Etude d’un traitement combiné bio-physico-chimique pour la ...theses.insa-lyon.fr/publication/2004ISAL0045/these.pdf · RESUME Ce travail concerne l’étude d’un procédé bio-physico-chimique

N° d’ordre 2004ISAL0045 Année 2004

Thèse

Etude d’un traitement combiné bio-physico-chimique pour la

décontamination des eaux polluées en atrazine

Présentée devant

L’institut national des sciences appliquées de Lyon

Pour obtenir

Le grade de docteur

Formation doctorale

Sciences et Techniques du Déchet

École doctorale

Chimie, Procédés et Environnement de Lyon

Par

Sophie GENDRAULT DERVEAUX (Maître ès Sciences en Biochimie)

Soutenue le 22 septembre 2004 devant la Commission

d’examen

Jury MM.

Mr J. Bourgois, Professeur (Mines de Saint Etienne) Président

Mr A. Pauss, Professeur (UTC Compiègne) Rapporteur

Mr B. Fabre, Professeur (UHA Mulhouse – Colmar) Rapporteur

Mr R. Gourdon, Professeur (INSA de Lyon) Directeur de thèse

Mr J.M. Blanchard, Professeur (INSA de Lyon)

Mr R. Bayard, Maître de conférences (INSA de Lyon)

Thèse S.GENDRAULT 2004

1

REMERCIEMENTS

Toute mon estime et mes premiers remerciements vont à mon directeur de thèse, Rémy Gourdon, un

homme exceptionnel qui a su me soutenir tout au long de cette épreuve qu’est celle du doctorat,

jusque dans les moments parfois désespérés. Merci pour ton amitié, ta sympathie et ta bonne humeur

quotidienne. Je ressors de ces années avec des cantiques plein la tête ! Merci pour ton efficacité,

c’est un véritable bonheur de travailler à tes côtés.

Je remercie Pierre Moszkowicz, directeur du LAEPSI qui m’a accueillie depuis mon année de DEA

dans son laboratoire.

Une pensée particulière va à mes collègues et amis de la FEUP de Porto, où une partie de ce travail

a été réalisé. Je pense particulièrement à Paulo, Nuno et Patricia, des amis pour la vie.

Ces années n’auraient pas été aussi gaies et festives sans notre « Pépito National ». Merci Rémy

pour tes conseils, ton soutient et ton amitié. Tu verras, un jour l’informatique te sourira !

Ces quelques années au LAEPSI ont été l’occasion de rencontres exceptionnelles. Merci à toi

Khalilou de nous sortir parfois de notre rationalité accablante. La philosophie peut alléger nos

pensées, elle peut aussi les troubler.

Merci à tous mes collègues et amis : Bada, sacrée partenaire de bureau et leader avec moi de

nombreuses festivités au laboratoire ! Vincent, Sonia, Daniela, Marion et tous les autres, partenaires

de franches rigolades, futurs Docteurs à qui je souhaite un grand succès. Merci à Christian pour tous

les coups de main et les bidouillages maison.

Spéciale dédicace à mes amis des quatre continents, qui se reconnaîtront ; leur présence est toujours

d’un grand réconfort.

A mes amis musiciens qui ont rythmé cette dernière année de thèse.

Un Merci tout particulier à mes parents et à toute ma famille qui ont cru longtemps que je serai

étudiante à vie. Cette fois j’arrête mes études, c’est promis !

MERCI mon Poussin, tout ton amour a rempli ces années de bonheur et notre séjour au Portugal m’a

laissé des souvenirs inoubliables.

« L’Odyssée suit son cours » … avec l’arrivée de notre premier bébé à qui je dédie ce travail ainsi qu’à toute sa

génération.


2

RESUME

Ce travail concerne l’étude d’un procédé bio-physico-chimique pour le traitement d’eaux polluées par

de l’atrazine. Le procédé étudié consiste en une biofiltration, utilisant l’écorce de pin comme support

d’adsorption et comme agent de biodégradation la souche bactérienne Pseudomonas ADP sp.,

connue pour sa capacité à minéraliser l’atrazine en tant que source d’azote. Cette technique vise à

éliminer totalement le polluant par minéralisation, valorisant l’écorce de pin, un déchet de l’industrie

du bois, le tout à faible coût.

Dans un premier temps, les essais d’adsorption ont montré que l’atrazine était retenue en faible

quantité sur l’écorce de pin, comparé à la capacité d’adsorption d’un charbon actif, rendant le

pesticide disponible pour les micro-organismes engagés dans le traitement.

L’approche biologique en milieu liquide a montré que la biodégradation de l’atrazine pouvait avoir lieu

à pH acide (jusqu’à pH 4,4) imposé par la présence de l’écorce en solution aqueuse et à des

températures relativement basses (jusqu’à 12°C) permettant d’exploiter ce procédé de manière

rustique : pas de chauffage ni besoin de tamponner l’eau à traiter. Pseudomonas ADP sp. a prouvé

qu’elle était capable de survivre en présence des composés organiques de l’écorce de pin et de les

consommer en tant que source unique de carbone. D’autre part, aucune source d’azote

supplémentaire à l’atrazine ne doit être apportée au cours du traitement sous peine de voir la

minéralisation de celle-ci diminuer.

La microflore indigène de l’écorce de pin a montré une légère capacité à minéraliser l’atrazine pour

des concentrations en atrazine comprises entre 45 µg.L-1 et 20 mg.L-1 permettant, à forte

concentration uniquement, d’augmenter le rendement global du traitement. D’une manière générale,

la présence de cette microflore n’aurait qu’un très léger effet inhibiteur vis à vis de la croissance de

Pseudomonas ADP sp. et de sa capacité à minéraliser l’atrazine.

L’étude du traitement combinant adsorption et biodégradation a été réalisée en essais batch et en

colonnes. En batch, 50% de l’atrazine sont minéralisés en 4 jours ; 50% restent adsorbés

irréversiblement à l’écorce et donc non disponibles pour les bactéries. En colonne, l’apport de

Pseudomonas ADP sp. améliore l’efficacité du traitement de 50% à 100% par rapport au procédé

d’adsorption seul.

Le traitement étudié semble inexploitable pour traiter des eaux contenant une faible concentration en

atrazine (quelques µg.L-1). En revanche, ce procédé combiné pourrait être envisagé comme pré-

traitement pour des eaux fortement polluées (quelques mg.L-1).


3

ABSTRACT

This work concerns the study of a combinated process for the treatment of waters contaminated with

atrazine. The treatment consists in a biofiltration ; it uses pine bark as the support of adsorption and

the strain Pseudomonas sp. ADP, known for its capacity to mineralize atrazine, using the pesticide as

sole nitrogen source. This process aims at a total elimination of the pollutant, recycling pine bark, a

by-product of wood industry, at low cost.

In a first step, the adsorption assays showed that atrazine was relativelyslightly retained by pine bark,

as compared to the adsorption capacity of an activated carbon. This characteristic makes the pollutant

easily available for the micro-organisms involved in the treatment.

The biological approach in liquid medium showed that atrazine biodegradation could occur under

acidic conditions (down to pH 4.4) imposed by the presence of the bark in an aqueous solution and at

low temperatures (until 12°C), allowing the development of the process in rustic conditions: without

heating and without buffering.

Pseudomonas sp. ADP proved that it was able to survive in the presence of the pine bark organic

compounds and metabolize them as a carbon source. Moreover, no other nitrogen source in more of

atrazine has to be added during the treatment, otherwise considerably decreasing the mineralization

of atrazine.

The indigenous microflore of the bark showed a low capacity for the mineralization of atrazine for

concentrations ranging from 45 µg.L-1 to 20 mg.L-1. At high atrazine concentration, this effect

increases the global capacity of the treatment. The presence of the pine bark microflora was shown to

inhibit very slightly the growth of Pseudomonas sp. ADP and its capacity to mineralize atrazine.

The study of the combinated process was done in batch and in column experiments. In batch assays,

50% of atrazine were mineralized in 4 days, as the other 50% stayed irreversibly adsorbed onto pine

bark and were not available for the micro-organisms. In column assays, the contribution of

Pseudomonas sp. ADP improves by 50 to 100% the efficiency of the treatment as compared to the

adsorption process.

The studied treatment appears be inexploitable for the treatment of waters contaminated with low

concentrations of atrazine. However, the combinated process could be considered as a pre-treatment

for the decontamination of water highly polluted.

Thèse Sophie Gendrault 2004

4

LISTE DES ABREVIATIONS

Nomenclature Acronymes et symboles

µ Moment dipolaire ues A Atrazine µmax Vitesse maximale de croissance bactérienne T-1 AFT Anodic Fenton Treatment

C0 ou Ci Concentration initiale en liquide mol.L-1 ATP Adénosine triphosphate

Ce Concentration à l'équilibre mol.L-1 BM Bilan Matière CL Concentration dans le liquide Mol.L-3 C Carbone

δ Diamètre L CA Charbon actif

∆H Charge hydraulique - CAF Charbon actif en fibres

ε Porosité totale ou Indice de vide - CAG Charbon actif en grains

H Consante de Henry P CAP Charbon actif en poudre

η Viscosité dynamique d'un fluide M.L-1.T-1 Cd Cadmium K Coefficient de perméabilité ou conductivité hydraulique L.T-1 CE50 Concentration à effet particulier chez 50% des individus

k Constante de vitesse T-1 CL Concentration létale

Kd Coef. de partage sol/eau (M.M-1)(L3.M-1)1/n Cl Chlore KF Constante de Freundlich (M.M-1)(L3.M-1)1/n CO Carbone organique

Ki Coef. d'inhibition COD Carbone organique dissous

KL Constante d'équilibre adsorbat/adsorbant L3M-1 CODB Carbone organique dissous biodégradable Koc Coef. de distrubution carbone organique/eau (M.M-1)(L3.M-1)1/n COT Carbone organique total

Kow Coef de partage octanol/eau - COV Composé organique volatil

Ks Constante de Monod Mol.L-3 Cr Chrome

λ Longueur d'onde L Cu Cuivre

m Masse M DBO Demande biologique en oxygène

Ma Masse d'air M DE50 Dose à effet particulier chez 50% des individus Me Masse d'eau M DEA Deséthyl-atrazine

Ms Masse de solide M DEDIA Deséthyl-desisopropyl-atrazine

Mt Masse totale M DGRAH Direcção Geral dos Recursos e Aproveitamentos Hidráulicos

ν vitesse de consommation d'un substrat M.T-1 ou mol.T-1 DIA Desisopropyl-atrazine

nF Constante de Freundlich - DL Dose létale

νmax vitesse maximale de consommation d'un substrat Mol.L-3.T-1 DMSE Dose maximale sans effet

θ humidité volumique % DO Densité optique

q vitesse de Darcy L.T-1 DT50 ou t1/2 Temps de demi-vie

Q ou D Débit d'écoulement L3.T DthO Demande biologique en oxygène théorique (OCDE-301) q0 Concentration initiale dans la phase solide M.M-1 ou mol.M-1 Fe Fer

qe Quantité de composé adsobé à léquilibre M.M-1 ou mol.M-1 GUS Groundwater Ubiquity Score

θeff Teneur en eau effective - H Hydrogène qm Concentration de soluté dans la phase solide - HA ou OHA Hydroxyatrazine

Qmax Quantité maximale de composé adsobé M.M-1 ou mol.M-1 Hg Mercure

R Coefficient de retard HIA Hydroxy-isopropylamino-atrazine

ρapp Masse volumique apparente M.L3 HMDS Hexaméthyldisilazane

ρre Masse volumique réelle M.L3 HPLC High Performance Liquid Chromatography

S Solubilité d'un composé M.L3 IFEN Institut Français de l'Environnement S Surface M2 IR Infra Rouge

s Degré de saturation L/S Ratio Liquide/Solide

S Concentration en substrat mol.L-1 MEB Microscope Electronique à Balayage Si Solubilité d'une molécule non ionisée M.L-1 MM Matière Minérale

τ Tortuosité L MM Milieu minéral

V Volume L3 MM-Glc Milieu minéral glucosé Va Volume d'air L3 MO Matière organique

Ve Volume d'eau L3 Mso Matière Organique soluble

Vo ou Ve Volume de pore L3 Na Sodium Vs Volume de solide L3 Ni Nickel

Vt Volume total L3 Ni Azote

Vv Volume de vide L3 O Oxygène w Humidité pondérale % OHDEA Hydoxy-deséthyl-atrazine

X Densité ou concentration de biomasse M.L-3 OMS Organisation mondiale de la santé

Y Coefficient de rendement cellulaire Mbio.Mol-1 de substrat P Phosphore Pb Plomb

PCA Plate Count Agar

PMPOA Programme de maîtrise des pollutions d’origine agricole RENQA Rede Nacional de Qualidade da Água

RNE Résidus non extractible

RUP Pesticide restreint d'utilisation S Soufre

UV-Vis Ultra violet - visible

Zn Zinc


Cette étude a fait l’objet de :

COMMUNICATIONS ORALES : Unicum Colloquium. Crop Portection. 33ème Congrès du Groupe Français des Pesticides ;

Aix en Provence, France, Mai 2003. Gendrault S., Bayard R., Nones O.P., and Gourdon R.

“Influence of pine bark on the growth and atrazine degradation activity of Pseudomonas sp.

strain ADP in the treatment of contaminated waters”.

POSTERS : First European Bioremediation Conference ; Chania, Crete, Greece, Juillet 2001. Gendrault

S., Alves M. A., Manaia C. M., Gourdon R., Bayard R., Nunes O. C. “Remediation of

contaminated natural waters with low concentrations of pesticides: a combination of physical

and biological method”.

Le CODEGPRA (Comité de Développement du Génie d es Procédés Rhône-Alpes),

« Apports du Génie des procédés aux enjeux sociétaux, Saint Martin d’Hères, Octobre 2003.

Gendrault S., Bayard R., Gourdon R., Nunes O.P. «Remediation of contaminated natural

waters with low concentrations of pesticides: a combination of physical and biological

method”.

Second European Bioremediation Conference ; Chania, Crete, Greece, Juin 2003. Gendrault S., Bayard R., Nones O.P., and Gourdon R. “Influence of pine bark micro-flora on the growth

and atrazine degradation activity of Pseudomonas sp. strain ADP in the treatment of

contaminated waters”.

PUBLICATION SOUMISE : Gendrault S., Bayard R., Nones O.P., and Gourdon R. “Influence of pine bark on the growth

and atrazine degradation activity of Pseudomonas sp. strain ADP in the treatment of

contaminated waters”. Agronomie.


SOMMAIRE

REMERCIEMENTS…………………………………………………………...1

RESUME………………………………………………………………………..2

LISTE DES ABREVIATIONS…………..…………………………………….4

INTRODUCTION GENERALE……………….………………………………5

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE………………………………………………..8

I. LES PESTICIDES : RÉGLEMENTATION, UTILISATION ET DEVENIR DANS L’ENVIRONNEMENT...................................................9

I.1 Aspects réglementaires ............................................................................................................... 9 I.1.1 Normes européennes, françaises et portugaises sur les pesticides – cas de l’atrazine ....... 9 I.1.2 Programmes de maîtrise et de réduction des pollutions d’origine agricole ......................... 10

I.2 Caractéristiques de l’atrazine.................................................................................................... 12 I.2.1 Généralités........................................................................................................................... 12 I.2.2 Mode d’utilisation et mode d’action de l’atrazine ................................................................. 12 I.2.3 Aspects Toxicologiques ....................................................................................................... 14

I.3 Dispersion des herbicides dans l’environnement................................................................... 15 I.3.1 Introduction .......................................................................................................................... 15 I.3.2 Devenir dans le sol............................................................................................................... 16

I.3.2.1 Rétention des pesticides dans le sol ........................................................................... 17 I.3.2.1.1 Facteurs de l’adsorption.......................................................................................... 18 I.3.2.1.2 Formation de résidus liés........................................................................................ 21

I.3.2.2 Dégradation des pesticides dans le sol....................................................................... 22 I.3.2.2.1 Dégradation abiotique............................................................................................. 23


I.3.2.2.2 Dégradation biologique ........................................................................................... 24 I.3.2.2.3 Minéralisation .......................................................................................................... 26

I.3.3 Volatilisation ......................................................................................................................... 27 I.3.4 Contamination des milieux aquatiques ................................................................................ 28

I.3.4.1 Le Ruissellement : contamination des eaux de surface.............................................. 29 I.3.4.2 Le lessivage: contamination des eaux souterraines ................................................... 29

II. PROCÉDÉS DE TRAITEMENT DE L’EAU POUR L’ÉLIMINATION DES PESTICIDES..................................................................................31

II.1 Introduction............................................................................................................................. 31

II.2 Elimination de l’atrazine dans la filière classique de traitement des eaux usées ........... 31

II.3 Procédés physico-chimiques dégradatifs ........................................................................... 32 II.3.1 Oxydation à l’ozone.............................................................................................................. 32 II.3.2 Oxydation au peroxyde d’hydrogène ................................................................................... 34 II.3.3 Traitement au réactif de Fenton (AFT, Anodic Fenton Treatment)...................................... 34 II.3.4 Dégradation photochimique ................................................................................................. 35

II.4 Procédés non dégradatifs : adsorption sur matrice poreuse ou membrane................... 35 II.4.1 Procédés d’adsorption sur charbon actif en poudre ou en grains ....................................... 35

II.4.1.1 Généralités .................................................................................................................. 35 II.4.1.2 Application à l’adsorption de l’atrazine sur charbon actif (CA)s.................................. 36

II.4.2 Procédés membranaires : microfiltration, ultrafiltration et nanofiltation ............................... 38 II.4.3 Valorisation des déchets verts pour le traitement de l’eau .................................................. 39

II.4.3.1 Une solution économique............................................................................................ 39 II.4.3.2 Quelques exemples..................................................................................................... 39 II.4.3.3 Cas de l’écorce de pin................................................................................................. 40

II.5 Procédés de dégradation biologique ................................................................................... 43 II.5.1 Caractéristiques générales des bioréacteurs....................................................................... 43 II.5.2 Traitements biologiques appliqués aux eaux contaminées par l’atrazine ........................... 44

II.6 Procédés combinés................................................................................................................ 47 II.6.1 Généralités........................................................................................................................... 47 II.6.2 La biofiltration....................................................................................................................... 49

II.6.2.1 Introduction.................................................................................................................. 49 II.6.2.2 Principales propriétés des biofilms.............................................................................. 49 II.6.2.3 Comportement des micro-organismes en biofilm........................................................ 50


II.6.2.4 Formation des biofilms ................................................................................................ 50 II.6.3 Facteurs influençant la formation et l’activité des biofilms................................................... 52

II.6.3.1 Caractéristiques des micro-organismes...................................................................... 52 II.6.3.2 Le support d’adsorption............................................................................................... 53

II.6.3.2.1 Caractéristiques physiques du support d’adsorption ............................................. 55 II.6.3.2.2 Caractéristiques chimiques du support d’adsorption ............................................. 57 II.6.3.2.3 Caractéristiques microbiologiques du support d’adsorption .................................. 57

II.6.3.3 Composition du fluide.................................................................................................. 58 II.6.3.4 Effet de la vitesse de circulation du fluide ................................................................... 59 II.6.3.5 Effet de la température................................................................................................ 60

II.6.4 Cinétique de biodégradation d’un substrat .......................................................................... 60

III. BIODÉGRADATION DE L’ATRAZINE PAR PSEUDOMONAS ADP SP. ..…………………………………………………………………………...62

III.1 Introduction............................................................................................................................. 62

III.2 Isolement de Pseudomonas ADP sp. ................................................................................... 64

III.3 Taxonomie et exigences métaboliques................................................................................ 65

III.4 Mécanisme de dégradation de l’atrazine et isolement des gènes de Pseudomonas ADP sp. impliqués dans la minéralisation de l’atrazine........................................................................... 67

III.5 Différentes applications......................................................................................................... 68 III.5.1 Traitement des eaux résiduelles d’usine de fabrication de pesticides ............................ 68 III.5.2 Traitement des sols pollués ............................................................................................. 69 III.5.3 Décontamination de sédiments et aquifères pollués....................................................... 69

IV. DESCRIPTION MATHÉMATIQUE DU PROCESSUS D’ADSORPTION....................................................................................71

IV.1 Modélisation de l’équilibre d’adsorption ............................................................................. 71

IV.2 Ecoulement dans un milieu poreux...................................................................................... 74 IV.2.1 Organisation du milieu poreux......................................................................................... 74 IV.2.2 Hétérogénéité de l’écoulement ........................................................................................ 76 IV.2.3 Loi de Darcy..................................................................................................................... 76 IV.2.4 Vitesse d’écoulement et tortuosité................................................................................... 77


ETUDE EXPERIMENTALE…………………………………………………78

I. ETUDE DU SUPPORT D’ADSORPTION : L’ÉCORCE DE PIN « PINUS PINASTER » ...........................................................................79

I.1 Origine et répartition .................................................................................................................. 79

I.2 Chimie générale des écorces .................................................................................................... 80

I.3 Caractéristiques physico- chimiques de l’écorce de pin ....................................................... 81 I.3.1 Caractéristiques physiques.................................................................................................. 82

I.3.1.1 Principe de la méthode BET........................................................................................ 82 I.3.1.2 Principales caractéristiques......................................................................................... 82

I.3.2 Caractéristiques chimiques.................................................................................................. 84 I.3.3 Analyse Infra Rouge des fonctions de surface .................................................................... 85

I.3.3.1 Principe de l’analyse Infra Rouge................................................................................ 86 I.3.3.2 Protocole expérimental................................................................................................ 86 I.3.3.3 Interprétation du spectre IR......................................................................................... 86

I.4 Observations de la structure l’écorce de pin au MEB ............................................................ 87

I.5 Préparation de l’écorce en vue des études d’adsorption....................................................... 87

I.6 Préparation d’un extrait aqueux d’écorce de pin .................................................................... 88

I.7 Méthode de stérilisation............................................................................................................. 88

II. ADSORPTION DE L’ATRAZINE SUR L’ÉCORCE DE PIN............90

II.1. Matériel et Méthodes.............................................................................................................. 90 II.1.1 Etude de l’adsorption en batch ............................................................................................ 90

II.1.1.1 L’atrazine : caractéristiques générales et méthodes d’analyses................................. 90 II.1.1.1.1 Caractéristiques physico-chimiques ...................................................................... 90 II.1.1.1.2 Méthodes d’analyse ............................................................................................... 92


(a) Chromatographie Liquide Haute Pression.............................................................. 92 (b) Dosage par Immuno-essai ...................................................................................... 92 (c) Suivi des essais avec des molécules marquées au 14C.............................................. 93

II.1.1.2 Cinétique d’adsorption................................................................................................. 93 II.1.1.3 Isothermes d’adsorption .............................................................................................. 94 II.1.1.4 Extraction de l’atrazine adsorbée sur l’écorce de pin.................................................. 94

II.1.2 Etude de l’adsorption en colonne......................................................................................... 95 II.1.2.1 Courbes d’élution d’un soluté ...................................................................................... 95 II.1.2.2 Caractérisation de l’écoulement à l’aide de traceurs .................................................. 97

II.1.2.2.1 Choix du traceur..................................................................................................... 97 II.1.2.2.2 Suivi du traceur en sortie de colonne..................................................................... 97

II.1.2.3 Méthodes expérimentales d’adsorption en colonne.................................................... 98 II.1.2.3.1 Préparation des colonnes ...................................................................................... 98 II.1.2.3.2 Suivi du COD, du pH et de la conductivité en sortie de colonne ......................... 100 II.1.2.3.3 Adsorption de l’atrazine en colonne..................................................................... 101

II.2 Résultats et discussion ....................................................................................................... 102 II.2.1 Etude de l’adsorption en batch .......................................................................................... 102

II.2.1.1 Cinétiques d’adsorption............................................................................................. 102 II.2.1.2 Isothermes d’adsorption ............................................................................................ 103

II.2.1.2.1 Influence de la granulométrie de l’écorce de pin sur l’adsorption de l’atrazine ... 103 II.2.1.2.2 Influence du pH sur l’adsorption de l’atrazine...................................................... 104 II.2.1.2.3 Isotherme d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin dans une large gamme de

concentrations ........................................................................................................................ 105 II.2.2 Etude de l’adsorption en colonnes abiotiques ................................................................... 107

II.2.2.1 Etude hydrodynamique des colonnes ....................................................................... 108 II.2.2.2 Suivi du COD, pH et conductivité en sortie de colonne ............................................ 109 II.2.2.3 Adsorption de l’atrazine en colonne d’écorce de pin en conditions abiotiques......... 111

II.2.3 Conclusion ......................................................................................................................... 113

III. BIODÉGRADATION DE L’ATRAZINE EN CULTURE PURE DE PSEUDOMONAS ADP SP. .................................................................115

III.1 Matériel et méthodes............................................................................................................ 115 III.1.1 Milieux de culture........................................................................................................... 115

III.1.1.1 Les milieux liquides ................................................................................................... 115 III.1.1.1.1 Milieu minéral MM............................................................................................... 115 III.1.1.1.2 Milieu riche complexe LB .................................................................................... 116 III.1.1.1.3 Extrait aqueux d’écorce de pin............................................................................ 116


III.1.1.2 Les milieux solides .................................................................................................... 117 III.1.2 Préparation et utilisation des cellules congelées........................................................... 117

III.1.2.1 Préparation de cellules congelées ............................................................................ 117 III.1.2.2 Utilisation de stocks congelés ou de précultures ...................................................... 118

III.1.3 Suivi de la croissance des micro-organismes et de l’activité respiratoire ..................... 120 III.1.3.1 Suivi de la croissance cellulaire ................................................................................ 120

III.1.3.1.1 Mesure de turbidité ............................................................................................. 120 III.1.3.1.2 Dénombrement sur boite de Pétri ....................................................................... 121 III.1.3.1.3 Dosage des protéines par la méthode de Folin- Lowry : .................................... 121 III.1.3.1.4 Dosage des protéines par la méthode Bradford : ............................................... 121

III.1.3.2 Suivi de l’activité respiratoire (ou Demande Biochimique en Oxygène DBO)........... 122 III.1.3.2.1 Principe de la mesure ......................................................................................... 122 III.1.3.2.2 Protocole expérimental ....................................................................................... 123

III.1.3.3 Détermination du taux de croissance maximal ......................................................... 123 III.1.4 Suivi de la biodégradation de l’atrazine......................................................................... 124

III.1.4.1 Biodégradation primaire de l’atrazine........................................................................ 124 III.1.4.2 Minéralisation de l’atrazine........................................................................................ 125

III.1.4.2.1 Préparation des solutions mères d’atrazine marquée ........................................ 126 III.1.4.2.2 Principe des essais de minéralisation................................................................. 126 III.1.4.2.3 Protocole expérimental ....................................................................................... 127

III.1.5 Influence de paramètres physico-chimiques ................................................................. 128 III.1.5.1 Influence des sources de carbone ............................................................................ 128 III.1.5.2 Influence de la température et du pH........................................................................ 128 III.1.5.3 Influence d’une source additionnelle d’azote ............................................................ 129

III.1.5.3.1 Croissance bactérienne et dégradation primaire de l’atrazine ........................... 129 III.1.5.3.2 Minéralisation de l’atrazine ................................................................................. 129

III.1.5.4 Influence des composés solubles de l’écorce de pin ................................................ 130 III.1.5.4.1 Influence sur l’Activité Respiratoire de Pseudomonas ADP sp. ......................... 130 III.1.5.4.2 Influence sur la croissance de Pseudomonas ADP sp.et la biodégradation de

l’atrazine 131

III.2 Résultats et dissussion ....................................................................................................... 132 III.2.1 Introduction .................................................................................................................... 132 III.2.2 Influence de paramètres physico-chimiques ................................................................. 132

III.2.2.1 Croissance et biodégradation de l’atrazine à différentes températures.................... 132 III.2.2.2 Croissance et biodégradation de l’atrazine à différents pH ...................................... 134 III.2.2.3 Influence d’une source additionnelle d’azote ............................................................ 135

III.2.2.3.1 Influence sur la dégradation primaire de l’atrazine............................................. 136 III.2.2.3.2 Influence sur la minéralisation de l’atrazine........................................................ 137

III.2.3 Influence des composés solubles de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp......... 138


III.2.3.1 Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin .. 139 III.2.3.2 Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en extrait

d’écocre de pin............................................................................................................................ 140

III.3 Conclusions .......................................................................................................................... 144

IV. CARACTÉRISATION ET RÔLE DE LA MICROFLORE INDIGÈNE DE L’ÉCORCE DE PIN........................................................................146

IV.1 Matériel et méthodes............................................................................................................ 146 IV.1.1 Isolement et identification des micro-organismes de l’écorce de pin ............................ 146 IV.1.2 Capacité de la flore indigène à dégrader l’atrazine ....................................................... 147

IV.1.2.1 Biodégradation de l’atrazine en consortium ou en cultures pures ............................ 147 IV.1.2.2 Minéralisation de l’atrazine par la flore indigène de l’écorce de pin.......................... 147

IV.1.3 Influence de la microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp...................... 148 IV.1.3.1 Croissance de Pseudomonas ADP sp. ..................................................................... 148 IV.1.3.2 Biodégradation de l’atrazine...................................................................................... 148

IV.1.3.2.1 Suivi de la dégradation primaire de l’atrazine en extrait aqueux d’écorce de pin

148 IV.1.3.2.2 Suivi de la minéralisation de l’atrazine ............................................................... 149

IV.2 Résultats et discussion ....................................................................................................... 150 IV.2.1 Isolement de la microflore de l’écorce de pin ................................................................ 150 IV.2.2 Capacité de la flore indigène de l’écorce à biodégrader l’atrazine................................ 151

IV.2.2.1 Biodégradation primaire de l’atrazine........................................................................ 151 IV.2.2.2 Minéralisation de l’atrazine........................................................................................ 152

IV.2.3 Influence de la microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp...................... 154 IV.2.3.1 Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en présence de

la microflore de l’écorce de pin ................................................................................................... 154 IV.2.3.2 Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en présence de la microflore

de l’écorce................................................................................................................................... 156

IV.3 Conclusion ............................................................................................................................ 158

V. ETUDE DU TRAITEMENT COMBINÉ...........................................160

V.1 Matériel et méthodes............................................................................................................ 160 V.1.1 Essais en batch.................................................................................................................. 160

V.1.1.1 Protocole expérimental.............................................................................................. 160 V.1.1.2 Distribution de la radioactivité dans les essais en batch........................................... 162


V.1.1.2.1 Radioactivité en solution...................................................................................... 163 V.1.1.2.2 Radioactivité associée à l’écorce ........................................................................ 164

V.1.1.3 Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du traitement combiné............................ 165 V.1.2 Essais en colonnes ............................................................................................................ 166

V.1.2.1 Choix des paramètres ............................................................................................... 166 V.1.2.2 Inoculation et caractérisation du biofilm et de l’hydrodynamique des colonnes ....... 167

V.1.2.2.1 Observation au MEB des micro-organismes sur l’écorce de pin ........................ 167 (a) Inoculation des colonnes....................................................................................... 168 (b) Traitement des échantillons pour observation au MEB ........................................ 168

V.1.2.2.2 Influence des micro-organismes sur le comportement hydrodynamique des

colonnes 169 V.1.2.3 Protocole expérimental des essais de biofiltration .................................................... 170

V.2 Résultats et discussion ....................................................................................................... 173 V.2.1 Etude du traitement combiné en batch .............................................................................. 173

V.2.1.1 Minéralisation de l’atrazine en présence d’écorce de pin ......................................... 173 V.2.1.2 Analyses des composés radioactifs en solution en cours d’incubation .................... 176 V.2.1.3 Répartition de la radioactivité résiduelle en fin de traitement ................................... 179 V.2.1.4 Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du traitement .......................................... 181 V.2.1.5 Conclusions ............................................................................................................... 184

V.2.2 Etude en colonne du traitement combiné .......................................................................... 186 V.2.2.1 Etude du développement de Pseudomonas ADP sp. en colonne d’écorce de pin... 186 V.2.2.2 Influence du biofilm sur l’hydrodynamique de la colonne.......................................... 187 V.2.2.3 Traitement combiné en colonne................................................................................ 188 V.2.2.4 Conclusions ............................................................................................................... 194

CONCLUSION GENERALE ET PERPECTIVES…...…………………196

ANNEXES………………………………………………………………..….199 ANNEXE 1 : Spectre IR de l’écorce de pin en poudre – Identification des fonctions de surface…….200

ANNEXE 2 : Observation au MEB d’écorce de pin et de charbon actif…………………………………201

ANNEXE 3 : Caractéristiques des colonnes – Etude hydrodynamique…………………………………203

ANNEXE 4 : Caractéristiques des colonnes – Adsorption de l’atrazine en conditions abiotiques…...204

ANNEXE 5 : Observation au MEB de Pseudomonas ADP sp. en colonne d’écorce de pin………….205

ANNEXXE 6 : Caractéristiques des colonnes – Influence d’un biofilm sur l’hydrodynamique……….211


REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES………………………………….212

LISTE DES FIGURES……………………………………………………..227

LISTE DES TABLEAUX…………………………………………………..234


5

INTRODUCTION GENERALE

L’utilisation intensive de fertilisants et de produits phytosanitaires principalement par les exploitants

agricoles provoquent de nombreuses pollutions du milieu naturel. L’utilisation des pesticides entraîne

entre autre le passage de molécules indésirables dans les eaux de surface ou les eaux souterraines.

Le transfert de ces pesticides à travers le sol et jusque dans les eaux naturelles peut avoir pour

conséquence le dépassement de la concentration limite légale fixée par les autorités européennes

(0,1 µg.L-1 par pesticide ou 0,5 µg.L-1 de pesticides cumulés) jusqu’à parfois entraîner l’interdiction de

la consommation de l’eau par les habitants résidant aux alentours de la zone contaminée. D’autre

part, les rejets issus de la manipulation de ces substances polluantes (lavage de cuves, rejets de

production…) peuvent engendrer de fortes pollutions locales (de l’ordre de plusieurs dixaines de

mg.L -1).

Face à ces problèmes récurrents, de nombreuses recherches ont été mises en œuvre, d’une part afin

de diminuer le pouvoir polluant (toxicité ou rémanence) des pesticides utilisés, et d’autre part afin de

traiter les eaux polluées de façon efficace. Aujourd’hui, de nombreuses techniques existent pour

traiter ces eaux chargées en pesticides. Il s’agit le plus souvent de traitements physiques (adsortion

sur charbon actif (Martin-Gullon et Font, 2001)) ou chimiques (procédés d’oxydation variés (Acero et

al., 2000)). Ces procédés relativement coûteux, ne sont finalement que très peu mis en œuvre et des

alternatives moins onéreuses ont été imaginées. Les traitements biologiques, notamment, répondent

à cette contrainte ; ils sont souvent simples et bon marché et d’une bonne efficacité. Les traitements

biologiques entraînent la consommation par biodégradation ou minéralisation des substances

polluantes par une biomasse capable d’utiliser le pesticide comme source nutritive. Des traitements

combinant « filtration » et bioremédiation dits « procédés de biofiltration » ont également fait leurs

preuves dans ce domaine (Sénat, 2004 ; Cemagref, 2004).

L’utilisation de matériaux naturels tels que des déchets végétaux comme support de biofiltration a été

étudiée avec succès à plusieurs reprises. Ces techniques concernent le plus souvent l’élimination de

métaux lourds contenus dans des eaux naturelles ; la décontamination d’eaux polluées par les

pesticides n’ayant été que très rarement abordée. Parmi les matériaux naturels testés, on peut citer

l’utilisation de bagasse (Peternel et al. 1999), coton (Bailey et al. 1999), fibres de betterave (Rima et

al. 2004) ou encore rafles de maïs (Hawthorne-Costa et al. 1995) pour l’adsorption de métaux comme

le cadmium, le plomb, le cuivre, le mercure, le nickel ou le zinc.

L’écorce de pin, un sous-produit issu de l’industrie du bois, abondamment disponible, notamment au

Portugal et en France, présente une bonne affinité pour les polluants métalliques (Al-Asheh et al.


6

2000 ; Vázquez et al. 2002 ; Farm 2003) et certains composés hydrophobes comme les pesticides

organochlorés (Bras et al. 1999 ; Ratola et al. 2003). Certains auteurs relatent également l’utilisation

de l’écorce de pin comme garnissage de biofiltre pour traiter des gaz chargés en méthane (Du Plessis

et al. 2003).

De nombreuses études (en laboratoire) réalisées sur l’écorce de pin ont ainsi été entreprises et de

nouveaux procédés ont été élaborés comme techniques alternatives aux traitements classiques.

Notre étude concerne particulièrement l’élimination de l’atrazine, un herbicide largement utilisé à

travers le monde, notamment dans les cultures de maïs, mais également épandu comme herbicide

total sur les routes, les voies publiques, les voies ferrées ou les terrains non cultivés. Désormais

interdite d’utilisation dans plusieurs pays européens, dont la France depuis juin 2003, la présence de

traces d’atrazine dans les eaux naturelles nécessite encore aujourd’hui la mise en place de

traitements spécifiques.

Cette étude concerne la faisabilité du traitement d’eaux polluées par une technique de biofiltration,

combinant l’adsorption sur un support naturel peu onéreux, l’écorce de pin Pinus pinaster, et la

biodégradation de l’atrazine par une espèce bactérienne déjà décrite dans la littérature pour ses

capacités à minéraliser l’atrazine, Pseudomonas ADP sp. (Mandelbaum et al. 1993). Depuis 1993,

Pseudomonas ADP sp. fait l’objet de nombreuses recherches et est testée pour ses capacités à

dégrader l’atrazine dans différents scénarii. Certains auteurs ont ainsi imaginé traiter les eaux

résiduelles d’usines de fabrication de pesticides (concentrations des eaux à traiter : 25 mg.L-1) avant

leur rejet dans les eaux résiduelles municipales (Shapir et al 1998). D’autres ont pensé utiliser

Pseudomonas ADP sp. pour traiter in situ des sols pollués par une technique de bio-augmentation

(Masaphy et Mandelbaum 1997 ; Newcombe et Crowley 1999)), étudiant notamment l’influence de la

présence de matière organique et du vieillissement (Kristensen et al. 2001) sur la biodisponibilité de

l’atrazine dans les sols vis à vis de Pseudomonas ADP sp. Des études relatant le traitement de

sédiments ou d’aquifères pollués à l’atrazine ont également été mises en œuvre utilisant

Pseudomonas ADP sp. (Clausen et al. 2002 ; Kristensen et al. 2001).

L’intérêt d’un traitement combiné est double:

- D’une part il permet de concentrer les polluants traces sur un support d’adsorption. Un

composé concentré (dans les limites de toxicité) sera plus facilement consommé par les

micro-organismes que lorsqu’il est présent dans un milieu sous forme de traces.

- D’autre part, l’utilisation d’un support solide permet également de concentrer une biomasse

fixée à sa surface et d’obtenir des densités cellulaires par unité de volume de réacteur

supérieures aux densités cellulaires obtenues en milieu dispersé (réacteurs à biomasse libre).

Ainsi, les vitesses de dégradation du polluant seront d’autant plus grandes que la

concentration en biomasse sera grande. La biofiltration est un procédé largement connu

aujourd’hui pour son efficacité et relativement répandu (Exemple de la société canadienne

Technologies St Laurent, www.dsp-psd.pwgsc.gc.ca, 2004).


7

Le traitement étudié a été mis en œuvre afin de répondre aux deux problématiques suivantes :

1- Le traitement d’eaux naturelles polluées par de faibles concentrations en atrazine (de l’ordre

du µg.L-1)

2- Le traitement d’eaux polluées à plus fortes concentrations (quelques centaines de µg.L-1,

voire quelques mg.L-1), correspondant à une pollution ponctuelle locale due, par exemple, à

des lavages de cuves, ou concernant des effluents issus d’usines de production de

pesticides. Dans ce cas, le bio-procédé serait mis en place comme pré-traitement

(éventuellement sur site) avant rejet des eaux dans le réseau d’eaux résiduelles municipales

ou avant de subir un traitement spécifique.

Dans le premier cas (eau polluée par des traces de pesticide), l’utilisation du procédé combiné

(adsorption et biodégradation) permettrait de concentrer l’atrazine sur le support d’écorce de pin pour

faciliter et stimuler sa biodégradation.

Dans le second cas, l’application du traitement combiné à des eaux plus fortement polluées en

atrazine permettrait par rapport à un traitement biologique simple, d’obtenir une densité cellulaire plus

importante, comparé à un réacteur en milieu dispersé, et par conséquent d’obtenir des vitesses de

dégradation plus importantes.

Dans les deux cas, l’intervention de bactéries dans le procédé a pour but d’éliminer totalement le

polluant par minéralisation, débarrassant le support d’adsorption de sa charge polluante et permettant

dans le meilleur des cas de régénérer le support d’adsorption par libération des sites d’adsorption.

Dans le cas d’un procédé d’adsorption simple, le support d’adsorption lorsqu’il est saturé, est éliminé

par incinération ou mise en décharge avec sa charge polluante, ou régénéré par d’autres techniques

complémentaires.

L’étude s’est déroulée en trois étapes principales :

Dans un premier temps une étude concernant le support d’adsorption d’écorce de pin a été

entreprise afin de déterminer les principales caractéristiques physico-chimique de ce

matériau. Puis l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce a été étudiée en conditions abiotiques en

milieu dispersé et en colonnes.

L’approche biologique a été l’objet de la deuxième phase de cette étude. Elle a permis de

mettre en évidence les capacités de la souche bactérienne Pseudomonas ADP sp. choisie

pour ce traitement, à minéraliser l’atrazine dans différentes conditions expérimentales et

notamment dans les conditions imposées par la présence de l’écorce de pin. L’influence de la

microflore indigène de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp. a également fait l’objet

d’une étude particulière.

Enfin, le traitement combinant adsorption et biodégradation a été testé en milieu dispersé et

en colonne, faisant l’objet de la troisième partie de cette étude.

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE


8

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Les Pesticides


9

I. Les pesticides : réglementation, utilisation et devenir dans l’environnement

La pollution des eaux de surface et des eaux souterraines par les fertilisants (engrais

chimiques, effluents d’élevages, effluents agroalimentaires et boues) ou les produits de traitement des

cultures (produits phytosanitaires) est principalement due à l’exploitation des sols pour l’agriculture.

Ces pollutions entraînent la dégradation des milieux aquatiques et ont conduit à plusieurs reprises à

l’interdiction de l’utilisation de l’eau destinée à la consommation humaine.

Pour maîtriser les pollutions d’origine agricole, les pouvoirs publiques s’appuient sur la combinaison

de différents outils : réglementaires, économiques ou basés sur le volontariat.

I.1 Aspects réglementaires

I.1.1 Normes européennes, françaises et portugaises sur les pesticides – cas de l’atrazine

La directive européenne 98/83/CE du 3 novembre 1998, relative à la qualité des eaux destinées à la

consommation humaine, et sa transposition en droit français, à travers le décret 2001 – 1220 du 20

décembre 2001, et en droit portugais à travers l’annexe IV de la loi D.L. 236/98, du 1er août 1998,

fixent à 0,1 µg.L-1 la concentration maximale admissible pour chaque pesticide, avec une limite de

0,5 µg.L-1 pour la concentration totale en pesticides.

La protection des milieux aquatiques vis à vis des produits phytosanitaires s’organise et s’appuie sur

des lois telles qu’ en France, « la loi sur l’Eau » du 2 janvier 1992, qui oblige la création d’un périmètre

de protection autour des sites de captage d’eau brute destinée à la consommation. Cette mesure

préventive tend à limiter très nettement la présence de pesticides dans les eaux.

De plus, en France, depuis le 1er janvier 2000, le principe de pollueur-payeur est appliqué aux

pollutions diffuses d’origine agricole par la création d’une « Pollutaxe » sur les produits

phytosanitaires, dans le cadre de la Taxe générale sur les activités polluantes. Cette taxe a pour but

d’inciter les industriels à développer des substances moins toxiques pour l’homme et l’environnement,

et inciter les agriculteurs à choisir les produits les moins nocifs.

Ces dernières années, les alertes à la pollution à l’atrazine se sont multipliées en France, dans de

nombreuses communes de l’Ouest, du Sud-Ouest et dans 4 départements bretons, conduisant

localement les maires à interdire la consommation d’eau pendant l’été 2000 et le mois d’avril 2001

(source AFP, 2001).



10

En 2001, Jean Glavany, à l’époque ministre de l’Agriculture, saisissait la commission d’étude sur la

toxicité pour évaluer la pollution des eaux par les triazines. Le ministère soulignait alors la présence

de plus en plus fréquente d’atrazine dans les eaux de surface mais également dans les eaux

souterraines. Les bilans établis par l’Institut Français de l’Environnement (IFEN) sont inquiétants :

En 2003, l’Institut Français de l’Environnement (IFEN) a publié un rapport alarmant sur la qualité des

eaux en France. 90% des points surveillés en rivières et 58% des points en eaux souterraines

contiennent des pesticides (Noualhat, 2003). 5% de la population aurait été alimentée au robinet en

2001 par une eau ayant dépassée au moins une fois la limite légale de 0,1 µg.L-1. Le premier rapport

de l’IFEN date de 1998. Déjà alarmant, il avait eu pour conséquence, le lancement en 2000 d’un plan

d’action pour la réduction des pollutions par les produits phytosanitaires, le Plan Phyto (voir aussi

II.1.2). Le Plan Phyto a ainsi entraîné le retrait total de certaines substances du marché. C’est le cas

de l’atrazine, herbicide du maïs retrouvé sur 5960 analyses, qui en septembre 2002, fut retiré du

marché et interdit à l’utilisation en juin 2003, malgré les résultats optimistes de la commission des

Toxiques du Ministère de l’Agriculture et de la Pêche, concluant le 3 mai 2003, à l’absence de danger

pour la santé humaine.

Au Portugal, en réponse aux nouvelles directives européennes (transposées en droit national à

travers le Decreto-lei 74/90 du 7 mars et revu par le décret 236/98 du 1er août), une large étude est

engagée dans le cadre du programme portugais de protection de l’eau. Elle est menée par la

Direcção Geral dos Recursos e Aproveitamentos Hidráulicos (DGRAH) à travers le Réseau National

de la Qualité de l’Eau (Rede Nacional de Qualidade da Água (RENQA). Cette étude menée entre

1983 et 1999 montre la présence de nombreux pesticides et en particulier de l’atrazine aussi bien

dans les rivières (concentration maximale de 0,63 µg.L-1 dans le Rio Tejo) que dans les eaux

souterraines (concentration maximale de 29 µg.L-1 dans la région Ribatejo)(Cerejeira et al., 2003).

I.1.2 Programmes de maîtrise et de réduction des pollutions d’origine agricole

En France, le gouvernement mène une politique globale d’intervention, comprenant, outre les aspects

réglementaires et fiscaux, un programme national de réduction des pollutions par les produits

phytosanitaires, lancé en concertation avec l’ensemble des partenaires, tant professionnels

qu’associatifs. Le ministère chargé de l’environnement porte son effort sur une meilleure

connaissance de l’impact des pesticides sur les milieux aquatiques ainsi que sur le développement de

solutions préventives et curatives les plus adaptées.

A partir des études menées par l’Institut Français de l’Environnement (IFEN) et des études

toxicologiques, l’impact environnemental des résidus de pesticides est évalué et les autorisations de

mise sur le marché de certains produits sont remis en cause.

Des solutions préventives et curatives ont pour objectif d’améliorer les pratiques des utilisateurs de

produits agricoles :



11

• En 1993 les ministères chargés de l’agriculture et l’environnement ont élaboré en accord avec

les organisations agricoles, un programme de maîtrise des pollutions d’origine agricole : le PMPOA. (Ministère de l’écologie et du développement durable, 2003)

Les objectifs sont les suivants :

- protéger les milieux aquatiques

- conserver une agriculture dynamique

Les principales pollutions des eaux d’origine agricole sont visées et tous les systèmes de

production concernés (élevages et cultures).

Les volets de ce programme sont :

- les pollutions par les produits phytosanitaires,

- les pollutions par les nitrates.

• En août 2000, un programme de réduction des pollutions par les produits phytosanitaires (le Plan Phyto) prévoit sur le plan national la mise en place d’une filière de récupération des

emballages de produits phytosanitaires, un renforcement des contrôles de l’utilisation de ces

produits et le développement de techniques de protection des cultures alternatives. Cinq

millions d’euros sont injectés chaque année par le ministère de l’Environnement dans ce

programme, surtout chargé d’inciter les changements de pratiques parmi les utilisateurs

(agriculteurs, particuliers ou services techniques). Parmi les mesures prises, la publication

d’un livret « Pesticides, Mode d’emploi » par le ministère de l’agriculture et de la pêche,

permet d’informer et d’orienter les utilisateurs. La lutte contre la pollution de l’eau par les

produits phytosanitaires se fait donc à deux niveaux :

- La prévention, qui vise à limiter l’émission abusive de ces micro-polluants

notamment en informant les utilisateurs sur les bonnes démarches à suivre.

- L’élimination de la pollution au niveau des unités de traitement de l’eau ; le

traitement de nappes phréatiques fortement polluées est également évoqué.

Un programme équivalent au Portugal, Programme de Protection intégrée ou de « Bonne pratique phytosanitaire » (« Boa Prática Fitossanitaria »), s’organise depuis 1994, visant à aider les

agriculteurs à mettre en œuvre des pratiques agricoles plus respectueuses vis à vis de l’homme et de

l’environnement. Ce programme porte essentiellement sur l’utilisation rationnelle et correcte des

pesticides ; il tend à responsabiliser les utilisateurs de substances phytosanitaires.

La mise en œuvre de politiques de réduction de l’utilisation des pesticides permettra de limiter la

dégradation, non seulement de la qualité de l’eau, mais aussi, et plus généralement, de

l’environnement : la biodégradabilité lente de certains produits utilisés il y a une dizaine d’année, fait



12

que l’on trouve encore dans l’environnement, des traces de DDT, pourtant interdit en France depuis

1972.

I.2 Caractéristiques de l’atrazine

I.2.1 Généralités

L’atrazine (2-chloro-4-ethylamino-6isopropylamino-1,3,5triazine) est un herbicide sélectif de la famille

des s-triazines, largement utilisé depuis la fin des années 50 par les agriculteurs pour lutter contre les

mauvaises herbes infestant les cultures de céréales, d’asperges, de cannes à sucre, d’ananas ainsi

que les vignes. L’atrazine est, en outre, épandue comme herbicide total sur les routes, les voies

publiques, les voies ferrées et les terrains non cultivés.

L’atrazine a été introduit sur le marché en 1962 par la société J.R.Geigy (actuellement Novartis Crop

Protection AG). C’est un herbicide de Classe III (légèrement toxique) (selon la classification de

l’OMS), classé comme pesticide restreint d’utilisation (RUP) dû à son fort potentiel de contamination

des eaux souterraines (les RUP ne pouvant être utilisés que par des applicateurs certifiés).

L’atrazine est une base faible (pKa de l’acide conjugué 1,64), peu soluble dans l’eau (30 mg.L-1 à

20°C) avec un coefficient de partage Kow de 398. Les caractéristiques physico-chimiques de

l’atrazine sont présentées au § II.1.1.1(1) du chapitre « Etude Expérimentale ».

Elle fut commercialisée sous une centaine de noms différents : Aatrex (USA - Novartis), Primextra

(Europe – Novartis), Mebazine (Rhône-Poulenc), Vectal (AgrEvo), Gesaprim (Europe – Novartis),

Atrazol (Sipcam),…

I.2.2 Mode d’utilisation et mode d’action de l’atrazine

La France utilisait ces dernières années environ 100000 tones de pesticide par an, ce qui la place au

deuxième rang des utilisateurs mondiaux, derrière les Etats Unis. En 2001 l’atrazine était autorisée en

France à une dose maximale de 600 à 650 g de substance active par hectare.

On la trouve sous différentes formes : poudre mouillable, en suspension, en granulés, en solution

avec des teneurs variables en matière active selon les formulations.

L’atrazine est principalement employée comme herbicide systémique, et le plus souvent, utilisée au

stade de pré-levée, c’est à dire peu après le semis, et avant le développement des adventices. Le

désherbage (lutte contre la flore adventice) d’une culture est possible grâce à la sélectivité de cette

culture vis à vis des molécules herbicides. Ainsi, certaines plantes comme le maïs sont capables de

métaboliser les molécules d’atrazine.



13

Parmi les mécanismes de métabolisation (Tissut et al., 1992), on peut retenir :

La formation de benzoxadine dans la sève au niveau racinaire.

La conjugaison au niveau des parties aériennes avec le glutathion pour donner un dérivé

inactif.

La N-déalkylation enzymatique.

Chez le maïs, la résistance à l’atrazine est attribuée à une rapide détoxification, par conjugaison au

glutathion, sous l’effet de transferases.

Dans la plante cible, l’atrazine inhibe rapidement le transport d’électrons lors de la photosynthèse,

stoppant totalement la croissance de celle-ci.

Le transfert de l’herbicide vers la plante se fait par l’eau du sol ; pour un traitement efficace, une

concentration minimale de 10 µg.L-1 dans l’eau du sol est requise, et doit être maintenue pendant les

deux premiers mois qui suivent le traitement (Tissut & Severin, 1984).

Il peut arriver que des plantes adventices parviennent à développer des résistances aux herbicides

par mutation génique. Il est alors nécessaire de changer de type d’herbicide.

Désormais totalement interdite d’utilisation dans plusieurs pays européens, dont la France, l’Italie, les

pays Bas ou l’Allemagne, l’atrazine n’a pas vu son autorisation renouvelée par l’Union européenne

(Décision de la commission 2004/248/CE) et les agriculteurs sont à l’affût de solutions alternatives.

« Aucune des nouvelles matières actives homologuées n'est aussi polyvalente que l'atrazine, mais de

nombreuses formules permettent, dans des situations données, de diminuer les doses d'atrazine,

voire de les supprimer, lorsque cela sera nécessaire », constate l'AGPM Technique (L’Association

Générale des Producteurs de Maïs).

En effet, la présence généralisée dans l’eau de traces d’atrazine et de ses produits dérivés

nécessitent, encore aujourd’hui, la mise en place de traitement spécifiques. D’autre part, l’observation

d’une efficacité de moins en moins avérée de l’atrazine, liée entre autre à l’apparition de phénomènes

de résistance de certaines mauvaises herbe explique l’interdiction de celle-ci sur le marché européen.

Le Portugal comme l’Espagne, le Royaume Uni ou l’Irlande bénéficient exceptionnellement d’une

autorisation pour un usage spécifique de produits phytosanitaires contenant de l’atrazine jusqu’au 30

juin 2007 (Décision de la Commission du 10 mars 2004 concernant la non-inscritpion de l’atrazine à

l’annexe I de la Directive 91/414/CEE du Conseil et le retrait des autorisations accordées aux produits

phytopharmaceutiques contenant cette substance active ; 2004/248/CE)



14

I.2.3 Aspects Toxicologiques

C’est le manque de sélectivité des pesticides vis-à-vis de leur cible qui provoque la plupart des effets

nocifs pour l’environnement. Les animaux absorbent les pesticides via la nourriture ou l’eau, via l’air

respiré ou au travers de leur peau. Ayant franchi diverses barrières naturelles, le toxique peut

perturber certaines réactions métaboliques. On utilise habituellement pour estimer la toxicité d’une

substance chimique, la dose (ou concentration) qui provoque un effet particulier chez la moitié de la

population soumise au toxique (DE50 ou CE50). Si cet effet est la mort, on parle de dose (ou

concentration) létale (DL50 ou CL50). La dose maximale sans effet (DMSE) est la dose

immédiatement inférieure à celle qui provoque le moindre effet dans la même épreuve expérimentale

(Severn et Ballard, 1990).

Si le coefficient de partage octanol-eau d’un composé est élevé et la vitesse de dégradation faible, la

substance s’accumulera à des concentrations croissantes dans les organismes se succédant le long

de la chaîne trophique. C’est ce qu’on appelle la bioaccumulation (biomagnification, Cooper, 1991).

Pour les substances liposolubles comme certains pesticides, la bioaccumulation dépend donc du

coefficient de partage octanol-eau Kow (Kow= 398 pour l’atrazine).

La toxicité aiguë de l’atrazine chez les mammifères est très faible. En raison de sa faible solubilité, il

ne se produit pas de résorption cutanée. Elle est très facilement résorbée après injection orale et plus

de 50% des quantités ingérées sont éliminées par l’urine en l’espace de 24h. Dans les expériences

sur l’animal, aucun effet mutagène ou tératogène n’a été observé.

Pour l’atrazine comme pour d’autres pesticides, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a publié

en 1994 une liste qui donne les valeurs guides pour chacun des pesticides. La consommation

quotidienne pendant toute une vie d’une eau potable contenant cette concentration guide, serait sans

conséquence pour la santé humaine. Ainsi, l’OMS annonce une valeur guide de 2 µg.L-1 pour

l’atrazine dans les eaux de boisson.

A titre indicatif, le Tableau 1 donne quelques valeurs de DL50 de l’atrazine pour différents types

d’animaux vis à vis de l’atrazine.

Tableau 1 : Toxicité de l’atrazine ; DL50 par voie orale sur quelques animaux (Trotter et al., 1990)

Animal Rats Souris Lapins Hamsters Canards Oiseaux

DL 50 (mg/kg) 672-3000 850-1750 750 1000 >2000 >10000



15

I.3 Dispersion des herbicides dans l’environnement

I.3.1 Introduction

Dans les années 40, les premiers pesticides sont apparus sur le marché, avec des résultats très

positifs quant à l’augmentation des rendements agricoles. Vingt ans plus tard, les premières

accusations d’atteinte à la santé publique et à l’environnement commençaient à se faire entendre

(Carson, 1962).

On estime aujourd’hui que 2,5 millions de tonnes de pesticides sont appliqués chaque année sur les

cultures de la planète. La part qui entre en contact avec les organismes cibles – ou qui est intergrée –

est minime. La plupart des chercheurs l’évaluent à moins de 0,3%, ce qui veut dire que 99,7% des

substances déversées s’en vont « ailleurs » (Pimentel, 1995).

Depuis la fin des années 70, l’agriculture intégrée à permis de réduire les intrants comme les engrais

ou les produits phytosanitaires issus de la chimie (Holland, 1994). Aujourd’hui, on est en mesure

d’informer l’agriculteur sur l’impact environnemental d’un traitement. L’impact d’un pesticide dépend

du degré d’exposition, résultant de sa dispersion et de sa concentration dans l’environnement, et de

ses caractéristiques toxicologiques (Serven et Ballard 1990 ; Emans et al. 1992).

Depuis une dizaine d’années, les caractéristiques chimiques des pesticides ont radicalement évolué ;

de produits extrêmement peu solubles dans l’eau, fortement adsorbés (très hydrophobes, coefficient

de partage élevé), et non mobiles, nous sommes passés à une génération de pesticides plus solubles

et peu mobilisables (plus hydrophiles, coefficient de partage plus faible) et par conséquent plus

mobiles (Carsel & Smith ; 1987). Cette évolution a eu lieu suite à une prise de conscience des

problèmes environnementaux (bioaccumulation et magnification) causés par la présence de ces

produits phytosanitaires et de ce fait à l’apparition d’organismes résistants (insectes, micro-

organismes ou plantes) vis à vis des pesticides chlorés.

Les propriétés des pesticides ainsi que la quantité appliquée déterminent leur devenir après

application au champ. La volatilité, l’hydrosolubilité et les phénomènes d’adsorption vont déterminer la

distribution relative du pesticide entre la phase vapeur (volatilisation et évapotranspiration), la phase

liquide (dissolution) et les surfaces solides (fixation sur particules de sol, racines, micro-

organismes…). Ainsi la persistance d’un pesticide dans un sol va dépendre directement de ses

propriétés physico-chimiques et de celles du sol. Un composé persistant va être difficilement

hydrolysable, faiblement biodégradable, avec une constante de volatilisation (ou constante de Henry)

faible et un fort coefficient de partage. Il va ainsi limiter la contamination des eaux souterraines ou de

surface (Carsel & Smith ; 1987) mais augmenter les risques d’adaptation d’organismes résistants et

de bio-accumulation.



16

I.3.2 Devenir dans le sol

Lors de l’application d’un produit phytosanitaire, la substance active va se répartir, dans des

proportions variant avec le stade de la culture, la formulation du produit, la cible, la technique

d’application (liquide pulvérisé, incorporation au sol, dépôt de granulés…)et les conditions

météorologiques, entre le sol, le feuillage de la plante ou les résidus de culture, et les pertes dues à la

« dérive » (entraînement par le vent).

Dès qu’ils atteignent le sol, les pesticides sont soit dégradés (chimiquement ou biologiquement), soit

dispersés, soit retenus. Les matières actives peuvent se volatiliser, ruisseler ou être lessivées et

atteindre les eaux de surfaces environnantes ou les eaux souterraines. Elles peuvent également être

adsorbées par les particules du sol, les plantes ou des organismes du sol.

Les processus suivants déterminent les différents comportements des pesticides dans les sols (Figure

1) :

• Dégradation par les micro-organismes

• Dégradation chimique (hydrolyse, oxydation, photodégradation…)

• Rétention par des composants organiques et minéraux du sol

• Adsorption par les racines des plantes

• Volatilisation

• Effet de dilution par les mouvements de l’eau

• Adsorption par certains végétaux

Figure 1 : Comportement des pesticides dans les sols

C 8 H 14 ClN 5 C8H15ON5 C6H11ON5 ...

Dégradationbiologique

Dégradationchimique

Volatilisation

Ruissellement ou lixiviation

Rétention

Adsorption Dilution

UV

Photodégradation

C8H14ClN5 → C8H15ON5 → C6H11ON5 → …



17

Le devenir des pesticides dans les sols est directement lié à la notion de persistance. La persistance

est définie par le temps de résidence d’un composé dans un compartiment défini (Greenhalgh, 1986).

La persistance d’un pesticide dépend des caractéristiques des cultures (morphologie, phase de

croissance au moment du traitement, taux de croissance, caractéristiques des cuticules), des

propriétés du pesticide (constante de Henry, solubilité, potentialité à subir des transformations

chimiques, physiques ou biologiques), des conditions environnementales (intensité des pluies, durée

et fréquence ; vitesse du vent ; humidité ; température ; intensité de la lumière ; nébulosité) et des

conditions d’applications (Himel et al., 1990).

Sirons et al. (1982) expriment la persistance de certains pesticides dans les plantes par la relation

suivante :

C= k(a*b*log t)

où :

- k : taux de disparition

- t : le temps après application

- a et b des coefficients.

Pour un herbicide, on peut en réalité distinguer trois formes de persistance (Heydel, 1998) :

- La persistance agronomique : temps durant lequel un effet phytotoxique est

observable sur les plantes sensibles.

- La persistance biologique : temps au cours duquel un effet est observable sur les

organismes vivants du sol.

- La persistance chimique : temps qui s’écoule entre le traitement et celui où

l’herbicide ne peut plus être détecté dans le sol, sans préjugé des voies de

disparition.

I.3.2.1 Rétention des pesticides dans le sol

La rétention englobe les processus d’adsorption sur le sol lui-même, sur les micro-organismes du sol

ainsi que sur les plantes. La rétention contrôle, et est contrôlée par des procédés de transformation

chimique ou biologique ; elle influence les transports du pesticide vers l’atmosphère, les eaux de

surface ou les eaux souterraines (Himel et al., 1990).

Elle est l’un des principaux facteurs responsables de l’efficacité d’un pesticide et a été largement

étudiée au cours de ces trente dernières années (Hamaker & Thompson, 1972 ; Yamane et Green ,

1972 ; Weber et al., 1974 ; Calvet, 1989).



