This article was downloaded by: [University of Strathclyde]On: 15 October 2014, At: 03:01Publisher: Taylor & FrancisInforma Ltd Registered in England and Wales Registered Number: 1072954Registered office: Mortimer House, 37-41 Mortimer Street, London W1T 3JH,UK

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Etats nucléaires etdédifférenciation des tissusséminaux de Pisum sativum etde Lupinus albusJoelle Bercetche a , Dominique Chriqui a , Marie-Françoise Legal b , Valérie Neyraud b , MichèleLecocq b & Jean-Noël Hallet ba Université Pierre et Marie Curie, LaboratoireCEMV , bât. N2, 4 place Jussieu, F-75252 , ParisCedex 05b Université de Nantes, Laboratoire de Biologievégétale et Biotechnologie , 2 rue de la Houssinière,F-44072 , Nantes Cedex 03Published online: 27 Apr 2013.

To cite this article: Joelle Bercetche , Dominique Chriqui , Marie-FrançoiseLegal , Valérie Neyraud , Michèle Lecocq & Jean-Noël Hallet (1993) Etatsnucléaires et dédifférenciation des tissus séminaux de Pisum sativum et deLupinus albus , Acta Botanica Gallica: Botany Letters, 140:6, 703-706, DOI:10.1080/12538078.1993.10515650

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Acta bot. Gallica, 1993, 140 (6), 703-706.

Etats nucleaires et dedifferenciation des tissus seminaux de Pisum sativum et de Lupinus albus

par Joelle Bercetche (1), Dominique Chriqui (1), Marie-Franc;oise Legal (2), Valerie Neyraud (2), Michele Lecocq (2) et Jean-Noel Hallet (2)

(') Universite Pierre et Marie Curie, Laboratoire CEMV, bat. N2, 4 place )ussieu, F-75252 Paris Cedex 05 (') Universile de Nantes, Laboratoire de Biologie vegetale et Biotechnologie, 2 rue de Ia Houssiniere, F-44072 Nantes Cedex 03

Les Ugumineuses a "grosses graines" res­tent tres souvent relractaires aux tentatives de regeneration de structures organisees par cul­ture in vitro, seules certaines regions emhryon­naires immatures etant parfois capables de conduire a une emhryogenese somatique. Une attention particuliere a ete portee aux etats nucleaires initiaux de differents territoires des graines matures de Pisum sativum (cvs. "nain hatif d'Annonay", Cameor et Amino) et de Lu­pinus albus (cvs. Lucky et Kalina) ainsi qu'au devenir de ces noy;mx apres passage in vitro. Pour les deux modeles, une forte endopoly­plo"idie (de 8 a 128 C) caracterise le parenchyme des cotyledons (Legal et al., 1984 ; Legal et al., 1986). Les zones sous-epidermiques (abaxiale et adaxiale pour le Lupin, abaxiale pour le Pois) demeurent cependant moins po­lyplo"ides (8 C et 16 C) que les regions plus in­ternes. Des teneurs en ADN de 2 C a 16 C sont egalement rencontrees dans l'epicotyle des grai­nes de Pois (Chriqui et Bercetche, 1985). Tan­dis que Ia structure nucleaire du Lupin est ty­piquement diffuse a chromocentres (Fig. 1a), celle du Pois est de type chromonematique re­ticulee (Fig. 1b) avec une repartition frequem­ment inegale de Ia chromatine condensee que met clairement en evidence !'analyse microspec­trophotometrique a balayage (Fig. 2). La mise en culture in vitro de cotyledons excises de Lupin sur milieu de Mitchell et Gildow addi­tionne de 2,4-D (0,5 a 2 mg.l·1) s'accompagne d'une poursuite de l'endopolyplo"idisation (Fig. 3) et seul le parenchyme sous-epidermi­que abaxial s'avere capable d'une activite pro­liferatrice conduisant parfois a un cal non or­ganogene (Neyraud, 1984). Dans le cas du Pois,

©Societe botanique de France 1993. ISSN (en cours).

