BIOCHIMIE, 1976, 58, 681-688.

l tude spectroscopique des modifications structurales de l'h6mocyanine de scorpion induites par les variations de pH

et l'addition de diffdrents sels.

Jean-Jacques TOULMt~ *, Francois VILLA ** et Max GOYFFON *'(>. * Laboratoire de Biophysique du Musdum National d'Histoire Naturelle,

61, rue Buffon, 75005 Paris, France. ** Laboratoire de Biophysique du MusOum National d'Histoire Naturelle,

57, Rue Cuvier, 75005 Paris, France el Division de Biologie G~ndrale et Ecologie, C.R.S.S.A., 92140 Clamart.

(14-10-1975).

S u m m a r y . - Structural modifications of the scorpion tmemoeyanin induced by pH variatiorLs and salt addition are studied by U.V. absorption, fluorescence, eireular di- ehroism and light scattering. Haemoeyanin fluorescence is dale to both aromatie amino- acids tyrosine and tryptophan. Deoxygenation or denaturation lead to a fourfold enhan- cement of its intensity. At acidic pH the active site is modified and the protein is disso- ciated, but at alkaline pH the haem~)cyanin aggregates. The addition of different salts (sodium citrate, potassium bromide and iodide...) involves protein dissociation, the ampli- tude of which depends on the anion. But pH variations and salt ad'dition don't change the ha, emocyanin secondary structure as shown by circular d, iehroism. The C.D. spectrum of scorpion haemoeyanin exhibits the characteristic band's of Arthropod haemoeyanin.

INTRODUCTIOn.

Les h6mocyanines , cuproprotd.ines mult im6ri- ques de poids mol6culaire 61ev6 (de 106 h 9.10 6 daltons) assurent le t ranspor t de l 'oxyg6ne ehez divers Mollusques et Arthropodes. Elles sont done l 'homologue fonct ionnel de l 'h6moglobine pour les ver~6br6s et leur 6rude pr6sente le m6me int6r6t physiologique el phylog6n.6tique. Les h6mocya- nines mon t ren t au sein de ces deux embranche- ments zoologiques une certaine homog6n6it6 struc- turale b ien que quetques caract6ris.tiques physico- chimiques (taille de l 'uni t6 fonct ionnel le , nombre de monom~res consti tutifs notamment) var ien t d 'une esp~.ce h l 'autre. Pour une esp6ce donn6e ]e degr6 d 'associat ion de ces prot6ines d6pend de nom.breux param~tres pa rmi lesquels le pH, la force ionique, ,la teneur du mil ieu en Ca 2~ et Mg 2÷ sont les p r i nc ipaux [1, 2]. Nous avons 6tudi6 l ' in- fl~ence de que.lques uns de ces pa ramOres sur la s t ructure de l 'h6mocyanine du scorpion nord- afri, caiu Androctonus australis (L.) (Buthidae) par absorpt ion U.V., diffusion de la lumi6re, di- chroisme ci rcula i re et spectrof luor imOrie . Si cette dernibre technique a 6t6 utilis6e pour l'6.tude de quelques h6mocyanines de Moll, usques [3-5], les propri6t6s d '6mission de f luorescence des h6mo-

A qui toute corres,pondance doit ~tre adress~e.

cyanines d 'Arthropodes demeurent ignor6es h ce jour.

MATERIISL ET METHODES.

PRt~PARATION DES SOLUTIONS.

L'h6motymphe d'A. australis, pr61ev6e par ponc t ion dorsale de l 'animal , est centrifug6e pen- dant 160 mn fi 50 000 rFm apr6s 6.1imination des d6hris cellulaires par une centr i fugat ion pr6alable de 5 mn h 6.00.0 rpm. Le eulot es,t repr is dans un mi l ieu ac6tate de stadium 0,1 M h pH 7,0 auquel sont ajout6es 5 mmo~les de MgC12 et 3 mmoles de CaCL pa r litre. La solution d 'h6mocyanine obte- hue, dont la concent ra t ion varie de 60 h 95 mg/ml selon les. pr6parat ions, est conserv6e h 5°C j~squ'/~ son uti.lisation. Nous avons pr6f6r6 ce too,de de conservat ion h la cong61ation car, bien que nous n 'ayons not6 aucune var ia t ion des propri6t6s de fluoTescence et de diffusi.on des solutions conge- 16es, l '61ectrophor6gramme de l ' h6mocyanine d'A. australis est modifi6 pa r cong61ation [6, 7].

Les 6chant i l lons d 'h6mocyan ine utilis6s pour les mesures de f luorescence con t i ennen t lnoins de 35 ~g/ml de prot6ine, afin que I ' absorbance fi 278 nm soit toujours inf6r ieure fi 0,05 ( A ~ ; 1 cm ---- 14,76 [8]).

