BIOCHIMIE, 1~975, 57, 1155-1162.

l tude par immunodlectrophor se bidimensionnelle de la dissociation spontande des lipoprot6ines de basse densitd.

Suzanne SALMON O, Marise AYR&ULT-JARI~II~'R, Isabel BE UCLE~ e¢ J~cques POLONOVSKI.

Laboratoire de Biochimie, CNRS-ERA ~81, C.H.U. Saint-Antoine, 27, rue Chaligny, 75571 Paris Cddex 12.

(27.6-1975).

Summary. - - Plasma-lipoproteins isolated between d 1.020 and d 1.055 g/ml were partially delipidated with ethyl ether at 4°C. This treatment induces a transformation of the lipoproteins 'which is evolutive during several days. Bidimensional immunoelectro- phoresis reveals the lipoproteins dissociation and the appearance of 4 immunologically different fractions. The time dependent formation of these subunits is slowed down by EDTA and less efficiently by antioxydants. Once started, the dissociation can be accele- rated by heating at 37°C or by UV exposition.

Another lipopeptide is more easily revealed by anti VLDL antiserum. It can be shown in the native and in the partially or completely delipidated LDL. Its presence does not depend on lipoprotein dissociation.

INTRODUCTION.

Les l ipoprot6ines de basse densit6 d.u s6rum humain S,f 4-12 (LI),L) ( ' ) sont habi tue l lement con- sid6r6es comme un 6di'frce homogbne dont la par- tie pro t6 in ique l ' apdl ipopept ide B est insoluble en solut ion aqueuse. Alaupovic et coll. [1, 2, 3] out t rouv6 darts des pr6para t ions de LDL sous fract ionn6es, h c6t6 des t ipopept ides insolnbles la pr6sen,ee de faibles quantit6s de l ipopept ides solu- bles A e t C.

Une h6t6rog6n6it6 immunolog ique des LDL a 6t6 d6,crite d6s 1966 [4, 5]. Nous avons mo,ntr6 pr6,c6- demment grace a l ' immuno61ectrophor6se unidi- mensionnel le , la pr6sence de plusieurs d6termi- nares antig6niques r+v616s apr6s d61ipidation /t F6ther [~, 7, 8]. Le Uraitement pa r l '6ther [9, 10J qui extrai t la totalit6 des l ip ides neutres, laisse en solution aqueuse des complexes prot6ines-phos- phol ip ides (,LDL~) contenant envi ron 70 pour cent

(*) Abrduiations : LDL = Lipoprotdine isolde entre tes densitds

1,020 et 1,055 g/ml. LDLe = LDL partiellement d~lipid6e h l'6ther. apo LDL = LDL d61ipidde h l'alcool-dther. VLDL ~ Lipoprotdine isol~e ~ la densit6

1,006 g/ml. VLDLo : VLDL partiellement dflipidbe h l'6ther. HDL : Lipoprotdine isolde entre les densitds

1,100 et 1,020 g/ml. apolipo A ~ peptides constituants des HDL. apolipo B ~ peptides constituants des LDL et des

VLDL. apolipo C ~ peptides eonstituants des VLDL et des

HDL. O A qui toute correspondanee dolt ~tre adressfie.

des phosphol ip ides in i t iaux [7, 8] ; tandis que la d61ipidation totale pa r ~es solvants p rovoque la fo rmat ion d'a, gr6gais insolubles. L?immuno61ectro- phorbse bidianensionne:lle, d6cri te par Ressler [11] pour les prot6ines du s6rum, est une m6ihode tr6s sensible pour s6parer et r e conna l t r e les diff6rents antig6nes d 'un ensemble. Nous avons emp,loy6 cette te.chnique pour la raise en dviden,ce et l '6tude de l '6volut ion au cours du temps de sous-unitds darts les LDL.

MAT~RI, EiL ~ T MET,HOD,ES.

1) Pr~paralion des lipoprot~ines de basse den- sit~ : LDL.

