ETUDE STRUCTURALE DES OLIGOSACCHARIDES …ddata.over-blog.com/xxxyyy/3/94/58/78/Carsbiom_Topo-TP...monosaccharides) de l’oligosaccharide X ou Y se fait par chromatographie sur couche

ETUDE STRUCTURALE DES OLIGOSACCHARIDES

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Licence Sciences et Technologies : Mention Biochimie

Travaux Pratiques du Module CARSBIOM : Etude structurale des oligosaccharides

L’objectif de ces 5 séances de travaux pratiques est d’appréhender les techniques physico-chimiques permettant de déterminer la structure d’oligosaccharides en termes de composition, de séquence et de liaisons glycosidiques. Pour cela, plusieurs méthodes analytiques et chromatographiques vont être utilisées pour résoudre la structure de deux oligosaccharides simples.

I- Perméthylation et méthanolyse

L’objectif de cette étude est d’identifier les différentes liaisons glycosidiques ainsi que déduire certains éléments de séquence. A- Perméthylation (1ère séance) • Ajouter 1 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) anhydre dans un

tube à méthanolyse A contenant 6 mg d’oligosaccharide X ou Y lyophilisé.

• Ajouter environ 50 mg de NaOH puis refermer rapidement le tube.

• Placer le tube à méthanolyse dans un bain à ultrasons pendant 30 minutes à température ambiante.

• Ajouter 600 μl d’iodure de méthyle (ICH3) puis refermer le tube rapidement (à réaliser avec les responsables du TP).

• Replacer le tube dans le bain à ultrasons pendant 1 heure à température ambiante.

• Arrêter la réaction dans le tube A par ajout d’1 ml d’eau. Agiter au vortex. Ajouter 1 ml de CHCl3. Agiter au vortex. Transférer la phase chloroformique dans un tube à essai B.

• Ajouter 1 ml de CHCl3 dans le tube A. Agiter au vortex. Transférer la phase chloroformique dans le tube à essai B. Répéter une fois l’opération.

• Laver la phase chloroformique (3 ml) dans le tube B par 15 x 3 ml d’eau.

• Sécher la phase chloroformique sur Na2SO4.

• Prélever 50 μl de la phase chloroformique sèche et les placer dans un tube Eppendorf. Cet échantillon servira pour l’analyse du produit perméthylé par spectrométrie de masse.

• Transvaser le reste de la phase chloroformique dans un tube à méthanolyse.

• Prendre un numéro d’expérience dans le cahier que vous reportez sur le tube à méthanolyse ainsi que sur le tube Eppendorf (écrire de manière lisible avec un marqueur indélébile).

• Les enseignants se chargeront d’évaporer le contenu du tube à méthanolyse.

B- Méthanolyse (2ème séance) • Reprendre le contenu du tube par 500 µl de méthanol

chlorhydrique (CH3OH / HCl 0,5 N) ( : ce produit doit rester anhydre !).


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• La méthanolyse est réalisée à 80 °C pendant 16 h.

• Le méthanolysat est ensuite séché par évaporation. C- Chromatographie en phase gazeuse (4ème et 5ème séances)

L’analyse des méthyl-glycosides est effectuée par chromatographie en phase gazeuse. • Reprendre le méthanolysat par 200 µl de CH3OH.

• Injecter 1 µl Gradient de température :

Temps (min) température (°C) 0,01 140

2 140 22.83 165 28.33 220 30.33 220 30.34 Fin de programme

Matériel utilisé : • Chromatographe en phase gazeuse Shimadzu

• Colonne CP6 SLB 5ms Supelco - Fused silica capillary column 30 m x 0.25 mm, film thickness 0.25 µm

• Détection par ionisation de flamme

II- Dosage par les dérivés heptafluorobutyrilés Cette manipulation a pour but de quantifier les différents monosaccharides et de doser les composés X et Y.

A- Méthanolyse (1ère séance)

• Dans un tube à méthanolyse, ajouter 200 µl d'une solution d'oligosaccharide X ou Y dans le méthanol à 5 mg/ml (soit 1 mg d'oligosaccharide X ou Y), puis x µl (à calculer) d'une solution de proline qui sert de témoin (80 µg pour X et 60 µg pour Y) à 0,5 mg/ml dans le méthanol.

• Le contenu du tube est évaporé sous courant d'air comprimé.

• Ajouter 500 µl de méthanol chlorhydrique (CH3OH/HCl 0,5N) ( : ce produit doit rester anhydre !) dans le tube à méthanolyse.

• La méthanolyse est réalisée pendant 16 heures à 80°C.

• Le méthanolysat est ensuite séché sous air comprimé.

• Prendre un numéro d’expérience sur le cahier que vous reportez sur le tube (écrire de manière lisible avec un marqueur indélébile).

B- Dérivation HFB (2ème séance)

• Les monosaccharides libérés et la proline sont dissouts par 200 µl d'acétonitrile. Ajouter ensuite 25 µl d'anhydride heptafluorobutyrique. Cette étape est à réaliser avec l'enseignant.

• La réaction de dérivation est obtenue par chauffage à 95°C pendant 45 min.


3

C- CPG (2ème et 3ème séance)

• Le contenu du tube est séché juste avant injection en CPG sous courant d'air comprimé puis repris par 40 µl d'acétonitrile (en présence de l'enseignant).

• Injecter 1 µl en CPG (matériel identique à l'analyse des composés méthylés).