682 J.-J. Toulm6, F. Villa el M. Goyffon.

To utes les so,lutions utitis~.es au cours de cette 6rude ont 6t6 p r@ar6es en mi l ieu ~c6tate de so- dium 0,1 M, MgCL 5 raM, CaC,le 3 anM h pH 7,0.

Le spectre d '6mission de f luorescence de l 'h6mo- cyanine d'A. australis est donn6 par la figure 1. Pour une longneur d 'onde d 'exci ta t ion donn6e, la

FLUORESCENCE, DIFFUSION DE LA I,UMIERE~

ABSORPTION U . V .

Les mesures de fluo'rescence ont 6t6 effectu6es avec un spect rof luor im~tre Pe rk in -E lmer MPF-3 dans des cuves en quartz de 1 X 1 cm, h temp6ra- ture ainbiante. La f luorescence est d6tect6e h 90 ° du fais~ceau d 'exci ta t ion. L ' enreg i s t rement du rap- por t entre la lumi6re 6mise et une f rac t ion de la lumi6re exci ta t r ice permet de compenser tes fluc- tuat ions de la lampe. Mats ]es spectres obtenus ne sont pas corrig6s pour la t ransmiss ion des mono- chromateurs et la r~po.nse des photomultipli ,ca- teurs. Dans ces condi t ions ]a posi t ion des max ima d '6mission et d 'exc i ta t ion de f luorescence du t ryp- tophane en solut ion aqueuse h pH neutre ne diff6re pas de plus de 3 nm des valeurs corrig6es qui s ont donn6es dans la ]itt6r~ture [9].

Les mesures de diffusion de la lumi6re ont 6t6 r6a]is6es h l 'a ide du spectrof luor iuibtre en p lacant les monochroanateurs d 'exci ta t ion et d '6mission h la m6me longueur d 'onde (290 nan).

Les spectres d 'absorp t ion ont 6t6 enregistr6s sur un spec t rophotombtre CA RY 15.

DICHRO~S~E CIRCULAIRE.

Les spectres de d ichro i sme c i rcu la i re ont 6t6 enregistr6s h temp6ra ture ambiante sur un dichro- graphe R.oussel-Jouan.

Le calcut des f rac t ions d'h61ice (~ et de struc- ture B dans l 'h6niocyanine a 6t6 effeclu6 h l ' a ide d 'un spectre r6f6rence obtenu h par t i r des spectres de d i ch ro i sme circu]aire de 9 prot6ines dont la s t ructure a 6t6 d~termin6e par di f f ract ion des rayons X (M,aurizot, r6su,ltats non publi6s). La composi t ion en acides aniin.6s de l ' h6mocyanine d'A. australis est inconnue. Nous avons alors uti- lis6 pour le ca'l,cul, une masse moyenne par acide amin6 6gale ~ 117, d6termin6e h par t i r des h6mo- cyanines d 'Ar tbropodes dont la composi t ion en acides aminbs est connue [10].

R~SULTATS.

FLUORESCENCE, ABSORPTION ET DIFFUSION DE LA

LUMIERE.

Le spectre d ' absorp t ion des h6~uocyanines se compose de trois bandes dont ]es max ima sont si~t~,s h 280, 340 e~ 570 ran, les deux dernibres 6~tan, t c~ra~ct~6.ris,tiqu,es d.e la pro t6,in,e oxyg6n,6e.

BIOCHIMIE, 1976~ 58, n ° 6.

)t Max | ~_. Em 330

15C

lO0

-~ 50 £

300 350 400 ~k (rim)

Fro. 1. - - Spectres de f luorescence de Fhdmocyanine d 'A. a u s t v a H s en mi l ieu acdtate de sod ium 0,1 M, MgCle 5 rnM, CaCIe 3 m M 5 pH 7,0 pour une longueur d'onde d 'exci tat ion de 275 ( . . . . ), 286 ( ), et 294 n m ( - - . - - ) .

E n c a r t : v a r i a t i o n de l a p o . s i t i o n d u m a x i m u m d ' ~ m i s s i o n X~m en f o n c t i o n de l a l o n g u e u r d ' o n d e d ' e x c i t a t i . o n ~E~¢.

- ~ 0,2 ,:" ",\\ _-..o--" \I .5 0 [ ~ ,

0 2 4 6

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.......... ( ........ 300 350 400 ~ (nml

FIG. 2. - - Spectres de f luorescence de l 'hdmocyanine d 'A. a u s t r a l i s en mi l ieu acdtate de sod ium 0,1 M, MgCl~ 5 raM, CaClz 3 m M ~ pH 7,0 pour une exci tat ion

290 n m ( . . . . . ) et en mi l i eu ur6e 8 M pour une exci- tation h 290 n m ( ) et 274 nm. ( - - - - - - )

En,cart : variati, on de l'a'bs, o rb~nce /t 339 nm (@) et d,u rapport F/Fo (O) des intensit~s de fluorescence mesure,es au maximum d'dmission en fonction de la concentration ~en urge (Fo d,~signe l'in,tensit~ de fluo- res,ceaace en absen~e,e d'urde).

