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ORLANDO MONCHEZ
EFFETS DES ANTT-OXYDANTS SUR LA MO-, LA VUS- ET LA CAPA- DE F~ONDATION
nVWZX0 DES SPERMATOZO~ES PORCINS
Mémoire
pour l'obtention
Depariemmtdes~MimPles
FACULTÉ DES SCIENCES DE CAGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATtON
UNIVERSITÉ LAVAL
AVRIL 2000
8 ORLANDO MONCHEZ, 2ûûû
National Library 1+1 ,cma& Bibliothèque natronale du Canada
AcquïsiRlons and ~cquisitions et Bbliographk Senrices services biblbgraphques
The author has granted a non- exclusive licence allowing the National Lïbrary of Canada to reproduce, loan, distnbute or seil copies of this thesis in microform, paper or electronic formats.
The author retains ownership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts fkom it may be printed or othem-se reproduced without the author's permission.
L'auteur a accordé une licence non exclusive pezmettant à la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distribuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de mic~ofiche/fihn de reproduction sur papier ou sur fomüt électronique-
L'auteur conserve la proprietk du droit d'auteur qui protège cette thése. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation,
Actuellement, ii est =cile de consemer la semence ftaïïche porcine
pour plus de trois jours. Le présente étude visait à comparer l'effet de
plusieurs anti-oxydants pour protéger les spermatozoïdes porcins contre
l'attaque de radicaux libns. L'hydroxytoluène bbutylé, à une concentration
de 0,s mM, donne les meilleurs résultats pour h motilité, la viabilité et &
fécondation in vitro mais l'effet observé n'est pas significatif.. La vitamine C,
à une concentration de 0,28 mM et aussi Ihydroxytoluène but@ à une
concentration de 1,O mM ont donnt des résultats négatifs sur la motilité et
la viabilité des spermat0u)ides porcins. Les anti-oxydants superoqde
dismutase, c a u s e et glutathione améliorent aussi, mais de façon non
signXcative la motilité et la viabilité des spermatou)i:des, après 5 jours de
conservation.
L a semence fkd-che porcine se conserve mal pour plus de trois jours
suivant la récolte. L a motilité diminue et ta capacité de fécondation des
spermatozoïdes diminue aussi rapidement.
Une des causes possibles est qpe les longues chahes molécutsires cpe
forment les lipides de la membrane des spermato201des deviennent la cible
principale de L'attaque des radicaux libres. Les radicaux libres
endommagent la membrane des spermatozoïdes et affectent leur motilité,
leur survie et leur pouvoir ficondant Quelques travaux de recherche chez
d'autres espèces ont montré que l'ajout d'anti-oqdants au dilueur de
semence protège la membrane des spermatozoïdes contre l'attaque des
radicaux libres.
L a présente expérience a permis d'évaluer l'effet de certains anti-
oxydants sut la motilité, la viabilité et la capacité de ficandation in vitro
des spermatozo5des porcins en conservation fkakhe. Les anti-oxydants
superoxyde dismutase (SOD), hydrortyt01uène butyle @HT) et la vitamine C
ont été évalués dans 14 éjaculats de verrats du centre d'insémination
artificielle du Québec (CIPQ). Le BHT a causé un accroissement de 9%, 7%
et 5% de la motilité spermatique par rapport au témoin à 2,3 et 5 jours de
conservation respectivement (effet non significatif). L a survie des
spennatozides et leur capacité de ficonder in viho n'ont pas été affectées
par le BHT. La SOD n'a eu aucun effet sur la semence consemée naiche
relatif au témoin.
La vitamine C, à une concentration de 0,28 mM, a eu un effet négatif
sur la motilité et viabilité des spermatozoïdes. il est probable que la
concentration utiiisée ait éti trop petite, ayant ainsi un dkt de pro-oxydant
au lieu d'anti-oxydarit, AItemativement. la vitamine C pourrait aItérer le pH
de la semence à la base, guoique des mesures directes n'ont pas permis de
le démontrer.
Dans une deuxième expérience utilisant 8 éjaculats de verrats gardés
au Pavillon des services de L'Université Laval, i'effet des anti-oxydants
catalase, giutathione réduit, et BEET a été évalué. Les trois anti-oxydants
ont permis une légère amélioration non significative de Ia motilité et de la
survie des spermatoddes par rapport au témoin.
Dans une troisième expérience, utilisant 8 éjaculats de 2 verrats
gardés à l'Université Laval, d i f f a t e s concentrations de BHT (0.1 mM,
0,25 mM, 0,s mM et 1.0 mM) ont été évaluées. Un effet négatif sur la
motilité et sur la survie des spermatozoïdes conservés pendant cinq jours a
été obtenu avec une concentration de 1.0 mM et il n'y a pas eu de
dinérence sigdïcative avec le témoin pour les autres concentrations.
Les résultats obtenus permettent de conclure que probablement la
perte normale et progressive de motilité des spermatozo1des pendant la
conservation en nais n'est pas pxincipaiement due à l'attague des
phospholipides membranaires par les radicaux libres car il nl a pas eu
d'effet protecteur des anti-oqdants aux doses utilisées. Toutefois, plus de
recherches avec les anti-oxydants sont nécessaires dans différentes
conditions, entre autres selon les saisons, les verrats et les concentrations
d'anti-oxydants. IL serait aussi intéressant d'évaluer l'effet de certaines
combinaisons d'anti-oxydants comme la vitamine E et la vitamine C et
aussi ajoutés à l'alimentation,
recherches avec les a n t i - ~ d r r n t s sont nécessains dans âifEé1:entes
conditions, entre autres selon les saisons, les v-ts et les concentrations
d'anti-oxydants. I l serait aussi intéressant d'évaluer l'effet de certaines
combinaisons d'anti-oxydants comme la vitamine E et la vitamine C et
aussi ajoutés a l'alimentation,
L'utilisation de BHT dans l'industrie de l'iisémïnation artificielle
pourrait être recommandée étant d o ~ é e la légère améIioration de la
motilité des spermatozoïdes après cinq jours de consemation et ses
propriétés antivirales. Toutefois, des essais de fécondité en élevages
devraient être effectués au préalable.
Avant Propos
Je tiens à remercier mon épouse Anakl Monchez, mes trois enfants
Orlando, Welmer AIexander et Stéphanie pour leur patience, leur
compréhension et L'amour qu'ils ont pour moi. Merci aussi à ma mère
Graciela Monchez et à tous mes W s , soeurs et leurs conjoints pour le
support mord qgas m'ont donné.
Je remercie le Dr Jean Paul Idorest, directeur de recherche, pour
son encadrement et ses conseils pendant la réalisation de cette recherche.
Merci aussi au Dr Marc André Sirard et à la Dre Janice Bailey pour
leur commentaires judicieux et pour l'intérêt manifesté dans cette
recherche.
J'aimerais aussi remercier le Ministère de l'&iucation de l'Ontario
par son aide hancière B la garde de mes enfats et aussi le CRSNG et le
CORPAQ, pour le support financier de cette recherche.
L'auteur tient à remercier le personnel du CIPQ inc. de St-Tambert
pour la semence gracieusement donnée et utilisée dans la première
expérience.
Merci aussi à la Coopérative Agricole Des Cantons de Coaticook, pour
m e permettre de travailler dans l'imdustrie porcine.
AVANT PROPOS ...................................................................
LISTE DE TABLEAUX ........................................................... LISTE DE FIGURES ..............................................................
.............................. CHAPITRE 1 INTRODUCTION G ~ ~ R A L E
2.1 Gmétogenès ......,....................................................... 6 2.1.1 Gamètes des.. ....................................................
2.1.2 Gamètes femelles .................................................. 2.1.2. 1 Croissance F0lliculau.e .................................... 2.1.2.2 Maturation des ovules ....................................
2-2 Fécondation in vitro... ................................................. .................................... 2 -2.1 Réparation de la semence
2 .2.2 Réparation des ovules ............ ..... ................... 2.2.3 Fécondation .........................................................
...................................... 2 -3 Insémination Artificieile(1.A.). .............................. 2 -3.1 Caractéristique de la semence
2.3.2 Avantages de 1'IA ....,.,............C............C............. ... 2.3.3 Choix du verrat .................................................... 2.3.4 haluation de la semence .....................................
III
2.3.4. l.PC\ncen-tion ......................................... . . C 2.3.4.2 Motilite ....................~.............................. 2.3.4.3 MorphoIogie ............................................
... 2 -3 -5 Facteurs infîuençant la production spermatique
2.4 Conservation de la semence .......................................... 2 .4.1 Facteurs influençant la conservation .................. 2.4.2 Radicaux libres ..................................................
...................................... 2 -4.3 Peroqdation de iipides 2.4.4 Antiorrydants ......................................................
2.4.4. 1 Généralités ............................................. 2.4.4.2 Chez les humains ....................W.............. 2.4.4.3 Espice bovine .........................................
........................................... 2 -4.4.4 Espèce ovine ........................................ 2 -4.4.5 Espèce porcine
2.5 Hypothèses et objectifs .................................................
Chapitre IXI EFFECTS OF ANTIOXIDANTS ON PRESERVATION OF FRESH P O R C E SEMEN ......................................................................
................................................................. Introduction
3.3 Material and methods .................................................. 3.3.1 Sperm preparation ............................................... 3.3 -2 Evaluation of sperm quality .................................. 3 .3.3 In vitro maturation and fertilization ....................... 3.3.4 Experiments ......................................................... 3.3 -5 Statistical analyses ...............................................
3.4 Results ......................................................................... Chapitre N Conclusion générale ...........................................
. . Liste des ouvrages cites .......................................................
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 2.1 Composition typique du sperme de verrat ...............
Tableau 2.4 Séquence d'addition des électrons a l'oxygène m o l é c d ~ e ............................................................. 26
TabJeau 2.5 Cjhle de l'attaque des radicaux ühns et canséqumces sur les cellules, .......... .t..,C....L..,....~.~,,.-....C.~.,.......... 28
Tableau 2.6 Réaction en chaîne de L'oxydation des lipides, .............. principalement dans les membrane cellulaire 30
Tableau 2.7 Élimination de produits toxiques par l'action ....................................................... des antioxydants.. 32
Figure 2.1
Figure 2.2
Figure 3.1
Figure 3.2
Figure 3.3
Figure 3.4
Figure 3.5
LISTE DES FIGURES
......................................... Morphologie du spermatomide 19
Exemple d'anomalies spermatiques retrouvées chez le porc ..................................................................... 22
EEect of the addition of antiorrydants (S0Dpitami.n C, BHT) to boar semen extended in BTS at a concentration of 40 x 106 sperm cells.ml-1 on motility (A) and surpival (B) &ter storage at 16 OC for 2 days. .................................L...... 48
Effect of the addition of antioxydants (SOD, vitamin C, BHT) to boar semen extended in BTS at a concentration of 40x 106 sperm cells.ml -l on motility (A) and surpival (B) after storage at 16 OC for 5 days .......................................... 49
Effect of the addition of antioxydants (SOD, vitamin C, BHT) to boar semen extended in BTS at a concentration of 40 x 106 sperm ~ells.ml-~, on in vitro fertilhtion of 482 gilts ovum after storage at 16 OC for 5 days (B) and 2 days (A) ................ ...........œ.......œ............................ 50
Effect of the addition of antioxydants (BHT, catalase, glutathione) to boar semen extended in BTS at a concentration of 40 x IO6 sperm ceUs.ml -1, on motility (A) and survivai (B) after storage at 16 OC for 5 days ....................................................................... 5 1
Effect of the addition of different concentrations of BHT (butylated hydroxitoluen) to boar semen extended in BTS at a concentration of 40 x 106 spem ceUs.ml - l , on motility (A) and s u ~ v a l (B), after storage at 16 OC for 5 days ............... 52
Au cours de 1998, la production canadienne de porcs a dépassi les
17,5 millions de têtes, en croissance de 6.1 % par rapport à 1997. Durant
cette méme période, la production québécoise affichait une croissance de 11
% avec 6,3 millions de têtes. Le Québec compte pour 36 % de la production
c a n a d i e ~ e (CDEQ, 1999).
