Etude microbiologique et hygiénique du yaourt fabriqué et ... · The quality hygienic revealed absence the pathogenic flora (total coliforms and fecal . staphylococcus aureus, salmonella)

Mémoire présenté pour l’obtention du diplôme DE MAGISTER

EN

Microbiologie Alimentaire et Industrielle Thème

Présenté Par: Mr. LOUMANI AKIL.

Devant le Jury composé de :

Président : Pr. BELKHOUDJA M. U. d’Oran Esenia.

Examinateur : Pr. CHEKROUN A. U. d’Oran Esenia

Examinateur : Dr. CHERIGUENE A. U.de Mostaganem

Examinateur : Dr. BEKADA A. U. d’Oran Esenia

Rapporteur : Pr. BENSOLTANE A U. d’Oran Esenia

Etude microbiologique et hygiénique du yaourt fabriqué et commercialisé dans

l’ouest Algérien

Année universitaire 2009/2010

Résumé

Huit (08) souches de bactéries lactiques ont été isolées et identifiées à partir de 4 échantillons de yaourt collectés dans différentes régions de l’ouest algérien à savoir Relizane, Oran, Ain Témouchent, et Mostaganem.

L’analyse des qualités hygiéniques des yaourts expérimentaux a révélé une absence totale

des bactéries pathogènes (Coliformes totaux et fécaux, Staphylococcus aureus, Salmonella) et la

présence de quelques colonies de levures et moisissures n’ayant pas d’incidence sur la qualité du

yaourt.

Le nombre des bactéries spécifiques du yaourt viables est en moyenne de l’ordre de 107

UFC/ ml pour les Streptocoques et de106UFC/ ml pour les Lactobacilles.

Les études macroscopique et microscopique ont montré les caractéristiques typiques

d’appartenance des bactéries isolées aux genres Lactobacille et Streptocoque.

L’identification des espèces par le système API50CHL a révélé la présence de 4 souches de

Lactobacilus delbuekii subsp bulgaricus et 4 souches de Streptococcus thermophilus

lactobacillus delbruekii subsp bulgaricus et Streptococcus thermophilus ont été étudiés de

point de vu physiologique et biochimique. Leur activité protéolytique est assez importante évalué

entre (27et 28mm)de diamètre pour Lactobacillus delbruekii subsp bulgaricus et entre 20 et

22mm pour Streptococcus thermophilus. Le pouvoir acidifiant des espèces de Streptococcus

thermophilus (strp1, strp2, strp3 et strp4) est respectivement de l’ordre de (54D°, 59D°, 58D° et

60D°), tandis que chez les espèces de Lactobacillus delbruekii bulgaricus (lb1, lb2, lb3, lb4), il

est de l’ordre de(60D°, 65D°, 69D° et 70°D) respectivement.

L’activité antagoniste des souches lactiques a montré que Lactobacillus delbruekii spp bulgaricus

et Streptococcus thermophilus ont un pouvoir d’inhibition vis à vis de souches pathogènes estimé

par des diamètres de l’ordre de 15 mm et 18mm respectivement.

UMots clés :U Lactobaclilus delbruekii sbsp bulgaricus ; Streptococcus thermophilus ; qualité

hygiénique ; propriétés technologiques; acidification; activité protéolytique.

Activité antimicrobienne

Abstract

During the work we have isolated and identified 8soche of lactic bacteria (streptococcus

thermophils and lactobacillus delbruekii subsp bulgaricus) from 4 samples collected from

different regions of Algeria to oust know Relizane, Oran, Ani temouchent and Mostaganem.

The quality hygienic revealed absence the pathogenic flora (total coliforms and fecal

staphylococcus aureus, salmonella) and the presence of some colonies of yeasts and molds but

don’t influence by the quality of yoghurt..

The enumeration of LAB determined the number of streptococci higher than 107 ufc./ ml

and the number of lactobacilli higher than 106ufc./ ml. all stains had a proteolytic activity (

prot+) and faster in skim milk .the acidifying capacity of strains (strp1,strp.strp3and strp4) is

respectively. strp1 (50D°). strp2 (50D°), strp3 (55D°), strp4 (65D°), and the strains (lb1, lb2,

lb3and lb4) is respectively lb1 (70D°). lb2 (50D°) lb3 (60D°). lb4 (70D°).the antagonistic

capacity for streptococci and lactobacilli against E.coli by the method of diffusion agar gave

the positive results by the appearance zones of inhibition (18.and15mm) respectively

Key Word: lactobacilli belbruekii bugaricus, streptococci theromphilus, hygienic quality,

Proteolytic activity, antimicrobienne activity.

الملخص

عينات من الياغورت المعطر المصنوع بالغرب 4 سالالت من بكتريا الحليب انطالقا من 8قمنا بعزل

الجزائري.تم التعرف علي هذه السالالت استنادا الي خواصها المورفولوجية

L’API système. و البيو كمائية و الفسيولوجية اضافة الى نظام التخمر الكربوهيدرات

تأثير المضاد الحيوية علي سالالت بكتريا الحليب تبين ان delbruekii spp bulgaricus حساسة لبعض

spiromycine, oxacilline,, pencilline ,amikacine مقاومة للبعض األخر مثلpristinamycine., colistine

بعد ذلك تم انتخاب السالالت تبعا للخصائص االنتاجية و البيو تكنولوجية مثل القدرة على انتاج الحمض و

تحليل البروتين

كما قمنا بمراقبة النوعية الجودة للعينات االربعة فوجدنا غياب للبكتيرات الممرضة وبعض المستعمرات

الخمائر التي ال تؤ ثر على النو عية .

مراقبة النوعية بكتيرات الحمض االكتيك. الخواض التكنولوجية .انتاج الحمض. التحلل كلمات المفتاحية البروتيني .التحلل الذاتي للخاليا

Remerciements Ce travaille a été réalise au laboratoire de microbiologie alimentaire

et industrielle a université d’Oran et laboratoire de contrôle de qualité de

willaya de Relizane.

Je teins a la remercies le professeur BENSOLTANE Ahmed pour

m’avoir proposé ce sujet et ces conseils et son suivi durant la période de

réalisation de ce travail avec toute la patience.

Je remercie aussi le président Pr BELKHOUDJA que me fait

présider ce travail

Un grand merci à monsieur, Pr : CHEKROUNE A, à Dr : BEKADA

.A et à Dr : CHERIGENE A pour avoir accepté d’examiner cette thèse.

Je remercie, les personnes du service de laboratoire d’hygiène de

Relizane, Mr Abdlehadi, Zoulikha, Atika, Fatima qui m’a aidé pour la

réalisation d’une partie de ce travail.

Je remercie aussi, l’équipe de laboratoire médicale de l’hôpital de Mazouna et Sidi Mohamed Benali, de m’avoir fourni les produits et les

milieux de culture.

Je remercie toute ma famille pour la confiance, à mes frères Omar, Aissa, youcef, moussa, Benali, Abasse et Moustafa. Mon oncle Cherif et

sa femme Houria .

Je veux adresser mes sincères remercîments à tous mes collègues étudiantes; Djamila, Nachida, Fatima, Fatima Zohra et Nadjet.

Dédicace

Je dédie ce travail à mon père et ma mère que Dieu les garde pour moi.

Liste des figures 1 : Diagramme de fabrication des yaourts

2 : Fabrication des yaourts ferme

3 : Effet du traitement thermique sur la structure de la microstructure du yaourt

4 : Techniques d’isolement des bactéries lactiques à partir des yaourts fabriquées

5 : Aspect macroscopique des levures et moisissure sur milieu OGA pour E1, E2, E3.

6 : Aspect macroscopique des levures et des moisissures sur milieu OGA pour E4

7 : Nombre des lactobacilles dans des quatre échantillons

8 : le Nombre des streptocoques dans Les quatre échantillons

9 : Aspect macroscopique de strp1 sur (M17) après 24h d’incubation en aérobiose à42C

10 : Aspect microscopique de strp1après coloration de Gram(X100)

11 : Aspect macroscopique de strp2 sur M17après 24hD’incubation en aerobioseà42C


13 : Aspect macroscopique de strp3 sur M17après 24hD’incubation en aerobioseà42C


15 Aspect macroscopique de strp4 sur M17après 24hD’incubation en aerobioseà42C


17 : Aspect macroscopique de lb1sur MRS acétique après d’incubation en

anaérobiose à 37°C.

18 : Aspect microscopique de lb1après coloration de Gram(X100).



20 : Aspect microscopique de Lb2après coloration de Gram(X100).

21 :

Aspect macroscopique de lb3sur MRS acétique après d’incubation en






25 : Teste de lait de sharman 0.1%des souches strp1, strp2, strp3, strp4 (de gauche adroite)

26 : Teste de lait de sharman 0.3%des souches strp1, strp2, strp3, strp4 (de gauche adroite

27 : Le profil fermentaire de strp1du .maltose, xylose, raffinose, mannitol, glucose, saccharose, lactose. (de gauche a droit).

28 : Type fermentaire de lactobacille témoin, lb1, lb2, lb3, lb4 (de gauche à droite)

29 : Test d’hydrolyse de l’arginine des souches lactobacilles témoin(+), témoin(-) Lb4, lb3, lb2, lb1 (de droite à gauche),

30 : Le profile fermentaire de lb1 du glucose, fructose, galactose, xylose mannitol, raffinose ribose (de droite à gauche)

31 : Profile de fermentaire d’une souche de lactobailus delbrueckii bulgaricus avent

’incubation

32 : Profil fermentaire d’une d’une souche lactobacilus delbruckii bulgaricus après 48h d’incubation.

33 : Profile de fermentaire d’une souche de Streptococcus thermophilus avant l’incubation.

34: Profil fermentaire d’une d’une souche de Streptococcus thermophilus après 48h

’incubation.

35 : Activité protéolytique chez les Lactobacillus delbruecklii ssp bulgaricus

36 : Activité protéolytique chez les Streptococcus theromphilus

37 : Evolution de Ph en fonction de temps des srtp1, stp2, strp3, strp4dans le lait écrémé à 42°C.

38 : Evolution de PH en fonction de temps des Lb1, lb2, lb3, lb4 dans lait écrémé à 42°C.

39 : Cinétique d’évolution de l’acidité doronic produite en fonction du temps par strp1, strp2

stpr3, strp4 dans lait écrémé à 42°C 40 : Cinétique d’évolution de l’acidité doronic en fonction de temps produite par lb1, lb2,

lb3, lb4 à 42°C 41 : Croissance des Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus dans le lait écrémé à 37C°.

Liste des tableaux Tableau

Page

01 : Réglementation concernant la quantité d’acide lactique ou le pH dans le yaourt. 2

02 : Composition physique du lait de vache et propriétés physiques. 4

03 : Les différentes façons de standardiser ou d’enrichir le lait. 6

04 : Mélange et incidences sur la qualité du yaourt. 7

05 : Caractéristiques distinctives des espèces de streptocoques lactiques 19

06 : Les caractéristiques physiologiques des Lactobacillus du groupe I 21

: Des bactéries lactiques utilisées dans la fermentation des aliments 30

08 : Principaux critères de choix des bactéries lactiques en fonction de leur

application

40

09 : Analyse microbiologique des quatre échantillons du yaourt 51

10 : Résultats des observations culturales et morphologiques des Streptocoques et

des Lactobacilles

53

11 : Caractère physiologique et biochimique des souches streptocoques 60

12 : Caractère physiologique et biochimique des souches lactobacille 61

13 : profil fermentaire des lactobacilles confirmé Par le système API50 CHL après 48h d’incubation

14 : profil fermentaire des streptocoques confirmé par système API50CHL

15 : Les antibiotique sensible et résistent pour les strptococcus thermophilus 68

64

66

16 : Activité protéolytique des isolâtes de yaourt sur milieu YMK 69

17: Test d’interaction bactérienne entre les bactéries du yaourt et des souches Pathogènes 73

Liste des abréviations

C° : Degré Celsius.

D° : Degré dornic.

Mg : milligramme.

T : temps.

Mn: minute.

h: heure.

p: poids.

Lab: lactic acid bacteria.

FIL: fédération international du lait.

UFC : unité formant colonies.

Strp: Streptococcus theromphilus.

Lb: Lactobacilus delbrueckii ssp bulgaricus.

pH: potentiel d’hydrogène.

ml : millilitre.

Introduction

Introduction

Introduction

Les bactéries lactiques représentent le deuxième plus grand marché de production

de biomasse, après les levures.

Principalement utilisées lors d’applications dans l’industrie alimentaire, comme la

fabrication des fromages, des laits fermentés, de certains légumes et produits carnés

fermentés et de certains vins, elles interviennent aussi dans l’industrie chimique pour la

production d’acide lactique et de bio polymères et acquièrent, depuis quelques années, un

rôle croissant en santé animale et humaine.

La production de ferments lactiques, située en amont de leurs applications,

représente une activité industrielle importante. Produits par fermentation, généralement en

cultures pures et en conditions contrôlées, les bactéries lactiques sont soumises à

différentes opérations unitaires lors de leur production industrielle: refroidissement,

concentration, cryoprotection, congélation ou lyophilisation et stockage à basse

température.

Or, l’objectif majeur de cette filière industrielle est de produire des concentrés

bactériens de qualité élevée, c’est-à-dire, comportant un nombre élevé de cellules viables,

présentant une reprise d'activité maximale lors de leur utilisation, capables d'être conservés

le plus longtemps possible et bien reproductibles.

Cependant, les étapes de la production des ferments induisent différents types de

stress (nutritionnel, acide, thermique, osmotique, oxydatif, mécanique) qui sont à l’origine

d’une dégradation de l’état physiologique des cellules, avec des conséquences directes sur

la qualité technologique des ferments. Il est donc nécessaire de bien maîtriser tout

l’ensemble de ces opérations.

Introduction

C’est dans cette optique que s’inscrit cette étude dont l’objectif consiste à étudier les

caractéristiques microbiologiques correspondants à la flore lactique spécifique de certaines

marques de yaourt commercialisées dans l’ouest algérien ainsi que leur qualité hygiénique

par la recherche la flore microbienne d’altération et la flore pathogène telle que stipuler par

la réglementation et la législation algérienne en matière de normes. Les travaux entrepris

dans cette thèse consistent plus particulièrement à isoler, caractériser et identifier les

bactéries lactiques spécifiques utilisées dans l’ensemencement des échantillons de yaourts

expérimentaux, suivis par une étude de leurs propriétés biotechnologiques notamment leur

pouvoir acidifiant, protéolytique, comportement vis-à-vis des antibiotiques et les effets

antagonistes.

Revue bibliographique


1

1. Fabrication et caractérisation du yaourt

1.1. Fabrication du yaourt 1.1.1. Définition, historique et réglementation

C’est dans la catégorie des laits fermentés obtenus par action de bactéries lactiques

thermophiles que se classe le yaourt, il est obtenu, selon la fédération internationale laitière

(FIL), par le développement des seules bactéries lactiques Lactobacillus delbrueckii sous-espèce

bulgaricus et Streptococcus thermophilus, qui doivent être ensemencées simultanément et

trouvées vivantes dans le produit à raison d'au moins 107

Les critères pris en compte par le codex :

bactéries/g.

a. Dénomination du produit Elle varie selon les langues, mais les termes les plus utilisés sont « youghurt », «yoghurt »

ou « yaourt ».

b. Types de produit Ils sont définis souvent en fonction de leur teneur en matière grasse ou de l’adjonction

éventuelle d’ingrédients (yoghourt partiellement écrémé ou maigre, yoghourt écrémé, le

yoghourt sucré et le yoghourt nature).

c. Le type de ferment utilisé Selon la FIL, et de nombreux alimentarius et la FIL dans la réglementation du yaourt sont

les suivants : pays, la dénomination « yaourt » nécessite l’utilisation obligatoire et

exclusive des deux ferments caractéristiques Streptococcus thermophilus et Lactobacillus

delbrueckii sous-espèce bulgaricus (Luquet et Carrieu, 2005).

d. La quantité de ferment contenue dans le produit fini

La FIL fixe la quantité de ferments vivants, égale à 107

e. La viabilité de la flore lactique

bactéries/g rapportés à la partie

lactée jusqu’à la datte limite de consommation.

Flore viable pendant toute la durée de vie.

Ingrédients laitiers Lait pasteurisé, congelé, écrémé, concentré, en poudre, crème et caséines etc.

f. Ingrédients non laitiers Une multitude d’ingrédients peut être incoyaourt. Il peut s’agir par exemple de fruits sous

différentes formes (purée, jus, pulpe, sirop etc.), de céréales, de légumes ou de sucre.


2

La quantité d’ingrédients non laitiers est fixée par le codex alimentarius, la FIL et la

plupart des pays à moins de 30% en poids du produit fini.

g.1. pH : La FIL préconise une teneur de 0,7% d’acide lactique. Cette valeur est respectée dans

certains pays avec une variabilité de 0,6 à 15%. Certaines normes imposent un pH inférieur à 4,5

ou 4,6 (tableau 1).

Tableau 1 : Réglementation concernant la quantité d’acide lactique ou le pH dans le yoghurt

(Luquet et Carrieu, 2005).

Organisme/pays Normes

FIL 0,7 % en poids exprimé en tant qu’acide.

France, Portugal, Italie Acide lactique libre > 0,7 %.

Espagne pH < 4,6

Pays-Bas pH < 4,5

Belgique < 0,7 % exprimé en acide lactique.

Pologne 3,9 < pH < 4,6

Tunisie 0,8 % d’acide lactique

Etats-Unis pH > ou = 3,8

Canada Acidité < 0,9 % exprimé en acide lactique.

Australie 0,8 % d’acide lactique.

Mexique pH < 4,5

Japon pH< 4,5

g.2. Taux de matière grasse

Il doit être minimum, inférieur à 3% dans le cas des yaourts (nature, sucré ou aromatisé),

compris entre 0,5 et 3% dans le cas des yaourts partiellement écrémés et 0,5% dans

les yaourts écrémés.

g.3. Teneur en protéines

Elle est égale à 2,8% dans le produit fini. En fonction de la technologie de fabrication, les

yaourts sont divisés en deux groupes :

g.3.1. Yaourts fermes :

Dont la fermentation a lieu en pots. Ce sont généralement des Yaourts nature ou

aromatisés.

g.3.2.Yaourts brassés :


3

Dont la fermentation a lieu en cuves avant le conditionnement. Ce sont généralement des

yaourts brassés nature ou aux fruits (Luquet et Carrieu, 2005).

Les yaourts et les produits fermentés frais, identifiés comme aliments bénéfiques pour la

santé, sont aujourd'hui des produits de grande consommation. Ainsi, selon une enquête du Centre

National Interprofessionnel de l'Economie Laitière (CNIEL), la production de yaourts et d'autres

laits fermentés ne cesse de croître et est parvenue à 1 435 993 tonnes en 2002 (Paci Kora, 2004).

1.1.2. Les matières premières et ingrédients La principale matière première pour la fabrication des yaourts est le lait dont, pour

l'essentiel, le lait de vache. Il est constitué d'environ 88% d'eau et de 12 % de matière sèche

contenant des glucides, des protéines, des lipides et des minéraux (Tamime et Robinson, 1985).

Le tableau 2 donne la composition du lait de vache. Afin d'augmenter la viscosité

apparente et la consistance des yaourts (Schkoda et al., 2001; Van Marle, 1998), la teneur en

matière sèche du lait écrémé utilisé est augmentée au préalable jusqu'à 10-12%. Après

concentration (par évaporation ou osmose inverse) ou, plus fréquemment, addition de poudre de

lait écrémé ou de protéines de lactosérum (Mahaut et al., 2000), on parle alors de lait écrémé

fortifié ou enrichi. Dans le cas des yaourts brassés sans matière grasse, des agents de texture

(épaississants ou gélifiants) sont souvent ajoutés. Ils améliorent l'apparence, la viscosité et la

consistance des yaourts.

Les additifs les plus fréquemment utilisés sont : la gélatine, les alginates, les celluloses, les

amidons, et les pectines. Les fruits dans les yaourts sont apportés sous forme de préparations de

fruits avec où sans sucres ajoutés. Les agents de texture, incorporés dans la préparation de fruit,

participent également à l'amélioration de la texture des yaourts. Les fruits les plus consommés

sont les fruits rouges et les fruits exotiques (Vignola, 2002).


