Annales Pharmaceutiques Françaises (2008) 66, 319—324

ARTICLE ORIGINAL

Étude des interactions entre oligosaccharidesimpliqués dans l’adhésion cellulaire. Exemple dutrisaccharide Lewisx

Study of the interactions between oligosaccharides involved in the celladhesion. Example of the Lewisx trisaccharide

Y. Zhang

Laboratoire de chimie organique (UMR CNRS 7611), université Pierre-et-Marie-Curie—Paris 6,tour 44/45, 1er étage, c. 181, 4, place Jussieu, 75005 Paris, France

Disponible sur Internet le 17 novembre 2008

MOTS CLÉSInteraction ;Oligosaccharide ;Adhésion cellulaire ;Trisaccharide ;Lewisx

Résumé La nature choisit souvent des interactions moléculaires faibles pour jouerdes rôles importants dans la reconnaissance et l’adhésion cellulaires. Ces interactionsmettent en jeu en particulier les oligosaccharides qui sont les éléments structuraux lesplus extérieurs à la surface de la cellule. Trois oligosaccharides ont été préparés pourl’étude des interactions par la technique de la micromanipulation de vésicules. Cetteétude nous a permis de mesurer directement pour la première fois une interactionsucre—sucre.© 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

KEYWORDSInteraction;Oligosaccharide;

Summary Nature often chooses weak molecular interactions for playing important role in cel-lular recognition and adhesion. These interactions involve particularly oligosaccharides, whichare the structural elements present at the most exterior surface of the cell. Three oligosac-

Cell adhesion;Trisaccharide;Lewisx

charides were prepared for study of the interaction by vesicle micromanipulation technique.This study allowed us to measure directly, for the first time, a carbohydrate—carbohydrateinteraction.© 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Adresse e-mail : yongmin.zhang@upmc.fr.

0003-4509/$ — see front matter © 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.doi:10.1016/j.pharma.2008.10.001

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lbqphospholipide fluide à température ambiante. Les vésicules

20

ntroduction

’adhésion cellulaire joue un rôle central dans beaucoupe processus physiologiques. Les mécanismes adhésifs sontouvent complexes, faisant appel à plusieurs systèmes dis-incts. Ils mettent en jeu des couples récepteur—ligandyant tous des affinités, des énergies de liaison oues portées d’interaction différentes. Les interactionsrotéine—protéine et protéine—sucre sont bien connuesans les processus biologiques [1]. Plus récemment,’interaction entre sucre et sucre a été postulée en ce quioncerne l’adhésion cellulaire [2]. En effet, lorsque deuxurfaces cellulaires s’approchent l’une de l’autre, les motifstructuraux les plus extérieurs sont les oligosaccharides, qui’attachent à des protéines et des lipides formant des glyco-rotéines et des glycolipides. Ce sont les premiers candidatse la reconnaissance cellulaire.

Le premier résultat concernant l’interaction sucre—sucreété obtenu par l’équipe américaine du professeur Hako-ori à l’université de Washington (Seattle, USA). Cette

quipe a proposé l’existence d’une interaction homotypiquepécifique, en présence d’ion calcium ou d’autres ions biva-ents, entre oligosaccharides Lewisx comme première étapee la compaction de l’embryon de souris [3]. Le composémpliqué dans cette reconnaissance contient l’épitope tri-accharidique Lewisx qui se présente à la surface des cellulesous la forme du glycolipide (1) sur la Fig. 1.

Les interactions Lewisx—Lewisx ont été démontrées indi-ectement par l’équipe d’Hakomori utilisant la cellule F9mbryonnaire du carcinome. En particulier, des liposomesrésentant le motif Lewisx sur leur surface interagissentvec des glycolipides de type Lewisx appliqués sur uneurface plastique [3] ; d’autres motifs sucres, sialylparaglo-oside (SPG) par exemple, ne donnent pas lieu à de tellesnteractions, indiquant une spécificité [3]. La démonstra-ion directe de l’importance des interactions Lewisx—Lewisx

interaction spécifique sucre—sucre) dans le développementqu’il soit naturel ou cancéreux) est d’une grande portée,es oligosaccharides pouvant être percus comme des molé-ules clés impliquées, par reconnaissance mutuelle, dans lesases moléculaires de l’oncogenèse et l’organogenèse des

ystèmes biologiques complexes [4]. Depuis les travaux pion-iers du professeur Hakomori sur l’interaction sucre—sucre,ertaines équipes de recherche ont effectué différentestudes afin de mettre en évidence cette interaction en

igure 1. Glycolipide Lewisx (1).ewisx glycolipid (1).