E t u d e s t r u c t u r a l e d e l ' h d m o c y a n i n e d e s c o r p i o n . 683

forme du spectre et la posi t ion du max imum ne var ient pas pour des solutions contenant de 8 h 35 t~g de prot6ine par ml. La s t ructure qua te rna i re de la prot6ine ne semble done pas d61aen,dre de la con'eentration, ou du moins, si une modi f ica t ion de l '6tat d 'associa t ion intervient , elle n 'affecte pas les chromophores . Cette ind6pendance entre degr6 d 'associat ion et concent ra t ion a 6t6 signa'16e pour d 'autres h6mocyanines [11-131.

On observe par eontre une var ia t ion des carac- t6ristiques de l '6mission de fluores,cence avec la longueur d 'onde d 'exei ta t ion (fig. 1). La posi t ion du m a x i m u m d '6mission se d6place de 315 331 nm quand l ' exc i ta t ion var ie de 274 h 29'5 nm. Ce d6placement sugg6re une cont r ibut ion de la tyros ine fi l '6mission de f luorescence de l 'h6mo- cyanine d'A. aus t ra l i s . La valeur de 331 nm obte- nue apr6s exci ta t ion ~t une ]ongueur d 'onde sup6- r ieure ou 6gale h 29,0 nm, c 'est-h-dire dans une r6gion od l 'on exci te essent ie l lement le t rypto- phane, ind ique que les r6sidus t ryp tophane fluo- rescents sont situ6s dans un env i ronnemen t hyd r ophobe [14].

E [ f e t de l 'ur~e.

L'addi t ion d 'ur6e h une solut ion d 'h6mocyanine provoque un d6ptacement du spectre de fluores- cence vers les gran.des longueurs d 'onde et une

i ) 250 300 350

0,05

// ~0.1

i[ ,\ / \ /

0,15 /6~

FI6. 3 . - Spectres d 'absorption di f fdrent ie l le entre une solut ion ~ 0,6 m g / m l d 'hdmocyanine dA. australis ~t pH 2,2 ( - - . - - ) en mi l ieu urde 8 M ( ), citrate tr isodique 1 M ~t pH neutre ( . . . . . . ) et une solut ion de m~me concentration en mi l ieu acdlate de sodium 0,1 M, MgClz 5 mM, CaCl~ 3 mM dt pH 7,0.

augmentat ion du rendement de f luorescence de la p,rot6ine. L ' intensi t6 de f luorescence croi t l in6aire- ment avec la concenCration en ur6e jusqu'h une valeur 6.gale ~ 7 M. Au-delh on note une augmenta-

tion rap ide : en mil ieu ur6e 8 M le rendement de la prot6ine d6natur6e est 4,5 fois plus 61ev6 que celui de ,la prot6ine native. Le max imum d'6mis-

e, F/~

%

4

3

2

1

,%

/ /'

0,3

3.2

0,1

2 4 6 8 10 I)H

FIG. 4. - - Variation en fonct ion du pH de l 'absor- bance ~ 339 n m (0), des rapports F/Fo des intensit~s de f luorescence (k~e = 290 nm, ~r,, = 340 nm) (©) el D/Do des intensitds di f fusdes (~) de l 'h~mocyanine d'A. australis en mil ieu acdtate de sod ium 0,1 M, MgCl, 5 raM, CaCI2 3 raM. Fo et Do song les intensit~s mesurges ~ pH 7,0.

sion est alors situ6 ~ 345 nm (_ 1 nm) queue que spit la lon,gueur d 'onde d'ex.citation. Dans ces con- dit ions la cont r ibut ion de la tyrosine n ' appara i t plus que sous forme d'un 6paulement dans le spectre d '6mission aprbs exci ta t ion ~ 274 nm (fig. 2).

L 'ur6e p rovoque 6galement une d iminut ion de la lumi~re diffus&e (l ' intensit~ diffus~e est divis6e pa r un f, acteur 7 d6s qu 'on atteint une concentra- t ion en urge 6gale fi 2 M e t ne var ie plus ensuite) et une modif icat ion du spectre d 'absorpt ion. L'ab- sorbance ~ 339 nm est r~duite de 85 p. cent pa r r appor t fi la prot~ine native, indiquant une d6- so xyg6nat ion par t ie l le de la prot~ine. Le spectre difference mont re de nombreux pies et 6paule- ments dans la r6gion 260-290 nm (fig. 3).

