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TD n°2TD n°2
ChromatographieChromatographie
PRINCIPE : PRINCIPE :
La chromatographie, méthode d'analyse physico-chimique, La chromatographie, méthode d'analyse physico-chimique,
sépare les constituants d'un mélange (les solutés) par entraînement sépare les constituants d'un mélange (les solutés) par entraînement
au moyen d'une phase mobile (liquide ou gaz) le long d'une phase au moyen d'une phase mobile (liquide ou gaz) le long d'une phase
stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la (ré)partition sélective stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la (ré)partition sélective
des solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis des solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis
à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une
force de mobilité (due à la phase mobile).force de mobilité (due à la phase mobile).
LES DIFFERENTS TYPES DE TECHNIQUES LES DIFFERENTS TYPES DE TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES :CHROMATOGRAPHIQUES :
Classification des chromatographies en fonction des Classification des chromatographies en fonction des
mécanismes de séparation :mécanismes de séparation :
Les facteurs qui interviennent dans le partage des molécules Les facteurs qui interviennent dans le partage des molécules
à séparer entre les phases fixe et mobile sont : la solubilité dans à séparer entre les phases fixe et mobile sont : la solubilité dans
un solvant liquide, la taille (la forme), la polarité, la charge un solvant liquide, la taille (la forme), la polarité, la charge
électrique, la présence de groupements d'atomes formant des électrique, la présence de groupements d'atomes formant des
sites particuliers. Les différents types de chromatographie sites particuliers. Les différents types de chromatographie
résultent du fait que l'on a privilégié l'effet de l'un de ces facteurs, résultent du fait que l'on a privilégié l'effet de l'un de ces facteurs,
mais l'exclusivité d'un mécanisme n'est jamais totale au cours mais l'exclusivité d'un mécanisme n'est jamais totale au cours
d'une séparation chromatographique.d'une séparation chromatographique.
1/ CHROMATOGRAPHIES EN PHASE LIQUIDE 1/ CHROMATOGRAPHIES EN PHASE LIQUIDE
(CPL) : (CPL) :
La phase mobile est un liquide. Selon la nature de la phase La phase mobile est un liquide. Selon la nature de la phase
stationnaire, on distingue :stationnaire, on distingue :
1-1/ Les chromatographies de PARTAGE :1-1/ Les chromatographies de PARTAGE :
La chromatographie de partage :La chromatographie de partage :
C'est une chromatographie liquide-liquide. La phase stationnaire C'est une chromatographie liquide-liquide. La phase stationnaire
est un liquide fixé sur un support inerte. Cette chromatographie est est un liquide fixé sur un support inerte. Cette chromatographie est
ainsi dénommée car elle est basée sur le partage du soluté dans les ainsi dénommée car elle est basée sur le partage du soluté dans les
deux phases liquides (deux phases liquides (chromatographie sur papierchromatographie sur papier).).
La chromatographie d'exclusion :La chromatographie d'exclusion :
Elle est encore appelée chromatographie d'exclusion-diffusion, Elle est encore appelée chromatographie d'exclusion-diffusion,
tamisage moléculaire, gel de filtration, perméation de gel. La phase tamisage moléculaire, gel de filtration, perméation de gel. La phase
stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont
exclues de la phase fixe, en revanche les petites particules incluses exclues de la phase fixe, en revanche les petites particules incluses
diffusent dans les pores du gel.diffusent dans les pores du gel.
1-2/ Les chromatographies d'ADSORPTION :1-2/ Les chromatographies d'ADSORPTION :
La chromatographie d'adsorption :La chromatographie d'adsorption :
C'est une chromatographie liquide-solide. La phase stationnaire C'est une chromatographie liquide-solide. La phase stationnaire
est un adsorbant solide polaire.est un adsorbant solide polaire.