Gradient de température :

Temps (min) température (°C) 0.01 120

2 120 27 150 34 220 36 220

36.01 Fin de programme

III- Détermination du degré de polymérisation

La détermination du degré de polymérisation (nombre de monosaccharides) de l’oligosaccharide X ou Y se fait par chromatographie sur couche mince et par spectrométrie de masse.

A- chromatographie sur couche mince (CCM1, 1ère séance)

La détermination du degré de polymérisation est réalisée

par chromatographie ascendante dans le solvant n-butanol / acide acétique / eau (2 : 1 : 1,5) sur couche mince de silice.

La révélation est réalisée par pulvérisation à l’orcinol sulfurique puis chauffage à 80°C.

• Plaque de silice sur aluminium 5 cm x 10 cm, Merck.

• 0,2 mm d’épaisseur

• 4 dépôts (1 binôme par couche mince) Dépôts

• 1 : Maltotétraose (1 µg/µl): 5 μl.

• 2 : Oligosaccharide X ou Y (1 µg/µl) : 5 μl.

• 3 : Maltose (1 µg/µl) : 5 μl.

• 4 : Maltohexaose (1 µg/µl) : 5 μl.

Sécher les dépôts 1 µl par 1 µl, introduire la plaque dans la cuve et faire migrer le solvant jusqu’à moins d’un cm du haut.

4321

5 cm

1,5 cm

8,5 cm

4321

5 cm

1,5 cm

8,5 cm


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B- Spectrométrie de masse (5ème séance) • Déposer 1 µl de DHB sur la plaque de spectrométrie de

masse. Sécher au sèche-cheveux.

• Ajouter sur le dépôt de DHB 1 µl de l’oligosaccharide perméthylé issu du tube Eppendorf. Sécher au sèche-cheveux.

• Les mesures par MALDI-TOF seront réalisées sur un Ultraflex II (Bruker Daltonics). L’interprétation du spectre MALDI-TOF de l’oligosaccharide

X ou Y perméthylé permettra de déterminer le degré de polymérisation de l’oligosaccharide ainsi que la qualité de la perméthylation.

IV- Cinétique d’hydrolyse chimique et hydrolyse enzymatique

La détermination structurale de molécules glucidiques

natives en faible quantité nécessite le recours à des méthodes chimiques qui dégradent les molécules initiales en structures de plus faibles tailles. Elles seront ainsi plus faciles à étudier et permettront ensuite de reconstituer le « puzzle » de la structure initiale. A- Cinétique d’hydrolyse chimique (2ème séance)

L’agent d’hydrolyse est l’acide trifluoroacétique 4 M qui présente l’avantage d’être volatile.

• Préparer dans 4 tubes à hémolyse en plastique, 22 µl d’une solution d’ammoniaque à 28% (sous la hotte) et les placer sur

glace. Ces tubes serviront au dépôt des échantillons de la cinétique.

• Mettre dans un petit tube en verre 0,5 ml de solution de glycanne X ou Y à 10 mg /ml dans l’eau.

• Ajouter 0,5 ml d’ATFA 4 M, agiter au vortex, et transvaser immédiatement 100 µl dans un des tubes à hémolyse préalablement préparés → temps 0 min de la cinétique. Conserver ce tube à hémolyse dans la glace.

• Mettre le petit tube en verre de la réaction d’hydrolyse au bain-marie à 95°C surmonté d’une bille (contre l’évaporation).

• Après avoir agité au vortex, effectuer des prélèvements aux temps 5, 30 et 120 min : 100 µl par tube à hémolyse préalablement préparé. Refroidir immédiatement les tubes en les plongeant dans la glace.

B- Hydrolyse enzymatique (1ère séance)

L’oligosaccharide X ou Y est soumis à l’hydrolyse enzymatique de l’invertase, enzyme purifié à partir de la levure de bière (Saccharomyces cerevisiae). • Ajouter dans un tube à hémolyse en plastique 450 µl de X ou

Y dissous dans de l’eau (équivalent à 450 µg).

• Ajouter 50 µl d’une solution d’invertase également préparée dans de l’eau puis boucher avec du parafilm.

• Agiter doucement.

• Incuber 2 h dans un bain-marie à 37°C.

• Prélever 5 µl et les transférer dans un tube Eppendorf de 200 µl) pour l’analyse par FACE (voir partie D).


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• Prendre un numéro d’expérience sur le cahier que vous reportez sur le tube à hémolyse et sur le tube Eppendorf (écrire de manière lisible avec un marqueur indélébile). Le contenu du tube Eppendorf sera lyophilisé par les enseignants.

• Le reste de l’hydrolyse enzymatique sera purifié par HPLC au cours des séances suivantes (voir partie E).

C- Chromatographie analytique (CCM2, 2ème et 3ème séance)

L’analyse des produits libérés par ces deux hydrolyses est réalisée par chromatographie ascendante dans le solvant n-propanol / acétate d’éthyle / eau (7 : 1 : 2) sur couche mince de silice imprégnée au préalable d’acide borique 0,1M.


• Plaque de silice sur aluminium 10cmx10cm, Merck.


Dépôts (10 dépôts, 1 binôme par couche mince) : • Cinétique d’hydrolyse chimique : 2 µl de chaque prélèvement.

• Hydrolyse enzymatique : 2 µl.

• Témoins (maltose, glucose, galactose, fructose, X ou Y à 5 µg/µl) : 1 µl.