La d6naturat ion de l ' h6mocyanine d'A. aus t ra l i s par l 'ur6e compor te done d 'abord une destruct ion de la s t ructure quatern,aire (ur~.e 2 M), puts pour des con, centra t ions sup~rieures une modif icat ion conformat ionne l le de la prot~ine (ces effets ne peuvent 6tre observ6s qu'apr~s plusieurs heures).

E f [ e t d u pH.

La figure 4 mont re les var ia t ions de l 'absorpt ion 339 nm, de l ' intensit6 de f luorescence et de Pin-

tensit6 de la diffusion en fonct ion du pH. Les r6- su,ltats obtenus par ces trois m6thodes demeuren t constants entre pH 5,5 et 9. Au-delfi de pH 9, on note une augmenta t ion brutale de la lumi~re dif- fus6e qui t radui t une agr6gation des molbcules.

BIOCHIMIE, 1 9 7 6 , 58 , n ° 6 .

684 J . -J . T o u l m d , F. V i l l a e t 31. G o y f f o n .

A par t i r de pH 10,5, la prot6ine pr6cipite. A pH acide (< 5) on observe un.e d iminut ion de la dif- fusion qui attei,nt ~ pH 4,5 une valeur 4 fois plus faible qu'~ pH neutre. On note 6ga'lement une aug- menta t ion impor tan te du r endemen t de fluores- cence, mutt ipl i6 pa r un facteur 4,5 quand on passe de pH neutre ~ pH 3, et une d ispar i t ion tot,ale/~ ce pH de la bande d 'absorpt ion h 339 nm. En~in ]e spectre d 'absorpt ion diff6rentielle pr6sente des modif icat ions dans la bande caract6r is t ique des acides ainin6s aromat iques (fig. 3).

o ®

1 2 3 4 [A 2',~:)

J

, t , ,

1 2 3 4 [A-](M}

Fro. 5. - - a) Variation en fonction de la concentration [A-] en KG1 (Q)~ KB~ (D), KI (R), acdtate de sodium (0) et citrate lrtsodique (&), it pH 7,0, en prdsence de MgCL 5 mM el CaCI~ 3 raM, de l'intensitd diffusde par une solution it 35 i~tg/ml d'hdmocyanine d'A. australis. Pour r6f6re.nce est d.on.n6,e la variation d,e 'l:a lumibre 4iffus6e par une s,o]uti.on tie lysozym,e h 35 !lxg/ml .on fonction tie la concentration en. a.e6ta~t~e de sodium (V).

b) Variation du rapport F/Fo des inlensit~s de fluo- rescence (XE~ = 290 nm, X~,,, = 3140 rim) en fonetion de la concentration en diffdrents sels. Fo est l'intensit6 mesur6e pour [A-] = 0. Les symbo]es utilis6s sont itlen~iques ~ ceux fie l a figure 5a).

L 'abaissement du pH ent ra ine donc une des- t rue t ion de la s t ruc ture qu.aternaire de l a prot6ine, puts une d6soxyg6nat ion totale de ]a mol6cule. Les modif icat ions p rodui tes fi bas pH (< 3) sont irr6- versib,les.

E[ fe t des anions .

Le degr6 d 'associa t ion des h6mocyanines d6- pend de la pr6sence dans le mi l ieu de diff6rents ions. Los a lca l ino- ter reux augmentent la stabilit6 de l '6difice prot6ique [1, 15]. Les alcalins Li ÷, Na +, K ÷, Cs ÷ affectent de fa~on ident ique la s t ructure de Ph6mocyanine d 'He l i x p o m a t i a ; par eontre les divers halog6nures de sodium ent ra inent des mo- difications s t ructurales de cette prot6ine dont l ' im- por tance var ie a v e c l a nature de l ' an ion [16!.

Nous avons 6tu, di6 los modif icat ions produi tes sur l ' h6mocyanine d'A. austral is par diff6rents anions : chlorure , bromure , iodure, ac6tate et ci- trate. T o u s l e s sels uti,lis6s p rovoquen t une dimi-

nut ion de la lumi6re diffus6e (fig. 5) dont l ' impor- tance var ie dans ]e sens

G1- < ac6tate < Br- < ci trate < I-.

Ces anions p rodu i sen t 6galement des var ia t ions de l ' intensi t6 de flu,orescence. Si l 'ac6tate condui t ~t u ne t.6g6re d iminu t ion de cette inten.sit6 les au- tres anions l 'au,gmentent, fa iblement dans le cas du chloru.re, de fa~on p~us impor tan te pour le c i t ra te (fig. 5). Dan,s l e c a s de l ' iodure les varia- t ions observ6es sont complexes. La courbe obtenue est la r6sultante de deux effets : inh ib i t ion de la fhaorescence des, r6sidus t ryp tophane accessibles aux ions I- d 'une part , exal ta t ion de la fluores- cence de la prot6ine par suite des modif icat ions s t ructurales produi tes pa r ces ions d 'aut re part. Le p r e m ie r effet est p r6pond6rant jusqu'h 0,5 M, le second le devient jusqu'h 2 M environ.

