Laboratoire de Cytologic et Morphogenese vegetales, Universite Pierre et Marie Curie, Paris,France

EtudeCytophotometrique et Histoautoradiographique du DNANucleaire de Cellules d'Erable en Suspension durant laPhaseStationnaire de Croissance

A Cytophotometric and Histoautoradiographic Study of Nuclear DNA ofAcer Cell Suspension Cultures during the Stationary Phase of Growth

JACQUES REMBUR

Avec 4 figures

Recu Ie 20 mai 1976 . Accepre Ie 22 juin 1976

Summary

Nuclear features of a cell suspension culture of Acer pseudoplatanus during the stationaryphase of growth have been determined. Histoautoradiography after incorporation of[3H-methyl]-thymidine and cytophotometry after Feulgen staining show the following:

- A complete absence of nuclear DNA synthesis- No mitotic activity- A heterogeneity in the cell population consisting of 71 Ofo of cells with a 2 C level

of DNA in the G1 phase of a diploid cell cycle, 23.5 Ofo of cells with 4 C in G1 of a tetra­ploid cycle and 5.5 Ofo of cells showing higher than 4 C levels of DNA.

The role of the G1 phase in cells whose cycle is temporarily held over is discussed.

Les caracteristiques nucleaires d'une suspension cellulaire de l'Acer pseudoplatanus enculture in vitro sont etablies durant la phase stationnaire de croissance. Les resultats d'uneetude histoautoradiographique apres incorporation de thymidine tritiee et d'un examencytophotometrique du DNA nucleaire apres coloration selon la reaction de Feulgen revelenr:

- une absence complete de toute synthese de DNA nucleaire ;- une activite mitotique nulle;- une heterogeneite de la population cellulaire constituee de 71 Ofo de cellules a teneur en

DNA 2 C, en phase G1 d'un cycle cellulaire diploide, de 23,5 % de cellules a teneur enDNA 4 C en phase G1 d'un cycle cellulaire tetraploide et de 5,5 Ofo de cellules a teneur enDNA superieure a4 C.

Le role de la phase G[ pour des cellules arretees mornentanemenr dans leur cycle estanalyse.

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Etude cyrophotometrique du DNA nucleaire 103

Introduction

On sait (REMBUR, 1974) que les suspensions cellulaires de l' Acer pseudoplatanusen phase exponentielle de croissance sont des ensembles complexes constitues d'agre­gats cellulaires qui se repartissent en deux populations, 1'une tetraploide, l'autreconstituee principalement de cellules diploides. Une telle suspension en etat decroissance maximale comprend une fraction quiescente d'environ 15 0J0 de cellules.Faisant suite a la phase exponentielle de croissance, une phase de ralentissement dela proliferation est caracterisee par un allongement du temps de doublement quis'accroit progressivement avec I'augmentation de la concentration des cellules. Deslors le problerne se pose de savoir si la baisse du taux de proliferation est due a uneaugmentation de la duree du cycle cellulaire ou a une diminution de la proportiondes cellules qui se divisent.

Pour FRINDEL et al. (1967) un fibrosarcome de Souris, se developpant sous formede tumeur solide, possede une duree de cycle cellulaire identique a toutes les phasesde la croissance tumorale. Par contre, LALA et PATT (1966), etudiant une tumeurascitique d'Ehrlich, mettent en evidence un allongement du cycle concomitant aI'augmentation du nombre de cellules et a la diminution de la fraction en prolife­ration.

Nous avons donc rente de determiner les parametres caracteristiques d'une popula­tion de cellules en suspension de l' Acer pseudoplatanus en etat de croissance nullelors de la phase stationnaire de culture.

Materiel et Methodes d'Etude

Les suspensions cellulaires de l'Acer pseudoplatanus sont cultivees selon une methode dejadecrite (REMBUR 1974). L'ensemencement est effectue a partir de cellules en phase exponen­tielle de culture a raison de 4 . 104 cellules par millilitre de milieu. Les cellules en phaseexponentielle et stationnaire sont prelevees respectivernent au 7eme (2,7 . 105 cellules/ml) etau 30eme jour (3 . 106 cellules/rnl) de la culture.