1,5 cm

1 cm ≈ 0,9 cm

D- FACE (Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis) (3ème et 4ème séance) Le produit de la réaction enzymatique est analysé par FACE. Les gels d’acrylamide (1 gel pour 2 binômes) nécessaires à l’analyse FACE seront coulés en séance n°3 (prendre un numéro d’expérience pour le gel). La dérivation du produit de la réaction enzymatique et des standards sera réalisée avant la migration sur gel en séance n°4. Vous préparerez un gel de polyacrylamide avec T=30 % pour le gel de séparation (10 ml) et T=5 % pour le gel de concentration (5 ml). D-1. Préparation du gel de séparation 1. Prévoir 10 ml de gel dans une éprouvette de 10 ml. Versez dans l’éprouvette dans l’ordre l’acrylamide/bis-acrylamide 19 :1 ( ? ml), le tampon Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) (2,5 ml). Mélangez puis


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ajoutez 5 μl de TEMED et bouchez le haut de l’éprouvette avec du parafilm, mélangez de nouveau. 2. Préparez 1 ml d’une solution de persulfate d’ammonium à 10 % (p/v) dans un tube à hémolyse en plastique (bien agiter pour dissoudre la poudre). 3. Au moment de couler le gel de séparation, ajoutez 50 μl de persulfate d’ammonium 10 % dans l’éprouvette et bien mélanger l’ensemble. (Attention, comme la concentration en acrylamide est élevée, la polymérisation du gel est rapide. Il faut que tout soit prêt pour la suite). 4. Coulez rapidement le gel de séparation sur le dispositif MiniProtean II (Bio-Rad) prévu à cet effet. 5. Couvrez tout de suite (et très délicatement) la surface du gel avec 2 x 200 μl d’eau disposé à l’aide d’une pipette automatique de 200 μl. Laissez polymériser le gel. Une démarcation clairement visible apparaitra lorsque la polymérisation sera complète. D-2. Préparation du gel de concentration 1. Prévoir 10 ml de gel dans une éprouvette de 10 ml. Versez dans l’éprouvette dans l’ordre l’acrylamide/bis-acrylamide 19 :1 ( ? ml), le tampon Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) (2,5 ml), H2O (qsp 10 ml). Mélangez et ajoutez 5 μl de TEMED et bouchez le haut de l’éprouvette avec du parafilm, mélangez de nouveau. 2. Au moment de couler le gel de concentration, ajoutez 100 μl de persulfate d’ammonium dans l’éprouvette et bien mélanger l’ensemble. 3. Coulez rapidement le gel de concentration au-dessus du gel de séparation jusqu’en haut des plaques. Disposez rapidement le peigne (10 dents) (attention aux éclaboussures ! Lunettes de

protection absolument obligatoire !). Laissez le gel polymériser (environ 20 min, visible à l’oeil nu). 4. Préparez 500 ml de tampon d’électrophorèse : Tris 25 mM, glycine 192 mM. D-3. Dérivation à l’APTS Veillez à bien respecter la température de conservation des différents réactifs en les replaçant rapidement à +4 °C ou -20 °C. Réactifs : – cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN). Ce produit doit absolument rester parfaitement anhydre. ; – tétrahydrofuranne (THF) ; – eau/glycérol (4/1 v/v) ; – APTS (1-aminopyrène-3,6,8-trisulfonate) à 2 % dans l’acide acétique 15 % (stockée à -20 °C, aliquote de 5 μl) ; Peser une masse de cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN) comprise entre 5 et 15 mg (noter la masse exacte) et ajouter le volume nécessaire de THF (tétrahydrofuranne) pour préparer une solution à 1 M. Vous avez 3 tubes à dériver : 1. un tube contenant le produit de la réaction enzymatique réalisée sur l’oligosaccharide X ou Y (environ 5 µg); 2. le glucidex : mélange de polymères de glucose dont la gamme de degré de polymérisation est comprise entre un et une vingtaine ; 3. un standard avec un DP (degré de polymérisation) connu (5 μg).


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Ajoutez ensuite dans l’ordre à chacun des échantillons: 1. 1 μl de d’une solution 0,2 M d’APTS (1-aminopyrène-

3,6,8-trisulfonate) dans l’acide acétique 15 %. Maintenez la goutte de réactif au bout du cône de votre pipette automatique et faites plusieurs tours de la paroi intérieure du microtube en faisant des spirales afin d’être sûr de bien solubiliser les chaînes oligosaccharidiques.

2. 1 μl de la solution de cyanoborohydrure de sodium (voir ci-dessus) que vous déposerez dans la goutte d’APTS avant de boucher immédiatement le tube ;

Incuber les 3 tubes à 50 °C pendant 1 h. Couvrez le tout avec un morceau d’aluminium (les fluorophores sont sensibles à la lumière). D-4. Dépôt des échantillons 1. A la fin de l’incubation, ajouter 10 μl d’un mélange eau/glycérol (4/1, v/v) dans chacun des tubes et déposer la totalité des échantillons sur le gel de polyacrylamide dans les puits 1, 3, 5 et 6, 8, 10). 2. La migration se fait sous un courant constant de 15 mA jusqu’à ce que le colorant fluorescent atteigne la limite du gel. 3. Récupérer le montage constitué des deux plaques de verre et du gel (ne démouler surtout pas le gel) et aller révéler votre gel sur le transilluminateur (vous mettrez des gants pour cette révélation !). 4. L’acquisition finale et l’impression du résultat de l’électrophorèse se fera grâce au système d’acquisition GelDoc (Bio-Rad™).