L e s exploitations porcines au Québec sont parmi les plus spéciaüsées
au Canada. Elles se sont consolidées tant pour la taille de leurs troupeaux
que par les infrastructures qu'elles se sont données en se concentrant dans
certaines régions du Québec.
La compétition féroce dans le marché de l'exportation du porc incite les
producteurs québécois à utiliser des techniques modernes d'amélioration
génétique, et depuis plusieurs années, i'amelioration génétique joue un rôle
de premier plan dans l'accroissement des performances d'élevage. Jusqu'a
tout récemment, le pmgrës génétique reposait essentieuement sur
l'application de principes de génétique quantitative. Bien que L'utilisation
rigoureuse de ces &@es continue à donner des Fisultats remarqyables,
l'apparition rêcente de nouvelles technologies et biotechnologies ouvre de
nouvelles possibilités en terme de sélection génétique. De ces biotechnologies,
on peut citer surtout l'insémination artincielle, la surovuiation, le transfert
d'embryons, la fécondation in vaiP, le clonage des embryons, la cytogénétique
du porc, les mRnipulations génétiques et les banques de gènes.
L'insémination (IA) est une technique relativement simple à appliquer et
pouvant donner de résultats techniques comparables à la saillie naturelle.
Malgré les avantages de FIA, cette technique n'est pas sans problèmes. La
production des spermatozoïdes est idluench par plusieurs facteurs comme
la saison, la néquence d'éjaculation, l'alimentation et i'âge du verrat. Il existe
aussi encore des difficultés de conservation à long terme de la semence
puisque la congélation donne de piètres résultats. En effet, un des plus
grands problèmes qui confronte L'industrie de PIA est la diminution du
pouvoir fécondant des spermatomides durant la période de conservation de la
semence fraiche. L'éleveur doit disposer d'une semence de qualité et il est
donc primordial que les spermatozoïdes gardent leur pouvoir de fécondation
pendant une période assez longue afin d'obtenir une proliEicité acceptable. L e
développement futur de procédés de conservation de longue durée (cinq jours
et plus) de la semence fiaiche permettrait d'ouvrir de nouvelles avenues à
cette technique. Ces nouveaux procédés de conservation faciliteraient la mise
en place d'un calendrier de récoltes des verrats pour la récolte à la ferme et
permettraient de planifier de façon plus harmonieuse les commsndes de
semence dans les centres d'M.
L'utilisation des anti-oxydants comme additifs au dilueur pour la
conservation de la semence pourrait être une solution au problème de
conservation. Dans la présente étude, les effets de divers anti-oxydants
(superoxide dismutase, vitamine C, catalase, glutathione réduit et
hydroqtoluène butyle) sur la motiliti, Ia viabilité et la capacité de
fécondation A viao des spcrmatozo1des porcins conservés penàant 2 et 5
jours. Les résultats sont prisentés sous fomne d t a article dentitique qui
fait suite à une =vue de littérature portant sur les facteurci qui dfiectent la
qualité de la semence de verrat et sa consemation.
La production des gamètes males, les spermatoÿoides, se f ë t dans les
testicdes, plus précisément dans les tubes sérninifèns. Lors de la
spermatogenèse, certaines cellules souches sont appelées à se différencier
tandis que d'autres resteront au stade de cellules souches. Les
spexmatogonies diuie même génération sont iiées entre eues par des ponts
intercellulaires durant toute la maturation. Diffërents types de
sperrnatogonies sont observées et sont issues de divisions successives des
cellules souches. L a dernière division des spermatogonies de type B produit
les spermatocytes 1. C'est à ce moment qu'il y a synthèse d'ADN et réplication
des fïiaments chromosomiques (stade préleptotene). Une première division
méiotique permet la séparation des chromosomes homologues pour former
les spermatocytes II à 2n chromosomes. Une deuxième division méiotique
produira les spermatides qui sont des ceïiules hap1oEdes. Ces aUules, aprës
plusieurs transformations, conduiront au &chernent des spermatou,ïdes
dans la lumiëre des tubes sérninir'ercs @e Kkcster et Ker, 1988).
Les spermatozoi:des relâchSs dans la lumière des tubes séminifères sont
poussés dans le liquide testiculairr vers les canaux efférents. A ce moment.
les spermatozoïdes sont immobiles et ce sont les cils épithéliaux des canaux
efférents qui les dirigent vers la tête de i'épididyme. L'épididyme est formé de
trois parties: la tête, le corps et la queue qui sert de résemoir. Le transport
dans l'épididyme est assuré par des contractions péristaltiques de 2 à 10
secondes tout au long de l'épididyme. Ce trajet prendra de 9 à 14 jours chez
le porc (Singh, 1962). Lors de ce transit, les spermatozoïdes ac@èrent leur
motilité et leur pouvoir fbndant. Les spermatozoïdes sont transportés dans
le liquide épididymaire qui assure leur sumie. Ce liquide est formé en partie
du liquide testiculaire. Les spermatozoïdes subissent aussi des changements
morphologiques comme le remaniement de la membrane plasmatique qui
permettra la reco~aissance et l'interaction entre! les gamètes. L a capacité de
se déplacer linéairement apparaît à du corps de Fépididyme. Cependant
certaines composantes du liquide épididymaire inhibent cette motilité (Mc
Gsady et Nelson, 1972).
2.1.2. 1 Crohanee folliculaire
Les ovocytes. qui seront relâchés lors de i'ovulation, sont entreposés
dans l'ovaire. Les ovocytes sont élaborés durant la vie embryonnaire et se
retrouvent à la naissance dans les fokuies primordiaux. Pour qu'il y ait
ovulation. il doit y avoir croissance d'un ou plusieurs foficuics. Les fàcteurs
qui provoguent l'entrée en croissance de follicules primordiaux sont mal
cornus. En bref. le follicule primordial qui contient l'ovule, se transforme en
follicule intermédiaire puis primairr et finaiement secondaire. Les foIlicuies,
aux stades précédents Le stade secondaire. sont considérés comme le stock
de follicules au repos mbault, 1997). Le follicule préovuiatoire sera
caractérisé, entre autres, par une taille et un nombre de ceUules de la
granulosa maximum, un rapport oestradiol/androgène et/ou
oestradiolfprogestérone élevé et des récepteurs de LH à Ia surface des
cellules de la granulosa.
Cependant, ce ne sont pas tous les follicules en croissance qui
pourront ovuler et donner un ovule fécondable. Quelques jours avant
l'ovulation (variable selon l'espèce). environ 2 à 3 fois plus de follicules que le
nombre nécessaire pour l'ovdation. seront recrutés. Ces follicules sont de
taille supérieure à la taille à laquelle ils deviennent gonadodépendants. C'est
la FSH qui provoque le recrutement des follicules mais une concentration
minimum de LH est nécessaire pour maintenir l'action de la FSH. Le
recrutement peut être induit chez les truies prépubaires par une injection de
l'hormone gonadotrope chorionique équine (eCG), ayant des effets analogues
à la FSH (King et al.. 1991). Le développement des foIlicules m t é s
provoque une augmentation de la production d'oestradiol et d'inhibine. Ces
deux hormones, qui jouent un rôle de rétro-contrôle négatif. causent une
diminution progressive de la sécrétion de FSH. C'est cette baisse de FSH qui
provoque la sélection. Lorsque les concentrations de FSH sont trop faibles
pour causer le recrutement, celui-ci s'arrête et le surplus de foliicuies entre
en atrésie ou involution folliculaire. Les foliicuies qui deviennent atretiques
sont ceux qui n'arrivent pas a leur croissance maximum et à être
susceptibles d'ovuier. Ils ont un rapport oestradiol/androgènes et/ ou
oestradiol/progestérone faible dans le liquide folliculaire, par suite de l'arrêt
de l'aromatisation de la testostérone. Les récepteurs à LH sur la granulosa
sont absents ou non fonctionnels. Le stade ultime d'iïvolution du follicule est
caractinsé par son écrasement et lrsvasion de l'antrum par des fibres
conjonctives, la régression de la gïande interstitielIe et la disparition de
cumulus. L'ovocyte bien que partrCeiîement dégénéré reste la delP11ière ctUule
identinable p b a u l t , 1997).
Les ovules immatures dans le foïiïcule sont au stade nucléaire de
vésicule germinale et doivent compléter la méiose pour pouvoir se développer
adéquatement à la suite de la fécondation,
2.1.2.2 Maturation &s owdea
Pour que l ' ode puisse reprendre la méiose, il doit auparavant subir
des transformations, C'est la maturation des ovules. Dans le foIiicule, l'ovule
est arrêté au stade dyctié et il contient 4n chromosomes. Dans le foIIicule,
l'ovule est en présence de facteurs inhibiteurs de la méiose. Cependant, cet
effet d'inhibition serait renversé in viw par de fortes concentrations des
gonadotrophines @articuiièrement Ia LH) relachées avant l'ovulation
(Thibault, 1977). Ce phénomène activerait la maturation nucléaire et
cytoplasmique de l'ovule. Les changements impliquent toutes les structures
majeures et fonctionnelles de î'ovule (Moor et Gandoln, 1987). Dans l'ordre, il
y a tout d'abord rupture de l'enveloppe nucléaire de la vésicule germinale,
métaphase 1, anaphase 1, télophase I avec expulsion du premier globule
polaire (contenant 2n chromosomes). L'ovule est alors au stade de métaphase
II et possède 2n chromosomes. L'autre moitié des chromosomes sera
expulsée dans le deuxième globule polaire lors de la fécondation.
Ces changements causent aussi la maturation cytoplasmique de
l'ovule. Cette maturation permettra à la chromatine du spermatozoïde de se
décondenser dans l'ovule fécondé et de former le pronoyau msrle. L a
maturation des ovules se doit donc d'être complStêe, tant sur le plan
nucléaire que cytoplasmique, pour permettre un développement no- de
l'ovule fécondé.