Des adjonctions de thymidine tritiee (c. E. A. France, activite specifique 4 Ci/mM) sonteffectuecs a partir du 30eme jour de culture, routes les 12 heures, a differentes concentra­tions (0,5, 1, 2 ,uCi/ml). Des cellules sont prelevees apres 1, 2 et 4 heures d'incorporationpuis toutes les 4 heures jusqu'a la 100eme heure.

Les cellules sont fixees par la solution de Carnoy (ethanol, 6 volumes; chloroforrne,3 volumes; acide acerique, 1 volume) durant 4 heures, traitees selon la reaction de Feulgen(acide chlorhydrique 3,3 N a 37°C durant 35 minutes) et etalees sous forme de frottis. Lescellules soumises au precurseur tritie du DNA sont recouvertes d'un film Kodak AR 10 pourhistoautoradiographie. Les preparations sont revelees apres 7, 15 et 30 jours d'expositionen chambre noire a la temperature de 4 0c.

Les preparations destinees a I'etude cytophotornetrique sont traitees en une seule fois selonla reaction de Feulgen, deshydratees et montees dans une resine «Eukitt» (nd = 1,50). Lesnoyaux sont analyses a l'aide d'un cytophotometre MPV Leitz muni d'un monochromateur,de diaphragmes variables et d'un objectif a immersion Leitz (FI Gel 54/0,95), huile a im­mersion Leitz (nd = 1,515).

La methode de PATAU (1952) est utilisee ; les deux longueurs d'onde (495 et 555 nanometres)sont obtenues a partir des courbes d'extinction de noyaux a structure hornogenc. Les teneurs

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en DNA sont exprimees en unites arbitraires (D. A.) et regroupees en histogrammes de fre­quence distributionelle. Les valeurs reperes 2 C, 4 C et 8 C sont deterrninees par l'analysed'environ 100 ~ telophases et prophases dans des cultures en phase exponentielle de crois­sance et selon une methode deja decrite (REMBUR, 1974). Les resultats sont analyses selonles methodes statistiques classiques: droite de Henry, X2 d'ajusternent, methode des ecartsreduits (SCHWARTZ, 1963).

Resultats

1. Caracteristiques de fa courbe de croissance

La courbe de croissance (fig. 1) exprimee en coordonnees semi-Iogarithmiquesmontre que, dans les conditions de culture, une proliferation de type exponentiels'etablit, sans phase de latence. Elle se poursuit durant 14 jours jusqu'a une concentra­tion de 17 . 105 cellules/ml (soit environ 5 doublements de la population). Un declinprogressif de la croissance s'etablit des le Heme jour et jusqu'au 27eme jour, puisun plateau indique que I'augmentation du nombre de cellules est interrompue et

30

20

E-;;;....Ql0x

II) 6~...2Qj4u

CIl"'0

~ 2..0Eor::

o 10 20 30 40..

TlJIFig. 1: Courbe de croissance d'une suspension cellulaire de l'Acer pseudoplatanus, en co­ordonnees semi-logarithmiques. Abscisses: temps d'incubation en jours. Ordonnees: nombresde cellules par millilitre de milieu. 1: phase exponentielle. 2: phase de transition. 3: phasestationnaire, 4: phase de senescence. Flcdies: prelevemcnts effectues en phase exponentielleet en phase stationnaire, respectivement au Seme er au 31eme jour de la culture. Les valeursobservces sont donnees avec leur intervalle de confiance calcule pour un coefficient desecurite de 95 %.

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Etude cy tophotometrique du DNA nucleaire lOS

qu'une phase stationnai re d'une dur ee d'en viron 11 jours precede une phase desenescence, entrairiant un important tau x de mortalite cellulaire.

2. Analy se des distribution s reperes 2 C, 4 C et 8 C dans les suspensions de l' A cerpseudo platanus en pha se exponentielle de croissance

Les teneurs en DNA 2 C, 4 C et 8 C exprim ees en unit es arbitraires, des noyauxtelophasiques et prophasiques sont regroupees en histogrammes de Frequence distr i­butionnelle (fig. 2) selon la methode precedemment exposee ( R EMBUR, 1974). Letableau 1 presente les parametres de ces distributions et les valeurs des x2 d'ajusternenta des distributions normales de meme moyenne et de meme variance. Les histo­grammes correspondant aux teneurs 2 C et 4 C de DNA sont assimilables ades distri­butions normales; pa r centre, la repartition des teneurs en DNA de noyaux «8 C"differe significativement d'un e distribution gaussienne.