E- Chromatographie haute performance préparative (2ème et 3ème séances)

Les produits libérés par l’hydrolyse enzymatique de X ou de Y sont séparés, en vue de leur étude ultérieure, par chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase normale. • Phase stationnaire : colonne SHODEX Asahipak amino

NH2P-50 4.6x250 mm

• Phase mobile : A) H2O :0.01%TFA B) 75% acétonitrile : 25% H2O

→ Débit : 1 ml/min

• Injection : on prélève 250 µl du produit de la réaction enzymatique qu’on évapore. Le résidu est repris dans 250 µl de tampon B. Deux phases vont se former et décanter. Bien homogénéiser à la seringue avant l’injection. Injecter 250 µl à

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


8

l’aide de la seringue dans la boucle d’injection en mode “LOAD”. Passer ensuite en mode “INJECT”. Lancer le gradient en appuyant sur “Run”. Commencer directement la collecte des fractions toutes les minutes (soit 1 ml/fraction).

• Gradient : les programmes sont différents selon que l’on souhaite séparer les produits d’hydrolyse de X ou de Y.

Séparation des produits d’hydrolyse de X :

Temps (min) B (%) 0,01 90 0,50 90 10,00 60 11,00 90 15,00 90 15,01 Fin de programme

Séparation des produits d’hydrolyse de Y :

Temps (min) B (%) 0,01 95 0,50 95 10,00 70 11,00 95 15,00 95 15,01 Fin de programme

• Détection: les fractions sont collectées manuellement toutes

les minutes (soit 1 ml/fraction). 25 μl de chaque fraction sont déposés dans une plaque 96 puits puis placés à l’étuve à 80°C pendant 20 minutes de façon à éliminer l’acétonitrile. 200 µl d’une solution d’orcinol sulfurique sont alors ajoutés dans chaque puits. La plaque est placée à l’étuve à 80 °C pendant 20 min. La plaque est alors refroidie à température

ambiante pendant 10 minutes avant mesure des intensités de D.O. au lecteur de plaque.

• CCM3 : un dépôt de 5 µl (5 fois 1 µl) de chaque fraction positive est effectué sur une plaque de CCM. Témoin : 2 µl de la réaction enzymatique, 1 µl de Glc, Gal, Fru, à 5 mg/ml.

• Les fractions pures correspondant au composé de DP le plus grand sont rassemblées pour être lyophilisées (prendre un numéro d’expérience).

V- Etude structurale de l’oligosaccharide X’ ou Y’, résultant de l’hydrolyse enzymatique (4ème séance) • Reprendre le lyophilisat par 1 ml d’eau.

• Diviser le produit en deux volumes égaux de 0.45 ml dans deux tubes à essais A et B.

• Ajouter dans le tube B une pointe de spatule de KBH4 (voir avec un enseignant) et laisser 1 heure à température ambiante.

• Ajouter 0.5 ml d’eau dans les tubes à essais A et B. Agiter au vortex.

• Prélever 0.25 ml des tubes A et B et effectuer un dessalage sur colonne carbone (selon les modalités expliquées en TP). Conserver le reste des tubes A et B pour le dosage des oses neutres en microplaques (voir ci-dessous, partie B).

• Les fractions dessalées sont éluées dans des tubes à hémolyse en verre A’ et B’ puis séchées sous courant d’air comprimé.

• Les tubes A’ et B’ sont ensuite repris dans 0.25 ml d’eau.

• Ajouter v ml (à calculer) d’acide trifluoroacétique (ATFA) 13 N pour obtenir une normalité finale de 2 N.


9

• Boucher avec une bille de verre puis porter au bain-marie à 95°C pendant 1h30.

• Refroidir les tubes, ajouter 1 ml de CH3OH puis évaporer sous courant d’air comprimé.

• Prendre un numéro d’expérience pour les tubes A’ et B’. A- Chromatographie analytique (CCM4, 5ème séance)

L’analyse des produits libérés par ces deux hydrolyses est réalisée par chromatographie ascendante dans le solvant n-propanol / acétate d’éthyl / eau (7 : 1 : 2) sur couche mince de silice imprégnée au préalable par de l’acide borique 0,1M.


• Reprendre les tubes A’ et B’ par 20 µl d’eau

Dépôts : • Hydrolysats A’ et B’ : 4 µl

• Témoins (glucose, galactose, fructose à 5 mg/ml) : 1 µl B- Dosage des oses neutres dans les hydrolysats A et B en microplaques (4ème séance)

Afin de déterminer le degré de polymérisation de l’oligosaccharide libéré par hydrolyse enzymatique des glycannes X et Y, les oses neutres sont dosés en plaque 96-puits selon la méthode de Tillmans et Philippi à partir de prises d’essai de 50 µl des tubes A et B (Voir protocole en Annexe 1).

• Plaque de silice sur aluminium 5 cm x 10 cm, Merck.


• 5 dépôts (1 binôme par couche mince)


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ETUDE STRUCTURALE DES OLIGOSACCHARIDES – ANNEXES

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ANNEXE 1 Dosage des osamines par la méthode d’Elson-Morgan

• Gamme étalon : 0 à 160 µg/ml • Solution mère de glucosamine : 200 µg/ml

• 0,5 ml de solution à doser

• 0,5 ml d’acétylacétone (4% dans Na2CO3 1,25N) • Agiter au vortex • 100°C, 10 min.

• Refroidir. • 2,5 ml d’éthanol • 75°C, 5 min. • Ne pas refroidir • 0,5 ml de p-diméthylaminobenzaldéhyde (pDMAB)

(1,3g/30ml HCl 30%)

• Agiter au vortex • 75°C, 30 min.

