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Essai de mise en évidence d'une activité protéolytique d'origine intracellulaire chez Aeromonas hydrophila LP 50

FRANCOISE DENIS ET LOUISE VEILLET-PONCET Laboratoire de Microbiologie Alimentaire, I.N .P.L. - E .N .S.A .I.A., 32, rup Sainte Catherine, 54000 Nancy, France

Approuvé le 4 juin 1984

DENIS, F., et L. VEILLET-PONCET. 1984. Essai de mise en évidence d'une activité protéolytique d'origine intracellulaire chez Aerornonas hydrophila LP 50. Can. J. Microbiol. 30: 1 190- 1 192.

Aeromonas hydrophila LP 50, isolée de lait pasteurisé conditionné, est cultivée sur milieu à la polypeptone glucosé, à 30°C. Son activité protéolytique, optirnum au cours de la phase stationnaire de croissance, est imputé à des protéases extracellulaires ou de membrane, aucune activité protéolytique d'origine intracellulaire n'ayant pu être mise en évidence.

DENIS, F., and L. VEILLET-PONCET. 1984. Essai de mise en évidence d'une activité protéolytique d'origine intracellulaire chez Aeromonas hydrophila LP 50. Can. J. Microbiol. 30: 1 190- 1 192.

Aeromonas lzy~irophila LP 50, isolated froni packaged paateurized milk, wüs grown in glucose-polypeptone medium at 30°C. The proteolytic activity of A. hydrophila LP 50, optimum at the stationary phase of growth, is attributed to extracellular or membrane protease; no intracellular proteolytic activity was shown.

Aeromonas hydrophila , utile indicateur de pollution, pathogène connu des animaux à sang froid, et path- ogène potentiel pour l'homme, suscite un intérêt grandissant.

Cette bactérie élabore une variété de facteurs extra- cellulaires, associés ou non à la virulence bactérienne, entérotoxines, cytotoxines, hémolysines, protéases, lécithinases, lipases, nucléases, amylases et élastase.

Devant l'importante aptitude a la protéolyse d'A. hydrophila LP 50, isolée de Lait pasteurisé conditionné (Veillet-Poncet 1973), il nous a paru digne d'intérêt d'approfondir l'étude de son équipement enzymatique protéolytique extracellulaire (Denis et Veillet-Poncet 1979, 1980).

Peu de données concernent, en fait, la production, la nature et les propriétés des protéases de l'espèce A.

hydrophila (Gross et Coles 1969; Riddle et al. 198 1 ; Allan et Stevenson 198 1 ; Thune et al. 1982; O'Reilly et Day 1983).

Nous nous proposons, dans le présent travail, de déterminer s'il y a une ou des activités protéolytiques d'origine intracellulaire, chez A. hydrophila LP 50, lors de l'optimum des activités endopeptidasique et amino- peptidasique extracellulaires, mises en évidence dans nos précédents travaux.

Notons que les protéases intracellulaires, tant d'A. hydrophila que de tout autre Aeromonas, n'ont encore fait l'objet que de peu d'étude (O'Reilly et Day 1983).

La culture d'A. hydrophila LP 50, est réalisée, sans agitation, sur milieu à base de polypeptone (B.D. Mérieux, communication personnelle (20 g de 1.a source azotée pour 1 L d'eau distillée)), glucosé à l o b , réparti

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sous un volume de 1 L en fioles Erlenmeyer de 2 L, et maintenue à 30°C (température optimum de croissance d'A. hydrophila LP 50).

L'ensemencement des cultures se fait par addition de 4 mL, par fiole, d'une suspension bactérienne en eau physiologique provenant d'une culture de 18 h sur mi- lieu gélosé nutritif enrichi incliné à 30°C. L7ensemence- ment est de l'ordre de 2 x 10' bactéries.

Après 36 h d'incubation, milieu de la phase station- naire de croissance, les cultures sont centrifugées à 14500 x g pendant 25 min à 5°C; le surnageant et le culot bactérien sont conservés.

L'extrait enzymatique extracellulaire est préparé par précipitation, au sulfate d'ammonium, du surna- geant de culture, à 50% de saturation. Cette prépara- tion, maintenue à 5°C pendant 15 h, est centrifugée à 30000 x g pendant 30 min, à 5°C. Le dépôt obtenu est remis en solution dans un minimum de tampon véronal (0,05 M, pH 8,5), puis dialysé 24 h, contre ce même tampon, à 5"C, avec renouvellement.

Les cellules bactériennes, lavées deux fois à l'eau physiologique, sont remises en suspension dans un volume de tampon véronal(0,05 M, pH 8,5) correspon- dant au 0,05 du volume de la culture initiale. Elles subissent ensuite un traitement aux ultra-sons dans un appareil M. S .E. (type MK 2) à 5"C, pour une fréquence de 24 KHz. La suspension cellulaire est centrifugée à 30000 X g pendant 25 min à 5°C. Le surnageant recueilli est précipité au sulfate d'ammonium, à 50% de saturation, centrifugé, puis dialysé, comme décrit au point précédent. Le dialysat constitue l'extrait enzyma- tique intracellulaire.

L' activité endopeptidasique est mesurée, par une modification de la méthode de Charney et Tomarelli ( 1947), sur azocaséine (Serva): 1 mL d'une solution d'azocaséine à 1% en tampon Tris-HC1(0,2 M, pH 8) est ajouté à 1 mL d'extrait enzymatique ou de sa dilu- tion. Après incubation à 40°C pendant 30 min, la réac- tion est arrêtée par addition de 2,5 mL d'acide trichlor- acétique à 5%. Après filtration du mélange sur papier Whatman No 3, 1,5 mL de filtrat est ajouté à 1,5 mL de NaOH (0,5 N). La teneur en produits solubles du filtrat trichloracétique est mesurée par la variation d'absor- bance à 440 nm, à l'aide d'un spectrophotomètre Beckman Acta 11. L'unité d'activité endopeptidasique est arbitrairement définie comine la variation de 0,01 unité d'absorbance dans les conditions décrites ci-dessus.