18

L’adsorption correspond à la rétention d’un composé à l’interface sol-eau ou sol-air (Calvet, 1989).

L’adsorption/désorption est un processus dynamique au cours duquel les molécules sont

continuellement en équilibre entre la phase solide et la phase liquide (ou gazeuse).

Le phénomène d’adsorption est directement lié aux caractéristiques de la molécule et à celles de

l’adsorbant. Différentes interactions ou liaisons peuvent s’établir entre une molécule organique et un

support d’adsorption ; il peut s’agir de forces de van der Waals, de liaisons hydrogène, d’interactions

dipôle-dipôle, de liaisons ioniques, liaisons covalentes ou d’effet de protonation (Himel et al., 1990).

On peut également rencontrer des interactions hydrophobes (Chiou et al., 1979).

I.3.2.1.1 Facteurs de l’adsorption

(a) Propriétés des molécules de pesticide

Les propriétés moléculaires du pesticide jouent un rôle important dans les phénomènes

d’adsorption. Quatre propriétés sont déterminantes (Calvet et al., 1980) :

• le structure électronique de la molécule

• l’aptitude à être ionisée

• le volume moléculaire

• la solvatation des molécules par l’eau ou les solvants organiques

Dans le cas de structures covalentes comme l’atrazine, il faut tenir compte de la répartition et de la

mobilité des charges (polarité). L’atrazine possède un moment dipolaire de 4,63.10-18ues. (plus polaire

que l’eau (µ=1,85.10-18ues))

L’atrazine est une base faible (pKa de l’acide conjugué 1,68) (Calvet et al., 1980). Dans un sol

agricole (pH 4-8,5) l’atrazine n’est pas ionisée, ce qui exclut les phénomènes d’adsorption ionique. La

solubilité des bases faibles augmente quand l’acidité du milieu s’accroît ; dans le cas des triazines,

Yamane et Green (1972) ont décrit cet effet par une relation simple :

S= Si [1 + 10 (pKa – pH)]

où Si est la solubilité de la molécule non ionisée (30 mg.L-1 à 20°C pour l’atrazine).

(b) Propriétés des matériaux adsorbants du sol

Les propriétés des matériaux adsorbants sont complémentaires des propriétés moléculaires et

contribuent en partie à déterminer la nature des liaisons entre les molécules de pesticides et la

surface de l’adsorbant.



19

L’adsorption va dépendre de la composition du sol et de sa teneur en minéraux (argile, oxydes,

hydroxydes et allophanes (aluminosilicates hydratés)) et de sa composition en constituants

organiques. Elle dépendra également des paramètres physicochimiques du sol en question.

Les argiles présentent des propriétés d’échange d’ions importantes, dues à la présence de charges

positives à leur surface. Des travaux ont montré que les propriétés d’adsorption des argiles

provenaient très souvent de la présence d’hydroxydes amorphes sur ces surfaces (Calvet et al.,

1980). Tercé et Calvet (1978) ont déterminé pour l’atrazine, les constantes de l’isotherme d’adsorption

de Freundlich sur une montmorillonite (nf = 0,78 et Kf = 65) et une illite (nf = 0,35 et Kf = 7,2).

Tandis que la présence d’oxydes et d’hydroxydes cristallisés dans les sols joue un rôle minime

dans les phénomènes d’adsorption des bases faibles comme l’atrazine (Tercé et Calvet, 1975), les

hydroxydes libres présentent quant à eux une grande capacité d’adsorption en raison de leur aire de

surface élevée (400-800 m2/g) et de la présence de nombreux groupes hydroxyles (sites potentiel de

liaison hydrogène) (Calvet et al., 1980).

Les allophanes (aluminosilicates hydratés) possèdent une aire de surface élevée (environ 500 m2/g)

et des charges positives ou négatives leur confèrent des propriétés d’échange d’ions.

La teneur en matière organique (MO) est un indice essentiel dans l’adsorption des pesticides dans le

sol. De manière générale, l’adsorption des pesticides est significativement plus importante pour les

sols dont la teneur en carbone organique est la plus forte (Calvet et al., 1980). Celle-ci est

essentiellement responsable de la rétention des matières actives non ioniques.

Dans le cas d’un sol, il est parfois difficile d’établir une relation étroite entre les coefficients Kd et le

teneur en MO. La constante normalisée Koc (coefficient de distribution carbone organique/eau, en

dm3.kg-1) est définie par la relation suivante

%CO.100K d

oc =K

où Kd (le coefficient de partage sol-eau) exprime le degré d’adsorption du pesticide dans le sol et

%CO est le pourcentage de carbone organique du sol considéré (Leonard 1990) ; Koc rend compte de

la mobilité du pesticide.

Par rapport au Kd, le Koc ainsi déterminé, permet une meilleure appréciation pour différents types de

sol. Si la matière organique est le principal adsorbant qui intervient dans les sols, le Koc devient un

indice caractéristique de la molécule de pesticide pour ce type de sol.

Les différentes études d’adsorption de l’atrazine, ont montré une grande variabilité du Koc en fonction

des sols, pouvant aller d’environ 100 l/kg (Gustafson, 1989 ; Wauchope et al. (1992)) à 1680 l/kg pour

Roy et Krapac (1994). La constante Koc varie également en fonction de la profondeur du sol. De la



20

même façon les études de Barriuso et al. (1994) montrent qu’il existe une variation du coefficient

d’adsorption Kd de l’atrazine en fonction de la profondeur du sol.

(c) Influence des paramètres physicochimiques du sol

D’une façon générale, la protonation d’un composé, imposée par ou contrôlant le pH environnant, va

favoriser son adsorption dans un sol (Wang et al., 1991 ; Delage, 1995 ; Clay et al., 1988).

L’adsorption des formes protonées se fait au niveau des sites chargés négativement (argiles ou MO

tels que les substances humiques). La Figure 2 montre l’évolution de la capacité d’adsorption de

l’atrazine en présence d’acides humique (0,4 g.L-1) en fonction du pH.

Figure 2 : Evolution de la capacité d’adsorption de l’atrazine sur les acides humiques (AH) (0,4 g/L) en fonction du pH, d’après Wang et al. (1991)

Weber (1966) en étudiant l’adsorption des triazines par la Montmorillonite, a montré que la rétention

était maximale pour des pH voisins du pKa des molécules en question.

Pour les triazines, qui sont des bases faibles, la protonation a lieu a des pH très acides (pKa = 1,6

pour l’acide conjugué de l’atrazine). Les valeurs de pH rencontrées pour les sols (4,5 à 8,5 (Calvet et

al. 1980)) sont en général supérieures à celle du pKa des triazines ; ainsi, le pourcentage de la forme

protonée pour l’atrazine est très faible. On peut donc penser que les variations de pH n’auront qu’une

faible influence sur l’adsorption de l’atrazine dans les sols.

La solubilité d’un composé est fonction de la température du milieu, de la pression de vapeur mais

aussi de l’excitation moléculaire. La solubilité augmente souvent avec la température, et l’adsorption

chimique étant un phénomène exothermique, elle doit théoriquement diminuer lorsque la température

augmente. Ainsi Schiavon (1980) et Montiel (1990) confirment cette hypothèse. Balayannis (1988)

constate que l’augmentation de température de 3°C à 27°C, entraîne une diminution des coefficients

d’adsorption de l’atrazine (respectivement 26,2 et 12,4 g.kg-1) dans un sol limoneux. Cependant,

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 2 4 6 8pH

Bind

ing

capa

city

of

At.

(x 1

03 M/

g H

A)

Atra

zine

ads

orbé

e (x

103 M

.g-1

AH

)



21

Calvet et al. (1980) ont observé après de nombreuses études, que l’élévation de température

conduisait à une promotion de l’adsorption sur le sol en présence de matière organique (acides

humiques) et à une diminution ou à un effet nul dans le cas d’une adsorption sur les argiles. Avant

eux, Dunigan et Mc Intosh (1971) avaient également constaté que l’affinité des acides humiques pour

l’atrazine augmentait en même temps que la température. Ceci peut s’expliquer par le fait que

l’agitation moléculaire augmentant avec la température, la probabilité de choc est multipliée et

l’adsorption favorisée.

La force ionique peut influencer l’adsorption de certains pesticides sur les sols. Calvet (1980) et

Schiavon (1980) mentionnent ainsi que l’adsorption des triazines augmente en même temps que la

force ionique.

Une variation de l’état d’hydratation peut modifier l’agrégation de l’adsorbant et augmenter ou

diminuer les surfaces accessibles aux molécules de soluté (Calvet et al., 1980). Ainsi, Calvet et Tercé

(1975) ont observé que la quantité d’atrazine adsorbée par la Montmorillonite calcique augmente

quand la teneur en eau diminue. Cette augmentation est attribuée à l’effet de l’acidité de la surface de

l’argile qui est moins neutralisée dans les échantillons à faibles teneurs en eau.

I.3.2.1.2 Formation de résidus liés

On appelle résidus liés (ou « non extractibles ») les résidus adsorbés de façon irréversible par les

constituants du sol et qui ne peuvent par conséquent pas être extraits par les méthodes classiques

d’extraction (solvants organiques ou solutions aqueuses, extractions à chaud, agitation…). Ces

résidus comprennent aussi bien les molécules mères que leurs produits de dégradation. D’une

manière générale, la quantité de résidus liés augmente avec le temps de contact entre la molécule

active et le milieu adsorbant, diminuant ainsi la biodisponibilité de ces molécules vis à vis des micro-

organismes et par là même, la dégradation biologique du pesticide.

La formation de résidus non extractibles (RNE) peut également être la conséquence d’une

incorporation biologique : rétention du pesticide par les plantes ou les micro-organismes du sol (Calvet

et Barriuso, 1994).

Les taux de RNE pour l’atrazine varient entre 23 et 47% de la dose appliquée sur un sol limoneux ou

argileux en conditions naturelles, avec un maximum de RNE observé après 180 jours d’incubation

(Schiavon et al. 1990).

Les études de Stolpe et Schea (1995) montent qu’un sol traité à l’atrazine et incubé à 22°C présente

après 120 jours 46% de résidus liés dans les 15 cm supérieurs du sol, et seulement 3% de RNE au

niveau des couches plus profondes (150 à 240 cm).



22

I.3.2.2 Dégradation des pesticides dans le sol

Les pertes de pesticides dans le sol, du fait de la présence de micro-organismes ou de réactions

chimiques, sont confondues sous le vocable de dégradation.

La dégradation est un processus essentiel entraînant la disparition du produit par sa transformation et

influant sur la persistance et les possibilités de contamination. Ce processus peut entraîner la

dégradation totale du pesticide ou simplement former des produits de dégradation intermédiaires.

La cinétique de dégradation est souvent bien décrite par une loi exponentielle, traduisant le fait que la

quantité dégradée par unité de temps est proportionnelle à la quantité restante (cinétique de 1er

ordre) ; cette hypothèse est admise quel que soit le processus de dégradation, biotique ou abiotique.

La vitesse de dégradation est indiquée par le temps de demi-vie de la substance (DT50 ou t1/2) (van

der Werf, 1997). Le temps de demi-vie rend compte de la persistance d’un pesticide dans le sol et

exprime le temps au bout duquel 50% du produit appliqué au le sol a été dégradé. Elle varie en

fonction de la substance active elle-même (propriété chimique, persistance, solubilité…), du sol dans

lequel elle se trouve (paramètres physico-chimiques, composition,…) et des interactions entre eux ; la

vitesse de dégradation influe donc sur la persistance et la disponibilité du produit en question dans le

sol.

Le processus de dégradation d’un pesticide dans un sol, qu’il soit chimique ou biologique est

indissociable des notions de persistance et de disponibilité (ou biodisponibilité).

La constante de vitesse de dégradation k, et le temps de demi-vie sont les deux paramètres qui

permettent de caractériser une cinétique de dégradation.

Dans le cas de l’atrazine, l’augmentation du pH du sol entraîne une augmentation du temps de demi-

vie (Walker et al., 1983).

Ainsi comme montre le Tableau 2, les temps de demi-vie de l’atrazine peuvent varier de 14 à 248

jours suivant les conditions et le type de sol.



23

Tableau 2 : Exemples de temps de demi-vie de l’atrazine dans différents sols

Temps demi-vie (j) Type de sol, pH, T Références

55 Limoneux Weed et al. 1995

46 Sable limoneux Lafrance et Banton 1995

57 et 131 Sableux pH 4,7 et 6,5 Walker et Blacklow 1994

30, 32 et 16 Sable, limoneux, lim-argileux Topp et al. 1994

36 ± 6 Sable limoneux Gish et al. 1994

50 à 120 25 sols différents Reinhardt et Nel 1993

11-27

107-248

81-160

22°C (0-15 cm)

(45-120 cm)

(150-240 cm)

Stolpe et Shea 1995

14, 28 35°C, 25°C Walker et Zimdahl 1981

59 - Lafrance et al. 1992

60 à 73 Helling et al. 1988

64 - Jury et al. 1987

35 - Rao et Davidson 1982

I.3.2.2.1 Dégradation abiotique

Des phénomènes chimiques peuvent conduire à une transformation dans le sol des substances

actives.

La photo-décomposition sous l’effet de rayonnements ultra-violets est l’une des voies de dégradation

abiotique (Pelizzetti et al., 1990). La photo-décomposition de l’atrazine conduit à la formation

d’hydroxyatrazine et de dérivés déalkylés (Pelizzetti et al., 1990).

Ce processus de dégradation, qui peut avoir lieu à la surface du sol, dans l’air ou dans les eaux de

surface, est d’intensité relativement faible pour l’atrazine par rapport aux autres voies de dégradation,

surtout sous un climat tempéré (Heydel, 1998).

L’hydrolyse de l’atrazine en son dérivé hydroxylé est la principale voie de dégradation chimique de cet

herbicide (Armstrong et al. 1967 ; Li et Felbeck, 1972 ; Nearpas, 1972 ; Plust et al., 1981) ; celle-ci a

lieu essentiellement dans les premiers centimètres du sol et aboutit principalement à la formation

d’hydroxyatrazine.

Une étude de Plust et al. (1981) montre que la réaction d’hydrolyse est d’ordre 1 (réaction de

protonation) et a permis d’élucider les paramètres catalytiques et énergétiques de cette réaction. En

milieu acide, le mécanisme proposé se compose des étapes suivantes :



24

1° Protonation du cycle (réaction d’ordre 1) :

2° Réaction de l’entité protonée avec une molécule d’eau :

Dans le sol, la matière organique constitue la principale source de protons : en particulier les acides

humiques et les acides fulviques (Li et Felbeck, 1972 ; Gamble et Kahn, 1985)

I.3.2.2.2 Dégradation biologique

La dégradation biologique est la conséquence de la présence de certains micro-organismes (bactéries

et champignons essentiellement) dans les sols (Skipper et al. 1967 ; Migrain et al., 1993). Elle est

considérée comme la voie principale de dissipation des pesticides dans les sols (Bollag and Liu, 1990)

et dépend de nombreux facteurs (structure chimique, type de sol, texture, teneur en MO, pH,

température, humidité…).

La densité de la population des micro-organismes diminuant avec la profondeur du sol, on observe

une diminution de la biodégradation dans les couches profondes, la dégradation abiotique devenant

alors prépondérante.

La matière organique du sol a une influence capitale sur les phénomènes de biodégradation : sa

présence dans le sol va favoriser la rétention des pesticides, diminuant la biodisponibilité de ces

derniers vis à vis de la micro-flore. Pen revanche, la présence de matière organique dans le sol va

être synonyme de forte activité microbienne.

Le pH du sol joue également un rôle important puisqu’il va favoriser une dégradation biologique pour

des pH allant de 5,5 à 8, ou plutôt influencer la dégradation vers une voie chimique (hydrolyse par

exemple) dans un sol acide (<5,5) ; c’est ce qu’ont observé Best et Weber (1974) dans le cas de

l’atrazine.

k1 NH

+NHCH3

N

Cl

N

NH

CH3

CH3 + H2O NNHCH3

N

OH

N

NH

CH3

CH3

+ +H+ Cl

-2

Ka1 NNHCH3

N

Cl

N

NH

CH3

CH3+ H

+

NH

+NHCH3

N

Cl

N

NH

CH3

CH3



25

En règle générale, la voie biologique de dégradation s’accentue avec l’augmentation de la

température et de l’humidité du sol (jusqu’à une certaine limite). Ainsi certains auteurs ont remarqué

que l’augmentation de 25 à 35°C de la température d’incubation d’un sol (25% d’humidité) divise par

deux le temps de demi-vie de l’atrazine (Walker et Zindahl, 1981).

La biodégradation peut entraîner la minéralisation complète d’une substance, ou plus souvent, la

formation d’intermédiaires de dégradation, pouvant parfois être plus toxiques que le produit original.

La dégradation biologique peut être assurée par un seul organisme ou par les effets combinés de

plusieurs organismes consommant les pesticides comme sources d’azote ou de carbone (Kaufman et

Kearney, 1970). Grâce à leur forte capacité d’adaptation et de mutation, les micro-organismes sont

capables d’exprimer des enzymes de dégradation lorsqu’ils sont exposés régulièrement à des

substances étrangères indésirables. Ainsi, le traitement pluriannuel d’une parcelle avec le même

herbicide, va favoriser la présence d’une population spécifique de micro-organismes capables de

métaboliser la substance active. Ainsi, Barriuso et Houot (1996) ont montré que le taux de

minéralisation de l’atrazine augmente dans le sol avec la fréquence des applications de cet herbicide.

Ce résultat a également été confirmé par Vanderheyden et al. (1997) et Pussemier et al. (1997).

La dégradation biologique de l’atrazine aboutit principalement à la formation de résidus déalkylés

(Deséthyl-atrazine DEA, Desisopropyl-atrazine DIA, Deséthyl-desisopropyl-atrazine DEDIA) et

également à la formation de résidus déhalogénés (Hydroxyatrazine HA) (Kaufman et Kearrney, 1970 ;

Behki et Khan, 1986 ; Mougin et al., 1994), déaminés ou à noyau clivé (Gschwing, 1992 ;

Mandelbaum et al., 1993a et 1995).

Une réaction de dégradation de l’atrazine a été proposée pour les s-triazines ; celle-ci conduit à la

formation de l’acide cyanurique (dernier intermédiaire) avant une série d’hydrolyse (clivage du noyau),

entraînant la formation de CO2 et NH4+, dans le cas d’une dégradation totale dite minéralisation (Cook

et al., 1981 et 1987).

Le clivage du noyau triazine ne pourrait se faire que suite à une hydroxylation (Kaufman et Kearrney,

1970).

A titre d’exemple, Giardina et al. (1985) proposent un schéma de dégradation de l’atrazine par

Niocardia en précisant les voies possibles de dégradation chimique pouvant intervenir simultanément

dans les sols (Figure 3).



26

Figure 3 : Exemple de mécanisme de dégradation biologique et chimique de l’atrazine, d’après Giardini et al., 1985

En 1993 (a et b), Mandelbaum et al. montrent que certaines bactéries isolées d’un sol pollué utilisent

l’atrazine comme seule source d’énergie. La dégradation est négligeable à des températures

inférieures à 7°C, mais significative entre 15 et 25°C, à un pH de 5,5 à 7,3. Ils observent une

conversion supérieure à 80% d’atrazine entre 4 et 8 jours, à une concentration initiale de 100 mg.L-1,

tandis que le même taux de conversion peut être atteint entre 0,5 et 2 jours en milieu enrichi en citrate

et sucrose.

I.3.2.2.3 Minéralisation

La minéralisation consiste en la dégradation totale d’un composé sous l’action d’une activité chimique

ou biologique. Dans les sols, la minéralisation des pesticides, comme leur biodégradation, peuvent

NNHCH3

N

Cl

N

NH

CH3

CH3

NNH2

N

Cl

N

NH

CH3

CH3

NNH2

N

Cl

N

NH2 NNH2

N

Cl

N N

N

NH

O

NH2

NNH2

N

OH

N

NH

CH3

CH3

NH

NH

O

NH2

NH2

Dégradation Biologique

Dégradation Chimique



27

être le résultat d’une activité individuelle d’un micro-organisme particulier mais plus souvent d’un effet

combiné de diverses souches microbiennes.

La minéralisation représente l’aspect le plus intéressant d’un point de vue environnemental, puisqu’il

entraîne la décomposition totale d’un produit indésirable de manière naturelle. Certains micro-

organismes présents dans le sol sont capables d’utiliser un pesticide comme nutriment et source

d’énergie ; dans le cas d’une minéralisation, les produits de dégradation sont le CO2 et autres

composés inorganiques (NH4+, H2O,..).

De la même façon que précédemment, des applications répétées d’atrazine peuvent entraîner

l’apparition de souches aptes à minéraliser l’atrazine. Ainsi, Ostrofsky et al. (1997) ont montré que la

minéralisation de l’atrazine atteignait 80% dans un sol traité annuellement depuis 25 ans, alors qu’elle

était inférieure à 30% dans un sol traité une année sur quatre depuis 25 ans, et inférieure à 7% pour

un sol non traité auparavant.

Plusieurs souches bactériennes provenant de sols contaminés ont ainsi été isolées pour leur capacité

à minéraliser l’atrazine (Yanze-Kontchou et al., 1994 ; Mandelbaum et al., 1995 ; Struthers et al.,

1998 ; de Souza et al., 1998). (voir aussi liste complète p.63)

I.3.3 Volatilisation

La volatilisation est l’une des causes principales de fuites de pesticides hors de la zone cible,

notamment lorsque les traitements visent la surface du sol ou celle des végétaux. Ces pertes

dépassent en général les pertes dues à la dégradation chimique, au ruissellement et au lessivage (

Taylor et Spencer, 1990). La volatilisation est maximale lorsque l’application est faite par dépôt

aérien ; elle est considérablement réduite par l’incorporation du pesticide directement dans les sols

(sous forme de granulés ou par aspersion). Lors des traitements par aéronef, jusqu’à 50% du produit

peut être entraîné par le vent en dehors des zones à traiter (Pimentel et Levitan, 1986). L’utilisation de

rampes de pulvérisation réduit ces pertes qui peuvent atteindre toutefois entre 1% et 30% selon

Emans et al. (1992) et Pimentel et Levitan (1986). En 1992, Schiavon et al. considéraient que les

pertes par volatilisation de l’atrazine étaient de l’ordre de 3% maximum de la dose appliquée sur une

période de un an. Quelques années plus tard, une étude de Rice et al. (2002) montrait que le taux de

volatilisation de l’atrazine pouvait atteindre 59%, 4 jours après l’application du pesticide sur un sol

agricole.

Le taux d’évaporation dépend d’une part, des propriétés physico-chimiques de la molécule en

question et des conditions climatiques et environnementales (humidité et température de l’air,

humidité et température du sol ; intensité du vent).

La constante de Henry H (rapport de la pression de vapeur à la solubilité dans l’eau), rend compte du

taux de volatilisation d’une substance (Jury et al., 1984). Les produits ayant un H dépassant

largement 2,5 sont considérés comme très volatils (Jury et al 1984).



28

D’autre part, le mode de travail du sol influe sur la volatilisation. Pour un sol non travaillé, la teneur en

matières organiques est importante : l’adsorption augmente et la volatilisation diminue.

Les molécules volatilisées sont véhiculées rapidement par les courants aériens et très rapidement

diluées dans l’atmosphère ; à cette dilution s’ajoute également les effets photochimiques et les

oxydations destructrices, limitant ainsi leur impact sur l’environnement. Cependant, des risques

existent : la volatilisation est la principale voie de transfert vers les plantes et donc vers les hommes et

les animaux. Glotfelty (1987) rapporte également que les vapeurs peuvent se concentrer dans les

gouttelettes de brouillard puis être redéposées sur les végétaux.

I.3.4 Contamination des milieux aquatiques

Tous les ans, des consommateurs sont privés d’eau courante dans les régions de cultures intensives,

et les exemples ne manquent pas : la Basse Normandie, le Pays de Loire ou la Bretagne, ont

fréquemment connu ces périodes de « crise ».

Les fortes pollutions des eaux de surface sont en général de courte durée, on parle de pic de

pollution. La contamination des eaux souterraines est plus discrète mais aussi plus permanente

(Schiavon et al, 1995 ; Heydel, 1998).

La contamination des eaux souterraines ou des eaux de surface par les pesticides est essentiellement

due aux phénomènes de ruissellement et de lessivage engendrés par les eaux de pluie. Le

ruissellement contribue à la pollution des eaux de surface tandis que le lessivage contribue surtout à

celle des eaux profondes. Bien qu’on considère souvent séparément les eaux de surface et les eaux

souterraines, elles sont liées presque partout par le cycle hydrologique. En fonction des gradients

hydrauliques, c’est l’eau de surface qui alimente les aquifères ou l’inverse (Leonard 1990). En

conséquence, les taux de pesticides dans les eaux superficielles peuvent affecter les eaux

souterraines ou dépendre d’elles.

La pollution des eaux est liée aux interactions pesticides-sol et est fortement influencée par les

conditions climatiques. Le caractère polluant d’un produit est en pratique associé à l’incapacité du sol

à le retenir ou à le dégrader, avant que, sous l’effet de l’eau, il ne soit dispersé dans l’environnement.

On peut donc estimer que les possibilités de pollution de l’eau par un produit phytosanitaire sont

corrélées à son état de disponibilité dans le sol au cours du temps (Barriuso et al., 1994).

La stabilité des pesticides et leur potentiel d’entraînement sont responsables de leur transfert des

zones d’applications vers les milieux aquatiques via les eaux de pluie.

Les risques de pollution sont également induits par la présence des métabolites de dégradation des

pesticides eux-mêmes. Souvent négligés, ils constituent parfois des risques similaires voire supérieurs

au pesticide lui-même. Dans le cas de l’utilisation de l’atrazine, Liu et al. (1996) montrent que la DIA et



29

la DEA sont, elles aussi, systématiquement présentes dans le milieu, les fréquences de détection de

l’atrazine et de la DEA étant similaires, et supérieures à celle de la DIA, en raison des stabilités

respectives des composés. De plus, Bottoni et al. (1996) rapportent que, du fait de temps de demi-vie

dans le sol supérieurs à celui du composé initial (40 jours pour la DIA, 72 jours pour la DEA, 37 jours

pour l’atrazine), le potentiel de lessivage des métabolites est supérieur à celui de l’atrazine. Ainsi,

considérer uniquement l’atrazine comme polluant revient à sous-estimer l’état de pollution du milieu et

donc sous-estimer le risque encouru.

I.3.4.1 Le Ruissellement : contamination des eaux de surface

Le ruissellement peut être défini comme le mouvement latéral de l’eau à la surface du sol et des

matières dissoutes et suspendues qu’elle contient (Leonard, 1990). Ce phénomène a lieu chaque fois

que l’intensité des pluies dépasse la capacité d’infiltration du sol. Cet écoulement peut entraîner les

pesticides dissous, en suspension ou adsorbés sur les sédiments. Ce phénomène dépend donc de la

solubilité des produits dans l’eau et de la stabilité de leurs liaisons avec les constituants du sol

(Schiavon et al., 1995), mais aussi du mode d’application du pesticide et du mode de travail du sol. Le

ruissellement emporte – pendant la saison d’épandage – en moyenne 2% d’un pesticide appliqué à un

sol, rarement plus de 5 à 10% (Leonard, 1990 ; Schiavon et al., 1995).

Leonard et al. (1979), à partir de données de nombreux bassins versants, ont trouvé que la

concentration en pesticides dans les écoulements de surface était fortement corrélée aux

concentrations mesurées dans les 10 mm supérieurs du sol à ces endroits. Les substances peu

volatiles qui sont fortement adsorbées et résistent à la dégradation restent longtemps à la surface du

sol et sont de ce fait plus sensibles à l’entraînement particulaire ou colloïdal par l’eau. Leur

incorporation dans le sol réduira les risques de ruissellement. Les pesticides solubles seront plutôt

entraînés dans le sol par lessivage.

I.3.4.2 Le lessivage: contamination des eaux souterraines

Le transfert par lessivage ou lixiviation, peut causer la pollution des eaux souterraines par mouvement

vertical. Le lessivage est favorisé par les chemins préférentiels du sol ; ainsi, dans certaines

conditions, même les molécules de pesticides de faible solubilité peuvent être entraînées vers les

couches profondes du sol et les eaux de drainage à travers les failles naturelles du sol. L’importance

de ce phénomène dépend de la nature du pesticide, des propriétés du sol, de la vitesse d’infiltration et

de l’épaisseur de la zone non saturée. La mobilité et la persistance des pesticides doivent être

simultanément considérées lorsqu’on parle de risque de pollution des eaux souterraines. Gustafson

(1989) a proposé l’utilisation d’un indice simple et unique du risque de contamination par les

substances actives des eaux souterraines : le GUS, ou Groundwater Ubiquity Score.



30

Le GUS est donné par la formule :

GUS = log(t1/2)[4-log(Koc)]

où t1/2 est le temps de demi-vie et

%CO.100K d

oc =K

Les molécules pour lesquelles GUS > 2,8 sont considérées comme très mobiles ; celles dont GUS <

1,8 sont peu mobiles.

On retrouve en général dans les eaux souterraines des pesticides ayant un GUS supérieur à 2,8 ;

ceux dont l’indice est inférieur à 1,8 n’ont jamais été mis en évidence.

Concernant l’atrazine, les valeurs de lessivage d’un sol de Lorraine, obtenues pour l’année 1981-1982

avec un sol limoneux ont montré un entraînement par les eaux de percolation de 0,56% de la

radioactivité, initialement appliquée sous forme de 14C-atrazine ; l’atrazine ne représentant à la fin,

que 10%, le reste étant constitué des produits issus de sa dégradation (Schiavon 1988). Albanis et al.

(1988) ont travaillé en lysimètres avec différents types de sol ; leurs résultats indiquent que les

quantités d’atrazine drainées représentaient seulement 0,54% (sol argileux), 0,66% (sol limoneux) et

0,47% (sol limoneux-sableux) de la dose initiale appliquée. Pour Gaynor et al. (1992), la quantité

d’atrazine et de DEA lessivés dans un sol argileux représente 1,2 à 1,4% de la quantité initiale de

substance active épandue. Le mode de travail du sol peut également être un paramètre déterminant ;

une étude de Weed et al. (1995) montre que selon le mode d’exploitation du sol (36 parcelles

travaillées différemment ont été testées) la quantité d’atrazine drainée par lessivage variait entre 0,2

et 0,35% de la dose initiale appliquée.

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Procédés de traitement


31

II. Procédés de traitement de l’eau pour l’élimination des pesticides

II.1 Introduction

L’élimination des pesticides représente aujourd’hui un enjeu important pour préserver la qualité de

l’eau. La panoplie des procédés existants permet de bien adapter le traitement en fonction de la

nature de la pollution (accidentelle ou chronique) et des caractéristiques de l’eau à traiter. De

nombreuses techniques de traitement sont aujourd’hui à la disposition des industriels. Les principaux

procédés utilisés, énumérés ci-dessous (ozonation, dégradation photochimique, adsorption sur

charbon actif, procédés membranaires), ont déjà fait leur preuve. D’autres procédés, encore à l’état de

recherche (Oxydation au réactif de Fenton, traitement biologiques…), sont très prometteurs pour

l’élimination des pesticides.

Ce chapitre donne une liste non exhaustive des procédés actuellement existants et pouvant être mis

en œuvre pour le traitement des eaux polluées par l’atrazine. Il présente également quelques voies de

dégradation de l’atrazine (chimiques ou biologiques) mettant en évidence les métabolismes

préférentiels de l’atrazine (métabolismes qui pourront être comparés aux métabolismes de l’atrazine

par la souche bactérienne utilisée dans le cadre de notre étude).

II.2 Elimination de l’atrazine dans la filière classique de traitement

des eaux usées

Lors de l’étape de clarification, trois procédés physico-chimiques peuvent se succèder en cascade :

La coagulation-floculation, la décantation et la filtration, permettent d’éliminer les matières en

suspension. Au cours de cette étape, seuls les pesticides aptes à s’adsorber sur les particules

formées lors de la coagulation-floculation pourront être éliminés.

Les contrôles effectués sur plusieurs installations industrielles montrent que le pourcentage

d’élimination de l’atrazine au cours de ces étapes ne dépasse pas 12% (Degrémont, 1994).

Randke et al. (1994) observent que les procédés de coagualtion, filtration sur sable et chloration, sont

inefficaces pour l’élimination de l’atrazine. Cependant, un apport de 5 mg.L-1 de charbon actif en

poudre, à ce stade du traitement, permet un abattement de 40% de l’atrazine (Welte et al., 1996).

L’utilisation du chlore n’aurait quant à elle, aucune efficacité pour l’élimination des s-triazines (Guerra-

Sanchez, 2000).



32

Paillard et al. (1990) montrent que l’atrazine (11,4 µg.L-1) présente dans les eaux brutes, n’est pas

bien éliminée par une filière classique de production d’eau potable. L’abattement obtenu au cours de

la floculation –décantation est de 5% en moyenne. En revanche l’addition de 30 mg.L-1 de charbon

actif en poudre pendant la coagulation permet d’éliminer l’atrazine à 80%.

II.3 Procédés physico-chimiques dégradatifs

Différents procédés d’oxydation avancée existent actuellement dans les filières de production d’eau

potable. Les procédés d'oxydation avancée sont particulièrement appropriés pour le traitement des

effluents contenant des composés récalcitrants, toxiques ou non-biodégradables.

II.3.1 Oxydation à l’ozone

L’ozone est un oxydant puissant couramment utilisé pour le traitement des eaux potables. L’ozone

peut agir par une réaction directe (réactions très sélectives) ou de façon indirecte par l’intermédiaire

d’espèces secondaires comme les radicaux OH°, formés par décomposition de la molécule d’ozone.

Cette action indirecte est peu sélective, mais les cinétiques de réaction sont très variables selon les

matières à oxyder (Degrémont, 1989). Ainsi l’ozone dégrade les molécules avec plus ou moins

d’efficacité. Par exemple, il est totalement inefficace envers le lindane, à des doses compatibles avec

des applications à grande échelle (GLS, 2003)

Lors d’un traitement à l’ozone, il faut prendre en compte les contraintes induites par la mise en œuvre

d’une ozonation, à savoir la nécessité de mettre en place une filtration sur charbon actif en grains en

aval afin de retenir d’une part, les sous produits d’oxydation pouvant être nocifs, et d’autre part, les

bromates (composés cancérigènes) qui peuvent se former si l’eau brute contient des bromures.

L’action de l’ozone sur les pesticides peut parfois amener à la production de produits toxiques ; en cas

de forte dose d’oxydant, certains composés haloformes sont susceptibles de se former en présence

de matière organique (Dore, 1989, Ch6).

Dans le cas de l’atrazine, l’utilisation de l’ozone à des teneurs d’environ 3mg.L-1 ne permet pas

l’ouverture du cycle triazinique (Nelieu, 1994). Cependant Husley et al. (1993) constatent une

réduction de 80% de l’atrazine présente initialement à une concentration de 5 µg/.L-1. Welte et al.

(1996) montrent que sous l’effet de l’ozone, l’atrazine subit une déalkylation pour former la deséthyle-

atrazine (DEA).

A titre d’exemple, Acero et al. (2000) ont étudié les voies de dégradation de l’atrazine par ozonation

(Figure 4).



33

Figure 4 : Différentes voies de dégradation de l’atrazine par ozonation selon Acero et al. (2000)

L’ozonation est souvent couplée avec un autre procédé. Beltran et al.(1994) ont étudié la possibilité

de couplage avec l’irradiation UV.

Utilisé en couplage avec une méthode biologique, l’ozonation est intéressante, car dans certains cas,

elle facilite la biodégradabilité des composés. Ainsi, Lai et al. (1995) observent que le niveau de

biodégradabilité de la simazine (herbicide de la famille des s-triazines) est considérablement

augmenté lorsqu’un pré-traitement à l’ozone/UV est appliqué.



34

II.3.2 Oxydation au peroxyde d’hydrogène

L’utilisation du peroxyde d’hydrogène permet d’augmenter la quantité de radicaux OH• disponibles

pour l’oxydation radicalaire. Les radicaux OH•, extrêmement réactifs, sont consommés rapidement par

la matière organique, les bicarbonates, les carbonates, l’ammonium et les alcools tertiaires.

Le couplage de ces deux dernières techniques (O3/ H2O2) permet d’éliminer 90% de l’atrazine avec

des taux d’ozonation de l’ordre de 3 mg.L-1 d’O3. L’efficacité de ce traitement dépend de la dose de

H2O2 utilisée ; l’élimination de l’atrazine serait optimale à partir d’un rapport massique O3/H2O2 de 2,5.

Selon Gaid et Ravarini (1996) et Degrémont (1994), la combinaison O3/ H2O2 à des rapports

massiques de l’ordre de 4, avec une dose initiale d’ozone d’environ 2 mg.L-1 permettrait un

abattement de l’atrazine de 80%.

Pour une dose d’ozone de 2 mg.L-1, l’élimination de l’atrazine peut atteindre 46% pour une

concentration initiale de 370 µg.L-1 ; elle s’élève à 75% en présence de peroxyde d’hydrogène, ajouté

dans un rapport H2O2/O3 de 0,4 g.g-1 (Richard et al., 1991).

II.3.3 Traitement au réactif de Fenton (AFT, Anodic Fenton Treatment)

Ce procédé consiste en une oxydation par les radicaux OH• formés à partir de la réaction de Fenton :

Fe2++H2O2 → Fe3++OH-+HO•

Cette méthode utilise une cellule électrochimique composée d’électrode de fer (anode et cathode).

L’anode délivre du Fe2+ à la solution tandis que la cathode fonctionne comme une électrode inerte.

Les demi-réactions suivantes illustrent les phénomènes mis en jeu lors de la réduction de l’eau pour

former les radicaux OH• réactifs.

Fe → Fe2++2e-

2H2O+2e- → H2(g)+2OH-.

Appliquées à des eaux contenant de l’atrazine, les études ont permis de mettre en évidence 7

produits de dégradation. L’AFT permet la dégradation de l’atrazine en 3 minutes (70% d’abattement)

(Saltmiras et al., 2002). Cependant le cycle triazine n’est pas clivé par cette technique.

La dégradation primaire de l’atrazine par réaction de Fenton augmentant sa biodégradabilité

(déalkylation, déchlorination), cette technique pourrait être envisagée en couplage avec un traitement

biologique.



35

II.3.4 Dégradation photochimique

La dégradation photochimique de l’atrazine a été étudiée sous irradiation UV-Vis, en présence ou non

d’un catalyseur (dioxyde de titane, TiO2).

En présence de 500 mg.L-1 de TiO2, la demi-vie de l’atrazine dans une solution à pH 6 est de l’ordre

de 20 minutes. La desisopropyl-atrazine (DIA) et la deséthy-latrazine (DEA) sont les sous-produits

principaux, formés au cours de ce traitement. La deséthyl-desisopropyl-atrazine (DEDIA) ainsi que

l’hydroxy-deséthyl-atrazine (OHDEA) sont également retrouvées en quantité non négligeable (Héquet

et al., 2001).

Dans tous les cas, le noyau triazine n’est pas clivé mais, comme précédemment, le traitement

photochimique fragilisant la structure mère de l’atrazine pourrait être envisagé comme pré-traitement

à un procédé de dégradation biologique.

II.4 Procédés non dégradatifs : adsorption sur matrice poreuse ou

membrane

II.4.1 Procédés d’adsorption sur charbon actif en poudre ou en grains

II.4.1.1 Généralités

L'adsorption est un traitement efficace pour retenir les polluants, particulièrement quand la charge est

importante et la polarité faible. Le charbon actif est utilisé pour éliminer des molécules peu solubles,

du type phénols ou hydrocarbures saturés, les pesticides, les métaux lourds, certains agents tensio-

actifs, etc...difficilement dégradés par l'ozone.

Les performances des filtres à charbon actif dépendent de la température, ainsi que du composé à

adsorber.

La mise en place d’une ozonation en amont permet d’améliorer le rendement d’adsorption du charbon

et de le protéger contre toute prolifération bactérienne.

Les différents facteurs qui vont influencer l'adsorption des polluants sur les charbons actifs sont :

• La température : L'adsorption est un phénomène généralement exothermique, toute

élévation de la température diminue l'efficacité de l'adsorption.

• La solubilité : Les composants les moins solubles sont adsorbés plus facilement

• La structure moléculaire : Les chaînes à ramifications (encombrement moléculaire

important) sont plus facilement adsorbées que les chaînes non ramifiées.

• La taille moléculaire :Les grosses molécules sont généralement mieux adsorbées que les

plus petites.



36

• La polarité : Les molécules apolaires sont plus facilement adsorbées que les molécules

polaires (dans le cas des charbons actifs, la surface est apolaire).

• La saturation de la chaîne carbonée : Les molécules contenant des liaisons insaturées sont

plus facilement adsorbés que molécules à liaisons saturées (échanges électroniques).

Il existe deux principaux procédés distincts d’adsorption par charbon actif : l’un utilise le charbon actif

en poudre (CAP), l’autre le charbon actif en grains (CAG). Tous deux reposent sur l’accumulation à la

surface ou à l’intérieur des particules de charbon, des polluants contenus dans l’eau par interactions

physico-chimiques. Chacun est utilisé dans des conditions bien spécifiques.

Le CAP est utilisé par injection de barbotine (mélange eau-charbon en suspension). Cette injection

s’effectue idéalement le plus en amont possible de la filière de traitement afin d’obtenir des temps de

contact le plus long possible. Il faut également prendre en compte les taux de matières organiques

contenues dans l’eau, matières qui peuvent entrer en compétition avec les pesticides et en limiter

l’adsorption. La chaîne de traitement doit comprendre une étape de décantation – filtration située

après l’injection de charbon, de façon à retenir les particules de charbon. L’utilisation de CAP est

particulièrement adaptée aux usines possédant une filière complète de clarification. Elle permet

notamment de traiter des pollutions accidentelles.

Le CAG est utilisé dans le cas de pollutions chroniques, mais pour des concentrations relativement

faibles. Le CAG s’utilise en lit filtrant généralement placé en fin de chaîne de traitement, lits dans

lesquels l’eau percole avec un temps de séjour de 10 à 15 minutes.

Lorsque le filtre est saturé, il est alors régénéré en usine via un traitement thermique qui lui permet de

recouvrer ses propriétés adsorbantes.

II.4.1.2 Application à l’adsorption de l’atrazine sur charbon actif (CA)s

L’adsorption sur charbon actif est actuellement l’un des procédés les plus utilisé pour éliminer les

composés organiques et notamment les micro-polluants du type pesticide des eaux destinées à la

consommation humaine.

De nombreuses études ont été réalisées sur la capacité des charbons actifs à retenir l’atrazine.

Différents types d’essais ont été réalisés : en réacteurs agités ou en colonne, avec des charbons

actifs de différentes natures : en grain, en poudre, sous forme de fibres…

La durée d’utilisation des CA dépend du type de CA utilisé, de la durée de temps de contact et de la

concentration en pesticide et autres matières organiques présentes dans l’eau.

Les quelques exemples cités ci-dessous donnent une idée de l’efficacité du charbon actif sous ces

diverses formes à retenir l’atrazine.

• Lors des premières études sur la capacité du charbon actif à fixer l’atrazine, Holiday et Hardin

(1981) ont montré que 99,9% de l’atrazine présente dans une eau de rivière (concentrations



37

initiales 0,5 à 430 mg.L-1) pouvaient être éliminés par filtration sur charbon actif (pH de la

solution circulante = 9).

• Bouillot et al. (1991) observent une capacité d’adsorption de l’ordre de 38 mg.g-1 de CAG,

tandis que l’utilisation du même CAG en filtre entraîne une diminution de la capacité

d’adsorption d’un coefficient 1000 (concentration initiale en atrazine = 1 µg.L-1).

• Brunet et al. (1996) ont testé les performances de plusieurs types de charbon actif en filtrant

des eaux de forage dopées en atrazine (concentration initiale = 104 µg.L-1). En appliquant une

masse de 10 mg.L-1 de CAP, ils trouvent des capacités d’adsorption de l’ordre de 10 µg.g-1 de

CAP (temps de contact 72h). Lorsque la concentration initiale en atrazine est plus faible

(46 µg.L-1), la capacité de rétention de l’atrazine passe à 30 µg. g-1.

• Des expériences en colonne CAG menées par Croll et al. (1992) indiquent que pour de faibles

concentrations entrantes en atrazine (<10 µg.L-1) un temps de contact entre le polluant et le

support d’adsorption de 15 à 30 minutes améliore la capacité du charbon à retenir l’atrazine

par rapport à un temps de contact de 8 minutes.

• Randke et al. (1994) observent les meilleurs taux d’abattement lorsque :

La concentration en atrazine est faible

La quantité de CAP est comprise entre 10 et 20 mg.L-1

Le temps de contact est de 20 à 30 minutes

• Les expériences menées par Campos et al. (2000), en réacteur agité de type décanteur,

montrent que pour une dose de CAP de 4 mg.L-1 et un temps de contact de 29h, le taux

d’abattement de l’atrazine présente initialement à une concentration de 1,34 µg.L-1, s’élève à

80%.

• Une étude comparative sur les différentes formes de charbon actif (Martin-Gullon et Font,

2001) montre que l’utilisation de fibres de charbon actif (CAF) (surface spécifique =

1700 m2.g-1) est 7 fois plus efficace qu’un charbon actif en grain (CAG) (surface spécifique =

1100 m2.g-1). Cependant, ce même CAG devient plus performant que le CAF faiblement

activé (surface spécifique = 1500 m2.g-1).

De nombreuses études portent également sur l’influence de la matière organique (MO), présente

naturellement dans les eaux, sur la capacité des charbons actifs vis à vis de l’adsorption de l’atrazine.

D’une manière générale, la plupart des auteurs sont d’accord pour dire que la présence de MO dans

l’eau réduit l’efficacité d’adsorption de l’atrazine sur les filtres de charbon actif (Edell et al., 1993 ;

Prados et al., 1993 ; Matsui et al., 1994 ; Knappe et al., 1996 ).



38

II.4.2 Procédés membranaires : microfiltration, ultrafiltration et nanofiltation

La nanofiltration est utilisée dans les procédés de purification d’eau, tels que l’adoucissement, la

décolorisation et l’élimination de micro-polluants. Elle permet d’éliminer des molécules de petite taille

sous une pression élevée. La nano-filtration permet ainsi de retenir une partie importante de la

matière organique ainsi que les ions divalents et les bactéries. Les résultats des essais de nano-

filtration réalisés par Gaid et Ravarini (1996) sont présentés dans leTableau 3.

Tableau 3 : Elimination d’atrazine par nano-filtration (d’après Gaid et Ravarini, 1996)

Atrazine à l’entrée Atrazine en sortie Taux d’abattement

0,42 µg .L-1 <0,02 µg .L-1 95%

0,39 µg .L-1 <0,04 µg .L-1 90%

0,25 µg .L-1 <0,04 µg .L-1 80%

L’efficacité de la nanofiltration dépend non seulement de la structure des membranes mais aussi de la

matrice de l’eau : en effet, la matière organique contenue dans l’eau (notamment les composés

humiques) permet de former des complexes avec les pesticides à éliminer ; ces macro-molécules sont

alors facilement retenues par les membranes. La nanofiltration permet l’élimination du CODB

(carbone organique dissous biodégradable), ce qui limite la croissance bactérienne dans les réseaux,

ainsi que la demande en chlore.

Un prototype de nanofiltration mis en place en 1993 à Auvers sur Oise, est aujourd’hui en cours

d’utilisation et alimente 6000 résidents en eau potable. Les membranes développées permettent de

retenir les pesticides comme l’atrazine tout en laissant passer les ions calcium et le bicarbonate

(Ventresque et Bablon, 1997).

L’inconvénient de cette technique est qu’elle nécessite de haute pression. D’autre part un pré-

traitement doit être réalisé pour éviter les colmatages ; un post-traitement est également nécessaire

afin de reminéraliser l’eau traitée.

Il est aussi possible de coupler un procédé membranaire avec du CAP (charbon actif en poudre) :

dans ce cas, on utilise des membranes de microfiltration ou d’ultrafiltration, une barbotine de CAP

étant injectée dans une boucle de re-circulation à des concentrations allant de 5 à 20 mg .L-1 (GLS,

2003).

Comme dans la nanofiltration, cette technique permet d’obtenir de bons rendements d’élimination des

pesticides, mais est inefficace pour adoucir l’eau et éliminer les nitrates.



39

II.4.3 Valorisation des déchets verts pour le traitement de l’eau

II.4.3.1 Une solution économique

Le traitement des eaux contaminées par les métaux ou les micro-polluants du type pesticide,

colorants ou autres, fait en général intervenir des techniques onéreuses telles que la précipitation, la

filtration sur membrane, l’échange d’ions, l’adsorption sur charbon actif, etc.

Dans un souci économique, social et environnemental et dans le cadre des projets de Développement

Durable défini lors du Sommet de la Terre (Rio de Janeiro, 1992), des techniques alternatives sont

aujourd’hui étudiées afin d’une part, de réduire les coûts de traitement et d’autre part utiliser au

maximum des ressources renouvelables et valoriser les sous-produits de l’agriculture ou les déchets

issus d’activités industrielles ou agricoles.

Ainsi, les produits naturels, disponibles en large quantité ou certains déchets industriels ou agricoles

peuvent présenter un potentiel adsorbant intéressant pour le traitement des eaux contaminées. Afin

que le coût de traitement soit intéressant par rapport aux techniques classiques, le choix de ce

matériau doit se faire en fonction de sa capacité adsorbante, de la quantité disponible mais aussi de

sa disponibilité géographique (le transport de matière entraînant un coup et une pollution non

négligeable).

En général, un matériau adsorbant est économique s’il est utilisable dans un procédé simple, s’il est

abondant naturellement (au moins localement) ou s’il constitue un sous-produit ou un déchet d’une

activité industrielle ou agricole.

Ainsi de nombreuses recherches ont été menées sur une grande variété de matériaux tels que les

écorces, les lignines, les chitines, les algues, la biomasse microbienne morte, la canne à sucre, les

fibres de betteraves, les cotons, la laine, certaines cendres, la tourbe…

Dans notre étude, l’idée d’utiliser des matériaux naturels comme support pour le traitement d’eaux

contaminées par l’atrazine a vu le jour dans un souci économique et environnemental. Ainsi, nous

nous sommes intéressés aux études déjà réalisées pour l’élaboration de procédés de dépollution des

eaux par filtration sur des matériaux naturels, qui dans la plupart des cas, constituent une masse

importante de déchets largement disponibles et valorisables.

II.4.3.2 Quelques exemples

C’est dans le domaine de l’adsorption des métaux lourds que l’on retrouve aujourd’hui les plus

nombreux exemples d’utilisation de produits naturels adsorbants pour le traitement d’eaux usées. De

nombreux matériaux ligno-cellulosiques ont notamment été étudiés ces dernières années. Le Tableau

4, présente une liste non exhaustive des différents matériaux naturels utilisés pour l’adsorption des

métaux lourds.



40

Tableau 4 : Exemple de matériaux naturels utilisés pour l’adsorption de métaux lourds dans des procédés de traitement des eaux usées ou effluents

Matériau Polluant Référence

Bagasse Cd(II) et Pb(II) Peternel et al. (1999)

Peau d’oignons Cd(II), Pb(II), Cu(II) et Hg(II) Kumar et Dara (1980) ; Asai et al. (1986)

Brou d’amande Pb(II) et Zn(II) Omgbu et Iweanya. (1990)

Peau de cacahuète Cu(II) Randall et al. (1975)

Matériau cellulosique Cd(II), Cu(II) et Pb(II) Okeimen et al. (1985)

Shukla et Sakhardande (1990)

Ecorce de pin U Freer et al. (1989)

Ecorce de pin Cd(II), Pb(II), Cu(II) et Hg(II),

Cr(III), Fe

Vasconcelos (1989)

Epi de maïs Cu(II) Hawthorne-Costa et al. (1995)

Cotton Hg(II) Bailey et al. (1999)

Tourbe Cr(III) Bailey et al. (1999)

Fibres de betterave Ni(II), Pb(II), Cu(II) et Zn(II) Rima et al. (2004)

La capacité d’adsorption des matériaux naturels, tout comme celle de n’importe quel adsorbant, varie

essentiellement en fonction du pH et de la force ionique du milieu environnant et dans une moindre

mesure de la température. Ainsi, les études de Peternele et al. (1999) montrent, par exemple, que

l’adsorption du plomb (Pb(II)) et du cadmium (Cd(II)) sur des fibres de bagasse augmentait lorsque la

force ionique diminuait et le pH augmentait.

Rima et al. (2004) observent un pH optimal de 6 à 6,6 pour l’adsorption des métaux lourds sur des

fibres de betteraves et parviennent à éliminer 98% des métaux présents à des concentrations initiales

de quelques centaines de mg.L-1 (soit une adsorption de environ 100 mg.g-1 de matériau ).

II.4.3.3 Cas de l’écorce de pin

Parmi les matériaux naturels potentiellement exploitables dans le domaine de l’adsorption et du

traitement de l’eau, l’écorce de pin a fait l’objet ces dernières années de quelques études.

En tant que procédé alternatif aux traitements classiques, l’écorce de pin (matériau ligno-cellulosique)

est particulièrement intéressante puisque étant un sous-produit de l’industrie du bois, elle est

abondamment disponible et présente une affinité importante pour les composés, entre autres,

hydrophobes.

La littérature révèle deux sortes d’utilisation pour l’écorce de pin. Dans certaines études l’écorce est

utilisée comme adsorbant tel quel ; différentes granulométries sont évoquées et parfois une activation

chimique permet d’augmenter l’efficacité de cet adsorbant. D’autres études montrent une efficacité



41

particulièrement attractive de l’écorce de pin utilisée comme garnissage de biofiltres pour le

traitement des gaz ou traitement de l’eau. Dans ce dernier cas, l’écorce joue le rôle de support

d’adsorption des polluants et de croissance pour les micro-organismes, eux-mêmes responsables de

la transformation ou de la dégradation des polluants.

La plupart des études sur l’écorce de pin relatent de la capacité d’adsorption de ce support vis à vis

des métaux lourds (Farm, 2003 ; Blais et al., 2003 ; Al-Asheh et al., 2000 et 1997 ; Meunier et al.,

2002 ; Orlando et al., 2002 ). Composée, entre autre, de molécules polyphénoliques tels que les

tanins, l’écorce de pin, à un pH et une température appropriés, présente une certaine capacité à

retenir les cations métalliques en solution (Vazquez et al., 1994). Ces tanins font office d’échangeurs

d’ions (Laks, 1991) chélatants le di-cations comme présentée Figure 5.

Figure 5 : Echange d’ions entre la procyanidine (tanin de l’écorce) et un ion métalique divalent (Vazquez et al. 2002)

L’écorce de pin s’est ainsi révélée efficace pour le traitement d’eaux chargées en ions tels que Pb2+,

Cu2+, Cd2+, Cr2+ pour ne citer que quelques exemples. Les capacités maximales d’adsorption de

l’écorce vis à vis de Pb2+ peuvent atteindre jusqu’à 10,3 mg.g-1 d’écorce, 7,5 mg.g-1 pour Cd2+ ou

encore 6,4 mg.L-1 pour le Cr2+ (Al-Asheh et al., 1997). Al-Asheh et al. (1997) ont également étudié

l’influence de certains paramètres sur l’adsorption des métaux lourds ; ainsi, leurs résultats montrent

logiquement qu’une écorce de faible granulométrie (<0,075 mm) est un meilleur adsorbant qu’une

écorce de plus grosse granulométrie. D’autre part l’augmentation du pH favorise l’adsorption du Cd2+.

La présence de plusieurs ions en solution diminuerait l’efficacité d’adsorption de l’écorce pour la

plupart des métaux lourds, excepté le Ni2+, qui verrait son adsorption augmentée lorsqu’il est mis en

contact avec une écorce ayant subi un prétraitement en présence d’ions Cd2+ et Cr2.

D’autre part, Blais et al. (2003) ont travaillé sur de nombreux adsorbants naturels dont l’écorce de pin

et montrent que dans la majorité des cas, une activation du matériau par un traitement alcalin (0,75 M

NaOH) améliore l’efficacité du support pour la rétention de métaux lourds. Inversement, un traitement

acide (0,75 M H2SO4) entraîne l’effet inverse ou un effet nul.

Compte tenu de sa capacité à retenir les métaux lourds, l’écorce de pin a également fait l’objet de

tests comme bioindicateur de pollutions résultant de l’activité humaine, comme par exemple le trafic

automobile, ou les émissions d’activités industrielles (Lippo et al., 1995). L’écorce de pin s’est révélée



42

être un indicateur aussi efficace que les mousses ou les lichens quant au suivi de la concentration des

métaux lourds présents dans l’atmosphère (Lippo et al., 1995).

L’écorce de pin en poudre a également prouvé sa capacité d’adsorbant vis à vis de pesticides

organochlorés comme le lindane ou l’heptachlore. Brás et al (1999) prétendent ainsi obtenir des taux

d’abattement équivalents à ceux obtenus avec des filtres à charbon actif, pour certains organochlorés

présents en solution aqueuse (concentrations initiales 1 à 10 µg.L-1). Ils notent également que plus le

composé est hydrophobe, meilleure sera l’adsorption sur l’écorce de pin.

L’écorce de pin préalablement activée par l’épichloridine et la diméthylformamide (méthode EDM)

pourrait également présenter des capacités d’échange d’anions et être utilisée pour l’élimination d’ions

nitrate (Qmax = 1,06 mmol.g-1) aussi bien qu’une résine amberliteIRA-900 (Orlando et al., 2002).

Enfin, certains auteurs ont montré que l’écorce de pin pouvait être utilisée comme garnissage de

biofiltre. Ainsi, Du Plessis et al. (2003) utilisent un compost d’écorce de pin comme support de

biofiltration pour traiter des gaz chargés en méthane et parviennent à des taux d’abattement de

méthane (oxydation) de 70% (temps de rétention 30 minutes, concentration initiale en

méthane > 0,5%, v/v).

A des conditions optimales d’humidité (65%), l’écorce disposée en lit de 0,9 m de hauteur (charge de

65 m3.m-2.h-1) peut également servir de support de biofiltration pour le traitement d’air malodorant

chargé en sulfure d’hydrogène (Van Langenhove et al., 1986).

Un biofiltre à garnissage d’écorce de pin a également été utilisé par Ramirez-Lopez (2001) pour

l’élimination de composés organiques volatils (COV) présent dans l’air, tels que le dichlorométhane,

l’éthanol, le toluène ou encore la méthyl-éthyl-cétone. Ces études montrent notamment l’importance

de la teneur en eau de l’écorce et concluent que l’écorce sèche doit être privilégiée dans un tel

procédé par rapport à l’écorce humide.

Compte tenu de la quantité d’écorce de pin disponible au Portugal et dans le sud de la France, dans

l’idée de trouver des solutions alternatives aux traitements classiques souvent onéreux et à la vue des

résultats cités précédemment, nous avons choisi d’utiliser l’écorce de pin comme support d’adsorption

pour l’élimination de l’atrazine présente dans les eaux par biofiltration.



43

II.5 Procédés de dégradation biologique

Parmi les procédés retenus pour la décontamination, les traitements biologiques sont susceptibles

d’offrir un avantage économique important comparés aux procédés physico-chimiques classiques,

souvent plus complexes dans leur réalisation et souvent onéreux.

Les procédés biodégradatifs sont souvent simples à mettre en œuvre et applicables à d’importantes

surfaces ou volumes ; ils peuvent être envisagés in situ ou sur site, ce qui limite considérablement les

frais (excavation, pompage ou transport) et réduit l’impact environnemental.

Les procédés biologiques font appel à des micro-organismes tels que les bactéries, les levures ou les

moisissures pour la réduction de la charge organique des eaux résiduelles ou l’élimination de micro-

polluants toxiques spécifiques, récalcitrants aux techniques de la filière classique de traitement de

l’eau.

Les techniques biologiques présentent l’avantage (dans les plus favorables des cas), d’éliminer

totalement les polluants, contrairement aux techniques d’adsorption (le polluant est immobilisé mais

non dégradé) ou aux techniques physico-chimiques (dégradation souvent partielle).

II.5.1 Caractéristiques générales des bioréacteurs

La mise en œuvre des cultures bactériennes peut revêtir de très nombreuses formes. Il est classique

de distinguer les procédés dits à culture libres et les procédés dits à cultures fixées.

Dans les procédés à cultures libres, utilisés uniquement en traitement des effluents liquides, on

provoque le développement d’une culture bactérienne dispersée au sein du liquide à traiter. On utilise

pour cela un bassin brassé pour conserver en suspension la culture, et dans lequel on maintient :

soit, une certaine concentration en oxygène : ce sont les procédés aérobies tels que les boues

activées, le lagunage aéré ou naturel

soit, au contraire, l’absence d’oxygène : ce sont les procédés anaérobies tels que les procédés à lit de

boue ou le lagunage anaérobie.

Dans les techniques à cultures fixées, on utilise la capacité qu’ont la plupart des micro-organismes à

produire des exo-polymères permettant leur fixation sur divers supports, pour former un biofilm.

Les cultures fixées comme les cultures libres, peuvent s’utiliser en traitement aérobie ou anaérobie.

Les cultures libres ont comme avantage essentiel une relative simplicité de mise en œuvre. Elles sont

limitées cependant par les concentrations en micro-organismes accessibles et conduisent ainsi à des

volumes d’ouvrages importants.

Les cultures fixées en revanche, permettent d’obtenir dans les réacteurs des concentrations en

biomasse plus importantes, ce qui permet de réduire leur taille.



44

Dans le milieu particulièrement complexe que représente la plupart des eaux résiduaires, les éléments

traces, les vitamines et autres facteurs de croissances sont généralement en concentrations

suffisantes pour assurer le renouvellement des micro-organismes et donc une épuration correcte. Il

peut arriver cependant, que l’effluent à traiter ne contienne pas assez de phosphore, ni même

d’azote ; il faut alors en ajouter pour stimuler l’activité microbienne. Pour qu’un effluent puisse être

traité par voie biologique, il doit en outre présenter des caractéristiques compatibles avec la

croissance bactérienne : pH, température, salinité, absence de produits inhibiteurs ou toxiques.

Les substances contenant du carbone organique sont consommées par les micro-organismes. En

effet, le carbone représente le constituant essentiel du matériel cellulaire et les molécules organiques

sont sources de carbone pour les hétérotrophes et d’énergie pour les chimioorganotrophes. Les

sources d’azote susceptibles d’être consommées par les micro-organismes incluent pratiquement

toutes les formes d’azote organique ou minéral. L’azote est métabolisé pour fournir essentiellement

les protéines, les acides nucléiques et les polymères des parois cellulaires.

Le phosphore est également consommé et incorporé dans les acides nucléiques, les phospholipides

et les polymères des parois bactériennes. Il est aussi un élément capital de l’ATP intervenant dans les

échanges énergétiques cellulaires.

Ainsi les matières organiques comme les pesticides peuvent être éliminées par voie biologique ; ils

sont utilisés comme source d’azote ou de carbone selon le pesticide et les micro-organismes. Le

traitement biologique spécifique pour l’élimination d’un polluant particulier utilise un consortium ou une

souche isolée connue pour ces capacités à métaboliser celui-ci.

Dans le cas le plus favorable, le polluant est minéralisé sous forme de CO2 et H2O (minéralisation),

mais dans certains des cas, il est partiellement dégradé et des métabolites intermédiaires de

dégradation sont formés.