2.2 F&con&tion in tri-
La méthode la plus utilisée pour la récolte de la semence chez le verrat,
est la technique de la main gantée (King et Macpherson, 1973). L a fraction
riche en spermatoÿoIdes de l'éjacuiat est recueïilie et diluée pour obtenir des
doses d'au moins 50 ml contenant chacune de 1 à 3 milliards de
spermatozoïdes motiles. Le dilueur utilisé peut varier selon les pays et les
centres dm. Au Québec, c'est le BTS supplementé de gentamycine qui est le
plus courant.
L a semence fraiche, Iorsqu'utilisée en fécondation m vitm. cause le plus
souvent des taux élevés de polyspermie. Cependant, il existe une grande
variation entre les mâles et même entre différents éjaculats d'un même verrat
(Sirard et al., 1993). Plusieurs traitements de la semence fraiche peuvent
être utilisés pour réduire la polyspermie et augmenter le taux de fécondations
réussies. Toutes ces techniques ont pour objectif d'isoler la population de
spermatozoides motiles de l'éjaculat et de la débarrasser des facteurs
décapacitants contenus dans le plasma séminal. En éliminant ces facteurs, il
est possible d'induire la capacitation des spermatou)ïdes, nécessaire à la
fécondation. 11 faut tout d'abord centrifuger la semence pour éliminer le
plasma séminal. Par la suite, les techniques pour induire la capacitation
varient selon les auteurs. Certains vont préincuber les spermatozoïdes dans
les cornes utérines à 37'C pour environ 4 heures (Iritani et al., 1978). Il a
aussi été démontré que la semence conservée à 16-20°C durant une journée,
se capacitait spontanément et pouvait ftconder les o d e s (Cheng et al.,
1986)
Les ovules utilisés en fkondation m vitra peuvent être obtenus en
effectuant une maturation Vr vWo ou Lr vitro- L a méthode m vivo est plus
couteuse car eile nécessite une chirurgie qui permettra de récupérer les
ovocytes, souvent obtenus suite à un traitement hormonal. En effet, cette
technique consiste généralement à prétraiter les femelles a Paide de L'eCG
pour ensuite induire l'ovulation avec une injection de hCG. Les animaux sont
abattus ou opérés pour en obtenir les ovocytes par aspiration et/ou lavage
des oviductes (Cheng et al., 1986). De cette façon, toute la période de
maturation nucléaire et cytoplasmique se passe à l'intérieur du follicule pré-
ovulatoire*
Les ovules, qui semiront à la maturation in vitro, son prélevés sur des
ov&s provenant généralement de l'abattoir* ï i est ainsi possible d'obtenir de
très grands nombres d'ovules. Les ovocytes sont aspirés, à l'aide d'une
aiguille et d'une seringue, des follicules d'environ 3 mm et plus de diamètre
(Intani et al., 1978). Les ovules subissent ensuite une maturation dans des
milieux spécifiques. Ces milieux servent à mimer les sécrétions et milieux
folliculaires normalement présents pour la maturation h vivo. Le liquide
folliculaire peut aussi être utilisé dans les milieux de maturation, pour
favoriser la formation du pronoyau mâle, lorsque dilué à 10Y0 (Yoshida et al.,
1992).
Pour qu'il y ait fécondation, le spermatozoïde doit d'abord se lier à la
zone peilucide de L'ovocyte. Les trois giycoprotéines de la zone peîlucide (ZP1,
ZP2 et ZP3) ont été identiiïées chez plusieurs espèces dont la souris @leil et
Wassarman, 1980). Les gLycoprotëines ZP1 et ZP2 sont principalement des
glycoprotéines de s t rucm, tandis que ZP3 est spécifique de la Iiaison
initiale avec les spermatozoïdes. La ZP3 permet aussi d'induire la réaction de
l'acrosome. En effet, le contact du spermatozofde avec le cumulus ou la zone
pellucide, active certains récepteurs qui facilitent la difiusion du Ca++
extracellulaire. Le Ca++ facilite aussi la fusion des deux membranes de
I'acrosome et la transformation de la proacmsine en acrosine, forme active de
l'enyme. L'activité enzymatique combinée aux mouvements du flagelle
permettrait au spermatozoïde de traverser la zone peliucide (Miyazaki, 1988).
2.3 Insémination
Les bases physiologiques de 1ZA porcine sont différentes de celles des
espèces bovines et ovines. Le taureau comme le bélier produisent un faible
volume de semence, très concentrée, et qui est déposée dans la partie
antérieure du vagin. Le verrat éjacule une semence de grand volume, peu
concentrée et qui est projetée dans l'utérus. Le pinis du verrat, au cours de
la saillie, pénètre par un mouvement de rotation vers la gauche dans la
partie postérieure du canal cervical où il reste fixé de sorte que l'éjaculat
s'écoule facilement dans l'utérus. Le reflux du sperme dans le vagin au cours
ou après la saillie se trouve fortement réduit suite a la constitution d'un
bouchon cervical a partir de la fkaction gélatineuse (Derivaux, 1989).
Chez le verrat, le nombre de spermatozoïdes par unité de volume est
relativement faible et varie entre 300 O00 et 500 O00 par pL Chez le jeune
verrat, le volume de l'éjacuiat est d'environ 120 mi alors que chez l'adulte, il
est parfois supérieur à 300 ml (Robijns et al., 1989). Ces volumes peuvent
toutefois varier durant l'année d o n l'état de santé de i'animal, et selon les
saisons. L a composition moyenne de la semence de verrat est présentée au
tableau 2.1, White 1980).
Les avantages de VIA sont nombreux. Sur le plan génétique, VIA permet
de réduire le nombre de verrats utilisés dans Pélevage et d'augmenter
Pintensité de sélection. Par conséquent 11A augmente le taw de progrès
génétique tout en réduisant le décalage génétique des élevages
multiplicateurs et commerciaux par rapport à l'élevage de sélection. Une
utilisation judicieuse de FIA permet donc &exploiter au maximum les
reproducteurs d e s de haut potentiel génétique. Un verrat utilisé en IA peut
engendrer 12 à 15 fois plus de descendants qu'en d e naturelie. Un seul
verrat peut féconder 1000 tniies/année (doubles inséminations incluses), ce
qui augmente considérablement son potentiel de diffusion génétique (Coudé
et Drapeau, 1995).
Les avantages Sanitaires son évidents puisque l'TA diminue les risques
de propagation de maladies. Cette réduction s'effectue de deux façon.
Tableau 2.1 Compodfion typique du ipeme de wmt.
Volume de l'éjaculat (ml)
PH Sodium
Potassium
Calcium
Magnésium
Chlore
Fructose
Sorbitol
Acide Citrique
Inositol
Glycérophosphory1choliae
Érgothionine
Rotéine (g/ 100ml)
Ression osmotique (mosm)
*Analyse de l'éjaculat entier. Valeurs moyennes: mg/lOûmi de
plasma séminal. Adapté de White, 1980.
Remièrement, la diffusion à l'intérieur des troupeaux est réduite. En effet,
une truie porteuse d'une infection (métrite, leptospirose, etc.) pourrait
risquer de contaminer un v e m t lors de la saillie, et ce dernier de faire de
même lors des accouplements subséquents avec d'autres femeîies,
Deuxièmement, la diaision a l'extérieur de l'élwage est aussi moindre. En
effet, le plus grand facteur de risque d'introduction de nouvelles maïadies
dans le troupeau demeure Fintroduction d'animaux provenant d'un autre
élevage, ce qui devient moins nécessaire avec l'utilisation de PIA.
Les avantages économiques en ce qui concerne l'achat et l'entretien de
verrats sont appréciables. De plus, la libération des espaces occupés par les
verrats procure a l'éleveur des surfaces supplémentaires qu'il peut douer à
des truies qui lui procureront un revenu additionnel (Laforest, 1995).
L'utilisation de géniteurs ayant le plus grand potentiel génétique permet, par
l'amélioration plus rapide de la vitesse de croissance, de Pindice de
consommation et par la diminution de l'épaisseur du gras dorsal, de réaüser
des économies en regard des coûts fixes reliés à la durée d'engraissement, a
la quantité d'aliments a acheter, ainsi qu'une amélioration du classement de
la carcasse à l'abattage.
L'IA peut aussi faciliter ou permettre la mise en place de techniques
visant a améliorer la régie du troupeau et les performances de repduction.
Par exemple, la conduite en bandes qui nécessite un grand nombre de
saillies à des moments bien précis dans la régie de l'élevage, peut
difficilement se f&e sans M. L'IA permet aussi Futilisation de mélanges
hétérospenniques (dose d'insémination contenant la semence de plus d'un
verrat). Des études ont montré que cette pratique pouvait améliorer les taux
de conception, la taille de la portée et le poids à la naissance des porcelets
(Coienbrander et al., 1993)
Avec tous ces avantages, depuis quelques années FIA se développe de
façon continue au Québec et dans le monde. Ce dêvcloppanent va de pair
avec les résultats obtenus avec la pratique de cette technique, qui sont
maintenant comparables a ceux de la saillie naturelle (Colenbrander et al.,
1993).
2.3.3 Choir du vemt
Le verrat contribue a 50% du patrimoine génétique de chaque mise-
bas. Comme il peut inséminer jusqu'à 1000 femelles par année, son impact
sur l'élevage est considérable. E m , les gènes qu'il transmet à ses
descendants sont responsables en bonne partie de leurs performances de
croissance et de la qualité de leur carcasses (Colenbrander et Kemp, 1990)
Lors du choix du verrat, plusieurs aspects sont à considérer: le
potentiel génétique de l'animal; son apparence physique; son aptitude à la
saillie; son innocuité sanitaire. L'état de santé est très important puisque la
semence peut être contaminée par des micro-organismes dans le plasma
séminal qui viennent des organes sexuels accessoires, de l'urètre, de la
muqueuse préputiale, de i'urine ou du sang. Considérant la grande diausion
possible de cette semence, il y a un fort risque d'introduction de malridies
dans les élevages. La meilleure façon de s'assurer que le verrat est exempt de
maladies est I'achat de verrats de troupeaux de haut niveau sanitaire
reconnu, l'utilisation de la qwantaine et le suivi régulier des analyses de
sang et de la semence. Les maladies les plus souvent transmises par la
semence sont la pseudo-rage ou d a d i e d'Aujesky's, le syndrome
reproducteur porcin (SRRP), le parvovirus (PPV), la peste porcine africaine, la
leptospirose et des maladies moins fkéquentes causées par quelques autres
micro-organismes comme les mycoplasmes et uréoplasmes (Colenbrander et
al., 1993).
Les exigences d'admission d'un verrat pour de tins cornmerciaïes varient d'un centre binsémi'natïon a un autre mais généralement les nonnes
sont comme suit: une motilité p~~grcssive des spamatoz01des d'au moins 60-
70%; une bonne morphologie (moins de 20% des spermat0201des anormaux);
une quantité produite par éjacuiat de 30 à 48 millimilliads dépendant de Fâge et
de la néquence d'éjaculation; une bonne habileté de conservation @lus de
60% de motilité progressive après 48 heures: Danske, 1987). A u Danemark
et aux Pays Bas 8% et 15 à 45% respectivement des verrats sont exclus dès
leur entrie en serpice principalement pour des raisons de qualité de semence
insunisante (Colenbrander et al., 1993). Le taux de réforme dans un centn
d'IA peut varier mais la plupart du temps le rejet se fait pour des raisons de
qualité de semence, libido et maux de membres.