4

Tableau 2 :

(Mietton et al., 1994).

Composition physique du lait de vache et propriétés physiques

Composition g / l

Eau 905

Glucides :

lactose

49

Lipides :

Matière grasse proprement dite

Lécithine (phospholipides)

Partie insaponifiable (stérols, carotènes, tocophérols)

35

34

0,5

0,5

Protides :

Caséines

Protéines solubles (globuline, albumine)

Substances azotées non protéiques

34

27

5,5

1.5

9

Sels :

de l’acide citrique

de l’acide phosphorique

de l’acide chlorhydrique

Traces

2

2,6

1,7

Constituants divers :

Vitamines, enzymes, gaz dissous

127

Extrait sec total 92

Extrait sec

1.1.3. Diagramme de fabrication d’un yaourt On peut voir à la figure 1 un diagramme des principales étapes de la fabrication du yaourt

et à la figure 2 un plan modèle de la fabrication d’un yaourt ferme.

Pour obtenir un produit final acceptable, les responsables de la qualité se doivent d’établir

les caractéristiques recherchées pour chaque produit et de dresser une liste des défauts possibles

associés à ces mêmes caractéristiques (Vignola, 2002). Le tableau 3 donne une liste des

Caractéristiques d’un yaourt nature.


5

Réception du lait

↓

Standardisation du mélange

↓

Homogénéisation

↓

Traitement thermique 90 à95 °C pendant 5 minutes

↓

Refroidissement jusqu’à 45 °C

↓

Inoculation

↓

Ajoute des fruits

↓

Incubation en chambre à 45°C pendant 4 ou 5 heures

↓

Refroidissement

Figure 1 :

Diagramme de fabrication des yaourts (Loones, 1994).

Cuve de lait Ensemencement Fermentation Refroidissement du Conditionnement traité (étuve) produit fini (tunnel)

Figure 2 :

Fabrication des yaourts ferme (Luquet et Carrieu, 2005).


6

Tableau 3 : Les différentes façons de standardiser ou d’enrichir le lait.

Mécanismes Remarque

Addition de solides totaux

Poudre de lait entier. Très utilisée malgré son goût, sa solubilité et

l’incorporation de l’air ; la mise en œuvre est facile.

Addition de lait évaporé. Mélange facile ; gût élevé ; peu utilisé.

Concentration par osmose inverse. Bon système ; toutefois l’installation et la mise en marche

sont coûteuses.

Evaporation du lait. Meilleur système ; enlever les odeurs (lait de chèvre) ;

enlève l’air du lait.

Addition de solide non gras

Addition de poudre de lait écrémé, de lait

écrémé évaporé.

Problème de solubilité ; incorporation possible de l’air ;

coût élevé.

Addition de poudre de lactosérum évaporé. Résultats très contradictoires.

Addition de protéines

Addition de caséine ou d’un concentré de

protéines de lactosérum ou de co-précipité.

Fort pouvoir texturant ; hydrophile ; efficacité

controversée ; chauffage nécessaire ; goût et texture

variables.

Concentration par ultrafiltration. Très bonne texture ; goût faible.

Addition de sucre

Addition de lactose. Texture faible ; changement de texture.

Dextrose, fructose, miel, sucres artificiels. Effets sucrants.

Adition des matières grasses

Addition de crème. Texture grasse typique ; type pouding ; nécessité

d’homogénéiser ; goût.

1.1.3.a. Réception du lait Il est généralement reconnu qu’on ne peut faire un produit de qualité avec une matière

première de mauvaise qualité. Dans cet esprit, il est primordial de mettre en place dés la

réception du lait ou toutes autres matières premières, des méthodes et des procédures rapides et

simples permettant de détecter les anomalies et les pertes possibles de contrôle.

1.1.3.b. Standardisation du mélange


7

Pour bien assimiler l’importance de la standardisation ou de l’enrichissement du lait sur la

qualité finale du yaourt, il est nécessaire de donner le rôle de chaque composante du lait.- Le gras

a un effet sur l’onctuosité et la sensation de douceur en bouche.

Le lactose est la matière première utilisée pour l’acidification et à un faible pouvoir sucrant,

Soit quatre fois plus faible que celui du sucre.

Les protéines, de par leur coagulation et leur capacité de liaison avec l’eau, agissent sur la

texture, particulièrement sur la viscosité, la consistance, l’élasticité et la fermeté.

Les minéraux, comme des boulons travaillent à la stabilisation du gel (Vignola, 2002).

1.1.3.c. Homogénéisation Elle a principalement des effets sur deux composantes du lait, soit la matière grasse et les Protéines. Le tableau 4 donne les causes possibles d’homogénéisation inadéquate d’un d’un

Mélange et les incidences sur la qualité du yaourt.

Tableau 4 :

causes possibles d’homogénéisation inadéquate d’un d’un mélange et les incidences sur la qualité du yaourt.(vignola 2002).

Causes incidences sur la qualité du yaourt

Pression

trop

faible

Séparation du gras, obtention de deux phases (présence d’une surface très crémeuse).

Présence d’un goût d’eau dans le produit non uniformité de la couleur.

Produit plus liquide, donc une consistance et une viscosité moindres.

Synérèse pression trop forte.

Pression

trop forte

Diminution dans l’onctuosité.

Viscosité et consistance inappropriées en raison d’un bris des protéines, produit plus liquide.

Présence de mousse ou de bulles à la surface.

1.1.3.d. Traitement thermique Le lait enrichi, éventuellement sucré, subit un traitement thermique. Le barème de

traitement thermique le plus couramment utilisé est de 90-95°C pendant 3 à 5 minutes (Mahautet

al., 2000 ; Paci Kora, 2004). Ce traitement a de multiples effets sur la flore microbienne ainsi

que sur les propriétés physico-chimiques et fonctionnelles du lait.


8

Tout d'abord, il crée des conditions favorables au développement des bactéries lactiques. Il

détruit les germes pathogènes et indésirables (Boudier, 1990) et inactive des inhibiteurs de

croissance tels que les lactopéroxydases (Farkey et Imafidon, 1995).

De même, il réduit les sulfures toxiques et entraînela production d'acide formique qui est

un facteur de croissance pour Lactobacillus bulgaricus (Loones, 1994).

Le traitement thermique a également un effet sur la conformation tridimensionnelle des

protéines, induisant la modification de leurs propriétés fonctionnelles. Il dénature la majorité des

protéines du lactosérum (85%) qui se fixent ainsi sur les molécules de caséines.

Enfin, il modifie les équilibres salins, en entraînant une augmentation de la taille des

micelles de caséines, de leur stabilité et de la quantité d'eau liée (Mahaut et al., 2000).

Au niveau rhéologique, ces modifications se traduisent par une amélioration après

fermentation de la fermeté des gels (Kalab et al., 1976 ; Mottar et al., 1989). De plus, le

traitement thermique entraîne une production plus importante d'acétaldéhyde, le composé

responsable de l'arôme "yaourt" (Singh, 1983).

1.1.3.e. Fermentation lactique Le lait, enrichi et traité thermiquement, est refroidi à la température de fermentation, 40-

45°C. Cette température correspond à l'optimum de développement symbiotique des bactéries

lactiques (Loones, 1994). Leur inoculation se fait à un taux assez élevé, variant de 1% à 7%,

pour un ensemencement indirect à partir d'un levain avec un ratio Streptococcus thermophilu s/

Lactobacillus bulgaricus de 1,2 à 2 pour les yaourts nature, et pouvant atteindre 10 pour les

yaourts aux fruits (Boudier, 1990 ; Mahaut et al., 2000).

L'ensemencement direct à partir de bactéries lactiques concentrées congelées se fait à des

taux de l'ordre de 0,03 %. Les deux espèces Streptococcus thermophilus et Lactobacillus

bulgaricus vivent en symbiose et en synergie. Lors de leur croissance, elles dégradent le lactose

en acide lactique, entraînant une baisse du pH et la gélification du milieu avec des modifications

structurales irréversibles.

En outre, ces bactéries produisent des composés carbonylés volatils (l'acétaldéhyde, le di

acétyle, l'acétone, l'acétate d'éthyle) (Imhof et al.,1994; Ott et al.,1997) et des exo

polysaccharides (Cerning et al., 1990) qui participent, respectivement, à l'élaboration de l'arôme

et de la texture des yaourts.

Lorsque le pH atteint une valeur comprise entre 4,7 et 4,3, un refroidissement en deux ;

temps (rapide jusqu'à 25°C, puis plus lent jusqu'à 5°C) est appliqué afin de stopper la

fermentation. En effet, l'activité des bactéries lactiques est limitée pour des températures

inférieures à 10°C (Tamime et Robinson, 1985).


9

1.1.3.f. Conditionnement et stockage Les yaourts, conditionnés dans des pots en verre ou en plastique, sont stockés en chambres

froides à 4°C en passant au préalable dans des tunnels de refroidissement.

A ce stade, ils sont prêts à être consommés. La durée limite de leur consommation est de

28 jours (Luquet et Carrieu, 2005; Paci Kora, 2004).

Pendant le stockage, les bactéries lactiques maintiennent une activité réduite. Cette

Évolution, appelée post-acidification, se traduit par une légère baisse du pH, surtout pendant les

2 premiers jours de stockage.

1.2. Structure et comportement rhéologique des yaourts La transformation du lait au yaourt s’accompagne de la mise en place d’une structure

complexe et d’un changement important des propriétés rhéologiques en passant d’un liquide

Newtonien à un gel viscoélastique à destruction non réversible.

Les additifs et les étapes du Procédé de fabrication jouent un rôle majeur sur le

comportement rhéologique du yaourt qui sera apprécié par le consommateur (Paci Kora, 2004).

1.2.1. Structure des yaourts

1.2.1.a. Gélification acide Les structures principales impliquées lors de la gélification acide du lait sont les micelles

de caséine.

En effet, dans le lait, les différents types de caséines (αs1, αs2, β et k) s'associent pour

former des micelles, de structure sphérique supramoléculaire et de diamètre moyen de 150 nm.

Différents modèles théoriques de l'organisation micellaire sont proposés dans la littérature

(Cayot et Lorient, 1998).

Les auteurs s'accordent néanmoins sur une structure générale très hiérarchisée (figure 3).

La micelle est composée d'un cœur hydrophobe essentiellement constitué des caséines α, β et k,

dont la partie terminale est très hydrophile et chargée négativement.

Les caséines sont situées à la surface des micelles et assurent le maintien en suspension

dans la phase aqueuse en constituant une sorte de chevelure. La micelle possède un degré

d'hydratation élevée.

La structure micellaire est maintenue grâce à des liaisons faibles, des ponts salins

impliquant le calcium ou le phosphate de calcium et des groupements phosphoryles ou

carboxyles de certaines chaînes latérales des caséines, ainsi que des interactions hydrophobes

(Paci Kora, 2004).


10

Lors de la baisse du pH, due à la fermentation lactique, les micelles de caséines subissent

des changements substantiels.

Le déplacement de l'équilibre acido-basique entraîne une diminution progressive de la

charge ionique des micelles qui devient nulle. En parallèle, une solubilisation du phosphate de

calcium micellaire est observée, entraînant la dissolution de la structure micellaire.

Par la suite, la solubilité des caséines se trouve fortement diminuée, ainsi que leur capacité

d'hydratation. Le pH auquel commence la gélification du lait dépend de la température et des

prétraitements thermiques du lait (Tamime et Robinson, 1985).

En dessous d'un pH de 5,5, lorsque la majorité des ions calcium et phosphate ont quitté la

micelle, celle-ci reste encore visible au milieu d'une quantité croissante de très petites particules

jusqu'à ce qu'un pH de 5,2 soit atteint (Heertje et al., 1985 ; Visser et al., 1986).

Pour des pH plus bas, des particules de caséines se créent à nouveau par la formation des

liaisons hydrophobes, hydrogènes et électrostatiques. Bien qu'elles ressemblent aux micelles de

caséines initiales, elles sont plus grosses et très différentes à cause de l'absence de phosphate de

calcium. Les particules ainsi formées constituent un réseau donnant naissance à un gel retenant la

phase aqueuse.

A un pH inférieur au point isoélectrique des caséines (pH = 4,60), le réseau se stabilise et

n'évolue pratiquement plus. Pendant la phase de coagulation, les caséines entraînent avec elles

les protéines sériques.

La microstructure du yaourt est fonction de la concentration en matière sèche (Schkoda et

al., 1998 ; Van Marle, 1998), de la méthode d'enrichissement du lait (Tamime et al., 1984), du

traitement thermique (Kessler, 1998) mais aussi des souches bactériennes utilisées et de leur

capacité à synthétiser des polysaccharides exocellulaires (EPS), augmentant la viscosité du gel

(Hassan et al., 1995).

Ainsi, les travaux de Kessler (1998) montrent que les micelles de caséines d'un yaourt

fabriqué à partir de lait chauffé forment des chaînettes bien liées entre elles, tandis qu'elles

forment des agrégats dans un yaourt fabriqué à partir de lait non chauffé (figure 3).

Cette différence est essentiellement due au comportement des β lactoglobulines.

Enfin, les sucres et les autres constituants mineurs restent solubilisés dans la phase

aqueuse.


11

ηa= K. γ. n-1 + τ0 / γ

1.2.2. Comportement rhéologique 1.2.2.a. Propriétés rhéologiques des yaourts

La connaissance du comportement rhéologique du yaourt est nécessaire pour la conception

et le dimensionnement des installations de transformation, sous réserve de maîtriser les

contraintes (cisaillements) notamment lors des étapes de brassage et de pompage ainsi que lors

des échanges de chaleur.

UFigure 3 :U Effet du traitement thermique sur la structure de la microstructure du yaourt

(Kessler, 1998).

La connaissance des propriétés rhéologiques permet également d'appréhender la qualité en

termes de texture des produits finis.

Le yaourt est défini comme un fluide viscoélastique. Il possède donc à la fois les propriétés

visqueuses d'un liquide et les propriétés élastiques d'un solide.

Le comportement rhéologique du yaourt est non-newtonien, ce qui veut dire que la

viscosité du produit dépend de la vitesse de cisaillement ou de la contrainte exercée.

La loi de Newton s'écrit: μ= τ /γ Où μ = viscosité (Pa.s), τ = contrainte ou taux de

cisaillement (Pa), γ = vitesse de cisaillement (s -1). Dans le cas des yaourts, la viscosité diminue

quand la vitesse de cisaillement augmente. C'est un fluide rhé fluidifiant. On parle alors de

viscosité apparente à une vitesse de cisaillement donnée.

Les suspensions de polymères (polysaccharides, etc) présentent également le même

comportement.

Le modèle le plus classique pour décrire le comportement d'un fluide rhé fluidifiant est le

modèle d' Herschel Bulkley :

ηa: viscosité apparente à la vitesse de cisaillement ; γ : (Pa.s) ; K, indice de consistance (Pa.sn) ;

N : indice d'écoulement (sans unité) ; τR0R : seuil d'écoulement (Pa).


12

Pour le yaourt brassé, le modèle se simplifie par une relation puissance car le seuil

d'écoulement est nul (τ0

Par ailleurs, le comportement rhéologique des yaourts est dépendant des traitements

mécaniques subis ultérieurement.

= 0).

Si les contraintes de cisaillement sont trop fortes, le gel ne retrouve plus sa structure

initiale. C'est un fluide partiellement thixotrope.

1.2.2.b. Méthodes de caractérisation Le yaourt étant un produit de comportement rhéologique complexe, sa caractérisation

s'avère assez délicate.

Différents appareils de laboratoire sont utilisés pour caractériser leurs propriétés

rhéologiques, à savoir le viscosimètre Brookfield, les rhéomètres rotatifs, les pénétromètres, ou

encore, l'entonnoir de Posthumus.

Généralement, les viscosimètres permettent de mesurer uniquement les propriétés

visqueuses (viscosité apparente), tandis que les rhéomètres mesurent les propriétés

viscoélastiques.

En fonction de la géométrie du module de mesure, des contraintes ou des vitesses de

cisaillements appliqués, les analyses réalisées déstructurent plus ou moins le gel lactique.

Les pénétromètres ou les appareils de traction/compression

Sont largement utilisés pour caractériser la fermeté du yaourt ferme ou du yaourt brassé

avant son brassage (O'Neil et al., 1979 ; Barrantes et al., 1996). Hess et al. (1997), à l'aide d'un

pénétromètre TA-XT2, ont déterminé les propriétés filantes du yaourt.

Entonnoir de Posthumus

C’est une méthode simple et rapide pour mesurer la viscosité du yaourt brassé, qui est

souvent appliquée en industrie laitière (Hellinga et al., 1986).

Le viscosimètre Brookfield

C’est également un appareil relativement simple, utilisé en routine, pour déterminer la

texture des yaourts.

Comme l'entonnoir de Posthumus, il ne permet de mesurer qu'un seul paramètre, la

viscosité Brookfield. Une caractérisation plus complète des propriétés rhéologiques des yaourts

brassés est obtenue à l'aide des rhéomètres rotatifs. Deux types de mesures sont possibles :

1) à vitesse imposée : la vitesse de rotation ou la déformation est imposée.


13

2) à contrainte imposée : un couple de torsion est imposé.

Diverses géométries des modules existent : cône-plan, plan-plan et cylindres coaxiaux. Les

systèmes cône-plan permettent de créer une vitesse de cisaillement uniforme dans l'entrefer, et

sont donc les plus adaptés aux produits rhé fluidifiants, tels que le yaourt. Les mesures peuvent être effectuées en régime harmonique ou en continu. Elles consistent

à imposer une grandeur (vitesse ou contrainte) dont l'amplitude varie de façon sinusoïdale avec

une fréquence d'oscillation fixée.

Pour un fluide purement élastique, la contrainte est en phase avec la déformation, tandis

que pour un fluide purement visqueux, la contrainte est déphasée de 90° par rapport à la

déformation.

Dans le cas d'un fluide viscoélastique, tel que le yaourt, la contrainte est déphasée d'un

angle compris entre 0 et 90°. Les composantes élastiques (G' (Pa)) et visqueuses (G") sont

calculées à partir de la grandeur enregistrée et de son déphasage par rapport à la grandeur

imposée.

La viscosité complexe du produit, prenant en compte les deux composantes, permet de

caractériser le comportement rhéologique. De nombreux auteurs ont caractérisé les propriétés

rhéologiques des yaourts (Skriver et al., 1993 ; De Lorenzi et al.,1995; Rohm et Kovac.1995;

Hirano et al., 1998. Lucey et al., 1998; Ozer et al., 1998 ; Lucey et Singh, 1999; Fiszman et al.,

1999; Shaker et al., 2000; Norziah et al., 2001 ; Haque et al.,2001; O’Donnel et Buttler, 2002 ;

Afonso et al.,2003; Dello Staffolo et al., 2004; Paci Kora et al., 2004 ; Koksoy et Kilic, 2004 ;

Decourcelle et al., 2004).

2. Les bactéries lactiques

2.1. Historique Les bactéries lactiques sont des cellules procaryotes, hétérotrophes et chimio

organotrophes. Elles sont Gram +, généralement immobiles, sporulées et ont des exigences

nutritionnelles complexes pour les acides aminés, les peptides, les vitamines, les sels, les acides

gras et les glucides fermentescibles (Dellaglio et al., 1994).

Il est possible de les classer suivant la nature des produits du métabolisme bactérien

obtenus à partir des glucides. En effet les bactéries homolactiques strictes produisent uniquement

de l’acide lactique, alors que les bactéries hétéro lactiques peuvent produire de l’acide acétique,

de l’éthanol et du CO2 en plus de l’acide lactique.


14

Onze genres bactériens figurent dans la catégorie des bactéries lactiques :

Aerococcus,Alloicoccus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,

Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus et Vagococcus.

Les bactéries du genre Bifidobacterium ne sont pas considérées comme des bactéries

lactiques typiques, mais leur usage se répand en industrie laitière.