• Refroidir • 2,5 ml d’éthanol • Agiter au vortex • Lecture à 520 nm

Dosage des oses neutres par la méthode de TILLMANS et PHILIPPI en plaque 96-puits

• Gamme étalon : 0 à 50 µg/puits (12 puits disponibles) • Solution mère de glucose : 2 mg/ml • 50 µl de solution à doser • 200 µl de réactif de dosage préparé comme décrit ci-

dessous

Préparer un stock de solution de dosage : • 1.5 ml d’orcinol sulfurique (1,5% dans H2SO4 30%) • 7.5 ml d’acide sulfurique à 60 %

• Agiter au vortex

• 80°C, 20 min • Refroidir • Lecture à 510 nm


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ANNEXE 2 FACE : Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis

1. Principe La technologie FACE (Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis) a été décrite par Jackson en 1990. Elle combine la haute résolution et la simplicité de l’électrophorèse en gel de polyacrylamide (Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE) avec la sensibilité de détection donnée par la fluorescence.

2. Dérivation En principe, les oligosaccharides qui possèdent une fonction aldéhydique libre vont pouvoir réagir avec un fluorophore possédant une fonction amine primaire (voir schéma). La base de Schiff ainsi formée est ensuite stabilisée par amination réductive avec un agent réducteur : le cyanoborohydrure de sodium, ce qui aboutit à la formation de dérivés glycanniques fluorescents stables qui seront séparés par PAGE. Après séparation, les dérivés sont détectés et quantités grâce leur fluorescence par illumination UV. Trois problèmes majeurs se sont posés lors du développement de la technique d’analyse des sucres par électrophorèse en gel. Tout d’abord, les oligosaccharides ne sont pas tous chargés (porteurs de résidus d’acide sialique et/ou de sulfate) et ne peuvent donc pas migrer. L’utilisation de fluorophores chargés négativement, tels que l’ANTS (8 aminonaphthalène 1,3,6-trisulfonate), l’ANDA (potassium 7-amino-1,3-naphthalène disulfonate), l’ANSA (sodium 4-amino-naphthalène sulfonate) ou encore l’APTS (1-aminopyrène-3,6,8-trisulfonate) (Fig. 1) a permis de résoudre ce premier problème. En effet, une fois que le glycanne est couplé avec l’un des fluorophores

chargés, la molécule va posséder une charge globale nette négative et pourra ainsi migrer dans un champ électrique.

Fig. 1 : Mécanisme de couplage d’un oligosaccharide réducteur avec l’APTS par amination réductive

Le deuxième problème concerne la quantification des oligosaccharides. Les systèmes de couplage et de détection des sucres doivent être tous deux quantitatifs. Plusieurs méthodes d’analyse des glycannes utilisent le radiomarquage avec du borohydrure de sodium tritié, mais des problèmes relatifs à la présence des radioisotopes et à la nécessité de travailler dans des volumes importants limitent l’utilisation en routine de ces composés.

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Les fluorophoredétection capabpermettant de tra

Fig. 2 : Structureglucosamine ; roialique et vert, m

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ETUDE S

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STRUCTURALE D

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13

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ANNEXE3

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ETUDE S

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cte

e es à

Le d

HARIDES – ANNE

le signal autres sisurface e

R doit êt

dosage par la m1. Déterminatio

mélange comà analyser e

et de m

pour [ ] [X =

2. On ajoute leinconnu

on veut déter

[ ]2X =

donc

EXES

du standard inteignaux du mélanest inexact. tre compris entre

méthode du staon du coefficientmprenant le stan

en concentration

picS

picX

AA

R = qua

manière général

[ ]1X et [ ] [ ]1SS =

e standard intern

miner [ ]2X incon

[ ]2

2 2

picS

picX

AA

RS

AA

=×

c [ ]22

1

AA

XpicS

picS ×=

erne doit être binge inconnu, sin

e 0,8 et 1,2

andard interne et de réponse : inndard interne et

ns connues.

and [ ] [ ]XS =

e : [ ]picX

AXA

R ×=

1 connues, A

R =

ne aux composé

nnue, avec [ ]S =[ ]

[ ]12

2

1

2

picXpicS

picX

AXA

SAA

××

[ ][ ] [

1

2

1

2 XAA

SS

picX

picX ××

1

en séparé des non le calcul de

en pratique : njecter un

les composé(s)

[ ]picSAS

[ ][ ]

1

1 1

1 picS

picX

AS

XA

×

s du mélange

[ ]2S= connue :

[ ]1

1

picSAS

]1X .

14

)


15

Coefficients de réponse de quelques monosaccharides en CPG :

• Quantification des hexoses avec Proline : RαGal/Pro = 0.762 RαMan/Pro = 0.827 RαGlcNAc/Pro = 1.321 RαGlc/Pro = 1.1 RαGalNAc/Pro = 1.723 MM(Pro)=115

• Quantification des hexoses sans Proline :

RαMan/Glc = 0.724 RαMan/Gal = 0.537 RαGal/Glc = 0.703 RαGlcNAc/Glc = 1.221 RαGalNAc/Glc = 1.225

A C 1Lpsdàtecdpcp Epvsc 2gIl

ANNEXE 4

CHROMATOGRA

1. Définition et aLa chromatograppar séparationsusceptibles décompositionà-dire, essentiellechnique de c

constituants d’udistribution de phase stationnacomposés, et unphase stationnair

En CPG, la phapoint d’ébullition vecteur ou gaz tationnaire à

conditionné par le

2. Principe géngaz : est constitué de

Un injec(solutés évaporati

RAPHIE EN PHA

application génphie en phase gan qui s’appliqu

d’être vapo(composés volalement les comchromatographieun mélange en

chacun des sire, qui va rete

ne phase mobilere.