II.5.2 Traitements biologiques appliqués aux eaux contaminées par l’atrazine

Au cours des dix dernières années, et suite à l’utilisation intensive de l’atrazine dans les cultures

agricoles, des chercheurs ont imaginé divers procédés d’élimination de cette pollution. De nombreux

micro-organismes (bactéries ou moisissures), utilisés en cultures pures ou en consortium, ont été

isolés à partir de milieux pollués, et testés pour leur capacité à métaboliser l’atrazine, aussi bien dans

les sols que dans l’eau. Pour certains d’entre eux, l’atrazine est métabolisée en tant que seule source

de carbone (Behki et Khan, 1986 ; Yanze-Kontchou et Gschwind, 1994) ; pour d’autres, l’atrazine est

une source d’azote (Mandelbaum et al., 1995 ; Radosevich et al., 1995). Différents métabolismes de

dégradation de l’atrazine ont été décrits dont un mécanisme général pour les s-triazines proposé par

Cook (1987). Dans ce mécanisme général, la dégradation des triazines conduit à l’acide cyanurique,

dernier intermédiaire triazinique ; puis, la dégradation complète des triazines conduit à la formation de

CO2 et NH4+ via les composés intermédiaires non cycliques comme le biuret et l’urée. Dans le cas de

l’atrazine, la première étape consiste en une N-déalkylation (Mougin et al., 1994 ; Nagy et al.,1995) ou

une hydroxylation (Mandelbaum et al, 1993a et b).



45

Un exemple de dégradation biologique de l’atrazine est proposé par Ostrofsky et al. (2001)

Figure 6 : Exemple de dégradation de l’atrazine par une communauté bactérienne, selon Orstrofsky et al. (2002)

Yanze-Kontchou et Gschwind (1999) ont montré qu’une communauté bactérienne capable de

minéraliser l’atrazine dans les eaux usées pourrait être utilisée dans le cadre d’un procédé de

traitement des eaux, au sein d’une station d’épuration.

Certains auteurs proposent de pré-traiter l’eau à l’ozone avant de la faire percoler à travers un sol

biologiquement actif (Somich et al., 1990) ou circuler dans un bioréacteur contenant des bactéries

disposées en biofilm à la surface d’un support solide (Lesson et al., 1993 ; Hapeman et al., 1995).

Dans ce procédé, l’ozone utilisé en pré-traitement, transforme l’atrazine par oxydation en des

composés cycliques plus facilement biodégradables.

Hapeman et al. (1995) parvenaient ainsi, à l’aide d’un pré-traitement à l’ozone et l’utilisation de

Klebsiella terragena, à éliminer 80% environ de l’atrazine présente initialement dans l’eau à une

concentration de 110 mg.L-1, sous forme de CO2 et NH4+, en 1 jour.

Yanze-Kontchou et Gschwind (1994) ont étudiés l’utilisation de Pseudomonas YAYA6 pour traiter

aussi bien une eau polluée qu’un sol contaminé par l’atrazine, sans pré-traitement à l’ozone.



46

En 1994, alors que Stucki et al. (1995) se penchaient sur un traitement biologique pour les eaux

souterraines, Feakin et al. (1995) intéressés par un procédé couplé d’adsorption/biodégradation,

proposaient de développer un biofilm dans des colonnes de charbon actif, avec une bactérie reconnue

pour sa capacité à dégrader l’atrazine.

McKinlay et Kasperek (1999) quant à eux, ont étudié la possibilité de décontaminer des eaux polluées

à l’atrazine provenant de sites agricoles, à l’aide de macrophytes issus de marais (jonc, iris jaune et

roseau), déjà utilisés dans des procédés de traitement de l’eau (Figure 7).

Figure 7 : Schéma du procédé de traitement imaginé par McKinlay et Kasperek (1997)

Dans ce procédé, la microflore responsable de la biodégradation de l’atrazine est localisée dans la

rhizosphère des plantes macrophytes, qui joue le rôle de « tampon environnemental » pour les micro-

organismes. Quelques résultats de ce procédé sont présentés à la Figure 8.

Le système de McKinlay et Kasperek (1999) présente des résultats intéressants puisque l’atrazine (à

concentration initiale de 6-7 mg.L-1) est totalement éliminée de l’eau circulante, au bout d’un mois

(pour la première application d’atrazine avec le jonc) et en 4 jours au bout de la quatrième application

d’atrazine.



47

Figure 8 : Dégradation de l’atrazine au cours du temps avec 4 additions successives d’atrazine (6 mg/l) dans le système de McKinlay et Kasperek (1999) pour les 4 macrophytes étudiés.

Les divers procédés de traitement présentés ci-dessus ne sont encore envisagés qu’au stade de la

recherche, à l’échelle du laboratoire.

II.6 Procédés combinés

II.6.1 Généralités

Actuellement, il est admis que les procédés biologiques représentent un faible impact

environnemental et rentrent donc bien dans la liste des technologies utilisables pour le traitement de

l’eau. L’épuration biologique de l’eau, du sol et de l’air a lieu selon un schéma semblable. Dans tous

les cas, il s’agit de profiter de la capacité des micro-organismes à biodégrader une substance

indésirable. Ainsi, la biofiltration est devenue un procédé d’épuration particulièrement attractif.

L’efficacité de la biodégradation est parfois limitée dans les cas de contamination à faibles

concentrations. Le polluant étant une source d’alimentation pour les micro-organismes, celui-ci doit

être présent dans le milieu à une concentration suffisante pour permettre la croissance microbienne

ou une cinétique de biodégradation significative. Dans le cas de faibles concentrations (de l’ordre du

µg.L-1), le polluant ne peut assurer un apport énergétique suffisant et/ou la cinétique de

biodégradation est trop faible. L’idée des procédés combinés est donc de concentrer le polluant sur un

support d’adsorption afin que celui-ci puisse être consommé par les micro-organismes présents à la

surface du support solide.



48

D’autre part, les bactéries fixées sur un support présentent généralement des activités spécifiques

supérieures à celles observées en culture libre (Olstead and Weber, 1991).

Le matériau solide utilisé joue donc deux rôles essentiels :

• Adsorption du polluant

• Support de croissance pour les micro-organismes

Ce procédé de traitement est économique puisqu’il permet la régénération des « filtres » par

consommation du polluant par les micro-organismes ; il a un impact environnemental très limité si le

polluant est minéralisé, c’est à dire totalement dégradé sous forme de CO2 et H2O.

Ainsi, l’efficacité d’un tel traitement (adsorption + biodégradation) à été prouvée pour l’élimination de

phénol (5 µg.L-1) et de dichlorophénol (10 µg.L-1) en colonne de charbon actif en grain (CAG) inoculée

par des bactéries (Speitel et al., 1989) connues pour dégrader ces deux polluants organiques.

Feakin et al. (1995) ont expérimenté un traitement combiné sur colonne de CAG pour le traitement

d’eau polluée par de faibles concentrations en atrazine (10 µg.L-1).

Des colonnes inoculées et non inoculées, contenant 10 g de CAG et alimentées par un débit de

0,5 ml.min-1 (temps de contact 40 minutes) ont été suivies pendant 20 jours. Les résultats montraient

que la biodégradation à l’intérieur des colonnes inoculées participait à 53% à l’élimination de l’atrazine

(contre 0% dans les colonnes non inoculées). Les mêmes expériences réalisées sur 302 jours avec

de l’eau de rivière préalablement clarifiée puis ozonée ([atrazine]i = 5µg.L-1 environ) ont montré que la

présence d’un biofilm dans la colonne réduisait notablement la concentration en atrazine de l’eau

traitée en sortie de colonne. Cependant, la présence du biofilm dans les colonnes de CAG ne retardait

pas pour autant le passage au-dessus de la limite fixée de 0,1 µg.L-1 par rapport à l’utilisation d’une

colonne de CAG non inoculée. La présence de bactéries au sein du CAG participait donc à éliminer

l’atrazine par biodégradation, limitant l’adsorption de celle-ci sur le support mais cette biodégradation

n’était pas assez rapide pour empêcher l’accumulation du polluant sur le CAG et rendre le procédé

efficace.

Nous nous sommes inspirés de cette approche pour étudier et tester un traitement combiné utilisant

de l’écorce de pin en tant que support de biofiltration et Pseudomonas ADP sp. comme bactérie

capable de minéraliser l’atrazine. Pour cette étude, une connaissance en générale des procédés de

biofiltration a été nécessaire et est abordée dans le chapitre qui suit.



49

II.6.2 La biofiltration

II.6.2.1 Introduction

Le biofiltre est constitué d’un matériau granulaire à la surface ou au sein duquel les micro-organismes

sont immobilisés, empilés dans un réacteur généralement cylindrique : l’eau à traiter circule de

manière ascendante ou descendante à travers un lit généralement fixe ainsi constitué. Le polluant

contenu dans l’eau à traiter est adsorbé sur le biofilm ou les particules de support (« garnissage ») où

la dégradation microbienne à lieu.

Le garnissage utilisé peut contenir de la matière organique (compost, tourbe…) qui assure une grande

surface d’accrochage et l’apport de nutriments pour les micro-organismes.

Les biofiltres sont des unités qui utilisent des combinaisons de processus fondamentaux : adsorption,

absorption, biodégradation et désorption (Devinny et al., 1999).

La connaissance et le contrôle des différents mécanismes de formation d’un biofilm permettent

d’optimiser l’efficacité de celui-ci.

II.6.2.2 Principales propriétés des biofilms

Un biofilm est une structure complexe et dynamique dont les caractéristiques peuvent varier en

fonction du temps, du support d’adhésion, des micro-organismes mis en jeu, et des paramètres

physico-chimiques environnants.

Un biofilm est une matrice d’aspect gélatineuse constituée par une agglutination de micro-organismes,

adhérents à une surface solide et la plupart du temps immergée dans un milieu liquide aqueux (Melo,

et al. 1994). L’adhésion au support solide se fait grâce à la présence de polymères extracellulaires

(polysaccharides chez les bactéries gram-négatif ou peptidoglycanes chez les bactéries gram-positif)

présents à la surface des micro-organismes. Cette structure extracellulaire permettant l’adhésion des

bactéries à un support est aussi appelée glicocalix (Costerton et al., 1995).

Les biofilms sont le plus souvent hydrophiles ; cette propriété est attribuée à la présence de nombreux

sucres hydrophiles au niveau de la pellicule extracellulaire de polysaccharides. L’adhésion sera donc

facilitée à la surface d’un support hydrophile.

Un biofilm peut être organisé en différentes couches entre la base et la superficie du biofilm. Par

exemple, on peut au sein d’un même biofilm, trouver des zones anaérobies au niveau de la base et

des zones aérobies en contact avec le liquide circulant.

La couleur d’un biofilm peut être variée, allant du blanc translucide au noir, variant selon les micro-

organismes présents. Une même souche microbienne va présenter des caractéristiques structurales

différentes lorsqu’elle est libre en solution ou lorsqu’elle est adsorbée à la surface d’un support solide.

L’épaisseur et la densité du biofilm varient en fonction des propriétés physico-chimiques et

biologiques du milieu environnant (conditions hydrodynamiques, composition du milieu circulant,



50

vitesse de circulation…). Les densités de biofilms peuvent varier entre 10 kg/m3 jusqu’à 105 kg/m3

(Vieira,1995).

La diffusion d’un soluté à l’intérieur du biofilm dépend des caractéristiques du biofilm (densité,

rugosité, etc…) et des conditions de circulation de la solution (vitesse de circulation du fluide…) ainsi

que des propriétés du soluté en question.

II.6.2.3 Comportement des micro-organismes en biofilm

Les micro-organismes se comportent de manière très différente lorsqu’ils sont libres en suspension et

lorsqu’ils sont organisés en biofilm à la surface d’un support solide (Fletcher, 1992). Il apparaît dans la

nature que la bactérie « préfère » résider sur une surface dans un milieu aqueux plutôt que « flotter

librement » (Melo, 1997). Les changements fondamentaux au niveau physiologique et cellulaire qui

apparaissent lors de la formation d’un biofilm, peuvent se traduire par une augmentation de la

résistance des micro-organismes vis à vis des agressions extérieures (O’Toole et al., 2000).

La principale différence est la distance entre les micro-organismes : à l’intérieur d’un biofilm la

proximité des micro-organismes entre eux est bien supérieure à celle observée en solution. D’autre

part, la présence d’une matrice extracellulaire va modifier les propriétés physico-chimiques du milieu

(forces d’interactions superficielles). La formation d’un biofilm va engendrer la création de gradient de

concentration, de pH, de champs électriques, de zones d’aérobiose et anaérobiose qui vont induire

nombre de variations dans le comportement des micro-organismes (Melo et al. ,1994).

Parmi les micro-organismes, les bactéries semblent être les plus adaptées à la formation de biofilm ;

ceci est dû à leur petite taille, à leur taux de croissance élevé, à leur capacité d’adaptation au milieu

ainsi qu’à leur forte capacité à synthétiser des polymères extracellulaires (Vieira, 1995).

Au sein des biofilms formés de communautés bactériennes, on peut trouver de nombreux genres et

espèces différentes. Dans ces communautés, le transfert de gènes est favorisé et les bactéries

échangent leur matériel génétique à des fréquences très élevées (Filloux et Vallet, 2003).

II.6.2.4 Formation des biofilms

L’épaississement du biofilm est en général représenté par une sigmoïde (Figure 9). Après une courte

période de conditionnement, le biofilm se développe rapidement puis se stabilise. Durant le

conditionnement, les (macro)molécules présentes dans le milieu circulant s’accumulent à la surface

du support. Ces (macro)molécules peuvent être des nutriments qui vont attirer les bactéries à la

surface du support et ainsi initialiser le développement et l’épaississement en biofilm (Melo, 1997). Au

niveau du plateau, le biofilm a atteint son épaisseur optimale et un équilibre s’établit entre la

croissance cellulaire (biodisponibilité des nutriments en fonction de l’épaisseur du biofilm) et l’érosion

du biofilm due aux forces appliquées par la circulation du liquide.



51

Figure 9 : Developpement idéal d’un biofilm (Melo, 1997)

La Figure 10 illustre les différentes étapes de formation d’un biofilm . Ces étapes sont les suivantes :

1. Transfert de masse de (macro)molécules vers la surface du support et adsorption de celles-

ci : formation d’un film de conditionnement.

2. Transport des micro-organismes vers la surface adsorbante et adhésion (réversible)

3. Adsorption irréversible des micro-organismes à la surface du support.

4. Transport de nutriments (transfert de masse externe et interne) à l’interface liquide/biofilm et à

l’intérieur du biofilm.

5. Métabolisme cellulaire et transformation du biofilm : production de nouvelles cellules et de

polymères extracellulaires (EPS).

6. Transport des métabolites produits par le biofilm vers l’extérieur.

7. Processus de détachement du biofilm : érosion superficielle ou décollement engendré par les

forces hydrodynamiques ou effets internes.

Epa

isse

ur d

u bi

ofilm

Temps

Conditionnement

Developpement rapide

Plateau



52

Figure 10 : Les différentes étapes de formation d’un biofilm (adapté de Melo, 1994)

La vitesse de formation du biofilm dépend de la vitesse du processus le plus lent. Par exemple, la

vitesse de transfert des nutriments à l’intérieur du biofilm limite le taux de consommation du substrat

par le biofilm et limite donc sa croissance.

II.6.3 Facteurs influençant la formation et l’activité des biofilms

De nombreux facteurs influencent la formation du biofilm. Les principaux paramètres à prendre en

compte sont : les caractéristiques des micro-organismes, la composition du support d’adsorption et

ses propriétés physico-chimiques, la composition du fluide le traversant, ainsi que de nombreux

paramètres physico-chimiques tels que la température, le pH, la force ionique…On devra également

tenir compte de la vitesse du fluide et de sa turbulence ainsi que de la présence de particules

organiques ou minérales.

II.6.3.1 Caractéristiques des micro-organismes

La formation de pellicule biologique va dépendre de la nature des micro-organismes présents ; d’autre

part, l’état physiologique des micro-organismes, associé à l’excrétion des polymères, sera déterminant

pour l’adhésion à un support.

O’Toole et Kolter (1998) ont développé une méthode de criblage génétique qui a permis de

caractériser un certain nombre de déterminants importants dans la formation de biofilm, dont la

présence d’appendice extracellulaire tels que les flagelles (qui permet à la bactérie de se déplacer en

milieu liquide ou semi-solide) les pili de type IV (structures fibrillaires présentes au pôle de certaines

bactéries à gram négatif ; Wall et Kaiser 1999) ou encore les appendices extracellulaires comme les

fimbriae ou les curli.

3

Micro -organismes

Film de conditionnement

1 2

Nutriments

4

5

Métabolites

6

7

BIOFILM SUPPORT D’ADSORPTION

FLUX



53

Les flagelles, les pili de type IV ou encore les Cup (fimbrae ou curli), sont des appendices de surface,

essentiels à la formation du biofilm, plus particulièrement dans sa phase initiale (approche et la

colonisation de la surface). Dans l’étape suivante, ces structures ne sont probablement plus

nécessaires et laissent la place à d’autres déterminants qui vont permettre la structuration et la

différenciation du biofilm (Filloux et Vallet, 2003). L’adhésion aux supports solides sera ensuite

facilitée pour des micro-organismes ayant une forte capacité à produire les polymères extracellulaires

(type alginate, par exemple chez P. aeruginosa, lipopolysaccharides…). Ainsi une souche dite

« muqueuse » pourra donner un biofilm d’une épaisseur moyenne de 40 µm, alors qu’une souche

« non muqueuse » ne pourra former qu’un biofilm de 6µm d’épaisseur (Filloux et Vallet, 2003).

II.6.3.2 Le support d’adsorption

La nature du support utilisé joue un rôle essentiel sur la capacité d’adsorption des polluants ainsi que

sur la fixation des micro-organismes. Ce support peut être constitué de particules homogènes ou

hétérogènes, il peut être rugueux ou lisse. Quel que soit le matériau choisi, la connaissance de ses

caractéristiques physico-chimiques et biologiques est fondamentale ; l’influence du microflore indigène

pouvant influencer notablement la formation d’un biofilm à sa surface (possibilité de compétition entre

les micro-organismes indigènes et exogènes).

Le support est un matériau solide qui peut être de nature organique, tels que : tourbe, compost

végétal, écorce de pin, fumier, gousse de cacahuètes (Chou et al. 1997 ; Ramirez et al. 1997) ou

charbon actif (Feakin et al. 1995, Servais et al. 1991, Scott et al. 1995, Jones et al. 1998). On trouve

également des matériaux inorganiques comme les matériaux argileux, le verre (Jucker et al. 1996), ou

des matériaux synthétiques comme la mousse, les billes de polystyrène (Devinny et al. 1999), des

structures Teflon (Jucker et al. 1996) ou encore des résines de type Ambérlite (Grosser et al. 2000),

etc…

Le Tableau 5 présente quelques exemples de matériaux utilisés pour la biofiltration lors de récentes

études expérimentales.



54

Tableau 5 : Supports utilisés dans les systèmes de biofiltration (selon Métivier, 2001)

Support d’adsorption Références

Compost Cardenas-Gonzales et al. 1999

Compost / perles de polystyrène Jan et al. 1998

Compost / charbon actif / lime / perles polystyrène Campbell et Connor 1997

Compost / charbon actif Hwang et Tang 1997

Compost / celite R-635 Sanchez-Pena et al. 2000

Compost / perlite Morgenroth et al. 1996

Compost de fumier de porc Chou et Cheng 1997

Compost / tourbe / bois Hsu et al. 2000

Compost / perlite / charbon actif Lee at al. 1999

Bioton® / charbon actif Deshusses et al. 1996

Sol / compost / écorce de pin Marran et Lausten 2000

Tourbe Wang et al. 1996

Tourbe / perle en verre Zilli et al. 2000

Tourbe / perlite Budwill et Coleman 2000

Tourbe / matériaux minéraux Wu et al. 1999

Ecorce de pin Douglas Lewis et al. 2000

Déchets des écorces / perlite Lee et al. 1996

Ecorce de pin / compost d’ordure de poulet Lackey et al. 1998

Charbon actif Feakin et al.1999

Support d’adsorption Références

Coquilles de cacahuètes Ramirez-L 1997

Billes d’alginate Chung et al. 1997

Boues granulées Gracian et al. 1998

Particules de biomasse Jorio et al. 2000

Mousse de polyuréthane Moe et Irvine 2000

Céramique / diatomée Lim et al. 2001

Les principales caractéristiques physiques du support à prendre en compte sont la

granulométrie, la porosité, la surface spécifique, la taille des pores, la perméabilité du lit constitué et la

capacité de rétention en eau ; ces paramètres permettront d’approcher le comportement

hydrodynamique du biofilm. Les caractéristiques chimiques essentielles d’un support sont le pH de

surface, la teneur en carbone, en azote, la nature des fonctions de surface et la charge, ainsi que la

composition ; celles-ci seront représentatives de la qualité du garnissage pour le développement et la

croissance du biofilm.



55

En règle générale, le support solide est un milieu poreux ; il doit donc présenter une grande surface

d’adsorption et une faible résistance au passage du fluide afin de réduire les pertes de charge. La

présence de micro-pores peut favoriser l’adsorption en créant une grande surface spécifique (Durham

et al. 1994 ). Parfois, le mélange de différents matériaux permet d’optimiser l’efficacité du biofiltre et

confère au filtre des propriétés mécaniques favorables, permettant par exemple d’éviter des

phénomènes de colmatage.

Pour une bonne adhésion des micro-organismes, le support doit de préférence être hydrophile, avoir

une surface rugueuse et ne doit pas être toxique (Durham et al. 1994).

D’autre part, la connaissance de sa biodégradabilité renseignera sur la stabilité du support. La

présence d’une activité microbienne à l’intérieur même du milieu filtrant aura également un rôle

essentiel sur le développement du biofilm, puisque celle-ci pourra engendrer des phénomènes de

compétition parfois non négligeables.

II.6.3.2.1 Caractéristiques physiques du support d’adsorption

Les principales caractéristiques physiques déterminantes pour le choix d’un support sont les

suivantes :

Surface spécifique et taille des pores : Plus la surface spécifique du support sera élevée, meilleur sera le développement des micro-

organismes à sa surface. La surface spécifique est de l’ordre de 380.103 m2.m-3 pour le compost, de

29.103 m2.m-3 pour l’écorce de pin (Smet et al. 1996), et de 500.106 m2.m-3 pour le charbon actif

(Barbulea, 2000). Les micropores sont peu occupés par les micro-organismes ; Tang et al. (1996)

estiment par exemple, que le biofilm formé sur un support de compost occupe une surface de

185 m2.m-3 seulement. Vieira (1995) a constaté que les supports d’adsorption dont les pores étaient

de dimensions 4 à 5 fois supérieures à la taille des micro-organismes, constituaient un support idéal

pour l’adhésion et le développement de biofilm.

Masse volumique : Les matériaux de faible masse volumique sont recommandés ; un matériau léger et qui comporte de

bonnes propriétés mécaniques évitera ainsi des problèmes de tassement. Les problèmes de

colmatage sont également à prendre en compte. Le compost est un bon exemple de matériau de

faible masse volumique (300 à 500 kg.m-3, humide) mais pose souvent des problèmes de colmatage à

cause notamment de sa faible granulométrie. Les sols (1000 à 5000 kg.m-3 pour un sol en place) sont

des matériaux beaucoup plus denses.



56

Indice de vide ou porosité intergranulaire : C’est l’espace disponible entre les particules d’un support ou garnissage, pour le passage d’un fluide

liquide ou gazeux à travers un lit. Un indice de vide élevé (ε ≥ 0,7 avec totalvolume

videdevolume ""=ε ) peut

éviter de fortes pertes de charge et des problèmes de colmatage (Kennes et Thalasso 1998 ; Le

Cloirec 1998). Une distribution homogène des diamètres de particules, induit un écoulement du fluide

plus uniforme à travers le lit garni. Un indice de vide compris entre 0,3 et 0,7 est conseillé pour un

biofiltre ( Martin et al. 1993 ; Baltzis et al. 1994 ; Bohn 1996 ; Kennes and Thalasso 1998).

Capacité de rétention en eau : Le support doit de préférence posséder une capacité de rétention en eau élevée pour fournir aux

micro-organismes l’eau nécessaire à leur croissance. L’eau retenue par le support favorise

l’accrochage des cellules à celui-ci. La capacité de rétention en eau est fondamentale car elle permet

le maintient des propriétés structurales du support. L’eau permet le transfert des polluants vers le

biofilm. Une capacité de rétention en eau comprise entre 40 et 80% (massique) est convenable quand

le support est saturé (Ottengraf 1986 ; Devinny 1999).

Granulométrie et caractéristiques de surface La taille des particules d’adsorbant ainsi que leur composition peuvent stimuler ou non l’adhésion du

biofilm. De manière générale, les études réalisées sur le développement des biofilms montrent que :

• L’adhésion des micro-organismes sur des particules est facilitée par la présence de charges

positives à la surface de celles-ci.

• Des inhibiteurs métaboliques ou la présence de métaux à la surface des particules peuvent

influencer la formation du biofilm.

La rugosité du support affecte particulièrement la rétention mécanique des (macro)molécules et des

micro-organismes et donc leur adhésion au support. De manière générale, l’augmentation de la

rugosité d’un support augmente la rétention des micro-organismes à sa surface. Après avoir étudié la

formation des biofilms sur différentes surfaces, Mott (1991) observe que sur une surface lisse (tube

d’acier inoxydable électropoli), le développement d’un film bactérien de Pseudomonas fluorescens est

35% moins dense que sur un même tube d’acier non poli.

Ce sont les irrégularités du support qui vont conditionner la formation des premières pellicules

biologiques.

Il est donc nécessaire de trouver un bon équilibre entre tous ces paramètres physiques afin d’assurer

une bonne stabilité du garnissage, d’éviter les colmatages et la formation d’agrégats de particules de

support.



57

II.6.3.2.2 Caractéristiques chimiques du support d’adsorption

Les principales caractéristiques chimiques du support d’adsorption à prendre en compte pour le bon

développement d’un biofilm sont les suivantes :

Le pH : D’une manière générale, les micro-organismes requièrent pour leur bon développement, un pH

proche de la neutralité ; le matériau utilisé devra de préférence posséder un pouvoir tampon. Les

supports organiques utilisés possèdent en général des pH compris entre 6 et 8. L’addition de

carbonate de calcium, carbonate de sodium, de soude ou autre composé tampon est préconisée lors

de l’utilisation de garnissage à faible pouvoir tampon. Dans certains cas particuliers, on pourra

observer le développement d’un biofilm à la surface de support possédant de faible pH (5-6) ; c’est le

cas pour un garnissage d’écorce de pin (Ramirez-Lopez, 2001).

Nutriments inorganiques et matière organique : La présence de nutriments dans le garnissage favorise le développement des micro-organismes à sa

surface. Le matériau considéré peut être une source de carbone, d’azote, d’hydrogène ou d’oxygène,

ou source de minéraux, ou encore de vitamines. Pour un support de compost, on trouve des

concentrations en azote, phosphore et potassium aux alentours de 0,4%, 0,15% et 0,15% (w/w sur

produit sec) respectivement, ce qui représente des concentrations satisfaisantes pour une bonne

activité microbienne. Dans le cas de garnissage pauvre en nutriments, il sera nécessaire d’apporter

ces nutriments par circulation d’une solution nutritive.

Les fonctions de surface : Les fonctions chimiques présentes à la surface du support peuvent être acides ou basiques et

influencent l’adhésion des micro-organismes et l’adsorption des polluants à sa surface.

II.6.3.2.3 Caractéristiques microbiologiques du support d’adsorption

L’utilisation d’un biofilm pour l’épuration d’un fluide peut se faire de différentes manières :

- dans un premier cas, le biofilm peut être constitué de micro-organismes endogènes au

support, c’est à dire naturellement présents (dans un compost, une tourbe ou autre). A titre

d’exemple, les supports comme l’écorce de pin ou la tourbe contiennent des populations

bactériennes spécifiques répondant facilement à de nouvelles conditions d’alimentation en air

ou en eau polluée et sont connues pour éliminer certains polluants (Bohn 1996).

- Dans d’autres cas, pour un polluant particulier, ou pour un garnissage pauvre en micro-

organismes (matériau synthétique par exemple), une inoculation est nécessaire avec des

boues activées, du sol, du compost ou des cultures bactériennes pures ou en consortium, afin

d’obtenir le biofilm désiré.



58

Dans le cas d’une inoculation de micro-organismes étrangers au support d’adsorption, il est

nécessaire de s’assurer de la survie et de l’adhésion de ces micro-organismes sur le garnissage, qui

peut être perturbée par compétition entre la microflore endogène et la ou les souches inoculées.

L’inoculation de micro-organismes exogènes en grande quantité permet d’avantager la flore exogène

dans sa compétition avec les différentes souches bactériennes présentes au sein du support.

Dans certains cas, une stérilisation préalable du support peut être recommandée.

II.6.3.3 Composition du fluide

Le pH de la solution circulante est également l’un des paramètres principaux influençant la formation

du biofilm. Le pH de la solution va conditionner la physiologie des micro-organismes ainsi que les

propriétés électriques des cellules et du support d’adsorption. En fonction du pH, les fonctions

chimiques présentes à la surface des cellules, des macro-molécules et du support vont être plus ou

moins répulsives ou attractives (Melo, 1994).

La composition de la solution va également affecter la production de bio-polymères responsables de

l’adhésion des cellules ; cette production est stimulée par un rapport carbone/azote élevé (Wimpenny

et al. 1977, Robinson et al. 1984).

D’autre part, la disponibilité des nutriments est également un facteur influençant l’épaisseur de biofilm

(Bott et Miller 1983). Des expériences menées par Trulear et Characklis (1982) ou Characklis (1990)

démontrent qu’à une vitesse constante, le biofilm sera d’autant plus épais que la charge organique du

fluide sera importante (Figure 11).

Figure 11 : Influence de la charge organique sur l’épaisseur du biofilm (inspiré de Characklis 1990)

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200

Temps (h)

Epai

sseu

r de

bio

film

(µm

)

-▲- 1 g.m-2.h-1

-■ - 0,4 g.m-2.h-1

-♦ - 0,2 g.m-2.h-1



59

La présence de nutriments en grande concentration aurait tendance à former des structures de biofilm

« ouvert » ; avec de plus faibles concentrations, on observe des structures plus compactes (Melo

1997). Une structure ouverte facilite la diffusion des nutriments vers les cellules du biofilm. Pour les

bactéries aérobies, le biofilm « ouvert » facilite également le transfert d’oxygène.

L’apport répété de fortes charges organiques ainsi que les carences en nutriments peuvent provoquer

le décollement du biofilm (Characklis et al. 1990).

II.6.3.4 Effet de la vitesse de circulation du fluide

D’une manière générale, l’augmentation de la vitesse de circulation du fluide peut avoir 2 effets

principaux :

L’augmentation du transfert de masse (nutriments pour les micro-organismes), qui pourra être

bénéfique pour la croissance du biofilm

L’augmentation de l’érosion, pouvant entraîner le décollement du biofilm.

L’augmentation de la vitesse de circulation entraîne la formation de biofilm plus fins mais plus denses.

Ainsi, la diffusion des nutriments est plus difficile dans ceux-ci que dans les biofilms formés à faibles

flux. Cependant, un biofilm dense sera plus stable et aura une meilleure résistance à l’érosion,

imposée par les forces hydrodynamiques extérieures.

La Figure 12, tirée des travaux de Pinheiro et al. (1988), représente l’effet de la vitesse du fluide

circulant sur la formation du biofilm. Cette figure montre qu’à faible vitesse (0,25 m.s-1), la période

d’induction est beaucoup plus longue qu’à des vitesses supérieures ; à faible vitesse, le transfert de

masse est l’étape limitante.

Figure 12 : Effet de la vitesse de circulation sur la formation du biofilm (inspiré de Pinheiro et al., 1988)

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0 2 4 6 8 10 12 14

Temps (j)

Rf (

m2.

K/W

) v = 0,44m/s

v = 0,25m/s

v = 0,72m/s

v = 0,80m/s

v = 1,24m/s

Rf

(m2 .K

g-



60

II.6.3.5 Effet de la température

Les changements de température affectent particulièrement l’état physiologique des micro-

organismes. Pour la plupart des bactéries, des températures allant de 30 à 35 °C représentent des

températures idéales de développement et de croissance.

Les micro-organismes sont très sensibles aux changements de températures. Bott et al. (1977) ont

montré que l’épaisseur d’un biofilm de Escherichia coli augmentait de 80% lorsque la température

passait de 30 à 35°C.

II.6.4 Cinétique de biodégradation d’un substrat

La plupart du temps, la cinétique de dégradation d’un substrat (dt

dCL− ) peut être reliée à la vitesse

de croissance des micro-organismes (dtdX

), comme suit :

où µ est la vitesse spécifique ou taux de croissance des micro-organismes (T-1) et Y le coefficient de

rendement cellulaire (Mcell.mol-1).

Le taux de croissance (µ) dépend de la concentration en substrat (CL) disponible pour les micro-

organismes, et est décrite par l’équation de Monod :

Dans le cas particulier où de fortes concentrations de substrat inhibent la croissance, l’équation de

Haldane est utilisée :

où Ki est la constante d’inhibition.

Dans un domaine de concentrations non inhibitrices, la cinétique de biodégradation d’un substrat peut

alors globalement être décrite par modèle de suivant :

dtdC

YXµdtdX L−== .

Ls

L

CKCµ

µ+

= max

( )iLLs

L

KCCKCµ

µ 2max

++=



61

XCK

CYdt

dC

Ls

LL

+=−= maxµ

ν

où

XCKC

Ls

L

+= maxν

ν

avec:

X : Densité ou concentration de biomasse (M.L-3)

µmax : Vitesse maximale de croissance (T-1)

Y : Coefficient de rendement cellulaire (Mbio.mol-1 de substrat)

CL : Concentration de polluant dans le liquide (Mol.L-3)

vmax : Vitesse maximale spécifique de dégradation (Mol.L-3.T-1)

Ks : Constante de Monod (Mol.L-3)

v : Vitesse de consommation de substrat (Mol.L-3.T-1)

Lorsque les concentrations en substrat sont très fortes par rapport à Ks, le substrat n’est pas limitant et

la vitesse de dégradation tend vers

XYK

µX

s .. max

max =ν

et la cinétique de dégradation sera d’ordre zéro par rapport au substrat. Quand les concentrations en

substrat sont bien inférieures à Ks, la vitesse de dégradation est quasi proportionnelle à la

concentration en substrat et la cinétique de dégradation sera du premier ordre par rapport au substrat.

On a donc souvent une réaction d’ordre zéro par rapport au substrat près de l’entrée du biofiltre, où

les concentrations sont fortes et de premier ordre par rapport au substrat en s’éloignant de l’entrée à

travers le biofiltre, où les concentrations décroissent.

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas


62

III. Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.

III.1 Introduction

Les nombreuses pollutions à l’atrazine rencontrées un peu partout dans le monde, dues à l’utilisation

intensive de cet herbicide depuis les années 60, ont motivé de nombreux travaux de recherche sur les

modes de dépollution. Parmi les procédés retenus, pour la décontamination de sols et des eaux

pollués par les pesticides, les traitements biologiques offrent un avantage économique important

comparé aux procédés physico-chimiques classiques, beaucoup plus complexes dans leur réalisation

et souvent très onéreux.

La recherche de micro-organismes capables de dégrader les pesticides date d’une vingtaine

d’années. De nombreux chercheurs ont isolé, à partir de sols pollués, différents micro-organismes

pour leur capacité à dégrader l’atrazine et donc potentiellement utilisables lors d’un traitement

biologique. Parmi les nombreuses souches isolées, la plupart d’entre elles n’offraient qu’une

dégradation partielle du pesticide (Rhodococcus sp. B30 (Behki et Khan , 1994), Nocardioides sp.

(Topp, 2000), Clavibacter michiganese ATZ1 (de Souza, 1998)…), tandis que d’autres parvenaient à

mineraliser l’atrazine (Pseudomonas sp. YAYA6 (Yanze-Kontchou, 1994), Pseudomonas sp. ADP

(Mandelbaum, 1995), Agrobacterium radiobacter J14A (Struthers, 1998), Pseudomonas sp. CN1 (de

Souza, 1998)...) .

Le Tableau 5 donne une liste (non exhaustive) des micro-organismes isolés pour leur capacité à

métaboliser l’atrazine.



63

Tableau 6 : Liste non exhaustive des micro-organismes isolés capables de dégrader l’atrazine

Souche Produits de dégradation

Minéralisation Références

Acinetobacter calcoaceticus DEA, DIA _ Migrain et al. (1993)

Agrobacterium radiobacter

J14A CO2 + Struthers et al. (1998)

Arthrobacter aurescens strain

TC1

alkylamines + acide

cyanurique _ Strong et al (2002)

Arthrobacter sp. AD1 _ Cai et al. (2003)

Chelatobacter heintzii Cit1 Rousseaux et al (2003)

Clavibacter michiganese ATZ1 HA + N-ethylammelide _ De Souza et al. (1998a)

Hymenoscyphus ericae _ Donnelly et al. (1993)

Klebsiella pneumoniae CO2 + NH4 + Ernst & Rhem (1995)

Mycelia sterilia INBI 2-26 Vasil’chenko et al. (2002)

Nocardioides sp. C190 HA + N-ethylammelide _ Topp et al. (2000a)

Nocardioides sp. SP12 Acide cyanurique _ Piutti et al. (2003)

Phaneochaete chrysosporium DEA + DIA _ Mougin et al (1994)

Pleurotus pulmonarius HIA - Masaphy et al. (1993)

Pseudomonas sp. DEA, DIA _ Bekhi & Khan (1986)

Pseudomonas sp. YAYA6 CO2 + Yanze-Kontchou & Gschwind

(1994)

Pseudomonas sp. ADP CO2 + NH4 + Mandelbaum et al. (1995)

Pseudomonas sp. CN1 Acide cyanurique + CO2 + De Souza et al. (1998a)

Pseudomonas alcaligenes

+ Agrobacterium sp. DEA, DIA _ Migrain et al. (1993)

Pseudomonas putida

+ Xanthomonas maltophilia DEA, DIA _ Migrain et al. (1993)

Pseudoaminobacter sp. CO2 + Topp et al. (2000b)

Streptomyces sp. PS1/5 DEA + DIA _ Fadullon et al. (1998)

Ralstonia M91-3 Biuret + CO2 + NH4 + Radosevich et al. (1995)

Rhizobium sp. HA - Bouquard et al. (1997)

Rhodococcus sp. B30 _ Bekhi & Khan (1994)

Rhodococcus sp. N186/21 HIA _ Nagy et al. (1995)

Rhodococcus TE1 DEA, DIA _ Behki et al. (1993)

HIA = hydroxy-isopropylamino-atrazine

DEA = deséthylamino-atrazine

DIA = desisopropylamino-atrazine

HA = hydroxyatrazine



64

Pseudomonas sp. ADP, connue pour ses capacités à minéraliser rapidement l’atrazine, a été et est

encore l’une des souches les plus étudiées depuis son isolement en 1995 par Mandelbaum et al.

(1995). De nombreuses équipes se sont penchées sur le métabolisme de dégradation de l’atrazine

par Pseudomonas ADP sp. et sont parvenues à isoler les gènes codant pour la synthèse des

enzymes impliquées. D’autres ont cherché à utiliser Pseudomonas ADP sp. pour des traitements

biologiques de dépollution et ont étudié ses limites d’adaptation à différents environnements.

Pseudomonas ADP sp. est également la souche que nous avons choisi d’utiliser dans notre procédé

de traitement combiné.

Ce chapitre a pour but de présenter l’historique de cette souche depuis son isolement en 1995 jusqu’à

l’identification des gènes responsables de la dégradation de l’atrazine, ainsi que les différentes

applications de dépollution mettant en jeu Pseudomonas ADP sp.

III.2 Isolement de Pseudomonas ADP sp.

En 1993, l’équipe de Mandelbaum isole d’un sol agricole pollué du Minnesota, le consortium LFB6,

reconnu capable de dégrader l’atrazine dans les sols (Mandelbaum et al. , 1993b). Les expériences

menées avec du 14C montrent la capacité du consortium à minéraliser l’atrazine. La dégradation

observée est très rapide (24 h pour une concentration initiale en atrazine de 100 mg.L-1) dans un sol

argileux ou dans du sable (Mandelbaum et al. , 1993b) ; elle a lieu aussi bien en présence des cellules

entières qu’avec des extraits protéiques du consortium. L’hydroxyatrazine est la première molécule

identifiée comme métabolite intermédiaire de dégradation (Mandelbaum et al. , 1993b).

Rapidement, les capacités du consortium sont testées ; on étudie notamment l’influence de

paramètres classiques tels que la température, le pH, l’effet de la salinité… La biodégradation de

l’atrazine par le consortium LFB6 est observée à partir de 15°C à des pH allant de 5,5 à 8,5

(Mandelbaum et al, 1993a).

C’est en 1995, à partir du consortium LFB6, que l’équipe parvient finalement à isoler et caractériser la

souche bactérienne responsable de la minéralisation de l’atrazine. Sa séquence ARN16S, comparée

aux bases de données de Genbank, révèle qu’il s’agit d’une Pseudomonas sp. (Mandelbaum et al,

1995). Pseudomonas ADP sp. révèle sa capacité à minéraliser l’atrazine présente à des

concentrations particulièrement élevées (>1000 mg/l) utilisant l’herbicide comme seule source d’azote.

D’autre part, Pseudomonas ADP métabolise plus d’atrazine que ce dont elle a besoin pour son propre

métabolisme. En milieu liquide, 100 mg.L-1 d’atrazine sont dégradés en 90 minutes par 9.109 cell/ml

(Mandelbaum et al.,1995).



65

III.3 Taxonomie et exigences métaboliques

Le tableau suivant réalisé à partir des travaux de Mandelbaum et al., résume les principales

caractéristiques taxonomiques de Pseudomonas ADP sp.

Tableau 7 : Principales caractéristiques taxonomiques de Pseudomonas sp.ADP

Gram Mobilité Flagelle Forme Couleur

des colonies*

Aspect sur boite*

Contours des colonies*

Croissance King’s B

négatif + 1

polaire bâtonnet beige

Opaque

Centre foncé irréguliers

<24h

colonie fluorescente

* Milieu complexe riche PCA

Pseudomonas ADP sp. croît rapidement à 42°C en aérobiose. Elle est capable d’utiliser le glucose

comme source de carbone mais le fructose, le sucrose, le galactose, le lactose ou le maltose ne sont

pas assimilés en tant que source de carbone (Mandelbaum et al. 1995). Pseudomonas ADP sp. est

catalase et oxydase positive ; elle réduit les nitrates et ne métabolise pas le glucose par fermentation.

Pseudomonas ADP sp. appartient au groupe I des ARN du genre Pseudomonas et présente 96.1%

d’identité avec l’ARN 16S de Pseudomonas citronellosis et 94.4 % d’identité avec Pseudomonas

aeruginos (Tableau 8).

Tableau 8 : Pourcentage d’identité de l’ARN16S de Pseudomonas ADP sp. avec d’autres souche de Pseudomonas et E. coli (Mandelbaum et al., 1995)

Souche comparée % identité de l’ARN 16S

P. citronellosis 96.1

P. aeruginosa 94.4

P. cepacia 82.7

P. testosteroni 80.8

E. coli 82.8

Pseudomonas ADP sp. utilise l’atrazine comme seule source d’azote aussi bien dans les sols que les

eaux polluées. Une étude réalisée par Mandelbaum et al. (1993) permet de comparer les temps de

demi-vie de l’atrazine soumise, dans différentes conditions, à une activité biologique de dégradation

(Tableau 9). Ces données permettent de mettre en évidence l’efficacité et la rapidité de Pseudomonas

ADP sp. à minéraliser l’atrazine (t1/2 (atrazine) = 0,5 à 2 jours pour Pseudomonas ADP sp. inoculée en

milieu liquide après 12 h de préculture à 100 mg.L-1 d’atrazine comme seule source d’azote) par



66

rapport aux études précédentes. Ces études montrent que d’une manière générale, les temps de

demi-vie de l’atrazine dans un sol biologiquement actif est de l’ordre de quelques mois ; dans les

cultures pures ou cultures « enrichies » le temps de demi-vie de l’atrazine est en général de quelques

semaines, contre quelques jours pour les cultures de Pseudomonas ADP sp.

Tableau 9 : Demi-vie de l’atrazine dans différentes conditions (cité dans Mandelbaum et al. 1993a)

Milieu pH Température (°C) Demi-vie (jours) Références

Sol 4,8-6,5 22 53-113 Burkart et al. 1988

Sol 5,6-6,6 Cond. Champs 37-168 Erickson et al. 1989

Sol-Eau boueuses 4,5 65-113 Armstrong et al. 1968

Eau filtrée stérile 5-9 25 64-200 Burkart et al. 1988

Bactéries issues de

déchets industriels >7 Geller et al. 1980

Pseudomonas spp. 6,8-7,0 28 >35 Behiki et al. 1986

Aspergillus fumigatus 24 Helgesen et al. 1975

Culture enrichie >42 DeLuca 1992

Culture Pseudomonas

ADP sp. (12

précultures à

100 mg. L-1)

7,3 25 0,5-2 Mandelbaum et al.

1993a

Culture Pseudomonas

ADP sp. . (6

précultures à

100 mg. L-1)

7,3 25 4-8 Mandelbaum et al.

1993a

(références dans Mandelbaum 1993)

Mandelbaum et al. (1995) ont montré que la croissance de Pseudomonas ADP sp. et son activité de

biodégradation de l’atrazine n’étaient pas directement corrélées. Ainsi, Pseudomonas ADP sp. est

capable de minéraliser l’atrazine dans des conditions non favorables à sa croissance.

Pseudomonas ADP sp. continuerait de métaboliser l’atrazine au delà de ses besoins en azote. Ceci

serait lié au fait que quelques enzymes responsables du métabolisme de l’atrazine seraient présentes

dans le cytoplasme ou le periplasme des bactéries.



67

III.4 Mécanisme de dégradation de l’atrazine et isolement des gènes

de Pseudomonas ADP sp. impliqués dans la minéralisation de

l’atrazine

Parmi les différentes bactéries isolées, capables de dégrader l’atrazine, on peut remarquer que la

première étape de dégradation biologique de l’atrazine a lieu soit par N-dealkylation soit par

dechloration (Struthers et al. 1998).

La Figure 12 représente la voie catabolique de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.

Figure 13 : Mécanisme de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.selon Martinez et al. (2001)



68

Le métabolisme de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. a été largement exploré au cours de ces

dernières années et la séquence complète des gènes codant pour les enzymes impliquées dans le

catabolisme de l’atrazine a été déterminée (gènes AtzA à Atz F). Elle contient 108,845 nucléotides

situés sur le plasmide pADP-1 et répartis sur 3 régions différentes.

Des gènes similaires, codants pour ces mêmes enzymes ont été retrouvés chez une grande variété

de bactéries, gram-négatif ou gram-positif (Bouquard et al, 1997 ; de Souza et al., 1998 ; Radosevich

et al., 1995 ; Rousseaux et al., 2001 ; Topp et al., 2000).

Le métabolisme de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. comporte une première étape de

déchloration catalysée par une atrazine chlorohydrolase (AtzA) et conduisant à la formation

d’hydroxyatrazine (HA) (de Souza et al. 1995 et 1996). AtzB catalyse ensuite l’hydrolyse de

l’hydroxyatrazine (HA) formée à la première étape pour donner du N-isopropylammelide (Boundy-Mills

et al. 1997). La troisième étape implique une N-isopropylammelide isopropylaminohydrolase (AtzC)

qui par hydrolyse du substrat forme l’acide cyanurique (Sadowsky et al. 1998). S’en suit un clivage du

cycle triazine et la formation de Biuret (AtzD), Allophanate (AtzE) pour finalement donner de

l’ammonium et du dioxyde de carbone par une ultime réaction (AtzF) (Martinez et al. 2001).

Les produits issus des premières et deuxièmes étapes de dégradations de l’atrazine par

Pseudomonas ADP sp. sont des métabolites non phytotoxiques, et moins mobiles que l’atrazine

(Boundy-Mills et al., 1997).

III.5 Différentes applications

III.5.1 Traitement des eaux résiduelles d’usine de fabrication de pesticides

Certains auteurs ont imaginé utiliser Pseudomonas sp. ADP pour traiter les eaux résiduelles d’usine

de fabrication de pesticide, avant qu’elles ne soient rejetées dans les eaux usées municipales. La

présence de forte concentration en sels (> 4%) dans ces eaux résiduelles représente un obstacle pour

tout traitement biologique. Pour survivre dans un milieu dont la salinité est élevée les cellules doivent

lutter contre la pression osmotique par accumulation dans le cytosol de solutés dits osmolytes. Shapir

et al. (1998) ont montré que Pseudomonas ADP sp. était capable de survivre dans un milieu riche en

sel (jusqu’à 4% de NaCl) par synthèse de thréalose comme principal osmolyte. De plus, prouvant que

Pseudomonas ADP sp. était capable de minéraliser l’atrazine dans des eaux résiduelles réelles à 3%

de NaCl (réduction de la concentration en atrazine de 25 à 3 mg.L-1 en 48h), ils concluent à la

possibilité d’utiliser cette souche dans le traitement des effluents liquides d’usines de synthèse

d’atrazine.



69

Auparavant, Kauffmann et Mandelbaum (1996) avaient pensé, afin de s’affranchir des problèmes de

survie bactérienne dans les effluents industriels, utiliser les enzymes de Pseudomonas ADP sp.

impliquées dans la dégradation de l’atrazine, en les isolant et en les fixant dans une matrice

(tetraméthyl orthosilicate sol-gel). Les performances de cette technique se sont avérées limitées car la

production de méthanol lors de la formation du gel entraînait une réduction de l’activité des enzymes ;

jusqu’à présent aucune autre étude n’a été publiée à ce sujet.

III.5.2 Traitement des sols pollués

D’autres auteurs, comme Masaphy et Mandelbaum (1997), ont proposé d’utiliser Pseudomonas ADP

sp. pour le traitement in situ de sols contaminés à l’atrazine. Ils ont montré l’efficacité d’un procédé de

bioaugmentation (addition de micro-organismes au sol) et étudié l’effet du vieillissement (et donc de la

biodisponibilité) de l’atrazine dans le sol, sur la capacité des bactéries à consommer l’herbicide. Ainsi,

dans un sol contenant initialement environ 20 µg d’atrazine par gramme de sol sec, jusqu’à 80% sont

minéralisés par bioaugmentation avec Pseudomonas ADP sp.

Newcombe et Crowley (1999) ont également suggéré l’utilisation de Pseudomonas ADP sp. pour

traiter des sols pollués par bioaugmentation. Ils ont noté que l’application répétée de Pseudomonas

ADP sp. sur un sol pollué, augmentait significativement le taux de minéralisation de l’atrazine. Ainsi,

dans leurs expériences en mesocosmes (atrazine initialement présente à 100 mg.kg-1 de sol), 90% de

l’atrazine sont minéralisés en 35 jours dans le sol inoculé tous les 3 jours avec Pseudomonas ADP sp.

contre 17% seulement lorsque le sol est inoculé une fois seulement.

Kristensen et al. (2001) remarquent que le temps de résidence de l’atrazine dans le sol à traiter influe

particulièrement sur la biodisponibilité de celle-ci vis à vis des micro-organismes et donc sur sa

minéralisation : plus l’atrazine aura été en contact longtemps avec le sol, plus elle aura formé des

liaisons avec le matériau, moins la minéralisation sera efficace. Chung et Alexander (1998) notent

également que plus le sol contient de la matière organique, plus l’effet de biodisponibilité en fonction

du temps de séjour de l’atrazine est important.

III.5.3 Décontamination de sédiments et aquifères pollués

Clausen et al. (2002) ont quant à eux étudié la capacité de Pseudomonas ADP sp. a survivre et

minéraliser l’atrazine dans des sédiments en conditions aérobies et en conditions de dénitrification.

Leurs expériences montrent qu’à 10°C, Pseudomonas ADP sp. est capable de minéraliser 50% de

l’atrazine présente initialement 0,6 mg.L-1 en 14 jours aussi bien en conditions aérobies qu’en

conditions d’anoxie en présence de nitrates comme accepteurs final d’électrons. Ils notent cependant,

qu’à fortes concentrations en nitrate (100 mM) la minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP



70

sp est inhibée. Quelques années auparavant, Bichat et al. (1999) et Katz et al. (2000) avaient déjà

montré la capacité de Pseudomonas ADP sp. à minéraliser l’atrazine en conditions d’anoxie, en

présence d’une source exogène en azote (NH4, NO3, Urée ou Glycine) et concluaient que la

dégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. n’était pas affectée par la présence d’azote

exogène.

L’existance de telles souches microbiennes capables de dégrader un polluant dans des conditions

d’anoxie en présence de nitrate comme accepteur d’électrons présente un avantage économique

important pour le traitement de sols ou de sédiments comparé aux traitement biologiques aérobie où

l’aération forcée à travers le matériau pollué représente un coût non négligeable.

Au Danemark, Kristensen et al. (2001) ont également étudié en laboratoire le traitement biologique

d’aquifères crayeux. Les résultats de minéralisation montrent que le temps de résidence de l’atrazine

dans le milieu crayeux avait une légère influence sur sa minéralisation par Pseudomonas ADP sp. 50

% de l’atrazine sont minéralisés lorsque celle-ci est incorporée 1 jour avant bioaugmentation, contre

40% lorsque l’atrazine est incorporé 3 mois plus tôt.

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Etude de d’adsorption


71

IV. Description mathématique du processus d’adsorption

Ce chapitre a pour but de rappeler les bases scientifiques nécessaires à l’exploitation de nos résultats

concernant les phénomènes d’adsorption et d’hydrodynamique pour les études en colonne. Il décrit

globalement les modèles classiques utilisés pour décrire l’adsorption d’un substrat sur une phase

solide et l’écoulement d’une solution à travers un milieu poreux.

IV.1 Modélisation de l’équilibre d’adsorption

L’adsorption s’effectue par formation de liaisons entre les molécules de solutés (adsorbat) et les

groupes fonctionnels ou sites d’adsorption à la surface des particules solides (adsorbant). Lors d’un

processus d’adsorption sur un milieu poreux, les molécules sont transférées par diffusion vers la

surface externe de la particule d’adsorbant et sont ensuite éventuellement transférées vers les cavités

constituées par les pores internes du matériau (surfaces internes).

L’adsorption est un phénomène chimique ou physique ; il est souvent difficile de faire la distinction

entre ces deux types de mécanismes. D’une manière générale, on peut dire que les chaleurs

d’adsorption pour les interactions de type physique sont de l’ordre de quelques kJ par mole, tandis

qu’une adsorption chimique entraînera des chaleurs plus importantes, en général supérieures à 2-3

kJ.mol-1. On peut également différencier ces deux phénomènes en comparant leur spécificité :

l’adsorption chimique est hautement spécifique alors l’adsorption physique est non spécifique. D’autre

part, l’adsorption physique est favorisée par la diminution de la température alors que le phénomène

chimique est souvent favorisé par une augmentation de température (Ruthven, 1938).

L’adsorption physique met en jeu des forces d’attraction faibles dont : des interactions

électrostatiques, forces de van der Waals, dipôle-dipôles,…

Le transfert d’électrons impliqué dans l’adsorption de type chimique entraîne la formation de liaisons

covalentes entre le soluté et la surface de l’adsorbant.

Pour décrire l’équilibre d’adsorption à l’interface liquide/solide, on exprime la quantité de soluté

adsorbée à l’équilibre par unité de masse d’adsorbant (qe), en fonction de la concentration restante

dans la solution à l’équilibre (Ce). Une fonction de ce type représente une isotherme d’adsorption et

définit l’équilibre thermodynamique à une température constante.



72

Le bilan matière utilisé pour représenter l’équilibre d’adsorption à un seul composé en milieu dispersé

parfaitement agité est donné par l’équation suivante :

)()( 00 qqmCCV ee −=−

où :

V : volume de la suspension (L3)

C0 : concentration initiale dans la phase liquide (M.L-3)

Ce : concentration dans la phase liquide à l’équilibre (M.L-3)

q0 : concentration initiale dans la phase solide (M soluté.M-1 d’adsorbant)

qe : concentration dans la phase solide à l’équilibre (M soluté.M-1 d’adsorbant)

m : masse d’adsorbant (M)

Différents modèles mathématiques ont été établis pour représenter l’équilibre d’adsorption d’un seul

composé. Parmi les modèles les plus souvent utilisés on peut citer :

Le modèle de Langmuir : C’est un modèle d’adsorption en monocouche développé à la base pour modéliser l’adsorption

chimique des gaz sur des surfaces solides homogènes (Langmuir, 1918).

Ce modèle est basé sur les hypothèses suivantes :

• La molécule adsorbée est située sur un site bien défini de l’adsorbant (adsorption localisée)

• Chaque site ne peut fixer qu’une molécule

• L’énergie d’adsorption est identique pour chaque site et indépendante de la présence de

molécules adsorbées sur les sites voisins (pas d’interaction entre les molécules)

L’équation de Langmuir s’écrit comme suit :

eLmme CKqqq111

+=

qm : concentration max de soluté dans la phase solide (M soluté.M-1 adsorbant)

KL : constante d’équilibre qui dépend de la température et du type d’interaction adsorbat –

adsorbant (L3.M-1)

Ce : concentration du soluté à l’équilibre dans la phase liquide (M.L-3)

L’équation de Langmuir présente deux cas limites. Pour une solution à faible concentration

(KL.Ce<<1), l’équation prend la forme linéaire :

eLme CKqq =



73

D’autre part si la concentration dans la phase liquide est élevée (KL Ce>>1), l’équation est une droite

horizontale de la forme :

me qq =

Le modèle de Freundlich : La relation empirique de Freundlich a été largement utilisée pour les systèmes hétérogènes et en

particulier pour décrire les phénomènes d’adsorption de composés organiques sur le charbon actif

(Freudlich, 1906). La forme de l’équation est la suivante :

KF et n sont les constantes de Freundlich et sont uniques pour un composé donné.

Le modèle de Freundlich est plus représentatif des surfaces hétérogènes. Toutefois il est uniquement

adapté sur une intervalle réduite de concentration. Généralement lorsque le modèle s’adapte bien

avec des données à forte concentration, ce n’est pas le cas pour les très faibles concentrations.

On peut également citer Modèle Brunauer, Emmett et Teller (BET) (Brunauer et al., 1938) qui est

une extension du modèle de Langmuir vers l’adsorption multi-couche et qui répond aux hypothèses

suivantes :

• Chaque molécule adsorbée dans la première couche forme un site d’adsorption pour la

seconde et ainsi de suite pour les couches supérieures.

• Les molécules des couches supérieures se conduisent essentiellement comme le liquide

saturé sous une réaction de condensation.

• Les couches supérieures peuvent se former sans que la couche antérieure ait rempli

complètement la surface d’adsorbant.

• La constante d’équilibre des premières molécules adsorbées est différente de celle des

couches moléculaires supérieures.

Cette équation est particulièrement adaptée pour la détermination de la capacité maximale

d’adsorption de la plupart des adsorbants.

La Théorie du Potentiel proposée par Polany (1916) suppose que l’adsorption est due aux forces

d’attraction qui s’étendent au-delà de la surface d’adsorbant. La théorie considère un espace

d’adsorption proche de la surface d’adsorbant et un potentiel d’adsorption ε, qui représente la

différence d’énergie potentielle entre les molécules du soluté adsorbées et le soluté dans la solution.

eFe CnKq lnlnln +=



74

D’autres modèles existent aujourd’hui qui permettent de modéliser l’adsorption d’un composé sur un

support solide (isotherme d’Elovich, de Temkin…) ; nous ne les aborderons pas ici.

IV.2 Ecoulement dans un milieu poreux

Dans le cadre de nos études en colonne, nous avons été amenés à étudier l’écoulement à travers

notre support poreux d’écorce de pin et à utiliser quelques notions de base présentées ci-dessous

concernant les vitesses d’écoulement.

L’écoulement en milieu poreux est décrit par une loi principale, la loi de Darcy, et fait intervenir un

certain nombre de paramètres comme la tortuosité ou la vitesse de pore, énumérés ci-dessous.

IV.2.1 Organisation du milieu poreux

Les milieux poreux contiennent un certain pourcentage de vides qui peuvent être occupés par de

l’eau ou d’autres fluides. D’un point de vue macroscopique, le milieu poreux peut être divisé en trois

composantes principales : une composante solide, une composante aqueuse et une composante

gazeuse. La Figure 14 définit les principales relations qui existent entre les volumes V et masses M

des différentes entités.

Figure 14 : Représentation des différentes phases d’un milieu poreux

Les principales caractéristiques permettant de définir un milieu poreux sont :

• La masse volumique apparente à l’état sec : Vtms

b =ρ

Relations Volumiques Relations Massiques

Vt Mt

Va

Ve

Vs

Ma

Me

Ms

AIR

EAU

SOLIDE

EAU

AIR



75

• La masse volumique apparente totale : Vtmt

app =ρ

• La Porosité totale : Vt

VeVatotalvolume

videdevolume +==

""ε

Avec le volume de vide : VeVaVv +=

La porosité se subdivise en trois catégories, selon la classification adoptée par l’IUPAC (International

Union of Pure and Applied Chemistry) :

Macroporosité : diamètre de pore > 50 nm

Mesoporosité : diamètre de pore de 2 à 50 nm

Microporosité : diamètre de pore < 2 nm

Certains auteurs distinguent également deux catégories de micropores : les micropores primaires

(ultramicropores) dont le diamètre est inférieure à 0,8 nm, et les micropores secondaires dont le

diamètre est compris entre 0,8 et 2 nm (Lastokie et al., 1993).

• Le Degré de saturation : VaVe

Ves+

=

• L’indice de vide : Vs

VeVae +=

• La Teneur en eau est caractérisée par deux paramètres essentiels :

- l’humidité pondérale w s

a

mm

soldemasseeaudmassew ==

sec'

- l’humidité volumique θ VtVe

totalvolumeeaudvolume

=='θ

D’autre part, on peut définir la structure du milieu poreux comme l’arrangement réciproque et

l’orientation des particules entre elles. Il existe notamment des structures à particules isolées, des

structures massives et des structures en agrégats. Dans le cadre de notre étude, nous nous

restreindrons au cas des milieux poreux granulaires, formés de particules poreuses isolées.

En outre, dans nos conditions, nous considérerons le milieu comme étant saturé en eau (Va=0).



76

IV.2.2 Hétérogénéité de l’écoulement

Les caractéristiques hydrodynamiques peuvent être différentes au sein même de la matrice du fait de

son hétérogénéité. Dans certaines régions du volume poreux, l’écoulement est plus ou moins lent,

parfois même nul. Les paramètres responsables de cette hétérogénéité de l’écoulement sont :

La structure du milieu

La teneur en eau au moment de l’infiltration

De fortes vitesses d’écoulement qui ont tendance à favoriser les écoulements préférentiels

La présence d’une lame d’eau à la surface qui favorise également les écoulements

préférentiels.

Les phénomènes principaux qui participent à l’écoulement sont :

• La convection, qui désigne l’écoulement massique de la solution dans la porosité

percolante (pores ouverts ou connectés). Le soluté se déplace avec la phase mobile.