Les bactéries lactiques sont utilisées pour la fermentation d’un grand nombre de produits

d’origine animale ou végétale. Seuls les cinq genres Bifidobacterium, Lactobacillus,

Lactococcus, Leuconostoc et Streptococcus sont communément propagés dans les salles à

ferments des industries laitières ou employés dans la fermentation lactique des produits laitiers

en Amérique du Nord (Champagne, 1998).

Le rôle principal des bactéries lactiques est la production d’acide lactique qui influence la

texture, le goût et la qualité microbiologique du fromage. En effet, la production d’acide facilite

la coagulation des protéines par la présure ainsi que la synérèse. L’abaissement du pH limite

aussi la croissance des bactéries indésirables (Gilliland, 1985a).

Enfin, la production d’acide Lactique intervient également sur le goût des produits

fermentés, soit directement dans les Produits frais, soit indirectement en agissant sur les activités

enzymatique pendant l’affinage.

Les bactéries lactiques tolèrent de petites quantités d’oxygène, mais de trop grandes

teneurs peuvent leur être néfaste. Ceci peut probablement être relié au peroxyde d’hydrogène

(H2O2) qui est produit dans les cellules en présence d’air. Le H2O2 doit être éliminé sinon son

accumulation devient toxique. Le système le plus efficace d’élimination du H2O2

Les bactéries lactiques possèdent plutôt une peroxydase, moins efficace que la catalase.

Ainsi, comme les bactéries lactiques n’éliminent pas facilement le peroxyde, elles sont

considérées comme micro-aérophiles.

est une

enzyme nommée catalase dont les bactéries lactiques sont déficientes.

Les bactéries lactiques aromatisants comme Lactococcus lactis ssp. lactis biovar.

diacetylactis produisent des composés aromatisants qui contribuent au goût des produits frais et à

la production de CO2

Enfin, certaines bactéries lactiques produisent des exo polysaccharides qui influencent

l’aspect et la texture des produits fermentés, ainsi que du peroxyde d’hydrogène et des

bactériocines inhibant la croissance de bactéries indésirables.

responsable d’ouvertures dans le fromage.

2.2. Définition et caractéristiques principales des bactéries lactiques Les bactéries lactiques sont des cellules procaryotes, hétérotrophes et chimio


15

organotrophes.

Elles sont Gram+, généralement immobiles, sporulées et ont des exigences nutritionnelles

complexes pour les acides aminés, les peptides, les vitamines, les sels, les acides gras et les

glucides fermentescibles (Dellaglio et al., 1994).

Il est possible de les classer suivant la nature des produits du métabolisme bactérien

obtenus à partir des glucides. En effet les bactéries homolactiques strictes produisent uniquement

de l'acide lactique, alors que les bactéries hétéro lactiques peuvent produire de l'acide acétique,

de l'éthanol et du CO2

Onze genres bactériens figurent dans la catégorie des bactéries lactiques: Aerococcus,

Alloicoccus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,

Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus et Vagococcus. Les bactéries du genre

Bifidobacterium ne sont pas considérées comme des bactéries lactiques typiques, mais leur usage

se répand en industrie laitière (Doleyres, 2003).

en plus de l'acide lactique.

Les bactéries lactiques sont utilisées pour la fermentation d'un grand nombre de produits

d'origine animale ou végétale. Seuls les cinq genres Bifidobacterium, Lactobacillus,

Lactococcus, Leuconostoc et Streptococcus sont communément propagés dans les salles à

ferments des industries laitières ou employés dans la fermentation lactique des produits laitiers

(Champagne, 1998).

Le rôle principal des bactéries lactiques est la production d'acide lactique qui influence la

texture, le goût et la qualité microbiologique du fromage. En effet, la production d'acide facilite

la coagulation des protéines par la présure ainsi que la synérèse. L'abaissement du pH limite

aussi la croissance des bactéries indésirables (GiIIiland, 1985b). Enfin, la production d'acide

lactique intervient également sur le goût des produits fermentés, soit directement dans les

produits frais, soit indirectement en agissant sur les activités enzymatiques pendant l'affinage.

2.3. Classification des bactéries lactiques 2.3.1. Classification classique

Elle s'appuie sur les caractères phénotypiques distinctifs de l'espèce et du genre; la

première classification était donc basée sur la morphologie, la température de croissance, le

mode de fermentation du glucose et la forme de l'acide lactique produit (Orla Jensen, 1919).

Ainsi, on a pu distinguer deux groupes homo-fermentaires et hétéro-fermentaires. En 1957,

le Bergey's Manual, a regroupé les bactéries lactiques dans la famille des Lactobacteriaceae,

mais cette classification à été remise en question et totalement simplifiée (Desmazeand, 1992).


16

2.3.2. Classification moderne Elle s'appuie principalement sur les techniques d'électrophorèse des protéines et des études

des acides nucléiques, la définition du pourcentage CG de l'ADN, ce qui permet de définir une

souche bactérienne du point de vue de la taxonomie moléculaire (importante pour son caractère

d'exclusion).

La taxonomie actuelle investie le progrès de la génétique (hybridation ADN-ADN, ADN-

ARN...), de l'écologie (découverte de bactéries de milieu externe), elle inclue également les

techniques modernes de séquençage d'ADN, de micro galerie d'identification, des banques de

données informatisées (Bugnicourt, 1995).

2.4. Les différents genres des bactéries lactiques Le groupe de bactéries lactiques est hétérogène, il est représenté par plusieurs genres à

différentes importances dans les industries agroalimentaires. Leurs cellules sont soit, des coques

comme Streptococcus, Lactococcus, Enterocqccus, Leuconostoc et Pediococcus, soit des bacilles

comme Lactobacillus (Kandler et Weiss, 1986).

2.4.1. Les streptocoques lactiques Dans le genre Streptococcus, les streptocoques forment un groupe distinct des autres

espèces qui sont soit pathogènes pour l'homme (Sc. pyogens) ou pour les animaux (Sc.

agalactiae) soit "saprophyte de la cavité oral (Sc. mutans, Sc. salivarius) ou de l'intestin

(Sc.faecalis), etc ...

Ces espèces diffèrent entre elles par la présence d'un antigène de groupe dit de Lancefield

et par leur capacité de croître à des températures extrêmes; 45°C pour les thermophiles, 10°C

pour les mésophiles (Jones, 1978).

2.4.1.1. Les streptocoques lactiques mésophiles ou du groupe N: 2.4.1.1. Le genre Lactococcus

Les lactocoques se retrouvent principalement dans les laits et crèmes fermentés ainsi que

dans les fromages où ils sont en quantité dominante et dans lesquels ils jouent un rôle

irremplaçable en contribuant à la structure et au goût et en assurant la conservation et la salubrité

des produits.

Les lactocoques se présentent sous forme de coques et forment des chaînes de longueur

variable. Ce sont des bactéries homo-fermentaires ne produisant que de l'acide lactique L(+),

anaérobies facultatives à micro-aérophiles. Leur température de croissance optimale est proche

de 30C.

Ces bactéries sont thermosensibles et ne peuvent pas croître en présence de 6.5% de NaCI,


17

ou lorsque le pH est supérieur à 9.6 (Dellaglio et al., 1994). Le genre Lactococcus comporte

plusieurs espèces et sous espèces dont les trois types suivants sont utilisés en fabrication

fromagère: Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris et Lactococcus lactis

ssp. lactis biovar. diacetylactis. Il regroupe entre autres:

Lactococcus plantarum, GC=37-38 %.

Lactococcus garvieae, GC=38-39 %.

Lactococcus piscium, GC=37-38 %.

Lactococcus raffinolactis, GC=37-38 %.

Lactococcus lactis, GC=34-36 %.

Néanmoins, les trois types suivants sont utilisés en fabrication fromagère: Lactococcus

lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris et Lactococcus lactis subsp. lactis biovar.

diacetylactis.

Le type Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis possède un plasmide

encodant la dégradation du citrate en di acétyle, molécule aromatique responsable de l'arôme du

beurre. Les autres caractères biochimiques sont une croissance à 40°C, en présence de NaCI 4%,

et à pH 9.2 (De Roissart et Luquet, 1994) (Tableau 5).

2.4.1.2. Streptococcus thermophilus Appartenant à la famille des Streptococcaceae, ce sont des bactéries sphériques, de

diamètre qui varie entre 0,5 à 1ìm, leur mode d'association par paire. Cette espèce reste dans le

genre Streptococcus (figure 6).

Streptococcus thermophilus se distingue des autres streptocoques lactiques par sa

croissance thermophile avec un optimum autour de 42-43°C, l'absence de tout antigène de

groupe, sa thermorésistante à 60°C (parfois 65°C) pendant 30 minutes (Garvie, 1984), une

activité fermentaire le plus souvent réduite à quelques sucres et une forte sensibilité au NaCI

(Hardie, 1986) (tableau 5).

Elles sont isolées à partir du lait chauffé à 45-50°C ou du lait pasteurisé et des produits

laitiers (yaourt). Ils sont trouvés également dans le matériel de la laiterie et dans le vin. Elles ne

sont jamais isolées dans d'autres habitats (Desmazeaud, 1992).Elles ont en général des besoins

complexes en facteurs de croissances, vitamine B, acides aminée, peptides, bases puriques et

pyrimidiques (Bourgeois et Larpent, 1996). C'est une des raisons qui explique leur abondance

dans un milieu aussi riche que le lait. Ces organismes ont un contenu en GC de 35-46%.

2.4.1.3. Le genre Enterococcus Le genre Enterococcus a été revu par Schleifer et Klipper-Balz en 1984 en vue


18

d'accommoder les espèces Streptococcus faecalis et Streptococcus faecz'um.

Des études ont permis de transférer plus de cinq autres streptococci du groupe D au genre

Enterococcus (Collins et al., 1984).

Le genre Enterococcus comporte plus de 19 espèces. L'analyse des séquences de L’ARNr

16S a permis de démontrer que les enterococci sont plus proches des Carnobacterium et

Vagococcus que des Streptococcus et Lactococcus.

Certaines caractéristiques de ce genre décrites par Schleifer et Klipper-Balz en 1984 et

1987 sont valables pour toutes les espèces d'entérocoque et qui sont comme suit; cellules à forme

sphérique, Gram-positifs, disposées en simples, en paires ou en courtes chaînes (figure 7), ne

formant pas d'endospores, peuvent être mobiles, anaérobies facultatifs et homo-fermentaires

(Devriese et Pot, 1995).

Tableau 5: Caractéristiques distinctives des espèces de streptocoques lactiques (Novel, 1993).

Lactococcus lactis

subsp cremoris

Lactococcus lactis

subsp Lactis

Lactococcus

raffinolactis

Strptococcus

thermophilus

Morphologie 0.5-1µm 0.6-1µm ND 0.7-0.9µm

Croissance à 10C° + + + -

40C° + + - +

45C° + - - +

pH9.6 + - ND -

Culture en lait au

bleu de méthylène

0.1% + + ND -

0.3% + + ND -

ND -

Culture en NACL 2% + + + -

4% + - + -

6.5% - - - -

Citrtase - - ND -

Réductase + + + -

Acétoine - - ND -

Arginine + - - -

Groupe sérologique N N N -

ND : Non déterminé ; + : croissance ; - : absence de croissance.


19

2.4.1.5. Le genre Lactobacillus Le genre Lactobacillus a été décrit en 1901 pour regrouper des bactéries à Gram positif

isolées de produits laitiers et à métabolisme fermentaire. Ces bactéries possèdent la capacité de

produire de l'acide lactique comme métabolite final, et sont classées dans le groupe des bactéries

lactiques (Freyney et al., 2000).

Ce genre regroupe plusieurs espèces bactériennes qui présentent toutes les caractéristiques

suivantes : Gram positif, catalase négatif, sous forme de bâtonnets ou coccobacilles isolés ou en

chaînes très longues, immobiles ou mobiles, asporogènes, anaérobies facultatives, micro

aérophiles, ne réduisent pas les citrates et elles n'hydrolysent pas la gélatine.

Elles sont soit homo-fermentaires, soit hétéro-fermentaires. Elles ont des exigences

nutritionnelles complexes, leur température varie entre 25-53°C. Elles sont acidophiles (pH 5.5 -

6.2).

Ce genre a été divisé en trois sous genres par Orla Jensen en 1919; Thermobacterium,

Streptobacterium, Betabacterium, et cela en fonction de la température optimale de croissance et

de la fermentation des sucres. Cette subdivision a été revue par Kandler et Weiss en 1986 ayant

abandonné cette classification et la remplaçant par des sous genres sous forme de numéros.

Groupe I Lactobacillus homofermentaires stricts qui fermentent les hexoses par la voie d'Embden

Meyerhof en produisant du lactate mais ne fermentent ni les pentoses ni le gluconate. Ce groupe

contient les espèces les plus acidifiantes et les plus thermophiles (température 40-52 °C).

Groupe II Lactobacillus hétérotrophes facultatifs qui fermentent les hexoses par la voie d'Embden

Meyerhof en produisant du lactate. Les espèces appartenant à ce groupe peuvent fermenter les

pentoses en lactate et acétate par une phosphocétolase inductible (tableau 6).

Groupe III Lactobacillus hétérotrophes stricts qui fermentent les hexoses en produisant du lactate,

acétate, CO2


20

Tableau 6: Les caractéristiques physiologiques des Lactobacillus du groupe I

, fermentent aussi les pentoses en lactate et acétate par une phosphocétolase.

(D'après Bourgeois et Larpent, 1996).

Espèces Fermentation

du lactose

Croissance à

15°C 45°C

Lb. helveticus Homo-fermentaire - + Thermophile

Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus Homo-fermentaire - + Thermophile

Lb. delbrueckii subsp. lactis Homo-fermentaire - + Thermophile

Lb. acidophilus Homo-fermentaire - + Thermophile

Lb. casei* Homo-fermentaire + - Mésophile

Lb. plantarum Hétéro-fermentaire + - Mésophile

Lb. kefir Hétéro-fermentaire + - Mésophile

Lb. brevis Hétéro-fermentaire + - Mésophile

Lb. fermentum Hétéro-fermentaire - + Thermophile

Ces trois groupes sont chacun/formés de complexes qui se distinguent par leurs similarités

génétiques, biochimiques ou physiologiques (De Roissart et Luquet, 1994) (tableau 7).

Le premier groupe est très recherché sur le plan technologique pour diriger la fermentation,

baisser le pH des produits et pour sécuriser les produits fermentés contrairement aux deux autres

groupes qui sont à l'origine des altérations.

Les Lactobacilles de par leur variété sont présents 'dans des milieux très différents. Ils sont

présents naturellement chez l'homme et l'animal et constituent la flore autochtone dominante de

la partie supérieure du tractus intestinal. Les Lactobacillus sont également naturellement présents

dans les aliments tels que la viande et ses dérivés ainsi que les produits laitiers.

Dans l'environnement, on peut les rencontrer sur les végétaux, dans les eaux de surface et

dans les eaux usées. Les espèces mésophiles Lb. casei subp. casei; Lb. plantarum; Lb. curvalus,

Lb. brevis sont caractérisées par un large spectre de fermentation et sont présentes dans le lait et

dans des fromages (Leve-au et Bouix, 1996). Ils sont utilisés industriellement dans trois

domaines:

En tant que probiotiques dans l'alimentation animale ;

Dans les préparations pharmaceutiques destinées à 1'homme ;

En tant que ferments lactiques pour produits fermentés (dans les domaines laitiers et carnés).


21

2.5. Principales propriétés métaboliques des bactéries lactiques ayant des

conséquences dans les produits alimentaires 2.5.1. Utilisation des sucres

Le métabolisme des sucres conduit, notamment, à la production de l'acide lactique et à un

fort abaissement du pH, ce qui est recherché pour la fabrication des produits alimentaires. Mais,

ce processus est avant tout indispensable aux bactéries elles-mêmes, en leur fournissant de

l'énergie.

Les bactéries lactiques homo-fermentaires convertissent le glucose en excès presque

quantitativement en acide lactique (>90%). Le glucose (ou le lactose dans le cas du lait) est

transporté par un système actif et, selon les espèces, peut être phosphorylé lors du transport à

travers la membrane cellulaire.

Dans ce cas, par exemple, les lactocoques mettent en jeu un système phosphotransférase

(PTS) qui phosphoryle le sucre aux dépens du phospho-énolpyruvate (PEP). Ainsi, chez les

lactocoques et certains lactobacilles, le lactose du lait apparaît dans la cellule sous forme de

glucosyl-(l, 4)-galactoside-6-P (ou lactose-P) (Novel, 1993 ; Ganzle et aL, 2007).

A l'opposé, les streptocoques thermophiles, des lactobacilles et des leuconostocs

transportent le lactose sous forme libre, par l'intermédiaire d'un système perméase, puisque la

présence systématique d'une galactosidase a été démontrée.

Le glucose ou le glucose-phosphate en résultant est alors dégradé suivant la voie

glycolytique d’Embden-Meyerhof-Parnas (voie EMP). Les germes homo-fermentaires utilisant

la voie EMP dans la dernière étape de la glycolyse convertissent le pyruvate en lactate et

régénèrent ainsi du NAD+

C'est précisément cette étape-clé qui permet au cycle de fonctionner. Toutes les bactéries

lactiques possèdent donc une lactate déshydrogénase (Desmazeaud, 1992).

à partir du NADH formé auparavant.

Les germes hétéro-fermentaires utilisent les voies du tagatose-6-phosphate et de la

glycolyse, mais aussi celle des pentoses-phosphate. Ainsi, chez ces bactéries, la fermentation

lactique conduit à la formation de quantités équimoléculaires de lactate, d'éthanol et de gaz

carbonique. Une production de formiate et d'acétate peut avoir lieu, notamment en aérobiose

(Leveau et Bouix, 1993).

La conséquence pratique, pour le produit alimentaire siège d'une fermentation lactique, est

que les bactéries lactiques jouent un rôle fondamental dans l'inhibition des flores nuisibles à la

technologie ou dans celle des flores pathogènes.

Ainsi, une bonne acidification lactique entraîne une inhibition de la croissance


22

d’Escherichia coli, des Pseudomonas, des Salmonella, des Clostridia ou de Listeria

monocytogenes (Piard et Desmazeaud, 1991).

2.5.2. Utilisation des sources azotées Les bactéries lactiques exigent la fourniture exogène d'acides aminés pour leur croissance

(Desmazeaud, 1983), car elles sont, en général, incapables d'en effectuer la synthèse à partir

d'une source azotée minérale simple. Ainsi, selon les matières premières considérées, les

bactéries lactiques ne satisferont qu'une partie de leurs besoins par les acides aminés libres, les

utiliseront aussi les peptides courts.

Le problème que rencontrent alors les souches est celui du transport, à travers les

enveloppes bactériennes, de ces acides aminés et peptides. Ce transport est un système,

dépendant de l'énergie et de la température, pouvant être facilement saturé.

Dans différents genres de bactéries lactiques (Lactobacilles, leuconostoc, lactocoques),

c'est une protéase, liée aux enveloppes cellulaires grâce aux ions calcium, qui réalise la première

étape du processus de dégradation des protéines. C'est ce niveau que certaines souches peuvent

avoir des problèmes de croissance dans un milieu complexe.

Certaines souches de bactéries lactiques produisent, avec une fréquence élevée, des

variantes qui ne se développent qu'à une densité très inférieure à celle de la souche mère.

L'arrêt de la croissance de ces variantes est en effet lié à l'épuisement rapide des faibles

quantités d'acides aminés libres et de peptides courts présentes dans la matière première

(Pritchard et Coolbear, 1993; Calderon et al., 2003).

Ces variantes, désignés par résultent de la perte de leur protéase de paroi, ce qui les rend

incapables d'utiliser au mieux les protéines du milieu et de bénéficier de nutriments peptidiques

supplémentaires. Ensuite, les peptides résultant de cette protéolyse seront hydrolysés jusqu'au

stade acide aminé par différentes peptidases membranaires et cytoplasmiques, après leur

transport dans le cytoplasme.

De plus, grâce à ces différentes enzymes, les bactéries lactiques vont ainsi pouvoir

participer à la maturation de certains produits alimentaires, tels que les fromages (Desmazeaud,

1996).

