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La centrifugation
L’électrophorèse
La chromatographie
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LA SÉPARATION DE MOLÉCULESLA SÉPARATION DE MOLÉCULES
PRINCIPE DE LA CENTRIFUGATIONPRINCIPE DE LA CENTRIFUGATION
Séparation de particules sous l’action d’un champ de gravitation.
Technique principalement préparative.
Après centrifugation, la partie située dans le fond du tube est appelée culot de centrifugation et la partie supérieure est appelée surnageant.
LE MATÉRIEL DE CENTRIFUGATIONLE MATÉRIEL DE CENTRIFUGATION
Un moteur capable de tourner à plusieurs dizaines de milliers de tours par minute.
Un rotor capable de supporter de telles vitesses.
Une enceinte réfrigérée, sous vide et blindée.
Jusqu’à 20 000 x g, on parle de centrifugeuse.
Au delà de 20 000 x g on parle d’une ultracentrifugeuse.
EXEMPLES DE ROTORSEXEMPLES DE ROTORS
Rotor à angle fixe
Rotor àgodets oscillants
LA FORCE CENTRIFUGELA FORCE CENTRIFUGE
La force centrifuge relative (F.C.R.) est exprimée en multiple de l’accélération terrestre (g).
F.C.R. (g) = 1,12 r n2
r : rayon de centrifugation exprimé en mmn : nombre de tours par minutes /1000
SÉDIMENTATION D’UNE PARTICULESÉDIMENTATION D’UNE PARTICULE
La sédimentation d’une particule dans un liquide, sous l’action d’un champ de gravitation, obéit à la relation suivante :
V = kµ
d2 (ρp−ρs) γ
V : vitesse de sédimentation
k : facteur de proportionnalité
d : diamètre de la particule
(ρp−ρs) : différence de densité entre la particule et le solvantµ : viscosité
γ : champ de gravité
Suivant le rapport de densité entre les particules à séparer et le solvant dans lequel elles se trouvent, on distinguera trois principes de centrifugation :
- la centrifugation différentielle ou culottage,
- la centrifugation zonale,
- la centrifugation à l’équilibre (isopycnique).
SCHÉMA DE LA CENTRIFUGATION DIFFÉRENTIELLE
SCHÉMA DE LA CENTRIFUGATION DIFFÉRENTIELLE
Centrifugationmoyenne vitesse
Centrifugationgrande vitesse
Centrifugationbasse vitesse
Surnageant Surnageant
::::::::::::::::::::
::::::::::::::::
::::::::::::::::
::::::::::::::::
:::::::::::::::: :::::::::
Particules de forte densitéParticules de moyenne densité
Particules de faible densité.
EXEMPLE DE CENTRIFUGATION DIFFÉRENTIELLEEXEMPLE DE CENTRIFUGATION DIFFÉRENTIELLE
Tissu de foie de rat homogénéisé
600 x g 5 minutes
Culot n°1noyaux, cellules, débris
Surnageant n°120 000 x g 20 minutes
Culot n°2mitochondries, lysosomes et peroxysomes
Surnageant n°2100 000 x g 1 heure
Culot n°3Microsomes
Fraction microsomale
Surnageant n°3Fraction cytosolique
150 000 x g 3 heures
Surnageant n°4Protéines solubles
Culot n°4Ribosomes
SCHÉMA DU LAVAGE DES CULOTSSCHÉMA DU LAVAGE DES CULOTS
Centrifugation CentrifugationCentrifugation
Culot remis en suspension Culot remis en suspension
SCHÉMA DE LA CENTRIFUGATION ZONALESCHÉMA DE LA CENTRIFUGATION ZONALE
Mélange de composés de densités différentes
Gra
dien
t d’in
tens
itéde
sucr
ose Centrifugation
Récupérationdes échantillons
EXEMPLE DE CENTRIFUGATION ZONALEEXEMPLE DE CENTRIFUGATION ZONALE
Mélange d’organites cellulaires
Lysosomes
Mitochondries
Peroxysomes
Gra
dien
t d’in
tens
ité d
e su
cros
e
Centrifugation
LA CENTRIFUGATION À L’ÉQUILIBRE(CENTRIFUGATION ISOPYCNIQUE)
LA CENTRIFUGATION À L’ÉQUILIBRE(CENTRIFUGATION ISOPYCNIQUE)
Centrifugation
Gra
dien
t de
dens
itédu
solv
ant
Mélangesolvant - particules
Exemple : séparation de fragments d’ADN en gradient de chlorure de césium
L’ÉLECTROPHORÈSEL’ÉLECTROPHORÈSE
- Séparation de particules sous l’action d’un champ électrique.