Les courbes normales calculees (fig. 2) correspondant aux distributions 2 C, 4 C et8 C sont reportees sur les histogramm es de frequenc e et rnettent en evidence:

F.10

5

15

10

5

o 40 60 80 U.A.

Fig. 2: H isto grammes de Frequ encc dis tributionnelle erablis a part ir de mesures effectueessur des ~ telophases ct des prophases d 'un e pop ulation cellulai re de l' Aeer pseudoplatanusen ph ase exponentielle de croissa nce. Les courbes norm ales calculees a partir des moyenn eset des va ria nces des po pulations reperes de noyau x 2 C (- - 0 - -), 4 C (- - 0 - - ) et 8 C(- - L, - ) sont reportees. Abscisses: teneur en D N A (unites arb itrai res). Or do nnees: [re­qu cnce.

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Tableau 1: Quanrites relatives de DNA, expnmees en unites arbitraires, dans des noyauxtelophasiques et p rophasiques de cellules d' Acer pseudoplatanus en phase exponentielle decroissance pour des cellules diploides et tetraploides. y: nombre de degres de liberte.

Phase de la mitose ~T2n P2n ~T4n P411

Valeur de ploidie · 2 C 4C 4C 8eTeneur moyenne en DNA (U. A.) 13,26 26,94 27,16 51,70Ecart type 2,22 4,07 3,49 9,74Variance 4,93 16,56 12,18 94,87Erreur standard 0,30 0,46 0,58 1,157.2 experimental 2,7 5,1 2,2 61,4

7.2 0,05l ' = 7 l ' = 10 I ' = 10 l' = 24

14,1 18,3 18,3 40,1

- Une correspondance parfaite entre Ies distributions theo riques gaussiennes et Ieshistogrammes 2 C et 4 C;

- Un decalage entre l'histogramme 8 C et Ia courbe de Gauss correspondante.

3. Caracteristiques des cellules en phase stationnaire de culture

L'adjonction rcpetee de thymidine tritiee dans Ie milieu de culture des cellules enphase stationnaire ne permet pas de mettre en evidence des noyaux marques en coursde synthese de DNA, meme apres 100 heurcs de presence du traceur quels quesoient les concentrations ut ilisees et Ie temps d'exposition des histoautoradiographies.

L'index mitotique est nul; en effet, aucune figure de mitose ri'est observee durantla phase stationnaire.

L'histogramme de la figure 3 montre la repartition des teneurs en DNA des noyauxde cellules en phase stationnaire. II presente :

- Un grand etalement des valcurs, de 6 a84 U. A.;- Un aspect dissymetrique avec une extension vers les teneurs en DNA les plus,

elevees;- Un caractere plurimodal avec un mode principal a 12-14 U. A. et un mode

secondaire a 26-28 U. A.Cet histogramme met donc en evidence I'heterogeneite de cette population consti ­

tuee d'au moins deux categories de cellules ateneurs en DN A differentcs.La figure 4 traduit, sur une echelle d'anamorphose, la courbe de frequence curnulee

relative (I) de l'histograrnme precedent. Cette courbe montre deux points d'inflexionB et C qui donnent approxirnativement la proportion de cellules a teneurs en DNAdifferences et qui se situent a71 % et a94,5 0/0.

Le tableau 2 indique la proportion des noyaux dans chaque portion de la courbe I,AB, BC et CD ainsi que les limites de leurs teneurs en DNA.

Chaque point des portions de courbe AB, BC et CD est ensuite rarnene a 100 0/0selon Ia technique de calcul de HARDING (1949). Ainsi, Ies 3 courbes independantesII, III et IV sont obtenues. Les courbes II et III sont lineaires et semblent done obeir

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F.

30

20

10

o

,

II

,

f

o

\\

20 60 80 U.A.

Fig . 3 : Histogramme de fr equ ence distributionnelle montrant la repartition des teneur s enADN des noyau x d'une suspension cellulaire de l'Acer pseudoplatanus en phase stationnairede croissance. Les courbes normales calculees correspondant aux deux populations principales2 C (- - 0 - - ) et 4 C (- - 0 - -) de la cul ture sont figurees, Abscisses: teneur en DNA(unites ar bitraires). Ordonnees: Ir equcncc.