Elles on.t 6t6 isol6es par u l t racen t r i fuga t ion pr6- para t ive [12, 13] h par t i r de s6rum de sujets nor- maux. Les f rac t ions Sf 4-12 pr6par6es par flotta- t ion dans un mil ieu de densit6 1,0,55 g / m l puts pa r s6dimentat ion dans un mi l ieu de densit6 1,020 g / ml ont 6t6 d6barxass6es de routes prot6ines conta- minan tes pa r une nouvel,le flottation darts nn mi- l ieu de densit6 1,063 g/m1. Elles sont ensuite dia- lys6es eontre au moins 100 vo.lumes de Na, C1 0,15 M pH 7,5 con tenant 0,0'2 pour cent d 'azoture de sodium c o m b e ant isept ique.

2) D~lipidation partielle des LDL.

La solution de LD*L est trait6e pa r 10 volumes d '6ther 6~hyHque redist/l ld, satur6 d'eau. I1 est n6- cessaire que la solut ion de LDL air une cer ta ine concent ra t ion saline pour 6viter qu 'el le ne pr6ci- pi te au cours du t ra i tement . Al~rbs 1,6 heures d 'agi-

1156 S. Sa lmon el coll.

tat ion h 4°C on s6pare par centr i fugat ion la phase aqueuse qui cont ient 90 ~ 9,5 p. cent des prot6ines et env i ron 70 p. cent des phosphol ip ides [7, 8]. La phase ¢~rganique con,tient les phosphol ipides ex- t ract ibles et les graisses neutres. La phase aqueuse est lav6e 2 fois par l '6ther. Les salut ions de LDL~ ainsi obtenues sour conserv6es h 4°C et analys6es par immuno61ectrophorbse au bout de temps varia- bles : de 1 a 30 jours.

3) D~lipidalion totale des LDL. Nous avons employ6 la technique d6crite par

Gotto et coll. [14]. Aprbs d61ipidation par le nab- lange al.cool-6ther (1/3) des LDL lyophilis6es, les apo LDL sont raises en solut ion dans un tampon Tris 0,13 M, EI)TA 0,1 p. cent, pH 8,2, contenant du d6cyl sulfale 100 mM ; puts dialys6es contre le m~,me tampon dont la concent ra t ion en d6cyl sulfate est 0,5 raM. Ces apo LDL con t i ennen t en- core 1 h 2 pour cent de phospholipides.

4) Preparation des immuns~rums.

Les lapins recoivent des in ject ions sous cuta- n6es, dans la r6gion dorsale, de solutions l ipopro- t6iniques de 1 ml con tenan t 1 h 1,5 mg de pro- teines auxquelles on ajoute 0,2 ml d 'ad juvant de Freund . Ces in jec t ions sont renouvel&es 3 h 4 fois h 15 h 20 jours d ' intervalle .

Les immuns6rums obtenus h par t i r de LD,L nati- ves, de LDL partiel.l.ement ou totalement d61ipi- d6es, de VLDL natives ou d61ipid6es ~ l '6ther pr6- sentent qua]i taf ivement les m6mes arcs de pr6ci- p i ta t ion envers les L.DL~ qu 'un immuns6rum anti s6ruin total de l ' lns t i tu t Pasteur. Quant i ta t ivement la r6par t i t ion en ant icorps cor respondant $ cha- cun des antigbnes composant ]es LDL, est diff6- rente selon la fra, ction inject6e.

5) Immunodlectrophor~se bidimensionnelle. Un tilm de 2 mm d'agarose h 1 pour cent dans

une solution tampon barbi turate , pH 8,2, F = 0,025, es¢ coul6 sur une plaque de verre (75 × 75 ram). L '6chant i l lon /~ 6tudier contenan¢ 0,05 0,1 mg de prot6ines est d6pos6 dans une fente (10 X 2 mm) s,itu6e ~ 1 cm du bord inf6r ieur de la plaque.