• La dispersion hydrodynamique, différenciée en :

Dispersion cinématique, provoquée par l’hétérogénéité de la distribution des

vitesses d’écoulement dans un milieu poreux (fonction de la structure et de la

texture du milieu)

Diffusion moléculaire, due aux gradients de concentrations entre les zones

mobiles (porosité percolante) et les zones stagnantes (porosité intra-

particulaire ou pores semi-ouverts ou mal connectés ou zones stagnantes par

écoulement non homogène de la porosité percolante).

IV.2.3 Loi de Darcy

La loi de Darcy permet de décrire simplement l’écoulement, qui dans la configuration réelle d’une

matrice poreuse est trop compliquée pour être considérée dans ses détails microscopiques, car les

vitesses de fluide varient considérablement d’un point à un autre et même le long d’un même

parcours.

Dans le cas des milieux saturés continus, le débit d’un liquide incompressible s’écoulant à travers un

milieu poreux peut se calculer grâce à la relation suivante :

HSKQ ∆−= .. (m3/s)

où

S : surface de la section d’écoulement (m2)



77

∆H : charge hydraulique (-)

K : coefficient de perméabilité ou conductivité hydraulique (m/s)

(K est le rapport entre la perméabilité k et la viscosité dynamique η du fluide)

La vitesse de Darcy, q, est une vitesse fictive du fluide à la sortie du massif, comme si toute la section

du massif était soumise à l’écoulement.

SQq = (m/s)

Limite de la Loi de Darcy La relation entre le flux et le gradient hydraulique n’est plus linéaire aux grandes vitesses

d’écoulement pour lesquelles les forces d’inertie ne sont plus négligeables par rapport aux forces de

viscosité. On peut aussi obtenir des phénomènes qui s’écartent de la loi de Darcy à l’autre extrémité

de la gamme de vitesses d’écoulement, notamment aux faibles gradients et dans les petits pores.

IV.2.4 Vitesse d’écoulement et tortuosité

D’une manière générale, on considère que l’écoulement ne se fait pas à travers toute la section S, car

seule la fraction correspondant à la porosité est ouverte à l’écoulement. De plus, le chemin réel

d’écoulement δ est plus grand que la longueur L de la colonne à cause de la tortuosité τ:

Lδτ = (-)

D’autre part, l’eau ne s’écoule qu’à travers les pores du milieu. Une définition correcte de la vitesse

d’écoulement implique donc une redéfinition de la section à travers laquelle s’effectue l’écoulement.

On définit donc la vitesse de pore comme le rapport entre la vitesse de Darcy et la teneur en eau

effective :

eff

qvθ

= (m/s)

où θeff prend tient compte uniquement de la fraction d’eau qui participe à l’écoulement.


227


234

ETUDE EXPERIMENTALE


78

ETUDE EXPERIMENTALE

ETUDE EXPERIMENTALE Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin


79

I. Etude du support d’adsorption : l’écorce de pin « Pinus

pinaster »

I.1 Origine et répartition Le pin maritime (Pinus pinaster) se rencontre près des côtes atlantiques et méditerranéennes, en

Espagne, en Italie, au Maroc mais plus particulièrement au Portugal dans les régions du centre et du

nord, et sur côtes atlantiques du sud ouest de la France. La Figure 1 représente l’occupation de Pinus

pinaster en Europe et Afrique du Nord.

Figure 1 : Distribution de Pinus pinaster en Europe et en Afrique du Nord (Ratola, 2002)

Au Portugal, le pin maritime représente 31% des espèces rencontrées en forêt ; mais aujourd’hui le

nombre de pins maritime décroît régulièrement en faveur de l’eucalyptus. La Figure 2 représente la

répartition des espèces peuplant les forêts portugaises.

Figure 2: Répartition des espèces forestière du Portugal (Inventaire National des forets – 3ème édition, 1998)

Pinus pinea (parasol)

2%Chêne liège

23%Chêne faginé

ou rouvre4%

Eucalyptus21%

Chataigner1%

Chêne vert14%

Pinus pinaster (maritime)

31%

Autres feuillus3% Autres

résineux1%



80

En France, le pin maritime également appelé pin des Landes, est implanté dans la région du sud-

ouest depuis l’antiquité ; il fut cultivé de manière intensive à partir du XIXème siècle afin d’enrayer le

phénomène d’ensablement de la côte landaise et d’assainir les zones marécageuses. Aujourd’hui, il

recouvre près d’un million d’hectares et constitue l’une des essences forestières les plus importantes

de France.

Pinus pinaster est un résineux de 20 à 30 mètres de haut, au tronc flexueux, à la cime peu compacte

et à l’écorce brun-rouge (figure 3).

Figure 3 : Ecorce de pin Pinus pinaster

Au Portugal le pin maritime, dit « pinheiro bravo », représente la principale source de matière

première pour les scieries, qui représente près de 70% de la production totale de bois. (Ratola, 2002).

Le Portugal produirait chaque année 6 millions de mètres cube de bois de pin (Ratola,2002). En

considérant que 1 m3 de bois sec produit 100 kilos d’écorce, 600 000 tonnes d’écorce pourraient être

disponibles annuellement (Fradinho et al., 2002). Ainsi, l’écorce en tant que matériau abondant et

gratuit (déchet de l’industrie du bois) représenterait une source valorisable intéressante.

I.2 Chimie générale des écorces

Les écorces sont, en général, constituées d’une fine couche intérieure (phloem) et d’une couche

externe (rytidom) séparées par une couche intermédiaire (periderm). L’épaisseur de l’écorce varie en

fonction de l’espèce de l’arbre et de son âge. Les parois cellulaires qui constituent le phloem sont

principalement riches en amidon, en acides gras et en tanins. Les résines circulent quant à elles, à

l’intérieur de minuscules canaux. Le periderm est composé de trois couches dont l’épaisseur varie

avec l’espèce.

La liste des composés rencontrés dans l’écorce est très longue ; on peut cependant citer les

principales familles de composés qui sont : les hydrates de carbone (cellulose, hemicellulose), les



81

pectines, les lignines, la subérine, les terpènes (flavonoïdes, salicines, tanins, stilbènes et autres), et

des poly-flavonoïdes.

La composition des lignines des écorces de conifères reste mal connu à cause de la difficulté qu’il

existe à isoler celles-ci sans contamination par des impuretés phénoliques. Cependant quelques

études suggèrent des structures particulières et indiquent que les lignines de l’écorce sont bien

différentes des lignines du bois ; elles contiennent notamment plus d’acides dicarboxyliques et moins

d’acide 3-4-dimetoxibenzoïque, éther diaril et dimères biphényl.

D’autre part, des acides dicarboxyliques ainsi que des acides gras libres (acide béenique, acide

lignocérique, et phérulique) ont été identifiés comme constituants des cires d’écorce, ainsi que de

petites quantités d’acides gras insaturés et des résines acides.

La subérine de l’écorce serait un complexe formé principalement par des hydroxyacides gras. Des

acides phénoliques sont également présents dans cette composition. Certains hydroxyacides gras

seraient unis entre eux par une liaison ester.

D’après ce qu’on connaît sur la chimie de l’écorce, on peut considérer que l’écorce pourrait être

utilisée comme matrice « échangeur d’ions ». Le contenu important de groupes fonctionnels,

principalement la présence de groupes hydroxyles, carboxyliques et phénoliques, rend l’écorce

intéressante pour des fixations ioniques.

I.3 Caractéristiques physico- chimiques de l’écorce de pin

Différentes études menées dans divers domaines (Ramirez Lopez, 2001 ; Vazquez et al 1994 ; …)sur

l’écorce de pin ont permis de mettre en évidence les caractéristiques physico-chimiques générales de

l’écorce de pin Pinus pinaster. Des analyses supplémentaires ont été réalisées dans le cadre de notre

étude.

L’écorce de pin utilisée dans cette étude provient d’une scierie du nord du Portugal. Elle nous a été

livrée sous forme brute, n’ayant subi aucun traitement préalable (morceaux d’environ 10 cm de long

sur 4 cm de large).



82

I.3.1 Caractéristiques physiques

La surface spécifique de notre matériau, le volume de pore et la taille des pores ont été déterminés à

l’Institut de Recherche en Catalyse (CNRS, Villeurbanne) selon les méthodes BET, Single Point, t.Plot

et BJH.

I.3.1.1 Principe de la méthode BET

Les surfaces spécifiques du matériau ont principalement été obtenues par application de la théorie de

Brunauer, Emmett et Teller (BET) aux isothermes d’adsorption d’azote à 77°K. La théorie repose sur

l’hypothèes d’une adsorption multimoléculaire due à des liaisons faibles du type Van der Waals.

L’énergie d’adsorption d’une molécule sur la surface est différente de celle d’une molécule située sur

la deuxième couche. Le calcul permet d’établir l’équation BET de l’isotherme d’adsorption :

00

0

.1

.1

)1( PP

CVC

CVPPVP

P

mm

−+=

−

où :

V : volume de gaz adsorbé à la pression relative P/P0

Vm : volume de gaz nécessaire pour couvrir la surface d’une monocouche

C : facteur proportionnel à la différence entre l’énergie d’adsorption de la première couche et

l’énergie de liquéfaction

Pour obtenir la surface spécifique, on porte )1(

0

0

PPVP

P

− en fonction de P/P0. La courbe théorique est

une droite de pente CV

C

m .1−

et d’ordonnée à l’origine CVm .

1.

En pratique la courbe est linéaire que pour l’intervalle de pression relative P/P0 compris entre 0,05 et

0,35. La surface spécifique est calculée à partir de la valeur Vm déduite de la transformée linéaire

BET.

I.3.1.2 Principales caractéristiques

La masse volumique apparente (ρapp), la masse volumique réelle (ρre) ainsi que l’indice de vide (ε0) ont

été déterminés sur la poudre d’écorce de pin de diamètre d inférieur à 200 µm.



83

La masse volumique apparente (ρapp) de la poudre d’écorce a été déterminée par remplissage d’un

récipient de volume connu (Vt) avec le matériau en question, tassé de la même manière que pour les

expériences en colonnes.

La masse volumique réelle (ρre) a été déterminée après remplissage d’eau des lits d’écorce de pin

ainsi formés. Le volume d’eau utilisé était le volume de vide (Vv) accessible à l’eau, on a :

vtre VV

m−

=ρ et t

app Vm

=ρ

Avec :

m : masse de l’échantillon dans le récipient (kg)

Vt : volume total du récipient (m3)

Vv : volume de vide (m3)

ρre : masse volumique réelle (kg/m3)

ρapp : masse volumique apparente (kg/m3)

La porosité totale (ε) adimensionnelle est donnée par l’équation :

t

v

VV

=ε

Les principales caractéristiques physiques de notre écorce sont présentées dans le Tableau 1.

Tableau 1 : Caractéristiques physiques de l’écorce de pin (d<200 µm)

PARAMETRE ECORCE Pinus pinaster

Masse volumique apparente ρapp 416 kg/ m3

Masse volumique réelle ρre 559 kg/m3

Indice de vide ε 0,59

Surface spécifique 1,3 à 7,7 m2/g (BET et Single point)

Surface des micropores

(préciser taille)

4,0 m2/g (t.Plot)

5,6 m2/g (BJH adsorption)

4,0 m2/g (BJH desorption)

Volume total des pores < 982,8 Å 0,006 cm3/g (Single point)

Volume des micropores 0,0015 (BJH)

Diamètre moyen des pores 32 Å



84

Une analyse BET a également été réalisée en parallèle sur l’écorce en poudre stérilisée (voir

procédure de stérilisation I.7) et non stérilisée. Les résultats présentés au Tableau 2, montrent que la

stérilisation ne modifie pas significativement la surface spécifique du matériau.

Tableau 2 : Analyse de la surface spécifique de l’écorce de pin (BET sur écorce broyée à d<200 µm)

Ecorce stérilisée Ecorce non sterilisée

1,31 ± 0,2 m2/g 1,48 ± 0,2 m2/g

I.3.2 Caractéristiques chimiques

L’analyse chimique élémentaire de l’écorce de pin (Tableau 3) a montré que la fraction organique

représentait 99% de la masse sèche et que l’azote, le potassium, le phosphore et le magnésium

étaient présents à de très faibles concentrations, pouvant rendre nécessaire, lors l’usage de l’écorce

comme biofiltre, une éventuelle addition de nutriments pour une bonne activité bactérienne.

Il est également important de noter qu’à 20°C, pour un ratio liquide / solide de 10 à 20 mL.g-1, le pH

d’une suspension aqueuse d’écorce de pin en poudre est acide (4,5 à 5 unités de pH). On peut donc

se poser la question de la survie des bactéries choisies dans le cadre de notre étude (Pseudomonas

ADP sp.) lorsqu’elles seront mises a contact de ce matériau.

Tableau 3 : Analyse élémentaire de l’écorce de pin

PARAMETRE ECORCE Pinus pinaster

Fraction organique 99,03 % ± 0,08 %

Fraction minérale 0,80 % ± 0,08 %

pH (20°C ; L/S=10-20)) 4,5 - 5

Carbone (g/kg) 400

Azote (g/kg) 2,3

Phosphore (g/kg) 0,30 (P) ; 0,69 (P2O5)

C/N/P 100/0,6/0,07

Potassium (g/kg) 0,50 (K) ; 0,60 (K2O)

Magnésium (mg/kg) 62

Calcium (g/kg) 0,37

Sodium(mg/kg) 0,29

Fer (mg/kg) 7,78

Cuivre (mg/kg) 1,3



85

La caractérisation de la matière organique (MO) de l’écorce de pin (Tableau 4) montre que le

constituant majeur est d’origine ligneuse (environ 50% de la MO). L’écorce possède ainsi une grande

stabilité biologique. Celle-ci peut être exprimée par le paramètre Tr (sadef.fr 2003) défini comme suit :

MSoMM

MSoLignined

MSoSoestderVandefractionc

MSooseHemicellulb

MSoMOaTr +++−=

avec :

MO : % matière organique

MSo : %matière organique soluble

MM : % matière minérale

(a, b, c et d sont des coefficients)

On note également que la matière organique soluble représente environ 15% de la matière organique.

Si cette matière organique soluble n’est pas toxique pour les micro-organismes et si elle est

suffisamment biodégradable, on peut imaginer qu’elle pourra être utilisée comme source de carbone

par les bactéries utilisées dans notre procédé combiné de biofiltration.

Tableau 4 : Caractérisation de la matière organique

% de la matière organique

Matière organique soluble 14,9

Matière Hémicellulosiqiue 1,1

Matière ligneuse 54,8

Matière cellulosique 29,2

Stabilité biologique (Tr) 126 (Sadef.fr 2003)

I.3.3 Analyse Infra Rouge des fonctions de surface

Une analyse par spectrométrie IR a été réalisée à l’Unité de Recherche en Génie Civil (URGC, INSA

de Lyon) afin d’identifier les principales fonctions chimiques présentes à la surface du matériau

« Ecorce de pin ». La connaissance des fonctions de surface a permis d’émettre des hypothèses

quant aux types de liaisons susceptibles de s’établir lors des phénomènes d’adsorption ou absorption

de l’atrazine sur le support d’écorce de pin.



86

I.3.3.1 Principe de l’analyse Infra Rouge

La spectrométrie infra-rouge est une méthode d’analyse non destructive, basée sur l’étude de

l’absorption par l’échantillon des radiations électromagnétiques de longueurs d’ondes λ comprises

entre 1 et 1000 µm, soit un nombre d’onde ν=1/λ compris entre 1 et 10-3 m-1. La partie la plus riche en

informations et la plus accessible d’un point de vue expérimental est celle du moyen infra-rouge

(λ compris entre 2,5 et 25 µm soit ν compris entre 0,04 et 0,4 µm-1 ). Les absorptions dans ce

domaine forment une sorte d’empreinte spectrale des composés caractéristiques des liaisons

interatomiques qui les composent.

I.3.3.2 Protocole expérimental

L’analyse IR s’effectue sur des pastilles de KBr fabriquées en respectant les proportions suivantes :

300 mg de KBr et 5 mg de matériau broyé finement. La masse de mélange prélevée pour faire la

pastille est de 30 mg. L’analyse est répétée 5 fois pour un nombre d’onde variant entre 400 et

4000 cm-1. Le spectre obtenu résulte de la moyenne de ces 5 balayages.

L’appareil utilisé est un Perkin Elmer de type dispersif (Spectrum One, FTIR Spectrometer) Les

spectres ont été traités avec le logiciel Spectrum.

Le spectre d’adsorption Infra Rouge obtenu pour l’analyse de l’écorce de pin en poudre (fraction

d<200 µm) est présenté en ANNEXE 1.

I.3.3.3 Interprétation du spectre IR

L’analyse du spectre IR montre la présence de nombreuses fonctions cycliques et aromatiques (C=C)

ainsi que des liaisons C=O, due sans doute à la présence de terpènes, flavonoïdes, résines acides et

tannins.

Le pic à 3435 cm-1 révèle clairement la présence de fonctions alcools (liaisons C-OH éventuellement

phénoliques et/ou de fonctions amines primaires ou secondaires.

Au pH imposé par l’écorce de pin (4-5) en suspension aqueuse, l’atrazine n’est pas sous une forme

ionisée ; une interaction ionique entre l’atrazine et l’écorce est, par conséquent, peu envisageable.

Les interactions les plus probables entre l’atrazine et l’écorce seraient une interaction hydrophobe

entre le cycle aromatique de l’atrazine et les composés organiques de l’écorce de pin, ainsi que des

liaisons hydrogène dues à la présence de fonctions -OH et -NH en surface de l’écorce et dans la

molécule d’atrazine. Des interactions de Van Der Waals résultant de forces électrostatiques peuvent

également s’établir entre l’atrazine et l’écorce de pin.

Aucune fonction acide n’a été mise en évidence à la surface de l’écorce de pin par spectrométrie IR.



87

I.4 Observations de la structure l’écorce de pin au MEB

La microstructure de l’écorce de pin en poudre a été caractérisée par observation au Microscope

Electronique à Balayage Jeol 840 LGS au Centre d’Etudes et de Caractérisations Micro-structurales

de l’INSA de Lyon. Ces observations ont permis de comparer les structures des particules d’écorce

selon leur granulométrire et de les comparer à celle du charbon actif en poudre.

La préparation des échantillons a été réalisée par séchage (chauffage à 80°C) des matériaux à

étudier, puis métallisation à l’or dans un pulvérisateur cathodique BLAZERS SCD 040.

Les clichés obtenus (ANNEXE 2) par observation au MEB des particules d’écorce de pin et de

charbon actif montrent que la structure de surface de ces deux matériaux est ressemblante,

présentant une structure en nid d’abeille (Figure 1). Cependant, le charbon actif semble présenter une

surface plus régulière que l’écorce de pin. L’observation des structures longitudinales des particules

d’écorce et de charbon actif montre également que le charbon actif présente un réseau de canaux

profonds et organisés (le diamètre des pores est d’environ 15 µm) alors que l’écorce est beaucoup

moins organisée et présente de plus gros pores, d’environ 50 µm de diamètre (Figures 2 et 3).

Lorsque l’écorce est broyée à 200 µm, la structure longitudinale des particules est détruite et les

canaux internes ne sont plus visibles ; seule une structure en feuillets superposés est encore

observable.

Le charbon semble ainsi présenter une structure poreuse beaucoup plus importante que l’écorce de

pin.

I.5 Préparation de l’écorce en vue des études d’adsorption

Les morceaux d’écorce brute ont été broyés dans un broyeur à lame (Retsch SM 2000/1430 UPM) sur

une grille de 2 mm. La poudre d’écorce a ensuite été séparée en différentes fractions

granulométriques sur des tamis de 200 µm, 400 µm, 700 µm et 2 mm. L’écorce en poudre a été

séchée dans une étuve à 80°C pendant 24 h avant chaque utilisation puis conservée si nécessaire

dans un récipient hermétique.



88

Figure 4 : Ecorce brute de pin Pinus Pinaster

I.6 Préparation d’un extrait aqueux d’écorce de pin

L’utilisation d’extrait d’écorce de pin nous a permis de réaliser des expériences en milieu liquide, tout

en gardant des conditions chimiques similaires aux conditions imposées par la présence de l’écorce

elle-même (pH acide et présence des composés hydrosolubles de l’écorce). L’utilisation d’extrait a

ainsi permis d’étudier la croissance de Pseudomonas ADP sp. ainsi que sa capacité à dégrader

l’atrazine dans ces conditions tout en s’affranchissant des autres processus liés à la présence de

particules dans le milieu tels que les phénomènes d’adsorption.

L’extrait d’écorce de pin a été obtenu en mettant au contact de la poudre d’écorce (d<200 µm) avec

de l’eau déminéralisée, à un ratio liquide / solide de 20 mL.g-1 pendant 48h, sous une agitation orbitale

de 120 rpm. L’extrait est filtré sur une membrane de nitrate de cellulose (0,45 µm) puis conservé à

5°C.

I.7 Méthode de stérilisation

Dans un premier temps, l’étude de la croissance de Pseudomonas ADP sp. et de sa capacité à

dégrader l’atrazine dans les conditions imposées par l’écorce de pin a été menée en milieu stérile

nécessitant la stérilisation soit de l’écorce elle-même soit de l’extrait utilisé dans les expériences en

milieu liquide.

L’écorce en poudre a été stérilisée par deux autoclavages successifs à 120°C pendant 20 minutes,

espacés chacun de 20 heures, directement dans les flacons utilisés pour l’expérimentation. Cette



89

méthode a été inspirée d’une étude réalisée sur les méthodes de stérilisation des sols (Wolf et al.

1989).

L’extrait aqueux d’écorce de pin a, quant à lui, été stérilisé par filtration à 0,2 µm sur des membranes

de nitrate de cellulose.

MATERIEL ET METHODES Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin


90

II. Adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin

II.1. Matériel et Méthodes

II.1.1 Etude de l’adsorption en batch

II.1.1.1 L’atrazine : caractéristiques générales et méthodes d’analyses

II.1.1.1.1 Caractéristiques physico-chimiques

La formule développée (Figure 5) ainsi que les principales caractéristiques physico-chimiques de

l’atrazine sont présentées dans le Tableau 5.

N

N

N

Cl

NN

HH (2-chloro-4-ethylamino-6isopropylamino-1,3,5triazine)

Figure 5 : Formule développée de l’atrazine

Tableau 5 : Propriétés physico-chimiques de l’atrazine (source : Dialogweb.com)

Formule brute C8H14ClN5

Aspect Cristallin solide, incolore

Masse molaire 215,69 g.mol-1

Masse volumique 1,2 g/cm3 à 20°C

pKa* 1,64

Solubilité dans eau 30 mg.L-1 à 20°C ; 70 mg.L-1 à 25°C

Solubilité dans méthanol 15000 mg/l à 20°C

Pression de vapeur 3.85 x 10-5 Pa à 25°C

Point de fusion 175,8 °C

Point d’ébullition 205,0 °C / 101 kPa

Stabilité Relativement stable à pH neutre, légèrement acide ou basique.

Rapidement hydrolysé à pH très acide ou très basique et à 70°C à pH

7.

DT50 9,5 j. (pH 1), 86 j. (pH 5), 5,0 j. (pH 13)

Kow 398

Coefficient de partition log P : 2,5 log Kow : 2,6

Moment dipolaire 4,63 Debye (Weber 1967)

* pKa de la forme protonée



91

On retiendra essentiellement de ces caractéristiques que l’atrazine est une base faible (pKa de la

forme protonée 1,64), et qu’elle n’est donc pas ionisée à des pH aux alentours de 4-5 souvent

imposés par la présence de l’écorce de pin dans un milieu liquide aqueux.

On note également la faible hydrosolubilité de l’atrazine qui nous a conduits à utiliser des solutions

mères à 2000 mg.L-1 préparées dans le méthanol et diluées dans l’eau au moment des essais pour

obtenir les concentrations initiales souhaitées. La présence résiduelle de méthanol agissant comme

cosolvant dans les solutions aqueuses ainsi préparées a permis de travailler à des concentrations en

atrazine allant jusque 50 mg.L-1.

L’effet du méthanol résiduel sur l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin a été testé (Figure 6).

Figure 6 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en présence de MeOH (A) ou sans MeOH (B) ; diamètre des particules d’écorce :d<200 µm ; ratio L/S=20 ; température 20°C ; temps de

contact 24h.

On remarque que la présence de méthanol (0,1 à 2,5 % dans les essais) a un effet négatif sur

l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin, la présence de méthanol augmentant l’affinité de

l’atrazine pour la solution. D’autre part, l’incidence de la présence du méthanol en solution sur la

croissance des micro-organismes et leur capacité à biodégrader l’atrazine a fait l’objet d’une étude

particulière (voir § III.1.4.1) ; cette étude montre que le méthanol présent à de telle concentration dans

le milieu n’avait pas d’effet ni sur la croissance ni sur l’activité de Pseudomonas ADP sp., utilisé dans

notre bio-procédé. Cet effet est cependant négligeable aux faibles concentrations (C<0,1 mg.L-1) ce

qui correspond au domaine de concentrations privilégié de notre étude. Nous avons donc choisi, pour

des raisons pratiques, de travailler avec ces solutions mères préparées dans le méthanol.

y = 0,1845x + 0,0031

y = 0,3036x + 0,0038

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Ceq (mg/l)

q (m

g/g)

A- Sol. mère / MeOH

B- Atrazine dans Eau



92

II.1.1.1.2 Méthodes d’analyse

(a) Chromatographie Liquide Haute Pression

L’atrazine a été dosée par chromatographie liquide en mode isocratique grâce à une HPLC Waters

Module I Plus équipée d’une colonne RP-18 Supelcosil (prévue pour la séparation des pesticides

organochlorés) et d’un détecteur UV réglé à 220 nm. La phase mobile, constituée d’un mélange

d’acétonitrile / Eau ultra Pure (50 :50, vol :vol), a été utilisée à un débit de 1 mL.min-1.

L’eau Ultra Pure est préparée grâce à un appareil Millipore MilliQ Gradient. Les phases mobiles ont

été dégazées à l’hélium pendant toute la durée des analyses (20 mL.min-1).

Dans ces conditions opératoires, le temps de rétention de l’atrazine est d’environ 7,3 minutes et la

limite de détection de 0,03 mg.L-1.

Les chromatogrammes ont été traités à l’aide du logiciel d’integration APEX.

(b) Dosage par Immuno-essai

Le dosage de l’atrazine à de faibles concentrations, de l’ordre de quelques µg.L-1, a été réalisé avec le

kit Atrazine Hach (Atrazine Reagent Set, ref. 27627-10) commercialisé par Hach Cie et utilisé comme

méthode semi-quantitative. La gamme de concentrations à utiliser pour ce kit est de 0,1 µg.L-1 à

3 µg.L-1. Cette méthode a été utilisée dans les expériences en colonnes (V.1.2). L’emploi de ce kit a

permis de travailler à des concentrations correspondant à une pollution réelle (de quelques µg.L-1

d’atrazine).

Le principe du dosage en kit consiste en une réaction antigène-anticorps ; le dosage est réalisé dans

des cuves de 1 mL recouvertes d’anticorps spécifiques à l’atrazine. La concentration en atrazine est

déterminée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 450 nm. La concentration en atrazine

est inversement proportionnelle à l’intensité de la couleur développée.

Protocole de dosage immuno-essai : La solution à doser (0,5 mL) est introduite dans une cuve, contenant les anticorps « anti-atrazine »

fixés sur ses parois. Une solution d’enzyme conjuguée (0,5 mL) est additionnée et le tout est

vigoureusement agité pendant 30 secondes. La réaction s’effectue pendant 20 minutes puis le

contenu de la cuve est jeté et la cuve est rincée 4 fois à l’eau déminéralisée.

Une solution permettant le développement de la couleur est placée dans la cuve (0,5 mL), agitée puis

la réaction se fait pendant 10 minutes. Enfin, 0,5 mL de solution d’arrêt permettant de bloquer la

réaction colorimétrique sont additionnés avant lecture au spectrophotomètre à 450 nm.

Des étalons fournis avec le kit (concentrations 0,1 µg.L-1 ; 0,5 µg.L-1 ; 3 µg.L-1) ont été utilisés afin de

tracer la courbe de calibration.



93

(c) Suivi des essais avec des molécules marquées au 14C

Des études d’adsorption à faibles concentrations en atrazine ont pu être réalisées grâce à l’utilisation

d’atrazine marquée [U-ring-14C]-atrazine commercialisée par Sigma Aldrich (pureté 98,6% ; activité

26,4 mCi.mmol-1).

Suivie de la radioactivité en solution Le suivi de la radioactivité dans la phase liquide des essais d’adsorption a été réalisé par prélèvement

de 0,1 à 1 mL de solution contenant initialement une quantité connue de [U-ring-14C]-atrazine. 7 mL de

liquide à scintillation sont additionnés au prélèvement puis le mélange est analysé au compteur à

scintillation.

II.1.1.2 Cinétique d’adsorption

L’étude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin a, dans un premier temps, été réalisée en

batch. Les cinétiques d’adsorption ont ainsi été déterminées à 20°C en milieu dispersé en mettant en

contact l’atrazine en solution aqueuse avec une quantité connue d’écorce de pin en poudre dans des

tubes en verre de contenance 20 mL (ratio liquide/solide = 10 mL.g-1 ; 1g d’écorce stérile (d<200 µm)

dans 10 mL d’eau déminéralisée stérile), le tout en conditions stériles afin de s’affranchir de tout effet

biologique et à l’abri de la lumière. Les tubes ont été placés sur un agitateur par retournement

(10 rotation/minute). Les cinétiques d’adsorption ont été étudiées à différentes concentrations initiales

en atrazine : 0,5 mg.L-1, 1,4 mg.L-1, 2,7 mg.L-1, 10,7 mg.L-1 et 15 mg.L-1. L’atrazine a été additionnée

aux essais à partir d’une solution mère de 200 mg.L-1 de méthanol.

Figure 7 : Essais de cinétique d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en milieu dispersé

L’adsorption de l’atrazine a été suivie en sacrifiant des tubes aux temps : 0, 10 minutes, 45 minutes,

2 heures, 6, 22, 32 et 46 heures. Le surnageant (1 mL) prélevé a été filtré sur des membranes de

0,45 µm en acétate de cellulose avant d’être analysé par l’HPLC. Chaque essai a été réalisé en



94

triplicats et des blancs sans écorce et/ou sans atrazine ont permis d’identifier les éventuelles pertes

ou transformations de l’atrazine, et d’identifier les pics provenant du relargage des composés solubles

de l’écorce dans l’eau.

II.1.1.3 Isothermes d’adsorption

Des isothermes d’adsorption ont été réalisées dans les mêmes conditions de température et

d’agitation que celles citées ci-dessus (II.1.1.2). Un temps d’agitation de 24h, correspondant à

l’équilibre apparent déterminé grâce aux études cinétiques, a été respecté. Les essais d’adsorption de

l’atrazine ont ensuite été réalisés avec différentes granulométries d’écorce de pin : d< 200µm,

200<d<500 µm, 500<d<2000 µm, à différents ratios L/S : L/S =10, 20, 40, 100 et 1000 mL/g.

L’effet du pH a également fait l’objet d’une étude particulière (l’adsorption à pH 7 et pH 4 a été

étudiée).

Les isothermes d’adsorption ont été tracées pour différentes gammes de concentrations en atrazine.

Pour les concentrations les plus faibles (de l’ordre de quelques µg.L-1) l’atrazine radioactive [U-ring-14C]-atrazine a été utilisée. Les isothermes d’adsorption ont ainsi pu être tracées pour des

concentrations initiales en atrazine comprises entre 2,6 µg.L-1et 20 mg.L-1.

Les essais ont été réalisés triplicats.

II.1.1.4 Extraction de l’atrazine adsorbée sur l’écorce de pin

Des expériences d’extraction de l’atrazine adsorbée sur l’écorce de pin ont été menées à plusieurs

reprises. Différentes méthodes ont été choisies mais malheureusement aucune d’entre elles n’a pu

répondre à nos attentes, le pourcentage d’atrazine extraite étant à chaque fois trop faible pour pouvoir

être pris en considération.

Les techniques d’extraction testées ont été les suivantes :

- Extraction SDE (Simultaneous Distillation Extraction) : Les solvants testés ont été le dichlorométhane et le chloroforme.

- Extraction au soxhlet : Les solvants testés ont été le dichlorométhane et le chloroforme.

- Extraction en milieu aqueux : Extractions à froid (20°C) avec une solution aqueuse de HCl (pH 2) et une solution aqueuse de NaCl

2M (pH 4).



95

II.1.2 Etude de l’adsorption en colonne

II.1.2.1 Courbes d’élution d’un soluté

La courbe obtenue par l’analyse de la solution en sortie de colonne est appelée « courbe d’élution ».

Lorsque l’injection de la solution contenant le traceur (ou tout autre soluté) est effectuée en créneau,

la caractéristique de la courbe d’élution peut se présenter de différentes manières (Figure 8).

Figure 8 : Différentes courbes d’élution rencontrées suite à une injection en créneau (1 à 3). C et V expriment respectivement la concentration en soluté et le volume de solution cumulé récolté en sortie de colonne ; Vo représente le volume d’eau total contenu dans la colonne, C0 est la concentration entrante

de soluté

- 1 : Courbe d’élution symétrique ; son sommet correspond au temps de séjour moyen.

Elle représente une fonction de distribution de type gaussien, qui signifie que

l’écoulement se déroule dans une structure homogène sans zone morte ni chemin

préférentiel. L’élargissement de la courbe par rapport au créneau résulte de la

dispersion axiale et radiale du soluté.

- 2 : Courbe asymétrique dans laquelle le front compressif (montée) est plus rapide que

le front diffusif (descente). Cet effet est lié à la présence de zones mortes ou

stagnantes, où l’échange entre les molécules entrantes et les molécules sortantes est

très lent.

- 3 : la présence de deux pics résulte de l’existence de chemins préférentiels.

Co

C(t) Co

V

C/Co

V/Vo

C/Co

V/Vo

C/Co

V/Vo

Injection

3

1

2



96

L’expression de ces courbes en concentration relative (C/Co) par rapport au volume relatif (V/Vo) ou

au temps t permet de s’affranchir de certaines variations dans les conditions opératoires (variation de

la concentration en entrée, de la vitesse d’écoulement, etc.) et permet de comparer les différentes

courbes d’élution entre elles. La représentation d’une courbe d’élution exprimée en concentration

relative en fonction du temps ou du volume relatif est appelée « courbe de distribution des temps de

séjour » (DTS).

L’analyse de la courbe d’élution fournit un certain nombre de paramètres caractéristiques, comme le

bilan de masse BM et le facteur de retard R.

Le bilan de masse s’exprime comme suit :

tBM

∆= 0µ

où ∆t est le temps d’injection du soluté (correspondant à 1 V0 dans le cas du traceur).

µ0 exprime l’aire sous la courbe d’élution et est calculée par :

dtC

tC∫∞

=0 0

0)(µ

La valeur de BM permet de décrire le comportement du soluté:

• Si BM = 1, toute la masse de soluté injectée en entrée est récupérée en sortie. Les

interactions pouvant se produire au cours de l’écoulement sont entièrement réversibles et le

soluté est dit « conservatif ».

• Si BM<1, une partie de la masse injectée est perdue suite à des réactions ou des interactions

irréversibles (volatilisation, précipitation, adsorption, dégradation biologique ou chimique,…).

Le facteur de retard permet d’évaluer le retard d’un soluté réactif au cours de son transfert par rapport

au transfert d’un soluté non réactif. Il est défini par le quotient entre les deux temps de séjour :

théoriques

solutés

tt

R =

avec

qLt théoriques

ε.=



97

où ,

- L : Longueur de la colonne (m)

- ε : Teneur en eau dans la colonne (-)

- q : Vitesse de Darcy en entrée de colonne (m.s-1)

Le facteur de retard R est un indicateur des interactions éventuelles existantes :

o Si R = 1, il n’existe aucune interaction entre le soluté et la matrice.

o Si R < 1, l’avancement du soluté est plus rapide que celui des molécules

d’eau. Ceci peut être dû à l’exclusion anionique.

o Si R > 1, le soluté est soumis à des interactions avec la matrice au cours de

son transfert, et est donc élué en retard par rapport aux molécules non

réactives de la solution.

II.1.2.2 Caractérisation de l’écoulement à l’aide de traceurs

Le traçage est une procédure expérimentale qui permet de rendre observable le déplacement réel de

l’eau, dans un milieu poreux, suivant une ou des trajectoires définies, entre un point d’origine et un ou

plusieurs points de détection, au moyen de traceurs artificiels.

II.1.2.2.1 Choix du traceur

Un traceur idéal a, en tout point, un comportement identique à celui de l’eau ou du liquide qui s’écoule

à travers du milieu poreux. C’est donc une substance non réactive. En pratique, on utilise souvent des

traceurs anioniques. Parmi ceux-ci on peut citer les sels de bromure, les chlorures ou certains

colorants.

II.1.2.2.2 Suivi du traceur en sortie de colonne

Après saturation de la colonne en eau, un volume de 1V0 de la solution de KCl (1g.L-1) est injecté en

créneau grâce à une vanne d’entrée, à l’intérieur de la colonne. La concentration en KCl est suivie en

sortie de colonne par conductimétrie. Une cellule de conductivité (XE100 Radiometer) reliée à un

analyseur CONSORT C832 permet de suivre la conductivité en continu par intégration sur ordinateur

des données toutes les 45 secondes. La solution circulante est envoyée avec un débit de 1 mL.min-1.

La courbe d’élution est exprimée en C/Co en fonction de V/Vo.



98

II.1.2.3 Méthodes expérimentales d’adsorption en colonne

II.1.2.3.1 Préparation des colonnes

Les colonnes utilisées sont des colonnes en verre de chromatographie (fournisseur Amersham

Biosciences) de dimensions L = 400 mm de hauteur et 25 mm de diamètre interne. Les colonnes sont

équipées de deux pistons dont l’extrémité qui est mise en contact avec le milieu poreux est protégée

par une grille plastique (maille de 1 mm2) recouvert d’une membrane en nylon (diamètre des pores

10 µm). L’étanchéité est assurée grâce à des joints caoutchouc. Les tubulures utilisées sont en

polyéthylène. La Figure 9 représente le détail des colonnes utilisées.

Figure 9 : Schéma d’une colonne

Les colonnes sont remplies avec environ 10 g de milieu poreux (écorce de pin en poudre ou charbon

actif dans certains cas). Le remplissage est fractionné, c’est à dire que tous les 2 g, une pression est

appliquée sur le matériau afin d’homogénéiser le tassement. Le milieu est ensuite pressé entre les

deux pistons (la hauteur de la colonne contenant le support d’adsorption représente environ 7 cm).

Colonne de verre(Dint 26mm, L 400 mm)

Joint caoutchouc

Grille protectrice

Membrane nylon

Tube PTFE



99

Les colonnes sont dans un premier temps saturées en eau par circulation en flux ascendant d’eau

déminéralisée stérile pendant 12 h environ jusqu’à obtenir un poids constant des colonnes.

Un traçage au KCl est ensuite effectué (comme décrit ci-dessus II.1.2.2.2) ; il permet de rendre

compte du comportement hydrodynamique des colonnes. Lorsque aucune irrégularité ne survient (le

pic d’élution est symétrique), les essais d’adsorption peuvent commencer. Si la courbe d’élution du

traceur présente une asymétrie, la colonne est vidée, remplie de nouveau et testée de nouveau.

Chaque colonne mise en place est caractérisée par un certain nombre de paramètres cités dans le

tableau ci-dessous (Tableau 6)

Tableau 6 : Caractéristiques d’une colonne

Paramètres colonne Symbole Unité

Diamètre interne d cm

Section S cm2

Hauteur du lit L cm

Masse de milieu poreux m g

Volume du lit Vt cm3

Volume de pore Ve ou V0 cm3

Indice de vide e (Ve/Vs) -

Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (Ve/Vt) -

Flux D cm3.h-1

Vitesse de Darcy q (D/S) cm.h-1

Vitesse de pore V (q/ ε) cm.h-1

Le volume d’air Va est considéré comme nul, et le degré de saturation s=1.

L’écorce de pin utilisée en colonne est constituée de particules de diamètre inférieur à 200 µm.

Pour certains essais l’écorce de pin stérilisée a été utilisée afin de tester l’influence de la stérilisation

sur l’adsorption de l’atrazine. La stérilisation de l’écorce de pin a été réalisée comme précisé au § I.7.

L’hydrodynamique de l’écorce de pin et du charbon actif a également été comparée.

Les particules de charbon actif utilisé (Darco G-60 fourni par Aldrich) possèdent un diamètre inférieur

à 200 µm.



100

II.1.2.3.2 Suivi du COD, du pH et de la conductivité en sortie de colonne

Lors de la circulation de l’eau à travers la colonne, certains composés organiques de l’écorce de pin

sont solubilisés dans la solution circulante ; une analyse du carbone organique dissous (COD) en

sortie de colonne permet d’évaluer la quantité de carbone relarguée au cours du temps. D’autre part,

lors de la solubilisation des composés de l’écorce en solution, le pH de l’eau ainsi que la conductivité

varient avec le volume de solution filtrée. Un système d’électrodes, positionné en sortie de colonne,

permet de suivre en ligne l’évolution du pH et de la conductivité en fonction du volume passé à travers

la colonne.

Le pH et la conductivité sont suivis simultanément par un appareil CONSORT C832 relié à une

électrode pHC3001 et une cellule de conductivité XE100 Radiometer. Chaque électrode est plongée

dans une cellule à débordement de 1mL, traversée par la solution en sortie de colonne. L’installation

est représentée Figure 10. Le Multianalyser CONSORT C832 est relié à un ordinateur à partir duquel

sont enregistrées les données toutes les 45 secondes.

Pour l’analyse du COD, les échantillons collectés ont été filtrés sur une membrane filtrante de

0,45 µm ; le carbone inorganique a été éliminé par acidification à l’acide phosphorique puis purgé par

barbotage à l’hélium. Les échantillons collectés ont été analysés au COT mètre O.I. Analytical 1020A

selon la norme européenne EN 1484.



101

Aquisition informatique

Cond.

Multianalyser CONSORT C832 - pH - Conductivité

pH

Pompe Peristaltique

Eau déminéralisée ou

Solution d’atrazine

10 g écorce de pin

Flux : 1 ml/min

Collecteur de fractions

COTMètre

Conditions stériles

HPLC

Figure 10 : Dispositif expérimental pour l’étude de l’adsorption en colonne

II.1.2.3.3 Adsorption de l’atrazine en colonne

Les essais d’adsorption de l’atrazine en colonne d’écorce de pin ont été réalisés à une concentration

entrante d’environ 0,2 mg.L-1, dans un premier temps. La capacité d’adsorption de l’atrazine a été

testée avec l’écorce préalablement stérilisée (Cf. I.7) ou non stérilisée ; une colonne de charbon actif

a également été préparée.

Les colonnes sont préparées et remplies comme décrit ci-dessus (II.1.2.3.1) ; après saturation en eau,

le comportement hydrodynamique des colonnes est contrôlé par un traçage au KCl (II.1.2.2.2). Un

biocide (NaN3 200 mg.L-1) est additionné à la solution entrante d’atrazine afin d’assurer des conditions

abiotiques et ainsi s’affranchir de tout phénomène biologique pouvant entraîner une dégradation

partielle du pesticide. L’installation est représentée Figure 10.

La solution est injectée dans les colonnes en flux ascendant à des débits de 1 mL.min-1 ou

0,3 mL.min-1. Les échantillons sont prélevés à intervalle de temps régulier par un collecteur de

fractions directement placé en sortie de colonne. Les échantillons sont ensuite analysés par HPLC

permettant de détecter une concentration minimale en atrazine de 0,03 mg.L-l.

RESULTATS ET DISCUSSION Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin


102

II.2 Résultats et discussion

II.2.1 Etude de l’adsorption en batch

II.2.1.1 Cinétiques d’adsorption

Les études de cinétique d’adsorption ont été réalisées pour des concentrations initiales en atrazine

(Ci) comprises entre 0,5 mg.L-1 et 15 mg.L-1, dans des tubes en verre soumis à une agitation par

retournement pendant environ 50 heures, selon le protocole (II.1.1.2).

Les cinétiques ont permis de fixer le temps d’équilibre apparent d’adsorption de l’atrazine sur le

support d’écorce de pin. Les résultats sont présentés ci-dessous.

0,0

5,0

10,0

15,0

0 10 20 30 40

Temps (h)

Atr

azin

e ad

sorb

ée (m

g.l

-1)

Ci=15 ppm

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

0 10 20 30 40

Temps (h)

Atr

azin

e ad

sorb

ée (m

g.l

-1)

Ci=1,4 ppm

0,0

0,7

1,4

2,1

2,8

0 10 20 30 40Temps (h)

Atr

azin

e ad

sorb

ée (m

g.l

-1)

Ci=2,7 mg/l

0,0

4,0

8,0

12,0

0 10 20 30 40

Temps (h)

Atr

azin

e ad

sorb

ée (m

g.l

-1)

Ci=10,7 ppm

0,0

0,2

0,4

0,6

0 10 20 30 40

Temps (h)

Atr

azin

e ad

sorb

ée (m

g.l

-1)

Ci=0,5 mg/l

0,0

2,0

4,0

6,0

0 10 20 30 40

Temps (h)

Atr

azin

e ad

sorb

ée (m

g.l-1

)

Ci=5 mg/l

Figure 11 : Cinétique de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin (d<200 µm) à différentes

concentrations initiales ; 20 ± 2°C ; L/S = 20 mL.mg-1

La Figure 11 montre que l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en poudre (d < 200 µm), a lieu

principalement lors des premières minutes de contact. Quelle que soit la concentration initiale en

atrazine, le pourcentage d’adsorption excède toujours les 92%. Au bout de 24 h de mise en contact de

l’atrazine et de l’écorce de pin en poudre, l’équilibre apparent est atteint ; c’est le temps que nous



103

avons choisi d’utiliser pour réaliser tous les essais ultérieurs d’adsorption en batch de l’atrazine sur

l’écorce.

II.2.1.2 Isothermes d’adsorption

Les isothermes d’adsorption ont été tracées afin de comparer la capacité de l’écorce à adsorber le

polluant atrazine dans différentes conditions expérimentales. Ainsi, les essais d’adsorption ont été

réalisés pour différents ratios liquide/solide, différentes granulométries de particules d’écorce, à

différents pH et dans une gamme de concentrations en atrazine relativement étendue : de quelques

µg.L-1 à plusieurs dizaines de mg.L1.

II.2.1.2.1 Influence de la granulométrie de l’écorce de pin sur l’adsorption de l’atrazine

Afin de sélectionner les meilleures conditions d’adsorption de l’atrazine pour notre procédé de

traitement, des études sur l’influence de la granulométrie de l’écorce sur sa capacité d’adsorption ont

été menées selon le protocole décrit au § II.1.1.3, pour 3 diamètres différents de particules d’écorce :

d<200 µm ; 200 µm < d < 500 µm ; 500 µm<d< 2000 µm. Les résultats des essais d’adsorption sont

présentés Figure 12.

Figure 12 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoclavée en poudre de différentes granulométries (d<200 µm ; 200 µm < d < 500 µm ; 500 µm< d < 2000 µm ; mélange de particules

d<2000 µm) ; 20 ± 2°C ; pH 4,5 ; Temps de contact 24h

L’application du modèle de Freundlich permet d’obtenir les constantes caractéristiques de l’adsorption

Kf et n. Les paramètres du modèle de Freundlich obtenus pour les différentes tailles de particules

d’écorce de pin sont présentés Tableau 7. Les valeurs de la constante de Freundlich Kf ((mg. g-

1)(L.mg-1)1/n) montrent la faible capacité d’adsorption de l’écorce de pin vis à vis de l’atrazine avec des

valeurs de Kf inférieures à 0,155 (mg. g-1)(L.mg-1)1/n. D’autre part, les coefficients n très proche de 1,

montrent que les isothermes sont quasiment linéaires.

y = 0,064x + 0,0017R2 = 0,985

y = 0,0818x + 0,0037R2 = 0,9984

y = 0,0848x + 0,0079R2 = 0,9958

y = 0,1478x + 0,0077R2 = 0,978

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Ceq (mg.l-1)

q (m

g.g-

1)

d<200 µm

200 µm<d<500 µm

500 µm<d<2000 µm

mélange d<2000 µm



104

Campos et al. (2000) obtiennent à titre d’exemple, pour l’adsorption d’atrazine sur un charbon actif en

poudre des constantes de Freundlich de l’ordre de 50 (mg. g-1)(L.mg-1)1/n (n=0,44).

Tableau 7 : Coefficients du modèle de Freundlich caractérisant les isothermes d’adsorption de l’atrazine sur des particules d’écorce de pin autoclavée de différentes granulométries

Avec Kf en (mg. g-1)(L.mg-1)1/n

L’écorce de pin présente une meilleure capacité d’adsorption de l’atrazine pour la granulométrie la

plus petite (diamètre des particules inférieur à 200 µm). Ce résultat est logique puisque, lorsque la

surface de contact augmente, la capacité d’adsorption augmente aussi. On note également que le

mélange (d<2000 µm, sortie directement du broyeur sans tamisage ultérieur) présente une capacité

d’adsorption proche de celle de la poudre la plus fine avec un Kf de 0,0927 (mg. g-1)(L.mg-1)1/n.

Lorsque le criblage est réalisé sur le mélange, la fraction inférieure à 200 µm représente la fraction

majoritaire ; ainsi cette fraction fine, qui présente la meilleure capacité d’adsorption, sera retenue pour

toutes les expérimentations ultérieures.

II.2.1.2.2 Influence du pH sur l’adsorption de l’atrazine

L’écorce de pin en poudre présente dans une solution aqueuse impose un pH acide à cette solution

aux alentours de 4-5. L’effet du pH sur l’adsorption de l’atrazine sur les particules d’écorce a été testé

à l’aide de solutions d’atrazine tamponnées à pH 7 et pH 4. Le protocole de ces essais est détaillé au

§ II.1.1.3. La Figure 13 présente les isothermes d’adsorption obtenues à pH 4 et à pH 7.

(µm) Kf n d<200 0,1555 0,964 200<d<500 0,0855 0,968 500<d<2000 0,0657 0,981 Mélange <2000 0,0927 0,937



105

Figure 13 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoclavée (d<200 µm) en

suspension aqueuse tamponnée à pH 4 ou pH 7 ; rapport L/S =40 ; 23 ± 2 °C ; temps de contact 24 h

Tableau 8 : Coefficients du modèle de Freundlich caractérisant les isothermes d’adsorption de l’atrazine (Ci=0,3 à 5,5 mg.L-1) en solution à pH 4 et pH 7 sur des particules d’écorce de pin

Avec Kf en (mg. g-1)(L.mg-1)1/n

Le pH de la solution d’atrazine a une influence sur l’adsorption de celle-ci sur le support d’écorce de

pin. A pH 4 le coefficient d’adsorption de Freundlich Kf atteint 0,243 (mg. g-1)(L.mg-1)1/n contre

0,171 (mg. g-1)(L.mg-1)1/n à pH 7. L’augmentation de l’affinité de l’atrazine pour l’écorce de pin à pH 4

pourrait s’expliquer par une éventuelle protonation des sites de l’écorce. Le paramètre n très proche

de 1 caractérise la linéarité des isothermes dans cette gamme de concentrations et de pH.

Travailler à pH 4 pourrait donc présenter un avantage ; cependant le traitement biologique combiné au

procédé d’adsorption va également imposer des conditions qui dans le cas d’une activité biologique,

pourrait ne pas concorder avec les conditions optimales d’adsorption. L’activité des micro-organismes

utilisés pour notre procédé combiné, sera etudiée à pH 4 lors de l’approche biologique (III.2.2.2).

II.2.1.2.3 Isotherme d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin dans une large gamme de

concentrations

La caractérisation de l’adsorption sur l’écorce a été réalisée pour une gamme de concentrations très

large en atrazine, allant de quelques µg.L-1 a plusieurs mg.L-1, pour différents ratios Liquide/Solide.

Les isothermes d’adsorption à faibles concentrations (jusqu’à 2,6 µg.L-1) en atrazine ont été réalisées

grâce à l’utilisation d’atrazine radioactive (protocole au § II.1.1.3).

y = 0,233x + 0,0103

y = 0,1677x + 0,0034

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Ceq (mg.L-1)

q (m

g.g

-1)

pH 4

pH 7

pH Kf n 4 0,243 0,969 7 0,171 0,986



106

Les Figure 14 et Figure 15 représentent les isothermes d’adsorption pour deux gammes de

concentrations différentes. Dans les deux cas, la diminution du ratio L/S entraîne la réduction de

l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce. Ce résultat indique que la dispersion des particules d’écorce en

suspension est modifiée en fonction du ratio liquide/solide utilisé ; l’agrégation des particules d’écorce

à faible ratio L/S pourrait entraîner la réduction de l’accessibilité des molécules d’atrazine aux sites

d’adsorption de l’écorce.

Figure 14 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine ([atrazine]i= 2,6 à 749 µg.L-1) sur l’écorce de pin en

poudre (d<200 µm) ; ratio L/S = 10, 100 et 1000 ; 20 ± 2°C ; pH 4-5 ; temps de contact 24h

Figure 15 : : Isothermes d’adsorption de l’atrazine ([atrazine]i= 1 à 20 mg.L-1) sur l’écorce de pin en poudre

(d<200 µm) ; ratio L/S = 10, 20 et 100 ; 20 ± 2°C ; pH 4-5 ; temps de contact 24h

y = 0,1478x + 0,0077

y = 0,1861x + 0,0046

y = 0,2723x + 0,0587

0

0,04

0,08

0,12

0,16

0,2

0,24

0,28

0,32

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

Ceq (mg/l)

q (m

g/g)

L/S=100

L/S=20

L/S=10

y = 0,2087x + 1,8534

y = 0,1214x + 1,4086

y = 0,0227x + 0,2525

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Ceq (µg/l)

q (µ

g/g)

L/S=1000

L/S=100

L/S=10



107

L’adsorption à ratio L/S=10 à faible concentration est réduite comparée à l’adsorption observée à plus

forte concentration. Cette observation peut être expliquée par un phénomène d’agrégation des

particules d’écorce entre elles, ce qui diminuerait la surface totale d’adsorption pour les molécules

d’atrazine.

Si l’on compare l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en poudre (d<200 µm) et l’adsorption sur

un charbon actif en poudre de granulométrie comparable, on remarque que la capacité d’adsorption

de l’écorce de pin est très faible par rapport à celle du charbon actif (Figure 16). Cette différence

s’explique entre autres par la porosité des matériaux. Le charbon actif en poudre possède une surface

spécifique environ 100 fois supérieure à celle de l’écorce de pin.

Figure 16 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin (d<200 µm) et sur charbon actif

(d<200 µm) ; ratio L/S=1000 ; 20 ± 2°C ; temps de contact 24h

Dans le cadre d’un procédé physique de décontamination (adsortpion), le charbon actif devra être

préféré à l’écorce de pin. Dans un procédé de décontamination tel que celui étudié ici, combinant

adsorption et biodégradation, la faible capacité d’adsorption de l’écorce peut devenir un avantage,

puisque le polluant restera plus disponible pour les micro-organismes choisis pour ce traitement.

II.2.2 Etude de l’adsorption en colonnes abiotiques

L’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin a été étudiée en colonne de 10 g de matériau sec.

Les essais ont été réalisés en conditions abiotiques selon le protocole décrit au § II.1.2.3.

Dans un premier temps, un traceur (KCl) a permis de vérifier le comportement hydrodynamique de

nos colonnes ; puis le suivi de la solution en sortie de colonne a permis d’évaluer les quantités de

y = 0,3047x + 0,2255

y = 87,59x + 1,3367

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Ceq (µg/l)

q (µ

g/g)

Charbon Actif

Ecorce de pin



108

matière organique libérée par l’écorce de pin ; le pH et la conductivité ont également été suivis en

sortie de colonne.

II.2.2.1 Etude hydrodynamique des colonnes

Le comportement hydrodynamique des colonnes d’écorce de pin stérile et des colonnes d’écorce non

stérile a été étudié en parallèle.

La Figure 17 présente les courbes d’élution pour ces deux types de colonnes après injection de 1V0

d’une solution de KCl (1g.L-1). Les caractéristiques des colonnes sont présentées ANNEXE 3.

Figure 17 : Comportement hydrodynamique : Transfert de KCl dans les colonne d’écorce de pin stérile (droite) ou non stérile (gauche) ; Débit de colonne = 1 mL.min-1 ; 22°C

Les comportements hydrodynamiques des colonnes d’écorce de pin stérile ou non stérile sont très

semblables. Dans les deux cas, le point d’inflexion de la courbe ascendante est obtenu après 1V0,

(R=1,002 et 0,96 pour l’écorce stérile et non stérile respectivement) indiquant l’absence de retard

dans l’élution du KCl. Cependant un délai de restitution du KCl est observé (phase descendante)

suggérant la présence de phénomènes de dispersion. Ce retard peut être expliqué par la présence de

zones stagnantes à l’intérieur de la colonne ou la dilution de la solution en sortie de colonne dans les

cellules contenant l’électrode de conductivité (dilution dans 1-2 mL). L’apparition d’un léger plateau

dans le cas de l’écorce non stérile peut s’expliquer par l’existence de chemins préférentiels dans la

colonne.

Dans les deux cas, le KCl injecté est récupéré en sortie à 100% (Bilan massique BM = 0,98) ; le KCl

n’est donc pas retenu sur l’écorce et constitue un bon traceur pour les colonnes d’écorce de pin. Ce

traçage au KCl avant chaque utilisation d’une nouvelle colonne, a permis de mettre en évidence

certains défauts de préparation (zones stagnantes, chemins préférentiels) par la présence

d’irrégularité sur les courbes d’élution. Dans ce cas les colonnes ont été préparées à nouveau.

Ecorce non stérile

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8

V/Vo

C/C

o

Ecorce stérile

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8V/Vo

C/C

o

Ecorce non stérile Ecorce stérile



109

II.2.2.2 Suivi du COD, pH et conductivité en sortie de colonne

Le passage de la solution aqueuse polluée à travers la colonne entraîne la solubilisation de certains

composés organiques solubles de l’écorce de pin, ainsi qu’une acidification de la solution. L’évaluation

en sortie de colonne de la concentration en Carbone Organique Dissous (COD) ainsi que des

paramètres pH et conductivité a été mise en œuvre selon le schéma présenté Figure 10 (§ II.1.2.3.2)

pour des colonnes d’écorce de pin stérile et non stérile. Les caractéristiques des colonnes utilisées

pour cette expérience sont présentées en ANNEXE 3.

La Figure 18 montre que la libération de matière organique issue de la solubilisation de composés de

l’écorce de pin est relativement identique pour les colonnes d’écorce stérile et non stérile. La

concentration de carbone organique est très élevée dans les premiers échantillons collectés (2500

mg.L-1 pour l’écorce non stérile et 2300 mg.L-1 pour l’écorce stérile). Rapidement, le COD en sortie de

colonne diminue et atteint 70 mg.L-1 entre 10 et 30 V0 (correspondant à un volume de 200 à 600 mL) ;

puis le COD devient inférieur à 20 mg.L-1 après 35 V0. Cette concentration est assez élevée puisque

proche des limites de rejet d’eaux brutes dans dans le milieu naturel (DCOmax 125 mg.L-1, soit une

concentration en carbone d’environ 30-50 mg.L-1).

La masse de carbone solubilisée représente 3,64% de la masse totale d’écorce stérile et 3,40 %

lorsque l’écorce n’a pas été autoclavée. Ces valeurs sont 3 fois supérieures à celles obtenues lors de

tests de lixiviations en batch à un ratio Liquide/solide de 20 mg.L-1 (COD = 1,16% de la masse totale

de l’écorce 2). Dans les colonnes le ratio L/S est environ de 2 mg.L-1, soit une écorce dix fois plus

concentrée en solution que dans les tests de lixiviation en batch ; ceci explique sans doute la

différence entre COD en colonne et COD en essais batch.

Figure 18 : Suivi du COD en sortie de colonne d’écorce de pin stérile et non stérile traversée par une

solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min-1 ; 22°C ; Temps de séjour ≅ 20 min

Cette libération de carbone organique dissous est importante puisque dans le cadre du traitement

biologique il sera important de connaître d’une part la toxicité de ces composés organiques solubles

de l’écorce de pin sur les micro-organismes utilisés, et d’autre part, la capacité des micro-organismes

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 10 20 30 40 50

V/Vo

CO

D (m

g/l)

Ecorce stérileEcorce non stérile



110

à utiliser ces composés comme source de carbone. La consommation des composés solubles de

l’écorce de pin par les micro-organismes pourrait alors éviter l’addition lors du traitement d’une source

de carbone additionnelle.

Il est également important de connaître le pH et la conductivité de l’eau en sortie de colonne (Figure

19 et Figure 20).

Figure 19 : Suivi du pH en sortie de colonne (10 g écorce stérile ou d’écorce non stérile) traversée par une

solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min-1 ; 22°C ; temps de séjour ≅ 20 min

Figure 20 : Suivi de la conductivité en sortie de colonne (10 g d’écorce stérile ou d’écorce non stérile)

traversée par une solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min-1 ; 22°C ; temps de séjour ≅ 20 min

Le pH de la solution d’eau en sortie de colonne est relativement acide pour les premiers mL élués

(environ 3,9) pour les colonnes d’écorce stérile comme pour l’écorce non stérile. Après circulation

d’environ 5V0, le pH se stabilise à 4,8 et 4,6 pour les colonnes d’écorce non stérile et d’écorce stérile

3,5

3,7

3,9

4,1

4,3

4,5

4,7

4,9

5,1

5,3

5,5

0 5 10 15 20 25

V/V0

pH


0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 10 20 30 40

V /V 0

C (µ

S/cm

) E co rce s té rileE co rce non s té r ile



111

respectivement. De la même façon, la conductivité très élevée en début de circulation 350 à

840 µS.cm-1), traduisant la lixiviation de composés ioniques de l’écorce de pin, décroît rapidement et

se stabilise après 30 V0 à une valeur de 20 µS.cm-1 dans les deux colonnes. Une quantité plus

importante de composés ioniques est relarguée par l’écorce de pin non stérilisée (840 µS.cm-1 pour le

premier échantillon prélevé) comparé à l’écorce stérilisée (350 µS.cm-1), indiquant que la stérilisation

stabilise certains composés de l’écorce de pin.

Des essais ultérieurs permettront de dire si Pseudomonas ADP sp. utilisée dans le cadre de notre

procédé combiné, sera capable de survivre et de croître dans ces conditions de pH, et de

conductivité.

II.2.2.3 Adsorption de l’atrazine en colonne d’écorce de pin en conditions abiotiques

L’adsorption de l’atrazine a été testée sur les colonnes d’écorce de pin préalablement stérilisée et non

stérilisée selon le protocole décrit au § II.1.2.3.3. Dans les deux cas la solution d’atrazine circulante

contenait un biocide (azoture de sodium 200 mg.L-1) afin d’assurer des conditions totalement

abiotiques, évitant ainsi l’intervention de phénomènes biologiques indésirables ici. Le schéma du

montage pour ces essais est représenté Figure 10 (p.101). Un essai sur colonne de charbon actif a

également été réalisé en parallèle.

Les caractéristiques des colonnes utilisées pour ces essais sont présentées en ANNEXE 4.

On observe que la saturation en atrazine des colonnes d’écorce non stérile est atteinte pour l’injection

d’un volume de 50 V0 environ, contre 100 V0 dans le cas des colonnes d’écorce préalablement

stérilisée (Figure 21). Dans la colonne de charbon actif, l’atrazine n’est pas détectée en sortie de

colonne après injection d’un volume correspondant à 170 V0 ; encore une fois, ce résultat montre la

bien meilleure capacité d’adsorption du charbon actif par rapport à celle de l’écorce de pin.