2.5.3. Métabolisme du citrate et d'autres substrats carbonés Les bactéries lactiques, en dehors de leur pouvoir fondamental d'acidification et

d'assainissement, sont aussi recherchées pour leur capacité aromatisant.

Les milieux naturels conduisant aux aliments renferment souvent de l'acide citrique, mais

aussi, pour certains végétaux, de l'acide malique, tartrique ou du glycérol. L'acide citrique peut


23

être utilisé par de nombreuses espèces des genres Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus,

Pediococcus, Leucol1ostoc et Lactobacillus.

Dans les produits laitiers fermentés, le co-métabolisme sucre fermenté cible/acide citrique

est considéré comme le principal précurseur de l'arôme du beurre (le di acétyle) (Hugenholtz.,

1993). En œnologie, on attribue aussi la formation d'acétate, d'acétoïne et di acétyle au

catabolisme de l'acide citrique.

Par ailleurs, le pyruvate peut aussi être hydrolysé par le pyruvate formiate Iyase en acétate

et formiate chez les Bifidobacterium. Pediococcus halophilus produit uniquement de l'acide

formique et de l'acide acétique à partir du pyruvate.

L'acide citrique est aussi ·métabolisé par cette voie par Lactobacillus brevis, Lb. casei et

Lb. plantarum (Talarico et aL, 1988).

2.5.4. Métabolisme de l'oxygène Les bactéries lactiques sont souvent appelées bactéries anaérobies facultatives, mais ce

terme cache une grande variété de comportements de ces germes vis-à-vis de l'oxygène.

Certaines y sont très sensibles (Bifidobacterium sp.), d'autres beaucoup moins

(Lactobacillus plantarum). Généralement, les chaînes transportant les électrons ne fonctionnent

pas, mais des étapes d'oxydoréduction du NAD interviennent.

Dans les conditions d'aérobiose, chez la plupart des bactéries lactiques, les molécules de

NAD réagissent avec l'oxygène pour former du peroxyde d'hydrogène (H2O2) ou une molécule

d'eau grâce à des NADH: H2O2 ou NADH: H2

De plus, diverses enzymes conduisent généralement à l'accumulation de peroxyde

d'hydrogène qui est plus ou moins toxique pour la bactérie lactique productrice. Notamment dans

le cas du lait, le peroxyde d'hydrogène est le constituant d'un système inhibiteur naturel devant

comporter aussi une peroxydase et du thiocyanate comme accepteur d'électrons.

O oxydases.

La peroxydase du lait est la lactoperoxydase, enzyme assez thermorésistante, trouvée à

environ 70mg/litre. Le thiocyanate vient de la catalyse, dans le foie, de thiosulfate ou de

glucosides particuliers de l'alimentation des vaches laitières, notamment ceux des crucifères ou

de certaines légumineuses.

Si le lait contient de l'oxygène dissous, le peroxyde d'hydrogène produit par les bactéries

lactiques dans ces conditions va activer l'oxydation du thiocyanate par la lactoperoxydase, en un

intermédiaire oxydé: l'hypothiocyanate (Piard et Desmazeaud, 1991).

Ce composé est un inhibiteur de la croissance microbienne car il bloque le fonctionnement

de certaines enzymes-clés intervenant dans la glycolyse, comme l'hexokinase. L'action

bactériostatique de ce système entraîne des irrégularités d'acidification par les levains lactiques,


24

qui peuvent ainsi s'auto-inhiber car ils y sont sensibles. Cependant, on peut sélectionner des

levains qui y sont résistants (Desmazeaud, 1996).

3. Les principales utilisations des bactéries lactiques en alimentation

humaine

3.1. Produits laitiers Les bactéries lactiques sont à la base de la fabrication des fromages, des yaourts, des laits

fermentés et du kéfir (tableau 8).

Selon les types de fromages considérés (Mietton et al., 1994), la coagulation du lait est

obtenue par les actions conjuguées des enzymes coagulantes et des bactéries lactiques

(lactocoques essentiellement et/ou leuconostocs pour les fromages à pâte molle ou à pâte

pressée; streptocoques thermophiles et lactobacilles thermophiles pour les fromages à pâte

pressée cuite).

Le rôle principal de ces bactéries est l'abaissement du pH du lait ou des caillés. Le caillé

obtenu par l'action des enzymes protéolytiques de la présure restant à un pH proche de celui du

lait (6,6 environ) n'est pas déminéralisé. Il conduit à un coagulum élastique avec une bonne

cohésion, qui pourra être travaillé mécaniquement et thermiquement, ce qui permettra une

expulsion poussée du sérum (synérèse) (Wood et Holzapfel, 1995).

A l'opposé, un caillé lactique pur conduit à un coagulum friable car déminéralisé, sans

cohésion, ne permettant pas un travail mécanique sans perte de particules de caséine dans le

sérum. La synérèse est lente, car la rétention d'eau est forte. Ainsi, plus l'acidité est élevée au

moment de l'emprésurage, plus le caillé prend le caractère acide ou lactique, donnant une pâte

plus perméable.

En plus de ce rôle fondamental d'acidification responsable de la formation du gel puis du

caillé, les bactéries lactiques interviennent dans la production des composés d'arôme ou de leurs

précurseurs. Par exemple, dans les fromages frais, le diacétyle résulte du métabolisme du citrate

(De Roissart et Luquet, 1994).

Par ailleurs, dans les fromages affinés, l'activité des enzymes protéolytiques des bactéries

lactiques est fondamentale, car elle complète l'action de la présure restant active dans le caillé, et

celle de la plasmine (protéase naturelle du lait). La protéolyse due aux bactéries lactiques va

surtout conduire à des peptides courts et à des acides aminés libres. Ces derniers sont des

précurseurs pour de nombreux produits d'arôme (Mietton et al., 1994).

Il existe dans le monde une très grande variété de types de yaourts (De Roissart et Luquet,

1994) et de laits fermentés, obtenus à partir de lait de vache, mais aussi de lait de brebis, de


25

chèvre, de jument, de bufflesse, d'ânesse ou de chamelle.

Selon les cas, sont utilisés soit les streptocoques thermophiles et les lactobacilles

thermophiles, soit les lactocoques, les leuconostoc et les lactobacilles mésophiles, soit ces

bactéries lactiques associées à des levures (dans le cas du kéfir) ou des bifidobactéries (Drouault

et Corthier, 2001).

Le yaourt constitue un bon exemple de produits de grande consommation qui a connu un

essor industriel sans précédent au cours des trois dernières décennies, dans tous les pays du

monde.

Cette fermentation lactique est due essentiellement à la culture associée de deux espèces

Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Drouault et Corthier,

2001). La maîtrise de la croissance et des métabolismes de cette culture mixte que constitue le

yaourt n'est pas sans poser différents problèmes de régularité des qualités finales des produits,

car des interactions (stimulation ou inhibition) entre les espèces perturbent la stabilité des

équilibres bactériens (Bourgeois et Larpent, 1996; Marilley et Casey, 2004).

On attribue classiquement un rôle de premier plan à l'acétaldéhyde dans la perception de

l'arôme du yaourt, encore qu'un certain nombre d'autres produits aromatiques figurent parmi les

nombreux composés volatils que révèlent les techniques d'analyse fine.

Pour la fabrication de yaourts brassés, on constate que l'onctuosité du produit pourrait être

améliorée en utilisant des souches particulières, produisant un épaississement du lait supérieur à

celui obtenu par la simple prise en gel du lait sous l'effet de l'acidification.

Ces souches épaississantes sont intéressantes car elles augmentent la viscosité ou

l'onctuosité du produit en améliorant sa texture. Elles évitent ainsi, au cours des différentes

étapes de fabrication du yaourt brassé et de son stockage, qu'une séparation du sérum et des

caséines coagulées ne se produise.

Il est démontré que des polysaccharides (Cerning et al., 1990) interviennent dans la

création de la viscosité. Chez Lb. bulgaricus, les filaments de polysaccharides lient les cellules

les unes aux autres, structurant la micro-colonie.

Ils connectent aussi les cellules bactériennes qui les produisent à la matricé du yaourt

constituée des caséines précipitées par l'acidification (Desmazeaud, 1996).

3.2. Produits carnés Les saucisses fermentées semi-séchées se caractérisent par une fermentation souvent

rapide, à des températures relativement élevées (21 à 46°C): les pH finaux sont donc souvent

inférieurs à 5,3. Au contraire, les saucisses fermentées séchées ou les saucissons secs subissent


26

une fermentation lente de plusieurs jours, à des températures relativement basses de 11 à 23°C

(phase d'étuvage), avant d'être séchées pendant plusieurs semaines en chambre froide. Leur

teneur en eau est basse.

En prenant en exemple le saucisson sec français, on constate que les bactéries à Gram

négatif disparaissent au cours de l'étuvage, les bactéries à Gram positif Brochothrix et

Enterococcus se multiplient pendant la phase d'étuvage, mais leur croissance s'arrête dès le début

du séchage, alors que les Micrococcaceae se multiplient.

Les lactobacilles ont, quant à eux, un développement rapide. Au début de l'étuvage se

développent Carnobacterium divergens et Cb. piscicola. Ces espèces disparaissent en cours de

maturation pour laisser la place à Lactobacillus curvatus et Lb. sake (Montel et al., 1992; Novel,

1993).

3.3. Produits de la pêche La plupart de ces produits sont obtenus par des pratiques ancestrales empiriques,

notamment en Asie ou les bactéries lactiques n'interviennent pas seules mais associées à d'autres

fermentations, à des hydrolyses enzymatiques, voire à des réactions purement chimiques.

Dans les pays scandinaves, le hareng est mis en tonneaux avec 15 à 17% de sel, du sucre et

des épices. On obtient les gaffelbitar ou titbits, ou Pediococcus halophilus est le plus fréquent,

avec Lactobacillus buchneri, Lb. brevis et Leuconostoc mesenteroides (De Roissart et Luquet,

1994).

Les sauces obtenues à partir de poissons (notamment mloc-nam vietnamien, nam pla

thaïlandais, pathis philippin, teuk-treï cambodgien et budu malais) représentent des volumes

consommés considérables. Si la plupart des phénomènes sont dus à des activités protéolytiques

du poisson, on attribue aussi un rôle au développement de Pediococcus halophilus (tableau 8).

De même, dans les pâtes de poissons asiatiques, on met en avant l'activité fermentaire de

Lactobacillus plantarum, Pediococcus damnosus ou Pc. halophilus et Leuconos/oc

mesen/eroides (De Roissart et Luquet, 1994).

3.4. Produits végétaux On sait favoriser, empiriquement, la conservation des végétaux en réalisant, sous l'action

des bactéries lactiques, la production d'acide lactique inhibant les fermentations indésirables

(tableau 8). En général, cette opération est conjuguée avec un salage ou un saumurage en

conditions les plus anaérobies possibles.

En Europe, le chou est fermenté en choucroute, différents légumes et végétaux donnent les

pickles aux Etats-Unis, le kimchi en Corée, le miso au Japon ou le gari en Afrique.


27

La fermentation lactique des végétaux (choux, manioc, concombres, olives, betteraves

rouges, carottes, navets, haricots verts, céleris, oignons, tomates vertes) est une technique

largement utilisée dans les pays ne bénéficiant pas d'une structure industrielle, car elle peut être

effectuée avec des moyens locaux très simples (Cooke et al., 1987).

Dans nombre de cas, au départ, après lavage de la matière première, les bactéries lactiques

sont peu nombreuses.

Elles appartiennent essentiellement aux espèces Leuconostoc mesen/eroides, Lac/obacillus

brevis, Lactobacillus plan/arum et Pediococcus damnosus.

L'addition de sel aux végétaux fait apparaître une phase liquide par plasmolyse. Celle-ci va

réaliser une certaine anaérobiose et contenir les éléments solubles indispensables à une bonne

croissance des ferments lactiques.

Sous l'influence de l'acidité, Lb. plan/arum arrête sa croissance en premier, Lb. brevis

continuant la fermentation en utilisant les sucres résiduels comme les pentoses. Les olives vertes

peuvent aussi être conservées après une phase de fermentation en saumure. Avant cette étape, on

débarrasse les olives de l'européenne, glycoside très amer, par un traitement à la soude.

Ensuite, il faut réensemencer par Lactobacillus plantarum en présence de sel (De Roissart

et Luquet, 1994).

3.5. Produits de panification Pour la fabrication de pains spéciaux dits « aux levains», les bactéries lactiques sont

utilisées pour développer, avec une certaine acidification due à la production d'acide lactique et

d'acide acétique, un goût typique dans lequel interviendrait les acides propionique, iso butyrique,

iso valérique, butyrique et valérique. Les principales espèces rencontrées appartiennent au genre

Lactobacillus, les plus fréquentes étant Lb. plantarum, Lb. brevis et Lb. Fermentum (tableau 8).

Ces levains étant des mélanges complexes de souches d'espèces différentes, les conditions

de manipulation de la pâte (notamment la température, l'hydratation des farines, le type de farine

plus ou moins riche en amylases, donc en sucres fermentescibles) vont avoir des répercussions

très importantes sur le maintien des équilibres microbiens, donc sur la vitesse d'acidification ou

la production des aromes.

De plus, il faudra tenir compte des interactions possibles entre les levures et les bactéries

lactiques, entraînées notamment par les modifications du milieu et les compétitions pour les

substrats (De Roissart et Luquet, 1994).


28

3.6. Produits de vinification En œnologie, on recherche pour certains vins, en particulier les vins rouges, une

désacidification, par transformation de l'acide L-malique en acide L-Iactique et en gaz

carbonique.

Il s'agit de la fermentation malolactique. La bactérie qui a été la plus étudiée est

Leuconostoc oenos (nouveau nom proposé Oenococcus oeni) qui possède une enzyme

malolactique et qui est dépourvue d'activité lactate déshydrogénase (tableau 8).

Par ailleurs, on peut isoler du vin des lactobacilles homo-fermentaires et des coques hétéro-

fermentaires pouvant utiliser les citrates. Ils conduisent donc à des facteurs d'arôme.

Habituellement, on considérait que la fermentation malolactique se déclenchait

spontanément mais, pour en assurer une plus grande régularité, on a étudié les possibilités

d'induction de cette fermentation par addition de bactéries. (Desmazeaud, 1996).

4. Les rôles bénéfiques des bactéries lactiques sur la santé humaine C'est vraisemblablement Eli Metchnikoff qui, le premier vers 1908, a suggéré d'utiliser les

laits fermentés contenant une souche de lactobacilles, capables de vivre dans le tractus

intestinal, comme composants d'une alimentation utile à la santé humaine. Pour que les bactéries

lactiques puissent avoir un rôle bénéfique sur la santé humaine, il faut qu'elles gardent une

certaine activité, voire une viabilité lors du transit intestinal.

Ainsi, les bactéries elles-mêmes ou les enzymes doivent pouvoir passer sans dommage

irréversible la barrière acide de l'estomac, puis l'effet inhibiteur éventuel des sels biliaires.

Aussi, de nombreux auteurs (Wood, 1992) se sont intéressés, d'une part, à l'influence d'une

alimentation à base de produits riches en cultures de micro-organismes sur l'écologie du tube

digestif et, d'autre part, à l'influence sur la santé d'une alimentation avec des produits laitiers

contenant des cultures de micro-organismes.

Actuellement, ce sont le yaourt et ses ferments vivants (Streptococcus thermophilus et

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) (Anonyme, 1987) et les laits fermentés contenant

des bifidobactéries (Tamime et al., 1995) et Lactobacillus acidophilus ou Lb. casei qui ont fait

l'objet des recherches les plus approfondies.


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Tableau 7 : Exemple de bactéries lactiques utilisées dans la fermentation des aliments (Drouault

et Corthier, 2001).

Aliment Produits Ingrédients Bactéries Lactiques

Produits laitiers

Fromages Lait de vache, chèvre ou brebis S. salivarius subsp. thermophilus et

Lb. bulgaricus subsp. delbrueckii

Yaourt Lait de vache Lb. acidophilus

Kéfir Lait de vache, de jument ou de chèvre Lb. Kefir

Produits carnés et de la pêche

Saucisse sèche Porc, bœuf Pediocoques, Lb. plantarum,

Lb. Brevis

Saucisse semi-sèche Porc Pediocoques

Izushi poisson, riz, légumes Leu. mesenteroides, Lb. plantarum

Produits végétaux

Ogi (Nigeria) Maïs Lb. plantarum, L. lactis

Olives Olives vertes Pédiocoques, Lb. plantarum,

Lb. brevis, Leu. mesenteroides

Pickles Concombres Pédiocoques, Lb. plantarum

Choucroute Chou Leu. mesenteroides, Lb. plantarum

Sauce soja Soja Lb. bulgaricus subsp. delbrueckii

Raisin Leu. oenos

Riz Lb. sake, Lb. homohiochi, Leu.

mesenteroides

Farines de riz et de haricots Leu. mesenteroides Farine de blé Lb. sanfrancisco

4.1. Effets sur le transit et sur la flore intestinale Souvent, les laits acidifiés ou le yaourt sont utilisés pour lutter contre les diarrhées,

notamment chez les jeunes enfants, en particulier ceux qui seraient, de plus, mal nourris.

L'ingestion de ferments lactiques peut contrer les effets d'une prolifération de certaines

souches pathogènes d'Escherichia coli par divers mécanismes: production de substances (H2O2,

acides lactique et acétique) directement inhibitrices de E. coli; abaissement du pH par les acides

produits; détoxification par dégradation des entérotoxines; prévention de la synthèse d'amines


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toxiques; fixation sur le tube digestif empêchant la colonisation de pathogènes (Chekroun et al.,

2006), ou effet barrière par compétition métabolique s'il n'y a pas d'attachement. Lactobacillus

bulgaricus ne s'implante pas dans le tube digestif et y survit difficilement à cause de sa faible

tolérance aux sels biliaires, de son peu de résistance aux pH acides.

En revanche, Streptococcus thermophilus, et surtout Lb. acidophilus, survivent beaucoup

mieux dans l'intestin (Staloff-Cost, 1994).

4.2. Amélioration de l'intolérance au lactose L'apparition de symptômes digestifs après ingestion de lait peut être liée au lactose,

notamment par l'incapacité de le digérer par manque de lactase de la muqueuse intestinale. Chez

les adultes, les symptômes digestifs d'intolérance au lactose sont principalement des douleurs

abdominales, crampes, flatulences ...

Chez le jeune enfant, l'importance clinique de l'intolérance au lactose est plus grande, avec

diarrhées acides et selles contenant des sucres réducteurs.

Il a été clairement démontré que le yaourt permet l'absorption du lactose chez les sujets

déficients en lactase et qu'il améliore les symptômes digestifs d'intolérance au lactose. Il faut

noter que ces effets bénéfiques disparaissent lorsque le yaourt a subi un traitement thermique.

Ceci signifie que l'action favorable n'existe que si les bactéries sont vivantes et leur lactase

(galactosidase) active. Même un chauffage rapide du yaourt inhibe les bactéries lactiques et la

lactase.

Les Bifidobacterium ont un type fermentaire acétique-lactique-formique, intéressant du fait

que l'acide lactique formé est de forme L(+) (Brassart, 1997).

4.3. Effet sur la réponse immunitaire Différents travaux suggèrent que l'administration de la flore lactique vivante est susceptible

de modifier la réponse immunitaire chez les animaux conventionnels et chez l'homme (Marteau

et Brassard, 1994; Perdigon et al., 1995).

Cette action interviendrait en stimulant, à plusieurs niveaux, la défense antibactérienne de

l'orgaJ1isme. De plus, l'absorption des bactéries lactiques ou des laits fermentés pourrait aussi

stimuler les défenses situées au niveau du tube digestif (système lymphoïde du tractus digestif

GAL T= gut associated lymphoid tissue).

On pense que, chez la souris, les lactobacilles absorbés par voie avec interférer avec le

système immunitaire de plusieurs manières: ils expriment des antigènes; Ms tiennent des,

composants doués de propriétés adjuvantes, ils peuvent, adjuvants jusqu'à des cibles situées dans

le tube digestif (cellules immunitaires).


