Enzymologie théorique Bio 2 M1

8/14/2019 Enzymologie thorique Bio 2 M1

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Ph. Collas 1

Enzymologie thor ique

I . Introduction Dfinit ions

A. Enzyme

Protine prsentant des proprits de catalyse spcifiques dune raction chi-

mique du mtabolisme de ltre vivant qui la produit.

Lenzymologie est ltude des enzymes.

Le substantif enzyme est du genre fminin.

Toutes les enzymes sont des protines.

Les protines enzymatiques sont des catalyseurs, cest--dire quen agissant

des concentrations trs petites, elles augmentent la vitesse des ractions chimi-

ques, sans en modifier le rsultat. A la fin de la raction la structure de lenzyme

se retrouve inchange.

Une enzyme donne est spcifique dune raction, cest--dire quelle catalyse

toujours la mme transformation, se produisant sur les mmes corps chimiques

initiaux.

Les protines enzymatiques sont synthtises par des tres vivants. Cette syn-

thse est dtermine gntiquement : sa conservation dans le gnome est favo-rise par le besoin quprouve cet tre vivant de faire cette raction.

B. Substrat

Molcule qui entre dans une raction pour y tre transforme grce laction

catalytique dune enzyme.

Toutes les molcules qui entrent dans une raction enzymatique et sont dfiniti-

vement modifies sont appeles substrats.


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Enzymologie thorique

Ph. Collas 2

C. Produit

Molcule qui apparat au cours dune raction catalyse par une enzyme.

La nouvelle molcule qui rsulte de cette transformation est appele produit.

D. Ligand

Corps chimique ayant une liaison spcifique avec une enzyme

Toutes les molcules ayant une liaison spcifique avec une protine sont

appeles ligands.

Pour chaque ligand, il existe au moins un site de fixation sur la protine qui le

reoit.

E. Cofacteur

Corps chimique intervenant obligatoirement dans une raction enzymatique :

- pour transporter ou complter un substrat ;

- pour accepter un produit ;

- comme participant la structure de lenzyme.

Les cofacteurs peuvent tre des ions comme latome de Zinc de lanhydrase car-

bonique ou de petites molcules minrales habituellement prsentes dans les mi-

lieux biologiques, commencer bien sr par la molcule deau.

Certains cofacteurs sont des molcules plus complexes synthtises par les cel-

lules : nous les appellerons coenzymes.

F. Coenzymes

Molcule biologique intervenant comme cofacteur indispensable dans la cata-

lyse enzymatique dune raction :

- les coenzymes libres interviennent dans la raction de manire

stchiomtrique ;

- les coenzymes lis interviennent dans la raction de manire cata-

lytique.


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Ph. Collas 3

Les coenzymes sont des molcules biologiques cest dire que leur synthse

naturelle ne peut tre faite que par des cellules vivantes. Lorsque cette synthse

nest pas inscrite dans le patrimoine gntique dune espce, alors tout ou partie

de la molcule du coenzyme doit tre apport cette espce par son alimenta-

tion : cet aliment indispensable sappelle une vitamine. Les coenzymes sont des

cofacteurs donc des molcules indispensables la catalyse enzymatique.

Lorsque les coenzymes sont lis lenzyme par des liaisons de type lectrostati-

que ou plus faiblement encore, cette liaison est renouvele chaque raction ef-

fectue : en effet, lnergie mise en jeu par la liaison enzyme - coenzyme est du

mme ordre de grandeur que lnergie mise en jeu dans la liaison enzyme-

substrat ; dans ce cas, la concentration des coenzymes doit tre du mme ordre

de grandeur que celle du substrat (on dit stchiomtrique). Ces coenzymes sont

appels coenzymes libres parce quils se dissocient de lenzyme chaque rac-

tion catalyse.

Lorsque au contraire les coenzymes sont lis aux enzymes par des liaisons for-

tes de type covalent, leur concentration est ncessairement la mme que celle de

lenzyme, cest dire trs petite (on dit catalytique). Ces coenzymes sont appels

coenzymes lis parce quils ne se dissocient pas de lenzyme.


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Ph. Collas 4

I I . Spcif icit

A. Notion de spcificit

1. Substrats

Thoriquement, une seule raction possible, sur un seulsubstrat

En ralit, il existe une relation structure activit : il faut que la bonne liaison soit

place au bon endroit

accs possible pb de conformation

raction possible pb chimique (grandeur et nature des forces en jeu)

il est frquent quune enzyme intervienne non sur une molcule unique, mais sur

une classe de substrats.

Exemple 1 : Galactose pimre en C4 du glucose, non pris en charge par les en-

zymes de la glycolyse

Exemple 2 : - oxydation des acides gras - Les enzymes prennent en charge

des acyl - CoA. A chaque dgradation, perte dun motif 2 carbones, mais les

mmes enzymes fonctionnent sur le nouvel acyl - CoA le mme motif est re-

connu.