- Technique principalement analytique mais qui peut être également utilisée comme technique préparative.
SCHÉMA D’UN MONTAGE D’ÉLECTROPHORÈSE
SCHÉMA D’UN MONTAGE D’ÉLECTROPHORÈSE
Solution tampon
+ -Anode CathodeGénérateur de courant
Support d’électrophorèse
LES DIFFÉRENTS SUPPORTS D’ÉLECTROPHORÈSELES DIFFÉRENTS SUPPORTS D’ÉLECTROPHORÈSE
Les supports solides :
- feuille de papier- feuille d’acétate de cellulose
Les supports sous forme de gels :
- polyacrylamide- agarose
ÉLECTROPHORÈSES SUR SUPPORTS SOLIDESÉLECTROPHORÈSES SUR SUPPORTS SOLIDES
- Séparation des protéines.
- Electrophorèses en conditions non dénaturantes.
- Migration des molécules principalement en fonction de leur charge globale.
SÉPARATION DES PROTÉINES DU SÉRUM SUR ACÉTATE DE CELLULOSE
SÉPARATION DES PROTÉINES DU SÉRUM SUR ACÉTATE DE CELLULOSE
Tampon pH 9,2 ; migration 40 minutes sous 180 Vrévélation par coloration des protéines au noir amido.
Globulines γ Globulines α
- +
Globulines βDépôt Albumine
ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE
ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE
Concerne exclusivement la séparation des protéines.
Migration des molécules en fonction de leur charge globale, de leur taille et de leur forme.
Electrophorèses sont possibles en conditions dénaturantes ou non dénaturantes.
Elles sont essentiellement utilisées en conditions dénaturantes.
On parle alors d’électrophorèses SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis).
L’ÉLECTROPHORÈSE SDS-PAGE
L’ÉLECTROPHORÈSE SDS-PAGE
Traitement des échantillons par :
- du Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) qui est un détergent anionique. Ce composé dénature les protéines et les enrobe de charges négatives.
− du β mercaptoéthanol qui est un agent réducteur. Ce composé entraîne la rupture des ponts disulfures.
Suppression des facteurs forme et charge.
Séparation des protéines uniquement en fonction de leur taille.
ACTIONS DU SDS SUR LES PROTÉINES EN PRÉSENCE DE β MERCAPTOÉTHANOL
ACTIONS DU SDS SUR LES PROTÉINES EN PRÉSENCE DE β MERCAPTOÉTHANOL
Sur une protéine constituée d’un seule chaîne polypeptidique
SH
SH
SS
+ β mercaptoéthanol
Chaînes polypeptidiques dénaturées et entourées
de SDS chargénégativement
Sur une protéine constituée de deux chaînes polypeptidiques
SH
+ SDSSH
+ β mercaptoéthanol
S
S
MIGRATION LORS D’UNE ÉLECTROPHORÈSE SDS-PAGE
MIGRATION LORS D’UNE ÉLECTROPHORÈSE SDS-PAGE
Sens
de
mig
ratio
n. ... . .. .
. ... ... .
Gel depolyacrylamide
Mélange de protéines dénaturées et toutes chargées négativement
par la présence de SDS.
Séparation en fonction de la taille
Grande taille
Petite taille
MATÉRIEL POUR UNE ÉLECTROPHORÈSE SDS-PAGE
MATÉRIEL POUR UNE ÉLECTROPHORÈSE SDS-PAGE
+
-
Réservoir inférieur de tampon
Sens
de
mig
ratio
n
Anode
Puits de dépôt des échantillonsCathode
Réservoir supérieur de tampon
Échantillons
Gel de polyacrylamidecoulé entre deux plaques de verre
RÉVÉLATION DES PROTÉINES PRÉSENTES SUR LE GEL
La visualisation de l’ensemble des protéines présentes dans le gel se fait par coloration.La coloration est effectuée dans la majorité des cas avec du bleu de Coomassie. Il est également possible de colorer les protéines présentes avec de l’argent.
Afin de visualiser uniquement la présence de certaines protéines, il est possible d’utiliser des anticorps marqués qui reconnaissent de manière spécifique ces protéines. Pour ce faire il est nécessaire de transférer les protéines sur une membrane de nitrocellulose (Western blot). Ce support, plus solide que les gels, permet une manipulation plus aisée.
EXEMPLE DE GEL DE POLYACRYLAMIDE COLORÉ AU BLEU DE COOMASSIE
EXEMPLE DE GEL DE POLYACRYLAMIDE COLORÉ AU BLEU DE COOMASSIE
ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL D’AGAROSEÉLECTROPHORÈSE SUR GEL D’AGAROSE
Concerne la séparation de fragments d’acides nucléiques.