La chromatographie sur échangeurs d'ionsLa chromatographie sur échangeurs d'ions : :
La phase stationnaire est un échangeur d'ions constitué par une La phase stationnaire est un échangeur d'ions constitué par une
résine porteuse de groupements ionisés négativement ou résine porteuse de groupements ionisés négativement ou
positivement, exerçant des interactions de type électrostatique avec positivement, exerçant des interactions de type électrostatique avec
les solutés ioniques du milieu.les solutés ioniques du milieu.
La chromatographie d'affinité :La chromatographie d'affinité :
La phase stationnaire est un support macromoléculaire La phase stationnaire est un support macromoléculaire
chimiquement inerte, sur lequel est greffé un effecteur qui présente chimiquement inerte, sur lequel est greffé un effecteur qui présente
une affinité biologique (bio-affinité) pour un soluté de l'échantillon à une affinité biologique (bio-affinité) pour un soluté de l'échantillon à
analyser (affinité enzyme-substrat, ligand-récepteur, antigène-analyser (affinité enzyme-substrat, ligand-récepteur, antigène-
anticorps). anticorps).
2-2/ Les chromatographies en phase 2-2/ Les chromatographies en phase
GAZEUSE (CPG) :GAZEUSE (CPG) :
La phase mobile est un gaz vecteur. On distingue dans ce cas: La phase mobile est un gaz vecteur. On distingue dans ce cas:
La chromatographie gaz-liquide :La chromatographie gaz-liquide :
C'est une chromatographie de partage. La phase stationnaire est C'est une chromatographie de partage. La phase stationnaire est
un liquide fixé par imbibition d'un support inerte.un liquide fixé par imbibition d'un support inerte.
La chromatographie gaz-solide :La chromatographie gaz-solide :
C'est une chromatographie d'adsorption. La phase stationnaire C'est une chromatographie d'adsorption. La phase stationnaire
est un solide adsorbant.est un solide adsorbant.
1/ Chromatographie sur papier :1/ Chromatographie sur papier :
Extraction et Extraction et
séparation des pigments:séparation des pigments:
Les chlorophylles et les Les chlorophylles et les
caroténoïdes sont solubles caroténoïdes sont solubles
dans des solvants organiques dans des solvants organiques
et peuvent donc être séparés à et peuvent donc être séparés à
l'aide de solvants ou de l'aide de solvants ou de
mélanges de solvants des mélanges de solvants des
lipides. Ces molécules sont lipides. Ces molécules sont
dites liposolubles.dites liposolubles.
Extraction des pigments bruts :Extraction des pigments bruts :
La feuille est broyée dans de l'alcool absolu ou de l'acétone. Les La feuille est broyée dans de l'alcool absolu ou de l'acétone. Les
pigments solubles dans les solvants organiques sont extraits. Après pigments solubles dans les solvants organiques sont extraits. Après
filtration pour éliminer les débris cellulaires, on obtient une solution filtration pour éliminer les débris cellulaires, on obtient une solution
brute de pigments.Il est alors possible de séparer les différents brute de pigments.Il est alors possible de séparer les différents
pigments de la solution brute. Une méthode simple, essentiellement pigments de la solution brute. Une méthode simple, essentiellement
qualitative, peut être réalisée par une chromatographie sur papier.qualitative, peut être réalisée par une chromatographie sur papier.
on dépose une goutte de on dépose une goutte de
pigments bruts sur une feuille de pigments bruts sur une feuille de
papier. On place la feuille de papier papier. On place la feuille de papier
dans un récipient hermétique dans dans un récipient hermétique dans
lequel on a placé un solvant lequel on a placé un solvant
approprié. Le solvant monte dans la approprié. Le solvant monte dans la
feuille par capillarité en entraînant feuille par capillarité en entraînant
les pigments de manière les pigments de manière
différentielle selon leur affinité avec différentielle selon leur affinité avec
le solvant. On peut distinguer ainsi le solvant. On peut distinguer ainsi
deux catégories principales de deux catégories principales de
pigments : les chlorophylles pigments : les chlorophylles
(vertes) et les caroténoïdes (jaunes). (vertes) et les caroténoïdes (jaunes).