Ia culture in vitro de fragments d'epicotyles is­sus de germinations de trois jours sur milieu B5 de Gamhorg contenant 5 mg.!·• de 2,4-D conduit aussi a une poursuite de l'endopoly­plo"idie (Bercetche, 1987). La teneur en ADN des noyaux, initialement repartie de 4 c a 8 c, passe en 21 jours de culture de 8 c a 16 c. 10 % seulement des explants d'epicotyles sont capables de regenerer des cals porteurs de bourgeons. Ces bourgeons sont, le plus sou­vent, de phenotype teratologique et appeles a degenerer. Leur evolution en bourgeons feuilles normaux est tres rare (Bercetche, 1987).

La succession des evenements qui president a Ia reactivation ceUulaire a ete suivie chez le Pois pendant les deux premiers jours de mise en culture (Fig. 4). La dedifferenciation debute, des Ia 5eme heure, par des fragmentations nu­cleaires tandis que Ia reprise des replications de l'ADN et de l'activite mitotique n'intervient que plus tardivement. La fragmentation nu­cleaire peut etre egale ou inegale, simple ou multiple (Fig. 5 et 6). Ce processus amitotique, qui survient pour des noyaux dont Ia chroma­tine condensee est spatialement repartie de fa­c;on heterogene (Fig. 1b), conduit frequemment a Ia formation de cellules aneuplo"ides. De tel­lea fragmentations ont deja ete observees dans d'autres situations de culture in vitro (Nuti Ronchi et al., 1973 ; Brossard, 1975), mais elles se doublent, dans le cas du Pois, d'une repartition heterogene de l'heterochromatine, ce qui ne peut qu'amplifier l'aneuplo"idie. Ces comportements nucleaires atypiques pourraient etre responsables des difficultes rencontrees chez le Pois pour realiser, a partir des tissus seminaux matures, une caulogenese organisee.

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BIBLIOGRAPHIE

Bercetche J., 1987.· Effets rhizogenes exerces par l'Agro­bactarium rhizoganas chez Je pois : reorientations cellu­laires et morphogenetiques. ThBsa. Univ. P. et M. Curie.

Brossard D., 1975.- La neoformation de bourgeons vegetatifs a partir de Ia moelle du tabac (Nicotiana tabacum L., var. Wisconsin 38) cultive in vitro. Analyse cytochimique, his· toradiographique at cytophotometrique. Ann. Sci. Nat., 12e ser., 16 (1), 43-149.

Chriqui D. & J. Bercetche, 1985.- Facteurs hormonaux et phenomenes amitotiques dans les explants vegetaux cul­tives in vitro. Bull. Soc. bot. Fr., 132 (314 ), Actual. bot.,152.

Legal M.F., F.M. Lecocq & J.N. Hallet, 1986.- The reserve proteins in the cells of mature cotyledons of Lupinus albus var. Lucky. II . Relationship with the nuclear DNA content. Protoplasms, 130, 128-137.

Neyraud V., 1984.- Le contenu en DNA nucleaire des cellu· les cotyledonnaires de Lupinus albus var. Kalina. Modifi­cations consecutives a Ia germination et au maintien en culture in vitro. DEA Bioi. veg. appl. & Sci. agro-alim., Univ. Nantes.

Nuti Ronchi V., A. Bennie! & G. Martini, 1973.- Nuclear frag­mentation in dedifferentiating cells of Nicotiana glauca pith tissue grown In vitro. Cell 0/ffarentiat/on, 2, n -86.

F"~g. 1.- Noyaux cotyfedonalres de Luplnus a/bus, 1 a, et de Plsum satlvum, 1 b, observes en fluorescence apres colora don par le Hoechst 33258, intercalant specifique des bases A-T. Remarquer Ia structure typiquement chromocentrique du Lupin, 1a (G x 980) et Ia repartition inegate de Ia chromatine dense chez le Pois, 1b (G x 840).

Fig. 2.- Analyse en microspectrophotometrie a balayage de Ia texture d'extinction de Ia chromatine des noyaux de l'epicotyle embryonnaire de Pisum sativum apres coloration par Ia reaction de Feulgen. Fig. 2a et 2b.· Les histogram mas correspon­dent a Ia distribution des valeurs d'extinction ponctuelles de Ia surface cytophotometree (encarts rectangulaires). Le choix d'un seuil d'extinction approprie (regions Feulgen·positives) permet de delimiter !'image du noyau saul.

