par gavage ont montré l’effet du plomb sur la prise alimentaire qui se traduit par

une diminution significative du gain corporel moyen chez les rats intoxiqués comparés aux

rats témoins. Cette diminution du gain corporel reflète une baisse du poids corporel chez

les rats exposés au plomb qui est directement associée à la diminution de la consommation

de la nourriture. Nos résultats montrent que l’intoxication au plomb provoque un effet

anorexigène et ils permettent de justifier l’implication du plomb dans le système de

transmission dopaminergique.

Différents travaux ont suggéré que de nombreux médiateurs sont impliqués dans la

régulation du comportement ingestif. Parmi ces neuromédiateurs la sérotonine et la

dopamine pouvant jouer un rôle prépondérant dans le contrôle de la satiété (Duterte-

Boucher, 1988). Nos résultats sont en accord avec les travaux entrepris par Gautam et al.,

(2001) ; Smith et al., (2008) qui ont observé une réduction dans la consommation de la

nourriture chez les rats mâles intoxiqués selon la dose administrée et la durée d’exposition.

Il est évident que la réduction dans la consommation de la nourriture est la cause de la

diminution du gain corporel.

163


En effet, il est connu que le plomb interagit avec de nombreuses voies nerveuses et

structures cérébrales qui sont impliquées dans le processus de régulation dans la satiété et

la faim, ce qui permet de justifier l’effet anorexigène chez les rats intoxiqués par l’acétate

de plomb et par modification des différents systèmes de transmissions nerveuses (Duterte-

Boucher, 1988 ; Auclair et al., 2004). Néanmoins, les métaux lourds sont connus pour agir

sur le poids corporel des animaux même lorsque les nivaux d’intoxication restent faibles

(Shailesh et Desiraju, 1990).

En plus, la durée de l’exposition au plomb induit des effets majeurs sur les

paramètres de santé chez les animaux intoxiqués (perte de poids et chute de poils). La

diminution de la prise alimentaire a engendré des répercussions sur la croissance pilaires.

Etant donné que le poil est constitué chimiquement de 4 à 13% d’eau, de 2 à 3% de lipides,

de 0,23 à 0,8% de cendres et enfin de 85 à 93% de protéines (Noli et al., 1999) Nos

résultats ont montré une chute très importante de poils chez les animaux exposés au plomb

par rapport aux rats témoins. Les résultats obtenus confirment que la diminution de la prise

alimentaire a engendré chez les animaux intoxiqués des carences nutritionnelles qui ont

aboutit à cette perte de poils importante (Macdowell, 1992). En revanche, durant notre

protocole expérimental nous avons constaté que l’exposition au plomb pendant 12

semaines a induit un changement dans le comportement des animaux intoxiqués

(agressivité, épuisement et incapacité motrice). D’après les travaux de Sidhu et Nehru,

(2003), ce/ perturbations sont associées au système dopaminergique et cholinergique.

Dans le même contexte, l’exposition chronique au plomb peut provoquer des effets

délétères sur la structure et le fonctionnement des organes sexuels et sur le cerveau. Nos

résultats ont montré que le plomb a induit une diminution significative dans le poids

relatifs et la taille des organes sexuels et le cerveau entier avec diminution du poids absolu

de l’hypophyse et l’hypothalamus des rats traités par rapport aux rats témoins. Cette

diminution est due à l’action du plomb sur les tissus induisant des lésions cellulaires qui

vont conduire à une atrophie des organes sexuels (Wang et al., 2008 ; Smith et al., 2008)

l’hypophyse et l’hypothalamus (Cooper et al., 1986 ; Coffigny et al., 1994); soulignant que

la toxicité sur les organes est de manière dose dépendante qu’elle que soit la voie de

pénétration dans l’organisme (Samuels et al., 1984 ; Kuladip et al., 2006).

164


Les études réalisées par Aitken, (1999), ont montré que la diminution de la masse

des testicules est due à une perte de cellules germinales ce qui confirme la toxicité du métal

(Biswas et Ghosh, 2004). Par conséquent le plomb est identifié comme un facteur de

risque provoquant des lésions morphologiques (Leret et al., 2003 ; Verstraeten et al.,

2008).

4. 2. Effet du plomb sur les structures histologiques des organes (testicules,

épididyme, vésicules séminales, prostate, hypophyse et hypothalamus).

L’étude histologique constitue un bon indicateur de l’atteinte de l’architecture et la

taille des organes (Karadeniz et Cemek, 2006 ; Meeker et al., 2007 ; Telisman et al.,

2008).

L’examen microscopique des coupes histologiques réalisées au niveau des

testicules de rats traités a montré une diminution des spermatozoïdes chez les rats

intoxiqués à 250 mg/l voire une absence totale des spermatozoïdes dans la lumière des

tubes séminifères des rats intoxiqués à 500 mg/l.

Nos résultats ont montré que l’action toxique du plomb est très sévère au niveau

des testicules car cette analyse histologique met en évidence la présence de lacunes ou

méats au sein de la paroi des testicules de rats intoxiqués qui témoigne de la

dégénérescence probable des cellules de Sertoli confirmant l’atteinte profonde de la

spermatogenèse et de la spermiogenèse.

La cellule de Sertoli a une importante activité élaboratrice, elle synthétise de très

nombreuses substances endocrines qui interviennent directement ou non dans la régulation

de la spermatogenèse (Gartner et Hiatti, 1997 ; Grignon, 2001). Nos résultats sont en

accord avec ceux de Johansson et Pellicciari, (1988) ; Imran et al., (2003) ; Haito et al.,

(2008) qui rapportent que l’exposition au plomb de rats, souris et lapins a des tombés

tissulaires délétères.

165


En revanche, l’analyse quantitative a montré une diminution remarquable dans le

diamètre et l’épaisseur des tubes séminifères chez les rats intoxiqués pendant 12 semaines

comparativement aux rats témoins. Nous postulons donc que l’arrangement désordonné de

la couche des cellules germinales a pu engendrer ces changements observés dans le

diamètre et l’épaisseur des tubes séminifères ce qui indique que le plomb inhibe la

croissance des testicules. Nos observations s’accordent avec celles de Liu et al., (2008) ;

Collin et al., (2001) qui montrent que l’exposition des rats au plomb à raison de 300 mg/l

et au fluoride à raison de 150 mg/l provoque aussi une réduction de l’épaisseur et diamètre

des tubes séminifères.

L’effet histopathologique du plomb dans les testicules a montré également une

atrophie partielle du tissu interstitiel chez les rats intoxiqués à 250 mg/l et une atrophie

totale chez les rats intoxiqués à 500 mg/l ce qui témoigne probablement d’après Holdcraf

et Braun, (2004) ; Dadoune, (2006) de la dégénérescence des cellules de Leydig qui

jouent un rôle essentiel dans l’élaboration des androgènes sous l’influence de LH

hypophysaire qui ont une action sur les cellules des Sertoli et stimulent aussi la

spermatogenèse. Ces résultats confirment également l’atteinte profonde de la

spermatogenèse et de la spermiogenèse (Wenda-Rozewicka., 1996).

Cet effet cytotoxique observé sur l’architecture du testicule est confirmé par les

dépôts de plomb mis en évidence par histochimie. Nos résultats sont en accord avec ceux

de Gobrel et al., (2002) ; Chakroun, (2003). D’autres études ont proposé l’hypothèse du

phénomène d’apoptose (mort cellulaire) des cellules germinales pour expliquer la

réduction du nombre voire l’absence totale des spermatozoïdes dans la lumière des tubes

séminifères .Nos résultats ont montré la présence de cellules apoptotiques au niveau des

tubes séminifères des rats exposés au plomb par rapport aux rats témoins. Des résultats

similaires sont obtenus par Ronis et al., (1996) ; Yan et al., (2000) ; Allouche et al.,

(2009).

166


Par ailleurs, l’analyse des coupes histologiques de l’épididyme des rats traités au

plomb révèle une atteinte sévère qui se manifeste par une atrophie partielle du tissu

conjonctif et une diminution des spermatozoïdes dans la lumière des canaux épididymaires

chez les rats intoxiqués à 250 mg/l. Par contre, chez les rats intoxiqués à 500 mg/l ces

perturbations sont plus profondes puisque l’étude histologique montre une dégénérescence

de l’épithélium qui tapisse les canaux épididymaires avec absence totale des

spermatozoïdes. Nos résultats coïncident avec ceux de Sokol et al., (1985) ; Ronis et

(1996) ; Vaglenov et al., (2001) ; Allouche et al., (2009) qui ont montré des altérations

sévères au niveau de l’épididyme y compris la dégénérescence de l’épithélium et du tissu

conjonctif causés par le plomb.

L’exposition chronique au plomb s’accompagne aussi d’une atteinte sévère de

l’architecture tissulaire de la vésicule séminale qui se manifeste par une hyperplasie et

atrophie de la glande. L’effet du traitement est dose dépendant. Les vésicules séminales

sécrètent un liquide alcalin riche en glucide, partie majoritaire du sperme. Le liquide sert à

nourrir les spermatozoïdes q’elles stockent (Guyton et Hall, 1996). L’atteinte de vésicule

séminale par le plomb a plusieurs conséquences, parmis eux la mort des spermatozoïdes.

Nos observations s’accordent avec celles de Pinon-Lataillade, (1995) ; Hovatta et al.,

(1993) ;Valojerdi et Rezazadeh, (2008) qui ont montré que l’éthanol et certains métaux

lourds provoquent des dommages au niveau de l’épithélium des vésicules séminales.

De même, l’analyse des coupes histologiques de la prostate des rats intoxiqués a

révélé aussi une atteinte sévère de la glande qui se manifeste par une hyperplasie de

l’épithélium. La prostate produit le liquide prostatique, ce liquide rentre dans la

composition du sperme en se mélangeant avec les spermatozoïdes en provenance des

testicules. Il favorise en apportant du volume au sperme émis ainsi que des enzymes

facilitant la pénétration des spermatozoïdes à travers le col utérin (Helminen et al., 1975 ;

Mann et Lutwak-Mann, 1981). Nos résultats sont en accord avec ceux de Alvarez et al.,

2004 ; Motrich et al., 2007 ; Multigner et al., 2008) qui ont rapporté que l’exposition des

rats aux métaux lourds conduit à de nombreuses anomalies qui touchent la glande et qui

peuvent engendrer même des cancer de la prostate.

167


L’exploration histologique de l’hypophyse et l’hypothalamus a permis d’observer

une dégénérescence totale des cellules neurosécrétrices chez les rats intoxiqués. Des études

similaires utilisant l’acétate de plomb durant une longue période les mêmes répercussions

tissulaires (Sokol et al., 1985 ; Kempinas et al., 1994 ; Verstraeten et al., 2008). Nos

résultats confirment la neurotoxicité du plomb (Leret et al., 2003; Ait Hamadouche et al.,

2009a).

4. 3. La bioaccumulation du plomb à l’échelle tissulaire :

Le dosage du plomb dans le sang total (plombémie) est le seul examen permettant

de repérer et de diagnostiquer une intoxication par le plomb. La plombémie physiologique

est égale à zéro car le plomb n’est pas nécessaire à la vie des êtres vivants. Après

absorption digestive, le plomb passe dans le sang où il se répartit dans les hématies, sous

une forme non diffusible avant d’aller se fixer dans les tissus ou être éliminé dans les

urines. Le sang est donc le carrefour de tous les trajets du plomb dans l’organisme, ce qui

complique l’interprétation des taux sanguins (Pezerat, 2006). Les deux indicateurs de

l’intoxication au plomb dans notre étude les plus sensibles sont la plombémie et la teneur

en plomb dans les organes (cerveau, testicules, épididymes, vésicule séminale et prostate).

Quand il existe du plomb dosable dans le sang circulant, la plombémie mesurée à un

moment donné résulte de l’équilibre entre d’une part l’éventuelle absorption récente et

d’autre part la résorption du plomb retenu dans les os.

L’analyse statistique a montré une plombémie significativement élevée chez les rats

intoxiqués comparativement aux rats témoins. Les travaux entrepris par kopp et al.,

(1988) ; Abd-El-Reheem, (2008) ont trouvé une corrélation entre les lésions pathologiques

des gonades mâles et la teneur du sang en plomb. Ces auteurs suggèrent qu’il existe

probablement une relation complexe entre l’ampleur de l’exposition qui devient de plus en

plus critique et la durée de l’exposition. Cette relation peut être liée à la cinétique du

plomb dans l’organisme. Les études réalisées par Hami et al., (2006) ; Moussa et

Bashandy, (2008) ont suggéré que le plomb accumulé dans les tissus mous et qui sont

hypersaturés est mobilisé dans la circulation. Les résultats suggèrent que après 12 semaines

d’intoxication le plomb des tissus mous qui sont hypersaturés est mobilisé dans la

circulation (Hami et al., 2006 ; Moussa et Bashandy, 2008).

168


Au cours de notre étude, nous avons également montré que le rat est doté de faculté

importante de bioaccumulation et de bioconcentration du plomb. Les concentrations

tissulaires mesurées chez les rats intoxiqués après 12 semaines d’exposition au plomb sont

effet avérées très importantes. Elles sont comprises entres 0,87 et 0,20 µg /g de tissus pour

les rats exposés à 250 mg/l et 1,66 et 0,70 g/g de tissus pour les rats intoxiqués à 500 mg/l.

Ces valeurs semblent comprises dans la gamme de celle citée dans la littérature (DeSilva,

1981 ; Froines et al., 1995 ; Manton et Malloy, 1983 ; O’Flaher et al., 1978). Des études

de biocénitique d’accumulation du plomb ont démontré que les expositions chroniques ne

pouvaient être extrapolées à partir d’expositions aigües (Paquet et al., 2005).

De façon surprenante au regard des résultats obtenus après exposition au plomb, les

résultats du dosage de la teneur en plomb des organes ont montré un effet significatif sur la

concentration du plomb dans les organes après 12 semaines de traitement (Gwiazda et al.,

2002 ; Lin et al., 2003). Les métaux exogènes ont une distribution hétérogène lorsqu’ils

pénètrent le cerveau (Subhash et Padmashree, 1990 ; Moller-Madsen, 1994 ; Tarohda et

al., 2004) et d’autres organes et peuvent interférer avec les ions métalliques fondamentaux

(p.ex. fer) (Aschner, 2000 ; Roth et Garrick, 2003). Dans notre cas, les résultats ont

montré que le plomb a également une distribution hétérogène dans l’organisme des rats

intoxiqués. Le cerveau et les testicules sont les structures qui concentrent le plus le plomb

alors que les autres organes (épididymes, vésicule séminale et la prostate) sont les

structures qui concentrent le moins de plomb. Cette distribution est assez similaire à celle

des autres métaux neurotoxiques (Rios et al., 1989 ; Paquet et al., 2005, Ait Hamadouche

et al., 2009b).

Or, chez les vertébrés il existe une barrière hémato-testiculaire (BHT) assurant un

isolement des testicules de la circulation sanguine générale (Sadykov et al., 2009). Ainsi,

dans les testicules, les cellules proches de la lumière du tubule séminifère sont protégées

des agressions toxiques chimiques ou radioactives par cette barrière. L’hypothèse d’un

passage de cette barrière semblerait néanmoins possible par le biais de la voie

physiologique (ce qui expliquerait que nous retrouvons du plomb dans les gonades)

(Flüry-Hérard et Ménétier, 2003).

169


La présence de cette barrière est généralement suffisante à éviter la diffusion des

molécules indésirables vers le compartiment cérébrale. Or d’après les résultats de notre

étude il apparaît que le plomb a pu franchir cette barrière et ce quelle que soit la dose

administrée. Ceci suggère qu’un franchissement facilité de la barrière hémato-encéphalique

ne serait pas attribuable à une altération de la barrière (comme cela est suggéré pour les

testicules). Ce sont donc les propriétés chimiques de cet élément qui lui confèrent sa

capacité à diffuser au travers de celle-ci.

Ainsi, pour franchir la barrière, les composés doivent avoir soit une forte lipo-

solubilité ce qui leur permet de traverser toutes les membranes cellulaires, soit une forte

affinité pour des systèmes de transport spécialisés (Legett Pellmar, 2003 ; Lemercier et al.,

2003 ; Barber et al., 2005 ; Bussy, 2005 ; Lestaevel et al., 2005 ; Paquet et al., 2006).

Toutefois, la barrière hémato-encéphalique présente deux caractéristiques : elle est

absente dans certaines zones très localisées du cerveau (organes périventriculaires dont les

noyaux supraoptiques et para-ventriculaire de l’hypothalamus) et possède une perméabilité

régionale naturelle (Coppin et Gache, 2003).

4. 4. Effet du plomb sur les paramètres biochimiques sanguins :

Au niveau sanguin nous avons entrepris l’analyse d’une série de paramètres

biochimiques portant sur le dosage du calcium, magnésium, l’albumine, l’ALP, le fer total

et cholestérol total.

En effet, nous avons observé une hypocalcémie significative chez les rats

intoxiqués qui est proportionnelle à la dose administrée. Nos résultats obtenus corroborent

avec les travaux réalisés par Bischoff-Ferrari, (2006) ; Lappe, (2007) ; Bischoff-Ferrari,

(2009).

L’hypocalcémie observée au cours de notre étude pourrait s’expliquer soit par la

compétition entre le plomb et le calcium au niveau intestinal (Todorovic et al., 2008 ;

Herman et Geraldine, 2009) ; soit par l’inhibition de l’activité de la vitamine D dans le

foie et le rein (Chichovska et Anguelov, 2006 ; Herman et Geraldine, 2009).

170


La vitamine D est transformée par le foie et le rein en métabolite actifs, le calcitriol

qui agit sur des récepteurs spécifiques pour augmenter la calcémie (Holick, 2007 ; Tevera-

Mendoza et White, 2008). Le calcitriol modifie la synthèse de protéines de transport et les

enzymes impliquées dans le métabolisme du calcium et du phosphore BenNacr et

Pascaud, 1991 ; Whitehead et al., 1997 ; Niyogi et Wood, 2003 ; Gavazzo et al., 2008 ;

Sadykov et al., 2009 ).

De même, l’administration du plomb a induit également une hypomagnésémie

significative chez les rats intoxiqués. Le dérèglement de ces deux paramètres biochimiques

dans le sérum pourrait s’expliquer par une atteinte rénale et hépatique (Dupin et al., 1992 ;

McLean, 1994 ; Schaafsma, 1997 ; Todorovic et al., 2008 ; Herman et Geraldine, 2009 ; ;

Royer, 2009 ).

A travers de notre étude, nous avons également montré que la concentration

plasmatique du fer total est significativement diminuée chez les rats intoxiqués par rapport

aux rats témoins. Ceci peut s’expliquer par le fait que le plomb rentre en compétition avec

le fer (Dobbin et al., 1978 ; Flanagan et al., 1982 ; Luhovsky , 2001 ; Golalipon et al.,

2007 ). Ces résultats sont en accord avec les travaux de Sokol et al., (1985) ; Haitao et

al., (2008) ; Herman et Geraldine, (2009) qui indiquent que la diminution du taux

plasmatique du fer total est un indice sensible du dysfonctionnement de la moelle osseuse.

Dans cette même série d’expériences nous avons recherché l’effet de

l’administration de l’acétate de plomb par gavage sur la concentration plasmatique de

l’albumine. L’albuminurie est comme un indicateur de lésions glomérulaires rénales

(Kempinas et al., 1994 ; Batra et al., 2001 ; Kiran et al., 2008)). Les résultats ont montré

une hypoalbuminurie chez les rats traités comparativement aux rats témoins. Cette

hypoalbuminurie pourrait être expliqué par la perturbation de l’activité des cellules

hépatiques ou par la diminution de l’apport exogène en protéines et la réduction dans

l’absorption des acides aminés causée par le syndrome de malabsorption ou malnutrition

(Abd-El-Reheem, 2008 ; Christensen, 2008).

171


En revanche, les résultats présentés dans notre étude ont montré une

hypercholestérolémie chez les rats intoxiqués comparativement aux rats témoins. La

relation entre l’induction de l’acétate de plomb et le taux du cholestérol permet de suggérer

une éventuelle altération du métabolisme des lipides (Skoczyńska et al., 1993 ;

Skoczyńska et Smolik, 1994 ; Hami et al., 2006 ; Moussa et Bashandy, 2008 ;

Ademuyiwa et al., 2009).

En analysant l’impact d’une intoxication chronique au plomb sur l’activité de

l’ALP nous avons remarqué une augmentation significative du taux plasmatique de

l’enzyme chez les rats intoxiqués. Nos résultats concordent avec les travaux réalisés par

Kaur et al., 1999 ; Kuladip et al., 2006. Ceci pourrait expliquer que l’augmentation de

l’activité de l’ALP résulte d’un dysfonctionnement hépatique et osseux (Berezhctskyx et

al., 2007 ; Smith et al., 2008).

Sachant que les phosphatases alcalines sont des enzymes du groupe des hydrolases

associées à la membrane plasmatique des cellules. Elles sont libérées lors de la

construction et de la destruction des membranes de différents tissus pour être ensuite

catabolisées par le foie et éliminées par la bile. Elles ont une large répartition tissulaire et

se retrouvent dans le foie, les canaux biliaires l’os, la muqueuse intestinale, les reins le

placenta, la glande mammaire et les leucocytes (Vanhoof et Debroe, 1994 et Martins et

al., 2001).

4. 5. Evaluation du pouvoir pro-oxydant du plomb:

Dans le cadre de ce travail, le stress oxydant a fait l’objet d’une étude

multiparamétrique. Ce choix a été motivé de façon à obtenir une "panoramique" des

conséquences de la présence du plomb dans un tissu via à vis de défense antioxydante.

L’étude de paramètres biologiques impliqués dans le stress oxydant a aussi permis

de montrer que, suite à une exposition chronique à l’acétate de plomb par gavage, ce métal

est capable d’induire des effets délétères sur les acteurs du système de défense cellulaire.

172


En effet, les résultats ont montré que les activités CAT et SOD testiculaires et

hypophysaires sont significativement diminuées à la suite d’une exposition au plomb. Nos

résultats sont en accord avec ceux disponibles dans la littérature traitant les effets du plomb

chez le rat (Abou-Seif et al., 2003, Ferrat et al., 2003 ; Bokora et al., 2008 et 2009). Cette

diminution trouve son origine dans des phénomènes chimiques qui semblent résulter de

l’accumulation de l’élément dans les tissus. Cependant, au regard de la littérature, il semble

probable que les mécanismes suggérés qui sont les dommages oxydatifs, action directe du

plomb, conséquences des interrelations enzymatiques aient effectivement été mis en jeu.

En effet, les protéines (et donc les enzymes du système cellulaire de défense

antioxydant) présentent de nombreux sites réactifs susceptibles d’être endommagés lors

d’un stress oxydant. Les altérations induites par la présence de métaux dans

l’environnement des protéines vont pouvoir apparaître à différentes échelle de la structure

de ces macromolécules et, en premier lieu, au niveau de la chaîne polypeptidique définie

par la séquence des acides aminés qui les compose (Stadtman, 1990 ; Davies, 1987 et

2005). Cette chaîne est généralement décrite comme étant constituée par une structure

répétitive faisant office de « colonne vertébrale » sur laquelle s’articulent des « chaînes

latérales » qui correspondent aux résidus non engagés dans la liaison peptidique des acides

aminés.

Les métaux sont capables d’agir à ces deux niveaux d’organisation de la séquence

en acides aminés via des phénomènes oxydatifs liés à la production d’espèces réactives de

l’oxygène. Concernant la colonne vertébrale des protéines, les phénomènes oxydatifs sont

généralement attribuables aux espèces radicalaires. L’action principale des espèces

radicalaires intervient essentiellement sous la forme de l’extraction de l’atome

d’hydrogène lié au carbone α des acides aminés (atome sur lequel vient s’insérer la chaîne

latérale), formant ainsi une espèce radicalaire (Davies, 2005).

173


Une interaction directe du métal avec les enzymes et/ou leurs cofacteurs est

également possible. En effet, il a été montré, notamment pour le plomb ou le mercure, que

les enzymes peuvent voir leur activité enzymatique inhibée de manière irréversible par

liaison du métal au niveau de certains groupements fonctionnels tels que les groupements

sulfhydriles (Ercal et al., 2001). L’hypothèse d’une interaction directe du plomb et du site

actif d’une enzyme est donc peut probable dans notre cas.

Il est également proposé que les métaux lourds puissent complexer avec certains

cofacteurs enzymatiques tels que le sélénium (cofacteur de la GPx), le fer (présent au sein

du domaine hémique de la catalase), le cuivre, le zinc ou le manganèse (cofacteurs de la

SOD). La formation de tels complexes conduirait alors à une inhibition de l’activité des

enzymes concernées (Ercal et al., 2001).

Tout comme pour l’hypothèse de dommages oxydatifs occasionnés sur les

enzymes, l’hypothèse d’une perturbation de la relation entre les enzymes et leur (s)

cofacteur (s) respectif (s) peut être avancée dans le cas de notre étude. Nous ne disposons

néanmoins d’aucun élément de réponse permettant d’affirmer ou de confirmer cette

hypothèse. Cette chute de l’activité CAT pourrait alors être à l’origine d’un ralentissement

du renouvellement du pool intracellulaire de cette enzyme (Barillet et al., 2006).

Une autre hypothèse permettant d’expliquer la diminution de l’activité de la CAT

du fait de ses liens biochimiques avec l’activité SOD reposerait non plus sur l’absence

d’hydroperoxyde mais sur l’excès d’anions superoxyde. En effet, il a été montré que la

catalase pouvait etre inhibée par la présence de ces ions dans son environnement proche

(Kono et Fridovich, 1982), le domaine hémique de la catalase pouvant voir statut redox

être altéré et ainsi devenir inactif. Cette hypothèse, bien que théoriquement admissible, est

néanmoins l’une des plus fragiles parmi celles formulées jusqu’à maintenant pour

expliquer les inhibitions enzymatiques observées (Buet et al., 2005 ; Brillet et al., 2005).