Une premi6re 61ectrophorbse est effectu6e paral- 161ement au bord inf6r ieur de la plaque dans un mi l ieu t ampon pH 8,9, compos6 d 'un m61ange /~ volume 6gal d 'une solution de tam, pon barb i tura te pH 8,6 ; F = 0,06 ; et d 'une solu~tion Tris base, EDTA, acide bor ique (10,(~5 ; 0,50 ; 0,65 g/l) ; pH 9,0 ; pendan t 60 minutes , sous une tension de 10 V/cm.

La deuxibme 61ectrophor6se, pe rpend icu la i re /a la premibre est r6alis6e en pr6sence d ' imniun-

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 10.

s6rum. Au d61h de 25 mm du bord inf6'rieur de la plaque, l 'agarose est remplac6e par un ni61ange agarose-immuns6rum ml/ml . Le m6iue t ampon que pr6c6demment est utilis6. L'61ectrophor6se est effectu6e pendan t 16 heures sous une tension de 2 V/cal. Les pics de pr6cipit6 antig~ne-anficorps sont r6.v616s au bleu de Coomassie.

L'importan.ce des pics lots de la deuxi6me 61ec- trophor6se est fonction des propor t ions relatives d 'antig6nes et d'antt.corps. Chaque lot d ' immun- s6rum est test6 pou.r ~tre employ6 de faeon h obtenir des pics de pr6cipi ta t ion de hauteur 6qui- valente d 'un essai h l 'autre. Nous ne comparerons que des exp6riences faites duns ]es m~qnes propor- t ions pour un m6me immuns6rum.

6) EIectroinmiunodiffusion.

Pour certaines identif icat ions de peptides, nous nous somInes content6s d 'une seule migrat ion 61ec- t rophor6tique dans les condit ions d6crites pour la deuxibme dimension de l '61ectrophorbse b id imen- sionnelle. Cette technique est plus sensible qu 'une immunodif fus ion d 'Ouchter lony car la migra t ion 61ectrophor6tique permet de mieux s6parer tes dif- f6rents pr6cipit6s antig6nes-anticorps.

7) Immuno~lectrophor~se [ractionn~e d plu- sieurs immuns~rums.

En in t roduisan t dans la deuxibme d imens ion de l'61ectrophorbse b id imensionnel te ou dans l'61ec- t ro inununodif fus ion, une premibre bande d'aga- rose de 1 cm de hauteur contenan~ un immun- s~rum en concent ra t ion suffisante puts sur le reste de la plaque de l 'agarose con tenan t un autre im- muns6vum, nous pouvons s6,parer des lipo ou apo- l ipopeptides diff6rents selou la sp6~cifici}6 de cha- cun des immuns@ums employ6s (*).

RESULTATS.

I - - IMMUNOELECTROPHORI~SE B I D I M E N S I O N N E L L E

DES LIPOPROTI~INES NATIVES OU D E L I P I D E E S .

1) LDL natives.

Les LDL m~grent au cours de ]a premi6re 61ec- trophorbse en une bande assez large /~ quelques millim6¢res du d6pbt. La deuxi6ine 61e,ctvophor6se en pr6sence d ' immuns6rum anti LDL, ou en pr6- sence d ' immuns6rum humain total de l ' Ins t i tu t Pasteur permet de r&v61er plusieurs pics (figure 1). Nous obtenons la m6me image soi.t en colorant les pr6cipit6s immunologiques au bleu de Coomassie, soit en pr6colorant les }ipi.des au noir Soudan [161,

(*) Nous avons v6rifi$ que si le deuxi6me immun- sdrum est identique au premier, on si l'agarose ne contient pas d'immunsdrum, seuls les pics rdvdlds par le premier immuns6rum sont visibles.

D i s s o c i a t i o n s p o n t a n d e d e s l i p o p r o t d i n e s . 1157

soit pa r auloradio,graphie de la p laque ob4enue avee une solut ion de LDL m,arqu6es in v i t r o par du cholest6rol- 4 - 14C.