2.3.4. bdumtion de k semence
L'évaluation adéquate de la qualité de la semence, pour i'IA, pour la
recherche ou pour la conservation est très importante. Les principaux
paramètres qui peuvent être mesurés au laboratoire sont l'intégrité de
l'acrosome, la motilité et la viabilité des spermatozoides, la sensibilité à
différents stress, la concentration, la structure de la chromatine et la
capacité de féconder des o d e s . Les principales propriétés des doses de
semence produites doivent être: absence d'organismes contagieux; bonne
capacité de fécondation; haute valeur génétique; bonnes propriétés de
conservation.
La concentration indigue le nombre de spermatozoiTdes par p a r 3 ou ml.
Cette valeur a beaucoup d'importance pour juger de La quelité de la semence
et pour déterminer le nombre de doses produites et la dilution. Diverses
méthodes sont utilisées à cet effet soit ïa numération -te a
Phémacymètre, le compteur électronique ou les méthodes indirectes comme
le spectrophotomètre.
Une méthode efficace pour mesurer la concentration est clairement trës
importante pour I'IA. La méthode la plus utilisée par les centres d'IA est la
façon indirecte avec un spectrophotomëtre. Cest la plus facile et la plus
rapide, mais il faut aussi savoir que la db ra t ion de cet appareil n'est pas
toujours valide pour tous les verrats et qu'il existe à l'occasion des Mirences
entre la concentration réelle et la concentration mesurée (Woelders, IWO).
Une mesure fiuorométricpe d'ADN utilisant un fluorochrome spécifique
comme H33258 ou H33342 pourrait aussi être une procédure très simple
pour évaluer la concentration. Toutefois, les équipements requis sont encore
pour le moment très dispendieux (WoeIders, 1990).
La motilité est mesurée par une estimation visuelle et subjective de la
vitesse et du type de déplacement des spermatozoïdes. Un examen superficiel
de la motilité des spermatozoïdes, assez souvent effectué par certains
éleveurs lors de la réception de la semence, n'a qu'une valeur relative. Il se
fait sur de la semence diluée, suite à une période de conservation plus ou
moins longue. D'autres méthodes sont aussi utilisées comme le compteur
électronique coup1é a un aComputer Assistcd Sperm h a ï p i s Systemm (CASA)
qui permet une évaluation plus complète et p-se. Le CASA a été umsé
jusqu'à présent surtout pour évduer les spermatozoïdes humains ou pour la
recherche. I l mesure les mouvements des spermat0mi:des génédement par
l'intermédiaire de 10 paramètres. Cependent, son utiiisation est restreinte
par son coût d'achat ( 30 000$ à 50 000$: Johnson et aI., 1996; Holt.,
1996). L a motilitt5 est un des caracteres de qualie qui est potentieilement le
mieux relié au pouvoir fécondant de la semence (Audet, 1988 ; Tardif et al.,
1999).
2.3.4.3 Morphologie
L'étude morphologigue des spennatozoides a bénéficié de la mise en
application de colorations vitales, de techniques histochimiques et de la
microscopie t5lectronique. La majorité des spermatozoides de dinérentes
espèces présente une structure tiliforme avec trois régions essentieues: la
tête, la pièce intermédiaire et la queue (Figure 2.1). L a tête est
essentiellement constituée du noyau recouvert à sa partie antérieure d'une
structure en bonnet appelée acrosome, le noyau est constituée d'ADN et de
protéines spéciales, les protamines (Garner et alJ986). Le col est la partie
étroite reliant la tête à la pièce intermédiaire du flagelle. 11 représente la
partie la plus vulnérable et la plus fragile du spermatozoïde et renferme
i'appareil centriolaire que marque le début du filament axial situé au centre
de la pièce intermédiaire et qui parcourt sans interruption, toute la longueur
du flagelle du spermatozo1de. L a pièce intem~diain, qui s'étend du centriole
distal a l'anneau centriolaire, constitue la partie la plus épaisse de la queue
et peut être considérée comme i'élément moteur du spermatozoïde.
L'enveloppe mitochondriale est riche en lipides et c'est à ce niveau que se
trouve le système cytochrorne oxydase pour la respiration des spermatozoïdes
L'acrosome. partie essentieue du spermatozoïde, est une énorme
vacuole située dans la partie antérieure de la tête. ElIe contient des enzymes
comme Pacmsine et l'hyduronidase, qui jouent un rôle dans la pénétration
de la zone pellucide qui entoure l'ovule. L a réaction de l'acrosome est la
fusion entre la membrane de I ' a ~ s u m e et la membrane cytopiasmkpe qui
permet de libérer les enzymes. au moment de la fécondation. Si il y a eu des
dommages à l'acrosome. il n'y aura pas de réaction de L'acrosome et pas de
fécondation, ce qui explique l'importance de I'intégrité de cette structure
(Pursel et Johnson, 1972)- Une façon de mesurer l'intégrité de l'acrosome est
d'évaluer la libération des enzymes de l'acrosome (hyaluronidase ou
acrosine), mais c'est une méthode complexe et laborieuse (Frornnn et al..
1987). Une façon plus simple est d'évaluer l'apparence de Eacrosome au
microscope, en utilisant des technigues de coloration ou en fixant les
spermatozoides dans le giutaraldéhyde pur obsemer la crete apicale de
l'acrosome et en différencier les stages de détérioration à fort grossissement
(Pursel et Johnson, 1972). Une membrane intacte est essentieue pour un
spermatozoïde parce que, contrairement aux autres cellules, les
spermatozo1des ne sont pas capables de réparer les dommages qu'ils peuvent
subir (Cardullo et Wolf, 1990).
La fluidité de la membrane est aussi très importante parce que la
perméabilité fait que les spermatozoïdes ne sont pas capables de maintenir
les concentrations nécessaires d'ions et de solutés. La ceilule perd alors les
métabolites essentiels et les coenzymes comme J'adénine nucléotide, J'ATP et
1'ADPAM (Holangk et Bonhnenseck, 1982). La motilité cesse et la cellule
meurt. Le test à l'éosine et le test hypo-osmotique @OS) permettent de
mesurer la perméabilité des membranes. L a plupart de ces tests sont
fastidieux, semi-subjectifs e t n'évaluent pas le comportement réel des
spermatozoïdes en milieu fécondant.
pièce
- - '.. Figure 2.2 Morphologie du spermato~ïde.
(Adapté de Gamer et Hafez, 1980)
Robijns et ai* (1989) ont observé p1usieurs anomalies encéphaligues
des spermatozoïdes, cile es a détecter parce pue les spermatozoîdes
gardent une motilité normale. Ces spermatozoïdes peuvent iventuellement
pénétrer l'ovule mais il ne peut y avoir un développement normal de
l'embryon. Une tête de spennatozoide trop épaisse est plus fade à voir, car
la motilité du spermatozoîde en est affectée. Un verrat ne devrait pas avoir
plus de 10% de spermatozoïdes avec de telies anomalies, car cela &ecte
certainement les taux de fécondation-
Il y a plusieurs sortes de queues anofmales chez les spermatozoïdes
(Lagerlof, 1989; cité par Denvaw, 1989). Fréquemment rencontrée, la
gouttelette protoplasmique (GPP) est une anomalie causée par un défaut
dans la maturation des spermatozoides. Lagerlôf (1989; cité par Deriva-
1989) estime que la présence de plus de 2 à 3 % de spermatozoïdes
immatures traduit l'existence de troubles de la spermatogenèse. Ce
phénomène est nature1 dans i'épididyme mais ne devrait pas s'observer dans
la semence éjaculée. Si la gouttelette est localisée immédiatement derrière la
tête (GPPP: pour proximal) ou à l'extrémité de la gaine mitochondriale (GPPD:
pour distsl), elle a une faible répercussion sur Le pouvoir fécondant, mais la
GPPP peut entraver de façon plus sérieuse la motilité. Les quantités de GPPP
et GPPD ne devraient pas dépasser 30%. Une queue recourbée avec une GPP
dans l'inflexion est la forme de queue anormale la plus fkéquente. Il y a
également les queues enroulées sur elles-mêmes, les queues extrêmement
courtes et les queues dédoublées mais ces formes sont rarement observées. Il
est importante de déceler la présence d'une grande quantité de queues
anormales dans la semence car les spennatozoîdes peuvent dimcilement
pénétrer la zone pellucide des ovules. Il ne devrait jamais y avoir plus de 20
% de queues anormales dans l'éjaculats de verrats actifs sexueilement. En
général, le sperme normal devrait avoir un mininiun de 70% de
spermatozoïdes normaux (Robijns et al., 1989).
L'influence des saisons sur la production de Ia semence est bien
connue. L'effet de la saison peut s'expliquer soit par la lumiëre, soit par la
température ou par les deux. En régions tempérées une diminution de
production peut s'obsemer à partir de mars jusqu'au mois d'aoitt suivie
d'une augmentation à partir de septembre à février (Claus et Weiler, 1985)
L a photopiriode change la production de la semence puisque les jours
courts augmentent la production totale de sperme comparativement à des
témoins en jours longs. Ii y a aussi une augmentation du nombre des
spermatozoides éjaculés, de la libido et de la production d'hormones
(testostérone et oestrogênes) en jours courts (Claus et Weiller, 1985).
Peu de choses sont connues sur les changements dans le métabolisme
des spermatozoïdes suite à une augmentation de l'activité sexuelle des
verrats. L a quantité de spermatozoïdes obtenue dans un éjaculat, de 80 B
120 d a r d s des spermatozoïdes pour une récolte hebdomadaire, est en
effet très élevée par rapport aux réserves épididymaires. Ainsi une
augmentation du rythme de récolte au delà d'uae par semaine, diminue
significativement le nombre total de spermatozoides par éjaculat.
Les réserves spermatiques se reconstituent lentement. Lors de la
récolte d'éjaculats successifs deux fois par jour pour deux jours de suite chez
des verrats au repos depuis une semaine, les quantités de spermatozoïdes
obtenues représentent 44, 28, 18 et 10% de l'ensemble des spermatozoïdes
récoltés du premier au dernier éjaculat. On n'a donc pas intérêt à trop
augmenter le rythme de récolte du verrat au-delà d'une à deux fois par
semaine (Coudé et Drapeau, 1995).
distaleet queue pli&
double
- Figure 2.2 Exemple d'anomalies spermatiques retrouvées chez les porcs.