L'activité aminopeptidasique est évaluee par mesure du taux d'hydrolyse de la L-leucine-paranitroanilide (LNA) (Serva). Le mélange réactionnel a la composi- tion suivante: 0,2 mL de LNA en solution dans le méthanol (0,2%), 1,3 mL de tampon véronal (0,05 M , pH 8,5), 1 mL d'extrait enzymatique ou de sa dilution. Le mélange est porté à 50°C pendant 30 min. La réac-

FIG. 1 . Elaboration des activités endopeptidasique et ami- nopeptidasique extracellulaires d'A. h~7drophila LP 50, en fonction du développement de la culture dans le temps. La croissance (*) sur milieu à la polypeptone glucosé, à 30°C, est déterminée par numération des cellules bactériennes viables (N = nombre de bactéries par millilitre). Les activités endopeptidasique (O) et arninopeptidasique (A) des extraits enzymatiques bruts extracellulaires sont dosées selon le pro- cédé décrit dans le texte.

tion est arrêtée par addition de 1 mL d'acide perchlori- que dilué (17,5 mL d'HC104 à 7% completés à 100 mb, avec de l'eau distillée). La variation d'absorbance du mélange est mesurée à 410 nm. L'activité aminopepti- dasique est exprimée en microgramme de nitroaniline libéré par millilitre d'extrait enzymatique, en 1 min, par référence à une courbe-étalon de 3-nitroaniline (Merck) .

Nous reportons (Fig. 1) l'évolution des activités en- dopeptidasique et aminopeptidasique extracellulaires, mises en évidence chez A. hydrophilu LP 50, en fonc- tion du développement de la culture dans le temps (Denis et Veillet-Poncet 1979, 1980). La cinétique d'apparition des deux types d'activités révèle qu'elles se manifestent dès le début de la croissance et que leur optimum se situe au milieu de la phase stationnaire, c'est-à-dire 36 h après la mise en culture. Ces activités sont dues principalement à des exoprotéines périplasmi- ques. Toutefois, nous ne pouvions omettre, à ce temps de culture, la présence éventuelle de protéases intracel- lulaires, libérées par lyse bactérienne.

Au cours des quatre essais effectués dans ce travail, et dans nos conditions d'expériences, aucune activité protéolytique d'origine intracellulaire n'a pu être mise en évidence, à ce temps de culture. Nous noterons, toutefois, que les substrats utilisés pour cette mise en évidence d'une activité protéolytique d'origine intra- cellulaire sont, respectivement, l'azocaséine et la

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L-leucine-paranitroanilide, par référence à nos travaux antérieurs (Denis et Veillet-Poncet 1979, 1980), ce qui n'exclut donc pas totalement le fait qu'il puisse y avoir d'autres activités protéolytiques d'origine intracellu- laire, actives sur d'autres substrats. Nous portons le temps d'incubation du mélange réactionnel de re- cherche des deux activités, de 30 min à 2 h. L'activité endopeptidasique intracellulaire représente, alors, le 0,0005 de la valeur de l'activité endopeptidasique ex- tracellulaire, libérée à 36 h d'incubation. Quant à l'activité aminopeptidasique intracellulaire, elle est le 0,004 de l'activité aminopeptidasique extracellulaire.

Nous pouvons donc considérer comme négligeable la présence de protéases intracellulaires, au niveau du sur- nageant de culture. Ceci concorde avec l'étude d'O'Reilly et Day (1983) qui ne trouvent pas d'activité protéolytique d'origine intracellulaire chez A. hydro- phila, pendant toute ou majeure partie de la courbe de croissance de cette souche.

L'activité protéolytique d'A. hydrophila LP 50, maximum au cours de la phase stationnaire de crois- sance, n'est donc imputable qu'à des protéases extra- cellulaires (Pollock 1962), dites exoprotéines péri- plasmiques, synthétisées sur les ribosomes liés à la membrane cellulaire (Glenn 1976), et dont la sécretion, au travers ou autour de la membrane externe, pourrait être rattachée à l'élaboration, par Aeromonas sp., de "bulles" ou fragments membranaires (Mac Intyre et al. 1980).

L'apparition, d'autre part, en moins de 24 h, d'une zone translucide (D = 8 mm) autour des colonies d'A. hydrophila LP 50, cultivé sur gélose au lait et sur milieu au caséinate de Ca-agar, traduit bien une dégradation de la caséine par des protéases de membrane.

Cette activité protéolytique extracellulaire, optimum à 36 h d'incubation, est, tout à fait, comparable aux résultats décrits par Allan et Stevenson (1981), et Riddle et al. ( 198 1). Allan et Stevenson (198 1) détermi- nent, ' chez trois souches d'A. Izydrophila isolées de poissons, une activité protéolytique extracellulaire ap- paraissant après 10 h de culture, et atteignant son max- imum à 35 h. Riddle et al. ( 198 1) mettent en évidence

une accumulation de protéase extracellulaire, s'accrois- sant de 20 à 37 h, pour une souche d'A. hydrophila, isolée d'une grenouille. Ces auteurs ne font, en aucun cas, mention d'une quelconque activité protéolytique d'origine intracellulaire.

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