Exercices Dirigés : Enzymologie

2011-2012

QCM

I) Les affirmations suivantes, concernant la spécificité des enzymes sont-elles vraies?

(1) les enzymes ont une grande spécificité vis-à-vis de leur substrat. (2) L’enzyme n’est pas modifiée par la réaction de transformation du substrat

en produit. (3) Une enzyme augmente la vitesse d’une réaction d’un facteur 106 par

rapport à la même réaction non-enzymatique. (4) La présence de l’enzyme change l’état initial et l’état final d’une réaction

enzymatique. (5) Le site actif (ou centre actif) d’une enzyme est la zone de la protéine où se

fixe le substrat (6) Une enzyme peut avoir plusieurs sites de fixation pour son substrat. (7) Une enzyme peut être utilisée plusieurs fois pour effectuer la même

réaction.

II) Soit la réaction enzymatique simple :

E est l’enzyme, S le substrat et P le produit. Si l’on part du principe que la réaction catalytique s’effectue à partir d’un seul complexe ES (complexe de Michaelis), et que dans les premiers instants de la réaction : k-2 est négligeable, l’équilibre k+1/k-1 très rapide et k+2 l’étape limitante. Dans ces conditions, les affirmations suivantes concernant « l’état stationnaire » sont-elles vraies ?

(1) Tant que la concentration en substrat est beaucoup plus importante que celle de l’enzyme (S saturant), tout l’enzyme est sous forme ES.

(2) Quand tout l’enzyme est complexé par le substrat, la vitesse de formation du produit est constante.

(3) La vitesse de formation du produit est constante jusqu’à disparition complète du substrat.

(4) La vitesse de formation du produit est directement proportionnelle à la concentration de l’enzyme.

(5) La vitesse de disparition du substrat est indépendante de la concentration en enzyme.

III) Lorsque [S] = Km, la vitesse de réaction enzymatique est à peut prêt de :

(1) 0,1 Vmax (2) 0,2 Vmax (3) 0,3 Vmax (4) 0,5 Vmax (5) 0,9 Vmax

IV) Lorsque [S] = 0,1 * Km, la vitesse d’une réaction chimique catalysée par une

enzyme ayant un comportement Michaelien est à peu prêt de :

(1) 0,1 * Vmax (2) 0,3 * Vmax (3) 0,5 * Vmax (4) 0,7 * Vmax (5) 0,9 * Vmax

V) Lorsque [S] = 10 * Km, la vitesse d’une réaction chimique catalysée par une

enzyme ayant un comportement Michaelien est à peu prêt de :

(1) 0,1 * Vmax (2) 0,3 * Vmax (3) 0,5 * Vmax (4) 0,7 * Vmax (5) 0,9 * Vmax

VI) Les affirmations suivantes sont-elles vraies ? La vitesse d’une réaction enzymatique : (1) présente une relation linéaire en fonction de quantités croissantes

d’enzyme. (2) présente une relation hyperbolique en fonction de quantités croissante

d’enzyme (3) est maximale à la concentration de NaCl 9‰ (4) est maximale à pH = 7 (5) est sensible aux variations de température. (6) est sensible à la présence d’autres ligands que le substrat.

VII) Il existe trois modèles simple d’inhibition enzymatique : l’inhibition

compétitive, l’inhibition non-compétitive et l’inhibition anti-compétitive (ou incompétitive).

Les affirmations suivantes sont-elles vraies ? Dans le cas d’une inhibition :

(1) compétitive, le substrat et l’inhibiteur se fixent séparément sur l’enzyme (2) compétitive, c’est Km qui varie et vmax qui reste fixe (3) non-compétitive, l’inhibiteur peut se fixer avant le substrat (4) non-compétitive, c’est le Km et la vmax qui varient (5) anti-compétitive, l’inhibiteur peut se fixer avant le substrat. (6) anti-compétitive, c’est Km et vmax qui varient

VIII) Lequel de ces composés pharmaceutiques, n’est pas un inhibiteur

enzymatique ?

(1) Méthotrexate (2) Pénicilline (3) Sulfonilamide (4) Iode (5) Viagra

EXERCICES

Exercice 1 : On étudie la constante de Michaelis d’une enzyme avec plusieurs substrats de structures voisines. Les résultats sont les suivants : A : 5 x 10-4 M B : 3 x 10-3 M C : 3,5 x 10-4 M D : 6 x 10-2 M E : 5,5 x 10-2M Pour lequel de ces composes, A, B, C, D et E l’enzyme a t’elle le moins d’affinité.