ase stationnaire et la phase mo

porteur : He, Ardébit constant.e type de détect

éral d’un appa

e 3 grandes partcteur : qui perm

pur ou solubon

ETUDE S

ASE GAZEUSE

nérale : azeuse est une ue aux comp

orisés par atils, thermiquem

mposés organiqe, elle permetn se basant sursolutés entre denir plus ou me, qui va les en

est constituée obile est un gazr, H2, N2 …) qu. Le choix duteur.

areil à chromato

ties : met l’introductio

bilisés dans un

STRUCTURALE D

(CPG)

méthode d’anaposés gazeux

chauffage sment stables), cques. Comme tt de séparer r une différencedeux phases : moins fortementtraîner le long d

d’un liquide à z inerte (appeléui parcourt la phu gaz vecteur

ographie en ph

on de l’échann solvant) et

DES OLIGOSACCH

alyse ou

sans c’est-toute

les e de une

t les de la

haut é gaz hase

est

hase

tillon son

InjeLes0,5 des

HARIDES – ANNE

Une colonnestationnaire mélange. En

Un détecteusortie de copar FID (Fionisation dcouplage avplus en plus

ecteur : produits sont i

à 10 µL) à travesolutés de l’é

Seringue (échantillon)

v

injecteur

EXES

e : placée dansqui va permett

n CPG, elle est gur : qui va permolonne après séFlame Ionizatioe flamme) est vec un spectroms souvent utilisé.

Schéma d’

njectés grâce àers un septum. L

échantillon qui v

gaz vecteur

four

co

s un four, elle ctre la séparatiogénéralement de

mettre de détectéparation. En Con Detection ola plus couram

mètre de masse

une CPG

à des microserinL’injecteur permvont alors se m

enregistreme(chromatogram

olonne

1

onstitue la phasn des solutés de type capillaireter les solutés eCPG, la détectioou détection p

mment utilisée. Le (GC-MS) est d

ngues (volume dmet la vaporisatiomélanger au ga

FID

ent mme)

16

se du . en on ar Le de

de on az

v(ss(s E(dtêLc Ls(b

vecteur. On rencsplit), qui permeaturer la colonnsplitless), recom

En mode splitlesde 30 secondesête de colonn

L’augmentation dcomposés et le s

La température dupérieure à la tebloc chauffant :

contre en généraettent d’injecter dne (colonnes ca

mmandés pour la

ss, la vanne de s à 1 minute), lene grâce à ude la températursolvant qui sort le

de l’injecteur esempérature d’éb180 – 400°C).

ETUDE S

al 2 types d’injecde très faibles voapillaires), ou saa détection de tra

fuite est ferméee solvant et le soune faible temre du four permee premier.

st fixée à une tebullition du comp

STRUCTURALE D

cteurs : avec diviolumes et de neans diviseur deaces.

e pendant l’injeoluté sont piégé

mpérature de et ensuite d’élue

empérature de 2posé le moins v

DES OLIGOSACCH

iseur e pas e flux

ction és en four.

er les

20°C volatil

RemliqukPaAutr

ColIl sgranuned’unstatDandire

HARIDES – ANNE

marque : l’évapoide va donner 1

a, 1 µl de méthanres types d’injec

On-column colonne, à farapide.

vanne d’inje

lonnes en CPGs’agit d’un tubnulométrie cont séparation eff

n film liquide de ionnaire pour les

ns le cas des ctement déposé

EXES

oration va entraî00 à 1000 µl de

nol donne 483 µcteurs

à froid : l’échaaible températu

ection

: e en acier inrôlée permettanicace) constitué haut point d’ébs colonnes rempcolonnes capill

ée sur la paroi in

îner l’expansione gaz (exemple

µl de méthanol g

antillon est dépre, et entraîné a

nox rempli de nt un remplissaés d’un supportbullition qui joueplies. aires, la phase

nterne de la colo

1

n du gaz : 1 µl d: à 200°C et 10azeux).

posé en tête daprès vaporisatio

grains fins (dage homogène t inerte recouve

e le rôle de phas

e stationnaire eonne.

17

de 00

de on

de et

ert se

est


18

Remarque : dans les 2 cas, il s’agit de chromatographie gaz-liquide car la phase mobile est un gaz et la phase stationnaire un liquide. La phase stationnaire peut aussi être un solide adsorbant (silices, alumines, zéolithes, polymères…). On parle alors de chromatographie gaz-solide.

Séparation en CPG sur colonne capillaire (en haut) et sur colonne

remplie (en bas) des constituants d’une huile. Illustration du pouvoir résolutif d’une colonne capillaire.

Des caractéristiques de la colonne, c’est-à-dire de la phase stationnaire, dépend la qualité de la séparation :

nature de la phase stationnaire : les principales phases stationnaires sont de type polyéthylène glycols - [CH2-CH2-O)]n- ou polysiloxanes - [Si (CH3)2O- Si (CH3)2O]n – (ces dernières étant les plus courantes). Plus leur polarité est élevée, plus la phase stationnaire est polaire et plus elle va retenir les composés polaires.

température de la colonne : elle peut être variable au cours de la chromatographie (gradient de température) pour raccourcir le temps de rétention des composés les plus retenus et affiner les pics correspondant.

longueur de la colonne (quelques mètres, jusqu’à 100 m) diamètre interne de la colonne (0,1 – 0,5 mm). Plus il est

faible, plus l’efficacité de la colonne est élevée épaisseur du film de phase stationnaire : les films épais sont

plus larges d’utilisation mais augmentent le temps de rétention ce qui a souvent pour conséquence d’augmenter la température de la colonne.