2/2/ Chromatographie sur couche mince:Chromatographie sur couche mince:
Ce type de chromatographie est utilisée pour séparer des Ce type de chromatographie est utilisée pour séparer des
composants dans un but d'analyse (CCM analytique) ou de composants dans un but d'analyse (CCM analytique) ou de
purification (CCM préparative).purification (CCM préparative).
On trace un trait horizontal (la On trace un trait horizontal (la ligne de baseligne de base) à environ 1 cm du ) à environ 1 cm du
bas de la plaque de CCM. Les marques D, B et M représentent bas de la plaque de CCM. Les marques D, B et M représentent
respectivement le produit de Départ, le Brut réactionnel et le respectivement le produit de Départ, le Brut réactionnel et le
point Mixtepoint Mixte (un mélange de D et B). Le point mixte permet de (un mélange de D et B). Le point mixte permet de
mieux visualiser les taches lorsqu'elles sont très proches ou mieux visualiser les taches lorsqu'elles sont très proches ou
lorsque l'étape d'élution est imparfaite.lorsque l'étape d'élution est imparfaite.
On dépose, à l'aide d'un capillaire ou d'une micro-seringue, une On dépose, à l'aide d'un capillaire ou d'une micro-seringue, une
petite quantité d'une solution du produit de départ sur les marques petite quantité d'une solution du produit de départ sur les marques
D et M et une petite quantité du brut réactionnel sur les marques B et D et M et une petite quantité du brut réactionnel sur les marques B et
M. Dans cet exemple, le produit de départ est incolore (cercle en M. Dans cet exemple, le produit de départ est incolore (cercle en
pointillé) alors que le brut réactionnel est légèrement coloré. pointillé) alors que le brut réactionnel est légèrement coloré.
On place la plaque de CCM dans une cuve contenant l'éluant On place la plaque de CCM dans une cuve contenant l'éluant
(environ 5 mm). Le solvant monte le long de la plaque par capillarité. (environ 5 mm). Le solvant monte le long de la plaque par capillarité.
Lorsqu'il arrive presque en haut de la plaque, on sort celle-ci de la Lorsqu'il arrive presque en haut de la plaque, on sort celle-ci de la
cuve et on laisse l'éluant s'évaporer. Ici, on ne voit que les taches 3 cuve et on laisse l'éluant s'évaporer. Ici, on ne voit que les taches 3
et 5 puisque les autres sont incolores. On observe que la tache 5 n'a et 5 puisque les autres sont incolores. On observe que la tache 5 n'a
que très légèrement migré au-dessus de la ligne de base. que très légèrement migré au-dessus de la ligne de base.
Pour visualiser les différentes taches, on commence par Pour visualiser les différentes taches, on commence par
placer la plaque sous une lampe UV à 254 nm. La plaque apparaît en placer la plaque sous une lampe UV à 254 nm. La plaque apparaît en
vert fluorescent et les produits qui absorbent les UV apparaissent vert fluorescent et les produits qui absorbent les UV apparaissent
sous forme de taches sombres. On utilise cette méthode de sous forme de taches sombres. On utilise cette méthode de
détection en priorité car elle n'endommage pas la plaque. Dans cet détection en priorité car elle n'endommage pas la plaque. Dans cet
exemple, on voit que le brut réactionnel contient encore du produit exemple, on voit que le brut réactionnel contient encore du produit
de départ (tache 4) mais la taille de la tache indique qu'il y en a de départ (tache 4) mais la taille de la tache indique qu'il y en a
moins qu'en début de réaction. On observe la formation d'au moins moins qu'en début de réaction. On observe la formation d'au moins
trois nouveaux produits (1, 2 et 5) : 1 et 2 sont moins polaires que le trois nouveaux produits (1, 2 et 5) : 1 et 2 sont moins polaires que le
produit de départ, et 5 est plus polaire. Il semble que le produit 5 est produit de départ, et 5 est plus polaire. Il semble que le produit 5 est
majoritaire dans le brut réactionnel (le produit 2 est beaucoup moins majoritaire dans le brut réactionnel (le produit 2 est beaucoup moins
visible) mais tous les produits ne révèlent pas avec la même visible) mais tous les produits ne révèlent pas avec la même
intensité aux UV. intensité aux UV.