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Y. Zhang

tilisant diverses techniques, comme la résonance magné-ique nucléaire (nuclear magnetic resonance [NMR]) [5—9],a spectrométrie de masse (mass spectrometry [MS]) [10],a microscopie de force atomique (atomic force microscopyAFM]) [11], ou encore la résonance des plasmons de sur-ace (surface plasmon resonance [SPR]) [12]. Récemment,e modèle foldamers a été utilisé pour étudier l’interactionucre—sucre au sein d’un environnement contrôlé [13].

ésultats et discussion

esure directe de l’interaction sucre—sucretilisant un néoglycolipide

n collaboration avec l’équipe du Dr Perez, nous nousommes tout d’abord proposés d’étudier les interactionsewisx—Lewisx en présence de Ca2+ par l’utilisation de’appareil à forces de surface (surface force apparatusSFA]). L’absence de reconnaissance spécifique lors desesures de forces par cette méthode nous a conduit à utili-

er une autre méthode : la micromanipulation de vésicules.ette méthode porte sur l’étude de la reconnaissance entreewisx avec la technique de micromanipulation disponibleu département de physique de l’École normale supérieure.’étude des vésicules manipulées par micropipette a étééveloppée dans les années 1980 par Kwok et Evans [14]ant sur le plan expérimental que théorique. L’expérienceonsiste à observer des vésicules maintenues par aspira-ion avec des micropipettes sous un microscope optique.’idée est de former des vésicules contenant le Lewisx et deesurer leur interaction en présence de calcium. L’avantagee cette technique pour mesurer l’interaction tient essen-iellement au fait que les molécules fonctionnalisées serouvent greffées sur un support éminemment flexible etuide, proche de leur environnement naturel.

Les propriétés élastiques des vésicules dépendent dea phase thermodynamique dans laquelle se trouvent lesicouches. Pour notre étude, les vésicules ont été fabri-uées à partir du stéaryl oléoyl phosphocholine (SOPC), un

ont donc aisément déformables. Par micromanipulation,n peut rapprocher, sous l’objectif du microscope, deuxésicules maintenues par aspiration avec une micropi-ette. L’adhésion entre deux vésicules fonctionnalisées est

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Figure 2. Néoglycolipide pentasaccharidique (2).Pentasaccharidic neoglycolipid (2).

Figure 3. Schéma de synthèse du néoglycolipide pentasaccharidique (2).Scheme for synthesis of pentasaccharidic neoglycolipid (2).

3 Y. Zhang

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Figure 4. Expériences de tests adhésifs entre des vésicules fonc-tionnalisées. A. Vésicules avant contact. B. Vésicules en contact[Tb

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Dgtndmglycolipide Lewis (1) [19].

L’étude d’interaction sucre—sucre sur ce glycolipideLewisx naturel a montré que l’énergie d’adhésion spécifiqueproduite par la reconnaissance Lewisx—Lewisx en présencedu calcium est très supérieure à celle produite par le néoli-

Tableau 1 Effet évident du calcium sur l’énergied’adhésion.Evident effect of the calcium on the energy of adhesion.

Énergie d’adhésion(�Jm−2) dans NaCl(0,2 M)

Énergie d’adhésion(�Jm−2) dans CaCl2(0,11 M)

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irectement reliée à l’interaction entre deux bicouchese phospholipides sur lesquelles sont présents les sucres.a fonctionnalisation est obtenue en incorporant dans laicouche lipidique des vésicules, un lipide à tête Lewisx.

Il était difficile d’obtenir les sphingolipides naturelsontenant du Lewisx à l’état pur (composé hétérogène)t en quantité suffisante (pour les biologistes) pour cestudes. Nous avons donc synthétisé le néoglycolipide (2)Fig. 2).