Fro. 1 . - lmmunodlec trophor~se b ld imens ionnel le d 'une solut ion de LDL contre un i m m u n s d r u m antise- rum total de l ' Ins t i tu t Pasteur.

Eleetrophor6se : agarose 1 p. cent, tampon barbi- turate q- tris pH 8,9 - - premi6re dimension : 1 heure, 10 V/era - - deuxi6me dimension : en pr6senee de 5 p. cent d'immuns6rurn, (ml/ml) 16 heures, 2 V/era.

Coloration : bleu de Coomassie.

Ces exp6r iences d6mont ren l l ' ex is tence dans /es LDL de plusieurs associat ions ' l ipoprot6iniques.

2) L D L p a r t i e l l e m e n t d ~ l i p i d ~ e s it l '~ ther .

L' image en immuno61ectrophor6se b id imens ion- nelle d 'une solution de LD,L e f r a i chemen t d61ipi- d6e est ir6s semblable h ceHe de la LDL na~tive. Quel,ques jours apr6s le t r a i t ement p a r l '6 ther on dist ingue en pr6sen,ce d ' immuns6rum anti s6rum humain total de l ' Insf i tut Pasteur [8~ ou d ' immuu- s6rum anti LDL ou LDL e 4 pics de pr6c ip i ta t ion p r i nc ipaux appel6s I, II, HI, IV ainsi qu 'un cin- qui6me pic, V, r6v616 en pr6sence d ' imInuns6rum anti VLDIL ou VLDL e (figure 2).

- - L e p i c I e s t foa'tement colorable au bleu de Coomassie, il est le seul qui fixe le noir Soudan ; il co~:res.pond donc h des peptid,es por tan t encore des phosphol ip ides . Ce p ic de tr6s faib]e rnobilit6 pourraJt 6tre l ' ensemble de l '6difice non encore dissoci6.

L e p i c H cor respond h une prot6ine de m6me mobili t6 que celle du p ic I. I1 n'est pas colorab!e au noir Soudan.

- - L e p i c H I cor respond h une prot6iue dont ta migra t ion e]ectropbov6tique en p remi6re dimen- sion est plus 6~tal'6e que les 2 pr6c6dentes. Ce p ic d ' immunopr6,c ipi ta t ion coupe toujours le p ic ]I (figure 2). I1 n'est pas colorable au noi r Sol]rdan.

FIG. 2. - - lmmunodlec trophor~se b id imensionnel le d'une solut ion de LDL par t i e l l ement ddlipid~e h l'dther.

Electrophor6se et coloration : voir figure 1. a) immuns6rum anti LDLo (4 p. cent ml/ml) : seuls 3 pics sont r6v616s. b) immuns6rum anti VLDL (4 p. cent ml/ml) : les 5 pies sont visibles.

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1158 S. S a l m o n et col l .

- - Le p i e I V n'est pas toujours r6v616. On ne ]e voit qu 'avee des LD,L~ vieillies qui pr6sentent un pic III. I1 est souvent mis plus d is t inc temenl en 6vidence par les immuns6rums anti VLD,L que par les immuns6ru,ras anti LDC.

Fro. 3. - - Comparaison en immunodi f fus ion et en dlectroimmunodif fusion de solutions de LDL natives, totalement et partiellement ddlipiddes.

Electrophor~se : m4me support et tampon que figure 1 ; 16 heures ; 2 V/cm.

Electroimmunodiffnsion contre 2 immuns6rums diff6rents :

A) immuns4rum anti VLDL, (10 p. cent ml/ml). B) immuns6rum anti LDL~ (17 p. cent ml/ml). Immunodiffusion 48 heures h 4°C : C) immuns~rum anti LDL~. On notera la eontinuit6 de la ligne r6v616e dans

l ' immuns6rum A, la continuii6 entre les lignes LDL et LDL, et ta continuit6 partielle entre les lignes LDL et apo LDL dans l ' immuns6rum B.