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VI Q> Cl

~ c: Q> ... :; 0 CL

Rg. 4.· Cinetique de Ia reactivation cellulaire au cours des 50 premieres heures de mise en culture in vitro de l'epi­cotyle de Pisum sativum. Les valeurs correspondent aux pourcentages de cellules en mitose, de cellules en phase de replication et de cellules dont les noyaux sont en cours de fragmentation (Frag. nucl.).

Fig. 4.· Kinetics of cell reactivation during the 50 first hours of in vitro culture of· Pisum sativum excised epicotyls. The curves present the evolution of the percentage of mitoses, of nuclear fragmentations and of nuclei in the S-phase.

Fig. 3.· Distribution de Ia teneur en ADN des noyaux de cotyledons matures (CM) de Lupinus a/bus et de cotyle· dons cultives in vitro (CIV) pendant 9 ]ours. Les valeurs sont exprimees en pourcentages de Ia population nu­cleaire. tous types cellulaires confondus.

Fig. 3.· Nuclear DNA distribution in Lupinus a/bus mature cotyledons (CM) and in excised cotyledons grown in vitro for 9 days (CIV)

.. .. 40

!:30 E 8 ~ 20 &.

10

~ Mllotn ~ Fn1.nud. -tr- RfpiiCIIIIOCI

10 :zo 10 heures

40 "

Rg. 5.· Observation ultrastructurale d'un noyau, N, en cours de fragmentation (fl9che) dans une cellule d'epicotyle de Pois. CO, chromatine dense ; COi, chromatine diffuse ; mi. mitochondria. Fixateur : glutaraldehyde postosmie ; contrastant : acetate d'uranyle-citrate de plomb (G x 5000).

Fig. 5.· Ultrastructure of Pisum epicotyl nucleus, N, in fragmentation. CO, dense chromatin ; COt, diffuse chromatin ; mi. mitochondria. Fixation : glutaraldehyde-OsO, ; poststaining : uranyl acetate-lead citrate (G x 5000).

Fig. 2c et 2d.· Representation tridimensionnelle des valeurs ponctuelles d'extinction des noyaux en lonction du champ cytophotometre (chaque valeur correspond a une plage de 0,25 ~m 2). 2c : noyau ou Ia repartition de Ia chromatine est homogene; 2d: noyau a repartition chromatinienne inegale.

Fig. 1.· Lupinus a/bus ( 1 a) and Pisum sativum ( 1 b) cotyledonary nuclei observed under fluorescence microscopy after Hoechst staining. The nuclear structure is typically chromocentric in Lupinus (1a, G x 980) and the dense chromatin in Pisum (1b, G x 840) is unequally distributed.

Rg. 2.· Scanning microspectrophotometry showing the texture of nuclei in Pisum sativum embryonic epicotyls after Feulgen staining. Fig. 2a and 2b.· Histograms corresponding to the distribution of pinpointed extinction values of analysed areas (inserts). The choice of the appropriate treshold (Feulgen-positive areas) allows the delimitation of individual nuclei. Fig. 2c and 2d.· Three-dimensional representation of pinpointed extinction values of analysed nuclei (each value corresponds to a 0.25 ~m• analysed area). 2c :nucleus with homogeneous chromatin. 2d :nucleus with unequal chromatin clstribution.

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F~g. 6.· Oblervalion en mlcrospec:lr0pho1Dm61rie i balayage de Ia fragmentation nucl6alre des ceDules d'6pk:otyle de Pols apr6s 30 i 48 heures de cuiiUre /n llitro. a et b : noyau antler ; c et d : fragmentation 6gale ; I et g : fragmentation simple ln6gale ; h, I et j : fragmentation multiple. L'6cr6rage des valeurs d'extlnctlon les plus 61ewes (b, g et j) permet une meUieure visualisation des coniDurs du noyau et de sa fragmentation.

F~g. 6.· Scanning microspectrophoiDmetry of nuclear fragmentation of Pisum sativum epk:otyllragments alter 30 ID 48 h of in llilrO culture. a and b : entire nuclei ; c and d : equal fragmentation ; e, I and g : simple and unequal fragmentation ; h, I and j : multiple fragmentation. The splicing of 1he highest extinction values (b, g and j) aUows a bell8r visualization of 1he nucleus outlines and of 1he fragmentation.

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