(Adapté de Glossop, 1996b)
Une période de repos trop courte entre c m e récolte de semence va
changer la quaatitt et la composition chimique du plasma séminal et alors
les conditions pour le métabolisme aémbie du spermatozorde vont aussi
changer. L'activité respiratoke de la semence du verrat augmente avec un
période de repos plus longue entre chaqye récolte et il y a une corrélation
positive avec la viabilité et la conservation de la semence (White, 1980)
2.4.1 Facteurs influençamt k conservation
La conservation de la semence porcine pour plus de trois jours est un
problème considérable. En effet, la semence porcine congelée donne des
résultats d'insémination très pauvres (Buhr et al., 1994). C'est pourquoi, la
semence diluée est presque toujours conservée fraiche, a une température
d'environ 16OC (Pursel et al., 1973). Ii est très difticile d'avoir de bons
résultats de fécondation avec une semence ayant été conservée trop
longtemps (Gottardi et al., 1980). Plusieurs facteurs sont responsables de la
baisse de qualité avec le temps. Elle s'explique entre autres par
l'accumulation des produits du métabolisme ainsi que pour une perte de
charge négative qui donne une indication du processus de vieillissement des
cellules, laquelle pourrait être due a une peroxydation des lipides qui cause
des dommages à la membrane des spermatozoïdes.
Les radicaux libres son considérés comme responsables d'une
augmentation du processus de peiwcydation des lipides des spermatozoïdes
de la plupart des espèces de mammifères (Alvarez et al., 1987). I l a été
proposé pour la première fois en 1954 que la plupart des dommages
membranaires causés par une concentration élevée d'oxygène sur les cellules
des organismes vivants pourrait être dû à la formation de radicaux libres
Les radicaux libres sont simplement des molécules -mement
réactives qui sont formées comme produits du processus métabolique des
cellules (Hallivel, 1994). Ce sont des produits secondaires, libérés pendant la
respiration oxydative, et aussi par la pollution, les radiations solaires, le
smog, diverses toxines, etc. Ces produits contiennent un ou plusieurs
électrons supplémentaires, très instables. Pour devenir des molécufes
stables, les radicaux libres cherchent des recepteurs d'électrons a partir
d'autres molécules comme par exemple i'ADN et les lipides des membranes
cellulaires. Quand ces molécules sont attaquées, leur structure moléculaire
est altérée et elles deviennent des radicaux libres qui cherchent eux aussi à
se stabiliser en @attaquants n'importe queue autre molécule biologique à
proximité.
Quand un électron est ajouté a une molécule d'oqgène, même si ce
radical n'est pas très réactif, ii peut agir avec Phydmgène et former le
peroxyde d'hydrogène (&OZ)- Cette molécules peut agir encore avec
l'hydrogène pour former de l'eau mais aussi le dangereux radical hyâroxyl
(HO.) qui, entre autres, peut s'attaquer aux purines et pyrimidines et causer
des mutations (Tableau 2.2: Levine, 1985).
En plus des sources endogènes de radicaux libres, de nombreuses
sources de produits qui réagissent avec l'oxygène sont présentes dans
l'environnement. Les poumons sont continuellement exposés à des gaz
oxydants comme l'ozone, le dioxyde d'azote et dioxyde de soufre. Quand ces
gaz oxydants interagissent avec les molécules biologiques comme les acides
gras polyinsaturés de la membrane cellulaire, ils produisent des radicaux
d'oxygène. Aussi, pIusieurs poiluants chimiques activent Le métabolisme des
radicaux libres (Chance, 1979)-
Ironiquement, Eo-gène, qui est indispensable pour la survie animale.
cause aussi des dommages à la santé- En effet, pendant le processus de
réduction de l'oxygène, il y a production de radicaux libres dont les plus
importants dans les organismes vivants sont le radical hydroxyl, le
superoxyde, l'oxyde nitrique et le peroxyde, avec d'autres produits réactifs de
l'oxygène produite réactifs de l'oxygène comme L'ozone, l'acide hypochlorique
et le peroxy d'hydrogène, lesque1 jouent un rôle important sur I'incidence de
certaines maladies, la toxicologie et la décomposition des aliments ~ a i k e l .
1994). Ils participent aussi au déveIoppement de la rancici* des huiles
végétales, des peintures, etc. I l y aurait près de 50 mnladies qui
impliqueraient les radicaux libres telles les cancers, certaines mutations
génétiques, plusieurs formes d'idamation et aussi le processus de
viellissement (Mc Cord. 1986) (Tableau 2.3; Amorna et al.. 199 1).
Les radicaux libres ont comme cible principale les- lipides des
membranes ceUulaires. Les dommages sont au niveau de la fluidité des
membranes, la diminution de l'activité enzymatique et la transfodon des
récepteurs. Le processus d'attaque est nommé peroxydation des lipides.
Réaction chimique Produit
0 2 + (e-) = 02- (anion supemxide)
0 2 + (e-) + 2H
H z 0 2 + (e-) + H+
HO. + (e-) + H+
Ha02 (peroxyde d'hydrogène)
&O + HO. (radical hydrorryl)
Hz0
0 2 : oxygène
H+ : ion hydrogène
Hm : eau
Adapté de Aitken et Clarkson (1987)
Les phospholipides de la plupart des membranes biologiques sont
normalement composés de 50% d'acides gras insaturés dont 30% d'acides
gras polyinsaturés. Cette haute proportion d'acides gras poïyinsaturés fait que
les phospholipides sont hautement susceptibles a la perorrydation et a la
propagation d'une réaction en chaûie. L a participation de l'oxygine dans cette
cascade de radicaux libres amëne I'accumdation d'hydroperoxyds lipidiques
et d'autres produits oxydants (Ching, 1988)- Une investigation plus complète
des membranes en activité de peroxydation spontanée ou provoquée révèle les
époxydes, les époxy-alcools, les carbonyles comme aussi les malonaîdéhydes,
les pentanes et les éthanes sont aussi des produits de peroqdation (Ching,
1988) .
La réaction débute généralement par l'attraction d'un ion hydrogène
~ H B ) d'un acide gras insaturé (phase d'initiation). L'oxygéne agit rapidement
et amène la formation d'un peroxyle organique (LOO.). Le radical peraxyle
peut lui même prendre un atome d'hydrogène d'un autre acide gras insaturé
pour former un acide gras hydropero>xyde stable (LOOH). L a chaule de
réactions se maintient parce qu'un autre radical centré sur le carbone est
formé dans ce processus (phase de propagation). Enfin, les hydmperoxydes
(stables) peuvent être réduits m uivo en acides polaires hydroxy inactifs par
Penzyme gluthation peroxydase et d'autres enzymes qui contiennent le
sélénium comme cofacteur. Si cela ne se produit pas, la peroxydation des
Lipides pourrait être stimulée par la réaction d'hydroperoqdes avec le fer et
les complexes de cuivre. Les radicaux organiques formés, comme aIkoxy (LO.)
et peroxy (L02.) sont assez réactifs pour endommager d'autres molécules
dinérentes que les acides gras insaturés (Tableau 2.4; Ching, 1988
Cibles d'attaques des radicaux libres Conséquences
Rotéines
Lipides
Produit secondaires
(aldéhydes)
A.D.N.
Hydrates de carbone
aitération des structures molécuiaires
perméabilité de la membrane affectée
diminuent l'activité enzymatique
mutations
Altérations des récepteurs,
viscosité (ex:glycosamino glycane
du liquide synovial)
Adapté de Aruoma et al. (199 1).
La membrane des spermatou)1des porcins, comme celle de toutes les
cellules, est composée principaiernent de lipides et protéines. Six types de
lipides p ~ c i p a u x sont identifiés: phosphatidy1sé~es, lipotidyl
phosphatidylinositols, ethanoiamines, phosphatidyléthanolamines,
phosphatidylcholines, sphingomyélines (Buhr et al., 1994).
Les produits du métabolisme de l'oxygène attaquent les lipides de la
membrane et amènent i'initiation de la cascade de peroxydation des lipides.
En conséquence, les spermatozoïdes perdent la capacité de mouvement, ne
peuvent plus subir la réaction de l'acrosome et la fusion spermatozoïde-
ovocyte devient impossible. Chez les humains, les Cvhements de la fusion
de la membrane pour la réaction de Pacrosome semblent être plus
vulnérables aux radicaux libres que la motilité des spermatozoïdes (De
Lamirande et Gagnon, 1992).
Le principal produit du métabolisme de l'oxygène qui est cytotoxique
pour les spermatozoïdes est probablement le pemxyde d'hydrogëne (De
Lamirande et Gagnon, 1992). Celui-ci est généré par la transformation
intracellulaire de l'anion superoxyde sous l'infiuence de l'enzyme superoxyde
dismutase (SOD). Sous conditions aérobiques. les spermatozoîdes produisent
des taux toxiques de peroxydes d'hydrogène qui agissent en inhibant les
groupes sulphydryles ('ïosic et Waiton. 1950).
L'utilisation d'inducteurs de la peroxydation des lipides, le plus efficace
pour les spermatozoides étant le système Fe (II)/ascorbate, permet de faire
des expériences dans une période de temps plus courte, mais ne donne pas
une information dans les conditions physiologiques. Le taux de peroxydation
est plus bas sans Putilisation d'inducteurs, mais il est aussi possible de le
mesurer. Ce mode de peroxydation est appelé peroqdation spontanée des
lipides (Alvarez et Storey, 1982
Tableau 2.4 Réictionm en cbrtae de 1'01~drtîon de. lipides,
prindpibment dans ks membnnea ceUdaha.
a) LH + OH-
b) L. + 0 2
c) LO2 + LH
d) 2 LOOH + Fe ou Cu =
L. + H20
L02.
LOOH + LI
LH
L.
L02.
LOOH
m. LO2.
: acide gras insaturé
: radical centré sur le carbone
: radical peroxy organique
: acide gras hydropemxy (stable)
: radical organique alkoxy
: radical organique peroxy
Adapté de A i v a . et Storey (1982).
Les effets de la peroxydation spontanée des lipides mu les
spennatozoZdes de lapin sont la perte de la perméabilité de la membrane
plasmatique et la déstabüisation de la structure de la membrane comme
conséquence de la peroxydation des phospholipides (Alvarez et al., 1987). Les
plus sensibles sont les phosphatidyléthanoIamines (PE) et les
phosphatidylcholines (EC). L e plasmalogène, qui est un composant des
phospholipides du sperme qui donne à la membrane plus de flexibilité et
plus de résistance pendant le mouvement, est le plus suscepalde à une
auto-oxydation (Jones et Mann, 1976).
Des études en laboratoire ont démontré que Paddition d'anti-oxydants
au dilueur de semence augmente la résistance des spermatozoïdes à la
peroxydation des lipides et, en conséquence, augmente la survie et la motilité
des spermatozoïdes.
Le mot anti-oxydant vient du Grec aantim qui signifie contre et
*oxydant. qui signifie oxydation. Un anti-oxydant est n'importe quelle
substance capable d'arrêter un processus d'oxydation. Les anti-oxydants
peuvent inhiber Foxydation en désactivant Poxygène, désactivant les produits
du métabolisme de î'oxygène, en attrapant des radicaux libres ~scavenging~),
ou en brisant la chauie de réactions des séquences initiées (Gutteridge.
1978). Les anti-oxydants jouent un important rôle dans Pinhibition des
réactions chimiques avec l'oxygène. Ces réactions incluent l'oxydation qui
cause des dommages cellulaires ainsi que ia dégradation des graisses (Frei,
1994).