- - Le p ic V est toujours r6v616 par l ' immun- s6rum anti VLDL. ll esl pr6sent duns ions les 6~hanti~lous de LDL e 6tudi6.s. I~l est en conti~auit6 immunolc~gique avec une l igne r6v616e h par t i r d 'une solution de LDL native ou d'apo LDL (figure 3). I1 s 'agit d 'uue pr4cip i ta t ion sp6cifique car, si dans l '61ec~roimmunodiffusion te]te qu'e]le est montr6e dans ]a figure 3, l ' in~muns6rum anti VLI)Le (A) a ~t6 remplac6 par un immuns6rum, ant i LDL e ou par de l 'agarose sans im~nuns6rum, seuls les pics r6v6'16s par l ' immuns6rum anti LDL e (B~ de la premi6re ban, de s.ont vis.ibles.

En coruparant des solut ions de LDL pr6par6es par ultra, cent r i fugat ion en, tre ]es densit6s 1,020-

1,05.5 g / m l ; 1,02,5-1,045 g/ml ; 1,030-1,040 g/ml, nous avons mis en 6vidence dans les 3 cas, le p ic ¥ r6v616 par l ' immuns6rum anti VLDL. Les LDL e p,r6par6es h par t i r de ces LDL pr6sentent t o u s l e s pics d ' immunopr6c ip i ta t ion d6crits ci-dessus.

L' immuno61ectrophor6se b id imens ionne l le d 'un m61ange de Iipopeptides LD,L e avec d 'autres apoli- poprot6.ines : apo]ipopeptide M des HD,L ou apo- l ipopeptides C des VLI)L so]ubles duns ] '6ther [15] montre qu'i'l n'exis~te aucune communaut6 entre les LDL~ et ces apolipopeptides.

3) L D L to ta lemen t d~lipiddes.

L'immuno61ectrophor6se b id imens ionnel le des apo LD,L donne en pr6sence d ' immuns6rum anti apo LDC (:figure 4) ou anti ¥.LDL 3 ]ignes de pr6- c ipi la t ion que ] ' immuns6ru,m anti LDL ne nous a pas permis de dist inguer (figure 4). La figure 3 mont re une co mmunaut6 to,tale entre les l ignes de pr6eipi ta l ion des LI)L et des LDLe et une com- munaut6 part iel le entre ']es ]ignes de prbe ip i ta l ion des LI)L et des apo LI~L que ee soit en immuno- diffusion (figure 3 C) ou en 61eetroimmunodiffu- s ion (figure 3 B).

Une 61ectroimmunodiffusion dont nous mort- i rons le sch6ma dans la figure 5 semble ind iquer que ee sont des d6terminanis ant ig6niques pr6- sents dans le pie I des LD~L e qui ne sont pas r6v6- 16s dans les apo LDL.

II - - ETUDE DES CONDITIONS DE S~PARATION DEnS SOUS-UNITES.

Les images obtenues en immuno61ectrophor6se b id imens ionnel le 6volueni selon te d61ai qui s~pare l '61ectrophor6se de ]a d61ipidafion. Le pre- mier jour apr6s la d6fipidation on ne d6c61e g6n6- ralemen~ aucu~e disso,ciation des LDL e. Selon les 6chantHlons, 5 h 10 jours apr6s le t ra i lemeut h l '6ther ]es pics I et II se s6parent Fun de l 'autre en m6me ~emps qu 'appara l t le p ic HI suivi quelque- fois du pic IV. Au cours du temps la hauteur du pic II reste constante, celle d u p i c III augmente tandis que celle du pic I d iminue (figure 6). Une solution de LDL conserv6e plusieurs semaines h + 4°C se dissocie plu~s ra~pi, demeni apr6s d61ipida- t ion h l '6ther qu 'une solut ion f ra ichement pr6pa- r6e.