Exemple 3 : RubisCO en fait, les deux ractions ne concernent pas les mmes

sites (rgulation allostrique).

2. Raction

En fonction de lenvironnement atomique du site catalytique, un seul type de raction

sera possible :

acide - base

redox, par change dlectrons avec des ions mtalliques (cytochromes)

transferts de groupements


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Ph. Collas 5

B. Classification et nomenclature des enzymes

1. Principe

1961 - 1972 : Enzyme commission codification internationale. Un certain nombre

dappellations traditionnelles subsistent, mais lemploi des numros de code est au-

jourdhui obligatoire dans toutes les publications scientifiques et les documentations

techniques et commerciales.

La nomenclature officielle comporte 6 classes, elles-mmes divises en sous

classes. Le numro de code spcifie :

1 - le type de raction (classe)

2 - le type de fonction du substrat mtabolis (sous-classe)

3 - le type de laccepteur

4 - Le numro dordre (dans la sous-sous-classe).

2. Classes et exemples

1 Oxydorductases : raction redox portant sur diffrents rsidus, associant des

coenzymes, des cytochromes, des accepteurs comme O2,

EC 1.1.1.67 Mannitol : NAD oxydorductase = Mannitol DH

Mannitol + NAD = Fructose + NADH

EC 1.1.2.3 L - Lactate : ferricytochrome coxydorductase = Lactate DH

Lactate + 2 Cyt cFe3+

= Pyruvate + 2 Cyt cFe2+

2 Transfrases : transfert dun groupement carbon, phosphor, azot, etc. dune

molcule une autre.

On distingue parfois les aminotransfrases : transfert dun groupement -NH2

dune molcule sur un cto-acide, en position : on obtient un nouvel acide ami-

n et les transaminases : le NH2 nest pas transfr en : le nouveau compos

nest pas un acide amin

EC 2.6.1.20 L - Tyrosine : pyruvate aminotransfrase

L - Tyr + Pyr = pHydroxyphnyl pyruvate + L - Ala

GOGAT = glutamate oxo-glutarate aminotransfrase


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Ph. Collas 6

Glu + Glu = KG + Gln

Kinase = Phosphotransfrases avec transfert dun ATP vers une autre molcule

EC 2.7.1.1 ATP : D - hexose 6 - phosphotransfrase = hexokinase

ATP + D hexose = ADP + D hexose 6 - phosphate

EC 2.7.1.11 ATP : D - Fructose 6 - phosphate 1 - phosphotransfrase =

phospho - fructokinase

ATP + D - Fructose 6 - phosphate = ADP + D - Fructose 1,6 - bis phosphate

3 Hydrolases : liaisons ester, rsidus glycosyle, etc.

EC 3.2.1.4 1,4 (1,3 ;1,4)-D-glucan 4-glucanohydrolase = cellulase

Glucose(n) = Glucose(n-1) + D-glucose

4 Lyases : catalysent lenlvement ou laddition dun groupement autrement que par

hydrolyse

EC 4.1.1.39 3-phospho D glycrate carboxy-lyase [dimerizing] = RubisCO

RuBP + CO2 = 2 A3PG

5 Isomrases :

EC 5.3.1.1 D-glycraldhyde 3-phosphate cto-isomrase = Triose phos-

phate isomrase

Glycraldhyde 3 phosphate = Dihydroxy actone phosphate

6 Ligases : cration dune liaison entre 2 molcules couple avec la dgradation

dune liaison haut potentiel nergtique

EC 6.4.1.1 Pyruvate : dioxyde de carbone ligase (ADP) = pyruvate carboxy-

lase

ATP + Pyr + CO2 + H2O = ADP + Pi + oxaloactate


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Ph. Collas 7

I I I . Cintique michalienne

A. Notion de vitesse initiale

PEESES ++

Mesure de lapparition du produit au cours

du temps ; Conditions exprimentales :

T, pH, salinit, etc. optimaux

[S] >> [E] et temps court on cherche

rester dans les conditions o [S] >> [P]

Dans ces conditions, [S] et [ES] sont

considrs comme des constantes : cest la phase stationnaire.

On observe deux parties : 1) pente constante vitesse constante, puis 2) apparition

progressive dun plateau vitesse diminue : les conditions initiales ne sont plus vri-

fies, en particulier cause de lpuisement du substrat

B. Influence de la concentrationen enzyme sur la vitesse

On augmente progressivement la concen-

tration en enzyme, toutes choses gales

par ailleurs.

A t1, en condition de vitesse initiale, il y a

proportionnalit entre la [E] et la quantit

de produit form. La courbe V = f ([E]) est

une droite (V = d[P] / dt)

A t2, les conditions initiales ne sont plus vrifies il ny a plus proportionnalit.

Thoriquement, toutes les courbes admettent le mme plateau, mais dans la ralit,

cause de problmes de solubilit, il est trs difficile dobtenir un plateau exprimen-

tal correct.