Exercice 2 :

Si une enzyme transforme à 25oC 100 µmol de substrat par minute, on peut admettre à priori, qu’à 85oC, elle en transformera par minutes :

A = 600 B = 300 C = 100 D = 10 E = 0

Exercice 3 : Une cinétique enzymatique peut être représentée graphiquement en portant respectivement Vi en ordonnée et Vi/S en abscisse. En utilisant l’équation suivante :

Vi = Vmax –Vi / S . Km (déduite de celle de Michaelis et Menten et dont elle emprunte les mêmes symboles), on obtient un graphique du type représenté ci-dessous pour un substrat en l’absence d’inhibiteur.

(1) quel est le paramètre, désigné par son symbole, qui est mesuré à l’intersection de

la droite et de l’axe des ordonnées ? (2) quel est celui mesuré à l’intersection de la droite et de l’axe des abscisses ? (3) La pente de la droite étant le troisième paramètre, citer uniquement celui ou ceux

qui varie (nt) en présence d’un inhibiteur compétitif. (4) La pente de la droite étant le troisième paramètre, citer uniquement celui ou ceux

qui varie (nt) en présence d’un inhibiteur non-compétitif.

Exercice 4:

Dans la figure représentée ci-dessous, la droite I représente une étude cinétique obtenue avec une certaine concentration d’enzyme. Laquelle des droites représentées sur cette figure pourrait correspondre à la cinétique obtenue dans les mêmes conditions expérimentales mais une concentration d’enzyme deux fois moindre.

Exercice 5:

Le foie du rat contient deux enzymes, l’hexokinase (HK) et la glucokinase (GK), capables de phosphoryler le glucose suivant la réaction : Mg2+

Glucose + ATP � Glucose-6-phosphate + ADP On mesure la vitesse initiale (V1 pour HK, V2 pour la GK et V représente l’activité phosphorylante totale) en fonction de la concentration en glucose, la concentration en ATP étant maintenue constante. Les résultats, exprimés en UI par g de foie, sont reportés dans le tableau ci-dessous.

(1) Déduire de ce tableau les constantes cinétiques Km et Vmax des deux enzymes (2) Sachant que la concentration intracellulaire hépatique de glucose est de 5 mM,

calculer en pourcentage de Vmax, les vitesses initiales des réactions catalysées par les deux enzymes.

(3) Indiquer laquelle de ces deux enzymes est susceptible d’intervenir efficacement en cas d’élévation de la concentration en glucose au delà de 5 mM. Justifier votre réponse.

(4) On mesure l’activité phosphorylante totale V en présence de glucose-6-phosphate (G-6-P) à la concentration de 5 mM. On obtient les résultats suivants :

- pour [glucose] = 0,5 mM, V = 0,03 UI/g - pour [glucose] = 150 mM, V = 1,00 UI/g Qu’en déduisez vous ? (5) La cinétique de l’HK en absence ou en présence de G-6-P donne les résultats

suivants en représentation de Lineweaver-Burk :

Qu’en déduisez vous ?

Glucose (mM) 0,05 0,1 0,5 1 5 10 15 150 500 1500

V1 (HK) 0,10 0,15 0,23 0,29 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30

V2 (GK) 0,01 0,01 0,03 0,06 0,25 0,50 0,60 1,00 1,00 1,00

V = V1 + V2 0,11 0,16 0,26 0,35 0,55 0,80 0,90 1,30 1,30 1,30

Exercice 6:

On étudie l’activité de la β-galactosidase sur orthonitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG). Le protocole opératoire est le suivant : Dans un tube on introduit :

• 1 ml de solution d’ONPG à 2 mmol/l

• 1 ml de solution tampon pH = 7

• mettre au bain marie à 37oC pendant 5 minutes

• ajouter 1 ml de préparation enzymatique à 1 mg/ml

• mettre au bain marie à 37oC pendant 10 minutes

• ajouter 1 ml de NaOH 1 M (afin de stopper la réaction)

On mesure alors la vitesse de la réaction enzymatique, et le résultat est de 0,091 µmol d’ONPG transformé par minute et par ml d’enzyme.