La posi t ion du m a x i m u m d'6mission var ie seu- lement en pr6sence du c i t ra te avec lequel on ob- serve un d6ptacement de 8 nm vers los grandes longueurs d 'onde. En absorpt ion, seuls le ci t rate et Yiodure en t ra inent une d iminu t ion de la bande h 339' nm (fig. 3).

Les ions ac6tate et ch lorure n 'ont que peu d'effet sur l~a s t ructure de la prot6ine. Au contra i re , les autres anions utilis6s en t ra inen t une des t ruct ion de la s t ructure quater n.aire. En outre le ci t rate et l ' iodure conduisen t h une d6soxyg6nation part iel te de l ' h6mocyanine d'A. anstralis .

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2 ! / t

1 , 5

li/S 0 0 ,1 0,2 rAcrylamide] (N

FiG. 6. - - Analyse selon l'~quation de Stern-Volmer de l'extinction par l'aerylamide de la fluorescence (hE,e = ~90 rim, k~m = 340 rim). & pH 7,0 de l'hdmocya- nine d'A. australis en milieu ac~lale de sodium 0,1M (A) et ~ M (©), KBr 1 M ([3), KCI I M (0), citrate tri- sodique 1 M (A) et urde 8 M (V) el du trgptophane en milieu aedtate de sodium 0,1 M (V). Tou.tes l~s solu- tions eon ti,ennen~: en outre MgGl~ 5 mM et OaGl~ 3 raM.

BIOCH1MIE, 1976, 58, n ° 6.

E t u d e s t r u c t u r a l e de l ' h d m o c y a n i n e de s c o r p i o n . 685

I n h i b i t i o n de la [ luorescence par I 'acry lamide .

,Par addi t ion d'acryl,amide, i nh ib i t eu r de la fluorescence du noyau indolc [17j, nous avons suivi l 'accessibil i t6 des r6sidus t ryp tophane duns i 'h6nlocyanine d'A. australis. Cet inh ib i t eu r de fluorescence ne modifie ni ]es propri6t6s de diffu- sion de la lumibre, n i l e spectre d 'absurpt ion de la protbine.

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250 300 350 400 )~ (nrnl . . . . I

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FIG. 7. - - Spectres de dichroi'sme circulaire de l'hdmo- cyanine d'A. ausCralis en milieu aedtate de sodium 0,1 M, MgCI~ 5 raM, CaCl2 3 m M & pH 6,8 ( .), 3,5 ( - - . - - ) , 9,9 ( - - - - - - ) et en prdsence de citrate de sodium 1 M h pH 7,0 ( . . . . . . ).

Les r6sultats ont 6t6 analys6s selon l '6quation de Stern-Vo.lmer :

Fo/F = 1 + kT [Q]

off F o et F sont ]es intensit6s de fluo.reseenee Ine- sur6es en absence et en pr6sence d 'aerylamide, !Q] est ,la concent ra t ion en a,crylamide, x est te temps de vie moyen des esp~ces fluoreseentes et k la eonstante de vitesse d ' inh ib i t ion de fluores- cence.

Les droites obten,ues pour diff6'rentes condi t ions de mi l ieu (pH, ur6e, pr6s.ence d 'anions) sont don- n6es pa r la figure 6. La pente des droites, 6gale "~ k~ est d 'au tant plus grande que l 'aceessibil i t6 des r6si, dus t ryp tophane ~ l ' aery lamide est plus impor- tan're, l~lle c'rolt duns ] 'ordre duns des additifs su,iv.ants :

Ac6tate 0,1 M (pro.t6ine ¢ native >)) < Ac6.tate 1 M ( Br- < C1- < Citrate < Ur6e 8 M (grot6ine d6na- tu'r6e).

La conformat ion de la prot6ine est donc d'au- tant plus modifi6e que 1'on p.rogresse duns cette s6rie. Par contre en mil ieu ac6tate de sodium 0,1 M, quel que soit le pH entre 3,5 et 9,5 les droi- tes obtenues selon l 'analyse pr6c6dente sont con- fondues h la pr6.cision exp6rimentale prbs.

D I C H R O I S M E C I R C U L A I R E .

Le spectre de dichroisme circulaire duns la r6gion 190-¢50 n.m de l 'h6mocyanine d'A. australis • h pH neu.tre montre une large bande n6gative ca- ract6rist ique de la prot6ine oxyg6n6e centr6e h 339 nm. Une seconde bande n6gative, d ' intensi t6 plus faible, pr6sentant plusieurs min ima et 6paule- ments duns le domaine 250-300 nm correspond aux acides amin6s aromatiques et h la cyst ine (fig. 7). Enfin, duns la r6gion pept id ique on note une large bande n6gative pr6sentant un m i n i m u m h 210 nm et un 6paulement vers 220 nm, et une bande posi- tive dont le m a x i m u m est situ~ h 192 nm (fig. 8).