Des enzymes comme la supemqde dismutase, la ca- et la
glutathione peroqdaac, fonctionnent intraceïïulairement de fawn coordonnée pour éliminer les produits toxiques interni&dïaires & la
réduction de l'oxygtne rableau 2.5; Piettonigro et Jones, 1977). Dans la région hydrophobe & i'inttrleur des membranes, dinérents types de
radicaux sont fonn&s. Il doit donc y avoir dintnnts anti-qdants,
comme par exemple, la p-carotène, le cholestérol et la vitamine E, qui
réduisent les dommages (Gutteridge, 1978).
Les fluides exti-a-cellulaires contravernent aux intracellulaires
contiennent moins d'uiymes comme la SOD, la catalase et la
glutathione peroxydase, mais des proteines comme la lactofedne et la
transferrine vont lier les ions de fer qui sont aussi responsables de
réactions de peroqrdation des lipides. Plusieurs autres composés
chimiques de faible poids moléculalle agissent comme anti-oxydants
et se trouvent dans les fluides extra-cellulaires comme par exemple
l'ascorbate, le glucose et les ions de zinc (Gutteridge, 1978).
2.4.4.2. Chez 1- apermatos~es humaâma
Des études menées par Aitkcn et Clarkson (1987) ont montré que
les leucocytes dans le plasma séminal, et principalement les
neutrophiles qui peuvent se retrouver dans la semence, peuvent faire
une importante contribution à l'augmentation des -gènes tiactifs
(ROS Veactive oxygene speciesm)* Le diagnostique clinique d'une
augmentation excessive de production des ROS est associé à des altérations du fonctionnement des spermatozoides, manifestées par
une altération de la motilité et de la fusion avec l'ovocyte (Aitken e t
Clarkson, 1978; Alvarez et al., 1987). Des études menées avec de
patients infertiles ont montré une corrélation négative entre
l'augmentation des ROS et le succès de la fécondation in Yibo et aussi
in uw (Aitken et al., 1993).
Tableau 2.5 &&ination de pf~duîts toriques p u 1'8ctfoi des aati-
0-.nt..
02- : anion superofide
SOD : superoxyde dismutase
Hz02 : peroxyde &hydrogène
G S S G : giutatione réduit
GSH : glutathion
Adapté de Pietronigro et Jones (1977).
L a vuhérabfité des spermatozoïdes à rattaque des ROS est une
conséquence de l'abonbce d'acides gras insaturés dans la membrane
spermatique. Ces acides gras donnent une structure fluide dont les
spermatozoïdes ont besoin pour la fusion avec la zone peliucide et les autres
événements qui mènent à à lafécondation. Malheureusement, la présence de
doubles liaisons dans ces molécules les rend vuinérables à l'attaque de
radicaux libres et à l'initiation de cascades de peroxydation des lipides.
laquelle est dinde à arrêter. Ceci amine donc une accumulation de lipides
peroxydés dans la membrane des spermatozoïdes (men , 1994).
11 y a de plus en plus d'évidences que certains types d'idertiiité chez
les hommes sont Es à la production anormale de radicaux libres. Il a été
démontré que 40Y0 des hommes infertiles présentent des quantités
excessives de radicaux libres dans leurs éjacuiats (Iwasaki et Gagnon, 1992).
Les leucocytes qui se trouvent souvent dans les voies génitales des hommes
subfertiles ou Mertiles sont une source importante de radicaux Iibres
(Aitken, 1994). Les spermatozoïdes endommagés sont aussi responsables de
la production de radicaux Iibres (De Lamirande et Gagnon, 1996).
2.4.4.3 Eapèce bovine.
Shannon et Curson (1982) ont rapporté que les spumatozoides du
taureau contiennent l'amino acide oxydase. une enzyme qui devient active
seulement après la mort des spermatozoïdes. Le pero~yde d'hydrogène est un
produit final de la peroxydation des acides aminés aromatiques. Une des
causes du changement dans la structure des membranes des
spermatozoïdes est l'accumulation de produits de la peroxydation des lipides
de la membrane. Les parties les plus sensibles sont l'acrosome et le
plasmalogène.
D'autres chercheurs ont utiIisé la giutathione comme un substrat qui
pouvait aider dans le système pemxydase-réductase comme stabilisateur de
la membrane et pour maintenir la viabüité des spermatozoides. km
résultats montrent que les échantillons des spermatowîdes avec giutathione
ont une motilité de 2,8% plus élevée que pour les échantillons sans
glutathione, mais l'état de i'acrosome n'était pas différent. Le traitement
avec glutathione a permis d'avoir un plus haut pourcentage de vaches
gestantes suite à l'insémination (Slaweta et Laskowska, 1987).
L'influence protectrice exercée par les anti-oxydants naturels (vitamine
E ou vitamine C) dans plusieurs traitements thermiques de la semence, et
leurs effets sur l'activité respiratoire et sur i'intégrité de la membrane
pendant la cryopréservation de la semence de bonne qualité, ont été
démontrés (Beconi et al., 1993). Les chercheurs ont mesuré une
augmentation de l'activité de la SOD corrélée négativement avec la
production de maiondialdéhyde. L'intégrité de l'acrosome a été aussi mieux
préservée que pour le témoin. L'utilisation d'anti-oxydants nahuels avec la
semence de bonne qualité (motilité entre 86 et 60%) a donc eu un effet
protecteur sur la membrane pendant la cryopréservation. Les anti-oxydants
utilisés n'ont eu aucun effet de protection des membranes quand ils ont été
ajoutés à la semence de mauvaise qualité (50 à 30% de motilité).
Le BHT Pbutylated hydroxytoluene). reconnu pour ses qualités
antiviraies et de résistance des membranes des spermatozoïdes pendant la
cryopréservation, a été utilisé pour améliorer la conservation de la semence
bovine (Anderson et al., 1994). Dans un étude, plus de 11 000 vaches ont été
inséminées, soit avec de la semence traitée avec 0,s mM de BHT qui avait été
ajouté au lait utilisé comme dilueur de la semence ou avec de la semence
sans BHT. Les taux de non retour en chaleur n'ont pas été significativement
différents entre les traitements. Par contre, dans une autre expérience
semblable (Wian et al., 1989), il a été montré que le pourcentage de motilité
des spermatoz0i:des après décongéïation est de 10 % plus élevé avec les
traitements de 0.5 mM a 0'75 mM de BHT en comparaison au traitement
sans BHT.
Ii semble que le BHT s'incorpore rapidement dans la membrane des
spermatozoïdes, évitant les dommages après î'exposition à des températures
froides (Hammersted et al., 1976). Les spe~1118towïdes bovins semblent plus
résistants aux effets toxiques des ROS comparativement aux spermatozo1des
des autres espèces. Ceci s'exprime par l'absence de peroqdation de lipides
après incubation à 37'C (Dawra, 1983) et par le fort pourcentage de
spermatozoTdes vivants après le processus de cryopréservation (Chen et al.,
1993).
Dans une étude faite par Guskow (1993, cité par Maxweli et Stojanov,
1996), l'application de Panti-oxydant ambiol a augmenté la capacité de
reproduction des brebis et la qualité des spermatozoïdes du béiier par
blocage du processus des peroxydation des lipides. Le (E)-4-hydroxy-2-
nonenal (HNE) est un produit du processus de peroxydation des lipides qui
fait d'importants dégâts à une variété de cellules et de tissus. Les effets du
HNE sur la semence de bélier ont été étudiés in uitro et les résuitats
montrent une diminution de la motilité, laquelle varie avec les
concentrations de spermatozoïdes et de HNE utilisées. Par contre, les effets
négatifs ont été éliminés par l'addition dans le milieu de réactivation de 1 mM
de glutathione réduit (Windsor et al.. 1993).
La semence du bélier contient une bonne quantité de SOD et en
moindre quantité, de la giutathione peroxydase et de la catalase (Abu-
Erreish et al., 1978). Leurs concentrations diminuent considérablement
suite à la dilution de la semence. Une expérience faite en Australie avec de
la semence consemée pendant 14 jours à des températures de 5 et 2s0c, en
utilisant les anti-oqdants SOD, catmhc, cytochmme c et giutathione
peroxydase, rapporte que tous Ies ant&oxydants ont causé une amélioration
de la motilité et une augmentation de l'iitëgrïté de l'acrosome. De plus, la
viabilité augmente linéairement avec la concentration des antioqrdants, sauf
pour la catalase qui, à des doses plus é1evécs que 200 000 U1f .d -1 . devient
toxique. Le pourcentage des ovocytes fécondés Or viho diminue avec le temps
de storage, mais à 7 jours de storage les traitements avec anti-oxydants ont
donné de meilleurs résultats que les traitements sans anti-oxydant (47% vs
32%; p< 0.05). Le pourcentage des agnelles fkondées a été plus élevé avec
lùtilisation d'une semence traitée aux anti-oqdants qp'avec une semence
témoin (41% vs 16%) (Mme1 et Stojam, 1996)
2.4.4.5 -@ce porcine
11 est connu que plusieurs enymes importantes qui participent a la
réaction de l'acrosome et qui assurent la capacité de fécondation. sont
placées à la surface de la celIule. La distribution des lipides dans la
membrane plasmatique des spermatozoïdes est asymétrique et la
température est un des plus importants facteurs qui aectent la distribution
des composantes de la membrane (Mazotti et al., 1974).
Les spermatozoïdes du taureau et de l'étalon sont plus résistants aux
processus de congélation, par contre les spermatozoïdes du porc et du bélier
sont moins résistants et ont une capacité de fécondation plus basse suite
aux processus de congélation-décongélation (Maxwell et Stojanov, 1996). Les
composantes lipidiques sont plus instables et Pinteraction lipidelprotéine
joue un rôle important en gardant la membrane intacte et fanctionne11ement
active (Windsor et al., 1993).
L'effet de protection de la vitamine E et du glutathione &duit pour
prévenir l'oxydation des Iipides dans le plasma sémifinl du verrat a été
étudié. L'oxydation des Iipides, mesurée par le test TBARS (athiobarbituric
acid reactives substancesm) a doublé en présence du Fe 2++ /ascorbate de
sodium, et a diminué de 62% et 57% en présence de la vitamine E et ou du
glutathione réduit, respectivement (Strezezek et al., 1992).
Dans une expérience m vivo, des verrats ont reçu oralement pendant 7
semaines de l'a-tocophérol (LOO0 UI /jour f 8nim8J). L a concentration de
malonaldéhyde a diminué de 2,2 à 1.2 nM/rnl. L a SOD et le glutathione
augmentent avec l'administration de vitamine E (Brzezinska et al., 1994). Il
existe une variation saisonnière de sensibilité des spermatomTdes à la
peroxydation des lipides, laquelle est plus haute pendant l'hiver et plus
basse au printemps.
Augmenter le période de préservation de la semence porcine fiakhe a
plus de trois jours semble donc être un problème dificile à résoudre. Il est
alors très d'obtenir des résultats de fécondation élevés à cetuse de la
perte de capacité de fécondation pendant la conservation de la semence
fraîche.