31

Chez l'homme, les lactobacilles ont aussi des effets immun modulateurs. Tout d'abord, il a

été remarqué que la consommation de yaourt stimule la capacité des lymphocytes circulants de

sécréter de l'interféron g. L'ingestion de Lactobacillus casei GG diminue la durée des diarrhées

aiguës à rota virus chez des nourrissons.

Par ailleurs, la consommation de lait fermenté par Lb. acidophilus stimule la capacité

phagocytaire des leucocytes circulants (anti-Escherichia coli). Il a aussi été constaté que Lb.

acidophilus associé à des bifidobactéries entraîne une augmentation de la réponse anticorps vis-

à-vis du vaccin oral atténué contre Salmonella typhi Ty21 a.

Enfin, les lactobacilles induisent chez l'homme une réponse immune locale forte dans le

tissu immunitaire associé au tube digestif (Desmazeaud, 1996; Majamaa et Isolauri, 1997).

4.4. Rôle anti tumeurs Différents travaux attestent des propriétés anti tumeurs spécifiques des lactobacilles ou des

aliments fermentés par ceux-ci, et des relations existant entre les problèmes de nutrition et les

cancers.

Plusieurs facteurs ont été suggérés qui peuvent contribuer à expliquer les propriétés anti

tumeurs des produits fermentés: inactivation ou inhibition de la formation des composés

carcinogènes dans le tractus gastro-intestinal; suppression de l'apparition de cancer grâce à la

stimulation ou à l'augmentation de la réponse immunitaire de l'hôte; diminution de l'activité des

enzymes des bactéries fécales (glucuronidase, azoréductase, nitroréductase) qui peuvent activer

les composés carcinogènes en convertissant les pro carcinogènes en carcinogènes (Sanders,

1993).

4.5. Influence sur l'absorption du calcium et des minéraux Le lait fermenté par les bactéries lactiques, de type yaourt, est une excellente alternative du

lait chez les individus présentant une intolérance au lactose.

En effet, la réduction de la teneur en lactose, qui fait suite à la fermentation lactique, ne

provoque pas de réduction de l'absorption des minéraux, ce qui, d'un point de vue nutritionnel,

constitue un élément particulièrement important.

Les minéraux contenus dans un lait fermenté par les bactéries lactiques sont pratiquement

aussi disponibles que ceux contenus dans le lait.

Les effets étudiés chez l'homme sont beaucoup plus contradictoires: on peut noter une

amélioration de l'absorption des minéraux lors d'un régime complété par le yaourt ou, au

contraire, aucune variation d'absorption du calcium (Desmazeaud, 1996).


32

4.6. Influence sur la cholestérolémie L'examen de la littérature montre des aspects contradictoires en ce qui concerne le rôle des

bactéries lactiques ou du yaourt sur le taux de cholestérol sanguin.

L'origine des variations dans les réponses peut être liée soit aux niveaux des composés

hypocholestérolémiants du yaourt lui-même, voire même du lait seul, soit aux souches de

bactéries lactiques utilisées dans les différents produits fermentés, qui sont très variables.

Chez l'homme, les études ne permettent pas de trancher définitivement sur l'effet

hypocholestérolémiant du yaourt, souvent en raison de la difficulté de faire la part des effets dus

à la ration alimentaire elle-même.

En conclusion, la littérature sur le rôle bénéfique des bactéries lactiques est abondante

(Sanders, 1993; Nakazawa et Hosono 1992), mais parfois; contradictoire, car certains rapports

manquent de précision scientifique, en manquant de certains témoins.

5. Les ferments lactiques : On définit les levains ou ferments lactiques comme étant des cultures pures ou des

mélanges de bactéries lactiques sélectionnées et utilisées pour la fabrication de produits

fermentés.

Parmi ces cultures, on distingue les ferments naturels, souvent des mélanges de

nombreuses souches de bactéries dont la composition exacte est indéterminée des ferments

mixtes, composés de cinq ou six souches soigneusement sélectionnées et cultivées séparément

jusqu'au stade de culture mère ou de ferment.

Au cours de la fermentation, les bactéries se multiplient et produisent des composés

conférant à l'aliment ses propriétés organoleptiques comme l'acidité, la saveur, l'arôme et la

texture (Deloyres, 2003).

5.1 Cultures mésophiles et thermophiles Selon la température optimale de croissance, on distingue les espèces mésophiles et

thermophiles. Les espèces mésophiles (Lactococcus et éventuellement Leuconostoc) sont mises

en œuvre en technologie beurrière et dans la fabrication des fromages à pâtes fraîches, à pâtes

molles et à pâtes pressées. Les espèces thermophiles (Streptococcus et Lactobacillus) sont plus

particulièrement utilisées dans la fabrication de laits fermentés de type yaourt, en fromagerie de

pâtes pressées cuites et dans certaines fabrications de pâtes molles stabilisées (De Roissart et

Luquet, 1994).

Dans .la fabrication du yoghurt, les deux espèces associées (Sc. thermophilus Lb.

delbrueckii ssp. bulgaricus) ont des températures optimales de croissance un peu différentes,


33

respectivement 37 et 42-45°C; il en résulte que le choix de la température d'incubation, le plus

souvent proche de 40°C, pourra influer sur la prédominance de l'une ou l'autre espèce et, par là,

sur les caractères du produit obtenu; le yoghourt est plus onctueux et plus doux si la température

est inférieure à 40°C, plus acide et plus ferme si elle dépasse 40°C.

On a recours aux cultures mésophiles pour la fabrication de fromages aussi variés que le

cheddar, gouda, édam, bleu et camembert, ainsi que pour les pâtes fraîches. Les bactéries

lactiques qui constituent ces ferments ont une température optimale de croissance proche de

30°C et comprennent toujours des souches de L. cremoris et de L. lactis; (Cogan, 1980).

A ces souches peuvent s'ajouter L. diacetylactis (ferment de type D) ou Leuconostoc

(ferment de type L), bactéries dites aromatisants de par leur synthèse de di acétyle.

Ainsi un ferment DL est un ferment composé d'un mélange de L. cremoris, L. lactis, L.

diacetylactis et de Leuconostoc.

En fromagerie de pâtes pressées cuites, il convient d'introduire dans le ferment des espèces

thermophiles (Sc. thermophilus et Lb. delbrueckii ssp. lactis et/ou Lb. helveticus), capables de

résister à la cuisson du grain de caillé (température voisine de 52-55°C maintenue pendant 1

heure) et ensuite que la masse de caillé est encore à température élevée, d'assurer l'acidification

sous presse en vue de préserver l'égouttage et de régler la déminéralisation et le pH de la pâte

(De Roissart et Luquet, 1994).

5.2. Les ferments probiotiques Bien que le premier lait fermenté par des bifidobactéries ait été mis sur le marché il y a un

peu plus de 50 ans, le domaine des aliments probiotiques ne s'est développé que dans les années

1970 (Tamime et al., 1995).

Un probiotique est un supplément alimentaire microbien vivant qui a des effets bénéfiques

sur son hôte en améliorant l'équilibre de la flore intestinale (Gibson et Roberfroid 1995).

En 1997, plus de 70 produits laitiers industriels tels que des laits fermentés, du fromage

blanc, du babeurre et des desserts surgelés contenaient des bactéries probiotiques, dont plus de la

moitié au Japon (Shah, 1997). Récemment, les marques LC 1 (Nestlé), Vifit (Campina Melkunie), Actimel (Danone) et

Yakult ont émergé comme des chefs de fil dans les yogourts et laits fermentés probiotiques

(Stanton et al., 2001). Par ailleurs, les laits fermentés 'AB milk' et 'Cultura' contenant L.

acidophilus et B. bifidum sont très populaires au Danemark (Tamime et al., 1995).

D'autres produits comme les yogourts acidophilus-bifidus (contenant L. acidophilus et B.

bifidum, ou B. longum et les ferments du yogourt), les laits 'Bifidus' (B. bifidum ou B. longum, '


34

Biogarde' (L. acidophilus B. bifidum et S. thermophilus), ' Biomild ' (L. acidophilus et

Bifidobacterium spp.) en Allemagne et les laits 'Diphilus' (L. acidophilus et B. bifidum) et '

Ophilus ' (L. acidophilus, B. bifidum, et S. thermophilus, ou L. acidophilus, B. bifidum, et L.

cremoris) en France ne sont que quelques exemples de l'utilisation variée des bifidobactéries

comme bactéries probiotiques dans des ferments mixtes en combinaison avec L. acidophilus ou

les ferments du yogourt (L. bulgaricus et S. thermophilus) (Tamime et al., 1995).

5.2.1. Critères de sélection des souches probiotiques Alors que les bactéries lactiques sont principalement sélectionnées pour leurs activités

acidifiantes et protéolytiques dans les ferments classiques, d'autres propriétés doivent être

étudiées dans le cas des probiotiques.

Pour exercer leur effet bénéfique sur la santé, les probiotiques doivent, comme pour les

ferments classiques, suivre en grand nombre au procédé de fabrication, à la lyophilisation

éventuelle et à l'entreposage qui s'en suit. 11 est en effet généralement admis qu'un nombre

minimal de 107

Cependant, la stabilité physique et génétique des cellules ainsi que toutes les propriétés

nécessaires pour exercer leurs bienfaits sur la santé doivent également être assurées.

cellules viables par gramme de produit est nécessaire pour exercer un effet

probiotique (lshibashi et Shimamura, 1993).

De plus, ces souches devraient être viables sans se multiplier pour ne pas provoquer d'effet

indésirable sur le goût ou l'arôme du produit ni augmenter l'acidité (Mattila-Sandholm et al.,

2002).

Enfin, ces bactéries probiotiques devraient être capables de survivre en grand nombre aux

conditions acides de l'estomac et aux sels biliaires de l'intestin lors de la consommation du

produit, puis d'adhérer aux cellules épithéliales de l'intestin afin de produire les effets bénéfiques

désirés le plus longtemps possible (Tamime et al, 1995; Huys et al., 2006).

6. Fonction et choix des bactéries lactiques en technologie laitière 6. 1. Introduction

De nos jours, l'industrie laitière s'intéresse à l'utilisation des souches qui possèdent de

bonnes caractéristiques technologiques telles qu’une bonne production d'acide lactique, d'arôme,

une protéolyse limitée, la production de composés aromatiques, d'exopolysaccharides (EPS),

comportement en association avec d'autres espèces microbiennes, résistances aux

bactériophages, etc. Un autre critère de sélection est basé sur la capacité des bactéries lactiques à

augmenter la valeur nutritionnelle du lait. Les exopolysaccharides produits par les bactéries

lactiques peuvent améliorer les caractéristiques rhéologiques des laits fermentés et éviter ainsi


35

l'addition d'autres produits épaississants (De Roissart et Luquet, 1994).

Ainsi, les critères devant être réunis dans les ferments lactiques sont comme suit:

Acidification, en vue de provoquer la coagulation du lait, favoriser l'égouttage du gel,

donner au produit une certaine fraîcheur, limiter les risques de développements microbiens

indésirables;

Formation de composants aromatiques, pour assurer aux produits laitiers les qualités

organoleptiques recherchées;

Protéolyse, en vue de conférer aux fromages affinés leur caractère rhéologique et

organoleptique;

Production de gaz carbonique pour assurer une certaine ouverture de pâte fromagère;

Production d'agents épaississants pour améliorer l'onctuosité d'un lait fermenté ou d'un

fromage frais maigre, ou pour améliorer la texture d'un fromage affiné maigre.

6.1.1. Choix sur la base de l'aptitude acidifiante La production d'acide lactique est une des principales fonctions des bactéries lactiques en

technologie laitière, en intervenant comme coagulant et antimicrobien.

La vitesse d'acidification et le niveau maximal de production de l'acide lactique diffèrent

selon les espèces et les souches.

Le critère de la vitesse d'acidification intervient dans le choix des espèces mésophiles ou

thermophiles; les premières sont utilisées dans les fabrications conduites à des températures

comprises entre enter 30 et 35°C (maturation des crèmes, fabrications de certains laits fermentés,

des fromages frais, des fromages à pâte molle, à pâte persillée et à pâtes pressées non cuites); les

secondes permettent d'assurer une acidification plus rapide, si la température se situe au

voisinage de 40°C; et l'on sait que les cultures mixtes de Sc. thermophilus et lactobacilles

thermophiles sont plus actives que les cultures pures.

Ce critère de vitesse d'acidification intervient aussi ans le choix des ferments des

lactocoques; selon les fabrications, ou par une même fabrication, selon le diagramme

technologique adopté et les caractéristiques du produit fini, on pourra mettre en œuvre des

souches "rapides" ou des souches "lentes".

La vitesse d'acidification est un critère important en technologie. On cherche le plus

souvent des souches rapidement acidifiantes. Dans le cas des lactocoques, il a été clairement

établi que cette propriété est étroitement liée à la présence de plasmides dans la cellule: Lac +

(souches capables d'utiliser le lactose). Prt+ (protéolytiques) (McKay, 1983 cité par Bourgeois et

Leveau, 1991).


36

Le critère d'acidification maximale est également pris en compte dans les fabrications où

sont utilisées des associations de souches (Sc. Thermophilus + Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus

ou Lb. delbrueckii ssp. lactis ou encore Lb. helveticus) qui assure une production d'acide

lactique sensiblement plus élevée que chacune des cultures pures (tableau 9).

6.1.2. Choix sur la base de l'activité protéolytique Les bactéries lactiques sont dotées de systèmes protéolytiques complexes par leur nature et

leur localisation.

Elles possèdent des endopeptidases liées aux parois et des exopeptidases de type

aminopeptidas, dipeptidase, tripeptidase (Desmazeaud, 1983).

L'activité protéolytique des bactéries lactiques joue un rôle important en technologie

fromagère dans l'affinage des pâtes, notamment celui des pâtes pressées, à flore essentiellement

lactique.

Cette activité, liée aux cellules, présente un double caractère: endopeptidasique, -qui se

manifeste sur les caséines en donnant naissance à des peptides de poids moléculaire plus ou

moins élevé, et exopeptidasiques (amino et dipeptidasiques) en libérant des acides aminés à

partir des peptides.

Des variations importantes dans le niveau des activités endo et exopeptidasiques ont été

mises en évidence et que les différences observées in-vitro se manifestent également au cours de

l'affinage (Desmazeaud, 1983).

Il importe donc, dans la sélection des ferments de fromagerie, de retenir le critère

d'aptitude à la protéolyse, au double plan de l'activité caséinolytique et de l'activité

aminopeptidasique qui sont indépendantes l'une de l'autre. La croissance des bactéries lactiques

dans le lait et, par suite, la vitesse d'acidification du milieu étant étroitement liées à leur activité

protéolytique, les ferments « rapides» sont formés des souches les plus actives sur les caséines.

Il a été également constaté que les aptitudes des bactéries lactiques à l'hydrolyse des

caséines et à la dégradation des peptides ont une influence sur le développement de l'amertume

des fromages. et des laites fermentés .

C'est dire l'intérêt de la prise en compte de l'activité protéolytique dans le choix des

espèces ou des souches utilisées en fromagerie (De Roissart et Luquet, 1994).

6.1.3. Choix sur la base de l'aptitude aromatisante Dans différentes technologies (beurre et certaines fabrications fromagères), des espèces

acidifiantes et aromatisants sont couramment utilisées en association; les souches acidifiantes

sont des lactocoques (Le. laetis ssp. laetis ou ssp. cremoris) tandis que les souches aromatisantes


37

appartiennent à l'espèce Le. laetis ssp. laetis var diacetylaetis ou au genre Leueonostoe (Ln.

mesenteroides ssp. cremoris notamment) et certaines souches de Laetobaeillus (Bourgeois et

Leveau, 1991).

Selon les souches aromatisants utilisées, le niveau de production de di acétyle et

d'acétaldéhyde peut varier sensiblement; aussi ce critère doit-il être pris en compte dans le choix

d'un ferment; Le. laetis ssp. laetis var diacetylaetis en culture pure produit des quantités assez

importantes d'acétaldéhyde; or, en excès, l'acétaldéhyde est responsable du développement d'une

saveur anormale (goût du yoghourt).

L'emploi dans le ferment de Ln. mesenteroides ssp. cremoris, capable d'utiliser

l'acétaldéhyde, corrige le défaut (De Roissart et Luquet, 1994).

6.1.4. Choix sur la base de l'aptitude texturant Certaines souches de bactéries lactiques ont la faculté de synthétiser des

exopolysaccharides (EPS), qui peuvent soit être excrétés dans le milieu environnant, soit resté

liés à la surface de la cellule sous forme de capsule.

Ces composés contribuent à modifier la texture des produits dans lesquels se développent

les souches compétentes.

Les EPS jouent donc un rôle important dans la formation de la texture des aliments et de

produits comme les yoghourts avec des fruits, les yoghourts aromatisés ou les yoghourts

buvables. Les bactéries lactiques mésophiles et thermophiles sont employés pour améliorer le

comportement rhéologique de ces produits.

Ces souches offrent la possibilité d'augmenter la viscosité du yoghourt et de diminuer la

susceptibilité à la synérèse ce qui est particulièrement intéressant pour les pays interdisant

J'addition des gélifiants ou épaississants aux laits fermentés.

En employant des bactéries lactiques épaississantes productrices d'EPS, il est possible de

produire des fromages allégés. Par exemple, l'utilisation d'une souche de S. thermophilus

productrice d'EPS et de Lb. bulgaricus a permis de produire un fromage mozzarella allégé avec

des propriétés améliorées de fusion et de rétention de 1 'humidité (Perry et al., 1998).

Une autre application possible des LAB productrices d'EPS est leur utilisation dans le

levain. Les EPS aident à ramollir le gluten et '" ainsi à améliorer la texture du levain et à

augmenter le volume spécifique du produit boulanger (De Vuyst et al., 2001).

On peut mettre en évidence l'aptitude texturant par culture des souches dans un milieu de

culture liquide renfermant 5% de saccharose. Après incubation, on met en évidence ma présence


38

de polysaccharides par précipitation à l'éthanol.

De façon plus simple, on peut relier la présence d'exo polysaccharides à l'aspect des

colonies sur milieu gélosé renfermant 5% de saccharose. Le test en condition technologique

consiste à étudier les caractéristiques rhéologiques da la culture, le plus classiquement en lait

écrémé, obtenu avec la ou les souches (en mélange) à étudier (Bourgeois et Leveau, 1991).

Plusieurs études ont proposé que les EPS aient une activité anti-cancérigène. Kitazawa et

al. (1991) ont postulé que l'EPS produit par L. laetis ssp. eremoris KVS 20 est responsable d'un

effet anti-tumoral de cette souche.

Tableau 8: Principaux critères de choix des bactéries lactiques en fonction de leur application

(De Roissart et Luquet, 1994)

Produits laitiers fermentés Critères de sélections e principales espèces bactériennes

Tous produits Température optimale et minimale de croissance.

Vitesse d'acidification (temps de latence et pente de la courbe).

Acidification finale (pH).

Aptitude sensorielle (absence de mauvais goûts, production

d’arômes).

Aptitude texturants (fermeté de coagulum, substances filantes).

Aptitude gazogène (CO2

Compatibilité en association de souches.

).

Résistance aux bactériophages.

Espèces Critères

Laits fermentés Le. Laetis, Ln. Mesenteroides,

Sc. thermophilus, Lb.

delbrueekii ssp. bulgarieus et/ou

laetis, Lb. helvetieus var.jugurti,

b. plantarum, Lb. aeidophilus,

Lb. Rhamnosus, Lb. hligardii,

Lb. Kefir, Bifidobaeterium.

Production de diacétyle,

acétaldéhyde, éthanol, acétate.

Propriétés probiotiques.

Production de polysaccharides.

Aérotolérance (Bifidobaeterium).

Beurre, crème acide Lc. Lactis, Ln. Mesenteroides.

Croissance à 8-l8°C.

Production de di acétyle.

Fromage frais Lc. Lactis, Ln. Mesenteroides,

Lb. Rhamnosus.

Croissance à 8-l8°C.

Production de di acétyle.

Production de polysaccharides.


39

Fromages

affinés

Pâtes molles Lc. lactis

Croissance à 27-34°C.

Activité protéolytique.