[P]

Tps

[S]

[ES]

[E]

[P]

Tps

[E] = 1

[E] = 2

[E] = 3

3

2

1

t1 t2


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Ph. Collas 8

C. Influence de la concentration en substrat

1. Equation de Michaelis - Menten (1913)

Dans la suite du cours, sauf mention

contraire, on considre quon se place en

conditions de vitesse initiale = Vi ou V0 ,

voire V (selon inspiration !)

On trace la courbe V = f([S]) (attention

ne pas confondre avec la courbe [P] =

f(t)!).

Quand [S] augmente, Vi tend vers Vmax

PEk

kES

k

kSE ++

2

2

1

1

on pose : [Et] = enzyme totale, [ES] = complexe enzyme - substrat, donc [EL] = [Et] -

[ES] = enzyme libre ; [S] = substrat, avec [S] >> [Et]

2. Vitesse de formation de ES

On nglige la formation partir de E + P, car [S] >> [E] et on est en Vi [P] est trs

faible : ]])[[]([1 SESEtk =

3. Vitesse de destruction de ES

][][ 21 ESES kk +

4. Etat stationnaire

La vitesse de formation et la vitesse de destruction de ES sont gales. On cherche

isoler [ES]

)]([]][[]][[][][]])[[]( 2111211 kkkkkkk ESESSSEtESESSESEt +=++=

)][]([)]([]][[]][[ 211211 1 kkkkkkk SESESSESSEt ++=++=

V=d[P]/dt

[S]

Vm

Vm/2

Km


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Ph. Collas 9

++

=++

=

kkkkkk

k

S

SES

SEES

tt

1

21211

1

][

]][[

][

]][[][ , or

KS

SEESVi

tkk +

==][

]][[][ 22 , vitesse initiale de for-

mation de P.

On posek

kkmK

1

21+= (car on nglige k-2) et ][2max tEV k= car la vitesse est maximale

quand toutes les molcules denzymes (thoriquement) prennent en charge chacune

une molcule de substrat, donc

][][

max

SKSV

Vim+

=

maxmax21

][][][

][Si VSS

SVViSKm =

+==


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Ph. Collas 10

D. Reprsentations graphiques

Exprimentalement, il nest pas possible de dterminer Vmax on ne connat

quune valeur approche. On peut retrouver les deux valeurs importantes Vmax et

Km grce diffrents traitements mathmatiques, parmi lesquels la reprsentation

en double inverse.

1/V

1/[S]

1/Vm

-1/Km

][][

][][1

][][

maxmaxmax

max

VK

SVS

SVKS

VKSSV

V mm

m+=+=

+=

maxmax1

][11

VVK

SVm +=

1. Lineweaver et Burk

Reprsentation en double inverse : 1/V =

f ( 1/S )

Le problme principal de cette mthode est

la prpondrance accorde aux valeurs les

plus faibles de S et de V, pour lesquelles

lincertitude est pourtant la plus grande. Elle

peut conduire des estimations fausses. Elle

ne devient intressante que pour des valeurs

de [S] leves, donc dans des conditions

saturantes .

[S]/V

[S]

Km/Vm

-Km

pente= 1/Vm

2. Hanes Woolf

VmSKm

SKmVm

SV

SKmSVm

V][

V[S]

:soit,][][][

][ +=+

=+

=

On utilise alors la relation :VmKmS

Vm+= ][1

V[S]

La droite a une pente de 1/Vm, dont

lextrapolation donne Km lintersection

avec laxe des abscisses.


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Ph. Collas 11

V/[S]

V

pente= -1/Km

Vm/[S]

Vm

3. Eadie Hoftsee

La relation utilise est linverse de la prc-

dente :

][][])[(][

][VSVVKmSVmSKmV

SKmSVm

V =+=++=

KmV

KmVm

SVVmVKm

SV ==+

][][

La pente est 1/Km, les intersections avec

les axes donnent Vm/[S] et Vm.

V

S

Vm

KmS1S2S3

V3

V2

V1

4. Reprsentation de Schwarzenbach

Mthode purement graphique : on reporte sur

laxe des abscisses les valeurs de [S] et sur

celui des ordonnes celles de V (pour des

couples S(i)/V(i) de rsultats exprimentaux),

et les droites se coupent en un point

dabscisse Km et dordonne Vm.


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Ph. Collas 12

E. Signification de Km

Rechercher Vmax ou 1/2 de Vmax correspond la mme dmarche intellectuelle,

sauf quune est possible exprimentalement, pas lautre (cf. demi-vie des atomes

marqus).

Km a la grandeur dune concentration et reprsente laffinit de lenzyme pour son

substrat. On compare 2 substrats possibles dune enzyme. Leurs Km respectifs sont

diffrents (Km2 > Km1). Cela signifie que, pour atteindre Vmax2, il faut une concen-

tration en S2 suprieure la concentration en S1 ncessaire pour atteindre Vmax1 :

a marche moins bien avec S2. Caricature : si une substance nest pas un substrat

de lenzyme, V = 0, mme avec [S]

On envisage 3 cas.