Processus de séparation de deux solutés : Un soluté A pénétrant dans la colonne à l'état vapeur et arrivant au contact de la phase stationnaire va se partager entre les deux phases. A l'équilibre, on peut écrire : K = [A]s / [A]v

K, ou coefficient de partage, est une constante. Pour un soluté A donné, sa valeur dépend de la température de la colonne et de la nature de la phase stationnaire.

Lg

Ldgpated

Lréqm

La séparation degrands critères e

la volatilit la polarité

Les solutés sontd’ébullition auqugénéralement cpossible permetapolaire, les cempérature d’éb

d’ébullition, le co

Les interactions ésultent en une

que B ou interagmoins polaire que

e plusieurs soluen CPG : té é

t principalemenuel on rajoute conseillé d’utilisttant une bonncomposés apobullition. Entre 2mposé le plus p

différentielles dee séparation de it moins fortemee B).

ETUDE S

tés en mélange

t séparés suival’influence de

ser la colonnene séparation. olaires sont é2 composés de polaire sera le m

es solutés A et Bces derniers. Ic

ent avec la phas

STRUCTURALE D

e se fonde sur d

ant leur tempéraleur polarité. Il

e la moins poSur une colo

élués suivant même tempéra

oins retenu.

B avec les 2 phci, A est plus v

se stationnaire (A

chromatogr

DES OLIGOSACCH

deux

ature l est olaire onne

leur ature

ases volatil A est

Remaugteméluestat Dét

ramme

HARIDES – ANNE

marque : la solumente : les apérature croît d’

er les composéionnaire.

tection FID : très sensible

H2O et inorganiques

les composé une électro

proviennent (destructif) qnA) d’ionisat

large gammdétection : p

en l’absencearrive à débproduit un cligne de bas

lorsqu’un so+, captés panégatif par création d’uau débit-ma

il est discriinjectés, ceréponse) si o

EXES

ubilité d’un gaznalytes sont d’où l’utilisation dés les plus fo

e, universel (sauorganiques), n

és sont brûlés daode collecte lde la décompos

qui vont généretion, qui va être

me de linéaritépg e de solutés en bit constant (precourant ionique rse ~ 0 oluté brûle dans ar une électroderapport à la tên coutant ioniqusse de soluté. minant : sa rép

e qui impose on veut analyse

z diminue quandonc moins red’un gradient de ortement retenu

uf composés simne convient q

ans une flammees ions carbosition des soluté

er un faible courensuite amplifié: de 20 à 10

sortie de colonnession constanterésiduel très faib

la flamme, il y ae collectrice portête du brûleur, ue de quelques

ponse varie suiun étalonnage r un mélange

1

d la températuetenus quand température po

us sur la phas

mples : CO2 , NHu’aux composé

e O2/H2 one formés qés dans la flammrant (de quelqueé. 00 pg ; limite d

ne, le gaz vectee) au détecteur ble et constant

a formation d’iontée à un potentiet d’électrons nA, proportionn

vant les produi(coefficients d

19

re la ur se

H3, és

qui me es

de

ur et

ns iel

nel

its de

A

Principe d

Autres détecteu Thermo-io

phosphorne sont p

A capturegroupemeélectroniqhalogéné

A photomcomposésréponse vecteur :

Spectromuniversel.

Infrarougevecteur co

Photoioniionisables

de la détection p

urs : onique : utilisérés, ou halogénéas détectés. Gae d’électrons : ents électrophileque (particuliès).

métrie de flamms contenant dest proportion

N2 ; H2 métrie de masse

. Gaz vecteur : He : assez peu ompatibles sontsation : adaptés. Le détecteur

ETUDE S

ar ionisation de

és pour les coés. Les compos

az vecteur : azotedétection de mes donc ayant rement adapté

me : principalemdu soufre ou nnelle au déb

e : très sensibleHe sensible mais

t l’hydrogène, l’aé à la détectest très sensibl

STRUCTURALE D

flamme (FID)

omposés azotéssés azotés minée

molécules ayant une grande aff

é aux comp

ment utilisé poudu phosphore.

bit massique.

e (moins d’1 pg

universel. Les azote et l’héliumtion de comple et sa réponse

DES OLIGOSACCH

s ou éraux

des ffinité osés

r les Sa Gaz

g) et

gaz

osés e est

Chr

HARIDES – ANNE

proportionnesoluté.

romatogramme Le tracé

l'enregistremdétecteur en

A partir du soluté grâcecomparaisonde déterminquantitatif).