On plonge la plaque dans une solution acide de vanilline (il On plonge la plaque dans une solution acide de vanilline (il
existe de nombreux autres révélateurs) et l'on chauffe la plaque existe de nombreux autres révélateurs) et l'on chauffe la plaque
jusqu'à ce que des taches colorées apparaissent. Ici on observe un jusqu'à ce que des taches colorées apparaissent. Ici on observe un
autre produit (3) qui n'était pas visible aux UV. La tache 1 est à peine autre produit (3) qui n'était pas visible aux UV. La tache 1 est à peine
visible ; elle l'était beaucoup plus sous lampe UV. La surprise vient visible ; elle l'était beaucoup plus sous lampe UV. La surprise vient
de la tache 2 : elle n'était que faiblement visible en UV mais elle de la tache 2 : elle n'était que faiblement visible en UV mais elle
révèle très intensément avec la vanilline. Il est fort possible que ce révèle très intensément avec la vanilline. Il est fort possible que ce
soit le produit majoritaire de la réaction et non le produit 5 comme le soit le produit majoritaire de la réaction et non le produit 5 comme le
laissait comme le laissait supposer la détection UV.laissait comme le laissait supposer la détection UV.
3/ Chromatographie de gel de filtration ou tamis 3/ Chromatographie de gel de filtration ou tamis moléculaire ou d’exclusion stérique:moléculaire ou d’exclusion stérique:
Ce type de Ce type de
chromatographie permet de chromatographie permet de
séparer les protéines et de séparer les protéines et de
déterminer leurs masses molaires. déterminer leurs masses molaires.
Pour cela, il faut calibrer le gel et Pour cela, il faut calibrer le gel et
obtenir une droite de calibration.obtenir une droite de calibration.
Un mélange de protéines Un mélange de protéines
standards de masses molaires standards de masses molaires
connues sont séparées dans les connues sont séparées dans les
mêmes conditions que les mêmes conditions que les
protéines de l’échantillon (Figure). protéines de l’échantillon (Figure).
Exemple:Exemple: thyroglobuline (669 kDa), ferritine (440 kDa), thyroglobuline (669 kDa), ferritine (440 kDa),
catalase (232 kDa), lactate déshydrogénase (140 kDa) et albumine catalase (232 kDa), lactate déshydrogénase (140 kDa) et albumine
(66 kDa). Le profil d’élution est tracé après mesure d’absorbance (66 kDa). Le profil d’élution est tracé après mesure d’absorbance
à 280 nm des fractions éluées. à 280 nm des fractions éluées.
le volume d’élution Ve de chaque protéine de référence est le volume d’élution Ve de chaque protéine de référence est
déterminé.déterminé.
le bleu Dextran (2.106 Da) permet de déterminer le volume le bleu Dextran (2.106 Da) permet de déterminer le volume
mort Vo du gel.mort Vo du gel.
La droite de calibration est : Ve/Vo = f (log PM) (figure ci-La droite de calibration est : Ve/Vo = f (log PM) (figure ci-
dessous).dessous).
Les protéines de l’échantillon sont ensuite séparées dans Les protéines de l’échantillon sont ensuite séparées dans
les mêmes conditions et l’absorbance à 280 nm des fractions les mêmes conditions et l’absorbance à 280 nm des fractions
éluées est mesurée. Par comparaison avec la droite étalon, on éluées est mesurée. Par comparaison avec la droite étalon, on
peut ainsi déterminer la masse molaire des protéines.peut ainsi déterminer la masse molaire des protéines.