1. [S] > Km

VmvSS

VmSKm

SVmv

][][

.][

].[ a

+=


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Ph. Collas 13

F. Constante catalytique Kcat

Kcat = nombre de moles de P formes par seconde et par mole denzyme.

Si lenzyme possde plusieurs sites catalytiques, lunit change et sexprime par

mole de sites.

Kcat = Vmax / mole denzyme = Vmax / [Et]

Le rapport Kcat/Km est souvent donn comme mesure de l'efficacit catalytique, car

il correspond une constante de vitesse pour de basses concentrations de substrat

(S)


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Ph. Collas 14

IV. Inf luence des facteurs physico-chimiques

A. Influence du pH

Le pH joue sur lionisation des molcules :

conformation de la protine enzymati-

que ;

disponibilit des fonctions chimiques de

lenzyme et / ou du substrat (i.e. le subs-

trat rel doit tre sous une certaine forme,

qui nest pas ncessairement la forme de

la neutralit).

En gnral, 2 units du pH optimum, lactivit est rduite 100 fois, mais parfois la

gamme est beaucoup plus restreinte.

Valeurs extrmes : il faut les atteindre pour quil y ait une dnaturation de lenzyme

par attaque acide ou basique, sinon, le plus souvent, cest une inhibition rversible.

B. Influence de la tempra-ture

1) Augmentation de la temprature :

on fournit de lnergie au systme.

Q10 = facteur daugmentation de

lactivit quand on augmente de 10C

Q10 # 2

2) Dnaturation : la temprature

laquelle elle intervient peut varier,

mais seules quelques exceptions sloignent vraiment de la gamme 40 - 60 C (pro-

tines thermostables).

pHOptimum

Activit enzymatique

Activit enzymatique

TC


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Ph. Collas 15

V. Inhibit ion

Il ne sagit pas ici des poisons, inhibiteurs irrversibles de lenzyme.

Un inhibiteur dune enzyme est un ligand, non transform par lenzyme, qui modifie

le comportement de cette enzyme. De nombreux types dinhibitions ont t dcrits.

Nous prendrons trois exemples : linhibition comptitive, linhibition non comptitive

et linhibition incomptitive.

[Et] = enzyme totale, [S] = concentration initiale en substrat, [ES] complexe enzyme -

substrat,

[EL] = enzyme libre

[S] >> [Et] ([Et] - [ES]) [S] dans les conditions initiales.

k2[ES] = Vi / k2[E] = Vmax

[I] = inhibiteur total, [EI] complexe inhibiteur - enzyme

[I] >> [Et] ([Et] - [EI]) [I] pendant toute la raction, puisque I nest pas consom-

m.

A. Inhibition comptitive

Linhibiteur ne peut se combiner avec

lenzyme en mme temps que le subs-

trat. Nous considrerons, bien que ce ne

soit pas toujours le cas, que linhibiteur et

le substrat sexcluent mutuellement, pour

des raisons striques, au niveau du site catalytique de lenzyme. Ils ont souvent des

structures analogues.

EIIEPEESSE +++ et

On a :

]][[])[]]([[][]][[][]][[od',][

]][[][ Ltt

tESESESKmESSEKmESSES

KmSSE

ES ===++

=

1/[S]

1/V

Vm = Vm

Km > Km

+ I


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Ph. Collas 16

o :][]][[

ESES

KmL= , soit encore

][][

][SKmES

EL =

De la mme faon :][]][[

EIEI

KiL= , on obtient donc :

KiI

SKmES

KiI

EEI L][

][][

][][][ ==

1. Equation de conservation

Cette quation exprime le fait que toute lenzyme est conserve au cours de la rac-

tion.

)]][

1(][

1][[)][

][][1]([][][][][

KiI

SKmES

KiI

SKm

SKmESEIESEE Lt ++=++=++=

2. Equation de vitesse

On a Vi = k2 [ES] et Vmax = k2 [Et], do :

)][

1(][

1

1][][

maxKiI

SKmE

ESV

vit ++== , do :

)][

1(][

][max

KiI

KmS

SVvi

++=

et )][

1(]max[max

11KiI

SVKm

Vvi++=

Quand on fait varier [I], les droites obtenues en double inverse se coupent, aprs

extrapolation, en un point dordonne 1/Vmax. ([I] = 0).

On peut lever linhibition par un excs de substrat.

En prsence dinhibiteur, la constante de Michaelis pour le substrat semble augmen-

ter, linhibiteur entrant en comptition avec lui. Laffinit semble diminuer.

Lintersection de la droite avec laxe des 1/[S] a pour abscisse :

)][1(')

][1(

11'1 KiIKmmK

KiIKmmK +=+

=


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Ph. Collas 17

B. Inhibition non comptitive

Linhibiteur se combine avec lenzyme

indpendamment du substrat : les deux

peuvent donc se fixer simultanment. La

fixation de I sur lenzyme ne modifie pas

Km. La fixation de S sur lenzyme ne

modifie pas Ki.