Pâtes persillées Sc. thermophilus Croissance rapide à 35-40°C.

Pâtes pressées non cuites Ln. mesenteroides Production de CO2

Pâtes molles solubilisées Sc. thermophilus Températures limites de

croissance.

Pâtes persillées Lb. delbrueekii ssp. lactis Activité protéolytique.

Pâtes pressées cuites Lb. helvetieus Résistance aux lysozymes.

6.1.5. Aptitude antagoniste Les bactéries lactiques sont connues et utilisées pour les influences antagonistes qu'elles

développent (Daeschel, 1989). Elles sont dues aux métabolites excrétés: acide lactique et autres

acides organiques, di acétyle, peroxyde d'hydrogène et surtout antibiotiques et de substances

inhibitrices spécifiques dites bactériocines.

Les bactéries lactiques sont de très bons producteurs de ces substances antibactériennes de

nature peptidique ou protéique (Piard et Desmazeaud, 1992 ; Klaenhammer, 1993).

La nisine est la plus connue des substances inhibitrices. Considérée comme un

antibiotique, ce polypeptide (PM 3500) est produit par Lc. lactis ssp. lactis et lui confère des

propriétés inhibitrices marquées (Mattick et Hirsh, 1944). De la même façon, Lc. lactis ssp.

cremoris produit un dip1ococcine plutôt considéré comme une bactériocine, substance de nature

protéique, à activité antibactérienne, avec un spectre d'action assez étroit, inactivé par les

protéases, et thermostable (Davey et Richardson, 1981).

Elle présente la caractéristique d'inhiber, en plus des bactéries lactiques, différentes

bactéries à Gram positif, notamment des Clostridium et des Baeillus.

D'autres bactériocines, comme les pédiocines (produites par Pedioeoeeus) ou la sakacine A

(produite par Lb. sake), sont aussi capables d'inhiber Lis. Monocytogenes (Vanderberg, 1993).

Donc, les bactériocines des bactéries lactiques peuvent présenter un spectre d'activité qui

n'est pas toujours confiné aux bactéries de la même espèce ou du même genre.

La première conséquence technologique de la production de bactériocine par une souche

de bactérie lactique est sa dominance éventuelle dans un mélange de souches dans un levain, au

fur et à mesure des repiquages et de l'utilisation de ces mélanges, ce déséquilibre modifiant les

caractéristiques organoleptiques des produits alimentaires finals. La deuxième conséquence

technologique est la possibilité de concevoir et d'employer à bon escient de nouveaux types de

levains pouvant inhiber des flores indésirables, comme Clostridium tyrobutyricum dans les


40

fromages, ou des flores pathogènes, comme CI. botulinum dans les conserves ou les semi-

conserves ou Listeria monocytogenes dans de nombreux produits alimentaires (fromages au lait

cru, produits carnés fermentés, chairs de poissons, produits végétaux fermentés) (Ogunbanwo et

aL, 2003).

Comme la littérature scientifique et technique décrit un nombre considérable de travaux

concernant les bactériocines (Vanderberg, 1993; Sarantinoupoulos et aL, 2002; Chen et Hoover,

2003; Simsek et aL, 2006), il existe si peu d'applications développées dans l'alimentation

humaine.

En fait, pour que ces substances inhibitrices produites par les bactéries lactiques- ou les

souches sélectionnées qui les produisent- puissent avoir un réel développement en tant qu'additif

industriel, elles devraient présenter les caractères suivants:

Avoir un spectre d'activité étendu, en étant actives à la fois sur les bactéries à Gram positif

et à Gram négatif, car doivent être éliminés des produits alimentaires non seulement Lis.

monocytogenes, Staphylococcus aureus ou certaines bactéries sporulées, mais aussi les souches

de Escherichia coli pathogènes et les salmonelles;

Avoir une action bactéricide et pas seulement bactériostatique. Il s'agit, dans les produits

alimentaires, d'éliminer définitivement la contamination initiale, afin qu'aucun développement

de bactéries nuisibles ne puisse reprendre dès que les conditions de pH favorables à ces germes

réapparaissent. C'est le cas, par exemple, dans les fromages à pâte molle, où une forte remontée

du pH est observée au cours de l'affinage.

Présenter une bonne activité et une bonne stabilité dans les conditions technologiques

régnant à tous les stades de la fabrication des produits, notamment dans toute la gamme des pH

et des températures caractéristiques de ceux-ci (Oumer et aL, 2001).

Ne pas perturber les cinétiques d'acidification des levains acidifiants (ou avoir les mêmes

potentialités pour les remplacer) et ne pas inhiber les autres levains éventuellement utilisés,

notamment ceux conduisant à la production des arômes caractéristiques des produits finis.

Présenter une bonne innocuité pour les consommateurs, notamment ne pas

entraîner de réactions d'allergie, même par les produits de leur dégradation, et ne pas perturber

les équilibres de la flore intestinale (Desmazeaud, 1996). De nombreux autres composés de ce

type ont été mis en évidence dans les cultures de Sc. thermophilus, Lb. bulgaricus,

(acidophiline), Lc. lactis ssp. diacetylactis (lactostrepcine) (Julliard et aL., 1987).

Matériel et méthodes


43

1. Lieu de l’étude L’étude à été effectuée au niveau du laboratoire de microbiologie alimentaire et industrielle

du département de biologie, faculté des sciences, université d’Oran, ainsi qu’au niveau de

laboratoire d’hygiène de wilaya de Relizane.

2. Microorganismes recherchés Les souches bactériennes utilisées dans cette étude ont été isolés à partir du yaourt lait

fermenté fabriqué et commercialisé en Algérie.

Ce produit a été obtenu par l’action des ferments lactiques Lactobacillus delbrueki subsp

bulgaricus et Streptococcus thermophilus.

3. Echantillonnage 04 échantillons provenant de différentes entreprises spécialisées dans la fabrication du

yaourt ont été procurés du marché local

1ère

2

Echantillon (E1) : lactat entreprise d’Ain-Temouchent. ème

3

Echantillon (E2): Danio, Enterprise d’Oran. ème

4

Echantillon(E3) : king, Enterprise de Relizane. ème

Les échantillons ont été acheminés au laboratoire et gardés à 4°C.

Echantillon(E4) : Roufaida, entreprise de Mostaganem.

4. Etude hygiénique Il s’agit de contrôler la qualité microbiologique des différents échantillons par la recherche

d’un certain nombre de germes selon les normes dictées dans le journal officiel Algérien.

4.1. Recherche des coliformes totaux Pour le dénombrement des coliformes totaux, les étapes à suivre sont les suivantes:

Revification dans un bouillon nutritif incubé à 37°C.

Culture sur milieu VRBG.

Mise l’étuve à 37C° pendant 24h.


44

4.2. Recherche des coliformes fécaux Ce dénombrement s’effectue selon les mêmes modalités que les coliformes totaux mais

l’incubation se fait à 44°C.

4.3. Recherche des Staphylococcus aureus La démarche est la suivante :

Culture sur Chapman bouillon.

Mise à l’étuve à 37°C pendant 48 heures.

4.4. Recherche de Salmonella La technique préconisée est la suivante :

Pré-enrichissement dans l’eau peptonnée tamponnée et incubation à 37°C pendant 24 heures.

Enrichissement dans du bouillon au sélénite à 37 °C pendant 24 heures

Culture sur gélose SS et mise à l’étuve à 37°C pendant 24 à 48 heures.

Les colonies suspectes sont incolores ou jaunâtres avec ou sans centre noir.

4.5. Recherche des levures et des moisissures

Dilution dans du NaCl à 0,8%.

Culture sur milieu OGA pendant 5 jours à 20-25°C.

5. Dénombrement et isolement des bactéries lactiques Une série de dilution décimale de chaque échantillon de yaourt 10-1 à 10-10

Le dénombrement et l’isolement des bactéries lactiques ont été réalisé à partir des

dilutions 10

ont été fait dans

l’eau physiologique stérile.

-3 à 10-5

Les colonies sont prélevées arbitrairement à partir des boites contenants entre 30 et 300

colonies selon la méthode décrite par IFM(1996).

sur milieux MRS De Man et al,.(1960) et incubation à 37°C dans une jarre

pour Lactobacillus et milieux M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) 43°C pour les Streptocoques

(fig4)


45

10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 10−6 10−7

10−5

Échantillon

Ensemencement 0.1ml

À partir des tubes -3,-4-5

Serie1 Versé M17 Versé M RS acétique

serie2

Laisser solidifier

Série 1 série2

Incubation 48h a42c° incubation 72h a37c°

Lecteurs des résultats

fig4 : Techniques d’isolement des bactéries lactiques à partir des échantillons de yaourt


46

6. Identification des bactéries lactiques

6.1. Identifications des souches sur la base de leurs profils fermentaire et

enzymatique Les isolats sont identifiés par les tests morphologiques et physiologiques selon les travaux

de Chougrani et al., (2008).

6.1.1. Coloration de Gram Cette méthode est basée sur la différence de structure de la paroi chez les deux groupes

Gram + et Gram -.

Quelques gouttes de solution aqueuse de violet de gentiane sont répandues sur le frottis de

bactéries isolées puis l’excès de violet est jeté après une minute d’action.

Le frottis est ensuite recouvert de lugol, cette liqueur prend une teinte mordorée ; on la

jette au bout de quelques secondes.

La lame est ensuite décolorée à l’alcool après lavage à l’eau de robinet, le frottis est

recoloré à la fuchsine pendant une minute, puis lavé à l’eau, séché à l’air et examiné à

l’immersion.

Les Gram + apparaissent en bleu noir et les Gram – en rouge.

6.1.2. Test de catalase La catalase permet la dégradation de l’eau oxygénée qui résulte de l’oxydation, par

l’oxygène de l’air, des protons issus des voies d’oxydation directe.

Elle est mise en évidence par contact de la culture avec une solution fraîche d’eau

oxygénée à 10 volumes.

Une goutte d’eau oxygénée est placée sur une lame et un peu de culture en milieu solide y

est répartie.

Un dégagement gazeux abondant sous forme de mousse ou de bulles traduit la

décomposition de l’eau oxygénée sous l’action de la catalase (Guiraud, 1998).

6.1.3. Température de croissance Des tubes à essai munis de capsules à vis et contenant 10 ml de lait écrémé stérilisé ont été

inoculés avec une culture pure de l’organisme à tester.


47

Une série de tubes a été incubée à 10°C pendant 7 à 10 jours et une autre série à 42°C

pendant 48 à 72 heures. Au bout de ce délai, la croissance a été appréciée par la coagulation du

lait.

6.1.4. Test de métabolisme fermentaire Ce test est défini par Gibson et Abd El Malek ( ), il se traduit par un dégagement de

CO2

Des tubes ont été remplis par 10 ml de bouillon de MRS pour Lactobacillus et 10ml de

bouillon de M17 pour Streptococcus avec une cloche de Durham introduite au fond des tubes et

l’ensemble a été stérilisé par autoclavage.

caractéristique des espèces hétéro fermentaires (Coppola et al.,1997).

Par la suite, les tubes ont été inoculés par les souches appropriés et incubés à 37°C pour les

Lactobacilles et à 42°C pour les Streptocoques pendant 3 jours. La présence ou l’absence du gaz

dans la cloche indique le type fermentaire.

6.1.5. Test d’ADH (l’activité d’arginine hydrolase) Pour la détermination de ce caractère, les germe ont testé est ensemencé dans des tubes

contenant de milieu de Moëller de base sans arginine et un tube avec arginine(Témoin). Les

tubes sont incubés à 37°C pendant 48 heures. La culture dans le milieu de base se manifeste par

un virage au jaune du milieu dû au métabolisme du glucose, si la souche dégrade l’arginine elle

produit une amine qui va augmenter le pH du milieu et on observe un virage de la couleur au

violet (Samelis et al., 1994).

6.1.6. Test de croissance en milieu hostile

6.1.6.1. Bouillon hyper salés Généralement, les bactéries lactiques ne poussent pas dans un milieu hyper-salé, pour le

confirmer, les souches sont ensemencées dans des bouillons hyper-salé à2%, 4 % et 6,5% de

NaCl et incubées à 37°C pendant 48 heures.

La croissance est appréciée par l’apparition de trouble visible à l’œil nu.

6.1.6.2. Test au lait de Sherman Ce test repose sur l’aptitude des bactéries lactiques à pousser en présence de bleu de

méthylène. Il permet de différencier les Streptocoques des Lactocoques. Les Streptocoques


48

fécaux se développent en présence de 0.1% quant à Streptococcus thermophilus elle est très

sensible au colorant utilisé (Guiraud, 1998).

6.1.7. Test de Fermentation des sucres Les bactéries lactiques dégradent différemment les sources de carbone. Le test est réalisé

en tube contenant 10 ml de bouillon MRS additionnés de pourpre de bromocrésol (0.16g/l) dans

lequel on rajoute du sucre à la concentration finale de 0.5%. Les sucres étudiés sont: Glucose,

Galactose, Fructose, Lactose, Arabinose, Ribose, Saccharose, Xylose. Après incubation à 37°C

pendant 48 heures, le virage de milieu du violet au jaune indique la fermentation du sucre.

7. Identification des bactéries lactiques en utilisant le système API Test d’identification plus rigoureux ont été effectués en utilisant le système API

(API50CHL pour Lactobacillus et API 50CHL pour Streptococcus ).

Il permet d’identifier les bactéries lactiques jusqu’à au stade d’espèce en se basant sur le

profil fermentaire et enzymatique, les galeries API50 CHL et API 20 STRP (biomérieux, Marcy

l’Etoile, France) (Cheriguene, 2007).

7.1. La méthode API 50CHL L’API 50 CHL comporte 50 tests biochimiques permettant l’étude du métabolisme des

hydrates de carbone des microorganismes, il est utilisé pour l’identification des Lactobacillus et

Streptococcus thermophilus. La galerie contenant 50 microtubes pour la mise évidence de la

fermentation des substrats correspondant à la famille des glucides et leurs dérivés (hétérosides,

polyalcools, acides uroniques).

Le premier tube sans principe actif sert de témoin négatif. La fermentation se traduit par un

changement de couleur dans le tube.

7.1.1. Préparation de l’inoculum La souche est cultivée sur le milieu à une température adaptée à sa croissance, après 24h

d’incubation, une culture très dense apparaissant sur le milieu est récupérée et centrifugée à 4000

trs/mn pendant 10 mn.

Le culot est homogénéisé dans 2 ml d’eau distillée, puis centrifugé une seconde fois à

4000 trs/mn pendant 10 mn.


49

Le culot est suspendu à nouveau dans 2 ml d’eau distillée, un nombre (n) de gouttes de

cette suspension est introduit dans 5 ml d’eau distillée stérile de façon à obtenir une opacité de 2

sur l’échelle de Mc Ferland. (Réf.50300.bio Mérieux).

On prélève alors à l’aide d’une pipette pasteur 2n gouttes de la suspension est initiale (2

ml) que l’on introduit dans 10 ml de milieu API 50 CHL (Ref50410, bio Mérieux).

7.1.2. Préparation des galeries Environ 10 ml d’eau distillée sont réparties dans les alvéoles du fond de la boite de la

galerie formé de 5 bandes comprenant chacune 10tubes numérotés (0-9,10-19,30-329,40-49) la

galerie est inoculée en répartissant la suspension bactérienne supplémentée par 2n gouttes à

l’aide d’une pipette pasteur.

Les cupules sont remplies avec de l’huile de paraffine, enfin, la galerie est incubée à la

température optimum de croissance du microorganisme étudié.

7.1.3. Lecture et interprétation La lecture des galeries est réalisée après 24 et 48h et comparées aux profils standards en

utilisant le logiciel Pib Win.

8. Etude biotechnologique

8.1. Activité protéolytique

Elle a été déterminée selon la méthode de Huggins et Sandine, (1984), ce test est basé sur

l'hydrolyse de la caséine sur milieu YMA. Les souches présumées des bactéries lactiques isolées

des échantillons de yaourt possèdent une activité protéolytique et donnent un zone claire autour

de la colonie. L’appréciation de cette activité protéolytique se traduit par l’apparition d’une zone

de protéolyse autour de la souche après une incubation durant 24h à 37C°.

8.2. Antibiogramme L’antibiogramme permet de déterminer la sensibilité ou la résistance des souches à étudier

à certains antibiotiques en utilisant la méthode de diffusion en milieu solide.


50

8.3. Acidité titrable

8.3.1. La cinétique d’acidification L'acidification a été suivie, selon la méthode recommandée par Chamba et Prost (1989),

Zourari et al, (1991), Thomas et Chamba (2000).

Les souches ont été repiquées deux fois dans du lait écrémé reconstitué stérile (10% p/v)

additionné de (0,5% p/v) d'extrait de levure (Difco) pendant 24 h, suivie d'une sous-culture finale

en lait écrémé reconstitué stérile durant 18h.

Les bouteilles contenant chacune 200 ml de lait écrémé reconstitué ont été inoculés avec

1% (v / v) d'inoculum préparé auparavant avec des cultures pures.

Après une légère agitation, les laits inoculés ont été distribués de façon aseptique dans des

tubes stériles à raison de 10 ml chacun et incubés à 43°C dans un intervalle de 0 à 24h.

La valeur du pH a été mesurée lors de la fermentation à l'aide d'un pH-mètre numérique avec

une électrode de verre combinée et une sonde de température (InoLab pH Level1 WTW,

Allemagne).

Le pH-mètre est calibré en utilisant des solutions tampons standard (Merck) à pH 4,0 et

7,0. L’acidité a été titrée par une solution de NaOH à N / 9

Le volume de NaOH est multiplié par 10 afin de calculer l'acidité titrable en degré Dornic

(°D), sachant que1°D = 0,1g d'acide lactique dans 1 litre de lait (Guiraud, 1998).

La cinétique de croissance des souches étudiées a été réalisée par un dénombrement sur

boîtes de pétri contenant les milieux gélosés (M17) et (MRS) inoculés à partir des milieux

liquides contenant les souches à étudier à des intervalles de temps de 0h, 8h, 12h, 18h et 24h.les

boites de pétri sont incubées à 43°C pendant 48h.

8.31. Activité antagoniste

l’activité antagoniste est effectuée selon la méthode décrite par Geis et al., (1983).Toutes les

souches de bactéries lactiques isolées ont été testées les unes contre les autres. A cet effet, les

souches sont cultivées pendant 16h dans leurs propres milieux spécifiques et incubées à leur

température optimum de croissance.


51

Les cultures (productrices de bactériocines) sont ensemencées en touches (5µl) à la surface du

milieu gélosé correspond 16h dans leurs propres milieux à leur température convenable pour

permettre aux souches productrices de se développer. Ensuite, on couvre la culture avec10 ml

de gélose molle (MRS ou M17) contenant 2% (0.5ml) d’une culture jeune de la souche

indicatrice à une concentration de 7UFC /ml. Les boites de pétri sont incubées en anaérobiose

pendant 24h.

L’inhibition s’observe par l’apparition d’un halo clair autour de la souche ensemencée en touche

(souche productrice).

Résultats

51

Résultats

52

1. Qualité hygiénique Les résultats d’analyse microbiologique ont montré l’absence de bactéries pathogènes dans

les quatre échantillons testés, il s’agit particulièrement des coliformes fécaux et totaux, de

Staphylococcus aureus et salmonella.

Concernant la flore d’altération les levures et les moisissures, un nombre réduit a été

enregistré soit des valeurs respectives de l’ordre de 3 101 UFC/g et 2 102

MOISISSURES

UFC/g (figure 5 et 6).

Figure 5 : Résultat positif des levures et moisissures des échantillons E1, E2, E3 sur milieu

OGA.

LEVURES

Figure 6: Résultat positif pour les levures et moisissures de l’échantillon E4 sur milieu OGA.

Résultats

53

Le tableau 9 résume les résultats du dénombrement microbien des quatre échantillons

Tableau 9 : Analyse microbiologique des quatre échantillons du yaourt.

