Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella

suis

Les bactéries Gram négatives possèdent plusieurs systèmes pour transférer le matériel génétique.

L’un de ces mécanismes est le système de conjugaison.

Ce mécanisme a été détourné par différentes bactéries pour d’autres transferts de macromolécules que

celui de matériel génétique = système de sécrétion de type IV

Echantillon des systèmes de sécrétion de type IV

(Covacci et al, 1999)

Schéma hypothétique du système de sécrétion de type IV chez Agrobacterium tumefaciens

IM

OM

PP

ext.

CP

B 7

B9

B 7

B9

SS

S

S

B4NTPB6

D4B3

NTP

B8 B11

NTP

B5 B5

B10

B2

Les composants du système de sécrétion sont codés par un opéron nommé virB

(Covacci et al, 1999)

B1

La bactérie d ’intérêt dans ce travail est Brucella suis.

- Coccobacille Gram-négatif - Zoonose affectant quelquefois l ’homme. - Pathogène intracellulaire - Famille des -2 Protéobactériacées comme Agrobacterium tumefaciens

Cette bactérie se développe, in vitro, dans les cellules HeLa et dans les macrophages, grâce à une déviation de la voie classique d’endocytose.

Trafic intracellulaire classique // Trafic intracellulaire de Brucella sp

endocytose

Dégradation enzymatique

Interaction

phagosomeEndosome précoce

Endosome tardif

Lysosome

Brucella

Interaction

Autophagosome

Vacuole de réplication

Reticulum endoplasmiqueIntervention du

système de type IV

Les ORFs de ces deux opérons partagent un pourcentage d ’identité moyen de 26% (19,5 à 31 %)

(O ’Callaghan et al, 1999)

Objectif de ce travail :

Utilisation d ’une approche bioinformatique en vue de voir si on peut appliquer le schéma du système de sécrétion de type IV d’Agrobacterium tumefaciens à Brucella suis.

Les étapes suivies :

1) Collecter des informations au départ des séquences protéiques : - les localisations cellulaires - les motifs - les structures secondaires et tertiaires 2) Analyse plus approfondie de composants pour lesquels nous aurons pu proposer une fonction

La méthodologie :

1) Recherche d’homologues (Blast)

- Banque non redondante - Banque de structures (PDB)- Banque d’ESTs humaines

Les composants des systèmes de type IVLa relation structure/fonctionInteraction avec l’hôte

2) Prédiction de localisation sub-cellulaire (PSORT)

- 4 localisations- Ne prédit pas encore la sécrétion- Prédictions fiables (cas-tests)- Localise une peu trop souvent en membrane interne

La méthodologie (suite) :

4) Prédiction de structures secondaires (PHD)

- Localisation des structures secondaires- Prédiction d’hélices transmembranaires- Prédiction des résidus enfouis et exposés- Validation des localisations sub-cellulaires

3) Détection de motifs

a) Caractérisation d’une famille protéique (Blocks)b) Recherche de motifs fonctionnels (Prosite)

La méthodologie (fin) :

5) Prédiction de structures tertiaires (3D-PSSM, Ucla-Doe)

- Similarité de repliement protéique Relation structure / fonction

Résultats du débroussaillage du système de sécrétion de type IV chez B. suis

IM

OM

PP

ext.

CP

B 7

B9

B 7

B9

S

S

SS

B4NTP

B6

D4B3

NTP

B8 B11

NTP

B5 B5

B10

B2

Agrobacterium tumefaciensBrucella

suis

IM

OM

PP

ext.

CP

B 7

B9

B 7

B9

B4NTP

B6B3 B8 B11

NTP

B5 B5

B10

B2

orf12 ?

B1

- 8 protéines du système de sécrétion de type IV d’A. tumefaciens peuvent être transposées à B. suis.- Des fonctions ont pu être proposées ou renforcées pour deux composants du système : VirB1 et VirB5.

Conclusions du débroussaillage :

La protéine VirB1 et son homologie avec les lysozymes

La fonction proposée, dans la littérature, pour VirB1 est la

dégradation du peptidoglycane qui est aussi une des fonctions que remplissent les lysozymes.

Les topologies de VirB1 et du lysozyme sont comparables

C N

C

N

Lysozyme VirB1

Lysozyme complexé avec du NAG

La protéine VirB5 et son homologie avec la MAP1A (Microtubule Associated

Protein 1A)

VirB5 ne partage pas le motif de liaison aux microtubules.

Domaines identifiés sur la MAP1A (2805 aa)(ProDom)

PD000002

(K/R)(K/R)(D/E)Motif de liaison aux

microtubules

Ce qui s ’aligneÀ VirB5

N C

Ce bloc PD000002 est conservé par beaucoup d’autres familles protéiques. Il s ’agit en fait d’un

coiled coil

Voici un échantillon des protéines quipartagent ce motif coiled coil:

Protéines liant l’ADN :- protéines activatrices- élément de dimérisation de facteurs de transcription

Famille des v-SNARE et t-SNARE

Intéressant

Protéines fibreuses

Apolipoprotéines

Schéma d’interaction entre v-SNARE et t-SNARE

Membrane vacuolaire

Membrane organiteRE, Golgi

Trafic intracellulaire classique // Trafic intracellulaire de Brucella sp

endocytose

Dégradation enzymatique

Interaction

phagosomeEndosome précoce

Endosome tardif

Lysosome

Brucella

Interaction

Autophagosome

Vacuole de réplication

Reticulum endoplasmiqueIntervention du

système de type IV

Conclusions :

- Nous avons pu transposer 8 composants du système de sécrétion de type IV d’A. tumefaciens à B. suis.- VirB1 dégraderait le peptidoglycane- VirB5 est le candidat préférentiel pour le détournement du trafic intracellulaire- Discussion sur la méthode employée

Perspectives :

- Validation de la fonction enzymatique de VirB1 en mutant les résidus conservés dans le site actif d’un lysozyme (mutagenèse dirigée)- Validation de la fonction de VirB5 par différentes manipulations (co-immunoprécipitation, …).- Analyse approfondie d’autres composants du complexe.