detector resp

EXES

elle sur une larg

e d'un soluté : ad'un chro

ment de l'intenn fonction du tem

chromatogramme à son tempsn avec un standner sa concentr

ponse

ge gamme à la

aspects qualitatmatogramme

nsité du signalmps

me, il est possibs (ou volume) dard (aspect quration dans un

2

concentration e

tif et quantitatifcorrespond

l généré par

ble d'identifier ude rétention p

ualitatif), ainsi qumélange (aspe

20

en

f à le

un ar ue ect

A S 1

2Il

c

ANNEXE 5

SPECTROMETR

1. Principe de l’a détermine

spectromprincipalehaut pglycoproté

déterminerésidus) (MS/MS)modificati

2. Principe géné est constitué de

une sourc(type ESAssisted faciles à a

un analysleur ratiovol=TOF,

un détecdonne unmesure e

on obtient chaque ion

RIE DE MASSE

’analyse par sper la masse étrie de m

ement aux comppoids molééines, oligosaccer la masse

constituant ce: obtention deions post-traduc

éral d’un spectre 3 grandes partce d’ionisation : SI= ElectroSpra

Laser Desorptianalyser que lesseur : permet la o masse sur ch FT-ICR)

cteur : détecte n signal en foncet amplifie le cou

un spectre m/

ETUDE S

MALDI-TOF

ectrométrie de moléculaire d

masse MALDposés thermolabculaire (pep

charides, oligonumoléculaire dees composés e la séquence ctionnelles…

romètre de masties : ionise les molécay Ionisation ; on Ionisation).

s composés neuséparation des

harge m/z (qua

les ions après ction de leur aburant ionique.

/z en fonction

STRUCTURALE D

masse : d’un composéDI-TOF s’adrbiles, non volatilptides, protéucléotides) es monomères

par fragmentaprimaire, sites

sse

cules de l’échanMALDI = Ma

Les ions sont tres ions en fonctioadrupole, temps

leur séparatiobondance relativ

n de l’intensité

DES OLIGOSACCH

: la esse ls de ines,

(ou ation s de

tillon atrix-plus

on de s de

on et ve. Il

é de

Remvidepartd’ai Intr

HARIDES – ANNE

marque : les 3 pe poussé pour t en part dans êr.

roduction de l’é dépend de la soit directem

soit « en cd’introductioun appareilspectromètrl’analyse MSdes différen

EXES

parties sont gépermettre aux

être gênés par d

échantillon : a méthode d’ion

ment dans la souchemin » vers

on (ESI uniqueml de chromatore de masse (LCS intervient apr

nts constituants

néralement maiions de traverses collisions av

nisation et du typurce d’ionisation

la source. Cment) implique ugraphie localisC-MS ou GC-Mrès passage (etd’un mélange)

2

intenues sous user l’ensemble dec des molécule

pe d’échantillon n (MALDI ou ESe dernier mod

un couplage aveé en amont dS). Dans ce ca

t donc séparatiosur une colonn

21

un de es

I), de ec du as, on ne

Sd

chromatoles autres

Spectrométrie desorption ionis

Ce type de moléculaires moins pour le

L’échantillon matrice, qui permettre l’io

ographique : les s au spectromètr

de masse MAsation – time of

MS permet l’anavec une préc

es composés de

est co-cristalva absorber fo

onisation des mo

cible MALD

ETUDE S

composés arrire de masse.

ALDI-TOF (maf flight)

nalyse de compcision de l’ordr

e masse inférieur

llisé avec un ortement l’énerg

olécules de l’éch

DI

STRUCTURALE D

ivent les uns a

atrix-assisted l

posés de haut pre de 1:10 000re à 40 000 Da.

composé, apgie du laser quantillon.

DES OLIGOSACCH

après

laser

poids 0e au

ppelé ui va

La mpoula ss’agmol

cet frag

dd’iodanperd

Exe

HARIDES – ANNE

matrice va transr les molécules

surface du mélagit d’un mode écules.

ce mode d’ionisdonc des spe

gmentation des iodeux modes d’ionisation se fait s l’échantillon :dent un proton.

o ionisatioprotéinesmoléculaparfois d38, par doublem

o ionisatioet les majeurs accompachargées

emples : aminacidealcoo

les ions sont endétecteur qui d

EXES

sformer l’énergiede l’échantillon

ange échantillod’ionisation do

ation génère deectres faciles ons ne se produnisation : positiven fonction de présence de

n positive (en s) : donne comaires protonés d’adduits (sodium

exemple). Onment chargées @

n négative (en goligosaccharidedes ions moléc

agnés parfois ds @ ½ m/z ou d

es es carboxyliquesols

suite accélérés détermine leur

e du laser en én et permettre l’én/matrice en puce qui n’endo

es ions portant uà interpréter.

uit pas. ve ou négative. Ls groupes foncgroupements q

général pour me espèces m(M+H+) @ m/

m m/z + 22 et/ou observe parfo

@ ½ m/z et des dgénéral pour leses) : produit culaires déprotond’adduits, d’espèe dimères @ 2 m

R-NH2 + H+ s R-CO2H R-C

R-OH R-O-

dans un champ masse comme

2

énergie excitatricéjection d’ions dhase gazeuse. ommage pas le

une seule chargEn général,

Le choix du modctionnels présenqui acceptent o

les peptides majeures des ion

/z, accompagnéu potassium m/zois des espècedimères @ 2 m/zs oligonucléotidecomme espècenés (M-H-) @ m/èces doublemem/z.

R-NH3+

CO2- + H+

+ H+

électrique vers une fonction d

22

ce de

Il es

ge la

de nts ou

et ns és

z + es z. es es /z,

ent

le du


23

“temps de vol” (time-of-flight, TOF) : les molécules de masse plus faible vont progresser et atteindre le détecteur plus rapidement que les molécules de masse plus élevées). L’analyseur mesure donc le temps qu’ont mis les ions pour parcourir la région sans champ électrique (dans le « drift tube »)

Analyseur en temps de vol :

Documents

ETUDE STRUCTURALE DES OLIGOSACCHARIDES …ddata.over-blog.com/xxxyyy/3/94/58/78/Carsbiom_Topo-TP...monosaccharides) de l’oligosaccharide X ou Y se fait par chromatographie sur couche