EL + SL ES EL + P ][]][[

ESSE

KmL=

][][][

SKmESEL =

EL + I EI ][]][[

EI

IE

Ki

L

= KiI

SKm

ESEI

][

][][][ =

ES + I EIS][]][[

EISIES

Ki= KiI

ESEIS][

][][ =

EI + S EIS][]][[

EISSEI

Km= KmS

KiI

SKmES

KmS

EIEIS][

)][

][]([

][][][ ==


)][1)(][

1]([)][][][

1][

]([][][][][][KiI

SKmES

KiI

KiI

SKm

SKmESEISEIESEE Lt ++=+++=+++=


KiI

SKm

SKm

kiI

KiI

SKmVm

vi][

][][][

1

1

)][

1)(][

1(

1

+++=

++=

)][

1()][

1]([

][][][

][][

][

kiI

KmkiI

S

S

kiI

KmKmkiI

SS

SVmvi

+++

=

+++

=

)][

1('

][

][)

][1(

][

)][

1(

][

kiI

VmmVSKm

S

kiI

Vm

vSKm

kiI

S

Vmv ii

+=

+

+=

+

+=

Quand on fait varier [I], les droites se coupent en un point dabscisse -1/Km :

linhibiteur ne modifie pas laffinit du substrat pour lenzyme.

1/[S]

1/V

Vm < Vm

Km = Km

+ I


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Ph. Collas 18

En prsence dinhibiteur, la vitesse maximum, Vmax, semble diminue. Les droites

coupent laxe des ordonnes en un point :

)][

1(

max

1

max'

1

Ki

I

VV

+=

C. Inhibition incomptitive

E + S ES P

KmS

EESES

SEKm L

L ][][][

][]][[ ==

ES + I EIS

KiKmISE

KiIESEIS

EISIESKi

L

.]][][[]][[][

][]][[ ===

[Et] = [EL] + [ES] + [EIS], on remplace par les valeurs correspondantes :

).

]][[][1]([][

KiKmIS

KmS

EE Lt ++=][

][][:or,

.]][[][

1

][][

SKmESE

KiKmIS

KmS

EE L

tL =

++=

On peut donc exprimer [ES] par rapport [Et] :

KiSI

SKmSE

KiI

SKm

E

KiKmIS

KmS

SKm

EES ttt ]][[][

]][[][1

][

][)

.]][[][

1(][

][][++

=++

=++

=

][][

1

)][

1(

]][[

)][

1]([

]][[][

S

KiI

KmKiISE

KiI

SKm

SEES

t

t

++

+=

++= or ViESk =][2 et max][2 VVEk t = , do

)][

1(][

)][

1(

max][

KiI

KmS

KiI

VS

Vi

++

+=

KiI

KmmK

KiI

VVSKm

SV

v ][1'et][1

maxmax'][

]max[

+=+=+=

En prsence dun inhibiteur incomptitif, le substrat a une affinit apparente sup-

rieure. Ici, Vmax et Km changent.

1/[S]

1/V

Vm < Vm

Km > Km

+ I


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Ph. Collas 19

D. Inhibition par excs de substrat

Soit la raction E + S ES P. On a :][

]][[

ES

ESKm

L= , soit encore][

][][

S

KmESEL =

Supposons quune deuxime molcule de substrat puisse se fixer sur le complexe

ES et le rendre inactif : cette molcule se fixe sur un site diffrent du premier, et

nous lappellerons site inhibiteur. Cette molcule se comporte comme un inhibiteur :

ES + S ESS ][]][[

ESSSES

Ki= , soit encoreKiS

ESESS][

][][ =


)][

][1]([][][][][

KiS

SKmESESSESEE Lt ++=++=


)][

][1(

max11

][][

1

max][][

max KiS

SKm

VviKiS

SKmVvi

EES

Vvi

t++=

++==

Si [S] est grand, 01soit)][

][1(donc

][aaaa V

viKiS

SKm

KmS ++

1/[S]

1/V

1/Vm

-1/Km

[S]

1/V

1/Vm

-1/Ki

Quand on porte 1/Vi en fonction de 1/[S], on obtient une hyperbole dont

lasymptote oblique, de pente Km/Vmax, coupe laxe en un point -1/Km.

Quand on porte 1/Vi en fonction de [S], on obtient une hyperbole dont lasymptote

oblique, de pente 1/Vmax. Km coupe laxe des [S] en un point dabscisse -Ki.

Dans les deux cas, Vi passe par un maximum pour KiKmS .][ =


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Ph. Collas 20

VI. Al lostrie

A. Considrations gnrales

1. Dfinition

Lallostrie dsigne une variation de conformation de protines sous leffet de la fixa-

tion dun substrat ou dune molcule effectrice, do lacquisition de proprits parti-

culires (changement dactivit.) On dcrit cela comme des effets coopratifs. Ceux-

ci sont concevables si et seulement si la macromolcule est sous forme oligomri-

que.