A pH alcalin, le spectre est peu diff6rent de celui obtenu h pH neutre ; seule la bande aromati- que est plus intense en valeur absotue. A pH acide, les var ia t ions par rappor t h pH neutre sont plus impor tantes : la bande h 339 nm a totalement dis, paru, l ' intensi t6 de la bande aromatique est plus faible (fig. 7). Ces deux modificat ions sont au moins en par t ie li6es : quand elle existe, la bande h 339 nm contr ibue au dichroisme duns la r6gion

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Fro. 8 . - S]aeetres de dichroi'sme circulaire dans la r~gion peptidzque de l'h~mocyanine d'A. australis en milieu acetate de sodium 0,1 M, MgClj 5 raM, CaC/, 3 mM 5 pH 6,8 ( ),, 3,5 ( - - . - - ) , 9,9 ( - - - - - - ) .

Eneart : Spectre exp6rimental ( .) et caleul6 (0) de l'h6moeyanine d'A. australis h pH 6,8.

280-300 n,m. La d ispar i t ion de la bande h 339 nm t ra ine don~c une diminu,tion de ]a bande aroma- tique.

A par t i r des spectres exp6rimen,taux obtenus entre 20,5 et 2.4.0 nm nous avons dbtermin6 par eaI- cul d 'un spectre th6orique (fig. 8) les fract ions des

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 6.

686 J.-J. Toulmd, F. Villa el M. Goyf fon.

diff6rentes s tructures secondaires dans l 'h6mocya- n ine h pH acide, neutre ou basique. Les r6sultats (28 p. cent d'h.61ice a et 33 p. cent de s t ructure ~) sont ident iques fi 2 p. cent pr6s quel que soit le pH.

Les var ia t ions de pH n ' e n t r a i n e n t donc pas de var ia t ion globale de la s t ructure secondaire de l 'h6mocyanine d'A. australis. Par contre les modi- fications observ6es clans la r6gion 2,50-300 nm in- d iquent des changements clans l ' env i ronnemen t des r6sidus aromatiques et la disp~ri t ion, h pH acide, de la bande ~ 339 nm montre que le site actif de ,la prot~ine es.t affect6.

Err pr6.sence des diff6rents sels utilis6s lors de l'~tt~de par fluorescence, le spectre de dichroisme circu,laire de l ' h6mocyanine varie peu. Les modifi- cations por tent essent iel lement sur la s t ructure de la bande aromatique. Avec le citrate, l ' in tensi t6 de la bande h 339 nm diminue tra, duisant une d6- soxyg6n.ation part iel le de l 'h,6mocyanine (fig. 7).

D~SCUSSION.

Les r6snltats de cette 6tude mon t ren t que l 'h6- mocyan ine d'A. australis 6met une fluorescence lorsque la longueur d 'onde d 'exci tat ion est situ6e darts la bande d 'absorpt ion dont le max imu m se trouve h 278 nm. Le d@~acement du max imum d'6anission de fluorescence avec la longueur d 'on- de d 'exci ta t ion sugg~re une con t r ibu t ion de la tyrosine ~t la fluorescence de la prot6ine. Si darts le cas de ~ 'h6mocyanine de Murex trunculus l '6mis- sion est due exclusivement au t ryp tophane [41, pour l 'h~mocyanine d 'un autre MoHusque (Levan- tina hierosolima) Shaklai et Daniel n ' exc luent pas une cont r ibu t ion de la tyros ine [3]. N6anmoins ces derniers ne signa]ent aucun,e modif icat ion du spectre d '6mission avec la ,longueur d 'onde d'exci- tat ion ; pour une excitat ion ~t 280 rim, le max i mum est situ6 ~ plus grande lo.ngueur d 'onde pour l'h~- mocyan ine de L. hierosolima (331 nm) que pour celle d'A. australis (317 nm). La contTibution des r6sidus tyrosine est dunc plus imp0r tante dans notre cas. I1 n 'est pas possible de dire sur ce seal exe,mple si 1.es c arac~t6ristiques de l '6mission de fluorescence const i tuent une propri6t6 dis t inct ive des h ~ o c y a n i n e s des deux embranchements .