Plusieurs facteurs infîuencent le changement de performance de la
semence, entre autres, les dinérences entre verrats, la variation de régie
d'élevage, les différences entre femelles, les variations saisonnières, etc.
D'autres facteurs, plus facilement contrôlables comme le type de dilueur
utilisé, les additifs au dilueur, la température de conservation, l'intensité de
dilution, affectent aussi les résultats de l'insémination.
La membrane des spermatou)1dts est trés sensible à L'attaque des
radicaux iibres et les dommages camés réduisent la motilité, la viabilité et La
capacité de fécondation de la semence. L'action des radicaux libres pourrait
expliquer, au moins en partie, la baisse rapide de qualité de la semence
conservée fiache. Les anti-oxydants agissent contre les radicaux iibres, donc
ils permettraient une meilleure consemati~n~
Les hypothèses de travail sont que:
1) L'ajout d'anti-oxydants à la semence fraiche porcine améiiore la motilité et la survie des spermatozoïdes consemés pendant 5
jours.
2) L a capacité de fécondation in vitro de la semence porcine,
conservée à 16OC, est améliorée avec l'ajout de dinérents anti-
oxydants.
3) Parmi les anti-oxydants utilisab1es, le BHT, à une concentration
optimale de 0.5 mM dans la semence freIche porcine, d o ~ e les
meilleurs résultats pour préserver la motilité et la survie des
spermatozoïdes porcins conservés pendant 5 jours.
L e s objectifs sont:
- De comparer divers anti-oxydants ajoutés au dilueur de semence
Wche porcine pour améliorer la conservation à 16% juqu'à 5
jours.
- D'évaiuer l'effet de divers anti-oxydants ajoutés au dilueur de
semence fraiche porcine pour accroître le pouvoir fécondant in vitro
de la semence, suite à la conservation.
EFFECT OF ANTIOXIDr#Tû 019 PRESERVAl'iOiW OF PRE8H PORCINE
SEMEN
One important problem encountered with m c i a l insemination in
swine is the rapid loss of sperm fettllity associated with fresh storage. This
loss might be partiaiiy caused by the detenoration of sperm membranes
following lipid oxidation. Antioxidants were inciuded with semen to prevent
membrane deterioration and improve sperm storage at 16 O C . The
antioxidants super oxide dismutase (SOD), butylated hydroxyt01uene (BHT),
vitamin C, catalase and reduced giutathione, added to the BTS extender,
were compared for their effects on motility, survivd and fertility of boar
semen stored for up to five days.
SOD, reduced glutathione and BHT increased numericdy sperm
motility on days 2, 3 and 5 of storage, although the Merence from control
was not significant @>O.OS). Vitamin C, at the concentration used in the
present experiment (0.28 mM) had a negative effet on spum motiEty, but no
effect on m vibo fertilization rates, suggestïng that ascorbate at low
concentrations may have a prosxidant effect instead of a . antioxidant one.
Different concentrations of BHT (0.12 mM, 0.25 mM, 0.50 mM)
increased sperm motility, but not sigdicantly @>O.OS) compared to the
control. At a concentration of 1.0 mM, BHT had a negative effect on sperm
motility and sumival @>0.05)
3.2 Introduction
Rolonging viability of fresh boar sperm beyond three days could k
useful for the swine artincial insemination (AI) industry. Normaily, long term
consexvation requires a reduction of the metabolism of the spermatozoa
thereby prolonging their We. This is commonly achieved with
cryopresemation with bdl semen, but cryopresemed bar semen gives very
poor reproductive results (Burh et al., 1994). Therefore, semen may also be
stored fresh , using reduced temperatures or other treatments to depress the
metabolism (reviewed by Mme11 and Salomon, 1993)
Since it is known that spermatozoa of various species are susceptible
to lipid peroxidation with subsequent Ioss of cell integrity (Jones et al.,
1978), the decrease in fertility of stored boar semen might be partly due ta
peroxidative breakdown of membrane phospholipids. Such degradation has
been shown to be involved in the progressive loss of sperm motility in human
(Aitken et al., 1989).
Since normal semen contains little or no protective enzymes, extenders
used for preservation of fresh boar semen could be prepared to provide an
environment preventing the formation of lipid peroxides. In vibo studies have
shown that the addition of antioxidarits, specinc scavengers or metal
chelators to semen extenders, can irnpmve the sumival and motiiïty of
bovine spermatozoa stored in the liqyid state (Shannon and Curson, 1982).
as well as the abüiw of human spermatozoa to penetrate oocytes (Jones et
al., 1978). There has ban evidence of a protective role of vitamin E and
reduced glutathione (GSH) agaïnst fatty acid peroxidation in boar semen
(Brzezinska et al., 1995). Supplementary vitamin E (oral a- tocopherol
acetate 1000/IU/d) to the boar's diet signincantiy increased the number of
spermatozoa per ml of ejaculate-
In the present study some antioxidants (superoxide dismutase (SOD),
butylated hydroxytoluene (BHT), vitamin C, catalase (CAT) and (GSH) were
compared as additives to the BTS extender for their effect on sperm motility,
survival and in d o fertilization potential after liquid storage of porcine
semen for up to five days.
3.3 Materiaï and methods
Semen was obtained fkom commercial b a r s at the Centre
d'insémination porcine du Québec inc. (CIPQ: Exp.1) and from two bars
collected twice weekly at the animal facilities of Laval University (Exp. 2 and
3 1.
After a visual evaluation of semen motility and abnonnaiities, semen to
be used, was selected and diluted in BTS (1: 10) at a final concentration of 40
x 106 spermatozoa.ml-1. Antioxidants (catalase, GSH, SOD, BHT (Sigma))
were added to the extender BTS (CIPQ) thus exposing the spermatozoa to the
chernicals before storage (see 3 -3.4 for details of antioxidant concentrations).
Aiïquots of 10 ml of semen, with and without antioxydants, were stond at
16OC with a s u t agitationt twia M y to resuspend the sperm cells.
Percentage of motile spermatozoa was assessed under a phase contrast
microscope at a magnifîcation 100 X Evaluation was done on a warm stage
at 37°C. Percentage of live sperm ceUs was determined with eosin-negrosin at
a dye content of 91% eosin (Aldrich) nigrosin (Sigma). The eosin component
of these stain penetrates the ïnjured ceU membranes causing the ceïi to
become pink. Sperm cells with intact membranes appear white against the
dark background provided by nigrosin. A &op of semen was mixed with two
drops of the stain and smears were made with a slide, viabilitty dcuiated by
considering spermatozoa stained as dead and not stained as alive (Pursel
and Johnson, 1972)
In vitro maturation and fertïiization was done according to the
technique of Sirard et al. (1993). Briefly, ovaries were collected nom a local
slaughterhouse and kept in saline (NaCl 9Y0) at 30°C to 37.C with
antibiotics: peniciîline 100000 U - 1 , streptomycin 100 mg/ .L-1 and
amphotericin B 250 pg /.L-1 (Sigma). Cumulus-oocyte complexes were
removed fkom 1 to 5 mm follicles using a 10 ml syringe with an 18-0 needle.
After washing 3 times in Hepes-buffered mode ' s medium ( TLH ; Bavister et
al. 1981) and once in the maturation medium (TCMI99 vith Earleh salts
(Gibco) supplemented with Hepes (Sigma), 10% fetal calf serum (FCS), 0.2
mM pyruvate (Sigma), 50 &.ml-' gentamicin, 1 pg/.ml-1 p-FSH (Shering
Canada Inc.), Sfl/.ml-1 LH (Nationai Institutc of Dîabetes and Digestive and
Kidney Diseases)), oocytes with a compact and complete cumulus were
transfered to microdroplets of maturation medium (10 oocytes f S O d droplet),
covered with mineral oil, and hcubated at 39°C under 5% CO2 in aVI
Diluted fkesh semen was washed *ce in saline and once in preincubation
medium (TCM-199 with Earle's salts supplemented with 3.05 mM glucose,
2.92 mM Ca-Lactate (Sigma), 10% FCS, 0.2 mM pyruvate, and 50 pgf.ml-1
gentamicin (Sigma). Concentration of motile spermatozoa was adjusted to
1.25 x 106/d. m e r culture, cumulus-expanded oocytes were randomly
aliocated to 48 pl fertilization medium, f e m t i o n medium was the same as
the preincubation medium but e ~ c h e d with 2 mM d e i n e (Sigma).
In vitro fertilization was accomplished in 50 J droplets of fertilization
medium containing five oocytes previously washed (twice) for 5 minutes in
this medium. The fertilization medium was the same as the preincubation
one but enriched with 2 mM caffeine (Sigma); 2 pl of semen was added to the
droplets and cultured under oil at 39'C in 5% CO2 in air. Eighteen hours
after insemination, presumptive zygotes were fked and stained with 1?40
aceto-orcein, and examined under light microscope at magnification of 200 X
for the presence of male, female or both pronuclei, two polar bodies, and
sperm heads (Ding and Foxcroft, 1992).
Three experiments were done to study the effect of some antioxidants.
In Exp. 1, SOD (500 IU/ .mi-'), vitamin C (0.28 mM) and BHT (0.5 mM) were
added to the extender BTS, before mixing BTS with the semen. Semen was
preserved at 16OC for 2 days (Exp. 1A) or 5 days (Exp. 1B) before quality
assessment. For Exp lB, semen was kept at 16OC for five days and quality
was also assessed on the third and last days of consemation. In Exp.2,
cataiase (1000 N/.ml-l), GSH (1.0 mM) and BHT (0.5 mM) were added to
BTS before difution and semen was preserved for five days kfore qyaîity
assessment In Exp. 3, different concentrations of BHT (0.12 mM, 0.25 mM.
0.50 mM, 1.0 mM) were added to BTS before dilution and semen was
preserved for five days before q d t y assessment.
To evaluate the effect of treatments and storage tirne, the repeated
measurements procedure of the General Linear Mode1 (GLM) of SAS (1985)
was performed using storage times as mpeated measures. Treatment enects
were compared using a Duncan multiple cornparison test (SAS, 1985).
In Exp. lA, N= 7 and 481 ovas were used to evaluate fecondation. In
Exp. lB, N= 6 and 475 ovas was used to evaiuate fecondation. In Exp.2 and
Exp.3, N= 8.
Although, for both trials in Exp.1, then was a tendency for BHT and
SOD to give better conservation results, and for vitamin C to give results
Iower than the control, no ciifference @( 0.05) was found between groups
after 2 days (Fig. 3.1 A-B ) and 5 days (Fig. 3.2 A-B) of conservation for both
percentages of live and motile sperm cells. However, BHT and vitamin C
treatments were significantly ditferent from one another @< 0.05) for both
quality measurements. The detrimental effect of vitamiri C on motility was
evident as early as after two days of storage for the motility results.
Results nom in Mtro fertilization (Fig.3.3). partly confumed the semen
quaiity assessrnent There was some advantage of using BHT but detrimental
effects with SOD and vitamin C on the percentage of oocytes fertilized h vitra
compared to the control. However, trcatments were not signincantly dinerent
h m the controL on day 2 and day 5 of conservation @>O.OS)
Because resultg fkom m vitro fertilization and motility assessment were
similar, it was decided to use only motility and sumival in the next
experiments to evaluate effects of treatments.