Forme relche

Forme compacte

Exemple : un ttramre constitu de 4 sous-units (monomres) activit biologique

et de 4 sous-units de liaison.

La fixation dun substrat entrane une modification de lensemble de la structure.

Toutes les sous-units reproduisent lunisson la variation de conformation subie

par lune delles.

2. Proprits dune molcule allostrique

Il existe une structure quaternaire (en pratique, entre un dimre et un ttramre)

La variation de conformation de la structure dpend du taux doccupation des sites

de liaison.

Pour toutes les enzymes allostriques, la cintique nest pas michalienne.

Ces molcules jouent des rles clef dans la rgulation du mtabolisme.


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Ph. Collas 21

3. Types

Il y a deux types denzymes allostriques :

Systme K : la rgulation se traduit par la variation de la fixation du substrat ou par lavariation de laffinit du substrat pour lenzyme, do une variation du Km

Systme V : la rgulation porte sur la vitesse maximale. Dans ce cas, cela corres-

pond une variation de la constante k2 des enzymes michaliennes.

B. Structure et fonction de lATCase

Laspartate transcarbamylase (ATCase) est implique dans la rgulation des bases

pyrimidiques.

Raction :

NH2

O

O

P -OOCNH

3+

COO-

-OOC

COO-NH

O

NH2+

Carbamyl-P AspartateATCase

Carbamyl-aspartate

+ Pi

On suit la cintique dapparition du produit par mesure de DO465.

1. Cintique de lATCase

V

[S]

12

3

4

1 - ATCase

2 - ATCase + CTP

3 - ATCase + ATP

4 - ATCase

dsensibilise

Les courbes sont des sigmodes : laspartate joue un rle deffecteur coopratif posi-

tif sur lactivit de lenzyme : faible concentration en substrat, la vitesse nest pas


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Ph. Collas 22

leve ; plus on lve la concentration, plus la vitesse prend lallure dune courbe de

Michaelis.

Le CTP joue un rle ngatif sur lATCase : inhibition de lactivit.

En prsence dATP, il y a activation de lATCase : cest un effecteur positif.

Quand lATCase est dsensibilise (par un agent chimique), il ny a plus de rgula-

tion : les proprits allostriques sont perdues.

2. Interprtation

La rgulation allostrique correspond au frein moteur de lactivit enzymatique :

avec le CTP, la vitesse diminue comme quand on lve le pied ; avec lATP, elle

augmente comme quand on acclre.

CTP : la molcule de base est la cytosine. Quant trop de cytosine est produite, le

produit de fin de chane va rguler lenzyme en amont de la voie de synthse : rtro-

contrle ngatif.

ATP : quand il y a beaucoup dadnine (base purique), il y a activation de la syn-

thse des bases pyrimidiques : rtrocontrle positif.

Lallostrie est donc un outil de rglage fin, de rgulation directe, instantane, qui

nest pas du mme ordre que, par exemple, lactivation de lopron Lactose qui est

un systme trs lourd.

3. Structure de lATCase

Lenzyme est forme de 2 trimres qui sont le support

de lactivit catalytique et de trois dimres qui sont lessous-units rgulatrices.

Domaineallostrique

Zn

La sous-unit rgulatrice possde un domaine allostri-

que et un site de fixation du zinc qui permet linteraction avec les trimres.


23/34


Ph. Collas 23

La sous-unit catalytique possde un domaine quatorial pour la fixation de

laspartate et un domaine polaire pour la fixation du carbamyl-phosphate.

Loligomre prsente deux formes, la forme T inactive (compacte) et la forme

R active (relche).

4. Effets homotropes ou htrotropes

[ T ] [ R ] avec Kq.

En prsence de substrat :

R + S RS R + P

Mais, quand on augmente [S], on induit la formation de RS, et donc une diminutionde [R] libre, do un passage de la forme T la forme R, do une diminution de T

dans la cellule : Le substrat S joue un rle homotrope positif.

En prsence dun effecteur positif (ATP) :

On a toujours quilibre entre les formes T et R, mais cette fois R se lie aussi E :

T R + E RE + S

Donc [R] diminue, donc transition T R, donc diminution de [T] libre. Effet htro-

trope positif.

En prsence dun effecteur ngatif (CTP)

Leffecteur se lie la forme T pour former un complexe TE, do une diminution de la

forme T libre, transition de R vers T et diminution de la forme R, ce qui correspond

une inactivation de lenzyme. Effet htrotrope ngatif sur lenzyme.


24/34


Ph. Collas 24

C. Approche thorique de la cooprativit

1. Cas dune enzyme 2 sous-units catalytiques

Deux sous-units distinctes ont permis la

fixation du substrat sur lenzyme.