Plusieurs études ont montré que le plomb accroit la peroxydation lipidique du

cerveau et des testicules qui est une forme de dommage oxydatif. Les résultats ont montré

que l’exposition chronique au plomb a induit une augmentation significative de la

peroxydation lipidique testiculaire et hypophysaire causés par une surproduction des ROS.

174


Ces résultats corroborent avec deux réalisés par (Ohtawa et al., 1983 ; Fraga et

al., 1990 ; Chainy et al., 1993 ; Ferrat et al., 2003). Il a été suggéré que le mécanisme de

l’action oxydante du plomb à travers son interaction à l’intérieur des membranes, produit

des changements subtils dans le réarrangement des lipides qui peuvent augmenter la

disponibilité des acides gras à l’attaque des radicaux libres ou faciliter la propagation de la

peroxydation lipidique.

Cette propriété est de grande importance car le plomb, comme les autres ions

métalliques, s’accumule dans l’encéphale et les gonades au fil des années au cours

desquels nous enregistrons des altérations distinctes que ce soit dans les phénomènes

oxydatifs qu’inflammatoires (Christen, 2001).

Les expériences réalisées dans ce travail ont permis de mettre en évidence quelques

effets produits par le plomb sur les membranes soit comme facteur direct du déséquilibre

soit comme facteur indirect dans la production de radicaux libres. En effet, les expériences

montrent qu’à l’augmentation de la concentration de plomb correspond une augmentation

de la production de MDA utilisée comme marqueur de la peroxydation lipidique.

Toutefois, le plomb à lui seul n’est pas capable de peroxyder les lipides ; il a

seulement un effet indirect à travers la désorganisation de la double couche lipidique qui

permet une agressivité majeure des éléments de transition comme le fer (Barillet et al.,

2007). Une peroxydation lipidique accrue, mise en évidence par de fortes concentrations

testiculaires en malondialdéhydes, peut entrainer des altérations irréversibles de la

membrane plasmatique et conduire à une mort cellulaire prématurée (Rao et al. ; 1989 ;

Huszar et Vigue, 1994 ; Suleiman et al., 1996 ; Zhang et Zheng, 1996).

Les données expérimentales démontrent que non seulement le fer est un catalyseur

des processus oxydatifs mais aussi que le plomb pourrait avoir une importante action

synergique dans la stimulation de la production des radicaux libres, agissant comme

déstabilisateur des membranes biologiques (Gutteridge et al., 1985).

175


En outre, il a été observé aussi bien dans les modèles qui utilisent les liposomes

préparés à partir des phospholipides purs que ceux de l’homogénat de cerveau de souris,

que la présence concomitante du plomb et du fer dans les modèles adoptés révèle une

importante augmentation de la production de radicaux libres exprimée en concentration de

MDA (Berroud, 1997).

Pour lutter contre les dommages oxydatifs, l’organisme met en place des systèmes

de défenses antioxydants enzymatiques et non enzymatiques. Les systèmes non

enzymatiques sont représentés par une série de petites molécules qui sont notamment la

vitamine C (acide ascorbique), la vitamine E (α-tocophérol), la β-carotène, la vitamine A

(rétinol), la N-acétyl cystéine (NAC), le NADH et l’urate.

La vitamine C est capable de piéger les radicaux libres (comme OH) et il est

soluble dans les membranes (Hijova et al., 2005). Il peut donc réduire les phospholipides

oxydés dans la membrane mitochondriale, il est régénéré par le coenzyme cellulaire à la

surface des membranes. Dans l’espace intermembranaire des mitochondries, le cytochrome

C est capable de supprimer O2. Il peut être utilisé par la chaîne respiratoire mais également

être réduit par l’anion superoxyde (Mc Cord et Fridovich, 1970). Il est à nouveau régénéré

lors de son oxydation par le cytochrome c oxydase (complexe IV de la chaîne respiratoire).

Il est intéressant de constater que cet antioxydant est capable de produire de l’énergie en

donnant des électrons au complexe IV, tout en éliminant les molécules d’O2 produites

accidentellement dans la chaîne respiratoire (Mailer, 1990). C’est pourquoi il est qualifié

d’antioxydant idéal (Pereverzev et al., 2003).

L’analyse des résultats du dosage de la vitamine C plasmatique et tissulaire a

montré chez les rats intoxiqués une diminution très significative de la concentration de la

vitamine C comparativement aux rats témoins. Ces résultats confirment l’effet oxydatif du

plomb sur les testicules et l’hypophyse.

176


4. 6. Evaluation de la fertilité des rats :

La méthode routine pour évaluer la fertilité potentielle d’un mâle est la réalisation

d’un spermogramme au cours duquel des paramètres séminaux quantitatifs (concentration

et nombre total en spermatozoïdes) et qualitatif (concentration de spermatozoïdes mobiles,

vivants, de formes anormales) sont analysés. Le plomb est considéré comme un complexe

spermatotoxique (Shih et al., 2000). La diminution du nombre total des spermatozoïdes au

niveau testiculaire et épididymaire que nous avons observé chez les rats intoxiqués est

probablement due à l’effet de l’acétate de plomb sur les différents niveaux de commande

de la spermatogenèse et l’effet du stress oxydatif sur les spermatozoïdes.

L’observation concernant les dommages de la membrane plasmatique semblerait

être confirmée dans notre étude par l’existence de la corrélation entre les concentrations en

malondialdéhydes testiculaire et la mobilité et la vitalité des spermatozoïdes.

Le spermatozoïde, de par sa constitution riche en acide gras comportant de

nombreuses instaurations, est une cellules particulièrement sensible au stress oxydatif,

pouvant entrainer de graves dommages, d’une part au niveau de la membrane

plasmatique, d’autre part au niveau de l’ADN (Aitken et al., 1987 ; Chen et al., 1997).

Cette altération membranaire pourrait expliquer la baissez de la mobilité et l’entrée des

colorants vitaux éosine-nigrosine à l’intérieur de la cellule signalant ainsi la mort du

spermatozoïde.

En plus, la diminution de la densité des spermatozoïdes épididymaires chez les rats

traités est corrélée avec l’arrêt de la spermatogenèse au niveau des testicules (Talbot et

Chacon, 1981 ; Chinoy, 1995). Les modifications mentionnées ci-dessus dans la mobilité

et la densité des spermatozoïdes peuvent être le résultat de l’altération opposée du milieu

intérieur de l’épididyme chez les rats intoxiqués car il est bien connu que la structure

normale de l’épididyme et son microenvironnement est important pour la maturation des

spermatozoïdes et leur maintien dans des conditions viables et motiles.

177


La réduction dans la numération, mobilité, densité et viabilité des spermatozoïdes

conduit à la diminution de la fertilité des rats traités (Talbot et Chacon, 1981 ; Chinoy et

Sequeira, 1992 ; Chinoy, 1995).

Nous suggérons également que l’augmentation du taux des spermatozoïdes

malformés chez les rats traités est peut être liée à l’effet du plomb sur les cellules de

Sertoli ; compte tenu de leur rôle important dans la différenciation des spermatozoïdes et

de la spermatogenèse. Le pourcentage élevé des anomalies observées surtout au niveau de

la tête peut être expliqué par la cytotoxicité du plomb au moment de la spermiogenèse

(transformation de la spermatide en spermatozoïde) durant lequel se forment la tête, la

pièce intermédiaire et le flagelle (Baoceth, 2002).

Les études de Lancranjan et al., 1975 sur 100 hommes exposés au plomb dans une

usine de batteries pendant 8 ans en moyenne montrent chez les hommes ayant la plus forte

plombémie, la principale anomalie observée est l’accroissement du pourcentage des formes

anormales (tétratospermie) chez 86 % des sujets ; une oligospermie et une asthénospermie

sont observées pour 50 %des sujets ce qui est significativement différent du pourcentage

observés chez les témoins. Selon les études faites par Piasecka et al., 1996, les

spermatozoïdes de la queue de l’épididyme ont présenté des modifications ultrastructurales

dans la pièce intermédiaire et la pièce principale, en particulier au niveau des

mitochondries, des fibres denses et de l’axonème. Concernant le mécanisme, l’activité

d’enzymes mitochondriales (isocitrate, malate et succinate déshydrogénase) était réduite ce

qui pourrait entraîner une déficience du métabolisme énergétique et conduire à une

perturbation des fonctions des spermatozoïdes requérant de l’énergie (Piasecka et al.,

1997). En plus, nos résultats ont montré l’exposition au plomb induit une diminution dans

la vitalité et la mobilité des spermatozoïdes. Ces résultats s’accordent avec les études faites

par (Schoff et Lardy, (1987) ; Chinoy et Narayana, 1994 ; Aitken, (1999) ; Jensin et al.,

(2006).

Les croisements entre mâles traités et femelles témoins ont mis en évidence une

baisse moyenne d’implantation par portée et du taux de gestation et le nombre de

naissance.

178


Ces résultats concordent avec ceux réalisés par Gorbel et al., (2002) ; Chakroun,

(2003 ). L’étude réalisée par Lin et al., 1996, sur 4 256 ouvriers de l’industrie du plomb

comparés à celle de 5 148 témoins a montré que le nombre de naissance dans le groupe

des ouvriers exposés était inférieur au groupe de référence. L’existence d’une relation

dose effet entre la plombémie moyenne et la fertilité a été trouvée.

Une exposition paternelle au plomb semble être associée à une petite augmentation

du risque d’avortement dans deux études où les plombémies moyennes étaient voisines de

500 à 600 µg/l (Coste et al., 1991). Nos résultats obtenus du test de fertilité confirment la

stérilité des rats intoxiqués à 500 mg/l et l’hypofertilité des rats intoxiqués à 250 mg/l.

4. 7. Interaction du plomb avec l’axe hypothalamo-hypophysaire :

Le plomb peut agir aussi sur les hormones hypothalamiques et hypophysaires

(Cooke et al., 1994) en perturbant la sécrétion de GnRH qui stimule l’antéhypophyse

pour sécréter LH (Luteinzing Hormone) et la FSH (Folliculo stimulating Hormone) par

modification des sites récepteurs de LH au niveau des cellules de Leydig : le plomb

entre en compétition avec LH au niveau des sites récepteurs de cellules de Leydig, ce

qui provoque une perturbation de la sécrétion de la testostérone (Schardein, 1993).

D’autre part, le traitement par le plomb a modifié aussi la sécrétion de FSH libérée par

les cellules de Sertoli qui sont nécessaires au développement des tubes séminifères

(Mallem et al., 2007).

Par ailleurs, les études réalisées par (Ghosh et al., 1990 ; Jana et al., 2005)

suggèrent que la diminution sérique de la testostérone est due à l’inhibition des enzymes

stéroïdogènes testiculaires telles que delta 5,3 béta hydroxystéroïde déshydrogénase

(∆5,3β-HSD) et 17 béta hydroxystéroïde déshydrogénase (17β-HSD) responsables de la

synthèse de la testostérone.

Toutefois, l’inhibition de ces enzymes stéroïdiennes est due à la diminution de LH

qui est le premier régulateur de ces enzymes (Shaw et al., 1979 ; kerr et Sharpe, 1986).

179


Les études réalisées par Rodamilans et al., 1983 dans une fonderie de plomb

pendant 5 ans ont constaté chez les ouvriers une diminution significative de la

concentration sérique de testostérone. Il apparaît que chez l’homme la concentration de

testostérone est diminuée pour des intoxications prolongées provoquant des plombémies

élevées >600µg/l.

De même, les expériences réalisées pendant 3 mois chez la souris adulte avec une

plombémie de 320µg/l ont montré que les concentrations plasmatiques des hormones

gonadotropes LH et FSH étaient diminuées (Aman, 1982 ; Pinon-Lataillade et al., 1995 ;

Ronis et al., 1996) avec une diminution significative de la testostérone sérique. Ces auteurs

suggèrent également que le plomb pourrait entraîner une atteinte de certaines enzymes de

la stéroïdogènes.

Le fait qu’une réduction de la concentration de testostérone n’entraîne pas une

augmentation de la concentration de LH laisse supposer que le rétrocontrôle négatif de la

testostérone au niveau hypothalamo-hypophysaire est perturbé par le plomb.

Afin de vérifier cette hypothèse Klein et al., 1994 ont déterminé les quantités

d’ARN messagers de GnRH de LH, respectivement dans l’hypothalamus et l’hypophyse de

rats intoxiqués par le plomb de plombémie moyenne de 420, 550 et 1000 µg/l. La quantité

de ces ARN augmente jusqu’à atteindre un facteur 2 à 3 pour la plombémie de 550 µg/l

puis se stabilise ensuite pour LH ou continue d’augmenter pour GnRH. La concentration

de LH hypophysaire est également augmentée dans les mêmes proportions, ce qui a

conduit ces auteurs à émettre l’hypothèse de l’interférence du plomb avec le relargage des

hormones hypophysaires Ces modifications pourraient selon ces auteurs résulter d’une

compétition du plomb avec le cation Zn2+ qui est présents sur les récepteurs à doigt de zinc

des stéroïdes.

Il a cependant été montré que la synthèse des stéroïdes, indispensables à

l’établissement de la spermatogenèse, ainsi que la liaison de la FSH à ses récepteurs sur les

cellules de Sertoli étaient diminuées dans les testicules de rats âgés de 21 jours et

intoxiqués par le plomb depuis le 9ème jour de vie in utero jusqu’à 21 jours post-partum

180


(Wiebe et al., 1982), ce qui pourrait éventuellement perturber l’établissement de la

spermatogenèse et justifier les diminutions de l’ordre de 20% de la production des

spermatozoïdes observées à l’âge adulte chez les animaux exposés in utero ou pendant la

lactation ce qui pourrait refléter un effet du plomb sur l’axe hypothalamo-hypophysaire

(Yu et al., 1996). Lorsque l’intoxication a eu lieu du 5ème jour de vie-utérine jusqu’à l’âge

de 85 jours (plombémie de 2 500 à 3 000 µg/l) les concentrations sériques de testostérone

ont été réduite de 65 % sans modification de celle de LH, ce qui reflète un effet direct du

plomb au niveau testiculaire sur la stéroïdogenèse dans la cellule de Leydig, mais en raison

d’une augmentation de la quantité de LH hypophysaire de 65 % sans modification de son

ARN messager, un effet du plomb au niveau hypophysaire pourrait exister (Ronis et al

1996). Il semble que l’allongement de l’intoxication sur la vie de l’animal a surtout pour

effet de réduire la production de testostérone (Ronis et al., 1996).

En revanche, les études faites par Bombino et Hsueh, 1989 et Sharpe et al., 1992,

ont suggéré que la diminution de la concentration plasmatique des gonadotrophines peut

être due à l’augmentation des glucocorticoïdes secrétés par la glande surrénale chez les rats

intoxiqués. En outre, les auteurs expliquent que le plomb stimule la voie du stress par

activation de l’axe hypophysaire-corticosurénal et l’augmentation de la sécrétion d’ACTH

par l’hypophyse (Bernstan et Nriagu, 2000).

L’augmentation du taux plasmatique de la corticostérone peut supprimer la

sensibilité des cellules à GnRH et donc empêcher la sécrétion des gonadotrophines (Kamel

et Kubajak, 1987). Cette augmentation de la concentration d’ACTH et corticostérone

supprime directement la production et la sécrétion de testostérone par suppression des

récepteurs LH des testicules (Bombino et Hsueh, 1989). Ceci aboutit à la diminution du

taux des spermatozoïdes testiculaires et épididymaires qui sont sous le control de

testostérone.

Afin de confirmer les données expérimentales, nous avons procédé au dosage de

LDH. L’activité de LDH dans le tissu testiculaire est associée avec la maturation des

cellules germinales de la couche épithéliale des tubes séminifères (Srivastava et al., 1990 ;

181


Pant et al., 2004). Le lactate déshydrogénase est une enzyme de transfert d’hydrogène que

nous retrouvons dans le cytoplasme de presque toutes les cellules de l’organisme. Son rôle

est de catalyser, avec le NAD+ comme coenzyme, l’oxydation du L-lactate en pyruvate.

Cette réaction est réversible et son équilibre favorise la réduction du pyruvate en lactate

(Adhikari et al., 2000). LDH est présente en quantité importante dans les testicules des

rats nouveau-nés et son activité diminue avec le développement des testicules.

Les résultats ont montré une baisse très significative de LDH testiculaire chez les

rats intoxiqués comparativement aux rats témoins. Cette diminution de l’activité de lactate

déshydrogénase (LDH) testiculaire reflète une dégénérescence testiculaire qui est

probablement due à la suppression de la sécrétion de la testostérone (Dixon et al., 1979 ;

Kaur et al., 1999; ; Li et al., 2009) ou une détérioration de l’épithélium germinal

(Srivastava et al., 1990 ; Srivastava et Vijayan, 1996; Pant et al., 2004).

La concentration des spermatozoïdes et la détermination de la morphologie sont

unanimes considérés comme les meilleurs indicateurs de fertilité, ainsi que le test de

fertilité. D’après ces résultats, il semble que le plomb représente un réel danger pour la

fertilité. Certains mécanismes physiopathologiques sont d’ores et déjà compris et admis de

tous, comme le passage de la barrière testiculaire, la production d’un stress oxydatif,

responsable d’une altération de la membrane cytoplasmique et d’une fragmentation de

l’ADN des spermatozoïdes.

Il apparaît donc judicieux, au cours l’exploration d’un éventuel stress oxydatif chez

les rats intoxiqués, d’associer à l’évaluation du profil morphologique de stress testiculaire,

analyse très subjective, un dosage spermatique de malondialdéhyde, reflet direct et fiable

des phénomènes de peroxydation pouvant intervenir au niveau de la membrane plasmique

du spermatozoïde des rats traités au plomb.

Des études complémentaires sont néanmoins nécessaires afin d’établir des valeurs

seuils de profil de stress ainsi que de malondialdéhyde spermatique, permettant ainsi

dévaluer avec précision les répercussions possibles d’un stress oxydatif sur la fertilité des

rats. Le rôle exacte du plomb dans l’altération de la qualité du sperme, ses conséquences

182


sur la descendance, anomalies chromosomiques, développement de certains cancer

méritent d’être étayés par d’autres analyses.

183

Conclusions et perspectives

L’ambition première de cette étude était l’évaluation du risque reprotoxique du plomb

chez le rat mâle, la recherche d’un éventuel retentissement sur la fertilité, étudier les

paramètres toxicocinétiques (distribution de l’élément dans l’organisme), toxicologiques

(mécanismes d’action toxique, effet biologique) du plomb et estimer l’influence relative des

caractéristiques chimiques du plomb sur ces paramètres. Les différents travaux entrepris chez

le rat et l’Homme ont permis de montrer que le plomb induisait des effets délétères sur tous

les compartiments de l’organisme aussi bien sur le système hématopoïétique, rénal, nerveux et

plus particulièrement le système reproducteur.

Nous avons étudié cinq aspects possibles de la toxicité du plomb : stress oxydant,

reprotoxicité, neurotoxicité via l’axe hypothalamo-hypophysaire, altérations histologiques et

altérations des paramètres spermiologiques Nous avons ainsi pu constater que l’exposition

chronique des rats à l’acétate de plomb par gavage à la dose de 250 mg/l et 500 mg/l durant

12 semaines a entraîné un effet anorexigène, ce qui est en faveur d’une implication direct de

ce métal sur les différents systèmes de transmissions nerveuses impliqués dans la régulation

de ce comportement.

L’examen toxicocénitique du comportement du plomb chez le rat a ainsi permis de

montrer que cet élément est susceptible d’être bioaccumulé et bioconcentré dans les organes.

Nous avons par ailleurs constaté une hétérogénéité de distribution de l’élément au travers de

l’organisme, le cerveau et les testicules constituant les principaux organes de stockage du

plomb, suggérant ainsi une altération chimique de la barrière hémato-testiculaire et la barrière

hémato-encéphalique par le plomb.

La présence du plomb observée également dans les épididymes, les vésicules

séminales et la prostate suggère en outre que le plomb est capable de franchir les barrières

physiologiques isolant normalement ces tissus de la circulation sanguine générale.

L’accumulation et la distribution du plomb au sein de l’organisme pose alors de problème de

la toxicité de cet élément.


Dans le même contexte, l’exposition chronique au plomb a provoqué des effets délétères sur

la structure histologique des testicules induisant une diminution et absence totale des spermatozoïdes

chez les rats intoxiqués à 250 mg/l et 500mg/l respectivement, des lacunes au sein de la paroi des

tubes séminifères ce qui témoigne d’une dégénérescence des cellules de Sertoli et donc l’atteinte

profonde de la spermatogenèse et de la spermiogenèse. L’analyse histologique a montré également au

niveau des testicules une atrophie partielle du tissu interstitiel chez les rats traités à 250 mg/l et totale

chez les traités à 500 mg/l, ce qui témoigne probablement de la dégénérescence des cellules de Leydig.

Ces résultats confirment que le plomb est un élément spermicide. Les résultats également ont montré

des altérations histopathologiques dans les organes accessoires (épididyme, vésicule séminale et

prostate) et au niveau de l’hypophyse et l’hypothalamus. L’analyse macroscopique a montré une

diminution significative dans le poids relatifs et une atrophie de la taille des différents organes.

Nous avons ainsi pu constater un déséquilibre de la balance oxydative (diminution des

activités SOD et CAT). De plus, une peroxydation lipidique accrue, mise en évidence par de

fortes concentrations en MDA, peut entraîner des altérations irréversibles de la membrane

plasmatique testiculaire et hypophysaire et conduire à une mort cellulaire prématurée.

L’analyse des résultats de la vitamine C plasmatique et tissulaire a montré une diminution

significative de la concentration de cette vitamine. Ces résultats confirment l’effet oxydatif du

plomb sur les gonades et l’hypophyse.

Cette altération membranaire et perturbation de la balance oxydative pourrait

expliquer les répercussions du plomb sur les paramètres spermiologiques classiques

(numération, mobilité, vitalité et morphologie). Les résultats obtenus de ces paramètres ont

confirmé l’azoospermie observée chez les rats exposés à 500 mg/l et l’oligospermie observée

chez les rats traités à 250 mg/l.

De même, les résultats ont montré que le plomb peut aussi agir sur les hormones

hypothalamiques et hypophysaires en perturbant la sécrétion de LH et FSH par modification

des sites récepteurs de LH au niveau des cellules de Leydig ce qui provoque une perturbation

de la sécrétion de la testostérone. Ces résultats ont conduit à émettre l’hypothèse de

l’interférence du plomb avec le relargage des hormones hypophysaires.


Les perturbations hormonales ont aboutit à l’hypofertilité des rats intoxiqués à 250

mg/l et la stérilité des rats intoxiqués à 500 mg/l. En plus, les résultats ont montré une

diminution significative de l’activité de LDH testiculaire ce qui reflète une dégénérescence

testiculaire qui est probablement due à la suppression de la sécrétion de la testostérone ce qui

a conduit à l’infertilité des rats traités. Le croisement entre mâles intoxiqués et femelles

témoins a confirmé ces résultats. Au regard de nos résultats et de leur interprétation, nous

confirmons la reprotoxicité du plomb.

En termes de perspectives, il serait intéressant de mener des approches comparatives

entre mâles et femelles pour comprendre les mécanismes de toxicité du plomb mais également

ceux de tolérance à ce métal. L’étude des approches nouvelles sur lesquelles pourrait

déboucher notre travail serait l’étude des conséquences comportementales sexuelles d’une

exposition au plomb.

Il est intéressant de mettre en place les mécanismes conduisant à la génotoxicité du

plomb notamment l’intégrité du matériel génétique dans les cellules gonadiques. L’utilisation

d’inhibiteurs des phospholipases, des lipoxyénases et de plusieurs antioxydants pourrait

permettre de déterminer la responsabilité relative des ERO et ses dérivés lipidiques dans la

génotoxicité du plomb. En plus, l’emploi de nucléase spécifiques pourrait permettre de

mesurer les cassures sur l’ADN et le taux d’oxydation des bases.

L’unes des approches nouvelles sur lesquelles pourrait déboucher notre travail serait

également l’étude des conséquences comportementales sexuelles d’une exposition au plomb.

Or, l’implication du système cholinergique dans le comportement de l’individu a largement

été démontrée.

Il serait nécessaire de réaliser de nouvelles expérimentations portant sur les

conséquences multigénérationnelles des perturbations individuelles observées suite à

l’exposition au plomb. Seul des menées sur la descendance des individus exposés nous

permettraient de relier nos observations à de réelles conséquences populationnelles.


Il serait également intéressant d’approfondir le côté hormonal qui est sous le contrôle

de l’axe hypothalamo-hypophysaire par le dosage de GnRH (Gonadotropin Releasing

Hormone), neurohormone produite dans l’hypothalamus par des neurones à fonction

endocrine. Ainsi que le dosage de l’activité de certaines enzymes clés responsables de la

biosynthèse de la testostérone telles que delta5, 3beta-hydroxystéroïde déshydrogénase (delta

5, 3beta-HSD), 17 beta- hydroxystéroïde déshydrogénase (17 beta-HSD) et sorbitol

déshydrogénase (SDH).

Enfin, il apparaît important d’apporter des éléments complémentaires permettant

d’affiner l’interprétation des résultats obtenus et d’ouvrir de nouvelles pistes de recherche

dans différents domaines.