Les facteurs formes et charges n’interviennent plus car les fragments d’acides nucléiques sont naturellement tous sous forme linéaire et chargés négativement.
Migration des molécules sur le même principe que ce qui a été décrit pour les protéines dans un gel de polyacrylamide.
Séparation directement en fonction de la taille.
PRINCIPE GÉNÉRAL DE LA CHROMATOGRAPHIEPRINCIPE GÉNÉRAL DE LA CHROMATOGRAPHIE
Système à deux phases, une phase stationnaire et une phase mobile.
Les molécules à séparer sont entraînées par la phase mobile au travers de la phase stationnaire.
On peut regrouper les techniques de chromatographie en deux catégories :
- les chromatographies de partage
- les chromatographies d’adsorption.
PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGEPRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
Il s’agit d’un système où les molécules sont entraînées plus ou moins vite par la phase mobile au travers de la phase stationnaire en fonction du bilan de leurs interactions avec les deux phases.Au bout d’un temps suffisamment long, toutes les molécules auront traversé la phase stationnaire et pourront être récupérées.
Les deux phases peuvent être identiques (liquide-liquide) ou différentes (solide-liquide), (liquide-gaz).
EXEMPLES DE CHROMATOGRAPHIES DE PARTAGEEXEMPLES DE CHROMATOGRAPHIES DE PARTAGE
La chromatographie sur couche mince.
La chromatographie sur papier.
La chromatographie en phase gazeuse (C.P.G.).
La chromatographie d’exclusion.
CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIERCHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER
Chromatographiedescendante
ChromatographieAscendante
Solvant
Phase stationnaire(support papier)
Solvant
Dépôtd’échantillon
Dépôtd’échantillon
Dépôt
Front du solvant après migration
d
d1
d2
Rf 1= d1/dRf 2= d2/d
Rf = coefficient de migrationCe paramètre est caractéristique d ’une molécule dansdes conditions expérimentales données
Avant migration
Après migration
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSECHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
DétecteurInjecteurDétendeur
Réserve de gaz vecteur(phase mobile)
Injection des échantillons
Identification des composés détectés
Colonne
CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSIONCHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION
. . . ....
. ....
.. .. .
..
............
..... . ....
..
.
Volume d’élution
Qua
ntité
de
prot
éine
s
Molécules de grandes tailles
Molécules de petites tailles
PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE D’ADSORPTIONPRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE D’ADSORPTION
Ils s’agit d’un système où les molécules qui ont une affinité pour la phase stationnaire y restent accrochées (adsorbées).Les molécules sans affinité pour la phase stationnaire sont entraînées par la phase mobile, elles traversent entièrement la phase stationnaire et peuvent être récupérées.
Une chromatographie d’adsorption se déroule donc en deux temps. Tout d’abord l’adsorption des molécules ayant une affinité pour la phase stationnaire et ensuite la désorption de ces molécules.Cette deuxième étape est réalisée en utilisant une nouvelle phase mobile (solution d’élution) dont les propriétés physico-chimiques vont permettre de décrocher les molécules fixées et de les récupérer.
Les chromatographies d’adsorption sont essentiellement réaliséesen colonne.
SCHÉMA D’UNE CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNESCHÉMA D’UNE CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE
Réserve de solvantphase mobile
Phase stationnaire
Migration de la phase mobile
Récupération de la phase mobile
EXEMPLES DE CHROMATOGRAPHIE D’ADSORPTIONEXEMPLES DE CHROMATOGRAPHIE D’ADSORPTION
La chromatographie sur colonne échange d’ions
La chromatographie sur colonne d’affinité.
SCHÉMA D’UNE CHROMATOGRAPHIE ÉCHANGEUSE D’ANIONSSCHÉMA D’UNE CHROMATOGRAPHIE ÉCHANGEUSE D’ANIONS
+++
++
++
+
+
+
++
+
+
++
++
++
Étape 1Dépôt de l’échantillon
Étape 2Adsorption des molécules
Étape 3Élution des molécules adsorbées
Qua
ntité
de
prot
éine
s
Protéines non fixées
Protéines faiblement fixées
Protéines fortement fixées
Gradient NaClProtéines cationniques
Protéines faiblement anioniques
Protéines fortement anioniques
Volume d’élution
SCHÉMA D’UNE CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITÉSCHÉMA D’UNE CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITÉ
Dépôt du mélange de protéines Fixation spécifique des protéines sur le ligand
Elution par addition de ligand libre
Ligand immobilisé sur un support insoluble présent dans la phase stationnaire
Qua
ntité
de
prot
éine
s
Protéines non fixéesPartie insoluble de la
phase stationnaire
Protéines fixées
Volume d’élution