La pr6senee de cations dans le mil ieu joue un r61e dans l ' appar i l ion des sous-unit6s. Quand les LI)L sont dialys6es avant ]e t ra i tement par l '6ther eontre une solut ion de NaC] 0,15 M, pH 7,5 con- tenant 0,05 pour cent de Na 2 F_,I)TA ] ' appar i t ion du pie III es~ retard6e (figure 7 G). Si on incube eerie so~lution de LDL e pe nda n t 1 h 3 heures h

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D i s s o c i a t i o n s p o n t a n ~ e d e s l i p o p r o t d i n e s . 1159

Fro, 4. - - Immunodlectrophor~se bidimensionnelle d'une solution de LDL totalement d~lipidde h l'aleool-dther el soIubilisde dans du ddelll sulfa'le.

Eleetrophor6se et coloration : v o i r figure 1. A) immuns6rum anti apo LDL. B) immuns~rum anti LDL~.

Fla. 5. - - Schdma d'une dleclroimmunodif fusion contre un immunsdrum anti LDL,, permettant "de uoir la continuit~ entre les p ics d' immunoprdeipitation de LDL natives et de L D L partiellement ou totalement ddlipiddes.

a) LDL natives. b) LDL partiellement d61ipid6es h l'~ther. e) LDL d61ipid6es ~t l'aleool-6ther.

BIOCHIM1E, 1975, 57, n ° 10.

37°C on r6dui t le temps n6cessaire /i l 'obtenf ion d 'une image de dissociat ion (~figure 7 D). On ne remarque l'effet du chauffage que sur une solu- t ion de LDL e en vote de disso.ciation, on observe ators la format ion rapide d ' u n pic III impor tan t avec d iminu l ion du pic I (,figure 8). Une incuba- t ion • h 37°,C, m6me pendan t 24 heures, n ' appor te pas de modif icat ions h des solut ions f ra ichement d~li,pid6es ou d6jh dissoci~es. Comme le chauffage /i 37°C, une deuxi~me extract ion h l '6ther p~ovo- que la foTmation rapide d ' u n pic III tr~s impor- tant avec d iminu t ion du pic I.

Si on rempla,ce au cours de la dialyse des LDL, I 'EDTA par du CaC12 (0,5 h 2 ' r aM) les LDL e obte- nues se dissocient aussi len tement que celles pr6~ parses en pr~sen.ce d'I~DTA.

Des an,tioxydanls [a(~ide ascorhique (0,1 p. mille), thiodiglycol (3 p. cent), a - t o c o p h 6 r o l (1 p. mille)] ajout~s soit avant, soil au eours de la d~l ip idat ion par l '6ther, ont 6galement entrainS. un reta,rd dans l 'aplaari t ion de la dissociat ion (figure 7 E) h l ' inverse, pour favoriser une oxyda- t ion 6ventuelle, nous avons expos6 des solutions

Fro

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D i s s o c i a t i o n s p o n t a n d e

de LDL e /I l ' ac t ion de rayons ultra-violets penda n t 1 heure (figure 7 B). Ce t ra i temenl effectu6 le jour de Ia d61ipidation n 'appor te pus de modif icat ions imm6diates, Inais ces fract ions se sont dissoci6es plus rap ide inen t que les fract ions t6inoins, pour a t te indre le m6me degr6 de dissociation.

DISCUSSION.

Des t ravaux ant6rieurs en immunodlec l ropho- r6se un id imens ionne l l e [6, 7] nous avaient per inis de mont re r que la d61ipidation part iel le ~ l '6ther n 'alt6re pas l 'ant ig6nici t6 de la mol6cule et per- met de r6v61er plusieu.rs l ignes immunologiques.

d e s I i p o p r o t d i n e s . 1161

cours du vieHlissement, en m6vne temps que se for- ment de nouvelles lignes de pr6ci.pitation, les pics III et IV, qui ne coupent jamais le pic I mats peuvent Ore en communau~6 partiel le. Contraire- Inen,t aux pr6c6dents, le pic II qui coupe le pic III ne varie gu6re au cours du temps. Le pic V cor- respond ~ une l ipoprot6ine pr6sente dans les VLDL et dans les LDL dis i incte de la l ipopro- t6ine B [2, 3, 17].

hauteur II

i / A • D

0 1 (J 2 0 3 6 jours FIG. 7. - - Variat ion par rapport au p i c It , de la

hauteur da pic I I I obtenu par immuno~lectrophor~se b id imens ionnel le d 'une solut ion de LDL~ conservde dt $°C.