Références bibliographiques

BURROWS IG, WHITTON BA. Heavy metals in water, sediments and invertebrates from a metal contaminated river free of organic pollution. Hydro Biology. 1983; 106: 263-273. FRIBERG L, NORDBERG GF, VOUK VB. Handbook on the toxicology of metals - 2

nd

editions, Elsevier Publ, Amsterdam, 1986. LESSLER MA. Lead and lead poisoning from antiquity to modern times. Othio J Sci.1988; 3: 78-84. WANG Q, LUO W, ZHENG W, LIU Y, XU H, ZHENG G, ET AL. Iron supplement prevents lead-induced disruption of the blood-brain barrier during rat development. Toxicol Appl Pharmacol. 2007; 219 (1):33–41. [PubMed] PONTHIEU M., JUILOT F., MORIN G., BENEDETTI M.F. Mobilisation des interactions métaux –oxydes de fer dans des sols contamonés. Première rencontre nationale de la recherche sur les sites et les sols pollués, bilan et perspectives. 2002; Paris 7e

NEWLAND L, W, DAUM KA. Hanbook of environmental chemistry. Anthropogenic compound, 3 - B. Hutzinger O., Sringer-verlag. ROUSSEL C, NEEL C, BRIL H. Minerals controlling arsenic and lead solubility in an abandoned gold mine tailings. The Science of the Total Environment. 2000 ; 263 : 209-219. LANDRANS M, PACLOT C. "Le saturnisme infantile".change santé sociale. 1994; 74 :23-28. LANDRANS M., LE GOASTER C., BOUY P., DEBAISIEUX F., ROUSSEL C. Evaluation de l’exposition des enfants aux polluants émis par l’usine métal blanc à Bourg-Fidèle, St-Maurice, RNSP et DDASS des Ardennes, 1999, 47, , p. et annexes. LANDRANS M, QUENEL P, JOUAN M. Evaluation des risques sanitaires liés à la population émise par une fonderie de métaux non ferreux à Bourg-Fidèl : bilan des données disponibles et propositions, Saint-Maurice, RNST, 1989, 20, p et annexes. PICHARD A. Plomb et ses dérivés. Fiche. INERIS-DRC-01-25590-ETSC-api/SD-N°00df257_version 2.doc, 2002, p. 1-83. PHILIPPON J. F. Evaluation de l’exposition des enfants au plomb d’origine industrielle. Le cas de l’usine Octel de Paimboeuf. 2000. Mémoire de l’Ecole Nationale de la Santé Publique ENSP. Rennes.; pp 5-23. AWAD L, HUEL G, LAZAR P, BOUDENEC C. "Facteurs de variation interindividuelle de la plombémie". Rev Epidem et Santé Publ. 1981, n° 29, pp 113-124. BOUYER J, HEMON D, CORDIER S, DERRIENIC F, STǕCKER I, STENGEL B, CLAVEL J. Epidémiologie. Principes et méthodes quantitatives, Paris, édition INSERM. DeSILVA PE. "How much soil do children ingest: a new approach"? App Occup Environ Hyg. 1994; n°9, pp 40-43.

http://www.pubmedcentral.nih.gov/redirect3.cgi?&&auth=0V5gTUB3a3yCxoDxJe1dcvRp4ISQi26cochp-e5t4&reftype=pubmed&article-id=1940080&issue-id=146779&journal-id=253&FROM=Article%7CCitationRef&TO=Entrez%7CPubMed%7CRecord&rendering-type=normal&&http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17234227


ERNHART CB, LANDA B, SCHELL NB. "Subclinical levels of lead and developmental deficit. A multivariate follow-up reassessment ". Pediatrics. 1981 ; n° 67, pp 911-919. HUEL G. surveillance de la population française vis-à-vis du risque saturnin. INSERM Rappor Final. 1997 ; p 90. PROST R. Suivi de la qualité de l’eau et des végétaux autour du site de Paimboeuf. INRA de Versailles. Unité de science du Sol. 2000; n° 4, p et annexes. MENCH M, RECALDE N, SOLDA P, BUSSIERE S, GUINBERTEAU J, VANGRONSVELD J, BLEEKER P, ASSUNÇAO A. Atténuation de l’exposition aux éléments traces du sol par l’apport d’amendement et phytostabilisation de sites contaminés : efficacité, persistance et effets non intentionnels. Présentation orales et posters de la journée ADEME "première rencontre nationale de la recherche sur les sites et sols pollués, bilan et perspective" 2002. MOREL J, L, SCHWARTC C. Qualité et gestion des sols des jardins familiaux. Acad Agri Fr. 1999; 85, 2, p. 103-104. NRIAGU JO, MOORE PB. Phosphate Minerals. Springer-Verlag. New York 1984. NRIAGU JO. The biogeochemistry of lead in the environment , Part B. - Topics in environmental health, 1 B. Elsevier. Publ. Amsterdam 1978. CRAFT E, ABU-QARE A, FLAHERTY M, GAROFOLO M, RINCAVAGE H. ABOU-DONIA M. Depleted and natural uranium chemistry and toxicological effects. J Toxicol Environ Health Crit Rev. 2004; 7: 297-317. WHO. Depleted Lead: Sources, Exposure and Health Effects - Full Report. (WHO/SDE/PHE/01.1). World Health Organization. 2004 .Department of Protection of the Human Environnment. Geneva. THOMPSON GN, ROBERTSON EF, FITZGERALD S. Lead mobilization during pregnancy. Med J Austr. 1985; 143: 131. AZAR A, SNEE R D, HABIBI K. An epidemiologic approach to community air lead exposure using personal air samplers. Environ Qual. Saf Sup. 1975 ; 2 : 254-290. BOTTA A, POYEN D, SIGOURET M, MATHIAS A. Les différents tests de dépistage d’une imprégnation saturnine applicables en médecine du travail. Arch Mal Prof. 1976; 37: 437-443. ROY BR. Effects of p article sizes and solubilities of lead sulphide dust on mill workers .Am Ind Hyg Assoc J 1977; 38: 327-332. SIMON T JB. Cellular interactions between lead and calcium. Br Med Bull. 1986a; 42: 431-434.


PIECHALAK A, MALECKA A, BARAŁKIEWICZ D, TOMASZEWSKA B. lead uptake, toxicity and accumulation in Phaseolus vulgaris.Biologia Plantarum. 2008; 52 (3): 565-568.

RUBY MV, DAVIS A, KEMPTON J, DREXLER J.W, BERGSTROM PD. Lead bioavailability ; dissolution kinetics under simulated gastric conditions. Environ Sci Technol. 1992; 26 : 1242-1246. POLAK J, O’FLAHERTY EJ, FREEMAN GB, JOHNSON JD, LIAO SC, BERGSTROM P D. Evaluating lead bioavailability data by means of a physiologically based lead kinetic model. Fund Appl Toxicol. 1996; 23: 63-70. KEHOE R A. The metabolism of lead in health and disease. J. Roy. Inst Public Heulth Hyg. 1961; 24: 81-96. GRAZIANO JH, BLUM CB, LOLACONO NJ, SLAVKOVICH V, MAMTON W I ET AL. A human in vivo model for the determination of lead bioavailability using stable isotope dilution. Environ Health Perspect. 1996; 104: 176-179. Hursh JB, Suomela J. Absorption of lead-212 from the gastrointestinal tract of man. Energy Comm.1968, UCRL-18140: 217-233. DEMICHELE S G, DOSSING M, PAULEV PE. Blood and hair lead concentrations during five years ofoccupational exposure: the effectiveness of an occupational hygiene program and problems due to welding operations. Ann Occup Hyg. 1984; 27: 367-372. O’FLAHERTY E.J, INSKIP MJ, YAGMINAS A P, FRANKLIN CA. Plasma and blood lead concentrations, lead absorption, and lead excretion in non human primates. Toxicol Appl Pharmacol. 1996; 138: 121-13. ALEXANDER FW. The uptake of lead by children in differing environments. Environ Health Perspect. 1974; 7: 155-159. ZIEGLER EH, EDWARDS B B, JENSEN RL, MAHAFFEY KR, FOMON SJ. Absorption and retention of lead by infants. Pediatr Res. 1978; 12: 29-34. ITO Y, NIIYA Y, OTANI M, SARAI S, SHIMA S. Effect of food intake on blood lead concentration in workers occupationally exposed to lead. Toxicol Lett. 37: 105-114. MALDONADO-ALDONADO-VEGA M, CERBON-SOLORZANO J, ALBORES-MEDINA A, HERNANDEZLUNA C N, CALDERON-SALINAS JV. Lead intestinal absorption and bone mobilization during lactation. Hum Exper Toxicol. 1996; 15: 872-877.


MOORE MR, MEREDITH PA, WATSON WS, SUMNER DJ, TAYLOR MK, GOLDBERGA. The percutaneous absorption of lead-203 in humans from cosmetic preparations containing lead acetate, as assessed by whole-body counting and other techniques. Food Cosme toxicol. 1980; 18, 4, 399-405. ONG C, NET LEE WR. Distribution of lead-203 in human peripheral blood in vitro. Br J Ind Med. 1980; 37 (1): 78-84. NILSSON U, ATTEWELL R, CHRISTOFFERSSON JO, SCHUTZ A, AHLGREN L, SKERFVING S, MATTSSON S. Kinetics of lead in bone and blood after end of occupational exposure. Pharmacol Toxicol. 1991 ; 68 (6) : 477-484. CEZARD C, HAGUENOER JM. Toxicologie du plomb chez l'homme. Lavoisier TEC DOC. 1992; p 350. BARTON JC. Retention of radiolead by human erythrocytes in vitro. Toxicol Appl Pharmacol. 1989; 99: 314-3. MUSHAK P. New directions in the toxicokinetics of human lead exposure. Neurotoxicology. 1993; 14 (2_3): 29-42. SMITH GR. Lead. Recycling-Metals, minerals information team US Department of the Interior, US Geological Survey. Lead statistics and information, minerals Yearbook, recycling metals 1996. WEDEEN RP. Bone lead, hypertension, and lead nephropathy. Environ Health Perspect. 1988; 78: 57-60. VA Medical Center, East Orange, NJ 07019. WITTMERS LE, AUFDERHEIDE AC, WALLGREN L. Lead in bone: IV. Distribution of lead in the human skeleton. Arch Environ Health. 1988; 43: 381-391. YOSHINAGA J, SUZUKI T. MORITA M. Sex-and age-related variation in elementalconcentrations of contemporary Japanese ribs. Sci Total Environ. 1989; 79 (3): 209-221. KURTTIO P, KOMULAINEN H, LEINO A, SALONEN L, AUVINEN A, SAHA H. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural lead in drinking water. Environ Health Perspect. 2005; 113: 68-72. CHRISTOFFERSSON JO, AHLGREN L, SCHUTZ A, SKERFVING S.AND MATTSSON S. Decrease of skeletal lead levels in man after end of occupational exposure. Arch Environ Health. 1986; 41 (5): 312-318. MILLER AC, MOG, S, MCKINNEY L, LUO L, ALLEN J, XU J, PAGE N. Neoplastic transformation of human osteoblast cells to the tumorigenic phenotype by heavy metaltungsten alloy particles : induction of genotoxic effects. Carcinogenesis. 2001a ; 22 : 115-125.


BARTHELEMY C, PROST G, TOLOT F AND NEULAT G. A propos d'un cas de pancréatite au cours d'une crise de colique de plomb. Arch Mal Prof. 1975 ; 3 : 357-360. TAULAN M. Etude des effets biologiques consécutifs à une accumulation chronique du plomb naturel chez les rongeurs. Doctorat de l’Université de Médecine de Montpellier, Montpellier 2004. AMDUR MO, DOULL J, KLAASSEN CD. Lead. Casarett and Doull'sToxicology.New York, McGrawhill. 5th Ed 1996. PAQUET F, HOUPERT, P, BLANCHARDON E, DELISSEN O, MAUBERT C, DHIEUX B, MOREELS A, FRELON S, VOISIN P, GOURMELON P. Aaccumulation and distribution of lead in rats after chronic exposure by ingestion. Health Phys. 2005, in press. RABINOWITZ MB, EVITON A, BELLINGER D. Relationships between serial lood lead levels and exfoliated tooth dentin lead levels: models of tooth lead kinetics. Cacif Tissue Int. 1993. 53; (5): 338-341. GULSON BL, JAMESON CW, MAHAFFEY KR, MIZON KJ, KORSCH MJ, VIMPANI G. Pregnacy increase mobilization of lead from maternal skeleton. J Lab Clin Med. 1997; (1): 51-62. LESTAEVEL P, HOUPERT P, BUSSY C, DHIEUX B, GOURMELON P, PAQUET F. The brain is a target organ after acute exposure to depleted lead. Toxicology. 2005a; 212: 219-226. BERLIN K, GERHARDSSON L, BORJESSON J, LINDH E, LUNDSTROM NG. Lead intoxication caused by skeletal desease. Scand J Environ Health. 1995; 21: 296-300. Tymen H, Gerasimo P, Hoffschir D. Nontamination and decontamination of rat and human skin with plutonium and lead, studied with a Franz’s chamber. Int J Radiat Biol. 2000; 76: 1417-1424. HAGUENOER JM, FURON D. Toxicologie et hygiène industrielles. Les dérivés minéraux, 2e partie. Paris. 1982, Paris. Technique et documentation, Tome II. ORLOFF K G, MISTRY K, CHARP P, METCALF S, MARINO R, SHELLY T, MELARO E, DONOHOE AM, JONES RL. (Human exposure to lead in groundwater. Environ Res. 2004; 94: 319-326. KEHOE RA. Studies of lead administration and elimination in adult volunteers under natural and experimentally induced conditions over extended periods of time. Food Chem Toxicol. 1987; 25 (6): 421-493. ROBINSON TR. Delta-aminolevulinic acid and lead in urine of lead antiknock orkers. Arch Environ Health. 1974; 28 (3): 133-138.


ASSAYAMA M, OGAWA T, MORIMOTO T. Excretion of heavy metals in sweat. J Aichi Med Uni Assoc. 1975; 3 (4): 230-235. WATT F, LANDSBERG J.P, POWELL JJ, EDE RJ, THOMPSON RPH, CARGNELLO JA. Analysis of copper and lead in hair using the nuclear microscope; results from normal subjects and patients with Wilson's disease and poisoning. Analyst. 1995; 120 (3): 789-791. AWAD EL KARIM MA, HAMED AS, ELHAIMI YA, OSMAN Y, EL KARIM MA. Effects of exposure to lead among lead-acid battery factory workers in Sudan. Arch Environ Health. 1986; 41 (4): 261-265. POLLOCK CA, IBELS LS. Lead intoxication in paint removal workers on the Sydney harbour bridge. Med J Aust. 1986; 145 (11-12): 635-639. SCHNEITZER L, OSBORN HH, BIERMAN A, MEZEY A, KAUL B. Lead poisoning in adults from renovation of an older home. Ann Emerg Med. 1990; 19 (4): 415-420. MALCOLM D. The effects of lead on the kidney. Trans Soc Occup Med. 1970; 2 (2): 50- 53. ABED D, BOLLINELLI R, BROUSSY G, CARLES P, SORBARA R. Encephalopathie saturnine mortelle. A propos d'une observation anatomoclinique. Arch Mal Prof. 1973; 34 (10-11): 599-608. BENNETT WM. Lead nephropathy. Kidney Intern. 1985; 28: 212-220. AL KHAYAT A, MENON NS, ALIDINA MR. Acute lead encephalopathy in early infancy-clinical presentation and outcome. Ann Trop Pediatr. 1997; 17 (1): 39-44. ALVARES AP, KAPELNER S, SASSA S, KAPPAS A. Drug metabolism in normal children, lead-poisoned children, and normal adults. Clin Pharmacol Ther. 1975; 17 (2): 179-183. SAENGER P, MARKOWITZ ME, ROSEN JF. Depressed excretion of 6 betahydroxycortisol in lead-toxic children. J Clin Endocrinol Metab. 1984; 58 (2): 363-367. SILBERGELD EK. Lead in bone ; implications for toxicology during pregnancy and lactation. Environ. Health Perspect. 1991; 91: 63-70. GILIOLI R, GRAZIA-CASSITTO M. Piombo e sistema nervoso i quadri clinici e subclinici con accenno al problema del monitoraggio neurologico in soggetti professionalmente esposti. Med Lav. 1978 ; 69 (1) : 34-44. LAUWERYS RR. Toxicologie industrielle et intoxications professionnelles. 1998. Paris, Masson, 4nd Ed. PASTERNAK G, BECKER CE, LASH A, BOWLER R, ESTRIN WJ, LAW D. Cross sectional neurotoxicology study of lead-exposed cohort. J Toxicol Clin Toxicol. 1989; 27


(1-2): 37-51. HAENNIEN H, MANTERE P, HERNBERG S. Subjective symptoms in low-level exposure to lead. Neurotoxicology. 1979; 4 (1): 333-347. HOGSTEDT C, HANE M, AGRELL A. Neuropsychological test results and symptoms among workers with well-defined long-term exposure to lead. Br J Ind Med. 1983; 50 (28): 99-105. STOLLERY BT, BROADBENT DE, BANKS HA, LEE WR. Short term prospective study of cognitive functioning in lead workers. Br J Ind Med. 1991; 48 (11): 739-749. BETTA A. Applicazione sul campo del test di frequenza critica di fusione in esposti a piombo seguiti in cieco. Med Lav. 1983; 74 (1): 73-74. LINDGREN KN, MASTEN VL, FORD DP, BLEECKER ML. Relation of cumulative exposure to inorganic lead and neuropsychological test performance. Occup Environ Med. 1996; 53 (7): 472-477. PAYTON M, RIGGS KM, SPIRO A, WEISS ST, HU H. Relations of bone and blood lead to cognitive function: the VA Normative Aging Study. Neurotoxicol Teratol. 1998; 20 (1): 19-27. LANSDOWN R, YULE W, URBANOWICZ MA, HUNTER J. The relationship between blood-lead concentrations, intelligence, attainment and behaviour in a school population: the second London study. Int Arch Occup Environ Health. 1986; 57 (3): 225-235. DUDEK B, MERECZ D. Impairment of psychological functions in children environmentally exposed to lead. Int J Occup Med Environ Health. 1997:10 (1): 37-46. FULTON M, RAAB G, THOMSON G. Influence of blood lead on the ability and attainment of children in Edinburgh. Lancet. 1987; 1: 1221-1226. THOMSON GO, RAAB GM, HEPBURN WS, HUNTER R, FULTON M, LAXEN DP. Blood-lead levels and children's behaviour-results from the Edinburgh Lead Study. J Child Psychol Psychiatry. 1989; 30 (4): 515-528. WASSERMAN GA, GRAZIANO JH, FACTOR LITVAK P, POPOVAC D, MORINA N, MUSABEGOVIC A, VRENEZI N, CAPUNI PARACKA S, LEKIC V, PRETENI REDJEPI E. Consequences of lead exposure and iron supplementation on childhood development at age 4 years. Neurotoxicol Teratol. 1994; 16 (3): 233-240.


BAGHURST PA, MCMICHAEL AJ, TONG S, WIGG NR, VIMPANI GV, ROBERTSON E.F. Exposure to environmental lead and visual-motor integration at age 7 years: the Port Pirie Cohort Study. Epidemiology. 1995; 6 (2): 104-109. TONG S, BAGHURST PA, SAWYER MG, BURNS J, MCMICHAEL AJ. Declining blood lead levels and changes in cognitive function during childhood: the Port Pirie Cohort Study. J Am Med Assoc. 1998; 280 (22): 1915-1919. SCIARILLO WG, ALEXANDER G, FARRELL KP. Lead exposure and child behavior. Am J Public Health. 1992; 82 (10): 1356-1360. THACKER SB, HOFFMAN DA, SMITH J, STEINBERG K, ZACK M. Effect of low-level body burdens of lead on the mental development of children: limitations of metaanalysis in a review of longitudinal data. Arch Environ Health. 1992; 47 (5): 336-346. YEH JH, CHANG YC, WANG JD. Combined electroneurographic and electromyographic studies in lead workers. Occup Environ Med. 1995; 52 (6): 415-419. EHLE AL. Lead neuropathy and electrophysiological studies in low level lead Exposure; a critical review. Neurotoxicology. 1986; 7( 3): 203-216. DAVIES DJ, THORNTON I, WATT JM, CULBARD EB, HARVEY PG, DELVES HT SHERLOCK JC, SMART GA, THOMAS J.F, QUINN MJ. Lead intake and blood lead in two-year-old U.K. urban children. Sci Total Environ. 1990; 90: 13-29. ROELS H, LAUWERYS R. Evaluation of dose-effect and dose-reponse relationships for lead exposure in different Belgian population groups (fetus, child, adult men and women). Trace Elem Med. 4: 80-87. ROELS H, LAUWERYS R. Renal function and hyperfiltration capacity in lead smelter workers with high bone lead. Occup Environ Med. 51: 505-512. LAUWERYS R, BUCHET JP, ROELS H, HUBERMONT G. Placental transfer of lead, mercury, cadmium, and carbon monoxide in women. I. Comparison of the frequency distributions of the biological indices in maternal and umbilical cord blood. Environ Res. 1978; 15 (2): 278-289. MEREDITH PA. MOORE MR, CAMPBELL BC, THOMPSON GG, GOLDBERG A. Delta-aminolaevulinic acid metabolism in normal and lead-exposed humans. Toxicology. 1978; 9 (1-2): 1-9. GENNART JP, BERNARD A, LAUWERYS R. Assessment of thyroid, testes, kidney and autonomic nervous system function in lead-exposed workers. Int Arc Occup Environ Health. 64, 1, 49-57.


SOLLIWAY BM, SCHAFFER A, PRATT H, YANNAI S. Effects of exposure to lead on selected biochemical and haematological variables. Pharmacol Toxicol. 1996; 78 (1): 18-22. SCHWARTZ J. Lead, blood pressure, and cardiovascular disease in men and women. Environ. Health Perspect. 1991; 91: 71-75. PAGLIUCA A, MUFTI GJ, BALDWIN D, LESTAS A. N, WALLIS RM, BELLINGHAM AJ. Lead poisoning: clinical, biochemical, and haematological aspects of a recent outbreak. J Clin Pathol. 1990; 43 (4): 277-281. SELEVAN SG, LANDRIGAN PJ, STERN FB, JONES JH. Mortality of lead smelter workers. Am J Epidemio. 1985; 122 (4): 673-683. SIEGEL M, FORSYTH B, SIEGEL L, CULLEN MR. The effect of lead on thyroid function in children. Environ Res. 1989; 49 (2): 190-196. FRISANCHO AR, RYAN AS. Decreased stature associated with moderate blood lead concentrations in Mexican-American children. Am J Clin Nutr. 1991 ; 54 (3) : 516-519. ALBAHARY C, RICHET G, GUILLAUME J, MOREL MAROGER L. Le rein et le saturnisme professionnel. Arch Mal Prof. 1965; 26: 5. VERSCHOOR M, WIBOWO A, HERBER R, VAN HEMMEN J, ZIELHUIS R. Influence of occupational low-level lead exposure on renal parameters. Am J Ind Med. 1987; 12 (4): 341-351. VERBERK MM, WILLEMS TE, VERPLANKE AJ, DE WOLFF FA. Environmental lead and renal effects in children. Arch Environ Health. 1987; 51 (1): 83-87. WU TN, YANG KC, WANG CM, LAI JS, KO KN, CHANG PY, LIOU SH. Lead poisoning caused by contaminated Cordyceps, a Chinese herbal medicine: two case reports. Sci Total Environ. 1996; 182 (1-3): 193-195. LIN S, HWANG SA, MARSHALL EG, STONE R, CHEN J. Fertility rates among lead workers and professional bus drivers: a comparative study. Ann Epidemiol. 1996; 6, (3): 201- 208. ALEXANDER BH, CHECKOWAY H, VAN NETTEN C, MULLER CH, EWERS TG, KAUFMAN JD, MUELLER B, VAUGHAN TL, FAUSTMAN EM. Semen quality of men employed at a lead smelter. Occup Environ Med. 1996; 53 (6): 411-416.


RODAMILANS M, OSABA MJ, TO FIGUERAS J, RIVERA FILLAT F, MARQUES J.M, PEREZ P, CORBELLA J. (1988) Lead toxicity on endocrine testicular function in an occupationally exposed population. Hum Toxicol. 1988; 7 (2): 125-128. KUO HW, WANG CS, LAI JS. Semen quality in workers with long-term lead exposure: a preliminary study in Taiwan. Sci Total Environ. 1997; 204 (3): 289-292. MURPHY MJ, GRAZIANO JH, POPOVAC D, KLINE JK, MEHMETI A, FACTOR LITVAK P, AHMEDI G, SHROUT P, RAJOVIC B, NENEZIC DU. Past pregnancy outcomes among women living in the vicinity of a lead smelter in Kosovo, Yugoslavia. Am J Public Health. 1990; 80 (1): 33-35. SALLMEN M, ANTTILA A, LINDBOHM ML, KYYRONEN P, TASKINEN H, HEMMINKI K. Time to pregnancy among women occupationally exposed to lead. J Occup Environ Med. 1995; 37 (8): 931-934. BELLINGER D, SLOMAN J, LEVITON A, RABINOWITZ M, NEEDLEMAN HL, WATERNAUX C. Low-level lead exposure and children's cognitive function in the preschool years. Pediatrics. 1991; 87 (2): 219-227. FACTOR LITVAK P, GRAZIANO JH, KLINE JK, POPOVAC D, MEHMETI A, AHMEDI G, SHROUT P, MURPHY MJ, GASHI E, HAXHIU R. A prospective study of birthweight and length of gestation in a population surrounding a lead smelter in Kosovo, Yugoslavia. Int J Epidemiol. 1991; 20 (3)/ 722-728. WASSERMAN GA, GRAZIANO JH, FACTOR LITVAK P, POPOVAC D, MORINA N, MUSABEGOVIC A, VRENEZI N, CAPUNI PARACKA S, LEKIC V, PRETENI REDJEPI E. Consequences of lead exposure and iron supplementation on childhood development at age 4 years. Neurotoxicol Teratol. 1994; 16 (3): 233-240. BOUND JP, HARVEY PW, FRANCIS BJ, AWWAD F, GATRELL AC. Involvement of deprivation and environmental lead in neural tube defects: a matched case control study. Arch Dis Child.1997; 76 (2): 107-112. TUPPURAINEN M, WAGAR G, KURPPA K, SAKARI W, WAMBUGU A, FROSETH B, ALHO J, NYKYRI E. Thyroid function as assessed by routine laboratory tests of workers with long-term lead exposure. Scand J Work Environ Health. 1988; 14 (3)/ 175-180. STANEK K, MANTON WI, ANGLE C. Lead consumption of 18- to 36-month-old children as determined from duplicate diet collections: nutrient intakes, blood lead levels, and effects on growth. J Am Diet Assoc. 1998; 98 (2): 155-158. UNDEGER U, BAŸARAN N, CANPINAR H, KANSU E. Immune alterations in lead-exposed workers. Toxicology. 1996; 109 (2-3): 167-172.