112

Figure 21 : Adsorption de l’atrazine sur écorce de pin (stérile ou non stérile) et sur charbon actif en colonne (masse d’adsorbant 10g), circulation en circuit ouvert ; [atrazine]i=0,2 mg.L-1 ; débit = 1 mL.min-1 ;

22°C ; temps de séjour ≅ 20 min

Le calcul de l’aire supérieure de la courbe (méthode des trapèzes) permet d’accéder à la quantité

d’atrazine adsorbée sur l’écorce de pin. Après l’injection de 164 V0, l’équilibre apparent est atteint et

0,031 ou 0,032 mg d’atrazine sont adsorbés par gramme d’écorce non stérile ou stérile

respectivement. Les deux courbes sont à première vue très différentes ; elles laissent penser que les

concentrations en atrazine adsorbée seraient significativement différentes entre l’écorce stérile et

l’écorce non stérile. Pourtant les résultats obtenus sont très similaires (0,031 et 0,032 mg.g-1) ; ceci est

expliqué par le fait que les concentrations C0 et les volumes de pores V0 de chaque colonne ne sont

pas les mêmes (C0=0,23 mg.L-1 et V0=25 ml pour la colonne d’écorce non autoclavée contre

C0=0,20 mg.L-1 et V0=18 ml pour la colonne d’écorce autoclavée). Ainsi, ces résultats montrent que

les capacités d’adsorption de l’écorce stérilisée et l’écorce non stérilisée sont tout à fait similaires.

Si l’on compare l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en colonne et en essais batch (Figure 22),

on remarque que pour une concentration à l’équilibre de 0,2 mg.L-1 les quantités d’atrazine adsorbées

sur l’écorce (stérile ou non stérile) sont similaires : 0,040 mg par gramme d’écorce stérilisée et

0,037 mg par gramme d’écorce non stérilisée, en batch. En colonne comme en milieu dispersé,

l’adsorption de l’atrazine est très légèrement supérieure sur l’écorce stérilisée que sur l’écorce non

traitée.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

V/Vo

C/C

o

Ecorce non stérile

Ecorce stérile

Charbon Actif



113

Figure 22 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoclavée et non autoclavée (d<200µm); ratio L/S=20 ; 20°C ; temps de contact 24h

Le traitement de l’écorce par 2 autoclavages successifs pourrait améliorer légèrement la capacité de

l’écorce de pin pour l’adsorption de l’atrazine. Le pH dans les essais avec écorce autoclavée et avec

écorce non autoclavée étant identique (pH 4,5), on peut penser que le chauffage de l’écorce à 120°C

pourrait ouvrir certains pores et ainsi offrir à l’écorce une plus grande surface de contact et donc

d’adsorption.

II.2.3 Conclusion

Les expériences ci-dessus ont permis de déterminer un temps d’équilibre apparent d’adsorption de

l’atrazine sur l’écorce de pin de moins de 24 h. Elles ont également permis de faire un choix quant à la

granulométrie de l’écorce à utiliser, pour une adsorption optimale ; désormais l’écorce en poudre fine

(particules de diamètre < 200µm) sera utilisé e pour tout le reste de l’étude.

Les essais ont également montré que l’adsorption était favorisée à des pH acides. En revanche

l’abaissement des ratios L/S, diminue notablement l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin,

suggérant qu’à un faible rapport Liquide/solide, l’adsorption pourrait être diminuée à cause de

l’aggrégation des particules d’écorce entre elles.

Concernant les essais en colonnes, le choix du KCl en tant que traceur s’est révélé être satisfaisant ;

le KCl n’est pas retenu sur les colonnes d’écorce de pin et permet d’étudier le comportement

hydrodynamique des colonnes avant chaque utilisation pour des essais d’adsorption.

y = 0,2052x + 0,0023

y = 0,1449x + 0,0077

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,5 1 1,5Ceq (mg/l)

q (m

g/g)

Ecorce autoclavée

Ecorce non autoclavée



114

Les études en colonnes ont montré que la solution en sortie de colonne était acide (pH 4,6 et

conductivité 40 µS.cm-1 après 5V0) ; le pH n’évoluant plus après 5 V0. La question se pose alors quant

à la survie des micro-organismes choisis pour le traitement combiné, dans les colonnes d’écorce de

pin, dans ces conditions de pH.

Les résultats d’adsorption obtenus en colonne montrent que la saturation en atrazine de l’écorce est

atteinte beaucoup plus rapidement dans les colonnes d’écorce non stérilisée que dans les colonnes

d’écorce stérilisée. En revanche, dans les deux cas la quantité d’atrazine adsorbée par gramme

d’écorce est équivalente (environ 0,03 mg.g-1 pour une solution entrante à 0,2 mg.L-1). Ce résultat

concorde avec les résultats obtenus en batch (0,04 mg.g-1 d’écorce stérilisée et 0,037 mg.g-1 d’écorce

non stérilisée). L’écorce préalablement stérilisée présenterait un léger avantage par rapport à l’écorce

brute.

D’autre part, les essais ont permis de mettre en évidence des concentrations en carbone organique

non négligeables en sortie de colonne. Un traitement sur écorce de pin serait donc difficilement

envisageable dans le cadre d’une filière classique mais en revanche exploitable en tant que pré-

traitement ou traitement individuel pour de fortes concentrations en atrazine avant que l’eau polluée

ne subisse une filtration sur charbon actif ou soit envoyée en station d’épuration.

Les essais comparatifs réalisés avec le charbon actif montrent que ce dernier est nettement plus

efficace que l’écorce de pin pour adsorber l’atrazine. Cependant, dans un procédé de

décontamination par biofiltration combinant adsorption et biodégradtion, la faible capacité d’adsorption

de l’écorce peut devenir un avantage, puisque le polluant restera plus facilement disponible pour les

micro-organismes mis en jeu.

MATERIEL ET METHODES Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.


115

III. Biodégradation de l’atrazine en culture pure de Pseudomonas ADP sp.

III.1 Matériel et méthodes

III.1.1 Milieux de culture

Les milieux de culture doivent contenir les nutriments nécessaires au développement et au

métabolisme des micro-organismes choisis. Ils doivent ainsi contenir au moins une source azotée,

une source carbonée, une source de phosphore, ainsi que des micro et macro-nutriments (sels

minéraux dont métalliques), éventuellement des facteurs de croissance. Les milieux de culture

peuvent être solides ou liquides, synthétiques ou complexes, riches ou pauvres.

III.1.1.1 Les milieux liquides

III.1.1.1.1 Milieu minéral MM

La plupart de nos essais ont été réalisés en milieu liquide minéral glucosé (source de carbone et

d’énérgie pour les bactéries), l’atrazine jouant le rôle d’unique source d’azote.

La composition du milieu minéral utilisé était la suivante (Barreiros et al., 2003) :

- Tampon Phosphate 27 mM, pH 7,2

- CaCl2,2H2O 0,2 mM

- NaCl 7,56 mM

- MgCl2,6H2O 0,81mM

- FeCl2,4H2O 5,19 µM

- HCl 1,3 µl.L-1, 25%

- ZnCl2 0,51 µM

- MnCl2,4H2O 0,51 µM

- H3BO3 0,01 mM

- CoCl2,6H2O 0,8 µM

- CuCl2,2H2O 0,1 µM

- NiCl2,6H2O 1 µM

- NaMoO4,2H2O 0,16 µM

Les solutions suivantes ont été préparées autoclavées 20 minutes à 120°C et conservées

séparément :

- Eau déminéralisée

- Solution de CaCl2 (0,2 M)

- Solution de nutriments

- Tampon Phosphate (1,35 M)

Chacune des solutions a été conservée à 4°C, à l’exception du tampon phosphate (1,35 M), conservé

à température ambiante.



116

Composition du tampon Phosphate: KH2PO4 0,37 M

Na2HPO4,2H2O 0,98 M

Le tampon est ajusté à pH 7,2 par addition d’une solution de soude 0,1 M.

III.1.1.1.2 Milieu riche complexe LB

Le milieu LB est constitué de :

Extrait de levure 5g

Tryptone 10g

NaCl 10g

L’ensemble est additionné à 1 L d’eau déminéralisée, agité puis autoclavé à 120°C pendant 20

minutes, puis conservé à température ambiante.

III.1.1.1.3 Extrait aqueux d’écorce de pin

L’extrait aqueux d’écorce de pin a été utilisé dans l’idée de nous fournir des informations sur la

capacité de Pseudomonas sp. ADP à croître et à dégrader l’atrazine dans un milieu contenant les

composés organiques solubles de l’écorce de pin. L’utilisation de ce milieu a permis d’une part de

tester la toxicité éventuelle de ces composés sur Pseudomonas sp. ADP et d’autre part de

déterminer si ces composés pouvaient ou non constituer une source de nutriments pour les micro-

organismes.

L’utilisation de l’extrait d’écorce de pin a ainsi permis de s’affranchir des phénomènes d’adsorption

de l’atrazine à la surface des particules d’écorce qui aurait modifié sa biodisponibilité si les essais

avaient été réalisés en présence d’écorce solide.

La préparation de l’extrait aqueux d’écorce de pin est décrite au paragraphe I.6. Cet extrait

constitue un milieu complexe pauvre car les teneurs en carbone et en azote notamment sont

faibles.

Le Tableau ci-dessous présente la composition des extraits réalisés à partir des deux écorces de

pin utilisées au cours de cette étude.



117

Tableau 9 : Teneurs en COT et azote total des extraits aqueux d’écorce de pin utilisés pour différentes expériences

Ecorce 1 Ecorce 2

Carbone Organique Total 100 ± 10 mg.L-1 580 ± 10 mg.L-1

Azote Total (Kejdhal) 4 ± 0,2 mg.L-1 4 ± 0,2 mg.L-1

Les deux écorces ont été utilisées l’une après l’autre. Toutes les deux provenaient d’une scierie

du nord du Portugal utilisant Pinus pinaster comme matière première.

Lors de son utilisation en culture pure, l’extrait a été stérilisé par filtration sur une membrane de

nitrate de cellulose à 0,2 µm.

III.1.1.2 Les milieux solides

Le milieu solide riche complexe PCA (Plate Count Agar, Merck réf. 1.05463) a été utilisé pour la

croissance des micro-organismes, aussi bien Pseudomonas ADP sp. que pour les micro-

organismes indigènes de l’écorce de pin.

Les étalements sur boite de Pétri contenant un milieu riche ont également permis de vérifier la

contamination ou non de certaines cultures réalisées lors des nombreuses expériences de

croissance bactérienne et de dégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.

Préparation du milieu solide PCA : A 1 L d’eau déminéralisée sont additionnés,

PCA en poudre 22,5 g

Après dissolution, le milieu est autoclavé à 120°C pendant 20 minutes.

Les boites sont coulées à 80°C en conditions stériles, solidifiées puis séchées pendant 2h à 60°C. Les

boites sont ensuite conservées à 4°C.

III.1.2 Préparation et utilisation des cellules congelées

III.1.2.1 Préparation de cellules congelées

La souche Pseudomonas sp. ADP connue pour ces capacités à minéraliser l’atrazine et décrite dans

la littérature pour la première fois par Mandelbaum et al. (1995) (voir Etude Bibliographique § III), est

commercialisée par l’entreprise allemande DSMZ sous le numéro de référence 11735.

Des cultures de Pseudomonas ADP sp. ont été dans un premier temps réalisées par étalement sur

boite de Pétri PCA incubées à 30°C pendant 48h. Les colonies ont ensuite été transférées en milieu



118

liquide MM contenant 20 mg.L-1 d’atrazine, comme seule source d’azote et 1 g.L-1 de glucose comme

source de carbone. Les cultures ont été incubées à 30°C sous agitation orbitale à 150 rpm pendant

20 h.

Les cultures ont ensuite été centrifugées à 7000 rpm pendant 20 minutes à 8°C et le culot de cellules

resuspendu dans un tampon phosphate (54 mM, pH 7,2) ; cette opération a été répétée afin

d’effectuer un deuxième lavage. Le culot obtenu après deux lavages a été resuspendu dans un

volume (V/V) de quelques mL d’un mélange de glycérol (40%) et de milieu LB (2 x concentré).

La solution concentrée en cellules a été aliquotée (500 µl) dans des tubes cryogéniques et congelée à

–20°C.

Les stocks de cellules directement utilisés pour les expériences (inoculation à partir de cellules

congelées) ont été préparés de la même manière mais les cellules ont été ressuspendues dans un

milieu constitué de 50% de milieu minéral (MM) et 50% de glycérol (40%).

Avant chaque utilisation d’un stock de cellules congelées, un comptage est réalisé juste après

décongélation pour quantifier le nombre d’unités cellulaires présentes dans un stock. Ces comptages

sont réalisés par dilution du stock de 10-4 à 10-9 et étalement sur boite de gélose PCA.

Ainsi, la concentration en cellules étant connue dans les stocks congelés, l’inoculation de

Pseudomonas sp. ADP dans les essais a pu être relativement maîtrisée (nombre de CFU/mL connu)

et contrôlée par mesure de densité optique des cultures liquides autour d’une valeur initiale d’environ

0,05.

III.1.2.2 Utilisation de stocks congelés ou de précultures

• Essais menés à partir de précultures

Les essais en cultures pures ont été, en général, réalisés à partir de précultures cellulaires, elles-

même obtenues à partir des stocks de cellules congelées.

Les précultures de Pseudomonas sp. ADP ont été réalisées par inoculation d’environ 108 CFU/mL

(provenant d’un stock congelé) dans un milieu MM contenant une source de carbone (glucose, 1 g.L-1

et une source d’azote (atrazine 20 mg.L-1, ou sulfate d’ammonium, 1 g.L-1)). Les stocks de cellules

congelées contenaient dans des proportions 50/50, un mélange de milieu MM (milieu minéral) et du

glycérol (40%). Du glycérol résiduel est donc présent dans les culture (environ à 8%). Cependant,

cette source de carbone est mal utilisée par Pseudomonas ADP sp. comme le montre la Figure 23 ci-

dessous, réalisée par mesure de l’activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. Le glucose est quant

à lui facilement biodégradé par Pseudomonas ADP sp.



119

Figure 23 : Utilisation du glycérol ou du glucose comme source de carbone par Pseudomonas ADP sp. Suivi de la respiration de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) en présence d’atrazine (30 mg.L-

1) comme source d’azote et 1g.L-1 de glucose ou glycérol comme source de carbone ; 30°C ; agiation 150 rpm

Les cultures de 50 mL ont été agitées (150 rpm) en Erlenmeyers de 250 mL dans une chambre

thermostatée à 30°C pendant 20h. Les essais ont été inoculés à partir de ces précultures lorsque les

micro-organismes étaient en phase exponentielle de croissance (environ 20 h pour Pseudomonas

ADP sp. en milieu MM-Glucose). La DO initiale dans chaque essai était d’environ 0,05.

• Essais menés directement à partir de cellules congelées La densité de cellules dans les précultures réalisées en présence d’atrazine (20 mg.L-1) étant très

limitée (DO en fin de croissance aux alentours de 0,18 dans les conditions optimales de croissance),

l’inoculation des essais impliquait l’introduction d’importants volumes de préculture (environ 10% du

volume initial), introduisant par là même une quantité de nutriments (notamment azotés) non

négligeable et non souhaités dans beaucoup d’essais. Une autre solution envisagée était de

centrifuger les précultures, puis d’effectuer un lavage des cellules au tampon phosphate pour les

débarrasser de leurs nutriments avant de les inoculer dans chaque essai, ce qui nécessitait la

préparation d’importants volumes de préculture à centrifuger avec parfois des moyens non adaptés à

ces quantités (volume maximum des tubes à centrifugation disponibles : 30mL).

Le choix d’utiliser directement les stocks de cellules congelées pour inoculer les essais, bien que non

« conventionnel », a permis dans tous les cas de réaliser des études comparatives. L’utilisation de

cellules congelées nous permettait ainsi de connaître parfaitement le nombre de cellules inoculées

tout en nous affranchissant des problèmes posés par la présence non souhaitée de traces d’atrazine

ou autre source de nutriments dans le cas de l’utilisation de préculture.

L’incertitude liée à l’effet de la congélation et de la conservation des cellules congelées sur leur survie

et leur physiologie demeure en l’absence de précultures permettant de contrôler la revitalisation des

cellules. Cependant, la comparaison d’essais de minéralisation de l’atrazine effectués à partir de

0

200400600800

1000

12001400

1600

0 10 20 30 40 50

Temps (h)

DB

O (m

g.L-1

)

Glucose (1g/L)

Glycérol (1g/L)



120

précultures ou de stocks de cellules congelées a montré que cet effet pouvait être négligé (Figure 24).

Une phase de latence d’une dizaine d’heures environ par rapport à l’utilisation de précultures est

observée, correspondant à la phase de revitalisation des cellules congelées.

Figure 24 : Comparaison de la minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. inoculé à environ 106 cfu/mL à partir d’une préculture ou de cellules congelées, en milieu minéral MM (glucose 1g.L-1 ; 14C-

atrazine 20 mg.L-1), 20°C.

III.1.3 Suivi de la croissance des micro-organismes et de l’activité respiratoire

III.1.3.1 Suivi de la croissance cellulaire

Selon les expérimentations menées, la croissance cellulaire à été suivie soit :

- par lecture de la densité optique à 600 nm.

- par comptage sur boite de Pétri

- par dosage des protéines

III.1.3.1.1 Mesure de turbidité

La croissance cellulaire a été suivie dans certains essais par mesure de la turbidité des cultures à

600 nm sur un spectrophotomètre UV-Visible Milton Roy Spectronic 401 multi-cuvettes.

Des aliquotes de 1 mL de culture ont été utilisés.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Temps (h)

% A

traz

ine

min

éral

isée

Préculture

Cellules congelées



121

III.1.3.1.2 Dénombrement sur boite de Pétri

Le suivi de croissance bactérienne pour les essais contenant de l’écorce de pin en poudre a été

réalisé par étalement sur boite de Pétri PCA (Cf. III.1.1.2) des suspensions décantées (non

centrifugées) et diluées entre 10-4 et 10-9. Les boites ont été incubées à 30°C pendant plusieurs jours.

Le dénombrement est effectué par comptage à l’œil nu des colonies formées.

III.1.3.1.3 Dosage des protéines par la méthode de Folin- Lowry :

La culture à doser (1 mL contenant 0 à 100 µg de protéines) est chauffée à 90°C en présence d’une

solution de NaOH (0,2 N) pendant 2 h. La solution traitée est centrifugée à 10000 rpm pendant

15 minutes afin d’éliminer les fractions cellulaires non hydrolysées.

La réaction colorimétrique se fait par mélange de :

- 1 mL de réactif cuprique (EDTA cuivré 0,25 g.L-1, NaCO3 20 g.L-1, NaOH 0,1 N)

- 0,1 mL de réactif de Folin

- 0,2 mL de surnageant

Le réactif de Folin (solution phénolique contenant des composés de tungstène et de molybdène) est

réduit, passant de la couleur du jaune au bleu, par les ions Cu+ (réactif cuprique).

La coloration se développe pendant 30 minutes à l’obscurité à température ambiante.

L’absorbance est mesurée à 660 nm contre un blanc sans protéine réalisé de la même manière que

l’échantillon à doser.

Une courbe de calibration est effectuée à partir de l’albumine sérique de bœuf entre 0 et 100 µg.

III.1.3.1.4 Dosage des protéines par la méthode Bradford :

L’échantillon à doser (100 µl) contenant 0 à 20 µg de protéines est mélangé à 2 mL de réactif de

Bradford. La coloration se développe en 2 minutes. L’absorbance à 595 nm est lue contre un blanc

sans protéines. La teneur en protéines de l’échantillon est déterminée grâce à une courbe

d’étalonnage réalisée avec de l’albumine sérique de bœuf.

Le réactif de Bradford est composé de :

- Bleu de Coomassie 100 mg

- Ethanol 95% 50 mL

- Acide O-phosphorique 100 mL

- Eau distillée q.s.p. 1000mL

Le réactif est stable pendant 15 jours à température ambiante.



122

III.1.3.2 Suivi de l’activité respiratoire (ou Demande Biochimique en Oxygène DBO)

La respiration des micro-organismes, témoignant d’une activité biologique aérobie, a été mesurée

dans des flacons de 500 mL équipés de têtes Oxitop® (commercialisés par WTW) permettant la

mesure directe de la pression à l’intérieur des flacons.

III.1.3.2.1 Principe de la mesure

Dans des flacons hermétiques (Figure 25), le CO2 expiré par les micro-organismes résultant de la

consommation d’oxygène pour l’oxydation de la matière organique du milieu est dissous dans la

soude, placée sous forme de pastilles solides dans un piège en caoutchouc au-dessus de la solution.

La quantité de soude placée dans la trappe doit être suffisante par rapport à la quantité de matière

organique présente dans les flacons et potentiellement biodégradable.

Dans ces conditions, la consommation d’oxygène et la dissolution du CO2 expiré crée une dépression

dans le flacon mesuré par des détecteurs de pression présents dans les têtes Oxitop® ; cette

dépression est ensuite exprimée en consommation de O2 en mg.L-1 ou mg.g-1 de carbone organique.

La réaction de dissolution du CO2 dans la soude (NaOH) est la suivante :

OHCONaNaOHCO 2322 2 +→+

La mesure de variation de pression et la consommation d’oxygène sont reliées par la loi des gaz

parfaits.

Ce système nécessite une approximation préalable de la DBO, calculée à partir de la DBO théorique

dite DthO normalisée (OCDE-301-AnnexeIV) dont la formule suit :

[ ]Mr

ONaPSNClHCDthO −+++−−+=

)2/1()2/5(3)3(5,0216

Pour une molécule considérée, chaque lettre représente le nombre d’atomes (correspondant au

symbole chimique) contenu dans celle-ci, et Mr son poids moléculaire.

Pour le glucose (C6H12O6), on trouve par exemple une DthO de 1,07 g de O2.g -1 de glucose.

La connaissance de la DthO, de la température d’incubation et de la pression atmosphérique permet

d’évaluer le volume d’échantillon à introduire dans les flacons pour avoir un volume d’air suffisant à la

respiration des micro-organismes pour un intervalle de temps déterminé.



123

III.1.3.2.2 Protocole expérimental

Les essais de respirométrie ont été réalisés dans des flacons stériles de 500 mL contenant 20 ou

50 mL de milieu de culture selon les cas. Les flacons ont été agités à 150 rpm sur une table orbitale

placée à 30 °C à l’obscurité pendant toute la durée de l’incubation. Les essais ont été inoculés à partir

de stock de cellules congelées (environ 106 cfu.mL-1).

Les essais ont été réalisés en triplicats. Des témoins abiotiques ont été traités de la même manière

mais sans inoculation. Des témoins « vides » (flacons vides) ont permis d’enregistrer les variations

éventuelles de pression ou de température au cours du temps.

Grâce au boîtier Oxitop®, les données ont été récupérées soit à la fin des essais soit au fur et à

mesure de la mesure grâce au logiciel OC Achat (commercialisé avec le matériel Oxitop par WTW).

Les données ont ensuite été traitées sur Excel. La Figure 25 représente le matériel Oxitop® utilisé lors

de ces essais de respirométrie.

Figure 25 : Flacon de DBO équipé de tête Oxitop® utilisé lors des études de respirométrie

III.1.3.3 Détermination du taux de croissance maximal

Le taux de croissance des bactéries µmax est calculé dans la phase exponentielle de croissance.

Ainsi, µmax est exprimé selon la relation suivante, lorsque S supporte la croissance (source de

carbone) :

tµeXX .max.0=

linéarisé en tµXX .lnln max0 +=

avec X, la concentration cellulaire au temps t et X0 la concentration cellulaire au temps t=0.

La vitesse de consommation du substrat S est exprimée selon l’équation :



124

dtdX

YdtdS

⋅=−1

où : S : Concentration en substrat (atrazine) au temps t (nS.V-1)

µm : Taux de croissance maximale (T-1)

Y : Taux de conversion biomasse/substrat (Nbre Cell. M-1)

X0: Concentration cellulaire à t=0 (nCell.V-1)

L’intégration de cette équation entre t0 et t donne :

)(100 XX

YSS −=−

soit

)1(00 −−= tµme

YX

SS

avec tµeXX .max.0=

Ainsi, seulement si l’atrazine est support de croissance de Pseudomonas ADP sp. nous pourrons

déterminer des vitesses de croissance en fonction du taux de conversion Y.

III.1.4 Suivi de la biodégradation de l’atrazine

III.1.4.1 Biodégradation primaire de l’atrazine

La biodégradation primaire de l’atrazine a été suivie par analyse HPLC des échantillons liquides,

après filtration à 0,45 µm sur membranes de nitrate de cellulose.

Le protocole pour l’analyse HPLC de l’atrazine est décrit au § (a). Les analyses HPLC en détection

UV nous ont permis de quantifier l’atrazine à des concentrations supérieures à 0,03 mg.L-1.

Au-dessous de cette concentration, l’utilisation d’atrazine uniformément marquée [U-ring-14C]-atrazine

a été requise.

Les composés intermédiaires de dégradation de l’atrazine n’ayant pas été pas détectés grâce à cette

méthode, l’analyse HPLC (dans le cas de l’utilisation d’atrazine froide) a simplement permis d’étudier

la disparition de l’atrazine du milieu ; ainsi, l’information donnée par ces analyses ne renseigne pas

sur la minéralisation mais seulement sur la dégradation primaire de l’atrazine.



125

L’atrazine a été ajoutée au milieu de culture à partir d’une solution mère concentrée (2000 mg.L-1)

préparée dans le méthanol, en suivant une procédure inspirée des protocoles utilisés par

Mandelbaum et al. (1993, 1995). Dans les essais, le méthanol est ainsi présent entre 1 et 2,5 % dans

le milieu de culture.

La Figure 26 montre que dans ces conditions (semblables à celles des futurs essais en milieu minéral,

glucose 1g.L-1 et atrazine quelques dizaines de mg.L-1), l’addition d’atrazine à partir d’une solution

mère concentrée préparée dans le méthanol n’a pas d’effet sur la croissance de Pseudomonas ADP

sp.

Figure 26 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM-glucosé à 1 g.L-1) avec atrazine (30 mg.L-1) additionnée au milieu à partir d’une solution mère concentrée dans le méthanol ou dissoute

directement en poudre dans le milieu MM ; 30°C ; agitation 150 rpm

En revanche, nous n’avons pas identifié si le méthanol était utilisé par Pseudomonas ADP sp. en tant

que source de carbone (aucune référence trouvée dans la littérature).

D’autre part, les résultats présentés au § III.1.2.2 montrent que le glycérol est très mal assimilé par

Pseudomonas ADP sp. et que par conséquent l’utilisation de cellules congelées contenant 20% de

glycérol ne contribue pas à alimenter les cultures en source de carbone utilisable par Pseudomonas

ADP sp.

III.1.4.2 Minéralisation de l’atrazine

L’étude de la minéralisation de l’atrazine a été réalisée grâce à l’utilisation d’atrazine radioactive par

suivi du 14CO2 formé.

La [U-ring-14C]-atrazine commercialisée par Sigma, d’activité spécifique de 24,6 mCi.mmol- 1 a été

utilisée pour réaliser plusieurs séries d’expériences à des concentrations initiales de 20 mg.L-1 et

44,2 µg.L-1.

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0 10 20 30 40 50 60

Temps (h)

DO 60

0nm

Atrazine sans MeOH

Atrazine dans MeOH



126

III.1.4.2.1 Préparation des solutions mères d’atrazine marquée

Pour les séries à 20 mg.L-1, une solution mère à 2 g.L-1 a été préparée dans le méthanol à partir d’un

mélange d’atrazine froide et d’atrazine radioactive. L’activité spécifique de la solution mère était de

2 µCi.mL-1. L’activité initiale dans chaque essai à 20 mg.L-1 était de 1 µCi par fiole (biomètre).

Pour les séries à 44,2 µg.L-1, une solution mère à 4,4 mg.L-1 a été préparée dans le méthanol à partir

d’atrazine radioactive uniquement. L’activité spécifique de la solution mère était de 0,5 µCi.mL-1.

L’activité initiale dans chaque essai à 44,2 µg.L-1 était de 0,25 µCi par fiole (biomètre).

III.1.4.2.2 Principe des essais de minéralisation

Le dispositif expérimental des essais de minéralisation en biomètres est présenté sur la photo ci-

dessous (Figure 27).

Figure 27 : Photo d’un biomètre pour l’étude de la minéralisation de l’atrazine

Le CO2 résultant de la respiration des micro-organismes est dissous dans la soude (1M) présente

dans un piège placée au-dessous des bouchons de chaque biomètre.

Suivi de la minéralisation. Quantification du 14CO2

La minéralisation de l’atrazine a été suivie par quantification du 14CO2 dissous dans la soude placée

dans les biomètres utilisés pour les expériences de minéralisation en milieu dispersé aussi appelé

« Essai en Batch » (Figure 28).



127

Figure 28 : Représentation schématique d’un biomètre utilisé dans les essais de minéralisation en « Batch »

La soude (1 M) contenue dans les pièges à CO2 (0,5 mL) a été prélevée régulièrement au cours du

temps et remplacée par de la soude fraîche (deux fois par jour en début d’expériences puis tous les 2

ou 3 jours ensuite). Les 0,5 mL de soude sont placés dans une fiole à scintillation dans laquelle 7 mL

de liquide scintillant sont ensuite ajoutés ; après une heure, le mélange est analysé au compteur à

scintillation TRI-CARB 2100TR Packard Liquid Scintillation Analyser (le délai de 1 heure permet

d’éviter la scintillation de la soude (environ 120 dpm)).

Les résultats donnés en dpm (désintégration par minute) sont finalement traduits en % de

minéralisation par rapport à la radioactivité initialement présente dans les biomètres.

Suivie de la radioactivité en solution Le suivi de la radioactivité dans la phase liquide des essais de minéralisation a été réalisé par

prélèvement de 1 mL de solution contenant initialement une quantité connue de [U-ring-14C]-atrazine.

7 mL de liquide à scintillation sont additionnés au prélèvement puis le mélange est analysé au

compteur de la même façon que précédemment.

III.1.4.2.3 Protocole expérimental

Les essais ont été réalisés en biomètre en milieu minéral stérile MM (50 mL/biomètre). Pseudomonas

ADP sp. a été inoculé au milieu à partir de précultures réalisées comme expliqué au chapitre III.1.2.2

pour obtenir une DO initiale d’environ 0,05. Les biomètres ont été incubés à 20 ± 2 °C sous une

agitation douce (barreau magnétique). Deux concentrations initiales en atrazine ont été testées

(20 mg.L-1 et 44,2 µg.L-1). L’atrazine était la seule source d’azote. Le glucose additionné au milieu à

une concentration de 1 g.L-1 était la source de carbone.

La minéralisation de l’atrazine a été suivie pendant environ 300 heures (avec renouvellement de l’air à

chaque prélèvement des pièges à soude, soit tous les 2-3 jours au maximum).

Des témoins abiotiques non inoculés avec Pseudomonas ADP sp. ont permis de suivre la

minéralisation de l’atrazine en milieu abiotique et de vérifier la non contamination des milieux utilisés.

Barreau aimenté

Trappe NaOH (1 M) 0,5 ml Piège à C02 – NaOH (1 M) 0,5 mL

Milieu liquide



128

Les essais et les blancs ont été réalisés en triplicats.

III.1.5 Influence de paramètres physico-chimiques

L’étude de l’influence de certains paramètres sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. et sur sa

capacité à dégrader l’atrazine a permis de fixer certaines limites expérimentales. Les paramètres

comme la température, le pH ainsi que l’apport de nutriments ont été testés en culture pure de

Pseudomonas ADP sp.

III.1.5.1 Influence des sources de carbone

Pseudomonas ADP sp. est décrite dans la littérature comme une souche capable de minéraliser

l’atrazine en tant que source d’azote (Mandelbaum et al., 1995) ; l’atrazine n’est donc pas utilisée

comme source de carbone. L’addition d’une source de carbone a donc été requise dans les différents

essais afin de subvenir au besoin des bactéries. Le glucose a été choisi comme source de carbone

facilement biodégradable. Mandelbaum et al. (1995) montre que le citrate constitue également une

source facilement assimilée par Pseudomonas ADP sp.

III.1.5.2 Influence de la température et du pH

Des essais de croissance bactérienne et de dégradation de l’atrazine ont été menés à des

températures allant de 12°C, qui pourrait correspondre à la température d’une eau naturelle à traiter, à

30°C correspondant à la température optimale de croissance des bactéries mésophiles.

L’influence du pH sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. et sa capacité à dégrader l’atrazine a

été étudié en parallèle.

Protocole expérimental pour les essais à différentes températures La croissance de Pseudomonas ADP sp. a été suivie en milieu minéral MM (§ III.1.1.1.1) en présence

de 50 mg.L-1 d’atrazine (addition d’atrazine dans le milieu à partir d’une solution mère d’atrazine à

2000 mg.L-1) en tant que seule source d’azote. La source de carbone était le glucose à 1 g.L-1.

Les essais de 50 mL ont été inoculés à une DO600 de 0,05 à partir d’une préculture réalisée à 30°C en

milieu MM pendant 20 h (III.1.2.2) et incubés à 30°C, 20°C ou 12°C, sous une agitation de 150 rpm.

La croissance a été évaluée par lecture de DO600 et les protéines du milieu ont été quantifiées par la

méthode de Bradford (III.1.3.1).

Les essais ont été réalisés en triplicats.



129

Protocole expérimental pour les essais à différents pH De la même manière que les essais précédents, des essais à différents pH ont été réalisés dans un

milieu MM (50 mL) contenant 20 mg.L-1 d’atrazine comme seule source d’azote et 1 g.L-1 de glucose

comme seule source de carbone. Ces essais ont été inoculés à partir de cellules congelées de

Pseudomonas ADP sp. (environ 106 cfu.mL-1, DO initiale environ 0,05) et incubés à 30°C sous

agitation orbitale (150 rpm).

Les 4 pH suivants ont été testés : 3,5 ; 4,4 ; 5,2 ; 7,0.


Le milieu MM non tamponéa été ajusté au pH désiré à l’aide d’une solution de KH2PO4 (50 g.L-1).

Après stérilisation du milieu MM par autoclavage, le pH a été vérifié avant d’utiliser le milieu dans les

essais. Le pH a également été contrôlé en fin d’expérience.

La dégradation primaire de l’atrazine a été suivie par prélèvements entre le temps 0 et 60 heures et

analyse des échantillons par HPLC (§ II.1.1.1.2(a)).

III.1.5.3 Influence d’une source additionnelle d’azote

III.1.5.3.1 Croissance bactérienne et dégradation primaire de l’atrazine

La croissance de Pseudomonas ADP sp. a été suivie en milieu minéral MM (§ III.1.1.1.1) contenant

environ 50 mg.L-1 d’atrazine en présence ou non d’une source additionnelle d’azote ((NH4)2SO4,

1 g.L -1). La source de carbone était le glucose à 1g.L-1.

Les essais de 20 mL ont été inoculés à une DO600 de 0,05 à partir de cellules congelées de

Pseudomonas ADP sp. (environ 106 cfu.mL-1).

Les essais ont été réalisés en triplicats, incubés à 30°C sous agitation (150 rpm).

La coissance a été suivie par mesure de densité optique à 600 nm, pendant 60 heures.

La biodégradation primaire de l’atrazine a été quantifiée par analyse HPLC des échantillons prélevés

entre t0 et 60 heures.

III.1.5.3.2 Minéralisation de l’atrazine

Ces expériences à l’atrazine marquée ont été réalisées au CEA (Commissariat à l’Energie Atomique)

de Grenoble, au laboratoire DBMS/BBSI.

Le suivi de la production du 14CO2 a permis de quantifier la minéralisation de l’atrazine selon le

protocole décrit en III.1.4.2.2



130

La minéralisation de l’atrazine a été suivie en MM (Glucose 1 g.L-1 comme source de carbone) en

présence ou non d’une source additionnelle d’azote (Sulfate d’ammonium, 1 g.L-1).

Les essais de 50 mL ont été inoculés à une DO600 de 0,05 correspondant environ à 106 cfu/mL.

III.1.5.4 Influence des composés solubles de l’écorce de pin

Le traitement combiné envisagé est principalement dépendant de la capacité de Pseudomonas ADP

sp. à survivre et à se développer en présence de l’écorce de pin choisie comme support de biofiltre.

L’écorce de pin contenant une grande variété de composés organiques, la toxicité de ces derniers vis

à vis de la souche bactérienne choisie pour ce traitement a dû être testée. Ainsi, l’activité respiratoire

de Pseudomonas ADP sp., sa capacité à croître et à dégrader l’atrazine en présence des composés

solubles de l’écorce de pin ont été étudiées dans les essais décrits ci-dessous.

Ces essais ont été réalisés en extrait aqueux d’écorce de pin, préparé comme décrit au § I.6 et

stérilisé selon le protocole présenté au § I.7.

Tous les essais réalisés en triplicats, ont été inoculés à partir de cellules congelées de Pseudomonas

ADP sp.

III.1.5.4.1 Influence sur l’Activité Respiratoire de Pseudomonas ADP sp.

Dans une première série d’essais, la respiration de Pseudomonas ADP sp. a été suivie en extrait

aqueux d’écorce de pin (20 mL) en présence ou non de sels minéraux additionnels contenus dans le

milieu MM utilisé dans les essais précédents. Aucune source de carbone additionnelle n’a été ajouté à

l’extrait d’écorce, les composés organiques solubles de l’écorce de pin représentant la seule source

de carbone pour Pseudomonas ADP sp. (COTextrait = 100 mg.L-1).

En parallèle à ces essais, des témoins réalisés en MM, ont servi de référence. Dans les témoins en

MM, le glucose a été additionné à 0,25 ou 1 g.L-1 comme seule source de carbone, correspondant

respectivement à 100 mg.L-1et 400 mg.L-1de carbone.

Dans tous les essais (MM et extrait), (NH4)2SO4 1 g.L-1 est ajouté comme source d’azote.

Le protocole opératoire pour ces essais de respirométrie est décrit au § III.1.3.2.2.

Dans une seconde série d’essais, l’influence de l’addition d’une source de carbone à l’extrait aqueux

d’écorce de pin a été testée selon le même protocole (§ III.1.3.2.2). Les flacons DBO ont été préparés

avec 50 mL de milieu. La source d’azote était l’atrazine (30 mg.L-1). Le glucose a été apporté à l’extrait

comme source additionnelle de carbone à différentes concentrations : 0 mg.L-1 ; 0,25 mg.L-1 ;

0,5 mg.L-1 et 1 mg.L-1.

Des blancs non inoculés ont également été suivis. Tous les essais ont été incubés en chambre

thermostatée à 30°C.



131

III.1.5.4.2 Influence sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. et la biodégradation de l’atrazine

La croissance de Pseudomonas ADP sp. a été suivie à 30°C (agitation 150 rpm) dans des

Erlenmeyers de 100 mL, dans les milieux suivants (20 mL de milieu):

- Extrait d’écorce de pin seul

- Extrait d’écorce de pin ± une source additionnelle d’azote ((NH4)2SO4 1 g.L-1 ± glucose

(1 g.L-1) ± atrazine (50 mg.L-1).

Des témoins ont été menés en parallèle en milieu minéral (MM). Des blancs non inoculés ont

également été suivis. La croissance a été suivie par mesure de la DO à 600 nm selon le protocole

décrit au § III.1.3.1.1.

La biodégradation primaire de l’atrazine a été suivie par HPLC selon le protocole décrit au § III.1.4.1.

RESULTATS ET DISCUSSION Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.


132

III.2 Résultats et dissussion

III.2.1 Introduction

Pseudomonas ADP sp. a été retenue pour ses capacités à minéraliser l’atrazine grâce à la présence

de gènes localisés sur le plasmide pADP-1 (Martinez et al., 2001) et choisie pour participer à

l’élimination de ce polluant dans le cadre de notre procédé de traitement combiné.

Dans un premier temps, quelques paramètres physico-chimiques ont été testés sur cette souche afin

de mieux connaître son comportement dans différents environnements et notamment de répondre aux

questions suivantes : Jusqu’à quelle température peut-on observer la croissance de cette bactérie et

l’activité de minéralisation de l’atrazine ? Pseudomonas ADP sp. est-elle capable de survivre dans un

milieu acide (pH 4-5) imposé par la présence d’écorce de pin en poudre en solution ? Quelle est

l’influence de la présence d’une source d’azote dans le milieu, autre que celle de l’atrazine ?

D’autre part, une partie de ce chapitre a été consacrée à l’étude de l’influence des composés

organiques solubles de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp. La toxicité de ces composés ainsi

que la capacité de Pseudomonas ADP sp. à les consommer en tant que source nutritive d’azote ou de

carbone ont été étudiées.

III.2.2 Influence de paramètres physico-chimiques

III.2.2.1 Croissance et biodégradation de l’atrazine à différentes températures

Dans un souci de réduction des coûts de traitement, l’utilisation de l’eau à décontaminer à

température ambiante présenterait un avantage certain. Les micro-organismes étant sensibles à la

température et leur genre Pseudomonas étant, dans leur grande majorité, connu pour posséder une

activité optimale entre 20 et 42°C (bactéries mésophiles) (voir § III.1.5.2), l’étude qui suit a eu pour but

de répondre à la question suivante : A basses températures (10°-15°C), pouvant correspondre aux

températures de l’eau à traiter, Pseudomonas ADP sp. peut-elle croître et conserver sa capacité à

consommer l’atrazine ?

Trois températures ont été testées : 12°C, 20°C et 30°C. Le protocole de ces expériences a été décrit

au § III.1.5.2. La croissance et la biodégradation primaire de l’atrazine ont été suivies en milieu

minéral MM avec l’atrazine (environ 50 mg.L-1) comme seule source d’azote.

Figure 29 présente le suivi de la croissance bactérienne et la dégradation primaire de l’atrazine par

Pseudomonas ADP sp. aux trois températures étudiées.



133

Les résultats montrent que croissance et biodégradation évoluent en fonction de la température. On

note bien que l’activité de Pseudomonas ADP sp. est optimale à 30°C. A 20°C, la croissance est

légèrement ralentie et la biodégradation de l’atrazine est très légèrement affectée (Tableau 11).

A une température de 12°C Pseudomonas ADP sp. est capable de survivre, de croître et dégrader

l’atrazine, mais de manière plus lente qu’aux hautes températures.

L’expression des taux de croissance µm. (Cf. § III.1.3.3) en fonction de la température (Tableau 10)

traduit l’effet de la température sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. Entre 12 et 30°C, le taux

de croissance µm évolue linéairement avec la température selon l’équation suivante (µ est estimé sur

les 20 premières heures de croissance) :

µm = 0,0015 θ + 0,0302

où θ est la température en °C et µm le taux de croissance en h-1 (Tableau 10).

La vitesse de dégradation de l’atrazine, quant à elle, n’évolue pas linéairement avec la température et

donc pas non plus avec le taux de croissance de Pseudomonas ADP sp. : croissance et biodéradation

de l’atrazine en tant que source d’azote ne seraient pas corrélées chez Pseudomonas ADP sp.

On remarque ainsi (Tableau 11) que les quantités d’atrazine dégradées en fonction du temps sont

similaires à 20 ou à 30°C ; à t=12h, 91 à 98% de l’atrazine initialement présente dans le milieu ont été

dégradés contre 70% seulement à 12°C. L’activité de biodégradation de l’atrazine est clairement

ralentie à cette température.

Figure 29 : Influence de la température sur la croissance (A) de Pseudomonas ADP sp. et sa capacité à dégrader l’atrazine (B) en milieu minéral (MM), avec atrazine (environ 50 mg.L-1) comme seule source

d’azote et glucose (1 g.L-1) comme source de carbone ; agitation orbitale (150 rpm) ; pH 7

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0 20 40 60 80 100 120

Temps ( h)

12°C20°C30°C

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 100 120

T emp s ( h)

12°C20°C30°C

A B



134

Tableau 10 : Taux de croissance µm de Pseudomonas ADP sp. calculés sur les 20 premières heures en fonction de la température

T 12°C 20°C 30°C

µm (h-1) 0,0482 0,0602 0,0752

Tableau 11 : Pourcentage d’atrazine dégradée en 12 heures en fonction de la température

T 12°C 20°C 30°C

Atz dégradée

t=12h 70% 93% 98%

Ces résultats montrent que le procédé pourrait être appliqué sans réchauffement de l’eau à traiter.

Cependant, l’augmentation de la température accélérant le taux de biodégradation, une analyse du

rapport Energie/Efficacité/Coût serait nécessaire pour déterminer la température optimale pour ce

traitement.

III.2.2.2 Croissance et biodégradation de l’atrazine à différents pH

La croissance de Pseudomonas ADP sp. ainsi que sa capacité à dégrader l’atrazine ont été testées à

différents pH, en particulier dans la gamme de pH 4-5 correspondant aux pH imposés par l’écorce de

pin en poudre en suspension dans l’eau. La survie des bactéries dans ces conditions de pH est

essentielle dans le cadre du traitement combiné. En effet, de ces résultats dépendent la faisabilité du

procédé.

Le protocole expérimental est décrit au § III.1.5.2 et la Figure 30 présente les résultats obtenus pour

les 4 pH testés.

Figure 30 : Influence du pH sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. (A) et sa capacité à dégrader l’atrazine (B) en milie minéral (MM) ; atrazine comme seule source d’azote (environ 15 mg.L-1) ; glucose

(1g mg.L-1) ; 30°C ; agitation orbitale (150 rpm)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0 10 20 30 40 50 60

T emp s ( h)

pH 3,5pH 4,4pH 5,2pH 7

02468

101214161820

0 10 20 30 40 50 60

T emp s ( h)

pH 3,5pH 4,4pH 5,2pH 7



135

Le Tableau 12 présente les taux de croissance µm de Pseudomonas ADP sp aux différents pH

étudiés (calculé sur les 20 premières heures). Tandis que la meilleure croissance est logiquement

obtenue à pH 7, on observe une croissance intéressante entre pH 5,2 et 4,4 avec des taux de

croissance 0,0381 h-1 à ces deux pH. A pH 3,5 le taux de croissance est très faible ; Pseudomonas

ADP sp. semble ne pas survivre dans ces conditions et par conséquent aucune dégradation de

l’atrazine n’est observée. De plus, on remarque que µ n’est pas proportionnel au pH comme c’était le

cas pour les températures. Malheureusement, aucune valeurs de µ n’a pu être trouvée pour

Pseudomonas ADP sp. dans la littérature.

La biodégradation primaire de l’atrazine à lieu majoritairement au cours des dix premières heures

d’incubation. Si l’activité de consommation de l’atrazine est maximale à pH 7 et 5,2 (Tableau 13, 96 à

99 % d’atrazine initialement présente sont dégradés en 10 heures), elle est également observée, de

manière légèrement retardée à pH 4,4 (82% de l’atrazine initialement apportée est dégradée en 10h).

Tableau 12 : Taux de croissance de Pseudomonas ADP sp. calculés sur les 20 premières heures et vitesse de biodégradation de l’atrazine calculée s sur les 10 premières heures en fonction du pH

pH 3,5 pH 4,4 pH 5,2 pH 7

µ (h-1) 0,0199 0,0381 0,0381 0,0387

Tableau 13 : Pourcentage d’atrazine dégradée en 10h en fonction du pH

pH 3,5 pH 4,4 pH 5,2 pH 7

Atrazine dégradée

T=10h

1% 82% 99% 96%

Dans l’hypothèse où l’écorce ne serait pas toxique pour Pseudomonas ADP sp., ces résultats

indiquent que ces bactéries seraient en mesure de survivre dans les conditions de pH imposées par

l’écorce de pin et qu’un traitement visant à tamponner le milieu pourrait ainsi être évité.

III.2.2.3 Influence d’une source additionnelle d’azote

Lors d’une pollution d’eaux de surface ou d’eaux souterraines par l’atrazine, la concentration en

pesticide ne représentant souvent que quelques micro-grammes par litre, le problème se pose quant à

la survie de Pseudomonas ADP sp. lorsque l’atrazine est la seule source d’azote. L’activité

métabolique des bactéries étant essentiellement liée à leur croissance, des expériences ont été

menées afin de tester l’influence qu’aurait l’addition d’une source d’azote (en plus de l’atrazine) sur la



136

capacité de Pseudomonas ADP sp. à dégrader le pesticide. Ces expériences ont été réalisées à des

concentrations en atrazine d’environ 50 mg.L-1 (bien supérieures aux taux de pollution observés dans

la nature et obtenues avec du méthanol comme cosolvant) afin d’obtenir des taux significatifs de

croissance et de permettre le suivi de la concentration en atrazine par analyse HPLC.

III.2.2.3.1 Influence sur la dégradation primaire de l’atrazine

La dégradation primaire de l’atrazine a été suivie par analyse HPLC. Il s’agit en réalité du suivi de la

disparition de l’atrazine du milieu, les métabolites intermédiaires n’étant pas mis en évidence. La

croissance de Pseudomonas ADP sp. a également été suivie en parallèle à la biodégradation de

l’atrazine. Le protocole expérimental pour ces essais est présenté au § III.1.5.3.

La Figure 31 montre très clairement que l’apport d’une source supplémentaire d’azote (sulfate

d’ammonium 1 g.L-1) a un effet positif sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral.

Les taux de croissance estimés dans les différents milieux varient entre 0,0119 h-1 dans le milieu ne

contenant que l’atrazine comme source d’azote (50 mg.L-1 environ, équivalent à 16 mg.L-1 d’azote) et

0,0665 h-1 pour un milieu contenant ou non de l’atrazine dans lequel le sulfate d’ammonium est

apporté à 1g.L-1 (équivalent à 200 mg.L-1 d’azote).

Figure 31 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et dégradation primaire de l’atrazine présente ou non (50 mg.L-1) en milieu minéral (MM) en présence ou non d’une source additionelle d’azote (sulfate

d’ammonium 1 g.L-1) ; Glucose (1 g.L-1) ; 30°C ; agitation orbitale 150 rpm

La Figure 31 montre également que lorsque du sulfate d’ammonium est apporté (1g.L-1), la croissance

est identique en milieu minéral glucosé en présence ou non d’atrazine (µ=0,0665 h-1 et 0,0624 h-1

5

10

15

20

25

30

35

0 10 20 30 40 50 60Temps ( h)

mg

Prot

.L-1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Atr

azin

ez (m

g.L

-1)

MM + Sulf. Am.

MM + Atrazine + Sulf. Am.

MM + Atrazine



137

respectivement) traduisant la non toxicité de l’atrazine, à une concentration de 50 mg.L-1 environ, vis à

vis de Pseudomonas ADP sp.

La croissance est très réduite lorsque l’atrazine est la seule source d’azote présente dans le milieu ; la

vitesse de dégradation ne semble pas en être pour autant affectée ce qui voudrait dire que croissance

et dégradation du substrat atrazine ne seraient pas directement corrélés. C’est également ce

qu’observent Mandelbaum et al. (1995) (voir étude Bibliographique § III.4).

En effet, les vitesses de dégradation de l’atrazine sont tout à fait comparables que ce soit en présence

ou non d’une source additionnelle d’azote comme le sulfate d’ammonium (3,73 et 3,84 mg.h-1

respectivement). Au bout de 13 heures d’incubation, plus de 95% de l’atrazine présente initialement

dans le milieu sont dégradés dans les deux cas.

Ces résultats montrent que la dégradation primaire de l’atrazine n’est pas affectée par la présence

d’une source additionnelle d’azote dans le milieu mais ne permettent en aucun cas de conclure sur sa

minéralisation.

Pour cette raison, des études de minéralisation ont été menées avec de l’atrazine radioactive.

III.2.2.3.2 Influence sur la minéralisation de l’atrazine

Les expériences de minéralisation ont été conduites selon le protocole décrit au § III.1.5.3.2 en milieu

minéral (MM) enrichi au glucose ou en milieu complexe riche LB en présence d’atrazine marquée

(concentration initiale 20 mg.L-1) . La minéralisation a été suivie par mesure de la production de 14CO2

selon le protocole détaillé au § III.1.4.2.3.

Le sulfate d’ammonium (1g.L-1) a été utilisé comme source additionnelle d’azote dans le milieu MM.

Les résultats présentés à la Figure 32 montrent qu’aucune minéralisation de l’atrazine n’a lieu en

milieu riche (LB) ; le milieu LB contient une quantité importante de nutriments azotés et carbonés

facilement disponibles pour les bactéries ; l’atrazine est « laissée » de côté en faveur des autres

substrats du milieu nutritif.

80% de l’atrazine sont minéralisés en milieu minéral glucosé (MM-Glc), en l’espace de 25h, lorsque

aucune source d’azote est ajoutée au milieu, contre 20% seulement lorsque le sulfate d’ammonium

est présent dans le milieu à 1g L-1.



138

Figure 32 : Minéralisation de l’atrazine (concentration initiale environ 20 mg.L-1) par Pseudomonas ADP sp. en milieu riche (LB) ou en milieu minéral (MM ; glucose 1 g.L-1) contenant ou non une source

additionnelle d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L-1) ; 30°C ; Agitation 150 rpm ; 14C-atrazine à 1 µCi/fiole

Si la dégradation primaire de l’atrazine n’est pas affectée par la présence d’une source additionnelle

d’azote dans le milieu, la minéralisation est quant à elle largement réduite, laissant penser que des

métabolites intermédiaires doivent être accumulés. Ce résultat montre également que croissance et

minéralisation ne sont pas couplées puisque l’apport d’azote augmente la croissance mais diminue la

minéralisation. Ce résultat est en accord avec les observations faites par Mandelbaum et al. (1995) :

Biodégradation et croissance ne seraient pas directement corrélées, Pseudomonas ADP sp. étant

capable de minéraliser l’atrazine dans des conditions non favorables à sa croissance.

Ceci implique que le traitement devra se faire sans addition d’azote. Les expériences menées en

extrait aqueux d’écorce de pin décrites ci-après ont pour objectif d’évaluer l’influence des composés

azotés libérés par l’écorce de pin (environ 4 mg.L-1 pour un ratio L/S=20) sur la minéralisation de

l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.

III.2.3 Influence des composés solubles de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp.

Cette étude a permis de déterminer si les composés organiques solubles de l’écorce de pin,

solubilisés lorsque la poudre est en suspension dans l’eau, étaient ou non toxiques pour la souche

Pseudomonas ADP sp. choisie. De ce résultat dépendait la faisabilité du traitement ; c’est donc un

point essentiel de cette étude que nous abordons dans ce chapitre. Les essais concernant l’influence

des composés solubles de l’écorce sur Pseudomonas ADP sp. ont été réalisés en extrait aqueux

d’écorce de pin (Cf. §I.6), nous permettant ainsi de suivre des croissances bactérienne par densité

optique et de suivre la dégradation de l’atrazine, en s’affranchissant des phénomènes d’adsorption qui

seraient intervenus si nous avions utilisé un milieu contenant l’écorce elle-même.

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80Temps ( h)

% A

traz

ine

min

eral

isée

MM

MM + Sulf. Am.

LB



139

Différents tests ont été mis en oeuvre : des essais de respirométrie ont permis d’étudier dans un

premier temps la toxicité des composés de l’écorce vis à vis de Pseudomonas ADP sp.; d’autre part la

croissance (par mesure de DO) et la biodégradation de l’atrazine (analyse HPLC) ont été suivis en

extrait d’écorce de pin ; l’influence de l’addition d’une source supplémentaire de carbone à l’extrait

d’écorce de pin a également fait l’objet d’une étude particulière.

III.2.3.1 Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin

L’extrait aqueux d’écorce de pin utilisé dans ces essais contenait une quantité d’environ 100 mg.L-1 de

carbone organique dissous (COD) et environ 4 mg.L-1 d’azote, potentiellement utilisables pour les

bactéries (Cf. § Tableau 9, p.117).

Le suivi en parallèle de l’activité respiratoire en milieu minéral (MM-Glc) glucosé à 1 ou 0,25 g.L-1 et

sulfate d’ammonium 1 g.L-1 et en extrait d’écorce de pin, a permis d’étudier la toxicité des composés

de l’écorce vis à vis de Pseudomonas ADP sp. (Cf. protocole expérimental au § III.1.5.4.2). D’autre

part, aucune source de carbone n’ayant été ici additionnée à l’extrait d’écorce, ces essais ont permis

de tester la capacité de Pseudomonas ADP sp. à utiliser les composés organiques solubles de

l’écorce de pin comme source de carbone.

La Figure 33 montre que pour une même concentration initiale en carbone organique dissous dans

l’extrait et en milieu minéral (COD 100 mg.L-1 en MM-Glucosé à 0,25 g.L-1 ou en extrait) l’activité

respiratoire de Pseudomonas ADP sp. est relativement équivalente en milieu minéral (MM) et en

extrait aqueux d’écorce de pin ; on note cependant une croissance très légèrement meilleure en MM.

Cette différence peut être expliquée soit par une faible toxicité des composés solubles de l’écorce de

pin vis à vis de Pseudomonas ADP sp., soit plus probablement par une plus faible biodégradabilité de

ces composés.

Figure 33 : Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) en présence de 1 ou 0,25 g.L-1 de glucose comme source de carbone, 1 g.L-1 de sulfate d’ammonium ; en extrait aqueux

d’écorce de pin (sulfate d’ammonium 1 g.L-1 comme source d’azote) en présence ou non de sels minéraux ; 30°C ; agitation 150 rpm

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 10 20 30 40 50temps (h)

DB

O (m

g.L-

1)

MM + Glc (1 g/l) + N (1 g/l)

MM + Glc (0.25g/l) + N (1g/l)

Extrait + N (1g/l)

Extrait + N (1g/l) + sels



140

Lorsque le glucose est apporté à 1 g.L-1 (correspondant à une concentration en COD de 400 mg.L-1)

la respiration est logiquement supérieure à celle observée avec une concentration plus faible en

glucose. L’apport de nutriments minéraux à l’extrait n’améliore pas l’activité bactérienne par rapport à

l’extrait seul, ce qui permet de conclure que les nutriments minéraux essentiels doivent être présents

en quantité suffisante dans l’extrait pour les bactéries.

Ainsi, les composés solubles de l’écorce de pin ne semblent pas présenter de toxicité vis à vis de

Pseudomonas ADP sp. De plus, ces composés peuvent être utilisés par Pseudomonas ADP sp.

comme source de carbone, permettant ainsi d’éviter l’addition d’une source additionnelle de carbone

lors du traitement combiné.

Ces résultats encouragent ainsi l’idée de faisabilité du traitement combiné sur écorce de pin.

III.2.3.2 Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en extrait d’écocre de pin

La croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin a été suivie en présence

ou non de sources additionnelles de carbone (glucose 1 g.L-1) et/ou d’azote (sulfate d’ammonium

1 g.L-1) et comparée à la croissance en milieu minéral (MM) enrichi en glucose (1 g.L-1) et en sulfate

d’ammonium (1 g.L-1).

Le protocole de ces essais est détaillé au § III.1.5.4.2.

La Figure 34 montre tout d’abord que la croissance de Pseudomonas ADP sp. est faible

lorsqu’aucune source complémentaire de carbone ou d’azote n’est ajoutée à l’extrait aqueux d’écorce

de pin. La présence d’une source additionnelle d’azote stimule considérablement la croissance

indiquant d’une part que la quantité d’azote contenue dans l’extrait (environ 4mg.L-1, avec C/N = 50/1)

est insuffisante pour permettre un bon développement des bactéries, et confirmant d’autre part, que

Pseudomonas ADP sp. utilise les composés organiques solubles de l’écorce de pin comme source de

carbone.



141

Figure 34 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait stérile d’écorce de pin ou en milieu minéral (MM) contenant ou non une source additionnelle de carbone (glucose 1g.L-1 noté Glc) et/ou une source

d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L-1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm

L’addition de glucose (1 g.L-1) à l’extrait induit une inhibition de la croissance de Pseudomonas ADP

sp., en présence ou non d’une source complémentaire d’azote (respectivement C/N=100/200 avec

une source additionnelle d’azote et C/N=100/0,8 sans source additionnelle d’azote) Dans les essais

contenant du glucose, des agrégats sont formés laissant penser que les cellules se regroupent pour

constituer une forme défensive, ce qui pourrait indiquer que la présence de glucose additionnel n’est

pas favorable à leur croissance. Cette hypothèse est confirmée par les essais menés en extrait

aqueux d’écorce de pin contenant différentes concentration de glucose (Figure 35).

D’autre part, la Figure 34 montre également que la croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait

est retardée par rapport à la croissance observée en milieu minéral (MM glucosé et azoté)

correspondant à une phase d’adaptation des micro-organismes d’environ 40h au milieu contenant les

composés organiques solubles de l’écorce de pin.

L’activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. a été suivie pour des concentrations en glucose

comprises entre 0 et 1 g.L-1 (Figure 35).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 50 100 150 200

Temps (h)

DO

600

nm

MM + N + Glc

Extract + N

Extract

Extract + Glc + N

Extract + Glc



142

Figure 35 : Activité respiratoire (exprimée en mg de O2.L-1) de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin contenant (0,25 mg.L-1 ; 0,5 mg.L-1 ou 1 mg.L-1) ou non du glucose ; 30°C ; agitation 150

rpm.

La présence d’une source additionnelle de carbone (glucose) dans l’extrait d’écorce de pin a un effet

inhibiteur sur la respiration de Pseudomonas ADP sp. La Figure 35 montre que la respiration est

meilleure lorsque aucune source de carbone n’est ajoutée à l’extrait. Dans ces conditions, le rapport

C/N est de 100/4 et correspond aux exigences nutritives classiques pour les bactéries. Pour des

concentrations en glucose supérieures à 0,25 mg.L-1 (C/N>250/4), la formation d’agrégats bruns

(1 mm de diamètre environ) a été observée comme précédemment, laissant penser à une forme

défensive des cellules.

Des essais de croissance ont également été menés en présence d’atrazine (50 mg.L-1) en tant que

source d’azote. La Figure 36 présente les résultats de ces essais et montre à nouveau que la

croissance en extrait (comme en MM) est très limitée lorsque aucune source d’azote supplémentaire

n’est apportée au milieu. L’apport d’atrazine dans l’extrait (50 mg.L-1) comme seule source

additionnelle d’azote stimule légèrement la croissance de Pseudomonas ADP sp. par rapport aux

conditions en extrait seul. Lorsque du sulfate d’ammonium est additionné à l’extrait (1g.L-1), le

développement de Pseudomonas ADP sp. se trouve très nettement stimulé que ce soit en présence

d’atrazine ou non, indiquant que l’atrazine en extrait aqueux d’écorce de pin ne présente pas de

toxicité vis à vis de Pseudomonas ADP sp.