Le spectre de dichroisme circulaire (dans la r6gion 200-450 nm) de l ' h6mocyanine d'A. austra- Its est ident ique h celui de l 'h,6mocyanine d 'un autre scorpion, Androctonus mauretanicus [8!, ef n.e diffbre de celui de l 'h6mo.cyanine d 'autres Arthropodes que par le max imum h 251 nm [18i. Ce max imum est posit if pour ]es h6mo.cyanines

6tudi6es par Nickerson et Van Ho.lde, n~gatif dans le cas des h61nocyanines de scorpion. La bande caract6rist ique du corrrplexe cuivre-oxygbne est centr6,e h 339 nm, valeur voisine de celle observ6e pour la l imule (340 nm) alors que pour d 'autres Arthropodes le m i n i m u m est situ6 h 335 nm [18]. Ceci souligne la parent6 phy.log6n6tique entre M6- rostomes et Arachnides. Le pourcentage des diff6- rentes s tructures secondaires diff6re notablement de ceux obten~as pour l 'h6nlocyanine d'H. pomatia [161 dans des condi t ions voisines (mats avec une m6thode .de calcul diff6rente) : 39 p. cent d'h61ice

ef 16 p. cent de s t ructure g au ~lieu de 28 p. cent et 3.3 p. cent respe,ctivement pour l ' h6mocyan ine d'A. australis. Ces pourcentages ne var ient ni avec le pH, ni lots de l 'ad.dition des diff6rents sels uti- lisbs au cours de cette 6rude.

L,es r6sidus t ryp tophane de la prot6inc sont re la t ivement in ternes comme en t6moignent d 'une par t la posi t ion du max in lmn d'6mission (331 nm sous excitat ion h 2,90 nm) et d 'autre par t ta faible valeu.r de la constante d ' inh ib i t ion par l ' acrylami- de. L 'augmenfa t ion de cette constante en pr6sence des ions CI-, Br- et citrate t radui t urre modificat ion conformat ionnel le de l 'b6mocyanine . En pr6sence de ci trate la valeur de cette constante est voisine de celle obtenue en mil ieu ur6e 8 M (fig. 6) don.c dans des condi t ions off la prot6ine esl d6natur6e. Les changements de conformat ion dus au pH de- meuren t tr6s localis6s : bien qu 'en dichroisme cir- cu~aire la baude cara,ct6ristique des acides amin6s aromatiques varie, la constante d ' i nh ib i t ion de fluorescence par l ' acry lamide est ind6pendan te du pH.

La s t ructure quaternai re de la mol6cule d'h$- mocyan ine d'A. australis est sensible au pH et h la pv6sence des anions. Dans les condi t ions de notre 6tude (ac6tate de sodium 0,1 M, M gCIu 5 raM, CaO12 3 mM) ~a mol6cule est stable de pH 5,5 h pH 9,0. A pH alcalin on observe une agr6gation de la prot6ine alors qu 'on note une dissociat ion pa'rt ir de pH 4,5, pH au voisina.ge duquel tes grou- pements carboxy~es des chaines lat6rales des a,ci- des aspart ique et glutamique sont proton6s. Or ces deux r6sidus cons t i tuent envi ron 29 p. cent en hombre des acides amin6s des h6mocyanines de composi t ion connue [10]. On peut r emarquer que la tat,He moyenne des produi ts de dissociat ion de l ' h6mocyan ine h pH acide est sup6rieure & celle des produi ts de d6natura t ion de la prot6ine par l'u,r6e 8 M (les rappor ts D/Do sont respect iveinent 6gaux h 0,2,5 et 0,14).

La dest ruct ion de la s t ructure quaterna i re de l ' h6mocyanine lots de l ' addi t ion de diff6rents sels n 'est pas due h u n effet de force ionique mats d6-

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E t u d e s t r u c t u r a l e de l ' h d m o c y a n i n e de scorp ion . 687

pend de la nature de l 'anion. Faible avec les ions ac6tate et chlorure la dissociat ion de ]a prot6ine est plus impor tan te avec les ions bromure , iodure et citrate. On ne pent pr6c iser si cette dissociat ion est ,li6.e au pouvoi r chao t rop ique des anions [19, 29] o u s i elle r6sulte d 'une in te rac t ion directe de ces ions avec cer ta ins groupements de la prot6ine. Dans ce dern ie r cas, comp~e tenu des rappor ts de concent ra t ion h6mocyan ine / se l n6cessaires pour observer un effet, la constante de fixation dolt Ore faible. Les r6sultats observ6s avec les halog6nnres sont comparables h ceux obtenus pour l 'h6mocya- nine d'H. pomatia par Enge,l~borghs et Lont ie [16]. L' import .ance des effets obtenus en pr6sence de ci t ra te peut su rprendre , ceci n ' ayant jusqu'h pr6- sent 6t6 signal6, pour aucune h6mocyanine . Cet ion susceptible de complexer le ca lc ium et le ma- gn6sium pour ra i t en t ra iner une d6stabil isation de la prot6ine. Cependant, des mesures analogues r6a- lis6es en mil ieu phosphate d isodique h pH 7,0 out condui t ~ des effets beancoup moths imt)ortants pour l ' h6mocyanine bien que cet ion complexe 6galement Ca ÷÷ et Mg% L 'ampl i tude des modif ica- t ions s t ructurales observ6es en pr6sence de c i t ra te ne peut donc 6tre un iquement imput6e h u n effet ind i rec t de complexat ion du ca lc ium et du ma- gn6sium. Par contre on ne peut exclure une com- p6ti t ion entre le citrate, por teur des trois fonc- t ions carboxyles et les chaines lat6ra,les des r6si- dus aspartate et glutamate,