PINKERTON LE, BIAGINI RE, WARD EM, HULL RD, DEDDENS JA, BOENIGER MF, SCHNORR TM, MACKENZIE BA, LUSTER MI. Immunologic findings among lead-exposed workers. Am J Ind Med. 1998 ; 33 (4) : 400-408. SQUINAZI F. Marqueurs biologiques du saturnisme infantile. In saturnisme et peinture au plomb. Journées d’études organisées par la DRASS IIe-de France 1991.p.105. WEICHERDING J. Ethique et déontologie : des principes à la pratique dans le domaine de la santé environnementale. Université de Rennes. D.E.S.S. Droit Santé Ethique. 1997, 67 p HUEL G, TUBERT P, FRERY N, MOREAU T, DREYFUS J. "joint effects of gestational age and maternal lead exposure on psychomotor development of the child at six years". Neurotoxicology. 1992; 13: 249-254. STERLING D. ET AL. "Evaluation of four sampling methods for determinng exposure of children to lead-contaminated household dust ". Environnmental Research Section A. 1999; 18: 130-141. HOPPIN J.A, ARO A, HU H, RYAN P B. In vivo bones lead measurement in suburban teenagers. Pediatrics. 1997; l00: 365-370. SEREGIN IV. SHPIGUN LK, IVANOV VB. Distribution and toxic effects of Cadmium and Lead on maize roots. Russian Journal of Plant Physiology. 2004; 51 (4): 525-533. PATRA M, BHOWMICK N, BANDOPADHYAY B, SHARMA A. Comparison of mercury, lead and arsenic with respect to genotoxic effects on plant systems and the development of genetic tolerance. Environmental and Experimental Botany. 52: 199-223. BOURRELIER PH, BERTHELIN J. Contamination des sols par les éléments traces: les risques et leur gestion. Académie des sciences, Technique et documentation. 1998. Rapport n°42, Lavoisier, 440p. ADEME. Traitabilité des sols pollués-Guide méthodologique pour la sélection des techniques et l’évaluation de leurs performances. Version test. 2003, 575. p. ISBN : 2-86817-719-0. HINSINGER P, SCHNEIDER A, DUFEY JE. Le sol : ressource en nutriments et biodisponibilité. In « Sols et Environnement », Dunod (ed), 2005 ; Paris, 285-305. SPOSITO G, LUND LJ, CHANG AC. Trace metal chemistry in arid-zone field soils amended with sewage sludge: I. Fractionation of Ni, Cu, Zn, Cd and Pb in solid phases. Soil Science Society of America Journal. 1982; 46: 260-264.


BELLINGER D, SLOMAN J, LEVITON A, RABINOWITZ M, NEEDLEMAN HL, WATERNAUX C. Low-level lead exposure and children's cognitive function in the preschool years. Pediatrics. 19991 ; 87 (2) : 219-227. Cecchi M. Devenir du plomb dans le système sol-plante. Cas d’un sol contaminé par une usine de recyclage du plomb et de deux plantes potagères (Fève et Tomate). Le titre de docteur de l’institut national polytechnique de Toulouse. 2008. École doctorale : Sciences Ecologiques Vétérinaires Agronomiques et Bioingénieries. p 1-205. SCHRODER JL, BASTA NT, CASTEEL SW, EVANS TJ, PAYTON ME. Validation of the In vitro gastrointestinal (IVG) method to estminate relative bioavailable lead in contaminated soils. J Environ Qual. 2004; 33: 513-521. GOYER RA, CLARKSON TW. In: Klaassen CD, editor. Casarett & Doull’s toxicology: the basic science of poisons, 6th ed. New York: McGraw-Hill, Health Professions Division; 2001. p. 811-68. MIQUEL G. Les effets des métaux lourds sur l’environnement et la santé. Offre parlementaire d’évaluation des choix scientifiques et technologiques. Rapport 261. 2001. Paris: Assemblé National, Sénat, 365p. WRAGG J, KLINCK B. The bioaccessibility of lead from welsh mine waste using a respiratory uptake test. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng.2005; 42 (9): 1223-31. NEAL, JW, FULKERSON R, LAWRIE KS, NANDRA A, HORADAGODA P, BEALE

H, KINGSTON P, LOOBY W, VAN KOUTERIK, D LAM. Development of a more

suitable forage base for the dairy industry. Dairy Res Found Symp. 2005; 10: 65–72.

PARENTEAU Z. Diminution de la fertilité humaine. Facteurs biologiques. La fécondation

au Québec ; éléments de comparaison, pistes et perspectives. 2007. p 1-8.

GUZICK D ET AL. Sperm morphology, motility and concentration in fertile and infertile men. N Engl J Med. 2001; 345: 1388-1393.

Greenlee AR Risk factors for female infertility in an agricultural region. Epidemiology 2003 ; 14(4) : 429-436. Hedrich, HJ. History, strains and models- In: KRINKE,G.J. The laboratory Rat, The handbook of experimental Animal-Academic press- 2000, Chap 1: 3-16. MATSUDA H, TANAKA, A, IKATURA A. Immunology and Hematology- In: KRINKE, G.J. The laboratory Rat, The handbook of experimental Animal-Academic press- 2000, Chap 22: 439-445.


WEISSJ, TAYLOR GR, ZIMMERMANN, F, NEBENDAHL K.- Collection of body fluids- In: KRINKE,G.J.- The laboratory Rat, The handbook of experimental Animal-Academic press- 2000, Chap 25, 485-495. DADOUNE J.P, DÉMOLIN A. Structure et fonction du testicule. In "La reproduction chez les mammifères et l'homme". 1991. pp. 221-250. Ellipses. BOUCHON A. Approche epidemiologique et clinique des tumeurs mammaires chez le rat domestique (rattus norvegicus) : étude bibliographique et expérimentale sur une population de rats en clientèle. Thèse de doctorat d’état. p 17-20.Toulouse. BENNETT R A, MULLEN, HS. Soft tissue surgery. In : QUESENBERRY K. E., CARPENTER J.W.Ferrets, rabbits and rodents – Clinical medicine and surgery. Second edition. St Louis : Saunders, 2004 :316-328. BIHUN C. Basic anatomy, physiology, husbandry, and clinical techniques. In : QUESENBERRY K. E., CARPENTER J.W. Ferrets, rabbits and rodents – Clinical medicine and surgery. Second edition. St Louis : Saunders, 2004 : 286-298. DADOUNE J P, SIFFROI J P, HADJIISKY P, VENDRELY E. Histologie. Collection de la Biologie à la Clinique.2ème édition. Médecine-Science. Flammarion. 2000. P 229-231. Dym M.. The mammalian rete testis--a morphological examination. Anat Rec. 1970; 186: 493-523. SOLER C, YEUNG C H, COOPER, TG. Development of sperm motility patterns in the murine epididymis. Int J Androl. 1994; 17: 271-8. SETCHELL B P., MADDOCKS S., BROOKS D E. Anatomy, vaculature, innervation, and fluids of the male reproductive tract. In : The physiology of reproduction, second édition, knobil E., Neill J D. raven Press Ltd, NY. 1994: 1063-1175. Vernet N. Analyse du rôle de l’acide retinoique et de ses récepteurs au cours de la spermatogenèse. Thèse de doctorat l’Université Louis Pasteur Strasbourg I (IGBMC). 2006. p 5-237.Toulouse. RAYMOND S. Consultations et dominantes pathologiques du rat. Point Vet. 2005; 36 (260): 30-37. HOLSTEIN AF, DAVIDOFF MS. 1997. Organization of the interbular tissueof the human testis. In Motta PM coord. Recent advances in microscopy of cells, tissues and organs. Antonio Delfino Editor. 1997. Rome: 569-577. WAITES G M H, SETCHELL P B. Physiology of mammalian testis. In: Lamming e ed, Marshall’s Physiology of Reproduction. 1990; 2: 1-105.


BELLVE A R, CAVICCHIA JC, MILLETTE CF, O’BRIEN DA, BHATNAGAR Y M, DYM M. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J Cell Biol. 1977 ; 74 : 68-85. JEGOU B. La cellule de Sertoli : actualisation du concept de cellule nourricière. Médecine Sciences.1995 ; 11 : 519-27. CAYROUSE C. Evaluation du risque reprotoxique chimique dans les laboratoires de recherches de l’université Bordeaux 2. Analyse de sa prévention et recherche d’un retentissement sur la fonction de reproduction du personnel exposé. Diplôme d’état de Docteur en Médecine du Travail. 2005. Thèse n° 3040. 16-22. De Rooij DG. Proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells. Reproductions. 2001; 121: 347-54. DYM M. Spermatogonial stem cells of the testis. Proc Natl Acad Sci. 1994, U S A 91: 11287-9. RUSSELL LD, ETTLIN R A, HIKIM APS, CLEGG ED. "Hitological and histopathological evaluation of the testis." Clearwater, FL: Cache River Press. 1993. DYM M, CLERMONT Y. Role of spermatogonia in the repair of the seminiferous epithelium following X-irradiation of the rat testis. Am J Anat. 1970; 128:265–282. Dadoune JP. Processus fondamentaux lies à l’évolution des cellules germinales mâles : nouvelle approche des anomalies de la spermatogenèse. Mt Médecine de Reproduction. 2006 ; 8 (2) : 85-98. Zhao G, Garbers D. Male germ cell specification and differentiation. Developmental Cell. 2002; 2: 537-547. NAGANO R, TABATA S, NAKANISHI Y, OHSAKO S, KUROHMARU M, HAYASHI Y. (2000).Reproloferation and relocation of mouse male germ cells (gonocytes) during presspermatogenesis. Anat Rec. 2000; 258: 210-20. VERGOUWEN R P, HUISKAMP R, BAS R J, ROEPERS-GAJADIEN HL, DAVIDS JA, De ROOIJ. Postnatal development of testicular cell populations in mice. J Reprod Fertil. 1993; 99:479-85. WERNER E A, DELUCA, H F. Metabolism of a physiological amount of all-transretinol n the vitamin A-deficient rat. Arch Biochem Biophys. 2001; 393: 262-70. RUSSELL L D, GRISWOLD, MD. "The Sertoli cell." Cache River Press. 1993


WEBER, JE, RUSSELL LD, WONG V, PETERSON RN. Three-dimensional reconstruction of a rat stage V Sertoli cell: II. Morphometry of Sertoli--Sertoli and ertoli--germ-cell relationships. Am J Anat. 1983; 167: 163-79. SHARPE RM, MCKINNELL C, KIVLIN C, FISHER JS. Proliferation and functional maturation of Sertoli cells, and their relevance to disorders of testis function in adulthood. Reproduction. 2003; 125: 769-784. Thibault C, Levasseur M C. La reproduction chez les mammifères et l’homme. INRA édition. Ellipses. 2001. ISBN 2-7298-04117-xp 257-259. BOUSSOUAR, F, BENAHMED, M. Lactate and energy metabolism in male germ cells.Trends Endocrinol Metab. 2004; 15: 345-50. GERARD N, SYED V, JEGOU B. Lipopolysaccharide, latex beads and residual bodies are potent activators of Sertoli cell interleukin-1 alpha production. Biochem Biophys Res Commun 1992; 185:154-61. TIMMONS, P M, RIGBY PW, POIRIER F. The murine seminiferous epithelial cycle is pre-figured in the Sertoli cells of the embryonic testis. Development. 2002; 129:635- 47. NAGANO R, TABATA S, NAKANISHI Y, OHSAKO S, KUROHMARU M, HAYASHI Y. Reproliferation and relocation of mouse male germ cells (gonocytes) during prespermatogenesis. Anat Rec. 2000; 258: 210-20. CLERMONT Y, PEREY B. Quantitative study of the cell population of the seminiferous tubules in immature rats. Am J Anat. 1975; 100:241-67. Committee, N. R. N. VERGOUWEN, R. P., HUISKAMP, R., BAS, R. J., ROEPERS-GAJADIEN, H. L., DAVIDS, J. A., AND DEROOIJ, D. G. Postnatal development of testicular cell populations mice. J Reprod Ferti.1993; 99:479-85. RODRIGUEZ I, ODY C, ARAKI K, GARCIA I, VASSALLI P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. Embo J. 1997; 16:2262-70. WANG R A, NAKANE P K, KOJI T. Autonomous cell death of mouse male germ cells during fetal and postnatal period. Biol Reprod. 1998; 58:1250-6. ORTH J M, GUNSALUS G L, LAMPERTI A A. Evidence from Sertoli cell-depleted rats indicates that spermatid number in adults depends on numbers of Sertoli cells producedduring perinatal development. Endocrinology. 1988; 122:787-94. LECUREUIL C, KARA E, GUILLOU F, MONNIAUX D, CREPIEUX P. La signalisation FSH a-t-elle un sexe ? Médecine Sciences. 2007; 23: 75-80.


POPESKO P, RAJITOVA V, HORAK J. A colour atlas of anatomy of small laboratory animals. Volume two : rat – mouse – hamster London : Wolfe Publishing Ltd, 1992. 253p. Dacheux F, Dacheux JL. La reproduction chez les mammifères et l’homme. Chapitre 14.Ellipses Edition Marketing. 2001 ; S.A. p 288-314. Harayama H, Liao PC, Gage D et al. Biochemical charactirization of sialoprotein: anti-agglutinin purified from boar epididymal and seminal plasma. Mol Reprod Dev. 2000; 55:96-103. DOHLE G R, SMIT M, WEBER R F. Androgens and male fertility. World J Urol. 2003; 21: 341-5. SINGH J, O'NEILL C, HANDELSMAN D J. (1995). Induction of spermatogenesis by androgens in gonadotropin-deficient (hpg) mice. Endocrinology. 1995; 136:5311-21. JOSEPH D R, HALL S H, FRENCH F. S. Rat androgen-binding protein: evidence for identical subunits and amino acid sequence homology with human sex hormonebinding globulin. Proc Natl Acad Sci. 1987; U S A 84:339-43. DE GENDT, K, SWINNEN J V, SAUNDERS PT, SCHOONJANS L, DEWERCHIN M, DEVOS A, TAN K, ATANASSOVA N, CLAESSENS F, LECUREUIL C, HEYNS W, CARMELIET P, GUILLOU F, SHARPE R M, VERHOEVEN G. A Sertoli cell-selective knockout of the androgen receptor causes spermatogenic arrest in meiosis. Proc Natl Acad Sci. 2004; U S A 101:1327-32. DUFAURE J P, DREVET J R. La régulation de l'expression des gènes dans l'épididyme. Médicine Sciences. 1998; 14:1392-8. FRAIRIA R, FORTUNATI N, FISSORE F, FAZZARI A, ZEPPEGNO P, VARVELLO L, ORSELLO M, BERTA L. The membrane receptor for sex steroid binding protein is not ubiquitous. J Endocrinol Invest. 1992; 5:617-9. PORTO C S, ABREU L C, GUNSALUS G L, BARDIN C W. Binding of sexhormone- binding globulin (SHBG) to testicular membranes and solubilized receptors. Mol Cell Endocrinol. 1992; 89:33-8. PETRUSZ P, JEYARAJ DA, GROSSMAN G. Microarray analysis of androgenregulated gene expression in testis: the use of the androgen-binding protein (ABP) - transgenic mouse as a model. Reprod Biol Endocrinol. 2005; 3:70. FORTUNATI N, FISSORE F, FAZZARI A, BECCHIS M, COMBA A, CATALANO M G, BERTA L, FRAIRIA R. Sex steroid binding protein exerts a negative control on estradiol action in MCF-7 cells (human breast cancer) through cyclic adenosine 3', 5’- monophosphate and protein kinase A. Endocrinology.1996; 137: 686-92.


NAKHLA A M, ROMAS N A, ROSNER W. Estradiol activates the prostate androgen receptor and prostate-specific antigen secretion through the intermediacy of sex hormone-binding globulin. J Biol Chem. 1997; 272: 6838-41. DELLA-MARIA J, GERARD A, FRANCK P, GERARD H. Effects of androgen-binding protein (ABP) on spermatid Tnp1 gene expression in vitro. Mol Cell Endocrinol. 2002; 198: 131-41. GERAR A, NYA A EEGLOFF M, DOMINGO M, DEGRELLE H, GERARD H. Endocytosis of human sex steroid-binding protein in monkey germ cells. Ann N Y Acad Sci.1991; 637:258-76. GERARD H, GERARD A, EN NYA A, FELDEN F, GUEANT J.L. Spermatogenic cell do internalize Sertoli androgen-binding protein: a transmission electron microscopy autoradiographic study in the rat. Endocrinology. 1994; 134: 1515-27. AZAR A, SNEE R, HABIBI, K. Lead and Compounds.Prioritization of Toxic Air Contaminants - Children’s Environmental Health Protection Act. 2001; 92 (1): 1-11. WRIGHT R, WRIGHT O, BACCARELLI A. Metals and Neurotoxicology. J Nutr. 2007; 137: 2809-2813 STOKLOV M, DE GAUDEMARIS R, BONNETON M, FAURE J, MALLION J M. Lead content determination in first teeth of children in Isère department: comparison of two groups: urban and rural. Preliminary study. 1985; 107 : 192-196. AITKEN RJ, SKAKKEBAEK NE, ROMAN SD. Male reproductive health and the environment. Med J Aust. 2006; 185: 414-5. FAURE NK. Exploration du génome et de l’épigénome dans les troubles sévères de la spermatogenèse chez l’homme. Thèse de doctorat. Unité Inserm U309, Institut Albert Bonniot Université Joseph Fourier, Grenoble. 2007 ; I.pp. 11-26. DENOLET E, DE GENDT K, ALLEMEERSCH J, ENGELEN K, MARCHAL K, VAN HUMMELEN P, TAN KA, SHARPE RM, SAUNDERS PT, SWINNEN JV, VERHOEVEN G. The effect of a sertoli cellselective knockout of the androgen receptor on testicular gene expression in prepubertal mice. Mol Endocrinol. 2006 ; 20: 321-34. GLOWINSKI J, IVERSEN LL. Regional studies of catecholamines in the rat brain. I. The

disposition of [3H]norepinephrine, [3H]dopamine and [3H] dopa in various regions of the

brain. J Neurochem. 1966; 13: 655–669.


NZELOF N. Technique microscopique. Ed Flammarion Médecine Science. 1972 ; 1-3: 35-

70.

HOULD RENE. Techniques d’histopathologie et de cytologie. Malune Editeur Paris .Décarie

Editeur Paris. 1984 ; p65-81.

GABE M. Techniques histologiques. Masson et Cie, Editeur. Paris. 1968 ; p 303-323.

MARCEL I, PERRET-GENTIL DVM. Rat Biomethodology workshop. Animal Care

Services. 2003; 3 (2): 1-21.

CHAKROUN H, HFAIEDH N, MAKNI-AYADI F, GURMAZI F,

KAMMOUN A, ELFEKI A. Nickel et fertilité chez le rat. Sexologie. 2000 ;

Vol XII, n°43 : 59-65.

AMIARD J C, AMIARD-TRIQUET C, METAYER C. Distribution de quelques métaux

(Cd, Pb, Cu, Zn) chez les organismes vivants de l’estuaire de la Loire et des zones côtières

adjacentes. Ouest de la France. Bull Soc Nat. 1982; 4 : 153-168.

AMIARD J C, PINNEAU A, BOITEAU H, METAYER C AMIARD-TRIQUET C.

Application de la spectrophotométrie d’absorption atomique Zeeman au dosage de 8 éléments

traces (Hg, Cd, Cr, Mn, Pb, Se) dans la matière biologique solides. Water Res. 1987 ; 21 (6) :

693-697.

SHINSHI OISHI. Lack of spermatotoxic of methyl and ethyl esters of p-

hydroxybenzoic acid in rats. Food and Chemical Toxicology. 2004; 42: 1845-

1849.

MAKOTO MITSUHASHI, KEIICHIROU MORIMURA, HIDEKI WANIBUCHI,

SHUJI HAYASHI, ATSUHIKO KIYOTA ET AL. Di-n butyl Phthalate is toxic to the male


reproductive system an its toxicity is enhanced by Thioacetamide induced liver injury. J

Toxicol Pathol. 2004; 17: 177-185.

JIAN YING YANG, GUO XIN WANG, JIA LI LIU, JING JING FAN, SHENG CUI.

Toxic effects of zearalenone and its derivaties α-zearalenol on male reproductive system in

mice. Reproductive Toxicology. 2007; 6023:1-7.

FOLCH J, LEES M, STANLEY G HS. A simple method for the isolation and purification

of total lipids from animal tissues. J Biol Chem. 1957; 226: 497-509.

AEBI H, PACKER L. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 1984; 105: 121-126.

BEAUCHAMP P C, FRIDOVICH I. Superoxyde dismutase: improved assay and an assay

applicable to PAGE. Analys Biochem. 1971; 44: 276-287.

HIROSHI O, OSISI N, YAGI K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by TBA

reaction. Anal Biochem. 1979; 95: 351-358.

FISHER RA, YATES F. Statistical Tables for Biological. Agricultural and Medical

Research, 6th edn. 1963, London: Oliver and Boyd.

AÏT-AÏSSA S, PALLUEL O, PORCHER JM. Biomarqueurs précoces d'écotoxicité, Rapport final BCRD, Ministère de l’Ecologie et du Développement Durable, INERIS, Paris 2003, p. 51.

BONNEFONT-ROUSSELOT D. Stress oxidant et veillissement. Biochimie. 2007; 157:1-

26.

WILSON A, SALAMATIAN L. Les radicaux libres : Une question d'équilibre, Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines, 2003, p. 37. BOUAÏCHA N. Les radicaux libres, ARET (Association pour la Recherche en Toxicologie) - Actualités, 2003, p. 5-7. BRAUT-BOUCHER F, PLANTIN-CARRENARD E. Agression oxydante et régulation cellulaire, ARET (Association pour la Recherche en Toxicologie) - Actualités, 2003, p. 14-19.


GHARBI N, MOUSSA F. Stress oxydatif et systèmes antioxydants, ARET (Association pour la Recherche en Toxicologie) - Actualités, 2003, p. 8-13. STOHS SJ, BAGCHI D. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions. Free Radical Biology and Medicine. 1995 ; 18 (2): 321-336. COSSU C, DOYOTTE A, JACQUIN MC, ET AL. Mécanismes de formation et effets des espèces réactives de l'oxygène, in Masson, ed., Biomarqueurs en écotoxicologie – Aspects fondamenaux: Paris,1997a, p. 125-148. JENSEN SJK. Oxidative stress and free radicals, Journal of Molecular Structure: Theochem. 2003 ; 666-667: 387-392. TAQUI KHAN MM, MARTELL AE. Kinetics of metal ion and metal chelate catalyzed oxidation of ascorbic acid. IV. Uranyl ion catalyzed oxidation. Journal of the American Chemical Society. 1969 ; 91 (17): 4668-4672. HAMILTON MM, EJNIK JW, CARMICHAEL AJ. Uranium reactions with hydrogen peroxide studied by EPR-spin trapping with DMPO. Journal of the Chemical Society. Perkin Transactions.1997 ; 2 (12): 2491-2494. MILLER AC, STEWART M, BROOKS K ET AL. Depleted uranium-catalyzed oxidative DNA damage: absence of significant alpha particle decay. Journal of Inorganic Biochemistry. 2002a ; 91 (1): 246-252. RIBERA D, LABROT F, TISNERAT G ET AL. Uranium in the environment: occurrence, transfer, and biological effects. Reviews in Environmental Contamintaion and Toxicology. 1996 ; 146: 53-89. LEVINE RL. Oxidative modification of glutamine synthetase. I. Inactivation is due to loss of one histidine residue. Journal of Biological Chemistry. 1983 ; 258 (19): 11823-11827. ROKUTAN K, THOMAS JA, SIES H ET AL. Role of specific protein S-thiolation under oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 1990 ; 9: 104. DAVIES MJ. Singlet oxygen-mediated damage to proteins and its consequences. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2003 ; 305 (3): 761-770. STARK G. Functional consequences of oxidative membrane damage. The Journal of Membrane Biology. 2005 ; 205 (1): 1-16. BRETON J, SICHEL F, PREVOST V. Stress oxydant et génotoxicité, ARET (Association pour la Recherche en Toxicologie) - Actualités, 2003, p. 20-25. CADET J, DOUKI T, GASPARUTTO D, RAVANAT JL. Réactions d’oxydation et cibles biologiques : acides nucléiques. In : Radicaux libres et stress oxydants. Aspects biologiques et pathologiques (DELATTRE J, BEAUDEUX JL, BONNEFONT-ROUSSELOT D, Ed), 2005, chap 7, 169 -243.