Echantillon

Bactéries (UFC/g)

E1 E2 E3 E4

Coliformes totaux 0 cfu/g 0 cfu/g 0 cfu/g 0 cfu/g

Coliformes fécaux 0 cfu/g 0 cfu/g 0 cfu/g 0 cfu/g

Staphylococcus aureus 0 cfu/g 0 cfu/g 0 cfu/g 0 cfu/g

Salmonella Absence/25g Absence/25g Absence/25g Absence/25g

Levures et moisissures 3 101 cfu/g 6 101 cfu/g 1 102 cfu/g 2 102 cfu/g

1. Dénombrement des bactéries lactiques Les histogrammes 1 et 2 (figure 7 et 8) résument les résultats du dénombrement de la flore

lactique La flore lactique a été dénombrée sur le milieu MRS (37C°) pour Lactobacillus et M17

(42°C) pour Streptococcus.

Figure 7: L’évaluation du nombre des Streptococcus thermophilus (UFC/ML) dans les quatre échantillons.

7,1

7,15

7,2

7,25

7,3

7,35

7,4

7,45

7,5

E1 E2 E3 E4

7,5

7,3

7,45

7,25

log

ufc/

ml

echentillons

strptococcus thermophilus

Résultats

54

Figure 8: L’évaluation du nombre de Lactobacillus bulgaricus(UFC/ML) dans les quatre échantillons.

Le dénombrement de la flore lactique sur M17 à donné des valeurs entre 7.3 et 7.5 UFC

/ml pour Streptococcus et des valeurs entre 6 et 6.8 UFC/ml pour Lactobacillus sur MRS

3. Caractéristique et identification des bactéries lactiques

3.1. Pré-identification des souches Un total de 8 isolats de bactéries lactiques à été obtenu à partir de quatre échantillons du

yaourt collectés de régions de l’ouest Algérien.

Ces isolats ont été identifiés au stade du genre en se basant sur leur caractère

morphologique et biochimique.

3.1.1. Aspect macroscopique et morphologique

a. Les Streptocoques Les observations macroscopiques (figure 8, 10, 12,14) et microscopique (figure,9, 11,

13,15) montrent l’aspect punctiforme des colonies et le mode d’association des Streptococcus. Les colonies ont une couleur blanchâtre, bien ronde à bords lisses et une forme sphérique, de petite

taille avec un diamètre entre 0.5 à 1.5mm, disposé en paires, en tétrade et en chaine.

5,6

5,8

6

6,2

6,4

6,6

6,8

E1 E2 E3 E4

6,8

6,3

6,5

6,1

log

ufc/

ml

echantillons

lactobacilus bulgaricus

Résultats

55

b. Les Lactobacilles L’observation macroscopique (figure 16, 18, 20, 22) et microscopique (figure 17, 19, 21,

23) a montré l’aspect punctiforme des colonies, le mode d’association des bacilles disposés en

paires ou en longe chaine (tableau 10).

Tableau 10 : Résultats des observations culturales et morphologiques des Streptocoques et

des Lactobacilles.

Les souches Aspect macroscopique

Aspect microscopique

Streptocoques Colonies Bien ronds

abords laisses Couleurs

blanchâtre

Sphérique petite taille

Disposé en paires, en chaine

Lactobacilles Colonies a bord régulier

lisse blanchâtre

Bâtonnet courts

Disposes en paire et en chaine

4. Identification des souches au stade du genre

a. Les Streptocoques L’identification des souches de Streptocoques (strp1, strp2, strp3 et strp4), au stade du

genre bactérien a été effectuée par les tests du type fermentaire, d’ADH, de croissance en

milieux hostiles et au lait de Sherman 0.1% et 0.3% (figure 24 et 25) ainsi que la fermentation

des sucres (figure 26). Ces tests ont montré que les Streptocoques sont de type homo fermentaire

elles poussent à 45C° pendant 30 minutes mais elles sont sensibles pour le milieu alcalin et aux

milieux hostiles et ne produisent pas l’arginine d’ammonium à partir de l’arginine. Le profil

fermentaire pour le métabolisme des sucres a montré des différences entre les souches. Le

tableau 11 résume les résultats des différents tests pour l’identification des Streptocoques

b. Les Lactobacilles L’identification au stade du genre indique que les Lactobacilles sont aussi de type homo-

fermentaire (figure 27), dépourvus d’enzyme de catalase, sensibles pour le lait de Sherman 0.1%

et 03 % et ne dégradent pas l’arginine (Figure28).

Résultats

56

Le profil fermentaire a montré des différences entre les souches pour le métabolisme des

sucres lactose, le saccharose, le glucose, le fructose, le lactose et le galactose figure(29). Le

tableau 12 résume les caractères physiologiques et biochimiques des Lactobacilles.

Figure 8 : Aspect macroscopique de strp1 sur Figure 9 : Aspect microscopique de

M17après 24h d’incubation en aerobioseà42°C. Strp1 après coloration de Gram(X100).

Figure 10: Aspect macroscopique de strp2 Figure 11: Aspect microscopique de strp2 Sur M17après 24h d’incubation en après coloration de Gram (X100). Anaérobiose à42°C

Résultats

57

Figure12: Aspect macroscopique de strp3sur Figure13: Aspect microscopique de

M17 après 24h d’incubation en aérobiose à strp3après coloration de Gram(X100).

42°C.

Figure 14 : Aspect macroscopique de strp4 sur Figure 15 : Aspect microscopique de strp4

M17 après incubation en aérobiose après coloration de Gram(X100).

à 42°C

Résultats

58

Figure16: Aspect macroscopique de lb1sur MRS Figure 17: Aspect microscopique de

Acétique après incubation en anaérobiose à 37°C. Lb1après coloration de Gram(X100).

Figure18 : Aspect macroscopique de lb2sur MRS Figure19: Aspect microscopique de lb2

acétique après incubation en anaérobiose à 37°C. après coloration de Gram (X100).

Résultats

59

Figure 20: Aspect macroscopique de lb3sur Figure 21: Aspect microscopique de lb3 après MRS acétique après incubation en anaérobiose coloration de Gram(X100). à 37°C.

Figure 22: Aspect macroscopique de lb4sur Figure 23 : Aspect microscopique de lb4 après MRS acétique après incubation en anaérobiose coloration de Gram(X100). à 37°C.

Résultats

60

Figure 24 : Test au lait de Sherman à 0.1% Figure 25 : Test au lait de Sherman à 0.3%

(Témoin, strp 1, strp 2, strp 3, strp 4 ) ( Témoin, strp 1, strp 2, strp 3, strp4 )

Figure 26 : Le profil fermentaire de strp 1. Figure 27 : Type fermentaire des souches

Lactose, saccharose, fructose, glucose, raffinose strp1, strp2, strp3, strp4.

Maltose.

Résultats

61

Figure 28 : Test d’hydrolyse d’arginine des Figure 29 : Le profil fermentaire de lb 1.

Souches lactobacilles.( lb1, lb2, lb3, lb4 Glucose, Fructose, Lactose, Galactose,

témoin +, témoin-) Xylose, Mannitol, Raffinose, Ribose

Résultats

62

Tableau 11 : Caractères physiologiques et biochimiques des souches de Streptocoque.

Caractère Strp1 Strp2 Strp3 Strp4

Gram + + + +

Catalase - - - -

Croissance à 45°C + + + +

Croissance à 30°C - - - -

Thermorésistante 30 min à 65°C + + + +

Type fermentaire homo homo homo homo

Croissance pH 9.6 - - - -

Croissance Nacl 6.5% - - - -

Croissance Nacl 4% - - - -

Croissance Nacl 2.5% - - - -

Lait de Sherman 0.1% - - - -

Lait de Sherman 0.3% - - - -

ADH - - - -

Glucose + + + +

Lactose + + + +

Saccharose + + + +

Fructose + + + +

Mannitol - - - -

Xylose - - - -

Raffinose - - - -

Maltose - - - -

Résultats

63

Tableau 12 : Caractères physiologiques et biochimiques des souches de Lactobacille. Souche Caractère

Lb1 Lb2 Lb3 Lb4

Morphologie Bacille Bacille Bacille Bacille

Gram + + + +

Catalase - - - -

Croissance à 45°C + + + +

Thermo résistance 30 min à 65°C + + + +

Type fermentaire homo homo homo homo

Hydrolyse d’arginine - - - -

Fermentation de glucose + + + +

Fermentation de fructose + + + +

Fermentation de lactose + + + +

Fermentation de galactose + + + +

Fermentation de xylose - - - -

Fermentation de mannitol - - - -

Fermentation de raffinose - - - -

Fermentation de ribose - - - -

5. Identification des souches au stade d’espèce a. Les lactobacilles

Les isolats ont ensuite été identifies au stade de l’espèce selon les méthodes décrites par

schillinger et lucke (1987) et samelis et al (1994).

Les souches lb1,lb2,lb3,lb4 et strp1,strp2,strp3, strp4 ont été identifiées en utilisant le

système API50CHL (fig30 ,31,33 ), le logiciel pib win donne à 90% l’appartenance de ces

isolats aux genres et espèces Lactobacilus delbruckii bulgaricus etStreptococcos thermophilus ce

qui confirme les résultats des tests physiologiques et biochimiques (Tableaux13 et14).

Résultats

64

Figure 30: Profil fermentaire d’une souche Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus avant l’incubation.

couleur jaune reflète la fermentation du sucre

Figure 31: Profil fermentaire d’une d’une souche de Lactobacilus delbruckii subsp

bulgaricus .après 48h d’incubation

Résultats

65

Figure 32: Profil de fermentaire d’une souche Streptococcus thermophilus avant l’incubation.

couleur jaune reflète la fermentation du sucre

Figure 33: Profil fermentaire d’une d’une souche Streptococcus thermophilus après 48h

d’incubation

Résultats

66

Tableau 13 : Profil fermentaire des Lactobacilles confirmé par le système API50CHL après 48h

Les souches Lb1 Lb2 Lb3 Lb4

N Les tests

0 CONTROL - - - - 1 Glycérol - - - - 2 Erythriol - - - - 3 D_arabinose - - - - 4 L _arabinose + + + + 5 Ribose + + + + 6 D xylose - - - - 7 L xylose - - - - 8 Adonitol - - - - 9 β Methyl-D-Xyloside - - - -

10 GaLactose + + + + 11 GLucose + + + + 12 Fructose + + + + 13 Manose + + + +

14 Sorbose - - - - 15 Ramnose - - - - 16 Dulicutol - - - -

17 inositol - - - - 18 Manitol - - - - 19 Sorbitol - - - - 20 α-Methyl-D-mannoside

- - - -

21 α-Methyl-D-glucoside

- - - -

22 N-Acetyl-Glucosamine - - - - 23 amygdaline - - - -

Résultats

67

+/- : puls de 50%des cas sont positifs lb : Lactobacillus delbrueckii spp bulgaricus

.

24 Arbutin - - 25 Esculin - - - - 26 Salicin - - - - 27 Cellibiose - - - - 28 Maltose - - - - 29 Lactose + + + + 30 Melibiose - - - - 31 Sucrose - - - 32 Trehalose - - - - 33 Inuline - - - - 34 Melezitose - - - - 35 Rafinose - + + + 36 Starch - - - - 37 Glycogen - - - - 38 Xylitol - - - - 39 Gentiobiose - - - - 40 D turanose - - - - 41 D_lyxose - - - - 42 D tagatose - - - - 43 D Fucose - - - - 44 L Fucose - - - - 45 D arabitoL - - - - 46 L arabitol - - - - 47 Gluconate +/- -/+ -/+ -/+ 48 2-Keto-Gluconate

- - - -

49 5-Keto-Gluconate

- - - -

Résultats

68

Tableau 14 : Profil fermentaire des Streptocoques confirmé par le système API50CHL

Les souches Strp1 Strp2 Strp3 Strp4

N Les tests

0 CONTROL - - - - 1 Glycérol - - - - 2 Erythriol - - - - 3 D_arabinose - - - - 4 L _arabinose - - - - 5 Ribose - - - - 6 D xylose - - - - 7 L xylose - - - - 8 Adonitol - - - - 9 β Methyl-D-Xyloside - - - -

10 GaLactose + + + + 11 GLucose + + + + 12 Fructose + + + + 13 Manose + + + + 14 Sorbose - - - - 15 Ramnose - - - - 16 Dulicutol - - - - 17 inositol - - - - 18 Manitol - - - - 19 Sorbitol - - - - 20 α-Methyl-D-mannoside

- - - -

21 α-Methyl-D-glucoside

- - - -

22 N-Acetyl-Glucosamine - - - - 23 amygdaline - - - - 24 Arbutin - - - - 25 Esculin - - - - 26 Salicin - - - - 27 Cellibiose - - - - 28 Maltose - - - -

Résultats

69

+/- : plus de 50% positifs strp : Streptococcus thermophilus

29 Lactose + + + + 30 Melibiose - - - - 31 Sucrose + + + + 32 Trehalose - - - - 33 Inuline - - - - 34 Melezitose - - - - 35 Rafinose - - - - 36 Starch - - - - 37 Glycogen - - - - 38 Xylitol - - - - 39 Gentiobiose + + + + 40 D turanose - - - - 41 D_lyxose - - - - 42 D tagatose - - - - 43 D Fucose - - - - 44 L Fucose - - - - 45 D arabitoL - - - - 46 L arabitol - - - - 47 Gluconate - - - - 48 2-Keto-Gluconate

- - - -

49 5-Keto-Gluconate

- - - -

Résultats

70

6. Etude biotechologique

6.1. Antibiogramme a. Streptococcus thermophilus

Les resultats de l’antibiogramme montrent une sensibilité des espèces à la pristinamycine,

la colistine, la nitroxolamine et une résistance à l’amikacine, l’oxacilline et la penicilline (tableau

4, figure 28).

b. Lactobacilus delbrueckii ssp bulgaricus

Les lactobacilles étant sensible à la pristinamycine, la colistine, la nitroxolamine et la

pénicilline mais résistants à l’amikasine, l’oxacilline (Tableau 15).

Tableau 15:Evaluation de la sensibélité des souches vis-à-vis des antibiotiques testés.

Les souches Antibiotiques

Les Streptocoques Les lactobacilles Strp1 Strp2 Strp3 Strp4 Lb1 Lb2 Lb3 Lb4

Pristinamycine S S S S S s S S

Colistine S S S S S s S S

Nitroxolamine S S S S S s S S

Spiramycine S S S S R R R R

Oxacilline R R R R R R R R

Penicilline s s s s s s s s

Amikacine S S S S R R R R

6.2. L’activité protéolytique

Les isolats des bactéries lactiques ont été capables de se développer sur milieu YMK qui s’est traduite par une zone claire autour des colonies comme le montre le tableau 16 et les figures 29,30, les valeurs du diamètre des zones d’hydrolyse varient entre 20 et 28 mm.

Résultats

71

Tableau16 : Activité protéolytique des isolâts de yaourt sur milieu YMK.

Code Souches Diamètre (mm) Evaluation de la protéolyse

Strp1 Streptococcus thermophilus 22 ++




Lb1 Lb. bulgaricus 28 +++




Figure 34 : Activité protéolytique chez Figure 35 : Activité protéolytique chez

. Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus Streptococcus thermophilus

Résultats

72

6.3. Acidité titrable

6.3.1. Evolution du pH et de l’acidité Dornic

L’évolution de pH pendant 24h de fermentation par les souches strp1, strp2, strp3, strp4

est représenté par la figure 31.

Les souches strp1, strp2, strp3, strp4 ont atteint respectivement après 4h de fermentation

les valeurs de l’ordre de 6.5, 6.5, 5.5 et 5 et après 24h de fermentation les valeurs respectives de

4.6, 4.5, 4.5 et 4.5. Chez les lactobacilles, après 4h de fermentation les valeurs notées étant

respectivement de l’ordre de 6.5, 5.9, 5.8 et au terme de 24 h de fermentation des valeurs

respectives de 5.7, 4.6, 4 et 3.5 (figures 33 et 34).

Figure 36 : Evolution de pH en fonction de temps chez srtp1, stp2, strp3, strp4 à 42°C.

Figure 37 : Evolution de pH en fonction de temps chez lb1, lb2, lb3, lb4

à 42°C.

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

0 2 4 6 8 24

pH

Temps (H)

strp1 strp2

strp3 strp4

33,5

44,5

55,5

66,5

7

0 2 4 6 8 24

LB1 LB2 LB3 LB4

Résultats

73

Figure 38: Cinétique d’évolution de l’acidité dornic en fonction de temps

Chez strp1, strp2 stpr3, strp4 à 42°C.

Figure 39 : Cinétique d’évolution de l’acidité dornic en fonction du temps

chez lb1, lb2, lb3, lb4 à 42°C.

Figure 40: Croissance des Streptococcus thremophilus dans

Le lait écrémé à 37°C.

0

10

20

30

40

50

60

0 2 4 6 8 24

D°

Temps …

strp1 strp2strp3 strp4

0

10

20

30

40

50

60

70

0 2 4 6 8 24

D°

TEMPS

LB1 LB2

LB3 LB4

6

6,5

7

7,5

8

8,5

0 8 12 18 24

logu

fc/m

l

Temps (H)

strp1

strp2

strp3

strp4

Résultats

74

Figure 41: Croissance des Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus

dans le lait écrémé à 37C°.

6.4. Activité antagoniste L’activité antimicrobienne a été déterminée selon le test décrit par Geis et al., (1983) et

Cheriguene et al., (2004).

L’apparition d’une zone d’inhibition sous forme d’un halo peut être considérée comme

signe de production de bactériocines( figures 37 et 38), d’acides, de peroxyde d’hydrogène ou

l’action des phages qui peuvent également être responsables des ces zones d’inhibition.

Les résultats ont révélé que les Lactobacilles sont capables de produire des substances

antimicrobiennes qui inhibent la croissance de la souche pathogène (E coli), par contre les

souches de Streptocoques présentant une activité antimicrobienne moins importante

comparativement aux Lactobacilles.

6

6,5

7

7,5

8

8,5

0 8 12 18 24

logu

fc/m

l

Temps(H)

lb1 lb2

lb3 lb4

Résultats

75

Figure 42 : Mise en évidence de production de Figure 43: Mise en évidence de production

substances antimicrobiennes par les lactobacilles. de substances antimicrobiennes par les

Streptocoques.

Souches inhibitrices : L1: Lactobacillus delbruckii bulgaricus L2: Lactobacillus delbruckii bulgaricus L3: Lactobacillus delbruckii bulgaricus L4: Lactobacillus delbruckii bulgaricus S1: Streptococus thermophilus S2: Streptococus thermophilus S3: Streptococus thermophilus S4: Streptococus thermophilus Souche indicatrice: Escherichia coli

Tableau 17: Test d’interaction bactérienne entre les bactéries du yaourt et la souche pathogène.

Souche pathogène Bactérie lactique

Diamètre d’halo inhibition(mm)

Inhibition

Escherichia coli Streptococcus thermophilus 18 +

Lactobacillus bulgaricus

15 +

+: présence de zone d’inhibition.

Discussion

Discussion

77

Le contrôle de la qualité hygiénique des échantillons de yaourts Un yaourt de bonne qualité hygiénique doit satisfaire à certains nombres de critères

particulièrement en matière de normes microbiologiques. Celles-ci ne peuvent être obtenues que

par l’application des bonnes pratiques d’hygiène (BPH) et les bonnes pratiques de fabrication

(BPF) à tous les stades de la vie du produit.

Dans le cas de nos échantillons de yaourts expérimentaux, les analyses microbiologiques ont

révélé l’absence totale de toutes les bactéries pathogènes telles que Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, ainsi que les germes indice de contamination fécale comme les coliformes

totaux et fécaux. Notons également la présence de quelques colonies de levures n’ayant aucune

incidence sur la qualité de produit notamment sur le plan sanitaire.

Les propriétés hygiéniques sont satisfaisantes pour les 4 échantillons et répondent de ce fait

aux normes de qualité microbiologique fixées par la réglementation, ces performances seraient

dues vraisemblablement à la validation correcte du barème de pasteurisation et au respect des

règles d’hygiène au cours de la fabrication. Des résultats similaires ont été rapportés par Tamine,

(1999), Abdelmalek et al., (2008).