0

200

400

600

800

1000

1200

0 20 40 60 80 100 120 140

Temps (h)

DB

O (m

g.L-1

) Sans glucose

Glucose 0,25 g/l

Glucose 0,5 g/l

Glucose 1g/l

Blanc stérile



143

Figure 36 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en extrait aqueux d’écorce de pin stérile ou en milieu minéral MM (glucose 1 g.L-1) en présence d’atrazine (50 mg.L-1) avec

ou sans sulfate d’ammonium (1 g.L-1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm

La Figure 36 montre également que la dégradation primaire de l’atrazine en extrait seul et en extrait

contenant une source additionnelle d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L-1) est équivalente : environ

40 % de l’atrazine initialement apportée au milieu est dégradée en 12 heures) alors que la croissance

est meilleure lorsqu’une source d’azote est ajoutée à l’extrait (µmax=0,0547 h-1 en extrait azoté contre

0,0296 h-1 en extrait seul). Cette observation confirme à nouveau que croissance et activité de

biodégradation de l’atrazine ne seraient pas directement corrélées comme cela a déjà été discuté au

§ III.2.2.3.2 p.137. D’autres auteurs (Mandelbaum et al., 1995) ont également montré que

Pseudomonas ADP sp. est capable de minéraliser l’atrazine dans des conditions non favorables à sa

croissance. Pseudomonas ADP sp. continue de métaboliser l’atrazine au delà de ses besoins en

azote. Ceci serait lié au fait que les enzymes responsables du métabolisme de l’atrazine sont

présentes dans le cytoplasme ou le periplasme des cellules bactériennes.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 20 30 40 50 60

Temps (h)

DO

600n

m

Extrait + N

Extrait + Atrazine + N

Extrait + Atrazine

Extrait

MM-Glc + Atrazine

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60

Temps (h)

Atr

azin

e en

sol

utio

n (m

g.L-1

)

Extrait

Extract + N

Témoin Stérile Extrait

Biodégradation

Croissance



144

L’addition d’une source d’azote au milieu, bien que profitable à la croissance des bactéries, ne stimule

donc pas pour autant la biodégradation de l’atrazine. D’autre part, les essais précédents réalisés en

milieu minéral glucosé (MM-Glc) ont montré que l’addition d’une source d’azote diminuait

considérablement le taux de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.

Ainsi, nous avons écarté l’idée d’ajouter une source additionnelle d’azote pour les essais suivants, ne

conservant comme seule source d’azote que l’atrazine et les quelques traces d’azote contenu dans

l’extrait aqueux d’écorce de pin ou les particules d’écorce de pin elles-mêmes.

Concernant les essais de minéralisation, la Figure 37 montre les résultats obtenus en extrait stérile

d’écorce de pin et en milieu minéral MM glucosé (protocole expérimental décrit au § V.1.1.1).

Figure 37 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp en extrait aqueux d’écorce de pin stérile ou en milieu minéral MM (glucose 0,25 g.L-1) ; concentration initiale en atrazine 20 mg.L-1 ; 22°C ;

agitation lente

La minéralisation est similaire en extrait et en milieu minéral glucosé, pour une quantité de carbone

équivalente dans les deux milieux (100 mg.L-1), à une concentration initiale en atrazine de 20 mg.L-1

(correspondant à un rapport C/N de l’ordre de 100/5-9). Une nouvelle fois ces résultats montrent que

la présence des composés organiques de l’écorce de pin ne sont pas néfastes pour Pseudomonas

ADP sp. vis à vis de la minéralisation de l’atrazine.

III.3 Conclusions

Les principales conclusions concernant la biodégradation de l’atrazine en culture pure de

Pseudomonas ADP sp. sont les suivantes :

- Pseudomonas ADP sp. est capable de croître et dégrader l’atrazine de façon

significative à une température de 12°C et à des pH acides compris entre 4,4 et 7.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Temps (h)

% A

traz

ine

min

éral

isée

MM-Glc + AtrazineExtrait + Atrazine



145

- L’addition d’une source d’azote au milieu, en plus de l’atrazine, stimule la croissance

des bactéries mais diminue considérablement le taux de minéralisation de l’atrazine,

elle-même consommée en tant que source d’azote par Pseudomonas ADP sp., sans

pour autant affecter le taux de dégradation primaire de l’atrazine.

- Pseudomonas ADP sp. est capable de croître et de dégrader l’atrazine en extrait

aqueux d’écorce de pin contenant les composés organiques solubles de l’écorce de

pin. Les taux de minéralisation observés en extrait aqueux d’écorce de pin et en

milieu minéral glucosé (MM-Glc 0,25 g.L-1) sont similaires. Les composés organiques

de l’écorce de pin peuvent être consommés par Pseudomonas ADP sp. en tant que

source de carbone (concentration en carbone dans l’extrait 100 mg.L-1 ). Ils sont par

conséquent biodégradables et non toxiques vis à vis de Pseudomonas ADP sp.

- L’addition de glucose à l’extrait aqueux d’écorce de pin provoque une inhibition de la

croissance de Pseudomonas ADP sp.

En terme d’application, ces résultats suggèrent que :

- La biodégradation de l’atrazine pourrait être efficace sans l’ajout d’une source

supplémentaire de carbone comme le glucose. Pseudomonas ADP sp. pourrait ainsi

dégrader en parallèle l’atrazine (source d’azote) et les composés organiques solubles

issus de l’écorce de pin (source de carbone).

- La faible concentration en azote contenue dans l’écorce de pin pourrait stimuler

l’utilisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en tant que source d’azote.

L’addition d’une source d’azote supplémentaire induirait une réduction du taux de

minéralisation de l’atrazine.

- La biodégradation de l’atrazine pouvant avoir lieu à des pH acides imposés par la

présence des composés organiques de l’écorce (pH 4,4), le traitement pourrait être

conduit sans addition de tampon. D’autre part, la biodégration ayant été observée à

12°C, le réchauffement de l’eau à traiter ne serait pas indispensable. Ainsi, des

conditions de traitement relativement « rustiques » pourraient être envisagées.

Cependant, le contrôle du pH et de la température dans les zones optimales

permettrait bien évidemment d’optimiser l’efficacité du procédé.

MATERIEL ET METHODES Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce


146

IV. Caractérisation et rôle de la microflore Indigène de l’écorce de pin

La capacité de Pseudomonas ADP sp. à coexister, à croître et à dégrader l’atrazine en présence de la

microflore indigène de l’écorce de pin est un aspect important de la faisabilité du procédé combiné

envisagé.

Quelle influence cette microflore indigène a-t-elle sur la souche bactérienne Pseudomonas ADP sp. ?

Sont-elles en compétition ?

D’autre part, la microflore de l’écorce de pin peut-elle également intervenir dans le processus de

dégradation de l’atrazine ? Les expériences décrites ci-dessous ont été conduites pour répondre à ces

questions.

IV.1 Matériel et méthodes

IV.1.1 Isolement et identification des micro-organismes de l’écorce de pin

L’isolement des principaux micro-organismes extraits de l’écorce de pin a permis d’identifier

qualitativement les espèces revivifiables prédominantes et de tester, en cultures pures ou en

consortium, leur capacité à croître dans un milieu contenant de l’atrazine et à la dégrader.

L’isolement de la flore indigène de l’écorce de pin a été réalisé à partir de la poudre d’écorce

(particules d’écorce d<200 µm). Deux grammes d’écorce en poudre ont été placés dans des

Erlenmeyers préalablement stérilisés contenant 20 mL de milieu riche LB, puis placés à 30°C sous

agitation (150 rpm) pendant 72 heures. L’isolement des souches a été réalisé par étalement des

surnageants dilués en cascade à 10-4, 10-6, 10-7 et 10-8, sur boites de Pétri contenant un milieu solide

riche PCA. Les boites de gélose ont été incubées dans une étuve thermostatée à 30°C pendant

plusieurs jours. Tous les essais ont été réalisés en triplicats.

Les colonies ont été différenciées selon leur forme, leur aspect et leur couleur. Chacune des

différentes colonies de morphologie différente a ensuite été purifiée par deux étalements successifs

sur un milieu PCA.

Une observation au microscope optique ainsi qu’une coloration Gram (coloration au Cristal violet,

Lugol et Safranine) ont été réalisées sur chacune des souches isolées afin de déterminer la forme des

cellules et leur appartenance à une classe de micro-organismes.

Les micro-organismes isolés ont été congelés suivant le même protocole que pour Pseudomonas

ADP sp.(cf. § III.1.2.1).



147

Il ne fait pas de doute que la totalité des micro-organismes présents dans l’écorce n’a pas été isolée

par cette technique de revitalisation. Il est connu que dans les sols, cette approche ne touche que

quelques % des cellules (Giacomazzi, 2002). Cependant, on peut penser que les micro-organismes

mis en évidence selon l’isolement effectué ci-dessus représentent les espèces indigènes majoritaires

de l’écorce de pin.

IV.1.2 Capacité de la flore indigène à dégrader l’atrazine

Les quatre isolats obtenus à partir de l’isolement des micro-organismes de l’écorce de pin sont notés

CP1 à CP4.

IV.1.2.1 Biodégradation de l’atrazine en consortium ou en cultures pures

La biodégradation de l’atrazine par le consortium, contenant les 4 souches isolées (CP1, CP2, CP3,

CP4) de l’écorce de pin, ou par des cultures pures de chacune des souches, a été testée en milieu

liquide LB et en extrait aqueux d’écorce de pin. Le milieu riche LB a été utilisé afin d’obtenir une

bonne croissance des micro-organismes présents, et donc une forte activité métabolique ; l’extrait

aqueux d’écorce de pin a quant à lui permis de simuler les conditions du milieu d’origine des différents

micro-organismes isolés.

Comme précédemment, la croissance des micro-organismes a été suivie par mesure de DO600

(III.1.3.1.1); la dégradation de l’atrazine du milieu a été analysée par HPLC (II.1.1.1.2(a)) sur les

prélèvements effectués entre le temps 0 à 200 heures environ.

Les essais ont été réalisés en Erlenmeyers dans 20 mL de milieu (LB ou extrait aqueux d’écorce de

pin) à 30°C sous agitation (150 rpm). Les fioles ont été inoculées à partir des stocks de cellules

congelées avec environ 106 cfu.mL-1de chacune des 4 souches isolées.

L’atrazine a été ajoutée aux essais à environ 50 mg.L-1.


IV.1.2.2 Minéralisation de l’atrazine par la flore indigène de l’écorce de pin

L’utilisation d’atrazine marquée uniformément au 14C a permis d’étudier la minéralisation de l’atrazine

par la flore indigène de l’écorce de pin en présence même d’écorce de pin en poudre dans un milieu

minéral (MM).

Les expériences ont été réalisées en biomètre en présence de 50 mL de MM stérile contenant 2,5 g

(ratio L/S =20 mL.g-1) d’écorce de pin en poudre non stérile (d>200nm). C’est donc l’écorce de pin qui

ici, apporte les micro-organismes indigènes au milieu. Deux concentrations initiales en atrazine ont



148

été testées : 44 µg.L-1et 20 mg.L-1. Les biomètres ont été placés à 20 ± 2°C et agités doucement avec

un barreau magnétique.

Les témoins abiotiques ont été préparés à partir de 2,5 g d’écorce préalablement stérilisée (§ I.7) et

50 ml de milieu MM stérile.

La minéralisation a été suivie par quantification du 14CO2 formé selon le protocole décrit au

§ III.1.4.2.3.

IV.1.3 Influence de la microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp.

Le travail qui suit a consisté à étudier la croissance de Pseudomonas ADP sp. ainsi que sa capacité à

biodégrader et à minéraliser l’atrazine en présence de la microflore de l’écorce de pin. Les essais ont

été réalisés en extrait aqueux d’écorce de pin dans un premier temps puis en présence d’écorce en

poudre.

IV.1.3.1 Croissance de Pseudomonas ADP sp.

Pseudomonas ADP sp. a été cultivé dans des Erlenmeyers de 250 mL contenant 50 mL d’extrait

aqueux d’écorce de pin stérile, ou non stérile, ou 50 mL de milieu minéral stérile (MM) contenant de

l’écorce de pin en poudre (diamètre<200 µm) préalablement stérilisée (§ I.7) ou non à un ratio

liquide/solide de 10 mL.g-1. Pseudomonas ADP sp. a été inoculé entre 0,5.108 et 1.108 cfu.mL-1 dans

chaque Erlenmeyer

Dans chacun des essais, 30 mg.L-1 d’atrazine ont été additionnés au milieu en tant que source

d’azote. Les composés solubles de l’écorce de pin constituaient la seule source de carbone pour les

micro-organismes en culture.

Les cultures ont été incubés à 30°C sous d’agitation (150 rpm).

Le suivi de la croissance de Pseudomonas ADP sp. a été réalisé par comptage sur boite de Pétri PCA

(III.1.3.1) lorsque l’écorce était présente dans les erlens et par mesure de densité optique en milieu

liquide d’extrait d’écorce de pin.


IV.1.3.2 Biodégradation de l’atrazine

IV.1.3.2.1 Suivi de la dégradation primaire de l’atrazine en extrait aqueux d’écorce de pin

La dégradation de l’atrazine a été suivie sur 5 jours par analyse HPLC des prélèvements de 1 mL

effectués périodiquement (II.1.1.1.2(a)). Cette étude n’a été réalisée que dans l’extrait aqueux



149

d’écorce de pin puisqu’en présence de particules d’écorce l’adsorption ne peut pas être distinguée de

la biodégradation.

IV.1.3.2.2 Suivi de la minéralisation de l’atrazine

La minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en présence de la microflore indigène de

l’écorce de pin a été étudiée en milieu minéral (MM) en présence d’écorce de pin en poudre (non

stérile, ratio L/S=20 mL.g-1). Pour ces expériences, l’atrazine était la seule source additionnelle

d’azote. Deux concentrations initiales en atrazine ont été testées : 44,2 µg.L-1 (correspondant à une

pollution probable) et 20 mg.L-1 (concentration en azote permettant un développement microbien

important). Les composés solubles de l’écorce de pin étaient la seule source de carbone (COT

initial = 580 mg.L-1) (Tableau 9, p.117). Les composés solubles de l’écorce de pin apportaient au

milieu une concentration en azote d’environ 4 mg.L-1. Pseudomonas ADP sp. a été inoculé à partir de

précultures à une DO initiale de 0,05. Les essais ont été réalisés à 20 ± 2°C dans des biomètres et

agités doucement à l’aide de barreaux magnétiques.

Les témoins contenant l’écorce stérilisée (débarrassée de sa microflore) ont été inoculés de la même

façon que précédemment (préculture de Pseudomonas ADP sp.) et incubés dans les mêmes

conditions.

La minéralisation a également été suivie dans des témoins non inoculés par Pseudomonas ADP sp.

RESULTATS ET DISCUSSION Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce


150

IV.2 Résultats et discussion

IV.2.1 Isolement de la microflore de l’écorce de pin

L’isolement de colonies issues de l’écorce de pin réalisé selon le protocole présenté au § IV.1.1 a

permis de mettre en évidence 4 isolats majoritaires nommés CP1, CP2, CP3 et CP4.

Les caractéristiques morphologiques et physiologiques de ces isolats sont résumées dans le Tableau

14.

Tableau 14 : Description des colonies de micro-organismes isolés de l’écorce de pin sur boite de Pétri

Colonie Taille Forme Contour Epaisseur Aspect Couleur Gram Filament

CP1 2-3 mm circulaire régulier plat opaque

incrusté

dans l’agar

blanc + oui

CP2 7 mm circulaire

ou ovale

régulier plat lisse

muqueux

translucide

beige Coque - non

CP3 2-3 circulaire régulier plat translucide

brillant

lisse

beige Bacile - non

CP4 2-3 circulaire régulier plat translucide

brillant

lisse

jaune Coque + non

Chacun des 4 isolats mis en évidence par cette méthode présente une morphologie particulière

(couleur, forme, taille, présence de filament…) ce qui a permis de les identifier assez facilement sur

boite de Pétri et de les distinguer de Pseudomonas ADP sp.

Si CP1, CP3 et CP4 présentent l’aspect de bactéries, l’observation de CP2 au microscope optique se

rapproche d’une structure de levure de part sa taille et sa forme (Coque 10 à 20 µm). Suite à cet

isolement, des stocks de cellules congelées de chacun des isolats ont été préparés et conservés pour

être utilisés, de la même façon que Pseudomonas ADP sp., lors des études qui suivent.



151

IV.2.2 Capacité de la flore indigène de l’écorce à biodégrader l’atrazine

L’objectif de cette étude est de déterminer si la flore indigène de l’écorce de pin joue ou non un rôle

significatif dans la biodégradation de l’atrazine. Chaque isolat (CP1 à CP4) a donc été testé pour ses

capacités à dégrader l’atrazine en culture pure et en consortium, en milieu complexe riche (LB) et en

extrait aqueux d’écorce de pin.

IV.2.2.1 Biodégradation primaire de l’atrazine

Les essais de biodégradation de l’atrazine ont été conduits en milieu riche LB et en extrait aqueux

d’écorce de pin selon le protocole décrit au § IV.1.2.1., en présence d’atrazine (concentration initiale

d’environ 50 mg.L-1) comme source d’azote ; aucune source de carbone n’a été ajoutée à l’extrait

d’écorce de pin.

La Figure 38 montre que, l’atrazine est biodégradée par le consortium (CP1, CP2, CP3 et CP4 à

environ 106 cfu.mL-1 chacun) en milieu complexe riche LB. Aucune biodégradation de l’atrazine n’est

en revanche observée dans l’extrait aqueux d’écocre de pin. De plus, la croissance du consortium en

milieu LB est nettement supérieure à celle observée en extrait d’écorce de pin où elle est quasiment

nulle. Ce phénomène peut être lié à une carence en azote dans l’extrait aqueux d’écorce de pin

(l’atrazine, 50 mg.L-1 environ, représente la seule source d’azote pour les bactéries, équivalent à

environ 17 mg.L-1 d’azote). Les micro-organismes de l’écorce peuvent également être inaptes à

consommer les composés organiques dissous de l’écorce de pin ou incapables de cométaboliser

l’atrazine en présence de ces composés organiques.

Figure 38 : Croissance du consortium isolé à partir de l’écorce de pin et biodégradation de l’atrazine en milieu LB ou en extrait aqueux d’écorce de pin inoculé avec environ 106 cfu.mL-1 de chaque isolat (CP1 à

CP4) ; atrazine comme source d’azote (55 mg.L-1) ; 30°C ; agitation 150 rpm

0

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300

Temps (h)

Témoin stérile

Extrait + Atrazine

LB + Atrazine

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

0 100 200 300

Temps (h)

Extrait + AtrazineLB + Atrazine

Croissance Biodégradation



152

Afin d’identifier les micro-organismes de la flore indigène de l’écorce de pin responsables de la

dégradation de l’atrazine en milieu LB, les mêmes expériences ont été répétées en culture pure de

chaque isolat.

La Figure 39 présente les résultats de biodégradation de l’atrazine obtenus en cultures pures.

Figure 39 : Biodégradation de l’atrazine en milieu LB par les micro-organismes isolés de l’écorce de pin (inoculé avec environ 106 cfu.mL-1 de CP1, CP2, CP3 ou CP4) ; atrazine comme source d’azote (environ 55

mg.L-1) ; 30°C ; agitation 150 rpm

Alors que les isolats CP3 et CP4 ne semblent pas présenter d’activité de dégradation significative de

l’atrazine, les isolats CP1 et surtout CP2, quant à eux, présentent une activité significative. En

présence de l’isolat CP1, environ 50% de l’atrazine présente initialement dans le milieu sont dégradés

en 310 heures, contre 83% dans ce même intervalle de temps en présence de l’isolat CP2,

correspondant à la dégradation observée avec le consortium. L’isolat CP2, et dans une moindre

mesure CP1, seraient donc responsables de la biodégradation de l’atrazine observée en présence du

consortium en milieu LB.

Ces résultats sont à analyser avec précaution puisqu’il s’agit ici de biodégradation primaire de

l’atrazine et non pas de minéralisation.

IV.2.2.2 Minéralisation de l’atrazine

La capacité de la microflore indigène de l’écorce de pin à minéraliser l’atrazine a été étudiée grâce à

l’utilisation d’atrazine marquée au 14C par suivi du dégagement de 14CO2 dans des biomètres, selon le

protocole présenté au § IV.1.2.2.

Ces expériences ont été réalisées en présence même de particules d’écorce (d<200 µm) non

stérilisée, et contenant par conséquent la microflore naturelle de l’écorce, immergées dans un milieu

minéral stérile MM à un ratio Liquide/Solide de 20 mL.g-1.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 50 100 150 200 250 300 350

Temps (h)

Atr

azin

e (m

g.L-1

)

CP4CP3CP1CP2



153

Deux concentrations initiales d’atrazine ont été testées : la première, 20 mg.L-1 a permis d’apporter

une source d’azote significative pour la croissance des micro-organismes (aucune autre source

d’azote n’a été additionnée au milieu). La seconde concentration en atrazine testée de 44,2 µg.L-1

pourrait correspondre à une probable pollution des milieux naturels à l’atrazine.

Les résultats de ces essais pour les deux concentrations en atrazine testées sont présentés Figure

40.

Figure 40 : Minéralisation de l’atrazine en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de pin stériles ou non stériles (d<200 µm) à un ratio L/S=20 ; [atrazine]i=20 mg.L-1 ou 44,2 µg.L-1 comme seule

source d’azote ; 20 ± 2 °C ; agitation lente

L’activité de minéralisation de l’atrazine par la flore indigène de l’écorce de pin n’est pas négligeable

puisqu’après environ 320 heures d’incubation des particules d’écorce non stériles en milieu minéral, 9

à 16% de l’atrazine présente initialement dans le milieu sont minéralisés sous forme de CO2. A faible

concentration en atrazine (44,2 µg.L-1), le pourcentage d’atrazine minéralisée est légèrement

supérieur à celui observé à forte concentration (20 mg.L-1).

Lors du traitement combiné envisagé, la microflore de l’écorce de pin pourra soit contribuer en même

temps que Pseudomonas ADP sp. à la dégradation de l’atrazine, apportant un effet cumulatif

bénéfique, soit entrer en compétition avec Pseudomonas ADP sp. pour les nutriments présents dans

le milieu, et notamment l’atrazine, provoquant un effet négatif sur l’activité de Pseudomonas ADP sp.

et donc sur l’efficacité du traitement mis en place.

Ainsi, dans le paragraphe qui suit, des expériences mettent en évidence l’effet de cette microflore

indigène de l’écorce de pin vis à vis de la croissance de Pseudomonas ADP sp. et de sa capacité à

minéraliser l’atrazine.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 100 200 300 400Temps (h)

% A

traz

ine

min

éral

isée

Ecorce non stérile + Atz 44 µg/L

Ecorce non stérile + Atz 20 mg/L

Témoin stérile (Atz 44 µg/L)

Témoin stérile (Atz 20 mg/L)



154

IV.2.3 Influence de la microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp

Quelle est l’influence de la microflore de l’écorce de pin sur le développement de Pseudomonas ADP

sp. utilisée dans le cadre du traitement combiné et sur sa capacité à dégrader l’atrazine ? Des essais

ont été réalisés afin de quantifier cet effet, afin de déterminer si une stérilisation de l’écorce serait

nécessaire avant son utilisation en tant que support de la biofiltration, lors du traitement combiné

étudié ici.

IV.2.3.1 Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en présence de la microflore de l’écorce de pin

L’influence de la microflore de l’écorce de pin sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. a été

étudiée en extrait aqueux d’écorce de pin non stérile, contenant naturellement une partie de la flore

indigène de l’écorce, et en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce non stériles

(d<200 µm). Des témoins stériles (extrait stérile et MM + particules d’écorce stériles) ont été suivis en

parallèle. Le protocole de cette étude figure au § IV.1.3.1.

La Figure 41 compare l’évolution de la croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu MM en

présence de particules d’écorce de pin stériles ou non.

Figure 41 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de pin (ratio L/S=10), en présence d’atrazine (30 mg.L-1) ; 30°C ; agitation 150 rpm. En foncé : Pseudomonas ADP sp. est inoculé avec l’écorce stérile ; en clair : Pseudomonas ADP sp. est inoculé

avec l’écorce non stérile

On constate dans les deux cas une diminution de la concentration en cellules de Pseudomonas ADP

sp. au cours des deux premiers jours, traduisant probablement une adsorption des cellules sur les

particules solides. La croissance de Pseudomonas ADP sp. est ensuite faible et s’avère en outre

réduite par la présence de la flore indigène de l’écorce. Le comptage des cellules n’inclut pas ici les

cellules adsorbées sur l’écorce mais uniquement les cellules présentes dans le milieu liquide.

0

50

100

150

200

0 1 2 3 7Jour

cell.

106 /m

l




155

Cependant, nous avons considéré que les cellules présentes en milieu aqueux et celle adsorbées

étaient proportionnellement réparties dans les deux phases et que par conséquent, l’évolution de la

densité de cellules dans le liquide était représentative de la croissance globale de Pseudomonas ADP

sp.

En extrait aqueux d’écorce de pin (Figure 42), la présence de la micro-flore de l’écorce n’affecte pas la

croissance de Pseudomonas ADP sp. La croissance est en effet équivalente en extrait stérile et en

extrait non stérilisé contenant la microflore de l’écorce de pin.

Figure 42 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin stérile ou non stérile en présence d’atrazine (environ 50 mg.L-1) ; 30°C ; agitation 150 rpm

Concernant l’influence de la flore de l’écorce sur la biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas

ADP sp., la Figure 43 montre que la dégradation de l’atrazine semble être légèrement réduite en

extrait non stérile d’écorce de pin mais seulement après 40 heures d’incubation, par comparaison à la

dégradation en extrait stérile. Après 120 heures d’incubation, environ 66% de l’atrazine initialement

présente sont dégradés dans l’extrait d’écorce de pin non stérile contre environ 80% dans l’extrait

stérile, alors qu’après 45h la biodégradation est similaire (65% environ).

Ce phénomène pourrait suggérer l’existence d’une compétition pour les nutriments du milieu

(carbone, azote ou minéraux) entre Pseudomonas ADP sp. et les micro-organismes indigènes de

l’écorce de pin présents dans l’extrait. Cependant, ce résultat est incertain car il ne repose que sur un

point de la courbe.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 20 40 60 80 100 120

Temps (h)

DO

600n

m

Pseudo en Extrait stérile

Pseudo en Extrait non stérile

Témoin - Extrait stérile

Témoin - Extrait non stérile



156

Figure 43 : Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux stérile et non stérile d’écorce de pin ; [atrazine ]i= 30 mg.L-1 ; 30°C ; agitation 150 rpm

La microflore indigène de l’écorce de pin aurait globalement un effet légèrement négatif à la fois sur la

croissance de Pseudomonas ADP sp., en présence de particules d’écorce de pin, et sur sa capacité à

biodégrader l’atrazine. Cette observation suggère l’existence d’une légère compétition entre les micro-

organismes de l’écorce et Pseudomonas ADP sp. pour la consommation des nutriments du milieu,

mais l’incidence en est très faible.

IV.2.3.2 Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en présence de la microflore de l’écorce

Les essais ont été réalisés en biomètres par suivi du 14CO2 en milieu minéral (MM) contenant des

particules d’écorce stériles et non stériles, selon le protocole décrit au § IV.1.3.2.2 à deux

concentrations initiales en atrazine (20 mg.L-1 et 44,2 µg.L-1).

Pour les deux concentrations initiales en atrazine testées, la Figure 44 montre que la microflore de

l’écorce seule (MM + écorce non stérile non inoculée par Pseudomonas ADP sp.) est capable de

minéraliser jusqu’à 16% de l’atrazine. Le témoin stérile (MM + Ecorce stérile) ne présente aucune

activité de minéralisation.

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

Temps (j)

% A

traz

ine

dégr

adée

Pseudo en Extrait stérile

Pseudo en Extrait non stérile



157

Figure 44 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. présente à une concentration initiale de 20 mg.L-1 (A) ou 44,2 µg.L-1 (B) en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de pin stériles ou

non stériles (L/S=20) ; 20 ± 2 °C ; agitation lente

Lorsque l’atrazine est présente dans le milieu à forte concentration (20 mg.L-1, Figure 44-A), le taux de

minéralisation atteint 52% en présence des particules d’écorce non stériles contre 35% seulement

avec l’écorce stérile, indiquant que la présence de la flore indigène de l’écorce aurait un effet positif

sur la minéralisation de l’atrazine.

A faible concentration en atrazine (44,2 µg.L-1, Figure 44-B) le phénomène inverse est observé : la

microflore de l’écorce de pin induit une légère inhibition de la minéralisation de l’atrazine par

Pseudomonas ADP sp. : 45% de l’atrazine sont minéralisés en présence d’écorce non stérile contre

50% environ en présence d’écorce stérile. Ce résultat indique que la microflore de l’écorce de pin et

Pseudomonas ADP sp. sont en compétition pour l’utilisation des nutriments et/ou des sources de

A

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150 200 250 300 350

Temps (h)

% A

traz

ine

min

éral

isée

Ecorce non stérile + Pseudo

Ecorce stérile + Pseudo

Témoin Ecorce non stérile

Témoin Ecorce stérile

B

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150 200 250 300 350

Temps (h)

% A

traz

ine

min

éral

isée Ecorce stérile + Pseudo

Ecorce non stérile + Pseudo

Témoin Ecorce non stérile

Témoin Ecorce stérile



158

carbone du milieu ; cette compétition induit un effet de réduction du taux d’atrazine dégradée par

Pseudomonas ADP sp.

A faible concentration, on peut penser que l’adsorption sur les particules d’écorce doit probablement

avoir lieu principalement en surface des particules, laissant ainsi l’atrazine facilement disponible pour

Pseudomonas ADP sp. A forte concentration, l’atrazine pourrait diffuser plus profondément dans les

particules d’écorce, le gradient de concentration étant plus élevé, diminuant la disponibilité de

l’atrazine vis à vis de Pseudomonas ADP sp. La présence de la microflore à l’intérieur de la structure

même des particules d’écorce pourrait justifier du fort taux de minéralisation observé dans ces

conditions.

En présence de la flore indigène de l’écorce de pin, les vitesses initiales de minéralisation de l’atrazine

sur les 48 premières heures, atteignent 0,218 mg.L-1.h-1 et 4,02.10-4 mg.L-1.h-1 respectivement pour

des concentrations initiales en atrazine de 20 mg.L-1 et 44,2 µg.L-1. Les résultats sont résumés dans le

Tableau 15. Ces données suggèrent une cinétique initiale d’ordre 1 par rapport à l’atrazine avec une

constante de vitesse k de l’ordre de 1.10-2 h-1.

Tableau 15 : Vitesse initiale de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. calculée sur les 48 premières heures, en présence d’écorce de pin stérile ou non (en mg.L-1.h-1)

[Atrazine]i Pseudo. + écorce stérile Pseudo. + écorce non stérile

20 mg.L-1 0,133 0,218

44,2 µg.L-1 4,54. 10-4 4,02.10-4

IV.3 Conclusion

• Quatre isolats appartenant à la flore indigène de l’écorce de pin ont été obtenus. Ces isolats

représentent les micro-organismes probablement majoritaires de l’écorce de pin et cultivables

dans les conditions utilisées mais ne sont pas pour autant les seuls micro-organismes

constituants cette microflore de l’écorce. Les essais réalisés ont montré une certaine capacité

de la flore indigène de l’écorce à dégrader l’atrazine en consortium. Les isolats CP2 et dans

une moindre mesure CP1 semblent être responsables de cette activité de dégradation de

l’atrazine.

D’autre part, la flore indigène de l’écorce de pin a été caractérisée comme ayant une activité

non négligeable de minéralisation de l’atrazine (entre 9% et 16% de minéralisation) présente

dans le milieu à forte (20 mg.L-1) ou faible (44,2 µg.L-1) concentration initiale.

• La présence de la microflore de l’écorce aurait un effet légèrement inhibiteur sur la croissance

de Pseudomonas ADP sp. Cependant les essais de biodégradation montrent qu’en présence



159

de cette microflore, le taux de minéralisation de l’atrazine (essais inoculés avec Pseudomonas

ADP sp.) est augmenté par rapport au taux de minéralisation observé en milieu contenant des

particules d’écorce stériles lorsque l’atrazine était présente initialement dans le milieu à une

forte concentration ([atrazine]i= 20 mg.L-1).

A faible concentration ([atrazine]i= 44,2 µg.L-1), la présence de la microflore de l’écorce n’a

qu’un effet très limité sur la minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. Le taux de

minéralisation est très légèrement réduit par la présence de la microflore de l’écorce

suggérant que les micro-organismes présents dans le milieu (Pseudomonas ADP sp. et la

microflore de l’écorce) sont en compétition pour les nutriments et/ou source de carbone du

milieu. Cette compétition induirait un très léger effet négatif sur l’efficacité de l’élimination de


MATERIEL ET METHODES Etude du traitement combiné


160

V. Etude du traitement combiné

L’étude de faisabilité du traitement combiné (adsorption/biodégradation) a été abordée sous deux

angles différents :

- Des essais en batch ont permis un suivi précis du devenir de l’atrazine au cours du

traitement grâce à l’utilisation d’atrazine radioactive.

- Des essais en colonne ont permis de comparer l’intérêt d’utiliser Pseudomonas ADP

sp. par rapport à un traitement physique simple d’adsorption.

En accord avec les résultats obtenus aussi bien dans les études d’adsorption que lors de l’approche

biologique, des choix ont été faits quant à l’orientation du traitement et la nécessité d’apporter ou non

certains éléments pouvant améliorer l’efficacité du traitement.

V.1 Matériel et méthodes

V.1.1 Essais en batch

Dans les essais en milieu dispersé, dits « Essais en Batch », le devenir de l’atrazine a pu être suivi

grâce à l’utilisation de [U-ring-14C]-atrazine.

Ces expériences ont été menées à l’Unité de Microbiologie et de Génétique de l’INSA de Lyon (UMR

5122 CNRS) et à l’Unité Environnement et Grandes Cultures de l’INRA de Versailles-Grignon.

V.1.1.1 Protocole expérimental

Les essais ont été réalisés dans des biomètres (voir schéma Figure 28 p.127) contenant 50 mL de

milieu minéral liquide (MM) et 2,5 g d’écorce de pin stérile ou non stérile (ratio L/S=20 mg.g-1), incubés

à 20 ± 2°C sous agitation lente à l’aide d’un barreau magnétique, pendant environ 350 heures (15

jours).

Des essais sans écorce, réalisés en parallèle en extrait aqueux d’écorce de pin et en milieu minéral

glucosé (MM + glucose 1,25 g.L-1, 50 ml), ont permis de mettre en évidence l’influence de la présence

de l’écorce de pin dans le milieu, sur la capacité de Pseudomonas ADP sp. à minéraliser l’atrazine.

La [U-ring-14C]-atrazine commercialisée par Sigma, d’activité spécifique de 24,6 mCi.mmol- 1 a été

utilisée pour réaliser plusieurs séries d’expériences à des concentrations initiales de 20 mg.L-1 et

44,2 µg.L-1. La préparation des solutions mères d’atrazine est détaillée au § III.1.4.2.1 (p.126).



161

Pseudomonas ADP sp. a été inoculé a partir de cellules provenant de précultures et réalisées selon le

protocole décrit au § III.1.2.2 (p.118) ; la DO initiale dans chaque biomètre atteignant une valeur

d’environ 0,05.


La minéralisation a été suivie par comptage de la radioactivité dans les pièges à soude selon la

méthode décrite en III.1.4.2.2.

Les essais ont été réalisés en 2 phases :

- Dans un premier temps, la minéralisation de l’atrazine a été suivie sur 15 jours (1ère

Phase) par dosage du 14CO2 .

- Dans une deuxième phase, des extractions et combustions ont permis d’établir un

bilan carbone. Puis, l’évolution à long terme de l’atrazine résiduelle a été suivie sur

7 mois dans 2 conditions différentes : 1) en milieu dispersé et 2) en microcosmes.

Lors de cette deuxième phase, les 3 replicats ont été utilisés à des fins différentes :

o Les réplicats A ont subi extractions et combustions pour établir un bilan

carbone en quantifiant la radioactivité résiduelle dans chacun des

compartiments au terme des 15 premiers jours.

o Les réplicats B sont restés incubés en milieu dispersé (L/S=20 mg.L-1)

pendant 7 mois. Le devenir à long terme de l’atrazine résiduelle a pu être

suivi par dosage régulier du 14CO2. Au terme des 7 mois un bilan carbone a

été établi grace à des extractions et combustions permettant de quantifier la

radioactivité dans les différents compartiments.

o Les réplicats C ont subi le même sort que les réplicats B pendant 7 mois ,

mais cette fois en microcosmes.

La Figure 45 résume l’utilisation des différents réplicats lors de l’étude en batch du traitement

combiné.



162

Figure 45 : Utilisation des différents réplicats pour l’étude en batch du traitement combiné

V.1.1.2 Distribution de la radioactivité dans les essais en batch

Un bilan complet de la distribution de la radioactivité été réalisé par mesure de celle-ci en fin

d’expérimentation dans les différents compartiments du biomètre :

- Atrazine ou métabolites en solution aqueuse (Phase liquide)

- 14CO2 piégé dans la soude, issu de la minéralisation de l’atrazine (Phase gazeuse)

- Atrazine ou résidus adsorbés sur l’écorce de pin ou les cellules (extractibles et non

extractibles) (Phase solide).

Poursuite de l’incubation et collecte de l’écorce à 7 mois

Essais en triplicat

- Suivi de la minéralisation sur 15 jours (14CO2) - Radioactivité en solution au bout de 15 jours

Si essais reproductibles

A CB

A B C

Extractions et

Combustion

Suivi minéralisation sur 7 mois en

Milieu dispersé L/S=20

Extraction à 7 mois

Combustions à 7

mois

Suivi minéralisation sur 7 mois en Microcosmes

Extraction à 7 mois

Combustions à 7 mois

Suivi du devenir à long terme de l’écorce de pin issue du traitement

Collecte de l’écorce

1ère Phase

2ème Phase



163

La Figure 46 représente la distribution possible de la radioactivité dans les différents compartiments

du milieu lors des essais en batch, ainsi que les méthodes de suivi de celle-ci pour chacun des

compartiments.

Figure 46 : Distribution de la radioactivité dans les essais batch – Méthodes de suivi de la radioactivité dans les différents compartiments

V.1.1.2.1 Radioactivité en solution

Au bout de 350 heures d’incubation des biomètres, 1 mL de solution est prélevé, centrifugé

(7000 rpm, 20 min) pour éliminer les cellules ou débris cellulaires ainsi que les particules d’écorce en

poudre, puis analysé au compteur à scintillation (ajout de 7 mL de liquide à scintillation) afin de

quantifier la radioactivité résiduelle en solution.

D’autres échantillons (1 ml) ont été prélevés et analysés à l’aide d’une HPLC (Waters 600 E) équipée

d’un module Waters 996 à photodiode et d’un auto-injecteur 717 Plus Autosampler. La colonne

utilisée était une Cartridge Nova Pack 60A C18 (dimension 4 µm, 4.6 x 20). La radioactivité est

détectée à l’aide d’un détecteur Radiomatic Flo-one Packard. Ces analyses ont permis d’étudier la

répartition de la radioactivité des composés en solution (atrazine ou métabolites intermédiaires).

Devenir de l'atrazine*

En phase gazeuse CO2

En solutionAtrazine

Métabolites de dégradation

Résidus extractibles Résidus liés

En phase solide Atrazine ou métabolites adsorbés

Autres résidus et cellule

Analyse du 14CO2 dissous dans

NaOH

Compteur à scintillation

Prélèvement de 1 ml de solution

ExtractionsCaCl2 MeOH

Combustion de

l’écorce

A*

Loc

alis

atio

n M

étho

de

Mat

érie

l

Oxidizer



164

L’analyse HPLC a permis de détecter les métabolites suivants :

- OHA : 2-hydroxy-atrazine

- OHDEA : Deséthyl-2-hydroxy-atrazine

- OHDIA : Desisopropyl-2-hydroxy-atrazine

- DEA : Deséthyl-atrazine

- DIA : Desisopropyl-atrazine

- DEDIA : deséthyl-desisopropyl-atrazine

- A : atrazine

Les éluants utilisés étaient:

- A : Eau Ultra Pure / HCl 0,5 M, 95/5 avec Dodécylsulfate de sodium (SDS) 1,44g.L-1 - B : Méthanol pour analyse /Eau Ultra Pure / HCl 0,5 M, 90/5/5 avec SDS 1,44g.L-1

La durée d’une analyse était de 45 min réalisée selon la table d’élution suivante (Tableau 16), avec un

rinçage de 15 minutes (éluant A) entre deux injections.

Tableau 16 : Table d’élution pour analyse HPLC de l’atrazine et des métabolites de dégradation

Temps (min) Débit (ml.min-1) %A %B

0 1 100 0

1 1 62 38

8 1 60 40

10 1 40 60

30 1 0 100

35 1 100 0

L’identification de l’atrazine et de ses métabolites a été plutôt qualitative que quantitative du fait des

concentrations très faibles de chacun des composés en solution en fin d’incubation.

V.1.1.2.2 Radioactivité associée à l’écorce

A la fin de la première phase de l’étude (350 h, voir Figure 45), l’écorce de pin de l’un des triplicats (A)

est récupérée par centrifugation de l’ensemble de la suspension (10000 rpm, 20 min), puis deux

extractions successives sont effectuées avec 10 mL d’une solution de CaCl2 (0,1 M) puis 10 mL de

méthanol pur sur la totalité de l’écorce (2,5 g). Les solutions sont analysées au compteur à scintillation

afin d’évaluer le pourcentage de résidus extractibles.



165

Après ces extractions, les résidus liés non extractibles ont été quantifiés après séchage de l’écorce de

pin de chacun des biomètres (80°C pendant 12h), par combustion d’une aliquote représentative

d’environ 150 mg d’écorce dans un Oxidizer Packard modèle A307.

Les échantillons d’écorce sont placés dans un cône en papier avec une pointe de cellulose en poudre

pour faciliter la combustion ; le tout est recouvert d’un second cône en papier et placé sur une

résistance chauffante dans l’Oxidizer.

La combustion est effectuée durant 2 minutes sous courant d’oxygène dans un four à 800°C. Les

combustions ont été réalisées en triplicats.

Le 14CO2 libéré par la combustion de l’écorce contenant les résidus liés radioactifs est retenu dans

une colonne contenant un adsorbant chimique (Carbosorb) puis élué au liquide à scintillation dans

une fiole à scintillation. La radioactivité est directement quantifiée au compteur à scintillation.

L’étalonnage de l’appareil est réalisé à l’aide d’une solution radioactive d’atrazine de concentration

connue. Un volume précis (10µL) de solution est déposé sur la poudre de cellulose dans un cône en

papier, puis brûlé dans l’Oxidizer pendant 2 minutes. L’étalonnage est réalisé en triplicats.

V.1.1.3 Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du traitement combiné

Le devenir de l’écorce issue de la première phase des essais en batch (contenant des traces

d’atrazine résiduelle et/ou de métabolites, ainsi que divers résidus et des micro-organismes) a été

suivi sur 7 mois. En effet, l’écorce après traitement devient un sous produit du traitement et il convient

de caractériser son évolution en vu d’une valorisation éventuelle.

L’évolution du « déchet-écorce » a été étudiée sur l’écorce débarrassée ou non de la plupart du milieu

liquide dans lequel elle se trouvait (essais en microcosme et essais en milieu liquide, ratio

L/S=20 mL.g-1). Pour cela, les réplicats B et C ont été utilisés (voir Figure 45).

La minéralisation de l’atrazine ou de ses résidus a été suivie par capture du CO2 dans les pièges à

soude. Après 7 mois d’incubation à température ambiante, des extractions et combustions selon les

protocoles décrits ci-dessus ont permis de quantifier respectivement les résidus d’atrazine non liés et

les résidus liés. L’analyse des solutions dans le cas des essais en milieu liquide (L/S 20 mL.g-1) a

permis d’établir un bilan de la radioactivité et d’étudier l’évolution du « Déchet-Ecorce ».



166

V.1.2 Essais en colonnes

Les essais en colonnes représentent la mise en œuvre du traitement combiné sous forme d’une

« Biofiltration ».

La biofiltration est réalisée par circulation de la solution polluée en atrazine à travers le filtre d’écorce

de pin en poudre dans lequel Pseudomonas ADP sp. a été inoculée et s’est développée sous forme

d’un biofilm.

Dans un premier temps, la capacité de Pseudomonas ADP sp. à former un biofilm à la surface de

l’écorce de pin a été étudiée.

Dans un deuxième temps, la circulation d’une solution polluée en atrazine dans différentes conditions

(flux, différents âges de biofilm, conditions biotiques ou abiotiques, concentrations initiales en atrazine

différentes) a été mise en œuvre.

V.1.2.1 Choix des paramètres

Les colonnes ont été préparées comme présenté au § II.1.2.3.1 avec 10 g d’écorce de pin (particules

d<200 µm) préalablement stérilisée ou non (hauteur du lit environ 7 cm ; diamètre de colonne 2,5 cm)

et ont subi les prétraitements décrits au § II.1.2.2 II.1.2.2.2 (saturation en eau, vérification de

l’homogénéité de la colonne par injection de KCl), avant inoculation de Pseudomonas ADP sp. et

circulation en circuit ouvert (pas de recirculation) de la solution polluée en atrazine (voir procédé ci-

après).

Différents paramètres ont été testés lors des essais de biofiltration :

- Si l’on se réfère à l’étude bibliographique (II.6.3.4) on peut noter qu’à priori, plus la

vitesse de circulation du fluide à travers le support d’adsorption sera faible (dans

une certaine limite permettant d’assurer une oxygénation correcte), meilleur sera le

développement du biofilm. En revanche, les faibles vitesses vont favoriser la

formation d’un biofilm fermé donc peu accessible aux nutriments et à l’oxygène

nécessaire pour la survie des bactéries en question.

Le temps de séjour de l’atrazine dans la colonne doit également être suffisamment

long pour pouvoir permettre la biodégradation. Un compromis doit donc être trouvé et

pour cette raison, deux vitesses de circulation de la solution à traiter à travers les

colonnes ont été testées : 1 mL.min-1 et 0,3 mL-1, correspondant à des temps de

séjour d’environ 20 et 67 minutes respectivement dans la colonne utilisée en circuit

ouvert.

D’autre part, toujours en référence à l’étude bibliographique, l’écorce de pin en

poudre, avec un masse volumique de 450 kg.m3 environ (équivalent à un compost)

constitue un bon support de biofiltration. Un indice de vide (ε) compris entre 0,6 et 0,7



167

est conseillé pour les biofiltre (Martin et al., 1993). De plus, une capacité en eau

comprise entre 40 et 80% (massique) est convenable quand le support est saturé

(Ottengraf 1986 ; Devinny 1999) ; c’est le cas pour l’écorce de pin en poudre.

- Différentes concentrations initiales en atrazine de la solution à traiter ont été

testées. Des essais à 0,2 mg.L-1 ont été suivis par analyse HPLC (au dessus de la

limite de détection de 0,03 mg.L-1). Cette concentration correspond bien sûr à une

pollution massive, et nous a permis de tester l’efficacité de la biofiltration dans des

conditions extrêmes. D’autres essais ont été réalisés à une concentration initiale de

2,34 µg.L-1, correspondant à une pollution courante d’eaux naturelles, et suivis par

dosages immuno-essai (II.1.1.1.2(b)) couvrant une gamme de concentrations de 0,1 à

3 µg.L-1. Ces essais ont été en nombre limités à cause du coût de ces analyses.

- Les essais en colonnes ont été effectués à une température de 20 ± 2°C,

correspondant à une température ambiante moyenne ; les essais de biodégradation

de l’atrazine en milieu liquide ayant prouvé que Pseudomonas ADP sp. était capable

de minéraliser l’atrazine jusqu’à 12°C.

- Afin de se rapprocher de conditions réelles de traitement d’eaux naturelles polluées,

la solution d’atrazine à traiter à été préparée dans l’eau du robinet, qui apporte aux

micro-organismes des nutriments divers.

- Les essais ont été réalisés avec de l’écorce de pin préalablement stérilisée ou non

afin d’évaluer l’influence de l’activité de la flore indigène de l’écorce de pin sur

l’efficacité du procédé de biofiltration.

V.1.2.2 Inoculation et caractérisation du biofilm et de l’hydrodynamique des colonnes

V.1.2.2.1 Observation au MEB des micro-organismes sur l’écorce de pin

L’étude du développement d’un biofilm sur les particules d’écorce dans les colonnes a été réalisée de

façon qualitative, par observation au Microscope Electronique à Balayage selon les méthodes décrites

ci-dessous.

Les observations au MEB ont été réalisées au Centre Technologique des Microstructures de

l’Université Claude Bernard – Lyon 1. Ces observations ont permis de déterminer un temps idéal de

mise en contact avec les bactéries, pour l’obtention de la fixation des cellules ou la formation d’un

biofilm à sa surface. L’effet de la flore indigène de l’écorce de pin sur le développement d’un biofilm de

Pseudomonas ADP sp. a également pu être observé qualitativement par cette technique.



168

(a) Inoculation des colonnes

Une culture de Pseudomonas ADP sp. en phase exponentielle de croissance, cultivée 20h à 30°C en

milieu minéral (MM) additionné de 1g.L-1 de glucose et 1g.L-1 de sulfate d’ammonium, est injectée en

circuit fermé à travers les colonnes d’écorce stérilisées ou non, pendant 2 ou 6 jours. Des nutriments

et cellules fraîches issues de cultures quotidiennes sont additionnés tous les jours à la culture initiale.

A la fin de la circulation, les colonnes sont rincées à l’eau du robinet (stérile) avec un volume de 50Vo

(débit 1 mL.min-1).

(b) Traitement des échantillons pour observation au MEB

Les lits d’écorce de pin contenus dans les colonnes sont alors récupérés et des prélèvements de

quelques milligrammes d’écorce sont réalisés au niveau de l’entrée et du centre de la colonne (photos

Figure 47).

Figure 47 : Lits d’écorce de pin issus des colonnes après inoculation de Pseudomonas ADP sp. pendant 2 ou 6 jours ; prélèvements pour analyses au MEB

Les prélèvements d’écorce sont ensuite traités pour l’observation au MEB selon le protocole décrit ci-

dessous.

La préparation des échantillons pour l’observation de cellules à la surface d’un support demande un

travail particulier différent ce celui effectué pour l’observation de la structure du support brut. Elle se

déroule en 4 étapes principales :

• Fixation des cellules sur le support : l’échantillon solide à observer est plongé pendant

60 minutes dans une solution (50/50, V/V) glutaraldéhyde 4% / tampon (cacodylate de sodium 0,2

M, pH 7).

• Rinçage : l’échantillon est ensuite rincé dans 3 bains successifs de 10 minutes, dans une solution

de tampon de cacodylate 0,2 M.



169

• Post-fixation : le tampon de rinçage est remplacé par une solution de tétroxyde d’osmium

tamponnée (OsO4 1% final dans une solution de cacodylate de sodium 0,1 M final). La post-

fixation s’effectue pendant 30 minutes, puis l’échantillon est rincé à l’eau distillée.

• Déshydratation progressive : l’échantillon est déshydraté après fixation, dans des bains

successifs d’éthanol à 30%, 50%, 70%, 80% et 95%, de 10 minutes chacun. Puis 3 bains de

10 minutes dans l’éthanol 100% sont réalisés. La déshydratation est finalement terminée par 1

bain de 10 minutes dans un mélange éthanol 100% / HMDS (50/50 ; V/V), et 3 bains de 10

minutes dans le HMDS (hexaméthyldisilazane) pur. Le dernier bain de HMDS est évaporé sous

hôte.

L’échantillon sec est ensuite déposé sur un porte objet et métallisé à l’or-palladium à l’aide d’un

pulvérisateur cathodique Hummer II Technics.

L’observation des échantillons a ensuite été réalisée au microscope électronique à balayage S800

Hitachi, 15 kV.

V.1.2.2.2 Influence des micro-organismes sur le comportement hydrodynamique des colonnes

D’autre part, l’influence du développement bactérien dans les colonnes sur l’hydrodynamique du

système a été étudiée à l’aide du traceur KCl comme décrit au chapitre (II.1.2.2.2). Ces tests

hydrodynamiques ont été réalisés avant et après inoculation de Pseudomonas ADP sp. (2 ou 6 jours)

à travers les colonnes d’écorce de pin (préalablement stérilisée ou non).

La Figure 48 résume le protocole utilisé pour ces expériences :

1. Une injection de KCl est réalisée avant inoculation de Pseudomonas ADP sp., pour

caractériser le comportement hydrodynamique initial de chaque colonne.

2. Une culture de Pseudomonas ADP sp. est circulée en circuit fermée comme décrit plus haut

pendant 2 ou 6 jours.

3. Une nouvelle injection de KCl après inoculation (2 ou 6 jours) de Pseudomonas ADP sp. dans

les colonnes d’écorce de pin permet de conclure sur l’influence du biofilm sur le

comportement hydrodynamique des colonnes.



170

Figure 48 : Montage expérimental : Hydrodynamique des colonnes avant et après inoculation avec Pseudomonas ADP sp.

V.1.2.3 Protocole expérimental des essais de biofiltration

La durée de développement du biofilm a été fixée à 6 jours grâce aux expériences précédentes et

deux vitesses de circulation de la solution à travers les colonnes ont été testées : 1 mL.min-1 et

0,3 mL.min-1. Des colonnes d’écorce de pin stérilisée et non stérilisée ont été testées en parallèle afin

d’évaluer l’influence de la flore indigène sur l’efficacité du traitement.

Cellule de conductivité

Pompe peristaltique

Flux ascendant 1 ml/min

2

1-3

Pseudomonas ADP sp. Culture en MM

(1g/l sulfate d’ammonium; 1g/l glucose) Aération par

barbotage

C

Analyseur CONSORT C832

Ordinateur

Traitement des données

2

Solution KCl (1g/l)

1-3



171

Protocole expériental (voir Figure 48) :

1. Les colonnes d’écorce de pin sont saturées en eau par circulation ascendante en circuit fermé

d’eau du robinet stérile.

2. Un traçage au KCl est réalisé afin de caractériser l’écoulement des solutions à travers les

colonnes.

3. Après rinçage à l’eau du robinet stérile, une culture de Pseudomonas ADP sp. est circulée

(débit = 1 mL.min-1) pendant 6 jours avec apport régulier de nutriments et de cellules fraîches,

en circuit fermé, avec aération de la culture par barbotage. Des échantillons sont prélevés

régulièrement afin de suivre l’évolution de la teneur en carbone (analyse COT) de la culture

cellulaire (la consommation de carbone étant signe d’activité biologique).

4. Un volume de 50 volumes de pore (V0) d’eau du robinet stérile est ensuite circulée afin

d’éliminer les nutriments et notamment l’azote apporté par la culture de Pseudomonas ADP

sp.

5. La solution polluée en atrazine est injectée (flux = 1 ou 0,3 mL.min-1 environ) à travers la

colonne jusqu’à obtention d’un plateau de concentration en atrazine en sortie de colonne.

6. L’effluent est collecté en sortie de colonne par un collecteur de fractions et les fractions sont

analysées par HPLC (essais avec [atrazine]i= 200 µg.L-1) ou par test immuno-essai (essais

avec [atrazine]i= 2,34 µg.L-1).

Les expériences en colonnes sont réalisées en chambre thermostatée à 20 ± 2 °C.

Aucun réplicat n’a pu être réalisé, le nombre de colonnes disponibles étant limité à 4 et la durée des

expériences étant de 15 jours environ.

La Figure 48 représente le montage utilisé pour les essais de biofiltration en colonne.



172

Figure 49 : Montage expérimental pour les essais en colonne de traitement combiné d’une solution polluée à l’atrazine après inoculation des colonnes avec Pseudomonas ADP sp. pendant 6 jours.

Pompe peristaltique

Flux ascendant 1ml/min – 0,3 ml/min

3

5

Pseudomonas ADP sp. Culture en MM

Aération par barbotage

6j

3

C/Co

V/Vo

HPLC

Collecteur de fractions

Sol. Atrazine 200µg.L-1 – 2,3 µg.L-1 5

Immuno-essais

H2O 2-4

6

RESULTATS ET DISCUSSION Etude du traitement combiné


173

V.2 Résultats et discussion

V.2.1 Etude du traitement combiné en batch

Cette étude à permis d’évaluer l’efficacité du traitement combiné en essais batch par quantification de

la minéralisation de l’atrazine en biomètre en présence de Pseudomonas ADP sp. inoculé dans un

milieu contenant de l’écorce de pin en poudre, débarrassée ou non de sa microflore indigène.

D’autre part, en fin d’expérience, la répartition de la radioactivité dans les différents compartiments

(gaz, liquide, solide) a été étudiée.

Enfin, une étude à long terme sur 7 mois a permis de déterminer le comportement du « déchet-

écorce » à l’issue du traitement et notamment son évolution quant au devenir de la radioactivité

résiduelle présente dans l’écorce après traitement.

V.2.1.1 Minéralisation de l’atrazine en présence d’écorce de pin

Des essais ont été menés en parallèle, en milieu minéral MM contenant ou non de l’écorce de pin

stérile ou non stérile), afin de quantifier l’effet de la présence d’écorce de pin sur la minéralisation de

l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. à faible (44,2 µg.L-1) et à forte (20 mg.L-1) concentration initiale

en atrazine.

Les essais ont été réalisés à température ambiante (20 ± 2°C) dans des biomètres équipés d’un piège

à soude, selon le protocole présenté au § V.1.1.1.

Les Figure 50 et Figure 51 présentent les résultats de minéralisation aux deux concentrations initiales

en atrazine testées.

Ces figures reprennent quelques courbes présentées dans les paragraphes précédents ; elles sont à

nouveau présentées ici pour permettre d’établir un bilan global comparatif sur la minéralisation de


Le Tableau 17 résume les résultats de ces expériences, après incubation de Pseudomonas ADP sp.

pendant 320h dans les différents milieux étudiés.



174

Figure 50 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM- Glucose 1,25 g.L-1), en présence ou non d’écorce en poudre (d<200 µm) stérile ou non stérile (ratio L/S =20) ou en

extrait aqueux stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation lente au barreau aimenté ; Concentration initiale en atrazine 44,2 µg.L-1. Les témoins ne reçoivent pas Pseudomonas ADP sp.

Figure 51 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM- Glucose 1,25 g.L-1), en présence ou non d’écorce en poudre (d<200 µm) stérile ou non stérile (ratio L/S =20) ou en

extrait aqueux stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation lente au barreau aimenté ; Concentration initiale en atrazine 20 mg.L-1. Les témoins ne reçoivent pas Pseudomonas ADP sp.

En absence de particules solides d’écorce de pin, on constate que la minéralisation de l’atrazine

atteint environ 70% en milieu minéral ou en extrait aqueux stérile d’écorce de pin, aussi bien à forte

(20 mg.L-1) qu’à faible (44,2 µg.L-1) concentration en atrazine, avec des vitesses initiales moyennes

[Atrazine ]i=44,2 µg/L

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 50 100 150 200 250 300 350Temps (h)

% A

traz

ine

min

eral

isée

MM

Extrait Aqueux d'Ecorce

MM + Ecorce stérile

MM + Ecorce non stérile

Témoin st. MM + Ecorce non stérile

Témoin st. MM + Ecorce stérile

[Atrazine]i=20 mg/L

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 50 100 150 200 250 300 350

Temps (h)

% A

traz

ine

min

eral

isée

Extrait Aqueux d'Ecorce

MM

MM + Ecorce non stérile

MM + Ecorce stérile

Témoin st. Ecorce non stérile

Témoin st. Ecorce stérile



175

dégradation de l’ordre de 0,54 mg.L-1.h-1 et 1,3 µg.L-1.h-1 respectivement sur les 24 premières heures

d’incubation. Il existe donc une relation proportionnelle entre concentration initiale en atrazine et

vitesse moyenne de minéralisation dans les deux milieux liquides.

La présence des composés solubles de l’écorce de pin (extrait aqueux d’écorce de pin) n’entraîne

aucun retard de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. que ce soit à faible ou à forte

concentration initiale en atrazine.

La présence de particules d’écorce de pin stérile dans le milieu réduit le taux de minéralisation

d’environ 30% et 50% (respectivement à faible et forte concentration initiale en atrazine) indiquant que

l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce la rend moins disponible pour Pseudomonas ADP sp., et que ce

phénomène a une incidence relative d’autant plus grande que la concentration initiale en atrazine est

élevée (peut être à cause de la diffusion intraparticulaire de l’atrazine).

Pour une concentration initiale en atrazine de 44,2 µg.L-1, 50,5 ± 4,0 % de l’atrazine est minéralisée en

présence d’écorce de pin stérile contre 47,1 ± 1,9 % en présence d’écorce contenant sa microflore

indigène. Cette différence n’est pas significative au regard des déviations standard sur les résultats

(Figure 51).

A forte concentration initiale, 36,5 ± 1,3 % de l’atrazine sont minéralisés en 320h en présence

d’écorce stérile contre 54 ± 0,6 % en présence d’écorce non stérile. La microflore de l’écorce

augmente donc significativement le taux de minéralisation pour de fortes concentrations en atrazine,

contrairement au phénomène observé plus haut (à faible concentration). Dans les deux cas (faible et

forte concentrations initiales en atrazine) la flore indigène de l’écorce de pin présente une activité de

minéralisation significative : 12 à 14% de l’atrazine sont minéralisés par la microflore indigène de

l’écorce seule (Ecorce non stérile + MM) non inoculée par Pseudomonas ADP sp., respectivement à

forte et à faible concentration initiale en atrazine.

On peut penser qu’à faible concentration (44,2 µg.L-1), l’atrazine est adsorbée principalement à la

surface des particules, la laissant accessible à Pseudomonas ADP sp. dont les cellules sont

essentiellement à la surface des grains d’écorce. A plus forte concentration (20 mg.L-1), l’atrazine

pourrait pénétrer plus profondément à l’intérieur des pores de l’écorce de pin par diffusion entraînant

ainsi une diminution de la disponibilité de l’atrazine vis à vis de Pseudomonas ADP sp. La présence

de la microflore indigène dans la porosité intraparticulaire pourrait alors expliquer le taux plus élevé de

minéralisation observé avec l’écorce non stérile par rapport à l’écorce stérile.



176

Tableau 17 : Taux de minéralisation d’atrazine (en %) en 320h d’incubation de Pseudomonas ADP sp. en biomètre à 20 °C avec [atrazine]i= 44,2 µg.L-1 ou 20 mg.L-1 (st.=stérile)

En conclusion, la présence de particules d’écorce dans le milieu réduit notablement le taux de

minéralisation, par effet d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce, diminuant la disponibilité de celle-ci

pour Pseudomonas ADP sp. Cependant, à forte concentration en atrazine, la contribution de la flore

indigène, probablement rendue possible par la diffusion intraparticulaire de l’atrazine, compense en

partie la baisse du rendement de minéralisation.

V.2.1.2 Analyses des composés radioactifs en solution en cours d’incubation

La répartition de la radioactivité en solution entre les différents composés (atrazine ou métabolites de

dégradation) a été suivie en cours d’incubation dans les essais en milieu minéral et en extrait aqueux

d’écorce de pin. Le suivi dans les essais contenant l’écorce de pin a malheureusement posé des

problèmes au niveau des analyses HPLC, dus sans doute à une concentration trop élevée des

composés organiques provenant de l’écorce de pin et par conséquent rendant les résultats

inexploitables.

Témoins non inoculés : La Figure 52 montre que dans les témoins non inoculés avec Pseudomonas ADP sp., seulement 80%

de la radioctivité initialement apportée au milieu sont retrouvés sous forme d’atrazine. Cette

observation indique qu’il existe des réactions ou transformations chimiques spontanées (qui ne sont

pas de la minéralisation) lorsque l’atrazine est additionnée aux milieux aqueux. A faible concentration

initiale, l’atrazine est toujours présente au bout de 312 h dans les essais en milieu minéral. Les

composés intermédiaires de dégradation DEDIA, DIA, OHDEA et OHA sont présents dans de faibles

proportions relativement constantes tout au long des expériences. Dans l’extrait aqueux d’écorce, les

témoins non inoculés contiennent également 80% d’atrazine et les autres constituants sont la DEDIA,

DEA, OHDEA et OHA.