Favier A. Le stress oxydant, L'actualité chimique: 2003 ; 108-115. SCHMUCK A, ROUSSEL AM, ARNAUD J, FAVIER A, FRANCO A. Analized dietary intakes, plasma concentrations of zinc, copper, and selenium, and related antioxidant enzyme activities in hispitalized elderly women. J Am Coll Nutr. 1996 ; 15 : 462-468. GARDET-ALBERT M, BONNEFONT-ROUSSELOT D, ABEDINZADEH Z, JORE D. Espèces réactives de l’oxygène. Comment l’oxygène peut-il devenir toxique ? L’actualité Chimique. 2003 ; 11-12 : 91-96. THEROND P, BONNEFONT-ROUSSELOT D. Systèmes antioxydants endogènes. In : Radicaux libres et stress oxydants. Aspects biologiques (DELATTRE J, BEADEUX JL, BONNEFONT-ROUSSELOT D, Eds), 2005, chap. 10, 281-309. DEL RIO D, STEWART AJ, PELLEGRIN N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2005 ; 15 : 316-328. MARNETT LJ. Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis. 2000 ; 21 (3): 361-370. DIZDAROGLU M, JARUGA P, BIRINCIOGLU M ET AL.Free radical-induced damage to DNA: mechanisms and measurement. Free Radical Biology and Medicine. 2002 ; 32 (11): 1102-1115. BRETON J, SICHEL F, PREVOST V.Stress oxydant et génotoxicité, ARET (Association pour la Recherche en Toxicologie) - Actualités, 2003, p. 20-25. STEARNS DM, YAZZIE M, BRADLEY AS ET AL. Uranyl acetate induces hprt mutations and uranium-DNA adducts in Chinese hamster ovary EM9 cells. Mutagenesis. 2005 ; 20 (6): 417-423. CALMET D, FLÜRY-HERARD A, JIMONET C ET AL. Toxicologie radiologique et chimique. 2003, Clefs CEA. BLAKELY WF, FUCIARELLI AF, WEGHER BJ ET AL. Hydrogen peroxide-induced base damage in deoxyribonucleic acid. Radiation Research. 1990 ; 121 (3): 338-343. KAWANISHI S, HIRAKU Y, MURATA M ET AL. The role of metals in site-specific DNA damage with reference to carcinogenesis. Free Radical Biology and Medicine. 2002 ; 32 (9): 822-832. KAWANISHI S, HIRAKU Y ET OIKAWA S. Mechanism of guanine-specific DNA damage by oxidative stress and its role in carcinogenesis and aging. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 2001 ; 488 (1): 65-76. POUGET JP. Effet du rayonnement ionisant sur l'ADN cellulaire : mesure des bases puriques et pyrimidiques modifiées: PhD thesis, Université Paris XI, Paris, 2000, 253 p.


PETROPOULOS I, CONCONI M, WANG X, HOENEL B, BREGEGERE F, MILNER Y, FRIGUET B. Increase of oxidatively modified protein is associated with a decrease of proteasome activity and content in aging epidermal cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2000 ; 55 : B220-B227. HU Q ET ZHU S. Induction of chromosomal aberrations in male mouse germ cells by uranyl fluoride containing enriched uranium. Mutation Research. 1990 ; 244 (3): 209-214. LIVINGSTONE DR. Contaminant-stimulated reactive oxygen species production and oxidative damage in aquatic organisms. Marine Pollution Bulletin. 2001 ; 42 (8): 656-666. BARILLET S. Evaluation des l'impact des polluants sur le génome d'organismes aquatiques: Comparaison de la cytométrie en flux et de l'essai des comètes dans le suivi de l'intégrité de l'ADN d'érythrocytes de poissons, Université de Metz, Metz, 2003, 56 p. FINKEL T. Oxidant sibnals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 2003 ; 15 : 247-54. BEAUDEUX JL, VASSON MP. Sources cellulaires des espèces réactives de l’oxygène. In : DELATTRE JB, BONNEFONT-ROUSSELOT D, Eds. Radicaux libres et stress oxydant. Aspects biologiques et pathologiques. Paris : Lavoisier, 2005 : 45-86. KIRKWOOD TB. Understanding the old science of aging. Cell. 2005 ; 120 : 437-47. DESAINT S, LURIAU JC, AUDE JC ET AL. Mammalian antioxidant defenses are not inducible by H2O2. J Biol Chem. 2004 ; 279 : 31157-63. BAKOURI R. Stress oxydant et vieillissement. Médecine Science. 2006 ; 22 : 266-72. MCGOWN EL, RUSNAK MG, LEWIS CM, TILLOSTON JA. Tissue ascorbic acid

analysis using ferrozine compared with the dinitrophenylhydrazine method. Anal Biochem.

1982; 119: 55-61.

HENRY R J, CHIAMORI N, GOLUB OJ, BERKMAN S. Am J Clin Path. 1960; 34 (381).

LARDY II A, IIANSEN RG, PHILLIPS PH. The metabolism of bovine epididymal

spermatozoa. Arch Biochem. 1945; 6: 41-51.

SMITH FO. Examining male dogs and cats for breeding soundness. Veterinary Medicine. 1989 ;

84 (6), 594-603.

PLATZ C, SEAGER S. Semen collection by electroejaculation in the domestic cat. J Am Vet

Med Assoc.1978 ; 173 (10), 1353-5.


Bujan L. Environnement et spermatogenèse. Contracept Fertile Sex. 1988, 26 (1):39-48.

NOLI C et al. Focus on skin and coat. Special Edition. Waltham Focus 1999, 52p.

MACDOWELL L. R. Magnésium. In Minerals in animal and human nutrition. Academic Press, 1992, 115-136. El Feki A, Ghorbel F, Smaoui M, Makni-Ayadi F, Kammoun A. Effets du plomb

d’origine automobiles sur la croissance générale et l’activité sexuelle du rat. Gynécol Obstet

Fertil. Paris, 28: 51-9.

Xie J. Effects of chelating agents on testicular toxicity in mice caused acute exposure to

nickel. Toxicology, 130 (3): 147-55.

Gautam AK, Agarwal K, Shah BA, Kumar S, Saiyed HN., 2001. Lead induced

spermatoxicity in mouse and MPG treatment. Environ Bio. 22 (4) : 287-91.

Duterte-Boucher D, Leclere JF, Panissaud C, Costentin J., 1988. Acute effects of direct

dopamine agonists in the mouse behavioural despair test. Eur, J Phamacol. 154: 185-190.

Smith DM, Mielke HW, Heneghan JB., 2008. Subchronic lead feeding study in male rats.

Arch Envion Contam Toxicol. [Epub ahead of print].

Auclair A, Drouin C, Cotecchia C et al. 5-HT2a and α1b-adrenergic receptors entirely

mediate dopamine release, locomotor response and behavioral sensitization to opiates and

psychostimulants. Eur J neurosci. 2004, 20 : 3037-84.

SHAILESH KUMAR M. V. ; DESIRAJU T. Regional alterations of brain biogenic amines

and GABA/glutamate levels in rats following chronic lead exposure during neonatal

development. Archives of toxicology ISSN 0340-5761

CODEN ARTODN 1990, vol. 64, no4, pp. 305-314.

Sidhu P, Nehru B. Relationship between lead-indicate biochemical and behavioral changes

with trace element concentration in rat brain. Neurotoxicology. 1993, 14 : 25-236.

Cooper RL, Goldman JM, Rehnberg GL. Pituitary function following treatment with reproductive toxins. Environ health Persp 1986; 70: 177-184.

Coffigny H, Thoreux-Manlay A, Pinon-Lataillade G, Masse R, Soufir JC. Effects of lead


poisoning of rats during pregnancy on the reproductive system and fertility of otheir offspring. Hum Exp Toxicol 1994; 13 (4): 241-6.

Aitken RJ. The amoroso lecture. The human spermatozoon-a cell in crisis? J Reprod Fertil 1999; 115: 1-7.

Biswas NM, Ghosh P. Effects of lead on gonadal activity in albinos rats. Kathmandu University Medical Journal 2004; 2 (1): 43-46.

Chia SE, Ong CN, Lee ST, Tsakok FH. Blood concentrations of lead, cadmium, mercury, zinc, an Meeker JD, Rossano MG, Protas B, Diamond MP, Puscheck E, Daly D, Paneth N, Wirth JJ. Cadmium, lead, and other metals in relation to semen quality: human evidence for Molybdenum as a male reproductive toxicant. Envron Health Persp 2008; 116:1473-1479.d

copper and human semen parameters. Arch Androl 1992; 29: 177-183.

Telisman S, Colak B, Pizent A, Jurasovic J, Cvitkovic P. Reproductive toxicity of low-level lead exposure in men. Environ res 2007; 105: 256-266.

Ali Karadeniza, , , Mustafa Cemekb, and Nejdet Simsek.

The effects of Panax ginseng and Spirulina platensis on hepatotoxicity induced by cadmium

in rat. Ecotoxicology and Environmental Safety

Volume 72, Issue 1, January 2009, Pages 231-235.

Gartner L, Hiatt JL. Atlas en couleur d’histolohie. 1997.Edition Pradel, 2ème edition francaise

Masson-Williams et Wilkins France.p 344-348. Grignon G. Cours d’histologie.Les cours de PCEM.2001.Médecine Science, Flammarionp258-267. Liu H, Niu R, Wang J, He Y, Wang J, China S. Changes caused by fluoride and lead in energy metabolic enzyme activities in reproductive system of male offspring rats. Research fluoride 2008, 41 (3): 184-191. Collins TF, Sprando RL, Black TN, Shackelford ME, Bryant MA, Ruggles DI et al. Multigenerational evaluation of sodium fluoride in rats. Food Chem Toxicol. 2001; 39 (6): 601-13.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WDM-4S9R87Y-2&_user=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=982897150&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=ad76bf2b29b643162e23cc6735f69f0e

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WDM-4S9R87Y-2&_user=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=982897150&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=ad76bf2b29b643162e23cc6735f69f0e#aff1

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http://www.sciencedirect.com/science/journal/01476513

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%236770%232009%23999279998%23700187%23FLA%23&_cdi=6770&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=570c9cfea0468c0e60e6bb340122ccf9


Dadoune JP. Processus fondamentaux liés à l’évolution des cellules germinales males: nouvelle approche des anomalies de la spermatogenèse. Médecine Reproduction. 2006vol 8 n°2:85-98. Holdcraft RW, Braun RE. Hormonal regulation of spermatogenesis. Int J Androl. 2004; 27: 335-42. Kamoratto AM, White LM, Lau YS, Ware GO, Berry WD, Moriarty CM. Effect of exposure to low lead on growth hormone release in rats. Toxicology 1993; 83 (1-3): 101-14. Sokol RZ, Saixi Wang, Yu-Jui Wan, Frank Z Stanczyk, Elisabet Gentzschein, Robert E Chapin. Long-term dose lead exposure alters the gonadotropin-releasing hormone system in the male rat. Environ Health Perspect 2002; 110 (9): 871-874. Allouche L, Hamadouche M, Touabti A. Chronic effects of low lead levels on sperm quality,gonadotropins and testosterone in albinos rats. Exp Toxicol Pathol 2009 [Epub ahead of print]. Vaglenov A, Creus A, Latchev S, Petkova V, Pavlova S, Marcos R. 2001. Occupational exposure to lead and induction of genetic damage. Environ health Perspect; 109: 295-298. Sokol RZ, Madding CE, Swerdloff RS. Lead toxicity and the hypothalamic-pituitary-testicular axis. Biol Reprod 1985; 33 (3): 722-8. Ronis MJ, Badger TM, Roberson PK, Shaikh F. Reproductive toxicity and growth effects in rats exposed to lead at different periods during development. Toxicol Appl Pharmacol 1996; 136: 361-371. Apostoli P, Bellini A, Porru S, Bisati L. The effect of lead on male fertility: a time to pregnancy (TTP) study. Am J Ind Med 2000; 38 (3): 310-5. Batra N, Nehrn B, Bansal MP. Influence of lead and zinc on rat male reproduction at biochemical and hispathological levels. J Appl Toxicol 2001; 21 (6): 507-12. Yan W, Samson B, Jegou J.Toppari, Bcl-w froms complexes with bax and bak, and elevated ratios of Bax/Bcl-w and Bak/Bcl-w correspond to spermatogonial and spermatocyte apoptosis in the testis. Mol Endocrinol. 2000 ; 14 : 682-699. Singh A, Cullen C, dykeman A, Rice D, Foster W. Chronic lead exposure induces ultrastructural alterations in the monkey testis. J Submicrosc Cytol Pathol. 1993 ; 25 : 479-486. Wenda-Rozewicka L, Machlewicz M, Barcew-Wiszniewska B, Piasecka M. The ultrastucture of the testis in rats after long-term treatment with lead acetate.Andrologia. 1996 ; 28 : 97-102. Joulin V. Importance des mécanismes d’apoptose dans la toxicité hépatique de certains polluants. Deuxièmes Colloque Sciences et Environnement, SSNT, Bizerte, CP3 : 3. El-Gohary M, Awara WM, Nassar S, Hawass S. Deltarmethrin-induced testicular apotosis in rats : the protective effect of nitric oxide synthase inhibitor. Toxicology. 1999 ; 132 (1) : 1-8.


Helminen HJ, Ericson JLE, RytÖluoto R, Vanha-Perttula T. Acid prophosphatase of the rat ventral prostate. In : Goland M, ed. Normal and abnormal growth of the prostate. Springfield, Illinois ; Charles C Thomas, 1975 ; 275-316. Mann T, Lutwak-Mann C. Male reproductive function and semen. Berlin : Springer-Verlag, 1981 : 205-214. • Guyton AC, Hall JE. Textbook of Medical Physiology [9th edition]. Philadelphia: W.B. Saunders; 1996. • • Pinon-Lataillade G, Thoreux-Manlay A, Coffigny H, Masse R, Soufir JC. Reproductive toxicity of chronic lead exposure in male and female mice. Hum Exp Toxicol. 1995 Nov;14(11):872–878. [PubMed] • Hovatta, O. and von Smitten, K. (1993) Sperm aspiration from vas deferens and in-vitro fertilization in cases of non-treatable anejaculation. Hum.Reprod., 8, 1689–1691 Valojerdi DH, Rezazadeh M. Ultrastructure of rat seminal vesicle epithelium in the acute phase of spinal cord transection. Neurological Reseach. 2008 ; 30 (5) : 487-492. Alvarez SM, Gómez NN, Scardapane L, Zirulnik F, Martínez D, Giménez MS. Morphological changes and oxidative stress in rat prostate exposed to a non-carcinogenic dose of cadmium. Toxicol Lett. 2004 Nov 28;153(3):365-76. Motrich RD, Ponce AA, Rivero VE. Effect of tamoxifen treatment on the semen quality and fertility on the male rat. Fertil Steril. 2007 ; 88 (2) : 452-61. Multigner L, Ndong JR, Oliva A, Blanchet P. Polluants environnementaux et cancer de la prostate : données épidémiologiques. 2008. Treizièmes Journées Nationales de la FFER (Paris, 17-19). Sokol RZ, Madding CE, Swerdloff RS. Lead toxicity and the hypothalamic-pituitary-testicular axis. Biology of Reproduction, 1985 ; 33 : 722-728. Verstraeten S, Aimo L, Oteiza P. Aluminium and lead : molecular mechanisms of brain toxicity. Archives of Toxicology. 2008 ; 82 (11) : 789-802. Leret L, Jose Antonio San Millán and M. Teresa Antonio. Perinatal exposure to lead and cadmium affects anxiety-like behaviour. Toxicology Volume 186, Issues 1-2, 15 April 2003, Pages 125-130 Carpenter, C. E. and Morrison, S. J., 2001. In-Situ Method to Remove Iron and Other Metals From Solution in Groundwater Down Gradient From Permeable Reactive Barriers, U.S. Patent 6,254,786. Pezerat H. Additif au mémoire d’avril 2006 sur le projet d’une nouvelle rédaction du tableau 1. La Revue de Médecine Interne. 2006 ; 5 : 1-4.

http://www.pubmedcentral.nih.gov/redirect3.cgi?&&auth=04MmdvKKJjKNbZBWpJDRUxA_0y-9aOC0PldpPHQkh&reftype=pubmed&article-id=1757597&issue-id=140535&journal-id=172&FROM=Article%7CCitationRef&TO=Entrez%7CPubMed%7CRecord&rendering-type=normal&&http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8588947

http://ctd.mdibl.org/query.go;jsessionid=F7E63599BC9B5351BB680BC66F522B3F?type=reference&action=search&partyNmQueryType=equals&partyNm=Alvarez+SM

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http://ctd.mdibl.org/query.go;jsessionid=F7E63599BC9B5351BB680BC66F522B3F?type=reference&action=search&partyNmQueryType=equals&partyNm=Mart%c3%adnez+D

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http://www.sciencedirect.com/science/journal/0300483X

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%235175%232003%23998139998%23391333%23FLA%23&_cdi=5175&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=1d1e3c83c5a56242dc91e58c5f0d48fb


Abd-El-Reheem AMA. 2008. Effect of honeybee feeding on some physiological parameters of female rats exposed to cadmium chloride. Al-Azhar Bull Sci (Aisc) March: 29-42. [30] Kopp SJ, Barron JT, Tow JP. 1988. Cardiovascular action of lead and relationship to hypertension: a review. Environ Health Perspect; 78: 91-99. Hami J, Dashti Gh R, Nema-bkhsh M, Afshar M, Ghaffari HR. 2006. The relationship between high dose lead exposure and serum lipids and lipoprotein levels. Shiraz E Medical Journal; 7 (2): 1-7. [32] Moussa SA, Bashandy SA. 2008. Biophysical and biuochemical changes in the blood of rats exposed to lead toxicity. Romanian J Biophys, 18 (2): 123-133. Hrdina, P. D., Peters, D. A., and Singhal, R. L. (1976). Effects of chronic exposure to cadmium, lead and mercury of brain biogenic amines in the rat. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 15, 483–493.[Web of Science][Medline] Normandin L., Panisset M. et Zayed J. (2002). Manganese neurotoxicity: behavioral, pathological, and biochemical effects following various routes of exposure. Rev Environ Health. 17, 189-217. Gwiazda R.H., Squibb K., McDiarmid M. et al., 2004, Detection of depleted uranium in urine of veterans from the 1991 Gulf War, Health Physics, 86 (1): 12-18. Lin, J. L., Lin-Tan, D. T., Hsu, K. H., and Yu, C. C. (2003). Environmental lead exposure and progression of chronic renal diseases in patients without diabetes. N Engl J Med 348, 277- 286. Subhash, M. N., and Padmashree, T. S. (1991). Effect of manganese on biogenic amine metabolism in regions of the rat brain. Food Chem Toxicol 29, 579-582. Tarohda, T., Yamamoto, M., and Amamo, R. (2004). Regional distribution of manganese, iron, copper, and zinc in the rat brain during development. Anal Bioanal Chem 380, 240-246. Moller-Madsen, B. (1994). Localization of mercury in CNS of the rat. An autometallographic study. Pharmacol Toxicol 75 Suppl 1, 1-41. Roth, J. A., and Garrick, M. D. (2003). Iron interactions and other biological reactions mediating the physiological and toxic actions of manganese. Biochem Pharmacol 66, 1-13. Aschner, M. (2003). Blood-Brain Barrier Transport of Uranium, Annual rept. 1 Sep 2002-31 Aug 2003, pp. 9. WAKE FOREST UNIV WINSTON-SALEM NC SCHOOL OF MEDICINE. Paquet, F., Houpert, P., Blanchardon, E., Delissen, O., Maubert, C., Dhieux, B., Moreels, A., Frelon, S., Voisin, P., and Gourmelon, P. (2005). Accumulation and distribution of uranium in rats after chronic exposure by ingestion. Health Phys, in press. Rios, C., Galvan-Arzate, S., and Tapia, R. (1989). Brain regional thallium distribution in rats acutely intoxicated with Tl2SO4. Arch Toxicol 63, 34-37. Sadykov R, Digel, I, Temiz ArtmanA, prost D, linder P et al. Oral lead absorption induces dysbacteriosis in rats. J Occup Health. 2009 ; 51 : 64-73. Cooley HM, Evans RE, Klaverkamp JF. Toxicology of diatery uranium in lacke witefish (coregonus clupea fomis). Aquatic Toxicology. 2000 ; 48 (4) : 495-515. Stouff P., 2002, Cours de physiologie digestive, in http://pst.chezalice. fr/svtiufm/mange.htm#cours, ed.

http://toxsci.oxfordjournals.org/cgi/external_ref?access_num=A1976CM36000007&link_type=ISI

http://toxsci.oxfordjournals.org/cgi/external_ref?access_num=996361&link_type=MED


Flüry-HérardA, Ménétrier F. Les effets de l’irradiation sur les fonctions de reproduction radionucléides et gonades : l’exemple du plutonium, clés CEA, 2003 ; p 56-57. Wang L, Xun P, Zhao Y, Wang X, Qian L, Chen F. effects of lead exposure on sperm concentrations and testes weight in male rats: a meta-regression analysis. Toxicol Environ Healh A 2008; 71 (7): 454-63. Johansson L, Pellicciari CE. Lead-induced changes in the stabilization of the mouse sperm chromatin. Toxicology 1988; 51: 11-24. Haitao Liu, Ruiyan Niu, Jinming Wang, Ying He, Jundong Wang, Shanxi China. Changes caused by fluoride and lead in energy metabolic enzyme activities in the reproductive system of male offspring rats. Research report Fluoride 2008; 41 (3): 184-191. Imran Ahmad, Muhammad Sabir, Khalid Fahim Yasin. Study of the effects of lead poisoning on the testes in albinos rats. Pakistan j Med Res 2003; 42 (3): 1-9. Copin, J. C., and Gasche, Y. (2003). [Morphology and physiology of the blood-brain barrier]. Ann Fr Anesth Reanim 22, 202-214. Leggett RW, Pellmar TC. The biokenetics of uranium migrating in human. Health Physics. 2003 ; 64 (2-3) : 205-225. Lemercier V, Millot X, Ansaborlo E et al. Study of uranium transfer across th blood brain barrier. Radiation Protection Dosimetry. 2003 ; 105 (1-4) : 243-245. Bussy C. Effets chimiques et radiologique d’une ingestion chronique d’uranium sur le cerveau du rat. Université (Paris) Denis Diderot, 2005, 238p. Lestaevel P, Houpert P, Bussy C et al. The brain is a target organ after acute exposure to depleted uranium. Toxicology. 2005 ; 212 : 219-226. Paquet F, Houpert P, Blanc Chardon E et al. Accumulation and distribution of uranium in rats after chronic exposure by ingestion. Health Physics. 2006 ; 90 (2) : 139-147. Han S, Oizo X, Simpson S, Ameri P, Kemp FW, Bogden JD. 1996. Weight loss alters organ concentration and contents of lead and some essential divalent metals in rat previously exposed to lead. Nutrition; 126: 317-323. Moussa FI, Adham KG, Abdd-Ellatif H, Abou-Samra W, Mahmoud SS, Ahou Shabana MB, Soliman S. 2001. Influence of dietary calcium on subacute lead toxicity in the rat. Pakistan Journal of Biological Science; 4 (1): 77-80. Pagenkopf GK. Gill surface model for trace-metal toxicity to fishes : Role of complexation, pH, and water hardness. Env Sci Techn. 1983, 17 (6) : 342-347. Niyogi S, Wood Cm. Effects of chronic waterborne and dietary metal exposure on gill metal-binding : Implications for the biotic ligand model. Human and Ecological Risk Assessment. 2003 ; 9 (4) : 813-846. BenNacr L, Pascaud M. vitamine D et différenciation cellulaire de l’intestin chez le rat. Travaux Universitaires. Thèse nouveau doctorat. 1991 Paris, N° 91. p 06-10.


Whitehead MW, Farrar G, Christie GL, Blair JA, Thompson RP, Powell JJ. 1997. Mechanisms of aluminium absorption in rats. Am J Clin Nutr; 5: 1446-52. Sadykov R, Digel I, Temiz Artman A, Porst D, Linder P, Kayser P, Artmann G, Savitskaya I, zhubanova A. Oral lead exposure induces dysbacteriosis in rats. J Occup Health; 51: 64-73. Gavazzo P, Zanardi I, Baranowska-Bosiacka I, Marchetti C. 2008. Moleccular determinants of Pb (2+) interaction with NMDA receptor channels. Neurochem Int; 1-2: 329-37. Todorovic T, Vujanovic D, Dozic I, Petkovic-Curcin A. 2008. Calcium and magnesium content in hard tissues of rats under condition of subchronic lead intoxication. Magnes Res; 21 (1): 43-50. Herman DS, Geraldine TV. 2009. Influence of minerals on lead-induced alterations in liver function in rats exposed to long-term lead exposure. J Hazard Mater; 166 (2-3): 1410-4. Chichovska M, Anguelov A. 2006. Study of the influence of L-lysine and zinc administration during exposure to lead and ethanol in rats. Viterinarski Arjuv; 76: 65-73. Bischoff-Ferrari HA, Giovannucci E, Willett WC, Dietrich T, Dawson-Hughes B. Estimation of optimal serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D for multiple health outcomes. Arch Intern Med. 2006 ; 84 : 18-28. Bischoff-Ferrari HA, Willett WC, Wong JB et al. Prevention of nonvertebral fractures with oral vitamin D and dose dependencey, a meta-analysis of ran domized controlled trials. Arch Intern Med. 2001 ; 169 ; 551-561. Lappe J. Vitamin D and calcium suplementation reduces cancer risk : results of a randomized trial. Am J Clin nutr. 2007 ; 85 (6) : 158-91. Royer I. Le magnésium. Apports réels et recommandés. Objectif nutrition N° 51. 2009. 1-4. Dupin H, Abraham J, Giachetti I. Apports nutritionnels conseillés. Tech Doc. Lavoisier (Paris) 1992 : 37-38. McLean RM. Magnesium and its therapeutic uses. Areview Am J Med. 1994 ; 96 : 63-76. Schaafsma G. Bioavailability of calcium and magnesium. Eur J Clin Nutr. 1997 ; 51 (1) : 13S-16S. Dobbins A, Johnson DR, Nathan P. Effect of exposure to lead on maturation of intestinal iron absorption of rats. J Toxicol Environ Health, 4(4): 541-50, 1978. Flanagan, P. R., Haist, J. & Valberg, L. S. (1980). Comparative effects gf iron deficiency induced by bleeding and a low iron diet on the intestinal absorptive interactions of iron, cobalt, manganese, zinc, lead and cadmium. Journal of Nutrition 110, 17541763. Kopp SJ, Barron JT, Tow JP. 1988. Cardiovascular action of lead and relationship to hypertension: a review. Environ Health Perspect; 78: 91-99.