A) LDLe en solution darts NaG1 0,15 M; pH 7,5. B) LDL,, en solution dans NaC1 0,15 M ; pH 7,5,

expos6e avant la premi6re immuno61ectrophor6se, pen- dant 1 henre, aux rayons ultra-violets.

C) LDL~ en solution dans NaC1 0,15 M, pH 7,5, contenant 0,5 p. cent d'EDTA.

D) LDL~ prdc~dente ineub~e 3 heures h 37 ° C, 14 jours apr6s la d61ipidation $t l'6ther.

E) LDL~ en solution dans NaCI 0,15 M, pH 7,5, contenant 3 p. cent de thiodigiycol.

Par la technique d'61ectrophor~se b id imens ion- nelle, nous conf i rmons la pr6sence de ces sous- unit6s et pouvons 6tudier ]eur 6volution. Le pre- mier pic d6cri t (pic I ) con{ t en t la plus grosse par- tie des phospholipopept~des de la mo16cule ini- tiale. Ces l ipopept ides disparaissent l en tement au

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FIG. 8. - - Ef fe t d 'un chauf fage de 3 heures d 37~C sur une LDL e ddlipidde depuis 9 jours .

Immuno61eetrophorbse bidimensionnelle contre un immuns6rum anti LDL~ (voir la figure 6).

La d61ipidation totale suivie d 'une solubi l isat ion en pr6sence de d6tergents provoque une perte d 'ani ig6nici t6 [14, 18, 19, 20J que Got.to et co i l [21] mesuren t par des dosages rad io immunologiques . L' i inmuno61ectrophor6se b id i inens ionne l le a per- mis de Inettre en 6vidence dans les apo LDL 3 entit&s diff6rentes. En 61ect ro i~munodif fus ion on voit que ces derni6res sont en communaut6 immunologique avec les LI)~ et les LD,L~ et que ce sont cer tains dO6rminan t s ant ig6niques du pie I qui ne sont pas r6v616s dans les apo LDL.

Nous avions confi.rm6 pa r uJ t racentr i fugat ion analyfique des LDL par t ie l lement d61ipid6es, la pr6sence de 3 fract ions de vitesse de s6,dimenta- t ion diff6rente [7]. D'autres auteurs ont d6crit l 'ex~stence dans les LI)L de sous-unit6s isol6es par diverses techniques : c h r o m a t o g r a p h i e sur DEAE cellulose [22] et f i l t ra t ion sur Seph~dex [23] qui

80

1 1 6 2 S. S a l m o n et col l .

o n t p e r m i s d e s 6 p a r e r d e s u n i t 6 s p r o t 6 i n i q u e s a y a n t u n e c o m p o s i t i o n d i f f 6 r e n t e e n a c i d e s ant i - n 6 s ; 6 1 e c t r o p h o r 6 s e en gel de po~ lyac ry l amide a p r 6 s a c t i o n des d 6 t e r g e n t s [23, 24] o,u m o d i f i c a - t i o n c h i m ~ q u e [23, 25] ; u l t r a c e n t r i f u g a f i o n ana - l y t i q u e de L D L d61ip id6es [26] ou m o d i f i 6 e s ch i - m i q u e m e n t [23, 25].