Ce néoglycolipide a été préparé par condensation du bro-ure de lactose (glucose—galactose) perbenzoylé donneur

vec un néolipide, disponible au laboratoire, conduisantu lactose néolipidique protégé avec un rendement de6 %. Celui-ci est déprotégé (NaOMe, MeOH, HCl) puises fonctions hydroxyles en 4 et 6 de l’unité galactoseont temporairement protégées sous forme d’un benzy-idène. La benzylation des autres fonctions hydroxylesous forme d’éther benzylique est suivie de l’hydrolysee l’isopropylidène. Enfin la glycosylation de ce dernieromposé par un trisaccharide conduit stéréo- et régiosé-ectivement au néoglycolipide pentasaccharidique attenduvec un rendement de 66 %.

Une série de déprotection a permis d’obtenir enfin leéoglycolipide pentasaccharidique attendu (2) (Fig. 3) [15].

Les premiers tests adhésifs ont été effectués dans uneolution de CaCl2 à 0,11 M, la proportion par rapport auhospholipide est de 10 %. Le choix de la proportion glycoli-ide/phospholipide est basé sur une étude de ces lipidesn monocouche, la proportion de 1/9 peut garantir uneeilleure homogénéité de ces deux lipides dans les vésicules

16]. On met en contact deux vésicules avec les micro-ipettes, puis on relâche la pression d’aspiration d’uneésicule. Le tout est laissé ainsi pendant quelques minutes,uis on réaspire légèrement la vésicule molle pour la main-enir. En actionnant délicatement le micromanipulateur, onépare les vésicules. Dans ces conditions, la vésicule mollee déforme à la séparation, signe de la présence d’une adhé-ion.

Les mêmes expériences ont été conduites dans une solu-ion aqueuse de NaCl à 0,2 M. Dans ces conditions, laéformation est beaucoup plus faible et l’adhésion presqueulle, même en augmentant le temps de contact. Les expé-iences de tests adhésifs entre des vésicules fonctionnaliséesnt donc montré l’existence d’une adhésion dépendanteu calcium et confirmé l’existence d’une interaction spé-ifique entre molécule de Lewisx. Les paramètres à prendren compte sont la concentration en lipides fonctionnali-és, la concentration en calcium et le temps pendant lequeles vésicules ont été mises en contact. L’énergie spécifique’adhésion entre deux vésicules [17] est obtenue (Fig. 4) enéterminant l’angle de contact �c des deux vésicules et laension � de leurs membranes : Wadh = �(1−cos�c).

Le Tableau 1 montre un effet évident du calcium :’énergie d’adhésion dans CaCl2 est 2,5 fois plus élevée queelle dans NaCl.

Pour vérifier que cette adhésion observée en présence dealcium est bien due au lipide et non à un effet du phospho-

ipide, ces tests adhésifs ont été menés avec des vésiculesormées uniquement de SOPC. Un autre contrôle a consisté

comparer l’expérience de Lewisx—Lewisx avec celle deewisx—Lac, l’une des unités Lewisx étant remplacée parn lactose néolipidique (Lac) sur la Fig. 5.

17].ests of cell adhesion with vesicles micromanipulation. A. Vesiclesefore contact. B. Vesicles in contact [17].

À la fin, il est important d’effectuer une expérienceans laquelle les deux vésicules sont composées du lac-ose néolipidique (Lac/Lac). Les résultats présentés danse tableau montrent clairement qu’il est nécessaire d’avoire trisaccharide Lewisx sur les deux vésicules pour produire’augmentation de l’adhésion.

Ces mesures faites avec un néoglycolipide confirment laroposition du biologiste. Nous avons ainsi montré que desligosaccharides neutres de surfaces sont capables, en pré-ence de Ca2+, de promouvoir la déformation et l’adhésione liposome [18].

nfluence du céramide sur la reconnaissanceucre—sucre

ans l’étude précédente, le glycolipide utilisé était un néo-lycolipide. Afin d’avoir une meilleure compréhension sur ceype d’interaction, il était important d’utiliser le glycolipideaturel. L’obtention de sphingolipides naturels contenantu Lewisx pur en quantités suffisantes étant particulière-ent difficile, nous avons effectué une synthèse totale du

x

Lewisx—Lewisx 4,5 ± 2 11 ± 2Lewisx—Lac 5,4 ± 1 2,5 ± 2Lac—Lac 9,5 ± 0,5 6 ± 1SOPC—SOPC 14 ± 2 15 ± 4

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Figure 5. Lactose néolipidique (Lac).Neolipidic lactose (Lac).

