Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques

Contribution à la recherche de nouveaux

agents antibactériens actifs sur les

biofilms de P. aeruginosa

Carole NAGANT

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences

Biomédicales et Pharmaceutiques Promoteur et co-promoteur : Jean-Paul DEHAYE (Laboratoire de Chimie biologique et médicale et de Microbiologie pharmaceutique) Michel VANDENBRANDEN (Structure et Fonction des Membranes Biologiques)

Composition du jury : Véronique MATHIEU (Présidente) Véronique FONTAINE (Secrétaire) Stéphanie POCHET Franck MEYER Philippe COURTOIS (Faculté de Médecine, Université libre de Bruxelles) Thierry BERNARDI (Membre du groupe européen de recherche COATIM)

2013

Faculté de Pharmacie

Remerciements

REMERCIEMENTS

Avant tout, je tiens particulièrement à remercier le Professeur Jean-Paul Dehaye qui,

par sa grande compétence scientifique, ses précieux conseils et son implication assidue m’a

aidée et soutenue tout au long de ce travail de recherche. Je le remercie très sincèrement pour

son immense disponibilité, son dynamisme et son écoute constante, attentive et constructive.

Je remercie le Professeur Michel Devleeschouwer et le Docteur Marie Tré-Hardy de

m’avoir initiée à l’étude des biofilms lors de la réalisation de mon mémoire de fin d’études.

Ils m’ont transmis leur enthousiasme, leur curiosité et m’ont convaincue de poursuivre la

recherche sur les biofilms, prometteuse dans le développement de voies thérapeutiques

innovatrices.

J’exprime vivement mes remerciements au Professeur Michel Vandenbranden pour

ses conseils et sa contribution à l’analyse des spectres infrarouges. Je le remercie ainsi que le

Professeur Philippe Courtois, pour l’intérêt qu’ils ont manifesté tout au long de ce travail

comme membres du comité d’accompagnement.

Mes remerciements s’adressent également à tous les membres du Département de

Biopharmacie, dont le Laboratoire de Chimie Biologique Médicale et de Microbiologie

Pharmaceutique, qui ont contribué au cadre de travail agréable dans lequel j’ai pu effectuer

ma thèse. Je remercie en particulier Malika, Michèle, Catherine, Jean-Marie et Anar pour le

partage de moments conviviaux et pour nos fructueux échanges durant la réalisation des

expérimentations. Merci également à Sara, Naïma, Delphine et Charaf pour leur aide et leur

sympathie.

Toute ma gratitude va au Professeur Philip S. Stewart et à Betsey Pitts pour m’avoir

accueillie au sein de leur laboratoire, lors d’un séjour au Center for Biofilm Engineering à

Bozeman (Montana, Etats-Unis). Je les remercie vivement pour leur accueil très chaleureux,

Remerciements

les nombreux échanges scientifiques et le partage de leur expertise technique en microscopie

confocale.

Je remercie le Fonds de la Recherche Scientifique (FRS-FNRS) pour son soutien

financier et la Fédération Wallonie-Bruxelles pour m’avoir nommée lauréate du Concours de

Bourse de Voyage qui m’a permis d’effectuer le séjour de trois mois aux Etats-Unis.

J’adresse mes remerciements au Docteur Olivier Denis de l’Hôpital Erasme et au

Docteur Mario Vaneechoutte de l’Université de Gent pour les souches cliniques de P.

aeruginosa. Je remercie également vivement le Professeur Stéphanie Pochet pour m’avoir

fourni les cellules HUVEC.

J’exprime aussi toute ma gratitude et mes remerciements, et non des moindres, à

l’ensemble du corps professoral et scientifique de la Faculté de Pharmacie de l’Université

libre de Bruxelles pour la qualité de l’enseignement et de la formation au cours du master en

sciences pharmaceutiques.

À titre plus personnel, j’adresse d’immenses remerciements à mes parents et mes

soeurs qui m’ont toujours soutenue et qui étaient d’une aide plus que précieuse tout au long de

ce parcours.

Enfin, toutes mes pensées vont à Clément que je remercie pour le bonheur et le soutien

qu’il m’apporte au quotidien.

Résumé

RESUME

Les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose sont colonisées par de

nombreux pathogènes, parmi lesquels la bactérie P. aeruginosa est prédominante. Après des

épisodes répétés d’infections du tractus respiratoire principalement liées à P. aeruginosa, les

patients développent une insuffisance pulmonaire associée à un déclin du statut clinique et à

une aggravation du pronostic puisqu’elle est souvent responsable du décès de ces patients. Les

infections chroniques à P. aeruginosa affectent 80 à 90 % des patients atteints de

mucoviscidose et, une fois ces infections installées, les associations actuelles d’antibiotiques

sont incapables d’éradiquer la bactérie des voies aériennes de ces patients. La chronicité des

infections est liée au développement de la bactérie sous un mode de vie particulier, le biofilm.

Les bactéries s’assemblent en communautés complexes et organisées, entourées par la

sécrétion d’une matrice extracellulaire polymérique. Ce mode de vie procure aux bactéries

présentes dans le biofilm un environnement dense et protecteur, augmentant la résistance du

pathogène au système immunitaire de l’hôte et aux antibiotiques conventionnels.

Dans la première partie de notre travail, nous avons caractérisé différentes souches de

P. aeruginosa, comprenant des souches de référence et des souches cliniques isolées des

expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Les propriétés d’adhésion, de

développement des biofilms, de mobilité, de production de rhamnolipides, l’activité

protéolytique et la production d’acylhomosérine lactones se sont avérées très différentes au

sein des souches. De plus, les caractéristiques phénotypiques des souches ne constituaient pas

une valeur prédictive de la sensibilité des bactéries à un antibiotique, soulignant la nécessité

d’étudier un panel large de souches pour caractériser l’effet d’un agent antimicrobien.

Dans la lutte pour combattre les infections et l’apparition de souches multirésistantes,

de nouvelles stratégies thérapeutiques sont développées. Les céragenines sont une famille de

molécules synthétisées dans le but de mimer la structure amphipatique des peptides

antimicrobiens responsable de leur activité bactéricide importante. Contrairement à ces

derniers, les céragenines maintiennent leur activité dans des conditions physiologiques.