Hami J, Dashti Gh R, Nema-bkhsh M, Afshar M, Ghaffari HR. 2006. The relationship between high dose lead exposure and serum lipids and lipoprotein levels. Shiraz E Medical Journal; 7 (2): 1-7.

American Journal of Scientific Research ISSN 1450-223X Issue 3(2009), pp.38-50 © EuroJournals Publishing, Inc. 2009 http://www.eurojournals.com/ajsr.htm

Reproductive Toxicity of Lead Acetate in Adult Male Rats

Ait Hamadouche N Laboratory of Applicated Biochemistry, Department of Biology

University Es Senia, Oran, Algeria E-mail: [email protected]

Slimani M

Laboratory of Applicated Biochemistry, Department of Biology University Es Senia, Oran, Algeria

Merad-Boudia B

Laboratory of Anatomy and Pathologic Cytology 31000 Oran, Algeria

Zaoui C

Laboratory of Development Biology and Differentiation University Es Senia, Oran, Algeria

Abstract

Environmental exposure to toxic levels of lead occur a number of industries with potential adverse effects on the reproductive capacity of exposed men. Clinical and animal studies indicate that abnormalities of spermatogenesis result from toxic exposure. The mechanism by which lead exerts toxic effects on reproductive system is quite complex. In order to ascertain what reproductive abnormalities occur in experimental animals when exposed to high levels of lead, adult animals were treated with mineral water containing lead acetate at 250mg/l and 500mg/l by oral gavage for 90 days prior to killing. This study was designed to associated blood lead concentration and reproductive discorders. The results revealed a significant decrease in the weight of both the testes, epididymides and pituitary. This reduction in weight of sex glands and pituitary was accompanied by an alteration of the normal histological structure. The results showed a significant (p<0,001) reduce of epididymal and testicular sperm counts including daily sperm production. Moreover, lead obviously affected sperm density and sperm viability and a significant increase of sperm abnormalities in rats treated compared with the controls. We have observed a significant difference for circulating testosterone, LH and FSH following lead poisoning. Therefore, lead exposure resulted in oxidative stress and this was well extrapolated from the increase in lipid peroxidation products (LPP). The results indicate that there was a significant (p<0,001) increase of (LPP) in exposed rats than their corresponding control both in pituitary testis, and epididymides. Results clearly show that lead has a deleterious impact on the reproductive system witch impairs hypothalamic-pituitary axis functions.

Lead toxicity and fertility 39

Keywords: Lead acetate; Fertility; Peroxidation; hypothalamiuc-pituitary axis; Sperm cells.

1. Introduction Accumulated data suggest there is a close relationship between declining reproductive health and environmental pollutants like lead [1]. Human exposure to lead continues to be a serious public health problem [2]. Lead is a heavy soft metal, occurs in nature as an oxide or salts. Lead is a ubiquitous environmental and industrial pollutant that has been detected in every facet of environmental and biological systems. Lead can be found in water pipes, insecticides, lining of equipment where corrosion resistance and pliability are required, in petroleum refining, in construction, bullets of gun, x-ray and atomic radiation protection and is a major industrial byproduct. The manipulation of lead for these uses has caused lead contamination of air, dust, and soil [3]. Chronic lead poisoning is commonly seen in young children from sucking lead paint or lead toys, in workers engaged in printing, paint and petroleum industries [4]. Reproductive dysfunction by lead has distinct morphological and biochemical features such as disorganized epithelia, decrease sperm quality, and alter sperm morphology, and low androgen levels [5-6]. In the animal model, lead has a primary toxic affect on the hypothalamic-pituitary unit, a primary effect on the testes, and acts at all levels of the reproductive axis [7]. The present experimental study has been undertaken on albinos rats to investigate the chronic effects of lead acetate on reproductive system which is responsible for male fertility. 2. Materials and Methods 2.1. Animals

Fifty adult wistar albinos rats (Rattus norvegicus) (9 weeks old, with a mean body weight of 163±5,3g) were obtained together with their standard diets. The rats were maintained on these normal diets under standard temperature (22-250°C), 12/12-hr light/dark cycle, ventilation, and hygienic conditions. 2.2. Experimental Design

Male rats were divided in three groups of 15 rats each. Group I: Rats served as control (C) and received mineral water ad libitum. Groups II: Rats served as experimental and received by gavage lead acetate diluted in mineral water at 250mg/l (1ml mineral water poisoned/day/ rat). Groups III: Rats served as experimental and received by gavage lead acetate diluted in mineral water at 500mg/l (1ml mineral water poisoned/day/ rat).

All the rats received treatment for 90 days. At the end of the period, animals were scarified under mild intraperitoneal chloral anaesthesia. After whole blood was collected from ventral aorta, and was stored at -4°C for the estimation of blood lead. Pituitary gland, testes and epididymides were dissected out. Each organ was then washed with normal saline to separate the surrounding fat and connective tissues. After drying the weight was recorded. 2.3. Whole Blood Lead (BPb) Analyses In hemolysis polystyrene tubes of 5 ml, we put in order: 1.4 ml of distilled water, 0.6 ml HCl, 0.1 ml HClO4, 0.4 ml of whole blood, then the tubes are centrifuged for 5 min at 3 000 rpm. We prepare as the measurement solution in a polyethylene cup: 0.25 ml solution of mercuric chloride, 2 ml supernatant, and 11.75 ml distilled water. The device can calculate the lead from the results of the standard range, taking into account the dilutions made. Measurements on whole blood were made on the following solution: 12.95 ml distilled water, 0.48 ml HCl solution of mercuric chloride 0.25 ml, 0.32 ml whole blood.

40 Ait Hamadouche N, Slimani M, Merad-Boudia B and Zaoui C

Standard Range The stock solution of lead is obtained by diluting 100 ml of standard Titrisol Merck in a polypropylene flask with HCl 2 N. Its concentration is 10 mg / ml of lead. The working solution was prepared extemporaneously by two successive dilutions 1/100th with HCl 2 N. Final concentration is 1µg/ ml. For a standard range, we add successively to the solution of the "white" 20, 30, 50 and 100 μl of the last dilution, by performing the steps. The response is linear in the range of concentrations. Whole blood lead was measured by an atomic absorption spectrophotometer (Perkin Elmer: AAnalyst 100-version 1, 10 5s70), and the concentration was expressed in µg/l. 2.4. Lipid Peroxydation Products These products were estimated by the method of Hiroshi et al [8]. Briefly, the homogenate (10%) of the different isolated tissues (testes, epididymides and pituitary gland) was prepared in 1, 5% potassium chloride solution. One millilitre of the homogenate was added to 2, 5 ml of 20 % trichloracetic acid (TCA). The mixture was centrifuged at 3,500rpm for 10 min at 4 °C. The pellet was then dissolved in 0, 05 M sulphuric acid and 3 ml of 2 M thiobarbituric acid was added to it. The test tubes were incubated in boiling water for 30 min. The contents were cooled and the colour was read at 530nm using a spectrophotometer against the blank. The results were expressed as micromoles of MDA formed/ gm weight of tissue. 2.5. Sperm Analysis and Evaluation The excised left testis and left cauda epididymis were weighed. The testis and epididymis from each rat were placed in 4 ml of normal saline (0, 9% sodium chloride) at 37°C and homogenized from sperm count. Testicular and cauda epididymis sperm counts were expressed as the number of sperm per milligram of testis or cauda epididymis, respectively. The estimate of the daily sperm production per testis per day was calculated based on a factor of 6, 1, witch is the duration of a seminiferous cycle during witch developing spermatozoa are in the spermatid stage [9]. Sperm viability (live/dead ratio) and sperm density were calculated by the method of Prasad et al [10] and expressed as percentage viability and density as x 1010/l, respectively. The percentage of abnormal sperm was scored in 10to 20 speared fields using 1% trypan blue by the method of Talbot and Chacon [11]. 2.6. Haematoxylin and Eosin (HE) Staining After scarified of 15 male rats in each group, the testes, epididymides, and Pituitary gland were quickly removed. Each of tissue was immersed in 10% neutral formalin for 16 hr for tissue fixation. Afterward they were rinsed with distilled water, dehydrated in graded alcohol, cleared in xylem, and embedded in paraffin. Finally, they were cut into 5µm section with a rotary microtome and stained with haematoxylin and eosin. Mean tubular diameter and thickness were determined by measuring 100 round sections of seminiferous tubules with the help ocular micrometer 3. Results 3.1. Changing in Testicular, Epididymides, and Pituitary Gland Weight after Lead

Administration

Testicular, epididymis, and pituitary gland organ weights were decreased remarkably after 90 days of lead administration (Table 1). The weights of testes, epididymis (p<0,001) and pituitary gland (p<0,001) were decreased significantly in group III (Rats intoxicated at 500mg/l).


Table 1: Chang in organ weights after lead treatment (mg/100g body weight)

Testes Epididymis Pituitary Gland Group I (control) 1220±15,9 470±8,9 29,9±12,5 Group II (250mg/l) 890±16,1 345±9,45 22,1±12,9 Group III (500mg/l) 569±18,8 289±9,79 17,9±13,7

Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). *p<0,05, **p<0,001 compared with control rats. 3.2. Whole Blood Lead (BPb)Analyses

Concentrations of BPb in each group of rats were shown in figure 1. All control animals had mean blood lead levels consistently = 0µg/l. All lead-treated animals had blood lead levels greater than those of controls. BPb in group III (500mg/l) was significantly higher than that in controls (p<0,001) or group II (250mg/l).

Figure 1: Concentration of whole blood lead (BPb) in three groups of rats.

0

20

40

60

80

100

120

140

Group I Group II Group IIIRats

BPb µg/l

Group IGroup IIGroup III

**

****

Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). **p<0,05, ***p<0,001 compared with control rats. 3.3. Lipid Peroxydation Products (LPP)

The results on lipid peroxidation products for testes, epididymides, pituitary gland were presented in Figure 2. The LPP showed a very high significant increase (p<0,001) in their levels up to group III when compared to their respective controls. There was an increase in LPP at group II with respect to their controls and this increase was also significant (p<0, 05).

Figure 2: Lipid peroxydation products in different tissues rat on exposure to lead.

0

2

4

6

8

10

12

Testes Epididymides Pituitary glandTissuesL

PP (µ

mol

es o

f MD

A/g

m w

eigh

t of t

issu

e

Group IGroup IIGroup III**

*****

***

**

***

Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). **p<0,05, ***p<0,001 compared with control rats.


3.4. Testosterone, FSH and LH Concentration

The results indicate that serum testosterone; FSH and LH levels were dose-dependent. The Figure 5 showed a very high significant decrease (p<0,001) in their levels up to group III when compared to their respective controls. However, there was a significant decrease in Serum levels of these hormones in group II (p<0, 05).

Figure 5: Serum levels of testosterone, FSH, LH after lead acetate administration.

0

2

4

6

8

10

12

Testosterone FSH LH

(ng/l) Group IGroup IIGroup III

**

**

*****

***

***

Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). *p<0,05, **p<0,01 compared with control rats. 3.5. Effects of Lead Acetate on Sperm Counts, Daily Sperm Production, and Cauda Epididymis

Sperm Counts in Adult Rate

The effects of lead acetate on total testicular sperm and total cauda epididymal sperm were dose-dependent. The Table (2) showed a very high significant decrease (p<0,001) in their levels up to group III (500mg/l) when compared to their respective control. However, there was a significant decrease in sperm and cauda epididymis counts in group II (p<0, 05). Table 2: Effects of lead acetate on sperm counts, daily sperm production, and cauda epididymis sperm counts

in adult rate Treatment Group Total Sperm/Testis (x106) Sperm/Testis/Day (x106) Total Sperm/Cauda Epididymis (x106) Group I (control) 110,00±6,55 18,03±1,17 185,00±5,66 Group II (250mg/l) 70,00±8,45** 11,47±1,75** 90,00±8,49** Group III (500mg/l) 30,00±8,49*** 4,91±1,98*** 56,00±11,42***

Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). **p<0,05, ***p<0,001 compared with control rats. 3.6. Sperm Quality

From Table 3, it can be seen that sperm viability and density were significant decrease in group II (250mg/l) and group III (500mg/l) rats as compared with the control. As well, rats exposed to 250mg/l and 500mg/l of lead acetate expressed a significant increase in percentage of abnormal spermatozoa. Table 3: Sperm quality in male rats treated with lead acetate Sperm Density 106/l Sperm Viability % Sperm Abnormality Ratio % Group I (control) 16,03±0,37 79,82±3,46 15,72±1,61 Group II (250mg/l) 10,65±0,46* 48,65±2,89* 29,89±2,27* Group III (500mg/l) 6,75±0,55** 41,87±5,02** 43,84±3,64**

Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). *p<0,05, **p<0,01 compared with control rats.


3.7. Morphology of Testis Tissue

As shown in Table 4, the diameter of seminiferous tubules was significantly decreased in both the group II and group III during the entire 90days, compared with the control (group I). The thickness of seminiferous tubules was significantly decreased in group II and III compared with the control Histological examination. Table 4: Diameter and thickness of seminiferous tubules of rats (µm)

Diameter Thickness Group I (control) 259,9±1,05 52,04±0,25 Group II (250mg/l) 245,4±1,32* 47,43±0,59* Group III (500mg/l) 199,8±2,01** 40,48±0,62**

Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). *p<0,05, **p<0,01 compared with control rats. 3.8. Histopathological Examination

3.8.1. Testicular Histology The light microscopy examination of the testis of the control rats (group I) had normal structure. The structural components of the testis are the seminiferous tubules and interstitial tissues. The light of the seminiferous tubes is filled with sperm (Fig 3 A). The morphology of testes of the group II was characterized by the presence of interstitial exudates, degeneration, and necrosis of spermatogenic and interstitial (Leydig) cells with focal arcas of vacuolar degenerative changes appeared in the cytoplasm of the spermatogenic epithelium, and abnormal distribution of spermatozoa showed in Lumina of the seminiferous tubules (Fig 3 B).The magnitude of this pathology was dose-dependent. Based on visual estimation, the high dose (500mg/l) appeared to have given rise to marked total absence of spermatogenesis and spermiogenesis relative to the control. Debris of shedded cells occupied most of the lumen of the seminifrrous tubules. Most of the tubules contained spermatogonia, with were large in size and contained darkly stained nuclei (Fig 3 C)


Figure 3: Testicular section from control rat (A) showing seminiferous tubules (T) with normal spermatogenic cells. Note the interstitial spaces (S). Rats exposed to 250mg/l of lead acetate (B). Note exudation (E) into the interstitial space, and degeneration/necrosis (N) of spermatogenetic cells, and vacuole (V). Rats exposed to 500mg/l of lead acetate (C). Absence of interstitial tissue, several in number of maturing spermatogenic cells in seminiferous tubule (T). H&E.

X 100

X 400

X 400

E

N

C

T

X 400

T

AA

S

X 100

S

T

V

X 100B B

C

T

3.8.2. Epidydymal Histology Histological studies showed reduction in the tubular diameter. In control rats (group I), epididymal epithelium enclosed a lumen containing spermatozoa. The interstitial space in between the epididymal tubules was filled with sparse stroma. The pseudostratified epithelium was composed of principal cells with nuclei situated at the base (Fig 4 A).

In group II animals, showed a decrease in the number of sperm, the pseudostratified epithelium was composed of principal cells with nuclei situated at the base (Fig 4 B). After rats treated with high dose (500mg/l) of lead for 90days showed more exaggerated features, increase in interstitial space, lumen of without sperm, and disappearance of the muscle layer (Fig 4 C).


Figure 4: Photomicrograph showing histological changes in epididymis of rats after 90 days of lead acetate treatment. A: control group, (S) –spermatozoids, (L) the two-line polar epithelium, B: group II, C: group III. H&E.X 400

A B

C

SL

3.8.3. Pituitary Gland Histology The fact that the testis is activated by a gonadotropic hormones principle had well been demonstrated in a number of ways. If a particular cell type in the pituitary is responsible for secretion of the gonadotropic hormones it would expected that in animals in which these cells have been over-stimulating by long-continued treatment with lead, some histological changes involving them should be observable.

Reference to Figure 5 will reveal a normal pituitary gland with uniform polygonal cells with round nuclei and clear cytoplasm. However, in group II animals showed some degenerative change in endocrine cells. The cells outlines tended to be indistinct, the cytoplasm stained less uniformly and many cells had distorted, seemingly pycnotic, nuclei. Rats treated with high dose (500mg/l) of lead for 90days showed more exaggerated features, hypertrophy of endocrine cells and glial cells. These results tend to support the concept that the decrease activity of testis after long –continued treatment with lead is due to an abnormality of the endocrine cells.


Figure 5: Effects of treatment with lead acetate upon the histology of the pituitary gland. (A) pituitary of control. (B). Pituitary of rat poisoned at 250mg/l (group I). (C) Pituitary of rat poisoned at 5000mg/l (group II). H&E.

A AX 100 X 400

B BX100 X 400

CC X 400 X 100

4. Discussion Are view of literature suggests that some metal, such as lead, cadmium, arsenic, and mercury can affect male reproductive functions including sperm counts [12]; motility and morphology [13]; spermatogenesis [14].

In the present study, our results clearly demonstrated that exposure of an adult male rats to lead acetate can seriously alter the testes and reproductive tract. Male rats exposed to lead acetate showed a significant decrease in the weight of both the testes, epididymides [15-16] and pituitary [17-18]. This reduction in weight of sex glands and pituitary was accompanied by an alteration of the normal histological structure.

In the present study, male rats treated with lead acetate for 90 days exhibited disordered arrangement of germ cells, a decrease spermatogenic cell layer in the seminiferous tubules. These findings support the results from other reports with indicated that lead [19-20] altered testis histology


resulting structural defects in spermatids and sperm mice, rat, and rabbits. Quantitative analysis showed that in treated rats the diameter of seminiferous tubules significantly decreased, while the tubule well thickness increased markedly over the entire 90 days period compared with the controls, indicating that lead inhibit testis growth [21]. The study also showed that the epididymal changes in treated rats were more sever than those in control rats [22]. The results were coincident with the study conducted by [23] that epididymal damage, including epithelial degeneration and interstitial tissue caused by lead [24-25]. Epididymal change may be an important contributory factor in infertility caused by lead [26]. These findings correspond with observations made by [27] that lead acts a spermicidal agent in case of high exposure. Although there were several histological changes in the pituitary using a lead acetate dose of 250mg/l and 500mg/l.this was characterized by marked reduction in endocrine cells and depletion of nuclear envelope [28]. Furthermore, our experiments acted that toxic effects of lead on reproductive system in male rats were dose-dependent. [29-30] found a correlation between toxic pathological changes in male gonads and concurrent blood lead values. These authors suggested that a complex relationship probably exists wherein the magnitude of exposure becomes progressively more critical as it increases in proportion to duration of exposure. This relationship may be dependent on the kinetics of lead metabolism. Our data indicate that a significant difference in blood lead and lead levels occurs after 90 days of exposure, compared to treated rats and controls. These results suggest that by 90 days of exposure, the soft-tissue lead pool is supersaturated, resulting in mobilization of lead in the circulation. Change of blood lead would influence lead induced disruption of hypothalamic secretion of hormones and spermatogenesis. The testicular sperm counts and daily sperm production are important indicators for investigators to detect adverse effects of various factors on spermatogenesis [31-32]. Our results suggest that lead significantly reduce epididymal and testicular sperm counts including daily sperm production. One possible explanation is that these compounds may be toxic to testicular histological structure. Another explanation is that lead can expect to have a direct influence on sperm quality. In this study, administration of lead acetate resulted in an obvious decline in sperm density and sperm viability and a significant increase of sperm abnormalities, in agreement with other reports [33-34]. Other authors suggest that a principal mechanism of action of lead toxicity at the level of the hypothalamic-pituitary axis or a combined defect involving the gonad and hypothalamic-pituitary sites [35].However, the impairment of spermatogenesis appeared to be as a consequence of the decline of testosterone serum in treated rats since the androgen is clearly essential to the gametogenesis [36]. Leydig cells secrete the male hormone, testosterone, which is a prerequisite for the production of sperm. We have observed a significant difference for circulating LH and FSH following lead poisoning. Furthermore, our result is partially consistent with previous finding showing a significant reduction in plasma for LH and FSH after 90 days.

Various studies suggest an interaction of heavy metal with the hypothalamo-hypophysis axis controlling spermatogenesis [37-7]. These products may also interact directly with Sertoli or Leydig cells, responsible for testicular production of proteins involved in the transport and the production of testosterone, respectively. The reduction level of the serum FSH and LH as a consequence of the impairment of the negative Feedback control on hypothalamic-pituitary axis [38]. Therefore, lead exposure resulted in oxidative stress and this was well extrapolated from the increase in lipid peroxidation products (LPP). An increase in LPP damages various cellular components of tissues. Our current investigations showed significantly increased concentration of LPP in testis, epididymis, and pituitary. The pituitary was of a primary concern due to its role in secretion of gonadotropic hormones. The values in these regions incriminate oxidative stress as a mechanism of lead toxicity. Our findings are in agreement with results obtained by several authors [39-40]. Intensification of lipid peroxidation caused by lead may affect the composition of cytoplasmic, mitochondrial and acrosomal membranes. It is known that on the way from caput to cauda epididymis the sperm membranes become richer in unsaturated fatty acids and therefore they show tendency to instability. In promotes acrosomal reaction but at the same time the membranes become more prone to peroxidative damage [41-42].


In summary, it is conclude from present study that lead at the dose of 250mg/l and 500mg/l introduced by gavage is responsible for irreversible damage and disturbances in metabolism of male reproductive organs. The results clearly show that lead has a deleterious impact on the quality of spermatozoa, resulting in a decrease in spermatozoal number, an increase in morphologically abnormal spermatozoa, including low viability, reduction in testosterone, FSH and LH levels. The observed increase lipid peroxidation products concentration in the tissues may confirm that lead disturbs pro-and antioxidative balance causing oxidative stress witch impairs hypothalamic-pituitary axis functions. Acknowledgement The authors are very thankful to Dr Merad-Boudia B for providing lab facilities and dedicated assistance with histophatology studies. I thank Mr. Slimani for encouragement and moral support. References [1] Bonde JP, Joffe M, Apostoli P, Dale A, Kiss P, Spano M et al. Sperm count and chromatin

structure in men exposed to inorganic lead: lowest adverse effect levels.Occup Environ Med 2002; 59 (4), 234-42.

[2] Pirkle JL, Kaufmann RB, Brody DJ, Hickman T, Gunter EW, Paschal DC. Exposure of the U.S population to lead, 1991-1994. Environ Health Perspect 1998; 106, 745-750.

[3] Kiran Kumar Bokara, Erika Brown, Rashidi McCormick, Prabhakara Rao Yallapragada, Sharada Rajanna, Rajanna Bettaiya. Lead-induced increase in antioxidand enzymes and lipid peroxidation products in developing rat brain. Biometals 2008; 21; 9-16.

[4] SAtoskar RS, Bhandarkar, SD, Alnapure SS. Pharmacology and Pharmacotherapeutics, 6th edn, popular Prakashan, Mumbi, India. 1999; 1012-1013.

[5] Hsu PC, Liu MY, Hsu CC, Chen LY, Leon Guo Y. Lead exposure causes generation of reactive oxygen species and functional impairment in rat sperm. Toxicology 1997; 122 (12): 133-43.

[6] Alexander BH, Checkoway H, Van Netten C, Muller CH, Ewers TG, Kaufman JD. Semen quality of men employed at a lead smelter. Occup Environ Med 1996; 53 (6): 411-6.

[7] Sokol Rebecca Z, Saixi Wang, Yu-Jui Y, frank Z Stanczyk, Elizabet Gentzschein, and Robert E Chapin. Long-term, low-dose lead exposure alters the gonadotropin-releasing hormone system in the male rat. Environmental health Perspectives 2002; 110: 871-874.

[8] Hiroshi O, Ohisi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by TBA reaction. Anal Biochem 1979; 95:351-358.

[9] Cooke PS, Hess RA, Porcelli J, Meisami E. Increased sperm production in adult rats after transient neonatal hypothyroidism. Endocrinology 1991; 129: 244-248.

[10] Prasad MR, Chinoy NJ, Kadam KM. Change in succinate dehydrogenase treated level in rat epididymis under normal and altered physiological conditions. Fertil Steril 1972; 23 (3): 186-90.

[11] Talbot P, Chacon RS. A triple stain technique for evaluating normal acrosome reaction of human sperm. J exp Zool 1981; 21 (2): 201-8.

[12] Chia SE, Ong CN, Lee ST, Tsakok FH. Blood concentrations of lead, cadmium, mercury, zinc, and copper and human semen parameters. Arch Androl 1992; 29: 177-183.

[13] Meeker JD, Rossano MG, Protas B, Diamond MP, Puscheck E, Daly D, Paneth N, Wirth JJ. Cadmium, lead, and other metals in relation to semen quality: human evidence for Molybdenum as a male reproductive toxicant. Envron Health Persp 2008; 116:1473-1479.