In Exp. 2, the motility of spermatozoa was numerically ktter in the
presence of antioxidants than for the control (Fig. 3.4 A ) but dinerences
were not significant @>O.OS). No ciifference was found between treatments
(p0.05) for the survival of spermatozoa (Fig. 3.4 B ).
In Exp. 3, number of motiie spermatozoa and live spermatozoa were
slightly higher than the controls with concentrations of BHT of 0.12, 0.25
and 0.50 mM but lower at a concentration of 1.0 mM. The detrimentai effect
of BHT at a concentration 1.0 mM was evident for both motility and sumival
of spermatozoa after three and five days of storage (Fig. 3.5). Differences
between treatments were not significant @> 0.05).
DAYS OF CONSERVATION
Fig. 3.1 Effect of the addiaon of antioxidants to boar semen extended in BTS at a concentration of 40 X 1 o6 spem cells.mrl, on the motility (A) and survival (B) after storage at 1 e0C for 2 days. BHT: butylated hydroxytoluene.0.50 mM. SOD: superoxide dismutase. 500 Ullml; VI. C: ascorbic acid, 0.28 mM.
A (n=7, SEM= 3.18. no signifiant difference, P*0.05) B (n=7, SEM= 1.95, no significant difference, PsO.05)
days of conservation
Fig. 3.2 Effect of the addition of antioxidants to boar semen extended in BTS at a concentration of 40 X 1 o6 sperm cells.mrl. on the motility (B) and survival (A) after storage at 16OC. BHT Sutylated hydroxytoluene, 0.50 mM;SOD: superoxïde dismutase. 500 Ullml; Vit.C: ascorbic acid, 0.28 mM. A (n=6, S E M-3.44 signifiint difference. P*0.05) B (n=6, S E M=2.65 no signif'icant difference, P~0.05)
BHT ViC
N=128 N=124 N=12l N=122
Fig. 3.3 Effect of the addition of antioxiâants to boat semen extended in BTS at a concentration of 40 X 1 o6 spem cells.mrl, on in vitro feftilkaüon of 976 ovas after storage at 16OC for 2 days (A) and 5 days (B). BHT: butyiated hydroxytoluene 0.05 mM.; SOD: superoxide dismutase, 500 Ullml; Vit C: ascorbic acid, 0.28 mM A (SEM=8.92. no signifiint difference, Ps0.05) B (sEM~9.34, no signifint difference, P>0.05)
Fig -3.4 Effect of the addition of antioxidants to boar semen extended in BTS at a concentration of 40 X 10' cells.mrl, on the motiiïi (A) and survival
(B) after storage at 16OC during 5 days. BHT: butyfated hydroxytoluene, 0.50 mM; catalase:lO 000 Ullml, glutathione:l mM. A (n=8 SEM-3.29, no signifiant difference P>0.05). B (n=8 SEM=2.32, no signifiant difference P>0.05).
-contrd
--*-- catalase
-BHT
+9 -GCuWhTone
60
8 z:: g 4s
40
--
- - r
O 3 5 d- of conservation
days of conservation
Fig. 3.5 Effect of the addition of different concentrations of BHT: butylated hydroxytoluene to boar semen ewtended in BTS at a concentration of 40 X 10' spem cells.rnrl, on the motifity (A) and survival (B) a€ter stomge at 16OC. for 5 days. A (n=8, SEM=3.15. signirkant difference, P>O.OS). 8 (n=8, SEM=2.6, significant difference, P>0.05).
Many antioxidants have ken tcsted to reduce pemm'dation in various
biological systems. These indude metal chelators, such as ethy1enediamid
tetracetic acid (EDTA*. Milonanov et al., 1976, cited by Maxwell and Stojanov,
1996) and desferal (Vishwanath et ai., 1992) and dinct scavengers of
reactive oxygene species (ROS) such as BHT (Hammerstedt et al., 1976).
vitamin E (a- tocopherol; Kasymov and Ashimov 1975, cited by Maxwell et
Stojanov, 1996 ) and GSH, However, there has k e n v e q littie work involving
liquid storage of boat semen with antioxidants.
In the present study, the effects of SOD, BHT, vitamin C, catalase and
GSH were examuied, Results of the two first trials with BHT are in
agreement with those of Renard et al. (1994). who reported that adding
antioxidants to spermatozoa did not improve the motility after six days of
conservation, with the exception of bovine senim albumin (BSA) which
seems to have protective effects (Alvarez and Storey, 1983). such as
inactivating products of spenn and bacterial metabolism. Malonyldialdehyde
(MDA), a product of lipid peroxidation, was not increased and the percentage
of polyunsatured f a q acids (PUFA) did not change &er six days of storage
possibly indicating that fkesh semen undergoes relatively Little oxidative
damages when stond at 16OC (Renard et ai., 1994).
In the present experiment, the percentage of survival after five days in
storage with vitamin C was only about 68 % and lower than the control. It is
diffcult to attribute this effect to damage of the membranes since the total or
percentage of PUFA and the integrity of the acmsomal membranes were not
measured. A possible exphnation for the detrimental effect of vitamin C
might be a decrease in the pH of the solution. However, no ciifference in pH
was found with or without vitamin C (data not shown). Alternately, as
reported by Miller and Aust (1989). ascorbic acid may act as a pro-oxîdant
instead of an antioxidant at Iow concentrations and the pro-oxïâant effit of
ascorbate is rehted to its ab- to promott the formaton of a proposcd
Fe(lI):FeO complex and not due to oxygen radicai production. It appears
that the concentrations and the subceliuiar distribution are important in
deterrnining the mtioxidant or pro-oxidant fiinctions of ascorbic acid (Chhg
K. 1988). Therefore, it is possible that the concentration used in the pnsent
experiment was too low.
Because BHT gave conservation results that were slightly better than
for the other treatments in Experiment 1, it was decided to determine the
optimal concentration in the media. None of the concentrations used
improved conservation signincantly more than the control. Numeridy, the
best results were obtained with 0.12 and 0.25 mM. However at 1.0 mM,
there was a detrimental effect of BHT on sperm motility and sumival. BHT is
an hydrophobie molecule readily pemeating the sperm plasma membrane
and disrupting a number of membrane-dependent h t i o n s (Aitken et al.,
1989). It could therefore become toxk at high concentrations.
In vitro fertilization results were not signiiïcantly affkcted by
antioxidants, even for the treatment with vitamin C, that gave the lowest
motility. It seems that the concentration of motile sperm ceils used for iit
&O fertilization was sf ic ient to obtain maximum fertilization. AIso, the
medium used for fertilization contained cafEeine which stimulated motility.
CafTeine was not added to the medium during motility assessment.
A possible reason why antioxydants did not improve sperm motility
and surtrival is that semen was extended in BTS. This extender contains
EDTA (ethylenediaminetetra-acetate) as a protector against lipid peroxidation
and the possible amount of ROS generated by death or non motile sperm
ceUs or by an anaerobic environment, might not have been high enough to
saturate the EDTA (F'uhrman et al., 1990). This could be accentuated by the
fact that semen was kept at 16OC , which Iowers the metabolic pmcesses.
Boar semen has little catalase, but some SOD and GSH. Therefon, it
contains factors that reduce peroxidation of plasrnalogens, poiyunsatured
fatty acids and palmitaldehyde. and the formation of toxïc compounds
destroying the fertilizing capacity of spr~tozoa @nezinska et al., 1995).
Seasonal effects have been observed when the peroxidation of lipids in
boar was triggered by ferrous-ascorbate (Jones and Mann, 1977). There was
seasonai variations in ttie sensitivïty of semen to lipid peroxidation, which
was higher in winter and lower in spring. A high occurrence of spontaneous
lipid peroxidation in boar semen is seen both in the seminal plasma and in
the spermatozoon (Strzezek and al., 1992 cited by Brzezinska et al., 1995).
The present study was conducted during spring, summer and fidi seasons. I t
is possible that the sensitivity to Lipid peroxidation was lower during that
time and an effect of an addition of antioxidants was not clearly noticeable.
Furthet research is requirrd during 0th- seasons, with different
extenders and at merent concentrations to determine whether the presence
of antioxidants can improve motility, sumivai and fertiiity a h r long term
storage of boar semen. It would be important to test antioxidants in
situations more detrimental to sperm cells, such as higher temperatures.
Combinations of antioxydants could also give better results. Aithough, the
addition of BHT to the semen extender did not improve signüicantly the
fertility. motility and survival of the spermatozoa, the antiviral propexties
mentioned by Snipes et al. (1975) may prove to be a beneficial application for
the AI industry. At last, it is possible that, even though no effect was
observed in vitro, antioxidants could improve AI results in vivo.
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Les expériences réalisées dans le cadre de cette étude nous amènent
aux conclusions suivants:
1- L'addition de la giutathione réduit, de la catdase ou de la superoxide
dismutase a la semence porcine diluée dans le BTS n'améliore pas de
façon signüicative la motilité et la viabilité des spermatozoïdes, pour
de la semence conservée naîche sur 5 jours, à 160C.
2- La vitamine C, à une concentration de 0.28 mM, a un effet négatif
significatif sur la motilité et la viabilité des spermatozoides, pour la
semence porcine diluée dans le BTS et consemée en frais à 160C, sur 5
jours.
3- L'addition de L'anti-oxydant hydroxytoluène butylé (BHT) a la semence
fiaiche porcine diluée dans le BTS à des concentrations entre 0,12 mM
et 0,50 mM, augmente légèrement la motilité et la survie des
spermatozoides après 5 jours de conservation à 160C, mais de façon
non significative.
4- Le BHT, à une concentration de 1,O mM, a un effet négatif sur la
motilité et viabilité des spermatou>i:des, pour la semence porcine
diluée dans le BTS et conservée en frais à 16OC sur 5 jours.
En générai les résultats obtenus confirment en bonne partie ceux de
Renard et al. (1994) qui ne rapportaient pas dSeEets simiificatifs de divers
antioxydants aprës une conservation de 6 jours. Ces chercheurs avaient
aussi mesuré la dégradation de la membrane des spermatozoïdes après six
jours de conservation et les analyses biochimiques n'avaient pas montré de
modifications de la composition de la membrane en fonction des anti-
oxydants ajoutés. Ils en conclurent que la perte normale et progressive de
motilité des spermatozoïdes pendant la consemation n'est pas due à la
dégradation des phospholipides de la membrane.
Plus de recherches avec les anti-oxydants sont nécessaires dans
différentes conditions, entre autres selon les saisons, les verrats et les
concentrations d'anti-oxydants. Il serait aussi intéressant d'évaluer l'effet de
certains anti-oxydants, comme la vitamine E et la vitamine C, mais ajoutés à
l'alimentation.
L'utilisation de BHT dans l'industrie de l'insémination artificielle
pourrait être recommandée, par sa légère amélioration de la motilité des
spermatozoides après cinq jours de consemation et ses propriétés antivirales.
Toutefois, des essais de fécondité en élevages devraient être effectués au
préalable.
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