Résumé

Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié l’effet d’un composé

antimicrobien appartenant à la famille des céragenines, le CSA-13, sur les différentes souches

de P. aeruginosa. Nous avons confirmé le potentiel bactéricide du CSA-13 sur des cultures

planctoniques de P. aeruginosa. Nous avons démontré qu’une concentration très faible et non

cytotoxique de CSA-13 (10 fois inférieure à la CMI), inhibait la formation d’un biofilm de 3

souches de P. aeruginosa sur les 8 testées. L’étude du potentiel zêta des souches nous a

permis de proposer un mécanisme basé sur des interactions électrostatiques pour expliquer

l’action préventive du CSA-13 sur le développement du biofilm. Une concentration plus

importante de CSA-13 a éradiqué l’entièreté d’un biofilm âgé de 24 h pour 7 des 8 souches

étudiées. Six souches ont été évaluées dans un biofilm mature et toutes ont répondu au

composé avec des concentrations croissantes ou un temps d’exposition du composé au biofilm

plus important. Aucune résistance au CSA-13 n’est apparue durant le traitement. L’usage de

la microscopie confocale à balayage laser a confirmé la rapidité et l’efficacité d’action du

CSA-13 sur un biofilm robuste et complexe de P. aeruginosa par visualisation dans le temps

et dans l’espace de l’effet du CSA-13 sur le biofilm. L’ensemble des observations de ce

travail nous a permis de conclure que 7 sur les 8 souches de P. aeruginosa étaient sensibles au

CSA-13, soit à un stade initial de la formation du biofilm, soit après maturation du biofilm.

Ces résultats soulignent le potentiel thérapeutique important, envers tous les stades de

formation et de développement du biofilm, de composés à structure amphiphile comme le

CSA-13, avec une face cationique favorisant les interactions avec les membranes bactériennes

chargées négativement et une face hydrophobe contribuant à la perturbation de ces

membranes.

Le traitement de référence actuel envers les infections à P. aeruginosa, chez les

patients souffrant de mucoviscidose, consiste en l’administration par inhalation de

tobramycine commercialisée sous le médicament TOBI®

. Nous avons investigué l’intérêt

d’une administration combinée de l’aminoglycoside avec le CSA-13. Un bénéfice évident de

la combinaison de CSA-13 et de tobramycine est apparu dans cette étude aussi bien sur

biofilm jeune que mature. Dans certaines conditions, le CSA-13 semblait même prévenir la

résistance à la tobramycine. Il sera cependant indispensable de concevoir des expériences in

vivo pour confirmer l’intérêt du CSA-13 ou d’une co-administration de CSA-13 et de la

tobramycine dans le traitement d’infections chroniques à P. aeruginosa chez des patients

atteints de mucoviscidose.

Résumé

Nos études in vitro sur cellules eucaryotes humaines ont mis en évidence une toxicité

membranaire et mitochondriale provoquée par le CSA-13 lors de l’administration de

concentrations importantes. L’association du CSA-13 avec l’acide pluronique F-127 a permis

de réduire significativement la toxicité du composé sur les membranes. Cependant,

l’association n’a pas diminué les effets délétères exercés par le CSA-13 sur l’activité

mitochondriale. Les études devront donc se poursuivre afin d’affiner la compréhension du

mécanisme d’action des céragenines et de pouvoir déceler des dérivés moins toxiques.

L’évaluation de l’activité in vivo du composé devrait nous éclairer quant à la fenêtre

thérapeutique utilisable en clinique.

Dans la troisième partie de ce travail, nous avons investigué le potentiel anti-

Pseudomonas du peptide antimicrobien LL-37, appartenant à la famille des cathélicidines. Les

peptides antimicrobiens partagent quelques caractéristiques communes ; leur cationicité, une

structure amphiphile et un nombre de résidus compris entre 10 et 50. L’intérêt pour ces

peptides dans le but de combattre les infections s’est fortement développé ces dernières

années face à l’émergence fulgurante de souches multirésistantes à l’antibiothérapie

conventionnelle. En effet, ces peptides possèdent un très large spectre antimicrobien et sont

très peu susceptibles d’induire une résistance. Malgré le haut pouvoir antibactérien du peptide

LL-37, l’utilisation clinique de ce peptide doit contourner certains inconvénients majeurs

avant de tirer pleinement profit de la molécule. Dans ce but, nous avons étudié une librairie de

fragments dérivés du peptide initial pour leur activité sur les différents stades de

développement du pathogène. Dans ce travail, nous avons caractérisé de plus petits fragments,

notamment les peptides LL7-37 et LL7-31, possédant une activité antibactérienne et

antibiofilm considérable sur P. aeruginosa. Ils inhibaient la croissance de cultures

planctoniques du pathogène et prévenaient le développement d’un biofilm par cette souche.

Cette étude est également la première à avoir investigué l’activité des différents fragments

dérivés du LL-37 sur un biofilm préformé de P. aeruginosa : nous avons ainsi souligné

l’efficacité de ces peptides sur des biofilms préformés avec une architecture tridimensionnelle

complexe. Nous avons également mis en évidence un avantage essentiel à l’utilisation de ces

deux dérivés : leur toxicité réduite sur les cellules eucaryotes. Des études de spectroscopie

infrarouge à transformée de Fourier à réflexion totale atténuée ont identifié une structure

secondaire en hélice-α pour les peptides actifs sur P. aeruginosa. La liaison des peptides aux

lipopolysaccharides de P. aeruginosa pour exercer leur activité, a également été proposée

dans ce travail. Le mécanisme d’action complet de ces peptides antimicrobiens n’est pas

Résumé

encore entièrement élucidé et semble impliquer différentes cibles, comme souligné par nos

expérimentations de perméabilisation des membranes internes et externes des bactéries.

L’expérimentation in vivo sera indispensable pour concrétiser le potentiel de ces dérivés

peptidiques.

En conclusion, ce travail démontre que les stéroïdes cationiques antimicrobiens

dérivés de l’acide cholique ainsi que les fragments LL7-37 et LL7-31 dérivés de la

cathélicidine humaine, offrent de nouvelles perspectives pour l’éradication de souches

résistantes de P. aeruginosa se développant dans un biofilm. Ils sont un modèle de composés

prometteurs aussi bien pour le traitement d’infections aiguës que pour le traitement

d’infections chroniques provoquées par ce pathogène et qui sont si fréquentes et souvent

fatales chez les patients souffrant de mucoviscidose.