11

..kSESEES

SEE.S

ESSE

k ====

2122

....

kkSE

kSSESES

SESSSE

SESSESk ====

v = k+2.ES + k+2 SE + 2 k+2 SES

Et = E + ES + SE + SESEn remplaant les valeurs par les ex-

pressions trouves prcdemment, on obtient :

+= +

kkkk SSEv

2112

2 et211

22.21.22kk

SkSEkEtkVm ++== ++

Do :

211

211

.21

.

kkS

kS

kkS

kS

Vmv

++

+=

On envisage alors deux cas :

La fixation du premier substrat est sans effet sur celle du second : il ny a donc

pas de diffrence entre k1 et k2.

SKVm.Sv:od',kkKavec,

D21D

+===

+=

SKS

Vmv

Det si k+2 est trs faible, KD = Km : il ny

a pas de rgulation allostrique, cest une enzyme michalienne.

La fixation du premier substrat modifie celle du second : k1 # k2.

.2..

221

2

SSkkkSSk

Vmv

+++=

Quand k2


25/34


Ph. Collas 25

n21 k...xkxkKhetescatalytiqusitesdenombrenavec,

. ==

+=

SS

n

n

Kh

Vmv

( ) ( )KhS

nvVm

v

KhvVm

v

VmvvKh log.log.

SSS

nnn

===+

n = 1 : pas de rgulation al-

lostrique

ou rgulation allostrique

par cooprativit ngative du

substrat

n = 2 : rgulation allostrique

avec 2 sous-units catalyti-

ques.

Remarque:

n = nombre de Hill = nombre

de sous-units rgulation

allostrique. Exemples :

Phosphofructokinase : n = 4

Lactate DH : il y a 4 sous-units, mais n = 1 : pas de rgulation allostrique.

On prend les pentes des droites au niveau des valeurs nulles sur les axes.

log [v/(vm-v)]

log (S/Kh)

pente = 1

n = 1

n = 2

0

0


26/34


Ph. Collas 26

VII . Ractions deux substrats

A. Fixation alatoire

E

AEA

B

EB

A

B

EAB

PEQ

Q

Q

EP

P

EEPQka

kb

kb

ka kc

ka et kb sont diffrents de ka et kb : lenzyme est modifie par sa liaison A ou B.

En conditions de vitesse initiale, la vitesse de retour est ngligeable. Comme ltape

limitante est la formation de EPQ partir de EAB, on se contente dexprimer V par-

tir de la concentration en EAB : v = kc. [EAB].

[Et] = [E] + [EA] + [EB] + [EAB] et Vm = kc. [Et].

1. Dmonstration de lquation

1) kaAEEAEAAEka ][][][][ ]].[[ ==

2)kbB

EEBEB

BEkb

][][][

][]].[[

==

3)akkb

ABE

akA

EBEABEAB

AEBak

'.]].[[

]['][

][][][]].[[

' ===

4)kabkAB

Ebk

BEAEAB

EABBEA

bk.'

]].[[][

'][

][][][]].[[

' ===

En conditions de vitesse initiale, [EAB] = constante, do :

5) ka.kb = ka.kb

kbakBA

kbB

kaA

EtE

kbakBA

kbB

kaA

EEt

.']].[[][][

1

][][

.']].[[][][

1][][+++

=

+++=

or, daprs la relation 4 : bkkaBA

EABE '..

]].[[][

][ = , do :


27/34


Ph. Collas 27

1*

*

]['

]['

]].[['.

][

.']].[[][][

1]].[[

'.

][][

+++=

+++

=

Aak

Bbk

BAbkka

Et

kbakBA

kbB

kaA

BAbkka

EtEAB (NB : * daprs la relation 5)

soit :]].[[

.'][

'][

'1ou]].[[

'.][

'][

'1BAkbak

Bbk

Aak Vmv

BAbkka

Bbk

Aak Vmv +++=+++=

Signification des constantes : ka et kb sont les constantes de formation des com-

plexes EA et EB, ka et kb sont les constantes de dissociation. En prenant diffrents

cas, on a :

1) KAmak

VmVmv '211

ak'[A]saturant,[B]00

=+++

== ++

2) Rciproque : kb=KmB

][].[

.

][][1

BA

ka

BA

VmvKKK

Bm

Bm

Am +++

=

2. Reprsentation graphique

a 1/v = f(1/[A])

][1][1][11][][][][111][][][][

1 ABkbVm

KB

KVmBkbA

KB

KA

KVmv

Bkb

AK

BK

AK Vmv

Am

Bm

Am

Bm

Am

Am

Bm

Am

++

+=

+++=+++=

[B] = constante : y = ax + b

[B] saturante :][

111AVmVmv

KAm+=

[B] limitante : expression complte

+==

][1110

][1

BK

VmvABm

cste1/v,[B]][

11][][][][

111][ =

=

+++==

AVmBAka

ABVmvkaA KKKK

Am

Bm

Am

Bm


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Ph. Collas 28

-1/Km(A) -1/Ka 1/[A]

[B] diminue

[B] saturante

1/Vm

1/V

On peut donc dterminer ka, KmA, Km

B, Vm, mais pas kb !