A forte concentration (Figure 53), l’atrazine est dégradée après 192 h d’incubation traduisant une

contamination du témoin en milieu minéral (MM). Le principal métabolite retrouvé est le DIA.

Dans l’extrait, malgré les problèmes techniques survenus au cours des analyses HPLC et nous faisant

perdre les résultats pour les temps 20 et 48h, on peut noter que la radioactivité en solution est

présente sous forme d’atrazine à 80 % jusqu’à la fin de l’incubation. L’atrazine en solution se dissocie

en différents métabolites ; on retrouve ainsi les composés DEDIA, OHDIA, DIA et OHDEA.

[Atrazine]i MM Extrait Ecorce st. Ecorce non st. Tém. Ecorce st. Tém. Ecorce non st.44,2 µg.L-1 70,5 ± 9,0 65,8 ± 7,6 50,5 ± 4,2 47,1 ± 2,0 0,10 ± 0,01 14,4 ± 1,4

20 mg.L-1 72,1 ± 1,3 71,7 ± 0,7 36,5 ± 1,3 54 ± 0,6 0,10 ± 0,01 11,7 ± 3,5



177

Essais inoculés : Dans les essais inoculés (MM et extrait), l’atrazine est totalement dégradée après 48 h d’incubation

quelque soit la concentration initiale d’atrazine testée (Figure 52 et Figure 53). Les métabolites de

dégradation sont principalement présents sous forme de DEDIA et OHA (premiers métabolites de

dégradation de l’atrazine), puis, après 300 h d’incubation l’OHA devient majoritaire dans le milieu MM.

On remarque que certains composés intermédiaires comme la DEDIA sont présents de façon

représentative en solution ; pourtant celui-ci ne figure pas comme métabolite intermédiaire du

mécanisme de minéralisation décrit pas Martinez et al. (2001) (voir Figure 13 du chapitre Etude

Bibliographique). Il en est de même pour les composés tels que l’OHDIA ou la OHDEA. En fait, les

analyses montrent que l’aire des pics correspondants à ces composés reste globalement équivalente

au cours du temps. La distribution augmente donc puisqu’il y a minéralisation de l’atrazine mais les

composés initialement présents dans le milieu comme la DEDIA prennent une proportion en

conséquence plus importante puisqu’ils ne sont pas dégradés. On notera à ce propos qu’aucune

enzyme chez Pseudomonas ADP sp. n’a été décrite comme étant capable de dégrader ces

métabolites.

Figure 52 : Distribution de la radioactivité en solution dans les essais de minéralisation ([atrazine]i=44,2µg.L-1 ) en milieu minéral (MM) et en extrait stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation

lente au barreau aimenté ; incubation 15 jours

MM

0%

20%

40%

60%

80%

100%

20 48 144 216 312Temps (h)

Autres% OHA% OHDEA% OHDIA% DEA% DIAND% DEDIA% A

Témoin MM

0%20%40%60%80%

100%

0 20 48 144 216 312Temps (h)

Autres% OHA% OHDEA% OHDIA% DEA% DIA% DEDIA% A

Témoin Extrait

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 20 48 216 312Temps (h)


Extrait

0%

20%

40%

60%

80%

100%

20 48 144 216 312Temps (h)

Autres% OHA% OHDEA% OHDIA% DEA% DIAND% DEDIA% A



178

Figure 53 : Distribution de la radioactivité en solution dans les essais de minéralisation ([atrazine]i=20 mg.L-1 ) en milieu minéral (MM) et en extrait stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation lente au barreau

aimenté ; incubation 15 jours

Avec,

- OHA : 2-hydroxy-atrazine

- OHDEA: Deséthyl-2-hydroxy-atrazine

- OHDIA: Desisopropyl-2-hydroxy-atrazine

- DEA: Deséthyl-atrazine

- DIA: Desisopropyl-atrazine

- DEDIA: deséthyl-desisopropyl-atrazine

En conclusion, on note que l’atrazine est transformée même lorsque Pseudomonas ADP sp. n’est pas

inoculée et que l’atrazine se trouve en milieu stérile ; l’atrazine dans les témoins stériles ne représente

que 80% de la radioactivité totale.

D’autre part, on retrouve beaucoup plus de métabolites intermédiaires de dégradation à faible

concentration qu’à forte concentration initiale en atrazine.

De plus, la différence principale observée entre la dégradation de l’atrazine en milieu minéral et en

extrait aqueux d’écorce de pin est la présence d’OHDEA comme métabolite de dégradation en milieu

MM, absent dans les essais en extrait d’écorce de pin.

Beaucoup d’intermédiaires de dégradation de l’atrazine sont présents, qui ne figurent pas dans le

schéma de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. décrit par Martinez et al. (2001).

Témoin MM

0%

20%

40%

60%

80%

100%

20 48 192 432Temps (h)

% OHA% OHDEA% DEA% DIA% DEDIA% A

Témoin Extrait

0%

20%

40%

60%

80%

100%

20 48 144 432Temps (h)

% OHA% OHDEA% OHDIA% DEA% DIA% DEDIA% A

MM

0%

20%

40%

60%

80%

100%

48 144 192 432Temps (h)


Extrait

0%

20%

40%

60%

80%

100%

20 144 192 432Temps (h)




179

Une étude quantitative serait donc nécessaire pour décrire en détail le mécanisme de dégradation

dans les conditions de notre étude (Milieu minéral ou extrait aqueux d’écorce de pin).

V.2.1.3 Répartition de la radioactivité résiduelle en fin de traitement

Au bout de 15 jours de traitement en biomètre et de suivi de la minéralisation, des extractions au

CaCl2 (0,1 M) et au méthanol ont été réalisées sur les essais contenant l’écorce stérile ou non stérile

afin de quantifier la radioactivité résiduelle (protocole § V.1.1.2). Les résidus radioactifs non

extractibles ont été quantifiés après extraction par combustion de l’écorce et les résidus en solution

ont été analysés par HPLC.

Pour les deux concentrations en atrazine étudiées (44,2 µg.L-1 et 20 mg.L-1) la répartition de la

radioactivité dans les différents compartiments du biomètre (phase gazeuse, phase liquide et phase

solide) est présentée sur les Figure 54 et Figure 55.

Dans les essais « liquides », en milieu minéral (MM) et extrait aqueux d’écorce de pin, la part de

résidus non extractibles représente la radioactivité retrouvée après filtration des solutions et

combustion des filtres supportant les cellules présentes dans les milieux à la fin des expériences

(t = 350 h ou 15 jours).

Les résultats montrent que le bilan de radioactivité totale se clôture à plus de 80% ce qui est un bon

résultat de restitution.

Figure 54 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu minéral (MM-Glucose), extrait aqueux d’écorce de pin, en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d<200 µm) stérile (E st.) ou non stérile (E non st.) après

350 h d’incubation à 20 ± 2 °C ; concentration initiale en atrazine = 44,2 µg.L-1 ; agitation lente

[Atrazine]i= 44,2 µg.L-1

0%

20%

40%

60%

80%

100%

MM ExtraitE

E st. E nonst.

Tém. Est.

Tém. Enon st.

Bila

n m

atiè

re AutresRésidus liésRésidus extractiblesEn solutionMinéralisation



180

Figure 55 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu minéral (MM-Glucose), extrait aqueux d’écorce de pin, en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d<200 µm) stérile (E st.) ou non stérile (E non st.) après

350 h d’incubation à 20 ± 2 °C ; concentration initiale en atrazine = 20 mg.L-1 ; agitation lente

Dans les deux séries d’essais (atrazine = 44,2 µg.L-1 ou 20 mg.L-1), la radioactivité résiduelle en

solution représente entre 8 et 11% de la radioactivité totale lorsque l’écorce n’est pas présente dans le

milieu. En présence de particules d’écorce de pin, environ 1% seulement de la radioactivité est

retrouvée en solution après 350 h d’incubation. Lorsque Pseudomonas ADP sp. n’est pas inoculé au

milieu contenant l’écorce de pin (« Témoins »), la radioactivité en solution est supérieure à celle

observée en présence de Pseudomonas ADP sp. soulignant son rôle prépondérant dans la

minéralisation. Environ 2% de la radioactivité est retrouvée en solution dans les témoins « Ecorce non

stérile » et environ 6 à 8% dans les témoins non inoculés « Ecorce stérile », indiquant que la

microflore indigène de l’écorce participe également à la minéralisation de l’atrazine en solution.

C’est résultats concordent avec les isothermes d’adsorption en batch ; dans les témoins stériles

(20 mg.L-1), 8% de l’atrazine initialement présente est retrouvée en solution après 350 h d’incubation,

soit une concentration à l’équilibre de Ce = 1,6 mg.L-1. Si l’on se réfère aux isothermes d’adsorption

obtenues par exemple Figure 15, pour le ratio L/S=20 mg.g-1, la quantité d’atrazine adsorbée q pour

cette concentration à l’équilibre est environ 0,3 mg.g-1. Pour une quantité de 2,5g d’écorce dans 50 ml

de milieu liquide cette quantité d’atrazine adsorbée (0,3 mg.g-1) représente 75 % de l’atrazine

initialement additionnée au milieu MM. Dans nos essais on retrouve 80% de résidus liés à l’écorce de

pin.

A faible concentration en atrazine, dans les essais « E st. » et « E non st. » inoculés avec

Pseudomonas ADP sp., 26% à 38% de la radioactivité est retrouvée sur l’écorce de pin (stérile et non

stérile respectivement) dont seulement 1% représente la fraction extractible. Même bilan à forte

concentration en atrazine, où la fraction extractible représente environ 1,5% de la radioactivité totale

[Atrazine]i= 20g.mL-1

0%

20%

40%

60%

80%

100%

MM Extrait E st. E non st. Tém st. Tém nonst.

Bila

n m

atiè

re

AutresRésidus liésRésidus extractiblesEn solutionMinéralisation



181

sur les 22 à 38% de radioactivité résiduelle retrouvée dans l’écorce dans les essais inoculés avec

Pseudomonas ADP sp.

Dans les essais non inoculés (« Témoin Ecorce non stérile » et « Témoin écorce stérile »), la

radioactivité non extractible retrouvée dans l’écorce représente respectivement entre 74 et 92% de la

radioactivité totale en fin d’expérience à faible concentration et entre 63 et 81% pour les essais à forte

concentration. On note ainsi, qu’en présence de la microflore de l’écorce de pin, le taux d’atrazine (ou

autres résidus radioactifs) retenue sur l’écorce est moindre par rapport au taux observé en absence

de cette microflore. D’autre part, la présence de Pseudomonas ADP sp. dans le milieu réduit de plus

de la moitié le pourcentage de radioactivité résiduelle retrouvée sur l’écorce de pin.

Ces résultats montrent que l’atrazine (ou ses métabolites de dégradation) est globalement très

difficilement extractible, rendant difficile sa disponibilité et donc sa consommation par les micro-

organismes. Après 15 jours d’incubation, une fraction importante est fortement liée à l’écorce (Figure

54 et Figure 55) et le taux de minéralisation n’évolue plus.

V.2.1.4 Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du traitement

Le devenir de l’écorce en tant que déchet à l’issue du traitement combiné réalisé plus haut à été

étudié sur une durée de 7 mois par suivi de la minéralisation (dégagement de 14CO2) puis combustion

des écorces en fin d’expérience. Les essais ont été réalisés dans des biomètres, tels qu’utilisés ci-

dessus, en présence de milieu liquide (MM, ratio L/S=20 mL.g-1) et sur l’écorce humide issue des

essais précédents. Le protocole de ces essais est détaillé au § V.1.1.3.

Les Figure 57 et Figure 58 présentent les résultats obtenus en milieu liquide et en microcosme,

respectivement, pour une concentration initiale en atrazine de 20 mg.L-1 et 44,2 µg.L-1. Il s’agit de

résultats cumulés avec ceux obtenus à t=350 h. Ces résultats sont également présentés sous fome de

tableau récapitulatif (Tableau 18).

Globalement, on remarque que l’évolution de la radioactivité dans les biomètres, que ce soit en

microcosme ou en milieu liquide, est similaire au bilan établi après 350 h d’incubation (Figure 56) ; la

Figure est de nouveau présentée ici pour faciliter la comparaison entre le bilan à 15 jours et le bilan à

7 mois. Le processus d’évolution est donc très lent dans les conditions expérimentales traduisant une

bonne stabilité du matériau.



182

Figure 56 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de minéralisation par Pseudomonas ADP sp., après 15 jours d’incubation à 20 ± 2 °C ; [atrazine]i = 44,2 µg.L-1

(Figure de Gauche) et [atrazine]i = 20 mg.L-1 (Figure de Droite)

A forte concentration initiale en atrazine (20 mg.L-1) on observe que 2 à 3% supplémentaires

d’atrazine (par rapport au bilan établi après 350 h) sont minéralisés dans les témoins non inoculés

avec Pseudomonas ADP sp. contenant l’écorce stérile, traduisant sans doute une contamination du

milieu par des micro-organismes extérieurs.

Figure 57 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d<200 µm) stérile

(Ec st.) ou non stérile (Ec non st.) 7 mois d’incubation à 20 ± 2 °C ; [atrazine]i = 20 mg.L-1

A faible concentration en atrazine (44,2 µg.L-1), la Figure 58 montre également que la minéralisation

n’a pas évolué pendant les 7 mois d’incubation supplémentaires (par rapport à la Figure 56) dans les

biomètres inoculés avec Pseudomonas ADP sp. que ce soit en milieu liquide ou en microcosme. En

Evolution en milieu liquide L/S=20à 7 mois

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ec st. Ec nonst.

Tém. Ecst.

Tém. Ecnon st.

Bila

n m

atiè

re AutresRésidus liésRésidus extractiblesEn solutionMineralisation

Evolution en microcosmeà 7 mois

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ec st. Ec non st. Tém. Ecst.

Tém. Ecnon st.

Bila

n m

atiè

re

Après 7 mois supplémentaires en

milieu liquide L/S=20


microcosme

[Atrazine]i= 20g.mL-1

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ec st. Ec non st. Tém st. Tém non st.

Bila

n m

atiè

re

Autres

Résidus liésRésidus extractibles

En solution

Minéralisation

[Atrazine]i= 44,2 µg.L-1

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ec st. Ec non st. Tém. E st. Tém. E non st.

Bila

n m

atiè

re

Après 15 jours en milieu liquide L/S=20



183

revanche, les Témoins non inoculés contenant initialement l’écorce stérile ou l’écorce non stérile

continuent d’évoluer et des valeurs de minéralisation de 2 à 7% (Ecorce stérile) et 14 à 18% (Ecorce

non stérile) sont observés au bout de 7 mois d’incubation, avec une minéralisation un peu plus

importante en microcosme. La minéralisation observée dans les témoins d’écorce stérile non inoculés

est attribuée à une contamination microbienne survenue en cours d’incubation après les 15 premiers

jours d’incubation.

Figure 58 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d<200 µm) stérile

(Ec st.) ou non stérile (Ec non st.) 7 mois d’incubation à 20 ± 2 °C ; [atrazine]i = 44,2 µg.L-1

Dans les essais en milieu liquide (L/S = 20), on ne retrouve plus que de très légères traces de

radioactivité en solution. Pour les essais en microcosmes, la part de radioactivité en solution

correspond à la radioactivité présente à 350h, avant élimination de cette fraction liquide.

Tableau 18 : % de résidus liés à l’écorce de pin après 15 jours ou 7 mois d’incubation par rapport à la radioactivité retrouvée dans l’écorce

D’une manière générale, l’évolution de la radioactivité dans les microcosmes et en milieu liquide

(L/S = 20 mg.L-1) est similaire. Le matériau est donc stable dans les deux conditions testées. Par

Evolution en milieu liquide L/S=20à 7 mois

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ec st. Ec nonst.

Tém Ecst.

Tém Ecnon st.

Bila

n m

atiè

re

AutresRésidus liésRésidus extractiblesEn solutionMineralisation

Evolution en microcosmeà 7 mois

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ec st. Ec nonst.

Tém Ecst.

Tém Ecnon st.

Bila

n m

atiè

re


milieu liquide L/S=20


microcosme

Après 15 jours d'incubation Après 7 mois d'inubation [atrazine]i=44,2µg/L [atrazine]i=20mg/L [atrazine]i=44,2µg/L [atrazine]i=20µg/L

Ec st. 95,7 96,9 95,2 92,4 Ec non st. 97,0 92,9 91,4 79,2 Tém Ec st. 96,1 94,1 98,3 95,2

% Résidus liés restant sur l'écorce

Tém Ec non st. 96,6 95,5 93,5 92,6 Ec st. 24,5 37,0 26,2 22,2 Ec non st. 37,5 20,1 42,2 17,0 Tém Ec st. 92,2 81,0 90,9 74,8

% Résidus liés par rapport à la radioactivité initiale

Tém Ec non st. 73,9 63,5 91,8 65,3



184

rapport au bilan établi à 350h d’incubation (Tableau 18), on note un taux de résidus liés légèrement

supérieur dans les essais à faible concentration initiale en atrazine. Dans les essais contenant

l’écorce non stérile, on retrouve 37,5% de résidus liés après 15 jours d’incubation contre 42,2% de

l’atrazine initialement apportée après 7 mois d’incubation (même observations pour les essais avec

l’écorce stérile ou les Témoins avec écorce non stérile). Le vieillissement du déchet, que ce soit en

milieu liquide ou en microcosme permet aux résidus de se lier plus fortement et irréversiblement au

support, en pénétrant plus profondément dans la structure de l’écorce ou en établissant des liaisons

chimiques plus fortes.

Si l’on compare les essais à forte et à faibles concentrations (Tableau 18), la principale différence

porte sur le pourcentage de résidus liés : pour les essais en milieu liquide en présence d’écorce non

stérile, les résidus non extractibles (ou résidus liés) représentent 17% de la radioactivité totale à forte

concentration initiale en atrazine, contre 42% dans les essais à faible concentration en atrazine. On

remarque le même phénomène dans les Témoins « Ecorce stérile » et « Ecorce non stérile ». Cette

observation est logique puisque plus la concentration à l’équilibre Ce sera petite, plus la proportion de

substrat adsorbée (qe/Ce) sera grande ; a forte concentration, les sites d’adsorption sont rapidement

saturés et la proportion de substrat adsorbée est donc moins grande. De plus, on peut imaginer que la

flore indigène de l’écorce consomme plus facilement l’atrazine lorsque celle-ci est présente à forte

concentration ; ainsi, on retrouverait moins (en proportion) de résidus liés à l’écorce à forte

concentration qu’à faible concentration.

D’autre part, le Tableau 18 montre que le pourcentage de résidus non extractibles dans l’écorce par

rapport à la radioactivité totale retrouvée dans celle-ci est dans tous les cas compris entre 90 et 98%.

Ces résultats montrent que l’atrazine au contact de l’écorce est principalement adsorbée

irréversiblement, que ce soit après 15 jours d’incubation ou après 7 mois. Si l’on se réfère aux

cinétiques d’adsorption établies en batch (Figure 11, p.102), on voit que ce phénomème est quasi

instantané et que l’atrazine est majoritairement adsorbée lors de la première heure avec contact

l’écorce. Ceci explique, entre autre, que la distribution de l’atrazine (de la radioactivité plus

exactement) évolue peu, entre les différents compartiments, entre 15 jours et 7 mois d’incubation.

V.2.1.5 Conclusions

Concernant le suivi de minéralisation de l’atrazine en milieu dispersé, les résultats obtenus

permettent de conclure qu’il existe une relation de proportionnalité entre la concentration initiale en

atrazine et la vitesse initiale moyenne de minéralisation, suggérant une cinétique initiale de 1er ordre

dans le domaine de concentration étudié, avec une constante cinétique de l’ordre de 0,0022 h-1.

La présence d’écorce de pin dans le milieu diminue de 25 à 30% le taux de minéralisation par rapport

aux taux observés en milieu liquide sans écorce (MM ou extrait aqueux d’écorce de pin).



185

Les essais confirment une faible activité minéralisatrice de la microflore indigène de l’écorce de pin :

entre 12 et 14 % de l’atrazine sont minéralisés dans les témoins non inoculés avec Pseudomonas

ADP sp.

A forte concentration initiale en atrazine, dans les essais inoculés avec Pseudomonas ADP sp., cette

microflore augmente significativement le taux global de minéralisation, alors qu’à faible concentration

on n’observe pas d’effet significatif.

Le bilan matière réalisé après 15 jours d’incubation des biomètres à température ambiante montre

que le taux de radioactivité retrouvé en solution est moins élevé dans les témoins « Ecorce stérile »

que dans les témoins « Ecorce non stérile », traduisant à nouveau le rôle de la microflore dans la

biodégradation de l’atrazine (confirmé par le suivi du 14CO2).

Au bout de 15 jours, une grande proportion d’atrazine est liée à l’écorce de pin (22 à 38%) diminuant

la biodisponibilité de celle-ci vis à vis des micro-organismes impliqués dans la biodégradation. Parmi

cette proportion d’atrazine liée, environ 1 à 2 % seulement sont extractibles (CaCl2 et MeOH).

L’atrazine est ainsi fortement liée à l’écorce de pin après 15 jours de mise en contact, et la

minéralisation n’évolue quasiment plus.

Concernant le devenir à long terme de l’écorce de pin issue du traitement combiné en batch, on

note peu d’évolution entre 15 jours et 7 mois, que ce soit en microcosme ou en milieu liquide (ratio

L/S=20 mg.L-1). En fait, le phénomène d’adsorption qui régit principalement le devenir de l’atrazine a

lieu au cours des premières heures de contact avec l’écorce de pin. Cependant, on note que l’atrazine

est liée plus fortement à l’écorce au bout de 7 mois : le pourcentage de résidus non extractibles parmi

les résidus liés à l’écorce augmente légèrement (quelques %, essais Témoin avec écorce stérile) par

rapport au bilan établi à 15 jours.

Cette interaction forte avec l’écorce limite la biodisponibilité de l’atrazine et donc l’évolution du déchet.

On pourra donc difficilement imaginer un traitement biologique du déchet pour éliminer les résidus

d’atrazine et régénérer le support pour une nouvelle utilisation. L’inoculation régulière des biomètres

tout au long des 7 mois, avec un plus grand nombre de micro-organismes pourrait être testé mais

n’aurait sans doute aucun effet puisque l’atrazine migre dans les particules alors que les micro-

organismes apportés s’accumulent à l’extérieur.

Par contre, cette forte interaction diminue la mobilité de l’atrazine, abaissant le risque environnemental

et permettant ainsi d’envisager des filières de stockage ou de valorisation de l’écorce. Des tests

d’écotoxicologie devraient être mis en œuvre pour vérifier cette possibilité.



186

Si la présence résiduelle de l’atrazine ou de ces produits de dégradation dans l’écorce était jugée

inacceptable environnementalement pour valoriser ce matériau, la combustion serait alors la seule

issue pour ces déchets d’écorce provenant du traitement combiné.

V.2.2 Etude en colonne du traitement combiné

V.2.2.1 Etude du développement de Pseudomonas ADP sp. en colonne d’écorce de pin

Une observation au Microscope Electronique à Balayage (MEB) (voir préparation des échantillons §

V.1.2.2.1) d’échantillons prélevés des cylindres d’écorce de pin (extraits des colonnes) préalablement

inoculés avec Pseudomonas ADP sp. selon le protocole décrit en V.1.2.2, a permis de vérifier la

capacité de Pseudomonas ADP sp. à survivre dans ce contexte et à coloniser le matériau. D’autre

part, ces observations réalisées après différentes durées de circulation d’une culture cellulaire ont

permis d’évaluer une durée minimale d’inoculation pour le développement et la colonisation des

cellules au sein de l’écorce de pin. De plus, ces essais ont été réalisés sur des colonnes d’écorce

stériles ou non stériles ; l’influence de la microflore indigène de l’écorce sur la colonisation de celle-ci

par Pseudomonas ADP sp. a ainsi pu être mise en évidence de manière qualitative.

Deux durées de circulation ont été testées : 2 jours et 6 jours. Les observations au MEB ont été

réalisées sur des échantillons prélevés en entrée de colonne et au centre de la colonne.

Les clichés obtenus sont présentés en ANNEXE 5.

Après deux jours de circulation d’une culture à travers les colonnes, on constate que Pseudomonas

ADP sp. n’a pas proprement dit colonisé l’écorce de pin. Les cellules sont très clairsemées sur le

support ; cependant, on note que sur l’écorce non stérile les cellules sont présentes en plus grand

nombre que sur l’écorce stérilisée. On peut différencier des cellules de tailles variables constituant

une partie de la flore indigène de l’écorce : les grosses cellules (environ 5 µm) pourraient

correspondrent aux levures nommées CP2 préalablement identifiées au cours de l’isolement de la

microflore de l’écorce de pin par microscopie optique (IV.2.1p.150). On note également la présence

de cellules possédant des filaments mycéliens.

Deux jours d’inoculation ne sont pas suffisants pour coloniser l’écorce avec Pseudomonas ADP sp. et

donc pour espérer obtenir une biodégradation de l’atrazine efficace dans le cadre d’un traitement

combiné par biofiltration.

Après 6 jours de circulation d’une culture de Pseudomonas ADP sp. à travers les colonnes, un biofilm

cellulaire plus dense tapisse l’écorce de pin surtout en entrée de colonne, que ce soit sur l’écorce

préalablement stérilisée ou non stérilisée. Les cellules sont encrées dans une sorte de structure

spongieuse vraisemblablement constituée d’exo-polymères sécrétés par les cellules.

Dans les colonnes d’écorce préalablement stérilisée, les cellules sont toutes identiques d’une taille

moyenne de 1 à 2 µm en forme de bâtonnet, caractéristiques de Pseudomonas ADP sp.



187

Dans les colonnes d’écorce non stérilisée, ces bâtonnets cohabitent avec d’autre formes cellulaires

(cellules plus grosses et filaments mycéliens). La présence de Pseudomonas ADP sp. semble tout de

même plus limitée que dans l’écorce stérilisée, suggérant de nouveau un effet de compétition entre

les différentes populations microbiennes présentes dans l’écorce.

On note également que, quelle que soit l’écorce (stérilisée ou non) les cellules sont en très grand

nombre en entrée de colonne et qu’elles sont réparties de manière plus éparse au centre de la

colonne. La structure d’exo-polymères est absente du centre de la colonne et ne se retrouve que

lorsque les cellules sont présentes en grand nombre.

Ces observations permettent de conclure qu’une durée d’inoculation de 6 jours est nécessaire pour

une bonne colonisation de l’écorce par Pseudomonas ADP sp. D’autre part, l’écorce stérilisée semble

présenter un avantage par rapport à l’écorce contenant la microflore indigène intacte, pour le

développement d’un biofilm de Pseudomonas ADP sp.

V.2.2.2 Influence du biofilm sur l’hydrodynamique de la colonne

L’influence du biofilm de Pseudomonas ADP sp., observé plus haut, sur l’hydrodynamique des

colonnes d’écorce de pin a été testée par injection du traceur KCl, comme décrit au § V.1.2.2., avant

et après colonisation des colonnes. La Figure 48 (p.170) résume les différentes étapes de ces

expériences.

Seuls les résultats pour une inoculation avec Pseudomonas ADP sp. de 6 jours sont présentés

Figure 59. L’inoculation de 2 jours n’a pas été retenue à cause d’une colonisation trop faible de

l’écorce. Les caractéristiques des colonnes d’écorce sont présentées en ANNEXE 6.

La Figure 59 montre que les courbes d’élution du KCl avant et après inoculation avec Pseudomonas

ADP sp. se superposent quasiment : La présence de Pseudomonas ADP sp. ne modifie pas le

comportement hydrodynamique de la colonne (écorce stérile ou non stérile). L’écoulement a lieu dans

les deux cas (avec et sans Pseudomonas ADP sp.) sans retard (courbe symétrique) et de façon

homogène dans la colonne, sans emprunter de chemins préférentiels. Aucun signe caractéristique de

la présence de zones mortes n’est observé (pas de pics).



188

Figure 59 : Courbe d’élution de KCl pour les colonnes d’écorce de pin stérile (gauche) ou non stérile (droite), avant (ronds) et après (carrés) circulation pendant 6 jours d’une culture de Pseudomonas ADP

sp. ; 20 ± 2°C ; débit 1,0 mL.min-1 ; temps de contact 20 min

V.2.2.3 Traitement combiné en colonne

Le traitement combiné « Adsorption + Biodégradation » a été testé sur les colonnes d’écorce de pin

stérile ou non stérile, après inoculation de Pseudomonas ADP sp. pendant 6 jours, défini comme

temps suffisant pour une bonne colonisation du support, selon les résultats obtenus au § V.2.2.1.

Deux débits de circulation de la solution en atrazine ont été testés :

1 mL.min-1 et 0,3 mL.min-1, correspondant respectivement à des temps de contact d’environ 22 et

100 minutes. Deux concentrations entrantes en atrazine ont également été testées : 0,2 mg.L-1 et

2,34 µg.L-1. La Figure 49 (p.172) résume les différentes étapes du traitement combiné testé ci-

dessous. La photo illustre le montage expérimentale utilisé pour ces essais.

Ecorce non stérile

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 1 2 3 4V/Vo

C/C

o

Without biofilm

With biofilmSans BiofilmAvec Biof ilm

Ecorce stérile

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 1 2 3 4V/Vo

C/C

o

Without biofilm

With biof ilmSans BiofilmAvec Biof ilm

Sans

Pseudo

Sans

Pseudo



189

Figure 60 : Montage expérimentale pour les essais d’adsorption en colonne composé d’une étuve climatisée à 20±2°C , d’un multianalyseur (pH, conductivité) ; de deux pompes peristaltiques et d’un

collecteur de fractions

La Figure 61 présente les courbes d’élution d’une solution d’atrazine à 0,2 mg.L-1, injectée à un débit

de 1 mL.min-1, à travers les colonnes d’écorce préalablement stérilisée ou non.

Lors du traitement combiné (colonne inoculée avec Pseudomonas ADP sp.) la courbe d’élution

exprimée par C/C0 en fonction de V/V0 (V0 étant le volume d’eau dans la colonne ou volume de pore)

tend plus lentement vers la saturation (C/C0=1) que lors d’une simple adsorption sans Pseudomonas

ADP sp. Dans les colonne d’écorce stérilisée, la quantité d’atrazine retenue et/ou dégradée après une

injection de 350 V0 (calculée par la surface au dessus de la courbe) représente 0,070 mg par gramme

d’écorce par « traitement combiné » contre 0,046 mg.g-1 lorsque la colonne n’est pas inoculée avec

Pseudomonas ADP sp. et que seule l’adsorption intervient dans le traitement. Les résultats sont

résumés dans le Tableau 19 p.192).

Des résultats similaires sont obtenus pour l’écorce non stérilisée : la quantité d’atrazine traitée est de

0,041 mg.g-1 et 0,050 mg.g-1 pour les colonnes non inoculées et inoculées respectivement avec

Pseudomonas ADP sp.. Ces résultats sont cohérents avec ceux obtenus en batch ; pour une

concentration à l’équilibre Ce= 0,2 mg.L-1, la quantité d’atrazine retenue par l’écorce qe était de

0,04 mg.g-1 (Figure 15 p.106) pour un ratio liquide/solide de 10 mL.g-1. On note cependant que

l’efficacité des colonnes d’écorce stérilisée est légèrement meilleure que celle des colonnes contenant

l’écorce non stérilisée. Ce phénomène peut être expliqué d’une part par l’adsorption de l’atrazine sur

l’écorce et d’autre part, par sa biodégradation par Pseudomonas ADP sp. En effet, dans les essais en



190

batch nous avons pu mettre en évidence une légère différence entre à la capacité d’adsorption de

l’atrazine sur l’écorce stérilisée et celle sur l’écorce non stérilisée :

L’écorce stérilisée présente des coefficients d’adsorption pour l’atrazine légèrement supérieurs à ceux

obtenus avec l’écorce non stérilisée. D’autre part, nous avons à plusieurs reprises évoqué des

phénomènes de compétition entre Pseudomonas ADP sp. et la microflore indigène de l’écorce,

pouvant également justifier de cette différence d’efficacité observée entre le traitement combiné avec

l’écorce stérilisée et celui utilisant l’écorce non stérilisée.

Figure 61 : Courbe d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 0,2 mg.L-1) traversant une colonne d’écorce de pin non stérilisée (à gauche) ou d’écorce stérilisée (à droite) inoculée (traitement

combiné) ou non (adsorption) avec Pseudomonas ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement. 20 ± 2°C ; débit 1 ml.min-1 ; temps de contact 22 min

Suite à ces essais, le traitement combiné a été testé uniquement sur des colonnes d’écorce de pin

préalablement stérilisée. D’autre part, pour améliorer l’efficacité du traitement, le débit de circulation

de la solution en atrazine a été diminué afin d’augmenter le temps de séjour de l’atrazine dans les

colonnes. Un temps de séjour plus long dans les colonnes pourra éventuellement permettre une

meilleure biodégradation de celle-ci par Pseudomonas ADP sp. et/ou une meilleure adsorption sur le

support écorce/biofilm. Nous avons vu plus haut que la biodégradation de l’atrazine avait lieu

majoritairement dans les premières heures de contact avec Pseudomonas ADP sp. (voir par exemple,

Figure 37 p.144).

Les Figure 62 et Figure 63 présentent les courbes d’élution obtenues pour un débit de circulation de

0,3 ml.min-1 (temps de contact environ 100 minutes) de solutions entrantes à 2,34 µg.L-1 ou

0,2 mg. L -1 d’atrazine respectivement, traversant les colonnes d’écorce de pin stérilisée préalablement

colonisées ou non par Pseudomonas ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement.

Ecorce non stérile

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 50 100 150 200 250 300 350 400

V/Vo

C/C

o

Adsorption

Traitement combiné

Ecorce stérile

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 50 100 150 200 250 300 350V/Vo

C/C

o

AdsorptionTraitement combiné

Ecorce non stérilisée Ecorce stérilisée



191

Figure 62 : Courbes d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 2,34 µg.L-1) traversant une colonne d’écorce de pin stérile inoculée (traitement combiné) ou non (adsorption) avec Pseudomonas

ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement. 20 ± 2°C ; débit 0,3 ml.min-1 ; temps de contact 100 min

Figure 63 : Courbes d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 0,2 mg.L-1) traversant une colonne d’écorce de pin stérile inoculée (traitement combiné) ou non (adsorption) avec Pseudomonas

ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement. 20 ± 2°C ; débit 0,3 ml.min-1 ; temps de contact 100 min

[Atrazine]i = 2.34 µg.L-1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 50 100 150 200

V/Vo

C/C

o


[Atrazine]i= 0,2 mg.L-1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 50 100 150 200

V/V0

C/C

0




192

La variabilité des résultats obtenus à faible concentration en atrazine (Figure 62) est due à l’utilisation

de kit de dosage immunologique permettant de travailler à très petite concentration mais parfois peu

précis dans cette gamme de concentrations (dosage colorimétrique).

D’autre part, la Figure 63 présente une chute brutale de la concentration en atrazine en sortie de

colonne au temps t=120h environ. Cette chute provoquée par un problème technique a impliqué la

stagnation de la solution d’atrazine dans la colonne pendant plusieurs heures. Cette observation

montre qu’avec un temps de contact plus long que celui imposé par un débit de 0,3 mL.min-1 (soit

100 minutes environ), la concentration en atrazine chute et donc que la biodégradation peut avoir lieu

de façon plus importante. Le temps de séjour dans les colonnes serait donc insuffisant pour une

bonne biodégradation.

Le Tableau 19 résume les résultats obtenus pour les différents traitements appliqués (différents

débits, différentes concentrations initiales en atrazine, avec ou sans Pseudomonas ADP sp.) et

permet d’évaluer l’éfficacité du traitement selon les différents paramètres d’étude choisis.

Tableau 19 : Quantité d’atrazine retenue ou dégradée par gramme d’écorce par circulation des solutions polluées à 0,2 mg.L-1 ou 3 µg.L-1 à des débits de 1 ou 0,3 ml.min-1 dans des colonnes d’écorce de pin

stérilisée, ayant ou non été colonisées par Pseudomonas ADP sp.

Lorsque Pseudomonas ADP sp. n’est pas inoculée dans les colonnes d’écorce de pin, l’efficacité du

traitement est équivalente pour les débits de 1 mL.min-1 ou 0,3 mL.min-1. L’augmentation du temps de

séjour dans les colonnes (multiplié par 3) n’augmente pas l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce. En

effet, les essais en batch ont montré que l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin était un

phénomène quasi instantané (Figure 11, p.102) ; l’atrazine est majoritairement adsorbée lors des

premières minutes de contact avec l’écorce.

Lorsque les colonnes sont colonisées par Pseudomonas ADP sp., la présence du biofilm améliore de

50% la quantité d’atrazine éliminée de la solution par rapport aux colonnes non inoculées, lorsque la

concentration en atrazine de la solution à traiter est de 0,2 mg.L-1 pour un débit de 1 ml.min-1.

A faible débit (0,3 mL.min-1), la présence de Pseudomonas ADP sp. permet de doubler la masse

d’atrazine éliminée, que ce soit pour une concentration entrante de 0,2 mg.L-1 ou 2,34 µg.L-1.

Débit = 1 ml.min-1 Débit = 0,3 ml.min-1 [Atrazine]= 0,2 mg.L-1 [Atrazine]= 3 µg.L-1 [Atrazine]= 0,2 mg.L-1 [Atrazine]= 3 µg.L-1

Sans Pseudo. 0,046 mg.g-1 ND 0,046 mg.g-1 0,348 µg.g-1

Avec Pseudo. 0,07 mg.g-1 ND 0,087mg.g-1 0,65 µg.g-1



193

La diminution du débit de 1 à 0,3 mL.min-1, rend également le procédé de biofiltration plus efficace

(+ 25 % d’atrazine éliminée à 0,3 mL.min-1 par rapport au débit de 1 mL.min-1), contrairement à ce qui

a été observé plus haut dans les colonnes non inoculées. L’augmentation du temps de séjour permet

donc d’obtenir un meilleur taux de biodégradation de l’atrazine.

Les études en batch (Figure 50, Figure 51, p.174) ont montré que la minéralisation de l’atrazine avait

lieu majoritairement au cours des 15 premières heures. Il pourrait donc être intéressant de répéter ces

expériences soit avec des débits plus faibles, afin d’atteindre des temps de séjour de plusieurs heures

dans la colonne (alors, la diminution du débit pourrait entraîner des problèmes d’oxygénation ou

d’apport en nutriments pouvant devenir limitant pour les micro-organismes) soit par recirculation de la

solution à traiter, ce qui augmenterait le temps de séjour de l’atrazine sans poser de problème

d’aération des colonnes. Dans le cas de l’utilisation de débit plus faible, l’utilisation de colonnes

aérées, type Airlift pourrait être la solution au problème d’oxygénation des bactéries.

Les analyses de carbone organique dissous (COD) effectuées tout au long de ces expériences ont

montré des concentrations toujours inférieures à 1g.L-1, soit une charge organique acceptable pour

être rejetée dans le milieu naturel. De plus, ces analyses ont montré que cette concentration en COD

en sortie de colonne variait très peu au cours du temps. L’activité biologique (consommation de la

matière organique de l’écorce) à l’intérieur de la colonne pourrait être responsable du transfert de

composés de l’écorce e solution et donc de la stabilité de la concentration en COD en sortie de

colonne (équilibre entre consommation de la matière organique et dissolution de celle-ci dans la

phase aqueuse circulante).

Si on calcule le volume d’élution par gramme d’écorce pour lequel on obtient en sortie de colonne la

concentration en atrazine maximale autorisée (soit 0,1 µg.L-1), on voit que pour traiter une eau

naturelle polluée à 2,34 µg.L-1 cette concentration maximale est atteinte pour un volume d’environ

40 ml pour 1 gramme d’écorce (débit de 0,3 ml.min-1) avec ou sans Pseudomonas ADP sp. Il faudrait

donc 25 kg d’écorce pour traiter 1m3 de cette eau, ce qui représente une masse considérable.

L’efficacité du traitement étudié reste donc limitée par rapport à un traitement classique sur charbon

actif puisque la capacité d’adsorption de l’atrazine sur un charbon actif en poudre est d’environ de 10

à 30 g.m-3 pour une concentration en atrazine de 0,1 µg.L-1, et utilise donc environ 1000 fois moins

d’adsorbant qu’un traitement sur écorce de pin (Detoc, 1998).

Dans le cas du traitement d’une solution polluée à environ 0,2 mg.L-1, correspondant à une forte

pollution (eaux provenant de lavage de cuve contenant des pesticides, eaux accidentellement émises

par une usine de production ou issues d’une mauvaise utilisation ou d’un mauvais stockage), on

observe un taux d’abattement de 60% après circulation d’environ 3 litres de solution lorsque la

colonne ne contient pas Pseudomonas ADP sp. contre 6 litres lorsque la colonne a été inoculée avec

Pseudomonas ADP sp. L’efficacité du traitement est doublée lorsque adsorption et biodégradation

sont combiné. La capacité de l’écorce pour abattre 60% de l’atrazine initialement présente à

0,2 mg.L - 1 est 1500 g.m-3. On pourrait donc imaginer mettre en œuvre ce procédé de traitement dans



194

le cadre d’une pollution ponctuelle, avec des quantités d’eau à traiter de quelques dizaines de mètres

cube.

Le traitement combiné pourrait dans ces conditions être utilisé comme un pré-traitement pour abattre

la majeure partie de la pollution, avant d’être envoyée dans une filière de traitement classique, en tête

de station d’épuration ou de subir un traitement final sur charbon actif.

V.2.2.4 Conclusions

Les résultats obtenus lors de l’étude du traitement combiné en colonne montrent qu’un temps d’inoculation de 6 jours est nécessaire pour coloniser la colonne d’écorce de pin avec

Pseudomonas ADP sp., avant qu’elle ne soit utilisée comme biofiltre.

D’autre part, la présence de la microflore de l’écorce de pin diminue faiblement la colonisation par

Pseudomonas ADP sp. suggérant à nouveau l’existence d’une faible compétition entre cette flore indigène et Pseudomonas ADP sp. pour les nutriments à leur disposition.

Lorsque le biofilm est établi, celui-ci ne modifie pas le comportement hydrodynamique des colonnes

d’écorce de pin.

D’une manière générale, les quantités d’atrazine éliminées par le traitement combiné ne sont pas très

importantes. On note cependant que la présence de Pseudomonas ADP sp. dans les colonnes améliore de 50 à 100 % l’efficacité du traitement par rapport au procédé d’adsorption seul. On note

également que la diminution du débit de circulation de la solution polluée dans les colonnes (de 1 à

0,3 ml.min-1), soit l’augmentation du temps de séjour de l’atrazine dans les colonnes augmente significativement le taux de biodégradation de celle-ci.

Globalement, les conditions testées dans ces essais n’ont pas été favorables à la biodégradation. Il

pourrait donc être intéressant d’optimiser ces conditions (diminution du débit circulation de la solution

polluée ou recirculation de la solution afin d’augmenter le temps de contact entre atrazine et écorce)

afin de provoquer la biodégradation de manière plus efficace. D’autre part, la connaissance de la

densité cellulaire à l’intérieur des colonnes permettrait d’accéder aux valeurs de taux de croissance et

de déterminer des vitesses de dégradation de l’atrazine dans les colonnes. En connaissant les

vitesses de dégradation, un débit optimal (ou temps de séjour) pourrait être calculé pour traiter de

façon optimisée l’eau polluée.

Ces essais ont montré que le traitement combiné était d’une manière générale inexploitable pour traiter des eaux contenant de faibles concentrations en atrazine. Cette méthode utiliserait des

quantités considérables d’écorce de pin. Le traitement sur charbon actif (inoculé ou non) est dans ce

cas beaucoup plus efficace et plus adapté malgré un coût supérieur du support d’adsorption.



195

En revanche, dans le cas d’une forte pollution ponctuelle en atrazine, le traitement combiné sur écorce de pin inoculée peut être envisagé en tant que pré-traitement. L’eau serait ainsi

débarrassée de la majeure partie de sa charge polluante avant d’être envoyée dans les filières de

traitement classique. Ainsi, on peut imaginer qu’un agriculteur lavant ses cuves de pesticides ou un

producteur d’atrazine pourrait, sur site, être équipé de colonne ou de bioréacteur individuel pour traiter

ses eaux fortement concentrées en atrazine, afin d’éliminer la plus grosse partie de la pollution. Cette

solution est d’ailleurs en accord avec la politique actuelle qui tend à responsabiliser de plus en plus

les pollueurs.



196

CONCLUSION GENERALE


196

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

A l’heure où les pays industrialisés sont conscients de la nécessité impérative de protection de la

qualité de l’environnement, de plus en plus de travaux sont mis en œuvre pour trouver, dans tous les

domaines et des solutions économiquement, socialement et environnementalement sont proposées.

Notre étude s’inscrit dans ce contexte de gestion durable de l’environnement, d’une part parce qu’elle

prétend dépolluer des eaux contaminées par un pesticide et d’autre part parce qu’elle permet de

valoriser un déchet abondement disponible dans les pays comme la France ou le Portugal.

L’utilisation de l’écorce de pin pour le traitement de l’eau permettrait d’économiser de l’énergie

(consommée par exemple pour la fabrication de charbon actif) et des matières premières, que l’on se

doit de protéger si l’on veut préserver notre planète. D’autre part, la connaissance et l’isolement de

nombreux micro-organismes pour leur capacité à consommer les polluants permet aujourd’hui

d’éliminer totalement un composé par minéralisation (soit transformation en CO2 et H2O). Le polluant

n’est plus stocké (pollution concentrée et déplacée) ou incinéré (impliquant une éventuelle pollution de

l’air par combustion) il peut être littéralement éliminé par ce type de traitement biologique.

Cette étude a engendré un grand nombre de travaux concernant séparément l’adsorption et la

biodégradation avant de pouvoir mener à bien les essais concernant le traitement lui-même,

combinant adsorption et biodégradation. Ces essais ont permis d’étudier la faisabilité de ce traitement

combiné sur écorce de pin avec Pseudomonas ADP sp. Elles ont notamment servi à fixer certains

paramètres d’études appliqués ensuite au traitement désiré.

Nos études ont montré que :

l’écorce de pin possédait une capacité d’adsorption très limitée par rapport à un charbon actif

(couramment utilisé pour l’élimination de micro-polluants présents dans les eaux). Cependant,

de par sa faible capacité adsorbante vis à vis de l’atrazine et dans le cadre d’une biofiltration,

l’écorce présente l’avantage de rendre le polluant plus disponible pour les micro-organismes

impliqués dans le traitement.

L’écorce a de plus, l’avantage d’être peu onéreuse puisque qu’il est un déchet de l’industrie du

bois, et disponible.

Pseudomonas ADP sp. est capable de survivre et de minéraliser l’atrazine en présence

d’écorce de pin en poudre, supportant le pH imposé par la présence de celle-ci en solution

CONCLUSION GENERALE


197

aqueuse (pH 4-5) et même d’utiliser les composés organiques solubles de l’écorce comme

source de carbone pour son propre métabolisme. D’autre part, Pseudomonas ADP sp. peut

se développer à la surface de l’écorce, et former un biofilm conséquent pour une application

en biofiltration.

La présence dans l’écorce d’une concentration très faible d’azote favorise la minéralisation de

l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. capable d’utiliser cette dernière comme source d’azote.

La microflore indigène de l’écorce de pin a une faible influence sur Pseudomonas ADP sp. (en

terme de croissance ou de capacité à minéraliser l’atrazine), les phénomènes de compétition

étant la plupart du temps négligeables. Lorsque l’atrazine est présente à une forte

concentration dans la solution à traiter (quelques mg.L-1), la présence de cette flore indigène

améliore même la biodégradation de l’atrazine.

En terme d’application, les travaux ont permis de faire des choix (qualité de l’écorce en poudre fine,

traitements éventuels à réaliser avant utilisation (stérilisation de l’écorce ou non), etc.), et d’envisager

le traitement combiné, sous forme d’essais en batch ou de biofiltration en colonne. Ces études ont

notamment montré que ce procédé pouvait être mis en oeuvre de façon simple et rustique notamment

par le fait des exigences très réduites de la souche bactérienne utilisée : pas de nécessité d’un apport

de source de carbone supplémentaire, possibilité de travailler à des températures basses (12°C)

pouvant correspondre à la température d’une eau à traiter (pas de chauffage nécessaire), pas de

nécessité non plus de tamponner la solution à traiter. Pseudomonas ADP sp. s’adapte à ces

conditions environnementales contraignantes sans que sa capacité à minéraliser l’atrazine ne soit trop

fortement affectée.

L’étude du traitement combiné a montré que, dans tous les cas, la présence de Pseudomonas ADP

sp. améliorait le taux d’abattement de l’atrazine dans l’eau, présente aussi bien à faible (quelques

µg.L-1) qu’à forte concentration (quelques mg.L-1) initiale.

Les essais en batch permettent de conclure qu’en 4 jours environ, 50 % de l’atrazine peut être

minéralisée (faible ou forte concentration initiale en atrazine) ; les 50 autres % étant adsorbés sur

l’écorce de manière irréversible à 95% et donc non disponibles pour les bactéries.

Les expériences de biofiltration en colonne ont montré que le traitement combiné était difficilement

envisageable pour traiter des eaux contenant de faibles concentrations en atrazine. Cette méthode

utiliserait des quantités considérables d’écorce de pin.

En revanche, dans le cas d’une forte pollution ponctuelle en atrazine, touchant un volume réduit

d’eau, le traitement combiné sur écorce de pin inoculée pourrait être envisagé après optimisation en

tant que pré-traitement pour débarrasser l’eau polluée de la majeure partie de sa charge polluante

avant d’être envoyée dans les filières de traitements classiques.

CONCLUSION GENERALE


198

Le traitement combiné par biofiltration sur écorce de pin en présence de Pseudomonas ADP sp.

pourrait être exploité sur site chez les agriculteurs, sous forme de bioréacteur mobile, ou directement

sur les usines de productions de pesticides.

Des études restent à mener avant d’envisager l’utilisation de ce traitement combiné sur site. Elles

concernent notamment le devenir de l’écorce après son utilisation dans le traitement. Des tests eco-

toxicologiques seraient souhaitables afin de définir l’évolution de ce déchet et sa compatibilité avec

une mise en décharge, une incinération ou une éventuelle valorisation. D’autre part une optimisation

du traitement pourrait être envisagée, principalement par re-circulation de la solution, permettant

l’augmentation du temps de séjour de l’atrazine dans les biofiltres et donc l’augmentation de la

biodégradation par les micro-organismes.

235


235

ANNEXE 1


200

ANNEXE 1 : Spectre IR de l’écorce de pin en poudre - Identification des fonctions de surface

Le spectre est présenté en détail à la page suivante.

- OH alcool ou phénol lié, intermoleculaire

- NH2 primaire ou amine secondaire

(CH2), (CH) proche d’un OH

C=O Aldéhyde ou acide saturé aliphatique ou substitution sur noyau

aromatique

C=C aromatique C=N cyclique C=O C=C phenyl conjugué (CH=CH2)

Phénol Noyau aromatique substitué

ANNEXE 2


201

ANNEXE 2 : Observation au MEB d’écorce de pin et de charbon actif en poudre

Figure 1 : Observation de la structure de surface du charbon actif (à gauche) et de l’écorce de pin (à droite (échelle 100 µm)

Figure 2 : Fibre de charbon actif (à gauche) et d’écorce de pin (à droite)

ANNEXE 2


202

Figure 3 : Observation de la structure longitudinale interne de particules d’écorce de pin

ANNEXE 3


203

ANNEXE 3 : Caractéristiques des colonnes - Etude hydrodynamique Colonne d’écorce non stérile :

Paramètres colonne Symbole Unité Diamètre interne d 2,50 cm Section S 4,91 cm2 Hauteur du lit L 6,70 cm Masse de milieu poreux m 9,60 g Volume du lit Vt 32,87 cm3 Volume de pore Ve ou V0 19,70 cm3 Indice de vide e (Ve/Vs) 11,60 Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (Ve/Vt) 0,60 Flux D 59,40 cm3.h-1 Vitesse de Darcy q (D/S) 12,11 cm.h-1 Vitesse de pore V (q/ ε) 20,20 cm.h-1

Colonne d’écorce de pin stérile :


Colonne de charbon actif :

Paramètres colonne Symbole Unité Diamètre interne d 2,50 cm Section S 4,91 cm2 Hauteur du lit L 5,00 cm Masse de milieu poreux m 9,90 g Volume du lit Vt 24,53 cm3 Volume de pore Ve ou V0 21,20 cm3 Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (Ve/Vt) 0,86 Flux D 60,00 cm3.h-1 Vitesse de Darcy q (D/S) 12,23 cm.h-1 Vitesse de pore V (q/ ε) 14,15 cm.h-1

ANNEXE 4


204

ANNEXE 4 : Caractéristiques des colonnes - Adsorption de l’atrazine en conditions abiotiques Colonne d’écorce non stérile :



Paramètres colonne Symbole Unité Diamètre interne d 2,50 cm Section S 4,91 cm2 Hauteur du lit L 7,00 cm Masse de milieu poreux m 10,00 g Volume du lit Vt 34,37 cm3 Volume de pore Ve ou V0 18,00 cm3 Indice de vide e (Ve/Vs) 10,00 Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (Ve/Vt) 0,52 Flux D 58,20 cm3.h-1 Vitesse de Darcy q (D/S) 11,85 cm.h-1 Vitesse de pore V (q/ ε) 22,79cm.h-1

ANNEXE 5


205

ANNEXE 5 : Observation au MEB de Pseudomonas ADP sp. en colonne d’écorce de pin

I. Circulation d’une culture de Pseudomonas ADP sp. 2 jours

I.1 Ecorce préalablement stérilisée Entrée de colonne

I.2 Ecorce non stérilisée Entrée de colonne

Filament mycélien Grosses cellules

ANNEXE 5


206

Milieu de colonne

Filament mycélien

ANNEXE 5


207

II. Circulation d’une culture de Pseudomonas ADP sp. 6 jours

II.1 Ecorce stérile

II.1.1 Entrée de colonne

Structure spongieuse sous-jacente

ANNEXE 5


208

II.1.2 Milieu de colonne

ANNEXE 5


209

II.2 Ecroce non stérile

II.2.1 Entrée de colonne

Structure spongieuse Filament mycélien Grosses cellules

ANNEXE 5


210

II.2.2 Milieu de colonne

ANNEXE 6


211

ANNEXE 6 : Caractéristiques des colonnes - Influence d’un biofilm sur l’hydrodynamique des colonnes Colonne d’écorce non stérile :




REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES


212




213

Acero J.L., Stemmler K., and von Gunten U., 2000. Degradation kinetics of atrazine and its deradation products with ozone and OH radicals: a predictive tool for drinking water treatment. Environ. Sci. Technol., 34:591-597 pp.

AFP (Agence France Presse), 2001 et 2003. Disponible sur www. health. fgov. be et www.afp.com. Consulté en 2003.

Al-Asheh S., Banata F., Al-Omaria R., and Duvnjakb Z., 2000. Prediction of binary sorption isotherms for the sorption of heavy metals by pine bark using single isotherm data. Chemosphere, 41:659-665 pp.

Al-Asheh S. and Duvnjak Z., 1997. Sorption of Cadmium and Other Heavy Metals by Pine Bark. J. Haz. Mat., 56:35-51 pp.

Albanis T.A., Pomonis P.J., and Sdoukos A.T., 1988. Movement of methyl parathion, lindane and atrazine through lysimeters in field conditions. Toxicol. Environ. Chemistry, 17:35-45 pp.

Armstrong D.E., Chesters G., and Harris R.F., 1967. Atrazine hydrolysis in soil. Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 31:61-66 pp.

Asai S., Konishi Y., and Tomisaki H., 1986. Separation of mercury from aqueous mercury chloride solutions by onion skins. Sep. Sci. Technol., 21:809-821 pp.

Bailey S.E., Olin T.J., Bricka R.M., and Adrian D.D., 1999. A review of potentially low-cost sorbents for heavy metals. Wat. Res., 33:2469-2479 pp.

Balayannis P.G., 1988. The prediction of the mobility of pesticides in soil, based on thermodynamic characteristics of the system: pesticide-soil. Methodological aspects of the study of pesticide behaviour in soil. INRA Versailles.

Baltzis B.C. and Androutsopoulou H. A studt of the reponse of biofilters to shock-loading. Air & Waste Management Association's 87th annual meeting & exhibition, Cincinnati, Ohio . 1994. Ref Type: Conference Proceeding

Barbulea C., 2000. Etude des phénomènes d'adsorption et désorption de composés organiques volatils sur charbons actifs. Application à l'amélioration des ambiances industrielles. Thèse de doctorat - Université Technique de Construction de Bucarest et Institut National des Sciences Appliquées de Lyon.

Barriuso E., Calvet R., Baer U., and Dabadie J.M., 1994. Field atrazine behaviour and dissipation kinetics in two different soils. COST 1994: Environmental Behaviour of Pesticides and Regulatory Aspects. Brussels 1994..

Barriuso E. and Houot S., 1996. Rapid mineralization of the s-triazine ring of atrazine in soils in relation to soil managment. Soil Bio.Biochem. 28:1341-1348 pp.

Behki,R. and Khan,S.U., 1986. Degradation of atrazine by Pseudomonas: N-dealkylation and dehalogenation of atrazine and its metabolites. J. Agric. Food Chem., 34:746-749 pp.

Behki,R., Topp,E., Dick,W., and Germon,P., 1993. Metabolism of the herbicide atrazine by Rhodococcus strains. Appl. Environ. Microbiol., 59:1955-1959 pp.

Behki,R. and Khan,S.U., 1994. Degradation of atrazine, propazine and simazine by Rhodococcus strain B-30. J. Agric. Food Chem., 42:1237-1241 pp.

Beltran F.J., Garcia-Araya J.F., and Acedo B., 1994. Advanced oxydation of atrazine in water - II. Ozonation combined with ultraviolet radiation. Wat. Res., 28:2165-2174 pp.

Best J.A. and Weber J.B., 1974. Disappearance of s-triazines as affected by soil pH using a balance sheet approach. Weed Sci., 22:364-373 pp.



214

Bichat F., Sims G.K., and Mulvaney R.L., 1999. Microbial utilization of heterocyclic nitrogen from atrazine. Soil Sci. Soc. Am. J., 63:100-110 pp.

Blais J.F., Shen S., Meunier N., and Tyagi R.D., 2003. Comparison of natural adsorbents for metal removal from acidic effluent . Environ. Technol., 24:205-215 pp.

Bohn L.H., 1996. Biofilter media. Air & Waste Management Association's 89th annual meeting & exhibition, Nashville, Tennessee, USA.

Bollag J .M. and Liu S.Y., 1990. Biological transformation processes of pesticides. "Pesticide in the soil environment: Processes, impacts, and modelling" - SSSA Book Series: 2. Edition Cheng H. H.,169-211 pp.

Bott T.R. and Miller P.C., 1983. Mechanisms of biofilm formation on aluminium tubes. J. Chem. Tech. Biotechnol., 33B:177-184 pp.

Bottoni P., Keiser J., and Funari E., 1996. Leaching indices of some major triazine metabolites. Chemosphere, 32:1401-1411 pp.

Bouillot P., Fauquez S., Benezet M., and Trancart J.L., 1991. Bilan sur les possibilité de traitement dans une filière de production d'eau potable. Water Supply, 9:11-14 pp.

Boundy-Mills,K.L., de Souza,M.L., Mandelbaum,R.T., Wackett,L.P., and Sadowsky,M.J., 1997. The atzB gene of Pseudomonas sp. strain ADP encodes the second enzyme of a novel atrazine degradation pathway. Appl. Environ. Microbiol., 63:916-923 pp.

Bouquard C., Ouazzani J., Prome J.C., and Michel-Briand Y., 1997. Dechlorination of atrazine by a Rhizobium sp. isolate. Appl. Environ. Microbiol., 63:862-866 pp.

Bras I., Santos L., and Alves A., 1999. Organochlorine pesticides removal by pinus bark sorption. Environ. Sci. Technol., 33:631-634 pp.

Brunauer,Emmett and Teller, 1938. J. Am. Chem. Soc., 60.

Brunet R., Gourmand M.J., Picot F., and Rech R., 1996. Elimination de micropolluants organiques dans les eaux souterraines par filtration sur charbon actif. Comparaison de l'efficacité de différents charbons. 12ème Journées Information Eaux JIE96. Conférence n° 11.

Cai B., Han Y., Liu B.Ren Y., and Jiang S., 2003. Isolation and characterization of an atrazine-degrading bacterium from industrial wastewater in China Source. Let. Appl. Microbiol., 36:272-276 pp.

Calvet R. and Tercé M., 1975. Solubilité de l'atrazine dans des gels de montmorillonite calcique. C. R. Acad. Sci. 281, Paris.

Calvet R., Tercé M., and Arvieu J.C., 1980. Mise au point bibliographique. Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants. Ann. Agron., 31.

Calvet R., 1989. Adsorption of organic chemicals in soil. Env. Health Perpect., 83:177 pp.

Calvet R. and Barriuso E., 1994. Retention and bioavailability of pesticides in soil. COST 1994: Environmental Behaviour of Pesticides and Regulatory Aspects. Brussels 1994..

Campos C., Vernon L., Snoeyink, Benito Mariñas, I.Baudin, and J.M.Lainé, 2000. Atrazine removal by powdered activated carbon in floc blanket reactors. Wat. Res., 34:4070-4080 pp.

Carsel R.F. and Smith C.N., 1987. Impact of pesticides on ground water contamination. In G. J. Marco et al. (ed. ) Silent Spring revisited. Am. Chem. Soc. , Washington, DC,71-83 pp.

Carson, 1962. Silent spring. Riverside Press, Cambridge, MA,USA.



215

Cemagref. 2004. Disponible sur internet www.cemagref.fr “Les Fiches”.Consulté en Juillet 2004

Cerejaira M.J., Viana P., Batista S., Pereira T., Silva E., Valério M.J., Silva A., Ferreira M., Silva-Fernandes A.M., 2003. Pesticides in Portuguese surface and ground waters. Wat. Res. 37:1055-1063 pp.

Characklis W.G., 1990. Microbial Transformation In W.G. Characklis and K.C. Marshall Editors, Biofilms. Wiley, New York.

Chiou C.T., Peters L.J., and Freed V.H., 1979. A physical concept of soil-water equilibria for nonionic organic compounds. Science, 206:832 pp.

Chou M.S. and Cheng W.H., 1997. Screening of biofilteringg material for VOC treatment. J. Air Waste Manag. Assoc., 47:681 pp.

Christensen B.E. and Characklis W.G., 1990. Physical and chemical properties of biofilms. In biofilms, W. G. Characklis and K. C. Marshal, Eds, Wiley, New York,93-130 pp.

Chung N.H. and Alexander M., 1998. Differences in sequestration and bioavailability of organic compounds aged in dissimilar soils. Environ. Sci. Technol., 32:855-860 pp.

Clausen G.B., Larsen L., Johnsen K.Radnoti de Lipthay J., and Aamand J., 2002. Quantification of the atrazine-degrading Pseudomonas sp. strain ADP in aquifer sediment by quantitative competitive polymerase chain reaction. FEMS Microbiol. Ecology, 41:221-229 pp.

Clay S.A., Koskinen W.C., Allmaras R.R., and Dowdy R.H., 1988. Differences in herbicide adsorption on soil using several soil pH modification techniques. J. Environ. Sci. Health, 6:559-573 pp.

Cook,A.M. and and R.Hutter, 1981. s-triazines as nitrogen sources for bacteria. J. Agric. Food Chem., 29:1135-1143 pp.