[14] Telisman S, Colak B, Pizent A, Jurasovic J, Cvitkovic P. Reproductive toxicity of low-level lead exposure in men. Environ res 2007; 105: 256-266.


[15] Wang L, Xun P, Zhao Y, Wang X, Qian L, Chen F. effects of lead exposure on sperm concentrations and testes weight in male rats: a meta-regression analysis. Toxicol Environ Healh A 2008; 71 (7): 454-63.

[16] Smith DM JR, Mielke HW, Heneghan JB. Subchronic lead feeding study in male rats. Arch Environ Contam Toxicol 2008; 55 (3): 518-28.

[17] Cooper RL, Goldman JM, Rehnberg GL. Pituitary function following treatment with reproductive toxins. Environ health Persp 1986; 70: 177-184.

[18] Coffigny H, Thoreux-Manlay A, Pinon-Lataillade G, Masse R, Soufir JC. Effects of lead poisoning of rats during pregnancy on the reproductive system and fertility of otheir offspring. Hum Exp Toxicol 1994; 13 (4): 241-6.

[19] Johansson L, Pellicciari CE. Lead-induced changes in the stabilization of the mouse sperm chromatin. Toxicology 1988; 51: 11-24.

[20] Haitao Liu, Ruiyan Niu, Jinming Wang, Ying He, Jundong Wang, Shanxi China. Changes caused by fluoride and lead in energy metabolic enzyme activities in the reproductive system of male offspring rats. Research report Fluoride 2008; 41 (3): 184-191.

[21] Imran Ahmad, Muhammad Sabir, Khalid Fahim Yasin. Study of the effects of lead poisoning on the testes in albinos rats. Pakistan j Med Res 2003; 42 (3): 1-9.

[22] Allouche L, Hamadouche M, Touabti A. Chronic effects of low lead levels on sperm quality, gonadotropins and testosterone in albinos rats. Exp Toxicol Pathol 2009 [Epub ahead of print].

[23] Marchlewicz M, Michalska T, Wiszniewska B. Detection of lead-induced oxidative stress in the rat epididymis by chemiluminescence. Chemosphere 2004; 57: 1553-1562.

[24] Sokol RZ, Madding CE, Swerdloff RS. Lead toxicity and the hypothalamic-pituitary-testicular axis. Biol Reprod 1985; 33 (3): 722-8.

[25] Ronis MJ, Badger TM, Roberson PK, Shaikh F. Reproductive toxicity and growth effects in rats exposed to lead at different periods during development. Toxicol Appl Pharmacol 1996; 136: 361-371.

[26] Apostoli P, Bellini A, Porru S, Bisati L. The effect of lead on male fertility: a time to pregnancy (TTP) study. Am J Ind Med 2000; 38 (3): 310-5.

[27] Batra N, Nehrn B, Bansal MP. Influence of lead and zinc on rat male reproduction at biochemical and hispathological levels. J Appl Toxicol 2001; 21 (6): 507-12.

[28] Kempinas WG, Favaretto AL, Melo VR, Carvalho TL, Petenusci SO, Oliveira-Filho RM. Time dependent effects of lead on rat reproductive function. J Appl Toxicol 1994; 14: 427-433.

[29] Sokol RZ. The effect of duration of exposure on the expression of lead toxicity on the male reproductive axis. J Androl 1990; 11 (6): 521526.

[30] Kamoratto AM, White LM, Lau YS, Ware GO, Berry WD, Moriarty CM. Effect of exposure to low lead on growth hormone release in rats. Toxicology 1993; 83 (1-3): 101-14.

[31] Wang XJ, Zhang YM, Cui JS. Study of effects of lead acetate on reproductive function in male mice. Chin J Ind Med 2004; 17 (4): 237-9.

[32] Xu HH, Chen ZP, Shen Y. Meta analysis for effect of lead on male productive function. J Industrial Hygiene and Occupational Diseases 2006; 24 (10): 634-6.

[33] Jensen TK, Bonde JP, Joffe M. The influence of occupational exposure on male reproductive function. Occup Med 2006; 56 (8): 544-53.

[34] Berry WD Jr, Moriarty CM, Lau YS. Lead attenuation of episodic growth hormone secretion in male rats. Int J Toxicol 2002; 21 (2): 93-8.

[35] Thoreux-Manlay A, Vélez de la Calle JF, Olivier MF, Soufir JC, Masse R, Pinon-Lataillade G. Impairment of testicular endocrine function after lead intoxication in the adult rat. Toxicology 1995; 26: 101-109.

[36] Martin J, Ronis J, Thomas M Badger, Sarah J Shema, Paula K Roberson, Fatima Shaikh. Reproductive toxicity and growth effects in rats exposed to lead at different periods during development. Toxicology and Applied Pharmacology 1996; 136: 361-171.


[37] Sokol RZ, Saixi Wang, Yu-Jui Wan, Frank Z Stanczyk, Elisabet Gentzschein, Robert E Chapin. Long-term dose lead exposure alters the gonadotropin-releasing hormone system in the male rat. Environ Health Perspect 2002; 110 (9): 871-874.

[38] Biswas NM, Ghosh P. Effects of lead on gonadal activity in albinos rats. Kathmandu University Medical Journal 2004; 2 (1): 43-46.

[39] Aitken RJ. The amoroso lecture. The human spermatozoon-a cell in crisis? J Reprod Fertil 1999; 115: 1-7.

[40] Batra N, Nehru B, Bansal MP. The effect of zinc supplementation on the effects of lead on the rat testis. Reprod Toxicol 1998; 21: 507-512.

[41] Marchlewicz M, Wiszniewska B, Gonet B, Baranowska-Bosiacka I, Safranow K, etal. Increased lipid peroxidation and ascorbic acid utilization in testis and epididymis of rats chronically exposed to lead. BioMetals 2007; 20: 13-19.

[42] Wang L, Wang H, Hu M, Cao J, Chen D, Liu Z. Oxidative stress and apoptotic changes in primary cultures of rat proximal tubular cells exposed to lead. Arch Toxicol 2009 [Eupb ahead of print].

American Journal of Scientific Research ISSN 1450-223X Issue 4 (2009), pp 5-16 © EuroJournals Publishing, Inc. 2009 http://www.eurojournals.com/ajsr.htm

Biochemical Parameters Alterations Induced by Chronic Oral

Administration of Lead Acetate in Albinos Rat

AIT Hamadouche N Laboratory of Applied Biochemistry, Department of Biology

University ES Senia Oran, Algeria E-mail: [email protected]

Slimani M

Laboratory of Applied Biochemistry, Department of Biology University ES Senia Oran, Algeria

Aous AEK

Laboratory of Applied Biochemistry, Department of Biology University ES Senia Oran, Algeria

Abstract

The present work is devoted to study the lead toxicity in experimental albinos male rats exposed to lead administrating by gavage at the dose of 250mg/l and 500mg/l and hence to evaluated the risk on human workers who were environmentally and occupationally exposed to similar toxicity. A total of fifty adult male rats were equally divided into 3 groups, I, II and III. Group I served as control group. Group II and III received lead acetate at 250mg/l and 500mg/l respectively. A number of parameters were examined in blood and tissues (pituitary gland, testes and epididymides) as indicators of toxicity, including blood phosphatase alkaline (ALP), albumin, cholesterol, calcium, magnesium, ascorbic acid. In addition, ALP, catalase and superoxide dismutase tissues were also measured and ascorbic acid testis. The results indicated that exposure of animals to lead caused a significant increase in blood lead concentration, ALP, Cholesterol a significant decrease in albumin calcium, magnesium and ascorbic acid levels. One the other hand, testicular, epididymal and pituitary gland enzyme such ALP and oxidative enzymes such catalase and superoxyde dismutase were significantly increased caused by oxidative damage. A decrease of ascorbic acid was also noted after lead exposure. The results indicate that oral exposure to lead causes alterations in biochemical parameters and testicular, epididymal and pituitary fuinctions. Keywords: Phosphatase alkaline; Catalase; Superoxide dismutase; ascorbic acid; Lead

toxicity 1. Introduction Recently, there has been substantial interest in the potential adverse effects of exposure to environmental hazardous chemicals on male reproduction. Lead is one of the most widespread contaminants among the myriad of xenobiotics [1]. Lead is a toxic element for human and animal

Biochemical Parameters Alterations Induced by Chronic Oral Administration of Lead Acetate in Albinos Rat 6 organisms [2]. It is considered as one of the most hazards and cumulative environmental pollutants that affect all biological systems through exposure from air, water and food source [3] Evidence of the harmful effects of lead on the public health in general and on male reproduction in different species of rodents in particular have been widely studies. Male occupational exposure to lead compounds results in a general suppression of the hypothalamus-pituitary-testicular axis [4; 5]. Lead exposure induces clinicophalogical changes through toxicity occurred to endocrine, nervous and reproductive systems [6]. However, the mechanism of its activity in the male reproductive system is not fully understood. The present study was designed to determine the effects of lead oral exposure on reproductive system by alteration of biochemical parameters in male albinos rats. 2. Materials and methods 2.1. Animals

Fifty adult wistar albinos rats (Rattus norvegicus) (9 weeks old, with a mean body weight of 163±5,3g) were obtained together with their standard diets. The rats were maintained on these normal diets under standard temperature (22-250°C), 12/12-hr light/dark cycle, ventilation, and hygienic conditions. 2.2. Experimental design

Male rats were divided in three groups of 15 rats each. Group I: Rats served as control (C) and received mineral water ad libitum. Groups II: Rats served as experimental and received by gavage lead acetate diluted in mineral water

at 250mg/l (1ml mineral water poisoned/day/ rat). Groups III: Rats served as experimental and received by gavage lead acetate diluted in mineral water

at 500mg/l (1ml mineral water poisoned/day/ rat). All the rats received treatment for 90 days. At the end of the period, animals were scarified

under mild intraperitoneal chloral anaesthesia. After, whole blood was collected from ventral aorta using heparinized syringe. Plasma samples were separated by centrifugation frozen for determination of the different biochemistry parameters. Pituitary gland, testes and epididymides were dissected out. Each organ was then washed separately with ice cold normal saline to separate the surrounding fat and connective tissues. The tissues were immediately used for the estimation of catalase and superoxyde dismutase. 2.3. Lead concentration in tissues

Lead content was measured in the testis, epididymis and pituitary gland according to Amiard et al method [7]. Tissue samples of testis, epididymis and pituitary gland were dried at 60°C and combusted at 450 °C (24 H). Thereafter, the combusted samples were dissolved in hot solution of M nitric acid. All the treatments were done twice. The samples were transferred into 50 ml volumetric flasks and adjusted with the deionized water to this volume. The appropriately diluted and digested tissue samples were analyzed using Perkin Elmer atomic absorption spectrophotometer AAS AAnalyst 100-version 1, 10 5s70, and the concentration was expressed in µgPb/g. 2.4. Biochemical analysis

Enzymatic activities (alkaline phosphatase) (ALP), blood calcium (Ca), magnesium (Mg), total iron, albumin were determined colorimetrically using commercial chemical kits (Kit Biosystems) and total cholesterol (Kits Boehringer).

7 AIT Hamadouche N, Slimani M and Aous AEK

2.5. Ascorbic acid level in plasma

The vitamin C level was estimated by McGown et al [8] method. Briefly, the plasma is diluted to 1 / 2 (v / v) with a solution of 10 % trichloroacetic acid (TCA) and was centrifuged at 3000 rpm for 15 min. 300 µl of the supernatant was added to 750 µl of ferrozine solution (32 mM). Samples are kept at room temperature for 15 seconds. The absorbance was read at 562 nm. 2.6. Assay of testicular, epididymal and pituitary gland alkaline phosphatase activities

The activity of testicular epididymal and pituitary gland alkaline phosphatase was measured following the standard method of Malymy and Horecker [9]. Organs tissues were homogenized in 0,02mol Tris Hcl buffer, pH 7.5, at a tissues concentration of 10mg/ml. 0.25 ml of a tissue homogenate was added in a centrifuge tube containing 1 ml buffer (1.0 ml p- nitrophenol phosphate (PNPP) in 1 mol Tris buffer, pH 8.0). The mixture was incubated at 37 °C for 30 min in a water bath. Then the reaction was terminated by addition of 0.1 ml 0.1 mol NaOH. The assay was based on the formation of p-nitrophenol (PNP) in the hydrolysis of PNPP. The’ activity was measured spectrophotometrically at 420 nm. The concentration of the sample was obtained from a standard curve and expressed as µg of PNP liberated/mg of tissue/hr. 2.7. Assay of testicular, epididymal and pituitary gland catalase activities

The enzyme activity was determined by the method of Aebi and Packer [10]. Different organs were homogenized separately in 0.05 M phosphate buffer (pH 7) containing 0.1 mM EDTA. The homogenate (10%) was centrifuged at 4,000 rpm for 15 min at 4 °C. The supernatant was decanted and centrifuged at 16,000 rpm for 60 min at 4 °C. The supernatant was used for the enzyme assay. The reaction mixture consisted of 100µl of supernatant and 10 µl of alcoholic ethanol was added to it. This was vortexed well and kept on ice water bath for 10 min. Then, the tubes were brought to room temperature and 10 µl of Triton X-100 was added and vortexed well till the whole tissue extract was completely dissolved. Afterwards, 0.66 M hydrogen peroxide (H2O2) in phosphate buffer was prepared afresh at the time of reaction and 100 µl of this buffer containing H2O2 was added to the above reaction mixture and decrease in the absorbance was read in a spectrophotometer at 240 nm against a blank for 60 sec. Care was taken that the reactions were carried out in dark. The data were expressed as micromoles of H2O2 metabolozed/mg protein/min. 2.8. Assay of testicular, epididymal and pituitary gland superoxide dismutase activities

The enzyme assay was performed by using the method described by Beauchamp and Fridovich [11]. A 10 % homogenate was prepared using a homogenizing buffer (100 mM phosphate buffer, pH 7.5) and then centrifuged at 4,000 rpm for 10 min at 4 °C. The supernatant was decanted and then centrifuged at 16,000 rpm for 60 min at 4 °C and the supernatant obtained during this spin was used for the assay. The reaction mixture contained 1.5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.5), 0.3 ml of 130 mM methionine, 0.3 ml of 750 mM nitroblue tetrazonium (NBT), 0.3 ml of 10 mM EDTA and 0.1 ml of enzyme source (supernatant). The reaction was started by addition of 0.1 ml riboflavin (60 mM) which was prepared afresh. After addition of the riboflavin, the tubes were placed under light for 30 min. A similar set of controls was maintained under dark condition. The optical density was read at 560 nm against the controls kept in dark condition. The results were reported as units/ mg protein. 2.9. Ascorbic acid level in the testis

The testis was homogenized in 5 ml phosphate buffered saline. The vitamin C level was estimated by 2,4-dinitrophenyl hydrazine method [12]. Briefly, 0.5 ml of testicular homogenate was added to 2 ml of freshly prepared metaphosphoric acid and mixed well in a vortex mixer, and centrifuged for 10 min at 2,500 rpm. 1.2 ml of the clear supernatant was taken. In seven other tubes 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0

Biochemical Parameters Alterations Induced by Chronic Oral Administration of Lead Acetate in Albinos Rat 8 and 1.2 ml of working standards was taken and made up the volume to 1.2 ml with metaphosphoric acid. To the blank, 1.2 ml of metaphosphoric acid was added. 0.4 ml of dinitrophenyl hydrazine-thiourea-copper sulphate was added to all the testis, mixed and incubated the tubes in a water bath at 37°C for 3 h with glucuronic acid and ascorbate-2-sulfate. The tubes were removed from the water bath and chilled for 10 min in ice bath. 2 ml oh chilled sulphuric acid (12 mol/l) was added to all the tubes, mixed well in a vortex mixer in room temperature. The absorbance was read at 520 nm against the reagent blank to express the result in mg/dl 2.10. Statistical analysis

The data are presented as the mean±S.E.M. Differences between control and treatment groups were analyzed using Student’s t-test or Fisher’s exact test. A value of p<0, 05 was considered significant. 3. Results 3.1. Lead concentrations in tissues

The lead content in the organs of control and experimental animals are presented in figure 1. The high increase of lead content was observed in the pituitary gland of treated male rats. Therefore, lead tissues concentrations in all of the lead-treated groups were significantly higher than in the control animals (p<0,001).

Figure 1: Organ lead concentrations in rats.

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

Pituitary gland Testes Epididymides Tissues

µgPb/g Group IGroup IIGroup III

******

***

**

** **

Note:Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). **p<0,05, ***p<0,001 compared with control rats. 3.2. Effect of lead administration on some biochemical parameters

Lead administration produced severe alterations in blood/plasma biochemical parameters. One of the most sensitive and dramatic indicators of hepatocyte injury is the release of intracellular enzymes such a plasma alkaline phosphatase in the circulation (p<0,01). Table 1 showed a prominent hypocalcaemia and hypo-albuminaemia and marked decrease in plasma magnesium and total iron values observed in experimental groups. In contrast, lead acetate administration has significantly increased (p<0,01) the total cholesterol values in treated rats when compared with controls.


Table 1: Effect of lead acetate on some plasma biochemical parameters in rats.

Groups Ca (mg/l) Mg (µg/100ml) Total iron (mg/l) Albumin (g/dl) ALP

(µmol/ml)

Total holesterol

(mg/100 ml) Group I 135,2±0,93 44,32±2,76 5,67±0,16 5,16±0,35 202±12 49,96±4,68 Group II 129,1±0,56* 30,82±2,38* 2,75±0,39* 4,1±0,28* 147±8* 65,2±3,69* Group III 122,3±0,49** 25,56±1,59** 1,22±0,42** 2,01±0,18** 130±5** 129,3±9,37**

Note: Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). *p<0,05, **p<0,01 compared with control rats. 3.3. Concentration of plasma ascorbic acid

The mean concentration of ascorbic acid is summarized in figure 2. In the control group the mean concentration of ascorbic acid was 45,33±5,44 µmol/l. Within the group of rats receiving lead acetate in a concentration of 500 mg/l and 250 mg/l, the concentration of ascorbic acid was decreased 24,65±2,48, 31,16±3,67 respectively, compared with those in the control group. These results indicate oxidative damage caused by treatment of lead acetate.

Figure 2: Influence of lead administration on ascorbic acid concentration.

0

10

20

30

40

50

60


µmol/l

***

Note: Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). *p<0,05, **p<0,01 compared with control rats. 3.4. Effect on pituitary gland, testicular and epididymal ALP activities

The pituitary gland, testicular and epididymal ALP activities was significantly (p<0,01) increased after lead acetate treatment in comparison to the rats control, which reflects the different organs degeneration and cytotoxicity (figure 3).

Biochemical Parameters Alterations Induced by Chronic Oral Administration of Lead Acetate in Albinos Rat 10 Figure 3: Testicular, Epididymal and pituitary alkaline phosphatase enzyme activities in control and

experimental rats.

Tissues0

5

10

15

20

25

30

35

40

Pituitary gland Testes Epididymides

µg o

f PN

P/m

g of

tiss

ue/h

r


***

****

**

Note:Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). *p<0,05, **p<0,01 compared with control rats. 3.5. Effect on catalase and superoxide dismutase (SOD) in different tissues The results on catalase and superoxide dismutase for pituitary, testes and epididymides were presented in figure 4-5. Chronic oral lead acetate treatment resulted in a significant increase in catalase activity and also a significant increase in superoxide dismutase in all the pituitary, testes and epididymides (p<0,001) in comparison to the control group.

Figure 4: catalase activity in different organs of rat exposed to lead acetate

s

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5


Supe

roxi

de d

usm

utas

e (U

nits

/mg

prot

ein)


**

***

***

***

****

Note: Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). **p<0,05, ***p<0,001 compared with control rats.


Figure 5: Superoxide dismutase activity in different organs of rat exposed to lead acetate

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5


Supe

roxi

de d

usm

utas

e (U

nits

/mg

prot

ein)


**

***

***

***

****

Note: Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). **p<0,05, ***p<0,001 compared with control rats 3.6. Ascorbic acid in the testis

After 12 weeks of exposure, the lead-treated animals has significantly lower ascorbic acid (p<0,001) in both the studied parts compared with their respective controls (figure 6).

Figure 6: Effect of lead acetate on ascorbic acid level (mg/g tissue) in the rats.

0

0,5

1

1,5

2

2,5


(mg/

g tis

sue)

** ***

Note: Levels of significance values are (mean ± SEM; n = 10). **p<0,05, ***p<0,001 compared with control rats. 4. Discussion One notable factor of environmental and occupational pollution is an accumulation of such elements resistant to biological degradation including heavy metals (lead, cadmium, mercury….). Both occupational and environmental exposures to heavy metals remain a serious problem [13; 14; 15]. The present results provide evidence that lead is accumulated in the following order: pituitary gland>testes>epididymides. The lead content of different tissues was heavily increased in group III.

Biochemical Parameters Alterations Induced by Chronic Oral Administration of Lead Acetate in Albinos Rat 12 Lead may be rapidly absorbed and reached considerable amount in the blood [16]. Han et al; Moussa et al [17; 18] suggested that this element is strongly bound to macromolecules in the intracellular compartment because lead binding proteins have been isolated from the kidney, liver, blood and brain. A great amount of research effort has been devoted to the description of intestinal adsorption [19; 20]. Lead affects bone development and mineralization [21], and has an antagonistic activity in calcium metabolism [22]. In the present study, administering lead acetate to rats resulted in a statistically significant decrease of calcium concentration in plasma of rats in relation to the control group which is in agreement with the results obtained for a proposed mechanism for the decrease calcium absorption and negative calcium balance seen in rats exposed to lead acetate is that this metal inhibits activation of vitamin D in the renal cortex [23; 24] In addition, depletion of endogenous magnesium may occur as a result of competition absorption between lead and this element at the level of intestinal epithelium [24; 25]. The measurement of total iron is one of the most frequently performed clinical laboratory test. Lead may compete with iron, results in decreased in blood total iron under low or high dose of lead than those in control group. It is another sensitive indicator of liver cell damage and disturbances in bone marrow functions [26; 24]. Albumin is the abundant protein in human plasma, representing 55-65% of total protein. It synthesized in the liver at a rate that dependent on protein intake subject to feedback regulation by the plasma albumin level [3; 27]. Albumin useful indicator of the integrity of glomerular and other membranes. It chief biological functions are to transport and store a wide variety of ligands, to maintain the plasma oncotic pressure, and to serve as a source of endogenous amino acids [28]. From this point in this study concentrated on the, plasma albumin of rats and the results were significantly lowers plasma albumin in which rats exposed to low or high dose of lead acetate as compared to the control rats indicating poor liver functions or impaired synthesis, either primary as in liver cells damage or secondary to diminished protein intake and reduce absorption of amino acids caused by malabsorption syndrome or malnutrition [29]. On the other hand, the results indicated that in the present study, plasma total cholesterol level was high in animals exposed to high dose of lead than in those not exposed. This relationship between lead acetate and plasma cholesterol suggesting an altered lipid metabolism related to lead exposure. The assessment of a possible relationship between lead level and lipid is an important step in elucidating the mechanisms underlying the excess cardiovascular morbidity among lead-exposed subjects [30; 31].Our finding of elevated total cholesterol is in agreement with [32; 33]. Administering lead acetate to rats resulted in a statistically highly significant increase of blood alkaline phosphatase compared with the control group, that are attributed to the irritation of all particularly liver cells by toxin lead or due to increased loss of intracellular enzyme by diffusion through cell membrane, which appear to acts as a stimulus to the synthesis of more enzymes. The alkaline phosphatases (ALP) are a group of glycoprotein enzymes that bound to alkaline PII. ALP activity is found in virturally all tissues, particularly bone, liver, kidney, intestine, adrenal and placenta. The functions and natural substances of ALP remain unknown. However Vanhoof and DeBroe [34] and Martins et al [35] reported that in bone a lack of ALP is a associated with a lack of mineralization present evidence indicates that probably four gene loci are involved in encoding the ALP group of enzymes, producing the following primary structures In addition, Johnson hypothesis that, in liver alkaline phosphatase is found at two distinct sites on the sinusoidal surface of the hepatocyte, and in the microvilli of the bilic canaliculi and ducts. ALP is also found in a number of other body tissues; thus, the plasma ALP activity is not specific for the liver. During obstruction of the bile passages (cholestatis) the plasma ALP level rises. This is due mainly to an increase synthesis of ALP, but the obstruction itself also plays a part by causing regurgitation of the enzyme back into the blood steam [36; 37; 38]. Moreover, the increased activity of testicular, epididymal and pituitary alkaline phosphatase in lead treated rats reflects tissues degeneration, which maylikely be an indicative of lytic activity [39; 40]. Some authors have reported elevation of oxidative stress indicators as a result of exposure to lead Oxidative stress may be a result of excessive ROS generation or failure of the cellular antioxidant system [41; 42]. These data are consistent with results obtained by [43; 44]. Intensification oxidative stress caused by lead may affect the composition of


cytoplasmic, mitochondrial and acrosomal membranes. It is known that on the way from testes and central nervous the sperm membranes become richer in unsaturated fatty acids and therefore they show tendency to instability. It promotes acrosomal reaction but at the same time the membranes become more prone to peroxidative damage [45]. The investigation suggests that the increase in antioxidant enzymes such as SOS and catalase were more in testes and pituitary compared to epididymides. Overall, lead disturbs pro-and anti-oxidative balance in the tissues causing oxidative stress which might explain the neurotoxic nature of lead. The effects of antioxidant clearly demonstrate the generation of reactive oxygen species by metal. It is likely that the protective effects of antioxidants on metal-induced damage are dependent on many factors such as the animal species, tissues, and cell types, as well as the level of antioxidants and metals inside cells. One important antioxidant in blood and tissues with a very wide spectrum of biological effects is ascorbic acid (vitamin C). Ascorbic acid is produced from the ultimate hexose precursor D-glucose. After the pathway of ascorbic acid biosynthesis had been established, it was soon revealed that in tissues of humans, monkeys [46]. Mice, rats and rabbits synthesize vitamin C in their liver. Our experiments showed that the exposure oh male Wistar albinos rats to lead acetate results reduce the synthesis of ascorbic acid compared with the control group. From this point of view ascorbic acid may contribute to reduce of the negative affects on intoxication. Therefore, findings of the present study lead induced oxidative damage in the testis due to decrease in acid ascorbic level in poisoning rats. The oxidative damage occurred might have destroyed most of testicular germ cells either to the membrane damage or macro molecular degradation incurred by increased of oxidative enzymes such SOD and catalase. Our experimental data have consequently evoked the questions as to what saturation with vitamin C would have been sufficient in human organisms being unable to produce it and what exposure to lead acetate from different sources (industrial waste, dental amalgam…) are required to eliminate lead negative impacts on human health [47; 48; 49]. In conclusion, our studies indicate that lead causes disturbances in metabolism of male rat reproductive system organs by alterations of biochemical parameters and oxidative stress. Acknowledgement The authors are very thankful to Dr BOKORTT F and Dr AIT YAHIA D for providing chemicals for this work. I thank Mr. Slimani for encouragement and moral support.