Tableau 2 Comparaison des interactions.Comparison of the interactions.

Vésicule gauche Vésicule droite Énergie d’adhésion (�Jm−2)

Dans CaCl2 (0,11 M) Dans NaCl (0,2 M)

x x

Dl

Lcldc(

LLca

LpcL

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Glycolipide Lewis —glycolipide LewisGlycolipide Lewisx—glycolipide Lewisa

pide Lewisx, (2).

L’énergie d’adhésion spécifique (�Jm−2)

Lewisx—Lewisx (néolipide) 9,5Lewisx—Lewisx (naturel) 47,5

C’est un phénomène intéressant, mais quelle estl’explication ?

Dans le néoglycolipide, la partie lipidique est compo-sée de trois chaînes alkyles connectées par un espaceurà la partie saccharidique, ce long espaceur peut confé-rer à la partie lipidique une orientation relativementlibre ; tandis que dans le glycolipide naturel, la conne-xion rigide entre la partie saccharidique et le céramiderestreint la conformation possible du pentasaccharide.Celui-ci s’oriente perpendiculairement au céramide [20].La reconnaissance de deux groupements Lewisx en pré-sence de calcium dépend fortement de leur positionrelative [9], or l’orientation relative de deux grou-pements Lewisx est un facteur prédominant dans lareconnaissance Lewisx—Lewisx. Notre résultat sur l’énergie

d’adhésion spécifique montre que bien que le céramiderestreignent le nombre d’orientation spatiale accessibleau groupement Lewisx, la proportion de molécules favo-rables à la reconnaissance Lewisx—Lewisx est plus élevée[19].

opcad

Figure 6. Glycolipide (3).Glycolipid (3).

67,8 ± 24,0 26,6 ± 2,115,1 ± 6,6 21,4 ± 5,8

émonstration de la spécificité sur’interaction Lewisx—Lewisx

’interaction Lewisx—Lewisx a été suggérée comme très spé-ifique [2]. Pour confirmer cela, nous avons souhaité étudier’interaction Lewisx—Lewisa, Lewisa étant un régioisomèree Lewisx, le céramide étant le même que dans (1). Pourela, le glycolipide (3) a été préparé, qui ne diffère donc de1) que par l’enchaînement du trisaccharide final (Fig. 6).

Pour synthétiser ce glycolipide renfermant un motifewisa, nous avons préparé tout d’abord ce trisaccharideewisa, puis un block lactose et l’azidosphingosine. Laondensation de ces trois parties, suivie d’une déprotection,conduit au produit désiré [19].Comme précédemment, l’interaction glycolipide

ewisx—glycolipide Lewisa a été étudiée par la micromani-ulation de vésicules, puis le résultat a été comparé avecelui obtenu à partir du glycolipide Lewisx—glycolipideewisx (Tableau 2).

Ces résultats montrent que les interactions non spé-ifiques pour ces deux systèmes sont similaires (résultatsbtenus dans la solution NaCl où la substitution de Lewisx

ar Lewisa n’a pas d’effet significatif sur l’adhésion.) Parontre, l’énergie d’adhésion pour la paire Lewisx—Lewisx

ugmente significativement en présence d’ion calcium, tan-is que celle pour la paire Lewisx—Lewisa baisse légèrement.

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24

a forte augmentation spécifique obtenue pour la paireewisx—Lewisx démontre que les deux déterminants Lewisx

ortés par les molécules naturelles insérées dans la bicoucheipidique peuvent se reconnaître et produire l’adhésiondditionnelle. Le choix de la paire Lewisx—Lewisa commeontrôle montre clairement la spécificité de l’interactionewisx—Lewisx, un changement de liaison de deux sucresans la molécule peut complètement supprimer la capacitée la reconnaissance du glycolipide [19].

onclusion

ette étude nous a permis pour la première fois de mesu-er directement l’interaction sucre—sucre. Il est maintenantossible de quantifier ces forces, malgré leur faiblesse. Ceravail pourra ensuite être généralisé, en particulier danse cadre de la détermination des éléments structuraux cri-iques pour l’existence d’une interaction sélective [21].

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