T ableau 2: Frequences rel at ives et limites des teneurs en DNA (D. N.) des noyau xcorrespondant au x 3 segments AB, BC et CD de la cou rbe I de fr equence cumulee relative.

Port ions de la courbe I

0/0 de noyauxLimites des ten eurs en DNA

AB

717- 21

BC

23,521-38

CD

5,538-85

aune loi de distribution normale; par contre, la courbe IV differe d'une droite etindique une population heterogene ,

Des l d'ajustement (tableau 3) ades distributions normales de merne moyenne etde meme variance, des courbes II et III, montrent que les teneu rs en DNA de cespopul ations cellulair es obeissent aune loi gaussienne dont les graphes sont reportessur les histogrammes de la figure 3.

Les deux populations correspondant aux courbes II et III sont comparees respec-

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F.C.R. i-b99 .-._._.-.-./._.

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C _.--"""•......-.-./' ...-",_ ..._...-

90 _I80 / ,/ ..._... _..._..._..._170 i ~/''/ . /

/60II'///' III! .-/

50 I V ,I40

I 1 j

30 j.I

20

! /10 ,I

f /'C." •0 20 40 60 80 U.A.

Fig. 4: I: courbe de frequences cumulees relatives se rapportant a une population cellulairede I'Acer pseudoplatanus en phase stationnaire de croissance. B et C: points d'inflexion.II, III, IV: courbes transforrnees des portions de courbe AB, BC et CD, selon la techniquede HARDING (1949). Abscisses: teneur en DNA (unites arbitraires). Ordonnees: [requencescumulces relatives, echelle gaussienne.

Tableau 3: Teneur moyenne en DNA des populations correspondant aux courbes II et III.v: nombre de degres de Iiberte.

Courbes II III

Moyenne 13,66 27,50Ecart type 3,33 4,09Variance 11,09 16,73X2 experimental 8,18 5,56

X2 O,05 v = 10 v = 1118.30 19,67

tivement aux populations reperes 2 C et 4 C. L'examen du tableau 4 donne la valeurdes ecarts reduits, E, obtenus dans la comparaison des parametres des populationsreperes et des echantillons observes. Des valeurs de E inferieures a 1,96 indiquent,avec un risque d'erreur de 5 0/0, que la moyenne et la variance de la population IIIsont identiques a celles des deux populations reperes 4 C. Par contre, la population

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Tableau 4: Comparaison des moyennes et des var iances des populations interphasiques II etIII et des populations reperes 2n et 4n.

Comparaison des Comparaison desmoyennes (1) variances (2)

II e = 1,00 e = 3,94P = 0,05 P = 0,05

~T2n e < 1,96 -> 1,96

III e = 0,78 e = 0,04P = 0,05 P = 0,05

P2n e < 1,96 e < 1,96

III e = 0,43 e = 1,06P = 0,05 P = 0,05

T4n e < 1,96 e < 1,96

(1) Comparaison des moyennes rnA - mB

e = VSA2 SB2nA +---;:;]3

e = ecart reduit, rnA' mB = moyennes des distributions. nA, nB = effectifs des echanrillons.SA2, SB2 = variances des echantillons.

repere 2 C et la population II ont meme moyenne mais possedent des variances signifi­cativement differentes (e > 1,96).

Discussion

Les cellules de l'Acer pseudoplatanus en phase stationnaire se caracterisent parl'absence de mitoses et de synthese de DNA nuclcaire. La courbe de [requence cu­mulee relative des teneurs en DNA nucleaire montre que cette suspension est hetero­gene et qu'elle est constituee de trois populations soit: 71 % de cellules a teneur enDNA, 2 C, 23,5 % de cellules 4 C et 5,5 % de cellules a teneur en DNA superieurea 4 C.

La population cellulaire, 4 C, a merne moyenne et meme variance que les deuxpopulations reperes correspondantes et se distribue donc selon la meme loi gaussienne.Par contre, la population repere 2 C, constituee de cellules en telophase, possede unevariance significativement plus faible que celle des cellules interphasiques 2 C. Lavariance qui traduit la dispersion des valeurs autour de la moyenne met en evidencela precision des mesures qui depend, pour une grande part, de l'erreur distribution-

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nelle consequence de l'heterogeneire nucleaire de distribution, dans le noyau, des re­gions hetercchromatiques et euchromatiques.