Abréviations

LISTE DES ABREVIATIONS

3-oxo-C12-HSL : N-(3-oxododecanoyl)-L-

homosérine lactone

A. tumefaciens : Agrobacterium

tumefaciens

A. xylosoxidans : Achromobacter

xylosoxidans

AB : Agrobacterium

ABC : ATP Binding cassette

ADN : acide désoxyribonucléique

ADP : adénosine diphosphate

aGM1 : récepteur asialoGM1

AHL : acylhomosérine lactone

AMPc : adénosine 5’-monophosphate

cyclique

ANOVA : analyse de variance

ARN : acide ribonucléique

ASTM : American Society for Testing and

Materials

ATCC : American Type Culture

Collection

ATP : adénosine 5’-triphosphate

ATR-FTIR : spectroscopie infrarouge à

transformée de Fourier à réflexion totale

atténuée

B. cepacia : Burkholderia cepacia

B. pseudomallei : Burkholderia

pseudomallei

B. thailandis : Burkholderia thailandis

BBM : Bouillon Biofilm Modifié

BFRT® : Biofilm Ring Test

®

BHI : Brain Heart Infusion

BM2 : Biofilm Modifié

C. albicans : Candida albicans

C4-HSL : N-butyryl-L-homosérine lactone

CAMHB : Mueller Hinton Broth ajusté en

ions Ca2+

et Mg2+

CAMP : Cathelicidin Antimicrobial

peptide

CCM : chromatographie sur couche mince

CDC : Center for Disease Control

CFF : Cystic Fibrosis Foundation

CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrane

Conductance Regulator

CLSI : Clinical and Laboratory Standards

Institute

CMB : concentration minimale bactéricide

CMI : concentration minimale inhibitrice

CSA : Cationic Steroid Antibiotics

CV : cristal violet

DDAO : 7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-

dimethylacridin-2-one)

DMSO : diméthylsulfoxide

DO : densité optique

E. coli : Escherichia coli

ECR : élastine congo rouge

EDTA : acide éthylène diamine

tétraacétique

EGM : Endothelial Growth Medium

EGTA : acide éthylène glycol-bis(2-

aminoéthyléther)-N,N,N’,N’-tétraacétique

ENaC : Epithelial Na+ Channel

ExoS : exoenzyme S

ExoT : exoenzyme T

ExoU : exoenzyme U

ExoY : exoenzyme Y

F. novicida : Francisella novicida

FDA : Food and Drug Administration

FPRL-1 : Formyl Peptide Receptor Like-1

FTIR : spectroscopie infrarouge à

transformée de Fourier

GFP : green fluorescent protein

H. influenzae : Haemophilus influenzae

H. pylori : Helicobacter pylori

hBD : β-défensine humaine

hCAP18 : human cationic antimicrobial

peptide

HDP : host defence peptide

hEGF : facteur de croissance épidermique

humain

HEPES : acide N-[2-hydroxyéthyl]

pipérazine-N’-[2-éthanesulfonique]

HIV : Human Immunodeficiency Virus

HNP : Human Neutrophil Peptide

Abréviations

HPLC : chromatographie en phase liquide

à haute performance

HSL : homosérine lactone

HSV : Herpes Simplex Virus

HUVEC : Human Umbilical Vein

Endothelial Cells

IFB : indice de formation du biofilm

IFN : interféron

IL : interleukine

IP : iodure de propidium

K. pneumoniae : Klebsiella pneumoniae

L. monocytogenes : Listeria

monocytogenes

LB : Luria Bertani

LDH : lactate déshydrogénase

LPO : lactoperoxydase

LPS : lipopolysaccharides

LRP : LDL receptor-related protein

MCBL : microscopie confocale à balayage

laser

MCT : mercure cadium tellure

MDR-PA : P. aeruginosa multirésistant

MH : Mueller Hinton

MRSA : S. aureus résistant à la

méthicilline

MS : Mineral Salt

MTT : bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-

2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium

MU : 4-méthylumbelliférone

MUG : 4-méthy-lumbelliféryl β-D-

galactopyranoside

N. gonorrhoeae : Neisseria gonorrhoeae

NADH/NAD+ : nicotinamide adénine

dinucléotide réduit/oxydé

NDA : New Drug Application

NIH : National Institute of Health

NO : monoxyde d’azote

NPN : 1-N-phénylnaphtylamine

ONP : o-nitrophénol

ONPG : orthonitrophényl-β-galactoside

ORCC : Outward rectifying Cl- Channel

P. aeruginosa : Pseudomonas aeruginosa

P. mirabilis : Proteus mirabilis

PAM : peptide(s) antimicrobien(s)

PB : Pseudomonas Broth

pb: paires de base

PBS : tampon phosphate salin

PC : Lα-Phosphatidylcholine

PCR : réaction en chaîne par polymérase

PKA : protéine kinase AMPc dépendante

PM : poids moléculaire

PMB : polymyxine B

POPG : Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-

[Phospho-rac-(1-glycerol)]

PPGAS : Proteose Peptone-Glucose-

Ammonium Salts

PQS : Pseudomonas quinolone signal

QS : quorum sensing

R2 : coefficient de corrélation

RFP : red fluorescent protein

RMN : résonance magnétique nucléaire

ROS : espèces réactives de l’oxygène

S. aureus : Staphylococcus aureus

S. epidermidis : Staphylococcus

epidermidis

S. maltophilia : Stenotrophomonas

maltophilia

S. pyogenes : Streptococcus pyogenes

S. typhimurium : Salmonella typhimurium

SBI : solution bactérienne initiale

SD : déviation standard

SEM : écart étalon de la moyenne

SEP : substrat extracellulaire polymérique

SIC : inhibiteur streptococcique du

complément

SP-A : protéine A du surfactant

pulmonaire

t1/2 : temps de demi-vie

TCA : acide trichloroacétique

TFA : trifluoroacétate

TMRE : tétraméthylrhodamine éthyl ester

TNF : facteur de nécrose tumorale

tpm : tours par minute

TRIS : tris(hydroxyméthyl)-aminométhane

TSA : Tryptic Soy Agar

TSB : Tryptic Soy Broth

TTSS : système de sécrétion de type III

u.a. : unités d’absorbance

u.a.f. : unités arbitraires de fluorescence

ufc : unité formant colonies

V. fischeri : Vibrio fischeri

X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-

galactopyranoside

Table des matières

1

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION

I. LA MUCOVISCIDOSE .............................................................................................................................. 6