En effet selon Dagher et al., (1984), la pasteurisation est un traitement thermique à température

modérée (de 60-90C°), dans le cas d’un produit comme le yaourt, cette technique permet de

conserver le produit fermenté en dehors de la chaine de froid tout en détruisant les germes

susceptibles de contaminer le produit durant la fabrication, c’est le cas des coliformes totaux et

fécaux, Staphylococcus aureus et Salmonella. Par ailleurs, selon Meziane et al., (1997), l’acidité

développée dans le milieu exerce un effet inhibiteur sur la majorité des germes pathogènes

Dénombrement des bactéries probiotiques Les produit laitières fermentés renferment plusieurs souches probiotiques, les plus

dominantes sont les Lactobacilles, les Streptocoques et les Bifidobacterium (Fasoli et al.,(2003)

,Gueimonde et al.,(2004), Abdelmalek et al.,(2008).

Les milieux proposés pour le dénombrement de la flore lactique du yaourt, les Streptocoques

et les Lactobacilles étant des milieux spécifiques, le cas du MRS acétique de pH 5.4 utilisé pour

les lactobacilles, le rôle de l’acide acétique est l’inhibition des Streptocoques (Chougrani, 2006).

Discussion

78

Les résultats du dénombrement de la flore bactérienne lactique révèlent la prédominance des

Streptocoques par rapport aux Lactobacilles avec des valeurs de l’ordre de log 7.5 UFC/ml pour

les Streptocoques et de log 6.25 UFC/ml pour les Lactobacilles.

Selon les travaux de Abdelmalek et al., (2008), le nombre des bactéries lactiques du yaourt

les Streptocoques et les lactobacilles est respectivement de l’ordre de log 7 UFC/ml et log 6.5

UFC/ml. Des résultats similaires sur le dénombrement de cette flore ont été rapportés par Ibrahim

et carrm, (2006). D’autre part Cheriguene et al., (2007) ont mentionné que le nombre de bactéries

lactiques estimé dans le lait de chèvre oscille entre 105 et 106UFC/ml après dénombrement sur

milieu MRS et M17. Par contre khedid et al., (2007) ont rapporté des valeurs de l’ordre de102 à

106UFC/ml pour les Lactobacilles et de 102à107UFC/ml pour les Streptocoques dans le lait de

chamelle.

Cette variabilité des résultats de dénombrement peut être expliquée par la nature du produit

et la sélectivité des milieux utilisés MRS, M17 pour ce type de bactéries (Reuter, 1985).

Sur le plan nutritionnel, un probiotique doit survive toute au long du passage gastrique pou

avoir des bienfaits sur la santé humain selon Kailasapaty et Rybeka, (1997).

Cependant, certaines études ont montré que la consommation de probiotiques non viables

peut aussi engendrer des effets bénéfiques sur le système immunitaire (Ouwehand et Salminea

1998), Salminen et al., 1998).

Dans de tels cas il suffit alors d’obtenir de grandes concentrations des souches probiotiques

dans le yaourt durant la période initiale de la production sans nécessairement conserver une bonne

viabilité durant le stockage, mais d’autres études ont motionné que la condition pour avoir des

bienfaits thérapeutiques est la présence d’un nombre important des bactéries probiotiques dans les

produits consommés (Gueimonde 2004).

Selon Abdelmalek et al., (2008) un probiotique efficace doit être au minimum de l’ordre de

107UFC/ml de Streptococcus et 106 UFC/ml de lactobacillus le jour d’expiration.

Plusieurs facteurs influencent la viabilité des bactéries du yaourt, parmi lesquels l’acidité du

produit durant le stockage ou post acidification (Gilliland et al., 2002) .

Discussion

79

Les conditions et les milieux d’isolement Plusieurs facteurs sont importants lors de l’isolement de Streptococcus thermophilus et

Lactobacillus delbruckii subsp bulgaricus , parmi les quels des conditions physico-chimiques

favorables et un milieu de culture adéquat (facteurs nutritionnels). La condition d’anaérobie pour

les Lactobacilles est assurée par une jarre et une bougie.

Les milieux de culture utilisés étant le MRS acétique pour les Lactobacilles et le M17 pour

les Streptocoques.

Isolement et purification L’isolement et la purification des souches lactiques à partir des échantillons des yaourts

expérimentaux nous a permis d’obtenir 08 souches lactiques ; 04 souches appartenant au genre

Lactobacillus et 04 autres au genre Streptococcus.

Les souches ont été pré identifiées à ce stade sur la base de leurs aspects macroscopique et

microscopique ainsi que des tests physiologiques tels que la croissance à différentes températures

et dans des milieux hypersalés à différentes concentrations

L’étude macroscopique consiste en une observation à l’œil nu, l’aspect des cultures en

milieu gélosé permet de déterminer la forme, la taille, la couleur et l’aspect des colonies.

L’observation macroscopique a montré en effet que toutes les colonies avaient une couleur

blanchâtre, bien rondes à bords lisses, laiteuses, de forme sphérique plus ou moins allongées et de

petite taille avec un diamètre en 0.5 à1.5 mm disposées par paires, en tétrades ,en chaines longues

avec parfois des coques isolées ou même en amas pour les Streptocoques. Pour les Lactobacilles,

les cellules sont des bacilles plus ou moins longs isolés disposés par paires ou en longues

chainettes.

L’identification des souches basée sur des tests biochimiques et physiologiques indique que

les Streptocoques sont dépourvus de toute activité de catalase et d’oxydase. Elles sont

homofermentaires et capable de pousser à température élevée. Par ailleurs elles sont sensibles à la

croissance en milieu alcalin et aux milieux hostiles et au lait de Sherman, de plus elles ne

produisent pas l’arginine d’ammonium à partir de l’arginine, par contre elles fermentent les sucres

comme le glucose, le lactose, le fructose et le saccharose.

Discussion

80

L’identification biochimique des lactobacilles montre qu’elles sont dépourvues des activités

des enzymes de catalase et d’oxydase de type homofermentaire, thermorésistantes, elles

fermentent le glucose, le lactose, le fructose et le galactose.

Plusieurs auteurs ont rapporté des constatations similaires de ce caractère chez les souches

de Streptocoques et Lactobacilles (Cheriguene et al., 2007 et Chougrani et al., 2008).

Caractère biotechnologique

Activité protéolytique L’activité protéolytique à été estimée par la culture des souches dans le milieu Y.M.K (Yeast

Milk Agar) solide et mesure la croissance, les souches sont ensemencées en touche.

La protéolyse se traduit par l’apparition d’un halo clair autour des souches ensemencées après

24h d’incubation due à la dégradation de la caséine.

La mesure de la dimension du halo permet de quantifier d’une manière relative l’activité

protéolytique des souches. Les diamètres des zones clairs varient entre 20 et 28mm comme le

montrent les figures (33,34 et35).

D’après les résultats obtenus de l’activité protéolytique, on remarque que les Lactobacilles ont

un pouvoir protéolytique élevé, contrairement aux Streptocoques. Ces résultats sont

compatibles à ceux de Cheriguene et al., 2007 et de Chougrani et al., 2008. Cependant,

l’activité protéolytique des souches lactiques isolées est assez faible

Par comparaison à d’autres microorganismes tels que les Bacilles,les pseudomonas, les levures

et les moisissures (salvador,1966 ; Gripson et al., 1975 ; Novel.,1993).

Le système protéolytique permet la dégradation des protéines essentielles à la croissance

bactérienne, en effet les acides amines résultant interviennent dans l’activité métabolique de la

fermentation lactique des bactéries.

De plus le système protéolyse peut également contribuer à la libération de peptides bioactifs

(Merilainen 1984, Merid et Bockemann ,1999) .

Discussion

81

Enfin cette activité intervient dans les caractéristiques des produits laitiers fermentés, la

protéolyse est à l’origine de l’apparition de nombreux composés aromatiques ou leurs

précurseurs et joue aussi un rôle dans la texture des fromages (Hemme et al., 1982).

Anti bio résistance Les résultats des tests de l’antibiorésistance des souches lactiques sont regroupés dans le

tableau 15. Les diamètres des zones d’inhibitions diffèrent selon les souches et les antibiotiques

utilisés. Après avoir soumis les souches lactiques isolées à partir du yaourt àl’action de 07

antibiotiques différents, on a pu déduire que les Lctobacilles sont sensibles à la pristinamine, la

colistine, la nitroxolamine et la pénicilline, par contre elles sont résistantes à la spiramicine et

l’oxacilline.

Par ailleurs, les Streptocoques sont sensibles à la pristinamine, la colistine, la nitroxolamine,

la spiramicine, la pénicilline et la mikacine mais résistantes à l’oxacilline.

Globalement, des résultats similaires ont été rapportés par la bibliographie particulièrement

dans les travaux de Tamine et al., 1983 ; Clambe et al., 1999 et Chougrani et al., 2008.

En fait les bactéries lactiques sont sensibles aux antibiotiques de la famille des

lactamines(comme la pénicilline) considérés comme étant les plus utilisés en pratique clinique

(Chopand et al., 2001).

Le pouvoir acidifiant

L’acidification du lait est essentiellement due la production de l’acide lactique qui varie selon

les souches (Larpent, 1987).

L’activité acidifiante à été estimée d’une part par culture des souches dans le lait écrémé et

mesure du pH toutes les heures et d’autre part par titrage de l’acidité produite par une base de

NaOH en présence d’indicateur coloré le phénol phtaléine durant 24h.

Les résultats de la production d’acide lactique par les différentes souches sont illustrés sur les

graphiques des figures 36, 37, 38 et 39.

Discussion

82

Si la coagulation survient à moins de 6 h elle est dite rapide, moyenne si elle survient au bout

6 à 8h, par contre si l’acidification ne survient qu’après 18 à 24h d’incubation elle est

considérée comme lente.

D’une manière générale on remarque que l’activité acidifiante diffère selon les germes et les

espèces et parfois au sein de la même espèce.

Ceci nous a permis de classer les différentes souches de bactéries lactiques selon leur aptitude

acidifiante en 03 groupes :

Souche à pouvoir acidifiant élevé ou rapide si la coagulation survient au bout 6h ou si le

degré d’acidification D° ≥65. Dans ce groupe on retrouve les souches lb1 (70D°) et lb4

(70D°).

Souche à pouvoir acidifiant moyen dont le taux d’acidification se situe dans l’intervalle 50≤

D°≤65. Ce groupe est représenté par les souches lb3 (60D°), strp4 (65D°)et strp3 (55D°)

Les résultats obtenus indiquent qu’à t=0 heure, le pH initial du lait écrémé se situe entre 5.8

pour certaines souches lactiques et 6.5 pour d’autres testées. L’évolution du pH est caractérisée

par une diminution en fonction du temps et atteint la valeur de 3.5 pour respectivement les

souches lb1et lb4 et 3.7 pour lb3. Par contre chez les Streptocoques, les valeurs de pH

atteignent 4.5 pour strp1et 4.6 pour strp4.

Souche à pouvoir acidifiant faible lorsque le taux d’acidification est ≤50D°, ce groupe est

représenté par les souches lb2, strp2 et strp1 pour une valeur d’acidité dornic de l’ordre de

50°D. Les valeurs de pH notées pour les souches à faible pouvoir acidifiant se situent à 5.1

pour strp2, 5.3 pour strp3 et 4 pour lb2.

On remarque également que le degré d’acidification en fonction du temps varie légèrement

d’une souche à l’autre mais aussi au sein de la même espèce.

Ces résultats sont en accord à ceux rapportés par Chougrani et al (2007).

Nos observations ont porté également sur le temps de coagulation, en effet à l’exception des

souches lb2, strp2, strp1 dont la coagulation du lait a été obtenue après 24h d’incubation, les

autres souches telles que lb1 et lb4 strp4, strp3 ont été plus actives en coagulant le lait après

Discussion

83

seulement 8h d’incubation, ce qui signifie que ces souches ont un pouvoir acidifiant plus

important. Par ailleurs, il existe une relation étroite ente le pH et l’acidité dornic, en effet au fur

et à mesure que la quantité d’acide lactique produite augmente, le pH diminue. Notons

également que le pouvoir acidifiant de certaines souches de Lactobacilles et de Streptocoques

diminue en fonction de temps. Globalement des résultats analogues ont été rapportés par

Chamba et al., (1989).

Étude de cinétique de croissance des souches

L’évolution de la croissance des bactéries lactiques durant 24h de fermentation à montré que

les phases de croissance des différentes souches isolées (lb1, lb2, lb3, lb4et strp1, strp2, strp3,

strp4) sont semblables, le maximum de développement a été atteint aux environs de 14

heures. Les valeurs enregistrées chez les Lactobacilles sont de l’ordre de 3.1x108 UFC/ml,

7.9x108 UFC/ml 1.4x108 UFC/ml et 2.5x108 UFC/ml pour respectivement les souches lb1,

lb2, lb3 et lb4. Cependant les valeurs des Streptocoques étant plus élevées soient

2.9x109UFC/ml, 5.9x109UFC/ml, 6.9x109UFC/ml et 3.5x109UFC/ml chez respectivement

strp1, strp2, strp3 et strp4.

Activité antimicrobienne

Durant la fermentation, les bactéries lactiques métabolisent le lactose en acide lactique,

abaissant ainsi le pH et créant ainsi un environnement défavorable au développement des

bactéries pathogènes et des microorganismes agents d’altération. C’est ainsi qu’à travers ce test,

les résultats obtenus ont indiqué que les isolats de bactéries lactiques testées ont manifesté une

activité antagoniste vis-à-vis des souches pathogènes telles que E.coli. Il est probable que cette

activité soit une conséquence de production de bactériocines (jack et al., 1995 ; Pirard et

Desmazeaud ,1992). Par ailleurs, il est important de signaler que certaines souches de bactéries

lactiques étaient capables d’inhiber deux ou plusieurs souches pathogènes, par contre d’autres

n’en inhibent qu’une seule. Ces mêmes observations ont été rapportées par cheriguene et

al.,(2004), toute fois, les valeurs indiquant les taux d’activité antimicrobienne de notre étude sont

proches ou légèrement supérieures de ceux rapportés par Cogan et al.,(1997 ).

Discussion

84

Les bactéries lactiques sont connues par leur pouvoir à produire des substances

antimicrobiennes tels que les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène, le diacétyl et les

bactériocines ayant un effet antagoniste contre les bactéries pathogènes (Daeschel, 1987 ; Piard et

Desmazeaud,1992).

En effet nous disposons de peu d’informations sur la nature des substances antimicrobiennes

mises en évidence dans la présente étude, il est possible que cette inhibition serait due aux acides

ou au peroxyde d’hydrogène produits par les bactéries, les phages seraient également responsables

de ces inhibitions.

Les souches produisant les bactériocines sont utilisées comme ferment lactique dans la production de fromages et de yaourt en vue d’en améliorer la sécurité et la qualité

Conclusion

Conclusion

Conclusion :

Durant notre étude, nous avons isolé des Lactobacilles et des Streptocoques à partir des

yaourts fabriqués et commercialisés dans l’ouest d’algérien.

Après dénombrement, les valeurs des bactéries lactiques atteintes dans le yaourt sont de

l’ordre de 107/ml pour les Streptocoques et 106 /ml pour les Lactobacilles.

Les études macroscopique et microscopique ont montré que les Streptocoques forment

des petites colonies blanchâtres, sphériques ou ovoïdes, associées en chainettes et parfois en

amas alors que les Lactobacilles sont des colonies punctiformes, blanchâtres sous forme de

bâtonnets courts, disposées par paires et en chaines.

L’étude physiologique a été réalisée afin de connaitre les conditions optimales de la

croissance des Lactobacilles et les Streptocoques et a montré que les deux souches étaient

capables de pousser aux températures de 37°C et de 45°C.

L’identification en utilisant le système API 50 CHL nous a permis de confirmer les genres

et les espèces pré identifiés par les tests physiologiques et biochimiques.

Les analyses microbiologiques des échantillons de yaourt entreprises dans ce travail ont

montré l’absence de germes indice de contamination fécale tels que les coliformes fécaux et

totaux et des germes pathogènes comme le Staphylococcus aureus ou les salmonella et par

conséquent les échantillons de yaourt sont de bonne qualité hygiénique et répondent aux normes

microbiologiques fixées par la réglementation.

Enfin sur le plan biotechnologique, les deux souches ont révélé de bonnes performances

technologiques telles que l’activité protéolytique, le pouvoir acidifiant et l’activité antagoniste.

Perspectives

Perspectives

Perspectives : Le but de notre travail était la mise en évidence des bactéries lactiques isolées

à partir des yaourts fabriqués et commercialisés en Algérie ainsi que l’étude de leur

performance et en guise de perspectives, nous recommandons ce qui suit :

1. Confirmer l’identité de nos souches en utilisant les méthodes de biologie

moléculaire (PCR).

2. Etude du potentiel probiotique de nos souches :

• In vitro : Etude de l’interaction avec d’autres bactéries pathogènes et

détermination de l’agent inhibiteur.

• In vivo : la résistance au passage gastrique chez les personnes saines ou

malades en étudiant les modifications possibles de la flore intestinale après

la consommation du yaourt probiotique.

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Annexe

.

Annexes

Annexe

Isolement et identification des bactéries lactiques

Milieux pour l’isolement

Milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) (Streptococcus thermophilus, Lactococcus sp. et Leuconostoc sp.)

Milieu de base Peptone trypsique de caséine 2,50g Peptone pepsique de viande 2,50g Peptone papaïnique de soja 5,00g Extrait de levure 2,50g Extrait de viande 5,00g β-disodium glycérophosphate 19,00g Sulfate de magnésium (MgSO4) 0,25g Acide ascorbique 0,50g Agar-agar 18,00g Eau distillée (qsp) 950,00ml pH=7,2 Répartir à raison de 95ml par fiole de 125 ml. Stérilisation à l’autoclave: 120°C pendant 20 minutes.

Solution de lactose

Lactose 10,00g

Eau distillée (qsp) 100,00ml La stérilisation est faite par filtration sur membrane millipore (0,45µm) ou stérilisation à l’autoclave: 120°C pendant 20 minutes.

Milieu complet

Milieu de base préalablement fondu et ramené à 48-50°C 95,00ml Solution de lactose chauffée à 48°C 5,00ml Mélanger par agitation. ● Pour les lactococcques le milieu M17 additionné de (0,5%, p/v) de glucose (GM17). Milieu MRS (De Man; Rogosa et Sharpe, 1960) (Lactobacillus sp., Leuconostoc sp. et Pediococcus sp.) Extrait de levure 4,00g Extrait de viande 8,00g Peptone 10,00g Acétate de sodium 5,00g Citrate d’ammonium 2,00g Glucose 20,00g Phosphate dipotassique (K2HPO4)

Sulfate de magnésium (MgSO 2,00g

4)

Sulfate de manganèse (MnSO 0,25g

4

Tween 80 1,00ml ) 0,05g

Agar-agar 18,00g Eau distillée (qsp) 1000,00ml pH=6,8

Annexe

Stérilisation à l’autoclave: 120°C pendant 20 minutes. Test de l’arginine dihydrolase :

1/ Milieu Möller à l’arginine Peptone pepsique de viande 5,00g

Extrait de viande 5,00g

Pourpre de bromocrésol 0,01g

Rouge de crésol 0,005g

Glucose 0,50g

Pyridoxal 0,005g Arginine 10,00g

Eau distillée (qsp) 1000,00ml pH=6,8 Stérilisation à l’autoclave: 120°C pendant 15 minutes. 3.3 - Milieu OGA

Composition :

Extrait autolytique de levure 5 g

Glucose 20 g

Agar agar bactériologique 15 g

Eau q.s.p 1000 ml

Autoclavage à 120 °C pendant 20 mn

Lait écrémé (milieu de conservation)

Lait en poudre 12.5g

Eau distillée 100ml

Glycérol 15ml

Eau physiologie

Utilisée pou la préparation des dilutions

Chlorure de sodium 9g

Eau distillée 1000ml

Autoclavage à 120C° pendant mn

Annexe

Documents

Etude microbiologique et hygiénique du yaourt fabriqué et ... · The quality hygienic revealed absence the pathogenic flora (total coliforms and fecal . staphylococcus aureus, salmonella)