Les cellules ateneur en DNA, 2 C, sont diploides et en phase G1 prolongee de leurcycle cellulaire; les cellules 4 C peuvent &tre des cellules diploides en phase G2 ou,plus vraisemblablement, les cellules tetraploides que nous avons mises en evidencedurant la phase exponentielle (REMBUR, 1974) et qui seraient done aussi en phase G1

prolongee.Le milieu de LAMPORT (1964) modifie par LESCURE (1966) que nous avons utilise

comporte deux facteurs limitants, le 2,4-D a une concentration inferieure a 10-6 Met la source d'azote (LEGUAY et GUERN, 1975). Ce milieu renferme 4,5' 10- 6 M de2,4-D; seule une deficience en azote peut done expliquer le passage des cellules enphase stationnaire par blocage de la synthese du DNA.

Les consequences sur le cycle cellulaire d'un arret ou d'un ralentissement de crois­sance paraissent differentes selon le materiel etudie, Les cellules des racines exciseesdu Vi cia Jaba, cultivees dans un milieu deficient en saccharose (VAN'T HOF et al.,1973) sont bloquees en phase G1 et G2 dans des proportions variables selon les con­ditions experimentales.

Dans le fibrosarcome de Souris se developpant sous forme de tumeur solide (FRIN­DEL et al., 1967), la duree du cycle cellulaire est constante a toutes les phases de lacroissance; elle s'allonge dans le meme materiel, sous forme ascitique (FRINDEL etTUBlANA, 1967), lorsque l'augmentation du nombre de cellules se ralentit. De meme,la baisse du taux de proliferation d'une tumeur ascitique d'Ehrlich (LALA et PATT,1966) est la consequence d'un allongement des phases du cycle cellulaire et d'unediminution de la fraction en division; l'absence complete de phase G1 a tous lesstades du developpement de la tumeur est par ailleurs constatee,

Par contre, les cellules en suspension de l'Hamster (ToBEY et LEY, 1970) ne syn­thetisent plus de DNA durant la phase stationnaire et son essentiellement en phaseG1 du cycle cellulaire. Par ailleurs, une etude cytophotometrique du DNA nucleairede cellules humaines en culture revele aussi que la phase en plateau est la consequenced'un arret en G1 de certaines cellules (GROVE, 1974), de merne, les cellules d'Erableen phase stationnaire (SHORT et al., 1969), transferees dans un milieu neuf, doublenttres rapidement leur contenu en DNA ce qui indique qu'elles doivent &tre fortementsynchronisees.

Chez les plantes, le blocage des cellules dans une phase preferentielle du cycle estun phenomene tres repandu, Ainsi les bourgeons axillaires du Tradescantia paludosa(NAYLOR, 1958) et ceux du Pois (NOUGAREDE et RONDET, 1975; TOUPIOL, 1976), lesbourgeons portes en hiver par les souches tuberisees du Phytolacca decandra (NOUGA­REDE et al., 1973), les embryons dormants du Triticum (AVANZI et al., 1969), lemeristerne caulinaire de l'embryon contenu dans la graine du Xanthium pennsyluani­cum (REMBUR, 1970), le meristerne caulinaire du Fraxinus excelsior 1. a l'etat dedormance (COTTIGNIES, 1974), l'apex de l'Isoetes setacea lors de la sedieresse estivale(MICHAUX, 1972) et les cellules a l'origine des bulbilles chez le Bryophyllum daigre-

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Etude cytophotometrique du D N A nucleairc 111

mo ntianum (B ROSSARD, 1971 ) sont preferentiellement en phase G1 du cycle cellulairc.La phase G1 est done l'etat Ie plus favorable a I'arr et puis a la reprise d'activite

prol iferatrice, contrairement a la phase G2 qui preparerait la specialisation ceIIulaire(B RUGAL, 1971 ).

Ce travail a ere effectue da ns Ie cadre de I'Equipe de Re cherche Associee au C. N. R . S.:«Cytologie experiment ale des cellules meristernati ques et de leurs deriveess , n? 616.

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