A- Parmi les propositions de réponse concernant les affirmations suivantes, indiquer laquelle est vraie.

1- Le temps t pendant lequel s’est déroulé la réaction enzymatique est de 10

minutes. 2- La même réaction enzymatique, réalisée dans des conditions identiques mais à

température de 80oC, présente une vitesse proche du double. 3- La même réaction enzymatique, réalisée dans des conditions identiques mais

avec une concentration double d’enzyme (soit 2 mg/ml) présente une vitesse moitié moindre.

4- La vitesse mesurée au terme de la réaction correspond à la vitesse initiale.

5- Au terme de la réaction, la quantité d’ONPG transformée est 0,91 µmol/ml d’enzyme.

Propositions de réponse :

a) 1 + 2 + 3 b) 2 + 3 + 5 c) 1 + 4 + 5 d) 1 + 3 + 5 e) aucune de ces propositions n’est exacte.

B- On recommence l’expérience mais en utilisant des solutions d’ONPG de

concentrations variables. Les vitesses de réactions pour chaque concentration figurent dans le tableau ci-dessous :

[ONPG] mmol/l

0,25 0,5 0,75 1 2 5 10 15 20

Vi

µmol/min/ml 0,027 0,045 0,070 0,083 0,091 0,11 0,14 0,14 0,14

Déterminer d’après ce tableau et sans construire de courbe, la vitesse initiale maximale (Vmax) de la réaction enzymatique exprimée en UI/l, ainsi que la constante

de Michaelis (Km) en µmol/l. C- On réalise la même expérience qu’en B mais en présence d’un composé inhibiteur

I. les vitesses de réaction obtenues en présence de I figurent dans le tableau ci-dessous :

[ONPG] mmol/l

0,25 0,5 0,75 1 2 5 10 15 20

Vi

µmol/min/ml 0,012 0,033 0,060 0,071 0,080 0,095 0,12 0,12 0,12

(1) Déterminer d’après ce tableau et sans construire de courbe, la vitesse initiale

maximale (Vmax) de la réaction enzymatique exprimée en UI/l, ainsi que la

constatnte de Michaelis (Km) en µmol/l, en présence de I. (2) En déduire la nature de l’inhibiteur I. (3) Calculer le pourcentage d’inhibition lorsque la concentration en ONPG est 2

mmol/l.

Exercice 7:

La phosphatase alcaline (PAL) hydrolyse les monoesters de l’acide phosphorique. Le substrat utilisé pour cette étude cinétique est le paranitrophényl phosphate de sodium (PNPP). Le produit de la réaction, le paranitrophénol (PNP), est jaune en milieu alcalin et présente un maximum d’absorption à 410 nm, ce qui permet un dosage spectrophotométrique. La réaction est effectuée à pH 10 selon le schéma suivant :

La vitesse initiale de la réaction a été mesurée pour des concentrations variables en

substrat en présence et en l’absence de β-glycérophosphate. Les résultats expérimentaux sont donnés dans le tableau ci-dessous (les vitesses initiales sont données en unités arbitraires)

Concentration du substrat (mol/l)

Vitesse initiale sans

β-glycérophosphate

Vitesse initiale en présence de b-glycérophsphate à la concentration de 2.10-3 M

1.10-4 83.10-5 51.10-5

2.10-4 132.10-5 88.10-5

5.10-4 200.10-5 154.10-5

(1) a partir des valeurs expérimentales ci-dessus, tracer, pour l’enzyme

étudiée la courbe 1/V = f (1/[S]) en absence de β-glycérophosphate. Déterminer les valeurs de Km et Vmax.

(2) Tracer sur le même graphique que précédemment la courbe 1/V = f (1/[S])

en présence de β-glycérophosphate. En déduire comment le β-glycérophosphate se comporte vis-à-vis du PNPP.

Exercice 8: Une enzyme (Km = 2.10-4 M) est essayée en présence de son substrat à la concentration 2.10-4 M et d’un inhibiteur compétitif à la concentration de :

2,5. 10-3 M (Ki = 2,5.10-3)

(1) la Vmax(sans inhibiteur) est de 55 µM/min. Calculer Vi, vitesse initiale de la réaction en présence de l’inhibiteur. (2) calculer Vo, vitesse initiale de la réaction en absence d’inhibiteur. En déduire le pourcentage d’inhibition.