Les var ia t ions de pH et de composi t ion du mi- lieu en t ra inent ~galement (d i rec tement ou indi rec- tement) des modif icat ions du site actif de la pro- t6ine. En presence d'ur~e 8 M, de ci trate t r isodi- que 1 M, de b romure ou d ' iodure de potass ium 1 M on observe une d iminut ion ( respect ivement 85, 55, 45 et 4.5 p. cent) de la bande d 'absorpt ion 339 nm, caract6r is t ique de 1.a pro,t~ine oxyg6n~e. Cette d6soxyg6nation par t ie l le de la p.rot6ine pour- rai t 6tre due h une modi f ica t ion conformat ionnel le de l 'h6mocyanin.e ent ra inant un 6,1oignemen,t des grot~pements - - v ra i semblab lement des r6sidus h is t id ine [21, 22~ - - por teurs des. deux cuivres n6cessaires h la f ixation d 'une mol.6cule d 'oxyg~ne. La dispart l ion totale de la bande h 339 nm h pH acide ( ~ 4) pour ra i t r6sttlter de ]a destruct ion du complexe cu ivre-h is t id ine par suite de la protona- t ion de l 'azote li6 au m6tal.

La d6soxyg6nation est responsable, au moins en part ie, de l ' augmenta t ion du r endemen t de fluores- cence de l ' h6mocyanine d'A. australis. I1 a 6t6 montr6 pour deux Mo]lusques que le r endemera de f luorescence de l ' h6mocyanine est quatre fois plus faible que celui de l ' apoh6mocyan ine et de la d6soxyh6mocyanine [3, 4]. Ceci a 616 attribu6 h u n

t ransfer t d '6nergie du noyau indole vers le grou- pement Cu...O I3] et (ou) h l ' augmenta t ion du ren- dement de convers ion in~tersys't&ne siaagttlet-tri- p'let du t ryp tophane par l 'oxygbne fix6 au site actif [4j. Cependant l ' augmenta t ion de fluores- cence peut 6galement 61re due h u n 61oignement de cer tains r6si,dus t ryp tophane du site de fixation de l 'oxygbne par suite du changement de confor- mat ion de l 'h6moeyanine . C'est no tamment le cas en mi l ieu ur6e 8 M. En effet l ' augmenta t ion de fluores,cence est de m6me ampl i tude dans ce mi- lieu et pour la prot~ine h pH 3. Or ~ ce pH la bande h 339 nm a totalement d i sparu aiors qu 'e l le subsiste (15 p. cent) en pr6sence d'ur6e.

Remerciements.

Nons remerdons M. J. C. Maurizot (Centre d~e Bio- physique lV~ol6cul~aire, Od6ans) qu.i a mis h notre dis- position le dichrograpl~e et le programme de ealeul 4es fractions des diff6rentes structures seeondaires des prot~in, es. Nous remercions ~g,alem,ent M. C. H~l~ne, pour la lecture critique d,u manuscrit.

R~SUM~.

Les modifications s~trueturales de l'h6mocyanine de scorpion cons~cutives h des variations des conditions de milieu ont ~t~ suivies par spectroscopic d'absorption et de fluorescence, par diehroisme eircu~aire et par diffusion de la lumi~re. Le spectre de fluorescence mon.tre une contribution de 1.a tyrosine h 1'6mission d,e l a prot6ine native. Le ce.ndem,e.nt de fluorescence de l'h6mocyanine d6soxyg6n6e ou d6natur~e par l'ur6e est 4,5 fois plus ~l,ev6 que celui de l'h6mocyanine native. Les variations du pH entrainent, du c6t6 acide une modification d~u site de. fixation de l'oxyg6ne et une dissociation de la mol,6cule et du c616 alcalin une agr6- gation de la prot6ine. La structure quaternaire de l'h6mocyanine est 6galement sensible h la pr6senee dans le milieu de divers anions (bromure, iodure, citrate). Au contraire la structure seeo~ndaire n'est pas affect6e par ces modifications d u milieu corn, me ie montre la d~termination des diffdrentes fractions (h~lice c~, chaine ~) ,effeotu6e h partir de la bande pepti- dique d.u spectre d,e dichroisme circulaire, spectre qui pr6ser~te par ailleurs 1,es bandes caract~ristiques des h6macyaniaes d'Arthropodes.

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