Les exp6 , r i ences que n o u s a v o n s d ~ c r i t e s m o n - t r e n t l a p o s s i b i l i t ~ de r 6 v ~ l e r p l u s i e u r s u n i t 6 s l ipo- p e p t i d i q u e s ou p e p l i d i q u e s qu i a p p a . r a i s s e n t a u t o u r s d u v i e i . l l i s s em en t des L D L e. K r i s h n a i a h et Wiegan , d t [27] s i g n a l e n t ~ 'ga lement l a f o r m a t i o n au e o u r s d u t e m p s de ban .des s u p p l ~ m e n t a i r e s dar t s l '61ecArccphor~se e n gel de p o l y a c ~ ' y l a m i d e des LDL. I ls a t t r i b u e n t ce t t e d i s s o c i a t i o n h F a c t i o n d ' u n e p r o t 6 a s e . Ce t t e h y p o t h 6 s e es t c o n t v e d i t e p a r C h e n et A l a d j e m [23]. L ' 6 t u d e des c o n d i - t i o n s de s 6 p a r a t i o n des s o u s - - u n i t 6 s mo~ntre que l ' e n v i r o n n e m e n t i o n i q u e a u n e g r a n d e i n f l u e n c e s u r le p h 6 n o m ~ n e . U n e c e r t a i n e c o n c e n t r a t i o n s a l i n e e s t n ,6cessa i re h la s o l u b i l i s a t i o n des u n i t 6 s l i p o p e p t i d i q u e s . L ' E D T A et les a g e n t s a n t i o x y - d a n t s h u n deg r6 moind~re, f r e i n e la pos s i b i ] i t 6 de les s 6 p a r e r les u n e s des au t r e s . U n e i n c u b a t i o n

37°C n e suff i t pu s h d6clen, c h e r la d i s s o c i a t i o n , e l le ne p e u t q u e l ' a cc616re r si ce l l e -c i est d6jh a m o r c 6 e . I1 e n e s t de m 6 m e si o n e x p o s e la so lu- t i o n l i p o p r o t 6 i n i q u e a u x r a y o n s u l t r a -v io l e t s . Cec i s ' a c c o r d e r a i t a v e c u n effe t p o r t a n t s u r ]a p a t t i e l i p i d i q u e . L a l e n t e u r des p h 6 n o m ~ n e s d 6 c r i t s n o u s f e r a i t p e n c h e r v e r s l ' h y p o t h ~ s e d ' u n e a u t o o x y d a - t i o n des a c i d e s gras . C e p e n d a n t n o u s ne p o u v o n s p a s e x c l u r e l a p o s s i b i l i t 6 d ' u n e p r o t 6 o l y s e 6ven - t u e l l e m e n t acc616r6e ou d 6 c l e n c h 6 e p a r les p r o - d u i t s de l ' a t ~ t o o x y d a t i o n de s l i p ide s .

R~suM~.

Les l ipoprot~ines p lasmat iques de densit~ comprise ent re 1,020 et 1,055 g / m l ont ~t6 d~lipid~es par t ie l le- men t pa r l '~ ther 6thyl ique. Ce t r a i t e m e n t permet une t r a n s f o r m a t i o n des l ipoprot~ines qui se poursu i t pen- dan t p lus ieurs jours . Gr/tce h l ' immuno~lect rophor~se b id imens ionne l le , il est possible de r~v61er une disso- c ia t ion de l'~difice l ipoprot~inique, en au moins 4 frac- t ions i m m u n o l o g i q u e m e n t dist inctes, et de mon t r e r la cin~tique de f o r m a t i o n de chacun des apolipo- peptides a ins i d~taeh~s.

La s~para t ion de ces sous-uni t~s est plus lente en presence d ' an t i -oxydan t s et sur tou t en presence d'EDTA. Lorsqu 'e l le est amorc~e, un chauffage h 37°C ou une exposi t ion h I 'UV l'acc~l~re.

Uu au t re l ipopeptide plus a i s6ment r6v616 pa r les i m m u n s 6 r u m s ant i VLDL est mis en 6vidence dans les LDL nat ives et duns les LDL par t i e l l ement ou to ta le- men t d61ipid~es. Sa pr6sence ne d6pend pus de la dissociat ion de l'6difice l ipoprot6inique.

Remerciements.

Nous remercions Madame A. Van Wambeeke de son aide technique. Ce t rava i l a b6n~fici~ de l 'a ide de la DGRST.

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