I.1 ASPECTS GENETIQUES ............................................................................................................................ 6 I.2 LA PROTEINE CFTR ................................................................................................................................... 7 I.3 PREDISPOSITION AUX INFECTIONS RESPIRATOIRES....................................................................... 8 I.4 COLONISATION BACTERIENNE DES POUMONS .............................................................................. 10 I.5 PATHOGENESE DU DECLIN PULMONAIRE PAR P. AERUGINOSA .................................................. 11 I.6 PRISE EN CHARGE ACTUELLE DE LA MUCOVISCIDOSE ................................................................ 16

II. PSEUDOMONAS AERUGINOSA ............................................................................................................ 18

II.1 MICROBIOLOGIE GENERALE .............................................................................................................. 18 II.2 PATHOGENICITE DE P. AERUGINOSA ................................................................................................ 19

II.2.1 Facteurs de virulence cellulaires ....................................................................................................... 19 II.2.2 Facteurs de virulence sécrétés ........................................................................................................... 21

II.3 LE QUORUM SENSING .......................................................................................................................... 25 II.3.1 Quorum sensing de type LuxI/LuxR ................................................................................................... 25 II.3.2 Quorum sensing chez P. aeruginosa .................................................................................................. 26

III. LE BIOFILM ................................................................................................................................................ 29

III.1 LE BIOFILM : UN MODE DE VIE PARTICULIER ............................................................................... 29 III.2 LA MATRICE DU BIOFILM DE P. AERUGINOSA ............................................................................... 30 III.3 LES ETAPES DE LA FORMATION DU BIOFILM DE P. AERUGINOSA ............................................ 31 III.4 LES MECANISMES DE RESISTANCE DU BIOFILM DE P. AERUGINOSA ...................................... 35

III.4.1 La résistance du biofilm envers les agents antimicrobiens ............................................................... 35 III.4.2 La résistance du biofilm envers les défenses de l’hôte ..................................................................... 38

IV. LES PEPTIDES ANTIMICROBIENS .................................................................................................... 40

IV.1 DES PEPTIDES COMME NOUVELLES STRATEGIES THERAPEUTIQUES ................................... 40 IV.2 LL-37, UN PEPTIDE ANTIMICROBIEN HUMAIN .............................................................................. 40 IV.3 MECANISMES D’ACTION ANTIMICROBIENNE DES PAM ............................................................ 42

IV.3.1 Attraction peptide-membrane ........................................................................................................... 43 IV.3.2 Liaison peptide-membrane ................................................................................................................ 43 IV.3.3 Interaction peptide-membrane .......................................................................................................... 44 IV.3.4 Cibles intracellulaires ....................................................................................................................... 46 IV.3.5 Mécanismes d’action antimicrobienne du LL-37 .............................................................................. 46 IV.3.6 Sélectivité cellulaire .......................................................................................................................... 49

IV.4 DES PEPTIDES QUI CONTOURNENT LA RESISTANCE BACTERIENNE ...................................... 49 IV.5 DES PEPTIDES MULTIFONCTIONNELS ............................................................................................ 51 IV.6 MECANISMES DE RESISTANCE AUX PAM ...................................................................................... 53

IV.6.1 Protéases ........................................................................................................................................... 54

IV.6.2 Molécules extracellulaires liant les PAM ......................................................................................... 54 IV.6.3 Pompes à efflux ................................................................................................................................. 54 IV.6.4 Altération des propriétés de la surface cellulaire ............................................................................. 55

IV.7 APPLICATION CLINIQUE DES PAM : OBSTACLES ET AVANCEES ............................................. 56 IV.7.1 Coût de la production ....................................................................................................................... 56 IV.7.2 Sensibilité aux conditions physiologiques et aux protéases .............................................................. 57 IV.7.3 Profil toxicologique .......................................................................................................................... 60

Table des matières

2

IV.7.4 Développement clinique actuel des PAM .......................................................................................... 61

V. LES CERAGENINES ............................................................................................................................... 62

V.1 PROPRIETES ANTIBACTERIENNES DU CSA-13 ............................................................................... 62 V.2 CSA-13 ET MUCOVISCIDOSE ............................................................................................................... 63

BUT DU TRAVAIL

MATERIEL ET METHODES

I. MATERIEL ............................................................................................................................................... 68

I.1 SOUCHES BACTERIENNES .................................................................................................................... 68 I.2 AGENTS ANTIBACTERIENS .................................................................................................................. 69

II. METHODES .............................................................................................................................................. 70

II.1 FORMATION DES BIOFILMS ................................................................................................................ 70 II.1.1 Formation des biofilms par le BFRT

® ............................................................................................... 70

II.1.2 Formation des biofilms par coloration au cristal violet (CV) ............................................................ 71 II.1.3 Formation des biofilms par dénombrement ....................................................................................... 71

II.2 MOTILITE DES SOUCHES ..................................................................................................................... 72 II.3 PRODUCTION DE RHAMNOLIPIDES .................................................................................................. 72 II.4 SENSIBILITE A UN ANTIBIOTIQUE .................................................................................................... 73 II.5 ACTIVITE PROTEOLYTIQUE................................................................................................................ 73 II.6 ACTIVITE ELASTOLYTIQUE ................................................................................................................ 74 II.7 PRODUCTION D’AHL............................................................................................................................. 75

II.7.1 Production des Cn≥6-HSL ................................................................................................................... 75 II.7.2 Production des C4-HSL ...................................................................................................................... 78 II.7.3 Détection et séquençage de 4 gènes du QS ........................................................................................ 79

II.8 POTENTIEL ZETA ................................................................................................................................... 80 II.9 ETUDE SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES .............................................................................. 81

II.9.1 Détermination de la CMI et de la CMB ............................................................................................. 81 II.9.2 Essai de viabilité par perméabilisation au 1-N-phénylnaphtylamine (NPN) ................................... 161 II.9.3 Interaction du CSA-119 avec P. aeruginosa ...................................................................................... 82 II.9.4 Essai de viabilité par dénombrement ................................................................................................. 83 II.9.5 Essai de viabilité par perméabilisation à l’iodure de propidium (IP) ............................................... 83

II.10 ETUDE SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM ................................................................................. 84 II.11 ETUDE SUR UN BIOFILM PREFORME .............................................................................................. 84

II.11.1 Etude par dénombrement sur un biofilm préformé .......................................................................... 84 II.11.2 Etude par MCBL sur un biofilm préformé ....................................................................................... 86