Biochemical Parameters Alterations Induced by Chronic Oral Administration of Lead Acetate in Albinos Rat 14 References [1] Graca A, Ramalho-Santos J, de Lourdes Pereira M. 2004. Effect of lead chloride on

spermatogenesis and sperm parameters in mice. Asian J Androl; 6: 237-241. [2] Vaglenov A, Creus A, Latchev S, Petkova V, Pavlova S, Marcos R. 2001. Occupational

exposure to lead and induction of genetic damage. Environ health Perspect; 109: 295-298. [3] Abd El-Hameed Amal R, Shalaby SIA, Mohamed AH, sabra HA. 2008. Effects of oral

administration of lead acetate on some biochemical and hormonal parameters during pregrancy in baladis goats. Global Veterinia; 2 (6): 301-307.

[4] Sokol Rebecca Z, Saixi Wang, Yu-Jui Y, frank Z Stanczyk, Elizabet Gentzschein, and Robert E Chapin. 2002. Long-term, low-dose lead exposure alters the gonadotropin-releasing hormone system in the male rat. Environmental health Perspectives; 110: 871-874.

[5] Nava-Hemández MP, Hauad-Marroquίn LA, Bassol-Mayagoitia S, Garciá-Arenas G, Mercado-Hernández R, Echávarri-Guzmán MA, Cerda-Flores RM. 2009. Lead, cadmium, and arsenic-induced DNA damage in rat germinal cells. DNA Cell Biol; 28 (5): 241-8.

[6] Jadhav SH, Sarkar SN, Patil RD, Tripathi HC. 2007. Effects of subchronic exposure via drinking water to a mixture of eight water contaminating metals: a biochemical and hostopathological study in male rats. Archives of Environmental Contamination and Toxicology; 53: 667-677.

[7] Amiard J C, Pinneau A, Boiteau H, Metayer C Amiard-triquet C. 1987. Application de la spectrophotométrie d’absorption atomique Zeeman au dosage de 8 éléments traces (Hg, Cd, Cr, Mn, Pb, Se) dans la matière biologique solides.Water Res ; 21 (6) : 693-697.

[8] McGown EL, Rusnak MG, Lewis CM, Tilloston JA. 1982. Tissue ascorbic acid analysis using ferrozine compared with the dinitrophenylhydrazine method. Anal Biochem; 119: 55-61.

[9] Malymy M, Horecker BL. 1966. Alkaline phosphatase. In methods in Enzymology Volume IX. New York: Academy Press; 639-642.

[10] Aebi H, Packer L. 1984. Catalase in vitro. Methods Enzymol; 105: 105-112. [11] Beauchamp PC, Fridovich I. 1971. Superoxide dismutase: improved assay and an assay

applicable to PAGE. Analyt Biochem; 44: 276-287. [12] Lardy II A, IIansen RG, Phillips PH. 1945. The metabolism of bovine epididymal spermatozoa.

Arch Biochem; 6: 41-51. [13] Lumb G. 1995. Metal toxicity.41-65. In: craighead JE (Ed). Pathology of environmental and

occupational disease. Mosby year Book, St. Louis. [14] Evans HF. 1998. Mercury. 993-999. In: Rom WNB (Ed). Environmental and occupational

Medecine. Lippincott-raven, Philadelphia. [15] Korenekova B, Skalicka M, Nad P. 2002. Cadmium exposure of cattle after long-term emission

from polluted area. Trace Eleme Electrolytes; 19: 97-99. [16] Haque MM, Awal MA, Mostofa M, Sikder MMH, Hossain MA. 2006. Effects of calcium

carbonate, potassium iodine and zinc sulphate in lead induced toxicities in rat model. Bang J Vet Med; 4 (2): 1213-127.

[17] Han S, Oizo X, Simpson S, Ameri P, Kemp FW, Bogden JD. 1996. Weight loss alters organ concentration and contents of lead and some essential divalent metals in rat previously exposed to lead. Nutrition; 126: 317-323.

[18] Moussa FI, Adham KG, Abdd-Ellatif H, Abou-Samra W, Mahmoud SS, Ahou Shabana MB, Soliman S. 2001. Influence of dietary calcium on subacute lead toxicity in the rat. Pakistan Journal of Biological Science; 4 (1): 77-80.

[19] Whitehead MW, Farrar G, Christie GL, Blair JA, Thompson RP, Powell JJ. 1997. Mechanisms of aluminium absorption in rats. Am J Clin Nutr; 5: 1446-52

[20] Sadykov R, Digel I, Temiz Artman A, Porst D, Linder P, Kayser P, Artmann G, Savitskaya I, zhubanova A. Oral lead exposure induces dysbacteriosis in rats. J Occup Health; 51: 64-73.


[21] Kim KA, Chakraborti T, Goldstein GW, bressler JP. 2000. Immediate early gene expression in PC 12 cells exposed to lead: requirement for protein kinase C. J Neurochem; 3: 1140-6

[22] Gavazzo P, Zanardi I, Baranowska-Bosiacka I, Marchetti C. 2008. Moleccular determinants of Pb (2+) interaction with NMDA receptor channels. Neurochem Int; 1-2: 329-37.

[23] Chichovska M, Anguelov A. 2006. Study of the influence of L-lysine and zinc administration during exposure to lead and ethanol in rats. Viterinarski Arjuv; 76: 65-73.

[24] Herman DS, Geraldine TV. 2009. Influence of minerals on lead-induced alterations in liver function in rats exposed to long-term lead exposure. J Hazard Mater; 166 (2-3): 1410-4.

[25] Todorovic T, Vujanovic D, Dozic I, Petkovic-Curcin A. 2008. Calcium and magnesium content in hard tissues of rats under condition of subchronic lead intoxication. Magnes Res; 21 (1): 43-50.

[26] Kielczykowska M, Pasternak K, Boguszewska A, Musik I. 2004. The influence of chosen metals administration in drinking water on magnesium balance in rats. Ann Univ Mariae Curie Sklodowska Med; 59 (2): 146-51.

[27] Abd-El-Baset M, Abd El reheem A. 2009. The roles of honeybee solution on the physiological parameters of rats exposed to cadmium chloride. Australian Journal of Basic and Applied science; 3 (1): 167-282.

[28] Peter T Jr. 1975. Serum albumin. In: The plasma proteins, vol 1 2nd ed. F. Putnam, Ed. New York, Academic Press, 133.

[29] Abd-El-Reheem AMA. 2008. Effect of honeybee feeding on some physiological parameters of female rats exposed to cadmium chloride. Al-Azhar Bull Sci (Aisc) March: 29-42.

[30] Kopp SJ, Barron JT, Tow JP. 1988. Cardiovascular action of lead and relationship to hypertension: a review. Environ Health Perspect; 78: 91-99.

[31] Hami J, Dashti Gh R, Nema-bkhsh M, Afshar M, Ghaffari HR. 2006. The relationship between high dose lead exposure and serum lipids and lipoprotein levels. Shiraz E Medical Journal; 7 (2): 1-7.

[32] Moussa SA, Bashandy SA. 2008. Biophysical and biuochemical changes in the blood of rats exposed to lead toxicity. Romanian J Biophys, 18 (2): 123-133.

[33] Ademuyiwa O, Agarwal R, Chandra R, Behari JR. 2009. Lead-induced phospholipidosis and cholesterogenesis in rat tissue. Chem Biol Interact; 179 (2-3): 314-20.

[34] Vanhoof VO, Debroe ME. 1994. Interpretation and clinical significance of alkaline phosphatase isoenzyme patterns.Crit Rev Clin Lab Sci; 31: 197-293.

[35] Martins MJ, Negrao MR, Hipolito-Resis C. 2001. Alkaline phosphatase from rat liver and kidney is differentially modulated. Clin Biochem; 34: 463-468.

[36] Jevtović-Stoimenov T, Kocić G, Pavlović D, Stojanović I, Cvetković T, Sokolović D, Bašić J. 2003. Effects of captopril on membrane-associated enzymes in lead-induced hepatotoxicity in rats. Acta Fac Med Naiss; 20 (3): 183-188.

[37] Teljón C, Olmo R, Blanco D, Romero A, Teljón JM. 2006. Low doses of lead: effects on reproduction and development in rats. Biol trace Elem Res; 111 (1-3): 151-65.

[38] Smith DMJr, Mielke HW, Heneghan JB. 2008. Subchronic lead feeding study in male rats. Arch Environ Contam Toxicol; 55 (3): 518-28.

[39] Kaur R, Dhanuju CK, Kaur K. 1999. Effect of dietary selenium on on biochemical composition in rat testis. Ind Exp Biol; 37: 509-511.

[40] Kuladip J, Subarna J, Prabht KS. 2006. Effects of chronic exposure to sodium arsenite on hypothalamo-pituitary-testicular activities in adult rats: possible an estrogenic mode of action. Reproductive Biology and Endocrinology; 4(9): 1-13.

[41] Kruk I. 1998. Environmental toxicology and chemistry of oxygen species. The Handbook of Environmental Chemistry. Vol. 2. Berlin: Sringer.

[42] Marchlewicz M, Wiszniewska B, Gonet B, Baranowska-Bosiacka I, Safranow K, et al. 2007. Increased lipid peroxidation and ascorbic acid utilization in testis and epididymis of rats chronically exposed to lead. BioMetals; 20: 13-19.

Biochemical Parameters Alterations Induced by Chronic Oral Administration of Lead Acetate in Albinos Rat 16 [43] Bokora KK, Brown E, McCormick R, Yallapragada PR, Rajanna S, Bettaiya R. 2008. Lead-

induced increase in antioxidant enzymes and lipid peroxidation products in developing rat brain. Biometals; 21 (1): 9-16.

[44] Bokora KK, Blaylock I, Denise SB, Bettaiya R, Rajanna S, yallapragada PR. 2009. Influence of lead acetate on glutathione and its related enzymes in different regions of rat brain. J Appl Toxicol. [Epub ahead of print].

[45] Aitken RJ. 1999. The amoroso lecture. The human spermatozoon-a cell in crisis? J Reprod Fertile; 115: 1-7.

[46] Hijova E, Nistiar F, Sipulova A. 2005. Changes in ascorbic acid and malondialdehyde in rats after exposure to mercury. Bratis Lek Listy; 106 (8-9): 248-251.

[47] Mohamed Fekry H, Ragab L, kamel M, hamed A. 2006. Effects of ascorbic acid on lead toxicity. Paediatrics; 189 (2): 2p.

[48] Tariq SA. 2007. Role of ascorbic acid in scavenging free radicals and lead toxicity from biosystems. Molecular Biotechnology; 37 (1): 62-65.

[49] Fan G, Feng C, Li Y, wang C, Yan J, Li W, feng J, Shi X, Bi Y. 2009. Selection of nutrients for prevention or amelioration of lead-induced learning and memory impairment in rats. Ann Occup Hyg. Epub ahead of print.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE

CHAPITRE I – ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Problématique du plomb dans l’environnement…………………………………………………………....4 1. 1. HISTORIQUE…………………………………………………………………………………....5

1. 1. 1. L’utilisation du plomb ………………………………………………………..……....5 1. 1. 2. Propriétés physico-chimiques du plomb………………..………………………….…....7

1. 2. Les sources d’exposition …………………………………………………………………………11 1. 2. 1. Sources d’exposition liées aux activités industrielles ……………………………….....11 1. 2. 2. Sources d’exposition liées aux activités domestiques et mode d’alimentation…….......11

1. 3. Le plomb dans les sols et les végétaux……………………………………………………………13 1. 3. 1. Dans les sols……………………...……………………………………………………..13 1. 3. 2. Dans les végétaux ………………………………..…………………………………......14

1. 4. Biocinétique du plomb après une contamination interne………………...…………...……....17 1. 4. 1. La voie pulmonaire…………………………...………...............................................17

1. 4. 2. L’absorption digestive….…………………………………………………………….18 1. 4. 3. Absorption cutanée……...…………………………………………………………….....21

1. 5. Transport sanguin……………………………………………………………………………..….….23 1. 5. 1. Distribution dans l'organisme…………………………………………………………....25

1. 5. 2. Excrétion du plomb…………………………………………………………………….…26 1. 6. Principaux effets toxiques du plomb sur la santé humaine………………....................................28

1. 6. 1. Toxicologie aiguë………………………………………………………………………....28 1. 6. 2. Toxicologie chronique…………………………………………………..………………...29

1. 6. 2. 1. Effets sur le système nerveux central……………………………………..……….29 1. 6. 2. 2. Effets sur le système nerveux périphérique……………………………………….31 1. 6. 2. 3. Effets hématologiques……………………………………………...………….....32 1. 6. 2. 4. Effets rénaux………………………………………………………...…………...33 1. 6. 2. 5. Effets sur le système cardio-vasculaire………………………………..………....34

1. 6. 2. 6. Autres effets………………………………………………………………….…...35 1. 7. Indicateurs biologiques………………………………………………………………………..........…..36

1.7. 1. La plombémie….....................................................................................................................37 1. 7. 2. La plomburie…………………………………………………………...…………………...37

1. 7. 3. Mesure du plomb dans les cheveux……………………………………………….............37 1. 7. 4. Mesure du plomb dans les dents……………………………………………………….…..38 1. 7. 5. Mesure du plomb dans les os…………………………………………………………….....38

1. 8. Effets sur la reproduction et le développement……………………………………………………….....39 2. Anatomie et physiologie de la reproduction chez le rat mâle……………………………………………….....40

2.1. Les testicules……………………………………………………………………………………………......40 2. 2. Les tubes séminifères………………………………………………………………………………….…..42 2. 3. Les espaces interstitiels…………………………………………………………………………………....45 2. 4. Le liquide des compartiments intratesticulaire……………………………………………………….…45

2. 5. La spermatogenèse…………………………………………………………………………………….…...46 2. 5. 1. Phases de la spermatogenèse………………………………………………………………………...46 2. 5. 2. Stades de l’épithélium séminifère…………………………………………………………………...49

2. 5. 2. 1. Cellules germinales associées à la phase proliférative……………………………….....49 2. 5. 2. 2. Cellules germinales associées à la phase méiotique………………………………….....49 2. 5. 2. 3. Cellules germinales associées à la spermiogenèse………………………………............52

2. 5. 3. Initiation de la spermatogenèse……………………………………………………………….….....53 2. 5. 4. La cellule de Sertoli……………………………………………………………………….…….…..54

2. 5. 4. 1. Fonctions de la cellule de Sertoli…………………………………………………..….....56 2. 5. 4. 2. Mise en place de la barrière hémato-testiculaire……………………………………..…56 2. 5. 4. 3. Activité de phagocytose……………………………………………………………........58 2. 5. 4. 4. Activité de sécrétion……………………………………………………………….…….58

2. 5. 4. 4. 1. Fluide testiculaire…………………………………………………………….58 2. 5. 4. 4. 2. Nutriments……………………………………………………………….…...59 2. 5. 4. 4. 3. Protéines et facteurs de croissance…………………………………………...59

2. 5. 5. Cycle de la cellule de Sertoli………………………………………………………………………..59

Table des matières

2. 5. 5. 1. Prolifération des cellules de Sertoli………………………………………………….....60 2. 5. 5 2. Etablissement du ratio cellules germinales / cellules de Sertoli……………………...61

2. 5. 6. Les espaces interstitiels………………………………………………………………………….....61 2. 5. 7. Les glandes annexes……………………………………………………………………………….62

2. 6. Régulation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique…………………………………………....64 3. Toxicologie à l’échelle moléculaire……………………………………………………………………………....68

3. 1. Effets sur le statut oxydatif cellulaire et ses conséquences…………………………………….......68 3. 1. 1. Conséquences du stress oxydant sur les protéines………………………………………...71 3. 1. 2. Conséquences du stress oxydant sur les membranes biologiques………………………....72 3. 1. 3. Conséquences du stress oxydant sur le matériel génétique……………………………..…74

3. 1. 3. 1. Les coupures de brins………………………………………………………....74 3. 1. 3. 1. 1. Les coupures simple brin (CSB)…………………………………..74 3. 1 .3. 1. 2. Les coupures double brins (CDB)…………………………….…..76

3. 1. 3. 2. Les bases modifiées……………………………………………………….…..76 3. 1. 3. 3. Pontages ADN-protéines…………………………………………………......76 3. 1. 3. 4. Altération des sucres…………………………....…………….……………...77

3. 1. 4. Conséquences du stress oxydant sur la reproduction…………………………………..….77 3. 2. Biomarqueurs de stress oxydant…………………………………………………………….……...77

3. 2. 1. L’activité superoxyde dismutase……………………………………………………….….79 3. 2. 2. L’activité catalase……………………………………………………………………...….79 3. 2. 3. L’activité glutathion peroxydase……………………………………………………….....79 3. 2. 4. Le glutathion, un antioxydant non enzymatique…………………………………...….…79

3. 3. Le système antioxydant cellulaire…………………………………………………………………...80

CHAPITRE II – MATERIELS ET METHODES

1. Matériel biologique ………………..…………………………………………………………….………...82 2. Méthodes………………………………………………………………………………………….………...82

2.1. L’exposition au plomb……………………………………………………………...………….……..82 2.2. Technique de gavage chez le rat……..…………………………………………………...….............84

2. 3. Test de fertilité……………………………………………………………………………………...…85 2.4. Sacrifice des rats……………………………………………………………………………………….85

2. 5. Observation macroscopique……………………………………………………….…….…….……..86 2.6. Etude histologique des organes …….…………………………………………………….…………..86

2.6. 1. Histologie classique (topographique)…………………………………………………….....89 2. 6. 1. 1. Fixation………………………………………………………………………...89 2. 6. 1. 2. Inclusion (circulation)…………………………….…………………………....89

2. 6. 1. 3. Coupe, étalement des coupes et coloration……………………………………..91 2. 6. 2. Histologie du cerveau (hypothalamus et hypophyse)……………………….………….....94

2. 7. La mise en évidence du plomb dans les testicules par technique histochimique………….……...97 2. 8. Mise en évidence du phénomène d’apoptose au niveau des testicules……………………..……...97

2.9. Dosage du plomb dans les organes prélevés ….te et vésicule séminale)……………………...….98 2. 9. 1. Minéralisation des organes ………………………………………………………………...98

2. 9. 1. 1. Principe………………………………………………………………..….......100 2. 9. 1. 2. Mode opératoire……………………………………………………..………..100 2. 9. 1. 3. Dosage spectrophotométrique (S. A. A à flamme)…………………….......…100

2.9. 2. Dosage du plomb dans le sang (plombémie)…………………………...…………...….....101 2. 9. 2. 1. Gamme étalon…………………………………………………………....…...101

2. 10. Etude du spermogramme………………………………………………………………………......101 2. 10. 1. Comptage des spermatozoïdes………………………………………………..…...…......101 2. 10. 2. Evaluation de la qualité des spermatozoïdes……………………………….…………...105

2.10.2.1. Test de motilité des spermatozoïde....................................................................105 2.10. 2. 2. Evaluation de la densité des spermatozoïdes.. ……………………………....106 2.10. 2. 3. Détermination du pourcentage des spermatozoïdes vivants……………..…106

2.10. 2. 4. Détermination des anomalies……………………………………………..….106 2.11. Evaluation des paramètres biochimiques……..….……………………………………………..…107

2. 11. 1. Dosage du Fer…………………………………………………………………….………107

Table des matières

2.11. 2. Dosage du magnésium…………………………………………….……..…………..…......107 2. 11. 3. Dosage de l’albumine…………………………………………………….….......................107 2. 11. 4. Dosage du calcium…………………………………………………………………….........108 2. 11. 5. Dosage de la phosphatase alcaline (ALP)………………………………………………......108 2. 11. 6. Dosage du cholestérol total dans du plasma……………………………...…………….......108 2. 11. 7. Dosage de la vitamine C (l’acide ascorbique) dans le plasma……………... ………...........109 2. 11. 8. Dosage de l’activité de lactate déshydrogénase (LDH) testiculaire ……………...……......109 2. 11. 9. Dosage de la vitamine C testiculaire et épididymaire…….………….………………..........109

2. 12. Evaluation du statut antioxydant……………………………………………………………..…………...110 2. 12. 1. Produits de peroxydation lipidiques au niveau des testicules et l’hypophyse……….…….....110 2.12. 2. Catalase au niveau des testicules et l’hypophyse....110

2. 12. 3. Superoxyde dusmutase au niveau des testicules et hypophyse.……………….……….…......111 2. 13. Dosage hormonal des hormones sexuelles (testostérone, FSH et LH………………………………….......111 2.14. Analyse statistique des résultats………………………………………………………………….....…….......111 CHAPITRE III RESULTATS

1. Effet du plomb sur l’évolution pondérale…………………………………………………………...........113 2. Effet du plomb sur la fertilité des rats mâles……………………………………………………….........116

3. Effet du plomb sur le poids relatif et la taille des organes sexuels ………………………………….….116 4. Impact du plomb sur l’architecture histologiques des organes………..………………….…….............120

4. 1. Structure des testicules………………………………………………………………..……….......120 4. 2. Structure de l’épididyme……………………………………………………………………..........123 4. 3. Structure des vésicules séminales……………………………………………….............................125 4. 4. Structure de la prostate………………………………………………………………….…….......127

4. 5. Effet du plomb sur les structures histologiques cérébrales………………………..........................129 4. 5. 1. Effet sur la structure de l’hypophyse………………………………………...........129 4. 5. 2. Effet sur la structure de l’hypothalamus…………………………..........................131

5. Mise en évidence du plomb par histochimie au niveau des testicules………...……………………...........135 6. Mise à l’évidence du phénomène d’apoptose au niveau testiculaire……………………………….….......137 7. Toxicocinétique du plomb……………………………………………………………...…………….............139

7. 1. Dosage du plomb dans le sang (PbS) ou plombémie…………………………………………..…..…139 7. 2. Dosage du plomb tissulaire (cerveau et les organes sexuels) …………………..…………....….........139

8. Etude du spermogramme (spermocytogramme…………………………………………………………….142 8. 1. Effet du plomb sur le nombre, la motilité et la densité des spermatozoïde…..…...........……....……..142 8. 2. Effet du plomb sur le taux des spermatozoïdes vivants..………………………….……………...…...144 8. 3. Effet du plomb sur l’analyse morphologique des spermatozoïdes...………………………….….…...144

8. 3. 1. Anomalies de la tête des spermatozoïdes………………………………………………..........146 8. 3. 2. Anomalies du flagelle des spermatozoïdes…………………………………………................148

9. Effet du plomb sur les paramètres biochimiques…………………………………………………...….........149 10. Effet du plomb sur la vitamine C plasmatique…………………………………………………….…....…..152 11. L’effet du plomb sur l’activité du lactate déshydrogénase (LDH) testiculaire……………………….…...152 12. L’effet du plomb sur la teneur en vitamine C testiculaire et épididymaire………………………........……....154

13. 1. Marqueurs de la peroxydation des lipides (Acide malondialdéhyde) (MDA)…………………...........155 13. 2. Effet sur l’activité catalasique testiculaire…………………………………………………….…........157

13. 3. Impact sur l’activité de la SOD testiculaire et hypophysaire…………………..……...........................160 14. Evaluation du taux des hormones sexuelles (Testostérone, FSH et LH)……………………….…….………..162

CHAPITRE IV DISCUSSION

1. Effet du plomb sur la croissance pondérale…………………………………………………………...163 2. Effet du plomb sur les structures Histologiques des organes (testicules, épididyme, 3. vésicules séminales, prostate, hypophyse et hypothalamus)………………………………..………...165 4. La bioaccumulation du plomb à l’échelle tissulaire ……………………………………………….....168 5. Effet du plomb sur les paramètres biochimiques sanguins………………………………………….170

Table des matières

6. Evaluation du pouvoir pro-oxydant du plomb……………………………………………………..172 7. Evaluation de la fertilité des rats……………………………………………………………………177 7. Interaction du plomb avec l’axe hypothalamo-hypophysaire…………………………………….…179 CONCLUSION ET PERSPECTIVES………………………………………………………………........183 REFERNENCES BILIOGRAPHIQUES………………………………………………………………..187 ANEXES

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EFFETS DE L’EXPOSITION CHRONIQUE AU PLOMB …Département de biologie Laboratoire de Biochimie appliquée THESE DE DOCTORAT D’ETAT Es - Science Option : BIOCHIMIE APPLIQUEE EFFETS