Cook,A.M., 1987. Biodegradation of s-triazine xenobiotics. FEM Microbiol. Rev, 46:93-116 pp.

Cooper K., 1991. Effects of pesticides on wildlife. In W. J. Hates & R. R. Laws: Handbook of pesticides toxicology. Academic Press, San Diego, CA, USA,463-496 pp.

Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., and Lappin-Scott H.M., 1995. Microbial Biofilm. Annu Rev Microbiol., 49:711-745 pp.

Croll B.T., Chadwick B., and Knight B., 1992. The removal of atrazine and other herbicides from water using granular activated carbon. Wat. Supply, 10:111-120 pp.

De Souza, M.L., Wackett,L.P., Boundy-Mills,K.L., Mandelbaum,R.T., and Sadowsky,M.J., 1995. Cloning, characterization, and expression of a gene region from Pseudomonas sp. strain ADP involved in the dechlorination of atrazine. Appl. Environ. Microbiol., 61:3373-3378 pp.

De Souza, M.L., Sadowsky,M.J., and Wackett,L.P., 1996. Atrazine chlorohydrolase from Pseudomonas sp. strain ADP: gene sequence, enzyme purification, and protein characterization. J. Bacteriol., 178:4894-4900 pp.

De Souza,M.L., Seffernick,J., Martinez,B., Sadowsky,M.J., and Wackett,L.P., 1998. The atrazine catabolism genes atzABC are widespread and highly conserved. J. Bacteriol., 180:1951-1954 pp.

Degrémont, 1989. Mémento technique de l'eau. Ouvrage, Neuvième édition.

Degrémont, 1994. Pesticides et traitement de l'eau destinée à la consommation. Rencontres Techniques Degremont.



216

Delage L. Adsorption et mobilité de l'atrazine dans le sol : influence de la matière organique naturelle : modélisation du transport. 1995. Ref Type: Thesis/Dissertation

Detoc S., 1998. Pesticides dans les eaux: les difficultés pour la production d'eau destinée à la consommation. Actes de colloque régional de "L'eau, les pesticides et la santé" - Quéven (56) - Avril 1998.

Devinny J.S., Deshusses M.A., and Webster T.S., 1999. Biofiltration for air polluted control. CRC-Lewis Publishers, Boca Raton, FL, U. S. A. , 299p..

DGRAH, 1983. RENQA - Rede Nacional da Qualidade das Aguas. I- Bases gerais da sua organisacao, Direccao dos servicos de controle da poluicao, Direccao Geral dos Recursos et Aproveitamentos Hidraulicos. Direccao dos servicos de controle da poluicao, Direccao Geral dos Recursos et Aproveitamentos Hidraulicos.

Donnelly P.K., Entry J.A., and Crawford D.L., 1993. Degradation of atrazine and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid by mycorrhizal fungi at three nitrogen concentration in vitro. Appl. Environ. Microbiol., 59:2642-2647 pp.

Dore M., 1989. Chimie des oxydants et traitement des eaux. Technique et Documentation Lavoisier, Ch 6.

Du Plessis C.A., Strauss J.M., Sebapalo E.M.T., and Riedel K.J., 2003. Empirical model for methane oxidation using a composted pine bark biofilter. Fuel, 82:1359-1365 pp.

Dunigan E.P. and Mc Intosh T.H., 1971. Atrazine-soil organic matter interactions. Weed Sci., 19:279-282 pp.

Durham D.R., Marshall L.C., Miller J.G., and Chmurny A.B., 1994. Characterisation of inorganic biocarriers that moderate system upsets during fixed-film biotreatment processes. Appl. Environ. Microbiol., 60:3329-3335 pp.

Edell A., Morrison G.M., and Hedberg T., 1993. Pesticide interaction with activated carbon in the presence of dissolved organic material. Water Supply, 11:167-176 pp.

Emans H.J.B, Beek M.A., and Linders J.B.H.J., 1992. Evaluation system for pesticides. Agricultural pesticides. National Institute of Public Health and Environmental Protection (RIVM), report n°679101004, Bilthoven, Pays-Bas.

Ernst,C. and Rehm,H.J., 1995. Utilization of chlorinated s-triazines by a new strain of Klebsiella pneumoniae. Appl. Microbiol. Biotechnol., 42:763-768 pp.

Fadullon,F.S., Karns,J.S., and Torrents,A., 1998. Degradation of atrazine in soil by Streptomyces. J. Environ. Sci. Health B, 33:37-49 pp.

Farm C., 2003. Removal of heavy metals in water by pine bark. Vatten, 59:31-37 pp.

Feakin S.J., Gubbins B., McGhee I., Shaw L.J., and Burns R.G., 1995. Inoculation of granular activated carbon with s-triazine-degrading bacteria for water treatment at pilot-scale. Wat. Res., 29:1681-1688 pp.

Filloux A. and Vallet I., 2003. Biofilm : mise en place et organisation d'une communauté bactérienne. Medecine Sci., 19:77-83 pp.

Fletcher M., 1992. Bacterial metabolism in biofilms. In Biofilms: Sciences and Technology, L. F. Melo, T. R. Bott, M. Fletcher and B. Caperville, Eds, Kluwer, Dordrecht,113-124 pp.

Freer J., Baeza J., Maturana H., and Palma G., 1989. Removal and recovery of uranium by modified Pinus radiata D don bark. J. Chem. Technol. Biotechnol., 46:41-48 pp.



217

Gaid K. and Ravarini P., 1996. Adaptation des techniques de traitement des eaux potables en fonction de l'évolution des nouvelles normes de qualité de l'eau. 1éème Journées Information Eaux JIE96 Conférence n°2.

Gamble D.S. and Khan S.U., 1985. Atrazine hydrolysis in soils: catalysis by the acidic functional groups of fulvic acid. Can. J. Soil Sci., 65:435-443 pp.

Gaynor J.D., MacTavish D.C., and Findlay W.I., 1992. Surface and subsurface transport of atrazine and alachlor from a Brookston clay loam under continous corn production. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 23:240-245 pp.

Gcshwing N., 1992. Rapid mineralization of the herbicide atrazine by a mixed microbial community. Proceedings of the International Symposium on Environmental Aspects of Pesticide Microbiology, Sigtuna, Sweden,204-206 pp.

Gendrault S., Bayard R., Nones O.P., and Gourdon R. Influence of pine bark micro-flora on the growth and atrazine degradation activity of Pseudomonas sp. strain ADP in the treatment of contaminated waters. Proceedings of the Second European Bioremediation Conference ; Chania, Crete, Greece, June 2003, 593-596. 2003.

Gendrault S., Bayard R., Nones O.P., and Gourdon R. Influence of pine bark on the growth and atrazine degradation activity of Pseudomonas sp. strain ADP in the treatment of contaminated waters. Proceedings of Unicum Colloquium. Crop Portection. 33ème Congrès du Groupe Français des Pesticides ; Aix en Provence, France, Mai 2003.

Giacomazzi S., 2002. Mise au point et validation des techniques d'évaluation des communautés microbienne dans les milieux complexes de type sol. Thèse de doctorat - Université de Technologie de Compiègne.

Giardina M.C., Giardi M.T., and Fialacchioni G., 1985. Chemical and biological degradation of primary metabolites of atrazine by a Nocardia strain. Agric. Biol. Chem., 44:1558 pp.

Gish T.G., Shirmohammadi A., and Wienhold B.J., 1994. Field-scale mobility and persistance of commercial and starch-encapsulated atrazine and alachlor. J. Environ. Qual., 23:355-359 pp.

Glotfelty DE, Seiber JN, and Liljedahl LA., 1987. Pesticide in fog. Nature, 325:602-605 pp.

GLS, 2003. Memotec N°8. Disponible sur www. gls. fr , Consulté en 2003.

Greenhalgh R., 1986. Definition of persistance in pesticide chemistry. Pure Appl. Chem., 52:2565-2566 pp.

Grosser,R.J., Friedrich,M., Ward,D.M., and Inskeep,W.P., 2000. Effect of model sorptive phases on phenanthrene biodegradation: different enrichment conditions influence bioavailability and selection of phenanthrene-degrading isolates. Appl. Environ. Microbiol., 66:2695-2702 pp.

Guerra-Sanchez R.J., 2000. Etude de l'interaction atrazine-matière organique avec adsorption sur charbon actif pour la production d'eau potable. Thèse de Doctorat - ENSEEIHT Toulouse.

Gustafson D.I., 1989. Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide leachability. Env. Toxicol. Chem.,-339 pp.

Hamaker J.W. and Thompson J.M., 1972. Organic chemicals in the soil environment. edited by Cleve A. I. and Hamaker J. W..

Hapeman C.J., Karns J.S., and Shelton D.R., 1995. Total mineralization of aqueous atrazine in the presence of ammonium nitrate using ozone and Klebsiella terragena (strain DRS-I) : Mechanistic considerations for pilot scale disposal. J. Agric. Food Chem., 43:1383-1391 pp.



218

Hawthorne-Costa E.T., Winkler Hechenleitner A.A., and Gomez-Pineda E.A., 1995. Removal of cupric ions from aqueous solutions by contact with corm cobs. Sep. Sci. Technol., 30:2593-2602 pp.

Helling C.S., Zhuang W., Gish T.J., Coffman C.B., Isensee A.R., Kearney P.C., Hoagland D.R., and Woodward M.D., 1988. Persistance and leaching of atrazine, alachlor and cyanazine under no-tillage practices. Chemosphere, 17:175-187 pp.

Heydel L., 1998. Diagnostique et maîtrise des contaminations des eaux souterraines par les résidus d'atrazine. Thèse de Doctorat, INP de Lorraine.

Héquet V., Gonzales C., and Le Cloirec P., 2001. Photochemical processes for atrazine degradation: methodological approach. Wat. Res., 35:4253-4260 pp.

Himel C.M., Loats H., and Bailey G.W., 1990. Pesticidde sources to the soil and principles of spray physics. "Pesticide in the soil environment: Processes, impacts, and modelling" - SSSA Book Series: 2. Edition Cheng H. H.,7-50 pp.

Holiday D. and Hardin D.P., 1981. Activated carbon removes pesticides from wastewater. Chem. Engineer., March 23:88-89 pp.

Holland J.M., Frampton G.K., Cilgy T., and Wratten S.D., 1994. Arable acronyms analysed - a review of integrated arable farming systems research in Western Europe. Ann. Appl. Biol., 125:399-438 pp.

Hulsey R.A., Randtke S.J., Adams C.D., and Long B.W., 1993. Atrazine removal using ozone and GAC: a pilot palt study. Ozone Sci. Eng., 15:227-244 pp.

IFEN, 2002. Les pesticides dans les eaux. Bilan 1997-1998 et 2002. Disponible sur www. ifen. fr (consulté en Décembre 2003).

Jones,L.R., Owen,S.A., Horrell,P., and Burns,R.G., 1998. Bacterial inoculation of granular activated carbon filters for the removal of atrazine from surface water. Wat. Res., 32:2542-2549 pp.

Jucker B.A., Harms H., and ZehnderA.J., 1996. Adhesion of the positively charged bacterium Stenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J Bacteriol., 178:5472-5479 pp.

Jury W.A., Spencer W.F., and Farmer W.J., 1984. Behaviour assesment model for trace organics in soil. J. Environ. Qual., 13:558-585 pp.

Jury W.A., Focht D.D., and Farmer W.J., 1987. Evaluation of pesticide groundwater pollution potential from standard indices of soil-chemical adsorption and biodegradation. J. Environ. Qual., 16:442-428 pp.

Katz,I., Green,M., Ruskol Y., and Dosoretz C.G., 2000. Characterization of atrazine degradation and nitrate reduction by Pseudomonas sp. strain ADP. Adv. Environ. Research, 4:211-218 pp.

Kauffmann C.G. and Mandelbaum R.T., 1996. Entrapment of atrazine-degrading enzymes in sol-gel glass. J. Biotechnol., 51:219-225 pp.

Kaufman D.D. and Kearney P.C., 1970. Microbial degradation of s-triazine herbicides. Residue Reviews, 32:235-265 pp.

Kennes C. and Thalasso F., 1998. Waste gas biotreatment technology. J. Chem. Technol. Biotechnol., 72:303-319 pp.

Knappe D.R.U., Snoeyink V.L., Matsui Y., Prados M.J., and Bourbigot M.M., 1996. Determining the remaining life of granular activated carbon (GAC) filter for pesticides. Water Supply, 14:1-14 pp.



219

Koreta R., 1996. Sur le devenir des pesticides dans le sol. Cas de l'atrazine et de la simazine en sol de boulbènes, de la colonne de saol à la paecelle drainée. Thèse de doctorat Toulouse 3 - BU sciences.

Kristensen G.B., Johannsen H., and Aamand J., 2001. Mineralization of aged atrazine and mecoprop in soil and aquifer chalk. Chemosphere, 45:927-934 pp.

Kumar P. and Dara S.S., 1980. Modified barks for scavenging toxic heavy metal ions. Indian J. Environ. Health, 22:196-202 pp.

Lafrance P., Salvano E, and Villeneuve J.P., 1992. Effet de l'herbicide atrazine sur la respiration et l'ammonification de l'azote organique dans un sol agricole au cours d'une incubation. Can. J. Soil Sci., 72:1-12 pp.

Lafrance P. and Banton O., 1995. Implication of spatial variability of organic carbon on predicting pesticide mobility in soil . Geoderma, 65:331-338 pp.

Lai M.S., Jensen J.N., and Weber A.S., 1995. Oxidation of simazine: Biological oxidation of simazine and its chemical oxidation byproducts. Wat. Environ. Res., 67:347-354 pp.

Laks P.E., 1991. Chemistry of bark.

Langmuir L., 1918. The adsorption of gases on plane surface of glass, mica and platinium. J. Am/ Chem. Soc., 40:1361 pp.

Lastokie C., Gubbins K.E., Quirke N., 1993. Pore size distribution analysis of microporous carbons : a density functional theory approach. J. Phys. Chem., 97 :4786-4796 pp.

Le Cloirec P., 1998. Le transfert gaz-solide : l'adsorption. Les composés organiques volatils dans l'environnement. pp. 435-489.

Leonard R.A., Langlade G.W., and Fleming W.G., 1979. Herbicide runoff from upland piedmont watersheds - data and implications for modeling pesticide transport. J. Environ. Qual., 8:223-229 pp.

Leonard R.A., 1990. Pesticides in the soil environment: processes, impacts and modelling. Edition Cheng H. H..

Lesson A., Hapemann C.J., and Shelton D.R., 1993. Biomineralization of atrazine ozonisation products. Application to the development of a pesticide waste disposal system. J. Agric. Food Chem., 41:983-987 pp.

Li G.C. and Felbeck G.T., 1972. Atrazine hydrolysis as catalysed by humic acids. Soil Sci., 114.

Lippo H., Poikolainen J., and Kubin E., 1995. The Use of Moss, Lichen and Pine Bark in the Nationwide Monitoring of Atmospheric Heavy Metal Deposition in Finland. Water Air Soil Pollution, 85:2241-2246 pp.

Liu S.Y., Yen S.T., and Kolpin D.W., 1996. Pesticide in ground water: do atrazine metabolites matter ? Wat. Res. Bull, 32:845-853 pp.

Mandelbaum,R.T. (a), Wackett,L.P., and Allan,D.L., 1993. Mineralization of the s-triazine ring of atrazine by stable bacterial mixed cultures. Appl. Environ. Microbiol., 59:1695-1701 pp.

Mandelbaum R.T., Wackett,L.P., and Allan,D.L., 1993. Rapid hydrolysis of atrazine to hydroxyatrazine by soil bacteria. Environ. Sci. Technol., 27:1943-1946 pp.

Mandelbaum,R.T., D.L.Allan, and L.P.Wackett, 1995. Isolation and characterization of a Pseudomonas sp. that mineralizes the s-triazine herbicide atrazine. Appl. Environ. Microbiol., 61:1451-1457 pp.



220

Martin G., 1993. Atmosphère, atmosphère! Biotechnol., 126:22-28 pp.

Martinez,B., Tomkins,J., Wackett,L.P., Wing,R., and Sadowsky,M.J., 2001. Complete nucleotide sequence and organization of the atrazine catabolic plasmid pADP-1 from Pseudomonas sp. strain ADP. J. Bacteriol., 183:5684-5697 pp.

Martín-Gullón I. and Font R., 2001. Dynamic pesticide removal with activated carbon fibers. Wat. Res., 35:516-520 pp.

Masaphy S., Levanon D., Vaya J., and Henis Y., 1993. Isolation and characterization of a novel atrazine metabolite produced by the furious Pleurotus pulmonarius, 2-chloro-4-ethylamino-6-(1-hydroxyisopropyl)amino1,3,5-triazine. Appl. Environ. Microbiol., 59 :4342-4346 pp.

Masaphy S. and Mandelbaum R.T., 1997. Atrazine mineralization in slurries from soils irrigated with treated waste water. Applied Soil Ecology, 6:283-291 pp.

Matsui Y., Kamet T., Kawase E., Snoeyink V.L., and Tambo N., 1994. GAC Adsorption of intermittently loaded pesticides. J. American Water Works Association, 86:91-102 pp.

Mckinlay R.G. and Kasperec K., 1999. Observations on decontamination of herbicide polluted water by marsh plant. Wat. Res., 33:505-511 pp.

Melo L.F., 1994. Biofilmes e o controle da poluiçao. Boletim de biotecnologia, 48:16-25 pp.

Melo L.F. and Bott T.R., 1997. Biofouling in water systems. Exp. Therm. Fluid Sci., 14:375-381 pp.

Meunier N. and Blais J.F Dayal Tyagi R., 2002. Selection of a natural sorbent to remove toxic metals from acidic leachate produced during soil decontamination. Hydrometallurgy, 67:19-30 pp.

Métivier H., 2001. Procédé de traitement d'eau par adsorption sur tissus de carbone active - Couplage ultrafiltration-adsorption. Thèse de doctorat - Ecole des Mines de Nantes.

Migrain,I., G.A.Green, and H.Monteil, 1993. Degradation of atrazine in laboratory microcosms: isolation and identification of the biodegrading bacteria. Environ. Toxicol. Chem., 12:1627-1634 pp.

Ministère de l'Ecologie et du Dveloppement Durable, 2003. Disponible sur www1. environnement. gouv. fr. Consulté en 2003.

Montiel A. Etude bobliographique: Utilisation des herbicides et des triazines en particulier. D.R.A.S.S.Ile de France SAGEP, 273. 1990. Ref Type: Report

Mott T.R., 1991. Biolouling and studies using simulated cooling water. Thèse de doctorat, Université de Birmingham, UK.

Mougin C., Laugero C., Asther M., Dubroca J., Frasse P., and Asther M., 1994. Biotransformation of the herbicide atrazine by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol., 60:708 pp.

Nagy,I., Verheijen,S., De Schrijver,A., Van Damme,J., Proost,P., Schoofs,G., Vanderleyden,J., and De Mot,R., 1995. Characterization of the Rhodococcus sp. NI86/21 gene encoding alcohol: N,N'-dimethyl-4-nitrosoaniline oxidoreductase inducible by atrazine and thiocarbamate herbicides. Arch. Microbiol., 163:439-446 pp.

Nearpass D.C., 1972. Soil Sci. Soc. Am. Proc. 1972, 36:606 pp.

Nelieu S., 1994. Les produits d'ozonation de l'atrazine dans l'eau: nouvelles stratégies d'analyse associées à la spectrométrie de masse. Thèse de doctorat - Institut National Polytechnique de Toulouse.



221

Newcombe,D.A. and Crowley,D.E., 1999. Bioremediation of atrazine-contaminated soil by repeated applications of atrazine-degrading bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 51:877-882 pp.

Noualhat L., 2003. Les eaux font le plein de pesticides. Le monde du 12 Février,20 pp.

O'Toole G.A. and Kolter R., 1998. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol. Microbiol., 30:295-304 pp.

O'Toole G.A., Kaplan H.B., and Kolter R., 2000. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol., 54:49-79 pp.

Okeimen F.E., Ogbeifun D.E., Nwala G.N., and Kunmsah C.A., 1985. Binding of cadmium, copper and lead ions by modified cellulosic materials. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 34:866-870 pp.

Olmstead K.P. and Weber W.J., 1991. Interactions between microorganisms and activated carbon in water and waste treatment operations. Chem. Engeng Comm., 108:113-125 pp.

Omgbu J.A. and Iweanya V.I., 1990. Dynamic sorption of Pb 2+ and Zn 2+ with palm (Elaegis guineesis) kernel husk. J. Chem. Ed., 67:800-801 pp.

Orlando U.S., Baes A.U., Nishijima W., and Okada M., 2002. Preparation of agricultural residue anion exchangers and its nitrate maximum adsorption capacity. Chemosphere, 40:1041-1046 pp.

Ostrofsky E.B., Traina S.J., and Tuovinen O.H., 1997. Variation in atrazine mineralization rates in relation to agricultural management practice. J. Environ. Qual., 26:647-657 pp.

Ostrofsky E.B., Robinson J.B., Traina S.J., and Tuovinen O.H., 2002. Analysis of atrazine-degrading microbial communities in soils using most-probable-number enumeration, DNA hybridization, and inhibitors. Soil Biol. Biochem., 34:1449-1459 pp.

Ottengraf S.P.P., 1986. Exhaust gas purification. pp. 462-452.

Paillard H., Cleret D., and Bourbigot M.M., 1990. Elimination des pesticides azotés par oxydation et par adsorption sur charbon actif. 9ème Journées Information Eaux JIE90 - Conférence n°12.

Pelizzetti E., Maurino V., Minero C., Carlin V., Pramauro E., Zerbinati O., and Tosato M.L., 1990. Photocatalytic degradation of atrazine and other s-triazine herbicides. Environ. Sci. Technol., 24:1559-1565 pp.

Peternele W.S., Winkler-Hechenleitner A.A., and Gómez Pineda E.A., 1999. Adsorption of Cd(II) and Pb(II) onto functionalized formic lignin from sugar cane bagasse. Biores. Technol., 68 :95-100 pp.

Pimentel D. and Levitan L., 1986. Pesticides: amounts applied and amounts reaching pests. Bioscience, 36:91 pp.

Pimentel D., 1995. Amount of pesticides reaching target pests: environmental impacts and ethics. J. Agric. Environ. Ethics, 8:29 pp.

Pinheiro M.M., Melo L.F., Bott T.R., Pinheiro J.D., and Leitao L., 1988. Surface phhenomena and hydrodynamic effects on the deposition of Pseudomonass fluorescens. Can. J. Chem. Eng., 66:63-67 pp.

Plust S.J., Loehe J.R., Benedict J.H., and Herbrandson H.F., 1981. Kinetics and mechanism of hydrolysis of chloro-1,3,5-triazines Atrazine. J. Org. Chem., 46:3661-3665 pp.

Polany M., 1916. Adsorption von gasen durch ein festes nichtfluchtiges adsorbens. Ber Deutsche Phys. Ges., 18:80 pp.

Prados M.J., Roche P., Dagois G., and Philipot J.M., 1993. Elimination de l'atrazine par adsorption sur charbon actif: modélisation du phénomène. AGT'A Toulouse 73ème Congrès,349-358 pp.



222

Piutti S., Semon E., Landry D., Hartman A., Dousset S., Lichtfouse E., Topp E., Soulas G., and Martin-Laurent F., 2003. Isolation and characterisation of Nocardioides sp. SP12, an atrazine-degrading bacterial strain possessing the gene trzN from bulk- and maize rhizosphere soil. FEMS Microbiology Letters, 221:111-117 pp.

Pussemier L., Goux S., Vanderheyden V., Debongnie P., Trésinie I., and Foucart G. Rapid dissipation of atrazine in soils taken from various maize fields. Weed Res. 37, 171-179. 1997. Ref Type: Generic

Radosevich,M., Traina,S.J., Hao,Y.L., and Tuovinen,O.H., 1995. Degradation and mineralization of atrazine by a soil bacterial isolate. Appl. Environ. Microbiol., 61:297-302 pp.

Ramirez Lopez E.M. Desarrollo de una tecnologia mexicana (CASCABIO) de biofiltracion con subproductos agricolas locales como soporte. 1997 M.S. Génie Biologique, Mexico. 150p.

Ramirez Lopez E.M., 2001. Elimination de composés organiques volatils (COV) présents dans l'air par un biofiltre à garnissage naturel structuré. Thèse de doctorat - Ecole des Mines de Nantes.

Randall J.M., Reuter F.W., and Waiss A.C., 1975. Removal of cupric ions from solution with peanut skins. J. Appl. Polym. Sci., 19:1571 pp.

Randke S.J., Witt A.A., Adams P.V., Pancake R.E., and Adams C.D., 1994. Occurence and control of atrazine and its degradation products in drinking water supplies. Annual Conference of the American Water Works Association,959-989 pp.

Rao P.S.C. and Davidson J.M., 1982. Retention and transfromation of selected pesticides and phosphorus in soil-water systems : a critical review. EPA-6003-82-060-US Environmental Protection Agency, Athens, GA,321 pp.

Ratola N., Botelho C., and Alves A., 2003. The use of pine bark as a natural adsorbent for persistent organic pollutants: study of lindane and heptachlor adsorption. J. Chem. Technol. Biotechnol., 78:347-351 pp.

Ratola N.M., 2002. Adsorcao de micropoluentes por casca de pinheiro. Thèse de Mastère Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, Portugal.

Reinhardt C. and Nel P. A bioassay technique for estimating atrazine dissipation time in soils. Proceedings IX Simposium Pesticide Chemistry " Mobility and degradation of xenobiotics", Piacenza. 479-487. 1993. Ref Type: Conference Proceeding

Rice C.P., Nochetto C.B., and Zara P., 2002. Volatilization of trifluralin, atrazine, metolachlor, chlorpyrifos, a-endosulfan, and b-endosulfan from freshly tilled soil . J. Agric. Food Chem., 50:4009-4017 pp.

Richard Y., Duguet J.P., Hubele C., and Mueller P., 1991. Pesticides et eau potable. L'eau, l'industrie et les nuisances, 144.

Rima J., Aoun E., and Hanna K., 2004. Use of beetroot fibers to clean water contaminated with heavy metals, to soften hard water and to desalinate seawater. Toxicol. Environ. Chemistry, In Press.

Robinson J.A., Trulear M.G., and Charaklis W.G., 1984. Cellular reproduction and extracellular polymer formation by Pseudomonas aeruginpsa in continuous culture. Biotechnol. Bioeng., 26:1409-1417 pp.

Rousseaux S., Hartmann A., and Soulas G., 2001. Isolation and characterisation of new Gram-negative and Gram-positive atrazine degrading bacteria from different French soils. FEMS Microbiol. Ecology, 36:211-222 pp.



223

Roy W.R. and Krapac I.G., 1994. Adsorption and desorption of atrazine and deethylatrazine by low organic carbon geologic materials. J. Environ. Qual., 23:549-556 pp.

Ruthven M.R., 1938. Principles of adsorption and adsorption processes. John Wiley and Sons.

Sadowsky,M.J., Tong,Z., de Souza,M., and Wackett,L.P., 1998. AtzC is a new member of the amidohydrolase protein superfamily and is homologous to other atrazine-metabolizing enzymes. J. Bacteriol., 180:152-158 pp.

Saltmiras D.A. and Lemley A.T., 2002. Atrazine degradation by anodic Fenton treatment. Wat. Res., 36:5113-5119 pp.

Schiavon M., 1980. Contribution à l'étude du mouvement et de la dégradation de l'atrazine dans deux sols agricoles drainés. Interaction matière organique-herbicide. Thèse de Doctorat, INP de Lorraine.

Schiavon M., 1988. Studies of the movement and formation of bound residues of atrazine, of its chlorinated derivatives and of hydroxyatrazine in soil using 14C ring labeled compounds under outdoor conditions. Ecotox. Environ. Safety, 15:55-61 pp.

Schiavon M., Barriuso E., Portal J.M., Andreux F., Bastide J., Coste C., and Millet A., 1990. Etude du devenir de deux substances organiques utilisées dans les sols, l'une massivement (atrazine) et l'autre à l'état de trace (le metsulfuron-méthyl), à l'aide de molécules marquées au 14C. Rapport SRETIE / MERE,75 pp.

Schiavon M., Portal J.M., and Andreux F., 1992. Données actuelles sur les transferts d'atrazine dans l'environnement. Agronomie, 12:139 pp.

Schiavon M., Perrin-Garnier C., and Portal J.M., 1995. La pollution de l'eau par les produits phytosanitaires. Agronomie, 15:170 pp.

Scott J.A., Karanjkar A.M., and Rowe D.L., 1995. Biofilm covered granular activated carbon for decontamination of streams containing heavy metals and organic chemicals. Miner. eng., 8:221-230 pp.

Sénat. 2004. Disponible sur internet www.senat.fr/rap/I02-215-2/I02-215-275.htm, „Etapes et procédés de traitement des eaux usées“. Consulté en juillet 2004

Servais G., Billen G., Ventresque C., and Bablon G.P., 1991. Microbial activity in GAC filters at the Choisy-le-Roi treatment plant. J. Am. Wat. Wks Assoc., 83:62-68 pp.

Severn D.J. and Ballard G., 1990. Risk/benefit and regulations. In Pesticide in the soil environment. Soil Sci. Soc. Am. Book Series, n°2, Madison, WI, USA.

Shapir,N., Mandelbaum,R.T., and Gottlieb,H., 1998. Atrazine degradation in saline wastewater by Pseudomonas sp. strain ADP. journal of industrial microbiology & biotechnology, 20:153-159 pp.

Shukla S.R. and Sakhardande V.D., 1990. Cupric ion removal by dyed cellulosics materials. J. Appl. Polym. Sci., 41:2655-2663 pp.

Sirons G.J., Anderson R., Frank R., and Ripley B.D., 1982. Persistance of hormone-type herbicide residue in tissue of susceptible crop plants. Weed Sci., 30:578 pp.

Skipper H., Gilmour C.M., and Furtick W.R., 1967. Microbial versus chemical degradation of atrazine in soils. Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 31:653-656 pp.

Smet E., Chasaya G., Van Langenhove H., and Verstraete W., 1996. The effect of inoculation and the type of carrier material used on the biofiltration of methyl sulphide. Appl. Microbiol. Biotechnol., 45:293-298 pp.



224

Somich C.J., Muldoon M.T., and Kearney P.C., 1990. On-site treatment of pesticide waste and rinsate using ozone and biologically active soil. Environ. Sci. Technol., 24:745-749 pp.

Speitel G.E.., Turakhia M., and Lu C.J., 1989. Initiation of micropollutant biodegradation in virgin GAC columns. J. Am. Wat. Wks Assoc., 81:176 pp.

Stolpe N.B. and Shea P., 1995. Alachlor and atrazine degradation in a Nebraska soil and underlying sediments. Soil Sci., 160.

Strong L.C., Rosendahl C., Johnson G., Sadowsky M.J., and Wackett,L.P., 2002. Arthrobacter aurescens TC1 metabolizes diverse s-triazine ring compounds Source : Applied and environmental microbiology. Appl. Environ. Microbiol., 68:5973-5980 pp.

Struthers,J.K., Jayachandran,K., and Moorman,T.B., 1998. Biodegradation of atrazine by Agrobacterium radiobacter J14a and use of this strain in bioremediation of contaminated soil. Appl. Environ. Microbiol., 64:3368-3375 pp.

Stucki G., Yu C.W., Baumgartner T., and Gonzalez-Valero J.F., 1995. Microbial atrazine mineralisation under carbon limited and denitrifying conditions. Wat. Res., 29:291-296 pp.

Tang H.M., Hwang S.J., and Hwang S.C., 1996. Waste gas treatment in biofilters. J. Air Waste Manag. Assoc, 46:354 pp.

Taylor A.W. and Spencer W.F., 1990. Pesticides in the soil environment: Processes, impacts, and modelling. Edition Cheng H. H..

Technologies Saint Laurent. 2004. Disponible sur internet http://dsp-psd.pwgsc.gc.ca/Collection/En1-17-6-1993F.pdf, consulté en juillet 2004

Tercé M. and Calvet R., 1975. Role of aluminium in the adsorption of atrazine by clay minerals. Proceeding of the Israel-France Symposium " Behaviour of Pesticides in soils".

Tercé M. and Calvet R., 1978. Adsorption on several herbicides by montmorillonite, kaolonite and illite clays. Chemosphere, 4:365-370 pp.

Tissut and Severin, 1984. Plantes, herbicides de désherbage. Bases scientifiques et Techniques. pp. 218.

Tissut. Le transfert des pesticides dans les plantes et dans l'eau du sol. Colloque Phyt'Eau, Versaille 1992. 1992. Ref Type: Conference Proceeding

Topp,E., Smith W.N., Reynolds W.D., and Khan S., 1994. Atrazine and metolachlor dissipation in soils incubated in undisturbed cores, and flasks. J. Environ. Qual., 23:693-700 pp.

Topp,E., Mulbry,W.M., Zhu,H., Nour,S.M., and Cuppels,D., 2000. Characterization of S-triazine herbicide metabolism by a Nocardioides sp. isolated from agricultural soils. Appl. Environ. Microbiol., 66:3134-3141 pp.

Topp,E., Zhu,H., Nour,S.M., Houot,S., Lewis,M., and Cuppels,D., 2000. Characterization of an atrazine-degrading Pseudaminobacter sp. isolated from Canadian and French agricultural soils. Appl. Environ. Microbiol., 66:2773-2782 pp.

Trotter D.M., Wong M.P., and Kent R.A., 1990. Canadian water quality guidelines for atrazine. Minister of Supply and Services Canada, Ottawa.

Trulear M.G. and Characklis W.G., 1982. Dynamics of biofilms processes. J. Water Pollut. Control Fed., 54:1288-1381 pp.



225

Van der Werf H.M.G., 1997. Evaluer l'impact des pesticides sur l'environnement. Le courrier de l'environnement, disponible sur http://inra. fr/internet/produits/dpenv/hayowc31. htm (consulté le 26/02/2002), 31.

Van Langenhove H., Wuyts E., and Schamp N., 1986. Elimination of hydrogen sulphide from odorous air by a wood bark biofilter. Wat. Res., 20:1471-1476 pp.

Vanderheyden V., Debongnie P., and Pussemier L., 1997. Accelerated degradation and mineralization of atrazine in surface and subsurface soil materials. Pesticide Sci., 49:237-242 pp.

Vasconcelos L.A., 1989. Utilização de Casca de Pinheiro na Remoção de Metais Pesados em Águas Contaminadas. Thèse de Doctorat - Faculdade de Engenharia de Porto.

Vasil'Chenko L.G., Khromonygina V.V., Koroleva O.V., Landesman E.O., Gaponenko V.V., Kovaleva T.A., Kozlov Yu P., and Rabinovich M.C., 2002. Consumption of triazine herbicide atrazine by laccase-positive and laccase-negative strains of soil fungus Mycelia sterilia INBI 2-26. Prikladnaâ biohimiâ i mikrobiologiâ, 38:534-539 pp.

Vazquez G., Antorrena G., Gonzalez J., and Doval M.D., 1994. Adsorption of heavy metal ions by chemically modified Pinus pinaster bark. Biores. Technol., 48:251-255 pp.

Vazquez G., Gonzalz-Alvarez J., Freire S., Lopez-Lorenzo M., and Antorrena G., 2002. Removal of cadmium and mercury ions from aqueous solution by sorption on treated Pinus pinaster bark: kinetics and isotherms. Biores. Technol., 82:247-251 pp.

Ventresque C. and Bablon G., 1997. The integrated nanofiltration system of the Méry-sur-Oise surface water treatment plant (37 mgd). Desalination, 113:263-266 pp.

Vieira M.J., 1995. Estudo da formacao de filmes biologicos por Pseudomonas fluorescens e dos efeitos associados a transferencia de massa interna e a incorporacao de particulas de caulino. Thèse de Doctorat - Université de Braga - Portugal.

Walker A. and Zimdahl R.L., 1981. Simulation of the pesticide atrazine, linuron and metolachlor in soil at different sites in the USA. Weed Research, 21:255-265 pp.

Walker A., Hance R.J., Allen J.G., Briggs G.G., Chen Y.L., Gaynor J.D., Hogue E.J., Malquori A., Moody K., Pestemer J.R., Rahman A., Smith A.E., Streibig J.C., Tortenson N.T.L., Widyanto L.S., and Zandvoort R., 1983. Herbicide-soil working group: collaborative experiments on simazine persistance in soil. Weed Research, 23:373-383 pp.

Walker S.R. and Blacklow W.M., 1994. Adsorption and degradation of triazine herbicides in soils used for lupin production in Western Australia : Laoratory studies and a simulation model. Aust. J. Soil Res.,1189-1205 pp.

Wall D. and Kaiser D., 1999. Type IV pili and cell motility. Mol. Microbiol., 32:1-10 pp.

Wang Z., Gamble D.S., and Langford C.H., 1991. Interaction of atrazine with Laurentian humic acid. Anal. Chim. Acta, 244:135-143 pp.

Wauchope R.D., Buttler T.M., Hornsby A.G., Beckers P.W., and Burt J.P., 1992. The SCS/ARS/CES pesticide properties database for environmental decision-making. Rev. Environ. Contam. Toxicol., 123:1-164 pp.

Weber J.B., 1966. Molecular structure and pH effects on the adsorption of 13 s-triazine compounds on montmorillonite clay. Amer. Miner., 51:1657 pp.

Weber J.B., Weed S.B., and Waldrep T.W., 1974. Effect of soil constituents on herbicide activity in modified soil field plots. Weed Sci., 22:454-459 pp.



226

Weed D.A.J., Kanwar R.S., Stoltenberg D.E., and Pfeiffer R.L., 1995. Dissipation and distribution of herbicides in the soil profile. J. Environ. Qual., 24:68-79 pp.

Welte B., Montiel A., Dupas S., and Hennion M.C., 1996. Evolution de la concentration en pesticides dans deux filières de traitement d'eaux de surface. 12ème Journées Information Eaux JIE96 - Conférence n°5.

Wimpenny J.W.T., 1977. Exopolysaccharide production by Pseudomonas NCIB11264 grown in batch culture. J. Gen. Microbiol., 102:21 pp.

Yamane V.K. and Green R.E., 1972. Adsorption of ametryne and atrazine on an oxisol montmorillonite and charcoal in relation to pH and solubility effects. Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 36:58-64 pp.

Yanze-Kontchou,C. and Gschwind,N., 1994. Mineralization of the herbicide atrazine as a carbon source by a Pseudomonas strain. Appl. Environ. Microbiol., 60:4297-4302 pp.

Yanze-Kontchou C.Y. and Gschwind, N., 1999. Biodegradation of s-triazine compound by a stable mixed bacterial community. Ecotox.Environ.Biotechnol. 43 :47-56 pp.


227

LISTE DES FIGURES

Etude Bibliographique

Figure 1 : Comportement des pesticides dans les sols ........................................................................ 16

Figure 2 : Evolution de la capacité d’adsorption de l’atrazine sur les acides humiques (AH) (0,4 g/L) en

fonction du pH, d’après Wang et al. (1991) ................................................................................... 20

Figure 3 : Exemple de mécanisme de dégradation biologique et chimique de l’atrazine, d’après

Giardini et al., 1985........................................................................................................................ 26

Figure 4 : Différentes voies de dégradation de l’atrazine par ozonation selon Acero et al. (2000) ...... 33

Figure 5 : Echange d’ions entre la procyanidine (tanin de l’écorce) et un ion métalique divalent

(Vazquez et al. 2002)..................................................................................................................... 41

Figure 6 : Exemple de dégradation de l’atrazine par une communauté bactérienne, selon Orstrofsky et

al. (2002)........................................................................................................................................ 45

Figure 7 : Schéma du procédé de traitement imaginé par McKinlay et Kasperek (1997) .................... 46

Figure 8 : Dégradation de l’atrazine au cours du temps avec 4 additions successives d’atrazine (6

mg/l) dans le système de McKinlay et Kasperek (1999) pour les 4 macrophytes étudiés. ........... 47

Figure 9 : Developpement idéal d’un biofilm (Melo, 1997) ................................................................... 51

Figure 10 : Les différentes étapes de formation d’un biofilm (adapté de Melo, 1994) ......................... 52

Figure 11 : Influence de la charge organique sur l’épaisseur du biofilm (inspiré de Characklis 1990) 58

Figure 12 : Effet de la vitesse de circulation sur la formation du biofilm (inspiré de Pinheiro et al.,

1988) .............................................................................................................................................. 59

Figure 13 : Mécanisme de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.selon Martinez et al.

(2001)............................................................................................................................................. 67

Figure 14 : Représentation des différentes phases d’un milieu poreux................................................ 74


228

Etude Expérimentale

Figure 1 : Distribution de Pinus pinaster en Europe et en Afrique du Nord (Ratola, 2002)...................79

Figure 2: Répartition des espèces forestière du Portugal (Inventaire National des forets – 3ème édition,

1998) ...............................................................................................................................................79

Figure 3 : Ecorce de pin Pinus pinaster .................................................................................................80

Figure 4 : Ecorce brute de pin Pinus Pinaster .......................................................................................88

Figure 5 : Formule développée de l’atrazine..........................................................................................90

Figure 6 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en présence de MeOH (A) ou sans

MeOH (B) ; diamètre des particules d’écorce :d<200 µm ; ratio L/S=20 ; température 20°C ;

temps de contact 24h......................................................................................................................91

Figure 7 : Essais de cinétique d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en milieu dispersé ..........93

Figure 8 : Différentes courbes d’élution rencontrées suite à une injection en créneau (1 à 3). C et V

expriment respectivement la concentration en soluté et le volume de solution cumulé récolté en

sortie de colonne ; Vo représente le volume d’eau total contenu dans la colonne, C0 est la

concentration entrante de soluté ....................................................................................................95

Figure 9 : Schéma d’une colonne ..........................................................................................................98

Figure 10 : Dispositif expérimental pour l’étude de l’adsorption en colonne .......................................101

Figure 11 : Cinétique de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin (d<200 µm) à différentes

concentrations initiales ; 20 ± 2°C ; L/S = 20 mL.mg-1..................................................................102

Figure 12 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoclavée en poudre de

différentes granulométries (d<200 µm ; 200 µm < d < 500 µm ; 500 µm< d < 2000 µm ; mélange

de particules d<2000 µm) ; 20 ± 2°C ; pH 4,5 ; Temps de contact 24h .......................................103

Figure 13 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoclavée (d<200 µm) en

suspension aqueuse tamponnée à pH 4 ou pH 7 ; rapport L/S =40 ; 23 ± 2 °C ; temps de contact

24 h ...............................................................................................................................................105


229

Figure 14 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine ([atrazine]i= 2,6 à 749 µg.L-1) sur l’écorce de pin en

poudre (d<200 µm) ; ratio L/S = 10, 100 et 1000 ; 20 ± 2°C ; pH 4-5 ; temps de contact 24h.....106

Figure 15 : : Isothermes d’adsorption de l’atrazine ([atrazine]i= 1 à 20 mg.L-1) sur l’écorce de pin en

poudre (d<200 µm) ; ratio L/S = 10, 20 et 100 ; 20 ± 2°C ; pH 4-5 ; temps de contact 24h.........106

Figure 16 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin (d<200 µm) et sur charbon actif

(d<200 µm) ; ratio L/S=1000 ; 20 ± 2°C ; temps de contact 24h ..................................................107

Figure 17 : Comportement hydrodynamique : Transfert de KCl dans les colonne d’écorce de pin

stérile (droite) ou non stérile (gauche) ; Débit de colonne = 1 mL.min-1 ; 22°C............................108

Figure 18 : Suivi du COD en sortie de colonne d’écorce de pin stérile et non stérile traversée par une

solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min-1 ; 22°C ; Temps de séjour ≅ 20 min ................109

Figure 19 : Suivi du pH en sortie de colonne (10 g écorce stérile ou d’écorce non stérile) traversée par

une solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min-1 ; 22°C ; temps de séjour ≅ 20 min ..........110

Figure 20 : Suivi de la conductivité en sortie de colonne (10 g d’écorce stérile ou d’écorce non stérile)

traversée par une solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min-1 ; 22°C ; temps de séjour ≅ 20

min ................................................................................................................................................110

Figure 21 : Adsorption de l’atrazine sur écorce de pin (stérile ou non stérile) et sur charbon actif en

colonne (masse d’adsorbant 10g), circulation en circuit ouvert ; [atrazine]i=0,2 mg.L-1 ; débit = 1

mL.min-1 ; 22°C ; temps de séjour ≅ 20 min .................................................................................112

Figure 22 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoclavée et non autoclavée

(d<200µm); ratio L/S=20 ; 20°C ; temps de contact 24h ..............................................................113

Figure 23 : Utilisation du glycérol ou du glucose comme source de carbone par Pseudomonas ADP

sp. Suivi de la respiration de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) en présence

d’atrazine (30 mg.L-1) comme source d’azote et 1g.L-1 de glucose ou glycérol comme source de

carbone ; 30°C ; agiation 150 rpm................................................................................................119

Figure 24 : Comparaison de la minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. inoculé à

environ 106 cfu/mL à partir d’une préculture ou de cellules congelées, en milieu minéral MM

(glucose 1g.L-1 ; 14C-atrazine 20 mg.L-1), 20°C. ...........................................................................120

Figure 25 : Flacon de DBO équipé de tête Oxitop® utilisé lors des études de respirométrie .............123


230

Figure 26 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM-glucosé à 1 g.L-1) avec

atrazine (30 mg.L-1) additionnée au milieu à partir d’une solution mère concentrée dans le

méthanol ou dissoute directement en poudre dans le milieu MM ; 30°C ; agitation 150 rpm ......125

Figure 27 : Photo d’un biomètre pour l’étude de la minéralisation de l’atrazine ..................................126

Figure 28 : Représentation schématique d’un biomètre utilisé dans les essais de minéralisation en

« Batch ».......................................................................................................................................127

Figure 29 : Influence de la température sur la croissance (A) de Pseudomonas ADP sp. et sa capacité

à dégrader l’atrazine (B) en milieu minéral (MM), avec atrazine (environ 50 mg.L-1) comme seule

source d’azote et glucose (1 g.L-1) comme source de carbone ; agitation orbitale (150 rpm) ; pH 7133

Figure 30 : Influence du pH sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. (A) et sa capacité à dégrader

l’atrazine (B) en milie minéral (MM) ; atrazine comme seule source d’azote (environ 15 mg.L-1) ;

glucose (1g mg.L-1) ; 30°C ; agitation orbitale (150 rpm)..............................................................134

Figure 31 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et dégradation primaire de l’atrazine présente ou

non (50 mg.L-1) en milieu minéral (MM) en présence ou non d’une source additionelle d’azote

(sulfate d’ammonium 1 g.L-1) ; Glucose (1 g.L-1) ; 30°C ; agitation orbitale 150 rpm ...................136

Figure 32 : Minéralisation de l’atrazine (concentration initiale environ 20 mg.L-1) par Pseudomonas

ADP sp. en milieu riche (LB) ou en milieu minéral (MM ; glucose 1 g.L-1) contenant ou non une

source additionnelle d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L-1) ; 30°C ; Agitation 150 rpm ; 14C-

atrazine à 1 µCi/fiole .....................................................................................................................138

Figure 33 : Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) en présence de 1

ou 0,25 g.L-1 de glucose comme source de carbone, 1 g.L-1 de sulfate d’ammonium ; en extrait

aqueux d’écorce de pin (sulfate d’ammonium 1 g.L-1 comme source d’azote) en présence ou non

de sels minéraux ; 30°C ; agitation 150 rpm.................................................................................139

Figure 34 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait stérile d’écorce de pin ou en milieu

minéral (MM) contenant ou non une source additionnelle de carbone (glucose 1g.L-1 noté Glc)

et/ou une source d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L-1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm..........141

Figure 35 : Activité respiratoire (exprimée en mg de O2.L-1) de Pseudomonas ADP sp. en extrait

aqueux d’écorce de pin contenant (0,25 mg.L-1 ; 0,5 mg.L-1 ou 1 mg.L-1) ou non du glucose ;

30°C ; agitation 150 rpm. .............................................................................................................142


231

Figure 36 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en extrait aqueux

d’écorce de pin stérile ou en milieu minéral MM (glucose 1 g.L-1) en présence d’atrazine (50 mg.L-

1) avec ou sans sulfate d’ammonium (1 g.L-1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm.........................143

Figure 37 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp en extrait aqueux d’écorce de pin

stérile ou en milieu minéral MM (glucose 0,25 g.L-1) ; concentration initiale en atrazine 20 mg.L-1 ;

22°C ; agitation lente.....................................................................................................................144

Figure 38 : Croissance du consortium isolé à partir de l’écorce de pin et biodégradation de l’atrazine

en milieu LB ou en extrait aqueux d’écorce de pin inoculé avec environ 106 cfu.mL-1 de chaque

isolat (CP1 à CP4) ; atrazine comme source d’azote (55 mg.L-1) ; 30°C ; agitation 150 rpm ......151

Figure 39 : Biodégradation de l’atrazine en milieu LB par les micro-organismes isolés de l’écorce de

pin (inoculé avec environ 106 cfu.mL-1 de CP1, CP2, CP3 ou CP4) ; atrazine comme source

d’azote (environ 55 mg.L-1) ; 30°C ; agitation 150 rpm.................................................................152

Figure 40 : Minéralisation de l’atrazine en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de

pin stériles ou non stériles (d<200 µm) à un ratio L/S=20 ; [atrazine]i=20 mg.L-1 ou 44,2 µg.L-1

comme seule source d’azote ; 20 ± 2 °C ; agitation lente ............................................................153

Figure 41 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) contenant des particules

d’écorce de pin (ratio L/S=10), en présence d’atrazine (30 mg.L-1) ; 30°C ; agitation 150 rpm. En

foncé : Pseudomonas ADP sp. est inoculé avec l’écorce stérile ; en clair : Pseudomonas ADP sp.

est inoculé avec l’écorce non stérile .............................................................................................154

Figure 42 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin stérile ou non

stérile en présence d’atrazine (environ 50 mg.L-1) ; 30°C ; agitation 150 rpm .............................155

Figure 43 : Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux stérile et non

stérile d’écorce de pin ; [atrazine ]i= 30 mg.L-1 ; 30°C ; agitation 150 rpm...................................156

Figure 44 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. présente à une concentration

initiale de 20 mg.L-1 (A) ou 44,2 µg.L-1 (B) en milieu minéral (MM) contenant des particules

d’écorce de pin stériles ou non stériles (L/S=20) ; 20 ± 2 °C ; agitation lente..............................157

Figure 45 : Utilisation des différents réplicats pour l’étude en batch du traitement combiné ..............162

Figure 46 : Distribution de la radioactivité dans les essais batch – Méthodes de suivi de la radioactivité

dans les différents compartiments ................................................................................................163


232

Figure 47 : Lits d’écorce de pin issus des colonnes après inoculation de Pseudomonas ADP sp.

pendant 2 ou 6 jours ; prélèvements pour analyses au MEB.......................................................168

Figure 48 : Montage expérimental : Hydrodynamique des colonnes avant et après inoculation avec

Pseudomonas ADP sp..................................................................................................................170

Figure 49 : Montage expérimental pour les essais en colonne de traitement combiné d’une solution

polluée à l’atrazine après inoculation des colonnes avec Pseudomonas ADP sp. pendant 6 jours.172

Figure 50 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM- Glucose

1,25 g.L-1), en présence ou non d’écorce en poudre (d<200 µm) stérile ou non stérile (ratio L/S

=20) ou en extrait aqueux stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation lente au barreau aimenté ;

Concentration initiale en atrazine 44,2 µg.L-1. Les témoins ne reçoivent pas Pseudomonas ADP

sp. .................................................................................................................................................174

Figure 51 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM- Glucose

1,25 g.L-1), en présence ou non d’écorce en poudre (d<200 µm) stérile ou non stérile (ratio L/S

=20) ou en extrait aqueux stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation lente au barreau aimenté ;

Concentration initiale en atrazine 20 mg.L-1. Les témoins ne reçoivent pas Pseudomonas ADP sp.174

Figure 52 : Distribution de la radioactivité en solution dans les essais de minéralisation

([atrazine]i=44,2µg.L-1 ) en milieu minéral (MM) et en extrait stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ;

Agitation lente au barreau aimenté ; incubation 15 jours .............................................................177

Figure 53 : Distribution de la radioactivité en solution dans les essais de minéralisation ([atrazine]i=20

mg.L-1 ) en milieu minéral (MM) et en extrait stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation lente au

barreau aimenté ; incubation 15 jours ..........................................................................................178

Figure 54 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de

minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu minéral (MM-Glucose), extrait aqueux

d’écorce de pin, en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d<200 µm) stérile (E st.) ou non

stérile (E non st.) après 350 h d’incubation à 20 ± 2 °C ; concentration initiale en atrazine = 44,2

µg.L-1 ; agitation lente ...................................................................................................................179


minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu minéral (MM-Glucose), extrait aqueux

d’écorce de pin, en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d<200 µm) stérile (E st.) ou non

stérile (E non st.) après 350 h d’incubation à 20 ± 2 °C ; concentration initiale en atrazine = 20

mg.L-1 ; agitation lente ..................................................................................................................180


233


minéralisation par Pseudomonas ADP sp., après 15 jours d’incubation à 20 ± 2 °C ;

[atrazine]i = 44,2 µg.L-1 (Figure de Gauche) et [atrazine]i = 20 mg.L-1 (Figure de Droite)............182


minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d<200 µm)

stérile (Ec st.) ou non stérile (Ec non st.) 7 mois d’incubation à 20 ± 2 °C ; [atrazine]i = 20 mg.L-1182


minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d<200 µm)

stérile (Ec st.) ou non stérile (Ec non st.) 7 mois d’incubation à 20 ± 2 °C ; [atrazine]i = 44,2 µg.L-1183

Figure 59 : Courbe d’élution de KCl pour les colonnes d’écorce de pin stérile (gauche) ou non stérile

(droite), avant (ronds) et après (carrés) circulation pendant 6 jours d’une culture de

Pseudomonas ADP sp. ; 20 ± 2°C ; débit 1,0 mL.min-1 ; temps de contact 20 min .....................188

Figure 60 : Montage expérimentale pour les essais d’adsorption en colonne composé d’une étuve

climatisée à 20±2°C , d’un multianalyseur (pH, conductivité) ; de deux pompes peristaltiques et

d’un collecteur de fractions ...........................................................................................................189

Figure 61 : Courbe d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 0,2 mg.L-1) traversant

une colonne d’écorce de pin non stérilisée (à gauche) ou d’écorce stérilisée (à droite) inoculée

(traitement combiné) ou non (adsorption) avec Pseudomonas ADP sp. pendant les 6 jours

précédant le traitement. 20 ± 2°C ; débit 1 ml.min-1 ; temps de contact 22 min..........................190

Figure 62 : Courbes d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 2,34 µg.L-1) traversant

une colonne d’écorce de pin stérile inoculée (traitement combiné) ou non (adsorption) avec

Pseudomonas ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement. 20 ± 2°C ; débit 0,3 ml.min-

1 ; temps de contact 100 min ........................................................................................................191

Figure 63 : Courbes d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 0,2 mg.L-1) traversant

une colonne d’écorce de pin stérile inoculée (traitement combiné) ou non (adsorption) avec

Pseudomonas ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement. 20 ± 2°C ; débit 0,3 ml.min-

1 ; temps de contact 100 min ........................................................................................................191


235


234

LISTE DES TABLEAUX

Etude Bibliographique

Tableau 1 : Toxicité de l’atrazine ; DL50 par voie orale sur quelques animaux (Trotter et al., 1990)..14

Tableau 2 : Exemples de temps de demi-vie de l’atrazine dans différents sols ...................................23

Tableau 3 : Elimination d’atrazine par nano-filtration (d’après Gaid et Ravarini, 1996)........................38

Tableau 4 : Exemple de matériaux naturels utilisés pour l’adsorption de métaux lourds dans des

procédés de traitement des eaux usées ou effluents ....................................................................40

Tableau 5 : Supports utilisés dans les systèmes de biofiltration (selon Métivier, 2001).......................54

Tableau 6 : Liste non exhaustive des micro-organismes isolés capables de dégrader l’atrazine ........63

Tableau 7 : Principales caractéristiques taxonomiques de Pseudomonas sp.ADP..............................65

Tableau 8 : Pourcentage d’identité de l’ARN16S de Pseudomonas ADP sp. avec d’autres souche de

Pseudomonas et E. coli (Mandelbaum et al., 1995) ......................................................................65

Tableau 9 : Demi-vie de l’atrazine dans différentes conditions.............................................................66


235

Etude Expérimentale

Tableau 1 : Caractéristiques physiques de l’écorce de pin (d<200 µm) ............................................... 83

Tableau 2 : Analyse de la surface spécifique de l’écorce de pin (BET sur écorce broyée à d<200 µm)

........................................................................................................................................................ 84

Tableau 3 : Analyse élémentaire de l’écorce de pin ............................................................................. 84

Tableau 4 : Caractérisation de la matière organique ............................................................................ 85

Tableau 5 : Propriétés physico-chimiques de l’atrazine (source : Dialogweb.com).............................. 90

Tableau 6 : Caractéristiques d’une colonne.......................................................................................... 99

Tableau 7 : Coefficients du modèle de Freundlich caractérisant les isothermes d’adsorption de

l’atrazine sur des particules d’écorce de pin autoclavée de différentes granulométries.............. 104

Tableau 8 : Coefficients du modèle de Freundlich caractérisant les isothermes d’adsorption de

l’atrazine (Ci=0,3 à 5,5 mg.L-1) en solution à pH 4 et pH 7 sur des particules d’écorce de pin ... 105

Tableau 9 : Teneurs en COT et azote total des extraits aqueux d’écorce de pin utilisés pour différentes

expériences .................................................................................................................................. 117

Tableau 10 : Taux de croissance µm de Pseudomonas ADP sp. calculés sur les 20 premières heures

en fonction de la température ...................................................................................................... 134

Tableau 11 : Pourcentage d’atrazine dégradée en 12 heures en fonction de la température............ 134

Tableau 12 : Taux de croissance de Pseudomonas ADP sp. calculés sur les 20 premières heures et

vitesse de biodégradation de l’atrazine calculée s sur les 10 premières heures en fonction du pH

...................................................................................................................................................... 135

Tableau 13 : Pourcentage d’atrazine dégradée en 10h en fonction du pH......................................... 135

Tableau 14 : Description des colonies de micro-organismes isolés de l’écorce de pin sur boite de Pétri

...................................................................................................................................................... 150

Tableau 15 : Vitesse initiale de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. calculée sur les

48 premières heures, en présence d’écorce de pin stérile ou non (en mg.L-1.h-1) ...................... 158


236

Tableau 16 : Table d’élution pour analyse HPLC de l’atrazine et des métabolites de dégradation.... 164

Tableau 17 : Taux de minéralisation d’atrazine (en %) en 320h d’incubation de Pseudomonas ADP sp.

en biomètre à 20 °C avec [atrazine]i= 44,2 µg.L-1 ou 20 mg.L-1 (st.=stérile) ............................... 176

Tableau 18 : % de résidus liés à l’écorce de pin après 15 jours ou 7 mois d’incubation par rapport à la

radioactivité retrouvée dans l’écorce............................................................................................ 183

Tableau 19 : Quantité d’atrazine retenue ou dégradée par gramme d’écorce par circulation des

solutions polluées à 0,2 mg.L-1 ou 3 µg.L-1 à des débits de 1 ou 0,3 ml.min-1 dans des colonnes

d’écorce de pin stérilisée, ayant ou non été colonisées par Pseudomonas ADP sp................... 192

FOLIO ADMINISTRATIF

THESE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

NOM : GENDRAULT DERVEAUX DATE de SOUTENANCE : 22 septembre 2004 (avec précision du nom de jeune fille, le cas échéant) Prénoms : Sophie TITRE :

Etude d’un traitement combiné bio-physico-chimique pour la décontamination des eaux polluées en atrazine NATURE : Doctorat Numéro d'ordre : 03 ISAL Ecole doctorale : Chimie de Lyon (Chimie, Procédés et Environnement) Spécialité : Sciences de l’Environnement Industriel et Urbain Cote B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 / et bis CLASSE : RESUME : Ce travail concerne l’étude d’un procédé bio-physico-chimique pour le traitement d’eaux polluées par de l’atrazine. Le procédé étudié consiste en une biofiltration, utilisant l’écorce de pin comme support d’adsorption et comme agent de biodégradation la souche bactérienne Pseudomonas ADP sp., connue pour sa capacité à minéraliser l’atrazine en tant que source d’azote. Cette technique vise à éliminer totalement le polluant par minéralisation, valorisant l’écorce de pin, un déchet de l’industrie du bois, le tout à faible coût. Dans un premier temps, les essais d’adsorption ont montré que l’atrazine était retenue en faible quantité sur l’écorce de pin, comparé à la capacité d’adsorption d’un charbon actif, rendant le pesticide disponible pour les micro-organismes engagés dans le traitement. L’approche biologique en milieu liquide a montré que la biodégradation de l’atrazine pouvait avoir lieu à pH acide (jusqu’à pH 4,4) imposé par la présence de l’écorce en solution aqueuse et à des températures relativement basses (jusqu’à 12°C) permettant d’exploiter ce procédé de manière rustique : pas de chauffage ni besoin de tamponner l’eau à traiter. Pseudomonas ADP sp. a prouvé qu’elle était capable de survivre en présence des composés organiques de l’écorce de pin et de les consommer en tant que source unique de carbone. D’autre part, aucune source d’azote supplémentaire à l’atrazine ne doit être apportée au cours du traitement sous peine de voir la minéralisation de celle-ci diminuer. La microflore indigène de l’écorce de pin a montré une légère capacité à minéraliser l’atrazine pour des concentrations en atrazine comprises entre 45 µg.L-1 et 20 mg.L-1 permettant, à forte concentration uniquement, d’augmenter le rendement global du traitement. D’une manière générale, la présence de cette microflore n’aurait qu’un très léger effet inhibiteur vis à vis de la croissance de Pseudomonas ADP sp. et de sa capacité à minéraliser l’atrazine. L’étude du traitement combinant adsorption et biodégradation a été réalisée en essais batch et en colonnes. En batch, 50% de l’atrazine sont minéralisés en 4 jours ; 50% restent adsorbés irréversiblement à l’écorce et donc non disponibles pour les bactéries. En colonne, l’apport de Pseudomonas ADP sp. améliore l’efficacité du traitement de 50% à 100% par rapport au procédé d’adsorption seul. Le traitement étudié semble inexploitable pour traiter des eaux contenant une faible concentration en atrazine (quelques µg . L -1). En revanche, ce procédé combiné pourrait être envisagé comme pré-traitement pour des eaux fortement polluées (quelques mg.L-1). MOTS-CLES : Atrazine, Ecorce de pin, Adsorption, Biodégradation, Minéralisation, Pseudomonas ADP sp., Biofiltration Laboratoire de recherches : Laboratoire d’Analyse Environnementale des Procédés et des Systèmes Industriels (LAEPSI) INSA de Lyon Directeur de thèse: Prof. Rémy GOURDON Président de jury : Professeur J. BOURGOIS Composition du jury : Professeur A. PAUSS (Rapporteur) Professeur B. FABRE (Rapporteur) Professeur R. GOURDON Professeur J.M. BLANCHARD Docteur R. BAYARD

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Etude d’un traitement combiné bio-physico-chimique pour la ...theses.insa-lyon.fr/publication/2004ISAL0045/these.pdf · RESUME Ce travail concerne l’étude d’un procédé bio-physico-chimique