II.12 TOXICITE SUR CELLULES EUCARYOTES (HUVEC) ...................................................................... 90 II.12.1 Evaluation de la libération de la lactate déshydrogénase (LDH) .................................................... 90 II.12.2 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium .......................................................................... 181 II.12.3 Evaluation de l’activité mitochondriale (test MTT) ......................................................................... 92 II.12.4 Evaluation du potentiel de membrane mitochondrial ...................................................................... 93

II.13 ETUDE DES STRUCTURES SECONDAIRES DES PEPTIDES A L’AIDE DE LA SPECTROSCOPIE

INFRAROUGE A TRANSFORMEE DE FOURIER A REFLEXION TOTALE ATTENUEE (ATR-FTIR) 94 II.13.1 Etude des structures secondaires des peptides seuls........................................................................ 94 II.13.2 Etude des structures secondaires des peptides au contact de liposomes ......................................... 95

II.14 FIXATION DES PEPTIDES AUX LPS .................................................................................................. 96 II.14.1 Synthèse de la dansyl-PMB .............................................................................................................. 96 II.14.2 Dosage de la dansyl-PMB par dinitrophénylation........................................................................... 97 II.14.3 Effet des peptides sur la fixation de la dansyl-PMB aux LPS .......................................................... 97

II.15 PERMEABILISATION DES MEMBRANES DE E. COLI ML-35P ...................................................... 98 II.16 ANALYSES STATISTIQUES ................................................................................................................ 99

Table des matières

3

CHAPITRE I : CARACTERISATION PHENOTYPIQUE DES

SOUCHES

I. INTRODUCTION ................................................................................................................................... 101

II. RESULTATS ........................................................................................................................................... 102

II.1 FORMATION DES BIOFILMS .............................................................................................................. 102 II.1.1 Formation des biofilms par le BFRT

® ............................................................................................. 102

II.1.2 Formation des biofilms par coloration au CV ................................................................................. 103 II.1.3 Formation des biofilms par dénombrement ..................................................................................... 104

II.2 MOTILITE DES SOUCHES ................................................................................................................... 105 II.3 PRODUCTION DE RHAMNOLIPIDES ................................................................................................ 106 II.4 SENSIBILITE A UN ANTIBIOTIQUE .................................................................................................. 106 II.5 ACTIVITE PROTEOLYTIQUE.............................................................................................................. 107 II.6 ACTIVITE ELASTOLYTIQUE .............................................................................................................. 107 II.7 PRODUCTION D’AHL........................................................................................................................... 108

II.7.1 Production des Cn≥6-HSL ................................................................................................................. 108 II.7.2 Production des C4-HSL .................................................................................................................... 110 II.7.3 Détection et séquençage de 4 gènes du QS ...................................................................................... 110

II.8 CORRELATIONS ENTRE LA PRODUCTION D’AHL ET DES CARACTERISTIQUES

PHENOTYPIQUES ....................................................................................................................................... 112

III. DISCUSSION ........................................................................................................................................... 113

CHAPITRE II : ETUDE DU CSA-13

I. INTRODUCTION ................................................................................................................................... 122

II. RESULTATS ........................................................................................................................................... 124

II.1 EFFET DU CSA-13 SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES ......................................................... 124 II.1.1 Détermination de la CMI et de la CMB ........................................................................................... 124 II.1.2 Effet du CSA-13 sur la perméabilité au NPN................................................................................... 124

II.2 EFFET DU CSA-13 SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM .............................................................. 125 II.2.1 Effet d’une faible concentration en CSA-13 sur la formation d’un biofilm ..................................... 125 II.2.2 Etude de la cinétique d’interaction du CSA-119 avec 8 souches de P. aeruginosa ......................... 126 II.2.3 Effet du CSA-13 sur la production de rhamnolipides ...................................................................... 127 II.2.4 Etude du potentiel zêta ..................................................................................................................... 128

II.3 EFFET DU CSA-13 SUR UN BIOFILM PREFORME ........................................................................... 130 II.3.1 Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé – étude par dénombrement ............................................. 130 II.3.2 Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé – étude par MCBL .......................................................... 135

II.4 TOXICITE DU CSA-13 SUR CELLULES EUCARYOTES .................................................................. 138 II.4.1 Evaluation de la libération de la LDH ............................................................................................. 138 II.4.2 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium ............................................................................ 138

II.5 EFFET DE L’ASSOCIATION CSA-13 ET ACIDE PLURONIQUE F-127 ........................................... 139 II.5.1 Activité antibactérienne de l’association CSA-13 et acide pluronique F-127 ................................. 139 II.5.2 Toxicité de l’association CSA-13 et acide pluronique F-127 sur cellules eucaryotes ..................... 140

III. DISCUSSION ........................................................................................................................................... 143

Table des matières

4

CHAPITRE III : ETUDE DU PEPTIDE LL-37 ET DE SES

DERIVES

I. INTRODUCTION ................................................................................................................................... 157

II. RESULTATS ........................................................................................................................................... 158

II.1 SEQUENCES ET CARACTERISTIQUES DES PEPTIDES .................................................................. 158 II.2 EFFET DES PEPTIDES SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES ................................................... 159

II.2.1 Determination de la CMI et de la CMB ........................................................................................... 159 II.2.2 Effet des peptides sur la perméabilité à l’IP .................................................................................... 159 II.2.3 Relation entre perméabilité membranaire et mort cellulaire ........................................................... 161

II.3 EFFET DES PEPTIDES SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM ........................................................ 162 II.4 EFFET DES PEPTIDES SUR UN BIOFILM PREFORME – ETUDE PAR MCBL ............................... 163

II.4.1 Effet des peptides sur un biofilm préformé dans une microplaque .................................................. 163 II.4.2 Effet des peptides sur un biofilm préformé dans un réacteur CDC ................................................. 165

II.5 ETUDE DES STRUCTURES SECONDAIRES DES PEPTIDES A L’AIDE DE LA SPECTROSCOPIE

INFRAROUGE A TRANSFORMEE DE FOURIER A REFLEXION TOTALE ATTENUEE (ATR-FTIR) 170 II.5.1 Etude des structures secondaires des peptides seuls........................................................................ 170 II.5.2 Etude des structures secondaires des peptides au contact de liposomes ......................................... 172

II.6 FIXATION DES PEPTIDES AUX LPS .................................................................................................. 173 II.6.1 Synthèse de la dansyl-PMB .............................................................................................................. 173 II.6.2 Dosage de la dansyl-PMB par dinitrophénylation........................................................................... 173 II.6.3 Effet des peptides sur la fixation de la dansyl-PMB aux LPS .......................................................... 174