Pour dterminer kb, on ralise un graphique secondaire : on prend les valeurs de

1/v pour les diffrentes [B] quand 1/[A] = 0 (les intersections de laxe des ordon-

nes) :

1/v

1/[B]1/Vm

-1/KmB

][1.11BVmVmv

KBm+=

b 1/v = f(1/[B])

)][][

...ou][

.][][][

111Bkb

ABAka

BAVmvKKKK

Am

Bm

Bm

Am

+++=

)][

1(][

)][

1(11Aka

BAVmvKK

Bm

Am +++=

Si [A] est saturante Michaelis

Menten un substrat

Si [B] = - kb [A],)1(11 =kbVmvK

Bm

Il faut l aussi faire un graphique secondaire pour obtenir tous les paramtres.

1/[B]

1/V

-1/kb

1/v=1/Vm(1-KMB/kb)


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Ph. Collas 29

c Remarques particulires

Quand on fait varier [A] et que [A] = -ka, 1/V > 0 ;

Quand on fait varier [B] et que [B] = - kb, 1/V < 0, donc :

KMA/ ka < 1 : la fixation de A est facilite quand B est dj fix (laffinit est sup-

rieure) ;

KMB / kb > 1 : la fixation de B est meilleure sur lenzyme libre

la fixation de substrats dpend de ltat de lenzyme.

d Fixation indpendante des substrats

KMA = ka et KM

B = kb : la fixation dun substrat nest pas affecte par la fixation de

lautre. Dans ce cas :

+++=

][][][][1

11

BABAVmvKKKK

BM

AM

BM

AM

:tdveloppanen

][1

][1

][11

][1

][1

][111

BAVmAVmABVmBVmvKKKKKK

AM

BM

AM

BM

AM

BM

++

+=

++

+=

1/V

1/[A]

[B] saturante

1/v=1/Vm(1+KMB/[B])

-1/KMA

Faire le graphique secondaire.


30/34


Ph. Collas 30

B. Mcanisme ordonn

1. Equation

E EA EAB=>EPQ EQ E

A B P Q

ka kb

k

kaAEEA

EAAEka .. ==

kbB

kaAE

kbBEAEAB

EABBEAkb .... ===

kbkaBAkaA

EtE

kbka

BA

ka

AEEABEAEEt

..1

)

.

.1(

++=++=++=

)..1(

.

....

.or

kbkaBA

kaA

BAkbka

Et

BAkbka

EEABBAkbkaEABE

++===

BAkbka

Bkb

Vmv

.

.1

++=

Si A et B = kb v=Vm / [ 1 + 1 + 0+] # Vm/2 kb=KmB

KmA = 0 : A ne peut quitter le complexe ternaire EAB tant que B est en place.

2. Reprsentations graphiques

a 1/v=f(1/A)

++=

AB

ka

BVmvKK

Bm

Bm 1.

.111

+== BVmvAK

Bm

11

1

01


31/34


Ph. Collas 31

BVmBBVmv

kaA KKBm

Bm =

+== ,1111

1/v

1/[A]1/Vm

-1/ka

[B] saturante

[B] diminue

A partir des valeurs de V pour 1/A = 0, on trace un graphique secondaire, qui re-

prsente la droite 1/v = 1/Vm (1 + KmB/B), qui a lallure des droites michaliennes :

1/v

1/[B]1/Vm

-1/KmB

b 1/v=f(1/B)

( )BA

kaVmVmBA

ka

BVmvKKK

Bm

Bm

Bm 111

.

.111 ++=

++=


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Ph. Collas 32

1/v

1/[B]

[A] saturante

[A] diminue

BVmVmvA K

Bm 1.11 +=a , cf. Michaelis Menten

VmBA 1

v101quand, == , donc il ny a pas de graphique secondaire, puisque 1/v =

constante.


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Ph. Collas 33

C. Mcanisme alternatif

E EA E EB E

A P1 B P2

24

2

21

3

1

1''' PEBEBEPEEAAE

k

k

kk

k

k++++

1. Equations

Dmonstration en conditions de vitesse initiale, donc avec toutes les concentrations

constantes.

On obtient finalement une relation symtrique par rapport A et B (donc on ne traite

quun seul cas ci-dessous) :

AB

VmvKK

Am

Bm 1

++=

2. Reprsentation graphique

AVmv

BVmBAVmvKKKK

Am

Bm

Bm

Am 1.11111 +

+=

++=

Menten)-Michaelis(cf.1.1v1,BSi

AVmVmK

Am+=a

+==

BK

Bm1

Vm1

v10

A1Si

+==

BKBm11-

A10

v1si

KBm


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1/[A]

1/v

[B] saturante

[B] diminue

1/Vm

-1/KmA

Pente = KmA / Vm

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Enzymologie théorique Bio 2 M1