II.7 EFFET DES PEPTIDES SUR LA PERMEABILISATION DES MEMBRANES DE E. COLI ML-35P 175 II.8 TOXICITE DES PEPTIDES SUR CELLULES EUCARYOTES ............................................................ 176

II.8.1 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium ............................................................................ 176 II.8.2 Evaluation de la libération de la LDH ............................................................................................. 177 II.8.3 Evaluation de l’activité mitochondriale ........................................................................................... 177

III. DISCUSSION ........................................................................................................................................... 178

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

LISTE BIBLIOGRAPHIQUE

ANNEXES

Introduction

5

INTRODUCTION

Figure 1 : Classification des mutations du gène CFTR

Classe I : absence de synthèse de la protéine ou arrêt prématuré menant à la production d’une

protéine aberrante, tronquée ; Classe II : maturation défectueuse de la protéine et dégradation

prématurée de la protéine malformée dans le système réticulo-endoplasmique – appareil de

Golgi ; Classe III : mutation affectant la régulation de la protéine CFTR notamment au niveau

des interactions entre l’ATP et les sites de fixation des nucléotides ; Classe IV : altération de

la conduction ionique par une ouverture du canal défectueuse diminuant la perméabilité au

chlore ; Classe V : réduction de la synthèse de CFTR due à une anomalie de l’épissage du

transcrit ; Classe VI : transfert acceléré de la surface cellulaire vers le cytoplasme réduisant

l’expression membranaire du canal CFTR ou sa stabilité (Boyle et De Boeck, 2013).

Introduction

6

I. LA MUCOVISCIDOSE

La mucoviscidose est la plus fréquente des maladies génétiques graves dans les

populations d’origine caucasienne. Elle touche approximativement 1 sur 3500 naissances aux

Etats-Unis (Cystic Fibrosis Foundation, 2010). L’affection héréditaire est présente sur

l’entièreté du globe, mais sa prévalence varie en fonction des régions du monde. L’incidence

est beaucoup plus faible en Afrique et en Asie.

I.1 ASPECTS GENETIQUES

La mucoviscidose est une maladie à transmission autosomique récessive causée par le

dysfonctionnement d’un seul gène, le gène CFTR, codant pour la protéine transmembranaire

CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) (Riordan et al., 1989). Le

gène CFTR comprend environ 180000 paires de bases (pb) situées sur le bras long du

chromosome 7 et est exprimé dans de nombreuses cellules épithéliales et sanguines. La

protéine CFTR, de 1480 acides aminés, appartient à la famille des transporteurs ABC (ATP

Binding Cassette) et fonctionne principalement comme un canal chlore à la membrane apicale

de cellules épithéliales des organes cibles (poumon, intestin et glandes sudoripares). A ce

jour, plus de 1900 mutations distinctes du gène CFTR associées à la maladie ont été décrites.

Les mutations peuvent être classées en 6 catégories sur base du mécanisme par lequel elles

affectent la protéine CFTR (atteinte de la synthèse, du transport, de la fonction ou de la

stabilité du canal CFTR) (Rowe et al., 2005 ; Amaral et Kunzelmann, 2007 ; Boyle et De

Boeck, 2013). Les conséquences fonctionnelles de toutes les mutations recensées ne sont pas

clairement établies et la majorité de ces mutations sont rares (The Cystic Fibrosis Mutation

Database). Les mutations des classes I, II et III auraient des conséquences phénotypiques plus

importantes liées à une maladie plus sévère. La mutation la plus fréquente est la mutation

ΔF508 (mutation de classe II) qui correspond à la délétion de la phénylalanine en position 508

de la protéine due à une délétion de 3 nucléotides au niveau du gène. Elle touche plus de 80 %

des patients. Sept % des patients sont victimes des mutations de classe I et 3 % des mutations

de classe III. Les classes IV et V sont liées à un taux de mortalité plus faible et à un phénotype

clinique plus doux (McKone et al., 2003).

Figure 2 : Modèle de la structure de la protéine CFTR

La protéine CFTR est composée de deux motifs répétés, formés chacun de 6 domaines

transmembranaires (TM1 et TM2) et d’un site de fixation aux nucléotides (SFN1 et SFN2),

séparés par un domaine régulateur (R). Les domaines TM forment un pore dans la cellule. Le

pore est maintenu fermé par le domaine R sous sa forme non phosphorylée. La

phosphorylation par une protéine kinase AMPc dépendante (PKA) permet un changement

morphologique et l’interaction entre les SFNs et l’ATP. Cette phosphorylation est nécessaire

pour l’ouverture du pore. L’ouverture du pore requiert l’hydrolyse de l’ATP après la

phosphorylation du domaine R. Adapté d’après Davidson et Dorin, 2001.

Introduction

7

I.2 LA PROTEINE CFTR

La protéine CFTR est exprimée principalement au niveau du pôle apical de l’ensemble

des cellules épithéliales de l’organisme recouvrant notamment les voies aériennes, le tractus

digestif, l’appareil génital et les glandes sudoripares. La protéine est également exprimée dans

d’autres types cellulaires comme les lymphocytes, les polynucléaires ou les macrophages

(McDonald et al., 1992 ; Yoshimura et al., 1991 ; Di et al., 2006). Il s’agit d’un canal ionique

dont la fonction principale est de permettre le passage des ions chlore (Bear et al., 1992) et qui

est régulé par l’AMPc et l’ATP. La protéine agit également comme régulateur des canaux

sodium ENaC (Epithelial Na+ Channel) et potassium. La protéine CFTR possède deux

segments transmembranaires (TM1 et TM2) composés chacun de six régions

transmembranaires, deux sites de fixation des nucléotides (SFN1 et SFN2) et un domaine

régulateur cytoplasmique (R). L’interaction de l’ATP avec le domaine régulateur entraîne sa

phosphorylation par l’intermédiaire d’une protéine kinase AMPc dépendante (PKA). L’ATP

se fixe au SFN1 et, après hydrolyse, modifie la conformation de la protéine ce qui provoque

l’ouverture du canal chlore (Cheng et al., 1991 ; Hwang et al., 1994 ; Zeltwanger et al., 1999).

La sortie des ions chlore entraîne un gradient électrochimique. S’ensuit la déphosphorylation

et l’interaction de l’ATP avec le SFN2 qui conduit à la fermeture du canal chlore.

Chez les patients souffrant de mucoviscidose, le dysfonctionnement du canal CFTR

entraîne une perturbation du transport des ions. Les anomalies de la sécrétion d’eau et d’ions

affectent principalement l’arbre trachéo-bronchique et les canaux de différents organes dont

ceux du pancréas exocrine, de l’intestin, des tubes séminifères et des glandes sudoripares. Au

niveau pulmonaire, les cellules épithéliales expriment les protéines CFTR et ORCC (Outward

Rectifying Cl- Channel), responsables du flux des ions chlore, et des canaux sodiques ENaC

intervenant dans le transport transépithélial du sodium. Dans le poumon, la protéine CFTR

active indirectement l’ouverture du canal ORCC qui permet la sortie des ions chlore et inhibe

le canal ENaC, qui permet l’entrée des ions sodium (Stutts et al., 1997). Chez les patients

atteints de mucoviscidose, le dysfonctionnement ou l’absence de la protéine CFTR, entraîne

une absorption excessive de sodium par le canal sodium épithélial. Le chlore accompagne le

sodium non pas via le CFTR mais plutôt par voie paracellulaire. L'augmentation du gradient

transépithélial de chlorure de sodium contribue à une réabsorption importante d'eau avec la

formation d’un mucus visqueux et épais tapissant l’arbre trachéo-bronchique. La

Figure 3 : « Hypothèse du faible volume »

Figure A : Illustration de l’ « hypothèse du faible volume » avec un transport des électrolytes

et un volume de liquide de surface des voies aériennes normal chez les sujets sains (gauche)

en contraste avec une déplétion du volume du liquide de surface suite à une altération du

transport des électrolytes chez les sujets malades (droite) (Wine, 1999). Figure B :

Représentation de la déplétion de volume du liquide des voies aériennes observée chez les

sujets sains (gauche) et atteints de mucoviscidose (droite). Chez les sujets sains les cils des

cellules épithéliales éliminent efficacement les particules ou les microorganismes qui sont

piégés dans le mucus fin et fluide (un processus appelé clairance mucociliaire). Chez les

patients atteints de mucoviscidose, les cils ne sont plus capables d’éliminer la couche de

mucus visqueux et déshydraté ; il en résulte la colonisation par des bactéries comme P.

aeruginosa (Matsui et al., 1998).

Introduction

8

déshydratation des sécrétions et du mucus est responsable de l’obstruction progressive des

bronches et de l’apparition de l’infection et de l’inflammation conduisant à une insuffisance

respiratoire. Au niveau des glandes sudoripares, on retrouve une concentration en sel élevée

dans la sueur chez les patients atteints de mucoviscidose. Cette caractéristique est à l’origine

du « test à la sueur », pratiqué dans le dépistage de la mucoviscidose.

I.3 PREDISPOSITION AUX INFECTIONS RESPIRATOIRES

Le mécanisme exact liant le dysfonctionnement de la protéine CFTR à la maladie

clinique reste incertain. Plusieurs mécanismes sont proposés pour expliquer la prédisposition

des patients atteints de mucoviscidose aux infections respiratoires (Davies, 2002 ; Hiemstra,

2007 ; Hauser et al., 2011).

(1) L’hypothèse la plus acceptée pour expliquer comment les mutations au niveau de la

protéine CFTR mènent à la colonisation des voies respiratoires par les bactéries est

l’« hypothèse du faible volume » (Sequeiros et Jarad, 2013).

La clairance mécanique du mucus est considérée comme un mécanisme de défense

inné primordial dans les voies respiratoires (Knowles et Boucher, 2002). Le mucus

recouvre l’épithélium respiratoire et constitue, avec la présence des cils à la surface de

l’épithélium, un mécanisme essentiel de défense de l’hôte par son rôle de piège des

bactéries et des particules. L’action des cils permet ensuite leur expulsion. La

clairance mucociliaire requiert un système fonctionnel à deux couches de mucus

composé d’une couche de liquide périciliaire de faible viscosité et d’une couche

superficielle de mucus. Ces deux couches forment le liquide de surface des voies

respiratoires. Le fluide périciliaire fournit un environnement aqueux qui permet le

battement des cils et la propulsion du mucus loin vers les voies aériennes supérieures.

La clairance appropriée de l'appareil respiratoire nécessite une interaction coordonnée

du mucus et de la couche de liquide périciliaire ainsi qu’une hydratation adéquate de

la surface des voies respiratoires.

L’« hypothèse du faible volume » a été avancée par Matsui et ses collègues. Dans ce

modèle la diminution du transport des ions chlore, liée à une protéine CFTR absente

ou altérée, entraîne l’hyperabsorption de sodium (augmentation de l’activité du canal

Figure 4 : Hypothèses expliquant la prédilection de P. aeruginosa dans les voies

respiratoires des patients atteints de mucoviscidose

(1) La clairance mucociliaire entravée liée au mucus épais et visqueux et à la déshydratation

de la surface des voies respiratoires ; (2) La forte teneur en sel du liquide de surface des voies

respiratoires entraînant l’inhibition de l’activité des PAM ; (3) L’augmentation de la

disponibilité des récepteurs de surface liant le pathogène (aGM1 = asialoGM1) ; (4)

L’internalisation défectueuse de P. aeruginosa par les cellules épithéliales ; (5) Les taux

faibles de molécules de défense comme le NO, le glutathion et la LPO (Davies, 2002).

Introduction

9

ENaC) et d’eau et réduit ainsi le volume du liquide périciliaire à la surface des cellules

épithéliales des voies respiratoires. Le battement des cils et, par conséquent, la

clairance mucociliaire y sont entravés. Ce modèle favorise le contact du pathogène

avec les cellules épithéliales (Matsui et al., 1998).

(2) La stérilité des voies aériennes inférieures est rendue possible par un mécanisme de

défense efficace impliquant la clairance mécanique mais aussi la sécrétion de

molécules effectrices du système immunitaire inné. Les peptides antimicrobiens

(PAM) et les protéines sont des composants essentiels de ce système immunitaire. Les

classes principales de PAM produites par les poumons sont les β-défensines et les

cathélicidines (LL-37) (Hiemstra, 2007). L’activité de ces médiateurs antimicrobiens

est limitée en présence de fortes concentrations en sel.

Par opposition au modèle « du faible volume », Smith et ses collègues proposent

l’ « hypothèse de la forte teneur en sel ». D’après ces auteurs, le liquide de surface des

voies respiratoires présente une concentration en sel élevée liée à une réabsorption

restreinte des ions chlore et par conséquent une rétention des ions sodium dans le

liquide de surface des voies respiratoires (Smith et al., 1996 ; Zabner et al., 1998). Ce

niveau élevé en sel est responsable de l’inhibition de l’activité des PAM, dont les β-

défensines et le peptide LL-37/hCAP-18, qui ne parviennent plus à tuer le pathogène

(Goldman et al., 1997 ; Bals et al., 1998a et 1998b).

D’autres hypothèses expliquent la susceptibilité augmentée aux infections chez les

patients atteints de mucoviscidose liée à une fonction inadéquate des médiateurs

antimicrobiens. La présence dans les poumons des patients souffrant de mucoviscidose de

concentrations importantes de protéases est responsable de la dégradation des PAM et

contribue à leur inactivation (Taggart et al., 2003). Bucki et ses collègues ont montré la

présence dans les expectorations de molécules comme l’ADN et la F-actine, qui se lient aux

PAM et entraînent leur inhibition (Bucki et al., 2007a).

(3) Les récepteurs asialoGM1 lient le pathogène P. aeruginosa. Chez les patients atteints

de mucoviscidose, on a montré une augmentation de leur expression à la surface des

cellules épithéliales des voies respiratoires. Ceci accroît la liaison de la bactérie à la

surface épithéliale contribuant à la colonisation bactérienne (Saiman et Prince, 1993).

Figure 5 : Prévalence en fonction de l’âge de plusieurs pathogènes respiratoires

dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose

Rapport des données annuelles de la CFF (Cystic Fibrosis Foundation, 2010). MRSA = S.

aureus résistant à la méthicilline ; MDR-PA = P. aeruginosa multirésistant.

Introduction

10

(4) Chez les sujets sains, la protéine CFTR joue un rôle de récepteur pour P. aeruginosa

au niveau des cellules épithéliales. La liaison de P. aeruginosa sur CFTR provoque

son internalisation et sa clairance du tractus respiratoire, participant à la défense

pulmonaire de l’hôte. Dans les cellules épithéliales pulmonaires exprimant un canal

CFTR muté, ces fonctions sont défectueuses et la clairance du pathogène entravée

(Pier et al., 1996 ; Pier et al., 1997).

(5) Le dysfonctionnement de la protéine CFTR entraîne une diminution de la production

de la NO synthase chez les patients souffrant de mucoviscidose. Le monoxyde d’azote

(NO) possédant des propriétés antibactériennes, son absence prédispose à la

colonisation bactérienne pulmonaire (Kelley et Drumm, 1998). La sécrétion de

glutathion, aux propriétés antioxydantes, est également défectueuse chez les patients

atteints de mucoviscidose (Gao et al., 1999).

La lactoperoxidase (LPO) intervient dans les mécanismes de défense de l’hôte des

voies aériennes. L’enzyme utilise l’H2O2 pour catalyser l’oxydation du thiocyanate

(SCN-) en produit antibactérien (OSCN

-). Chez les sujets sains, la protéine CFTR

entraîne l’efflux de SCN- à la surface apicale des cellules épithéliales. Chez les sujets

atteints de mucoviscidose, le dysfonctionnement de la protéine CFTR empêche

l’accumulation de SCN- et altère l’activité antibactérienne de la LPO (Conner et al.,

2007).

I.4 COLONISATION BACTERIENNE DES POUMONS

La prédisposition à une infection par un pathogène spécifique change avec l’âge pour

les patients atteints de mucoviscidose. Chez les enfants et les adolescents, S. aureus est le

pathogène le plus fréquemment isolé, bien que P. aeruginosa et H. influenzae soient aussi

prévalents. La fréquence de cultures positives pour P. aeruginosa augmente avec l’âge.

D’après le Registre des Patients du CFF, environ la moitié des patients en dessous de 18 ans

sont colonisés par P. aeruginosa et à la fin de la vingtaine, le pathogène est isolé chez 80 %

des patients malades (Cystic Fibrosis Foundation, 2010). B. cepacia est moins fréquent mais

colonise malgré tout les poumons d’une minorité substantielle d’adultes. D’autres

microorganismes comme A. xylosoxidans et S. maltophilia sont représentés avec des

Introduction

11

fréquences plus élevées que B. cepacia (Razvi et al., 2009 ; Millar et al., 2009). Mais ce sont

les infections à P. aeruginosa et B. cepacia qui sont associées à un déclin de la fonction

pulmonaire et une morbidité et mortalité importantes chez les patients atteints de

mucoviscidose (Emerson et al., 2002 ; Nixon et al., 2001 ; Courtney et al., 2007). Les

infections pulmonaires chroniques à P. aeruginosa sont celles qui causent les obstructions les

plus prononcées des voies respiratoires et consistent en des processus critiques dans la

détérioration de la fonction pulmonaire chez les patients adultes atteints de mucoviscidose

(Lopes et al., 2012).

I.5 PATHOGENESE DU DECLIN PULMONAIRE PAR P. AERUGINOSA

Bien que le mécanisme précis de prédisposition à une infection ne soit pas clairement

établi, il est évident que certains microorganismes sont capables d’infecter les voies

respiratoires des patients atteints de mucoviscidose menant à un déclin de la fonction

pulmonaire. La bactérie P. aeruginosa est le pathogène le plus fréquemment identifié dans les

sécrétions des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose. Le processus menant

à la détérioration pulmonaire lors de cette infection a été l’objet de recherche intense.

Acquisition de P. aeruginosa

La première étape dans le développement d’une infection à P. aeruginosa dans les

voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose est l’acquisition du pathogène. Des

analyses génétiques ont montré que les souches initiales de la colonisation bactérienne

proviennent de réservoirs environnementaux (Burns et al., 2001). Le pathogène est

omniprésent dans les sols humides, les lacs, les ruisseaux et sur les légumes et un contact avec

ces sources environnementales naturelles peut induire l’acquisition de la bactérie (Römling et

al., 2005). La transmission de P. aeruginosa à partir d’autres personnes infectées ou par

d’autres patients atteints de mucoviscidose est également possible.

Adhésion

L’entrée du pathogène dans l’organisme hôte est suivie de l’infection. Les bactéries

colonisent d’abord les voies respiratoires supérieures puis, atteignent les voies respiratoires

inférieures (Mainz et al., 2009). Chez les patients atteints de mucoviscidose, la clairance

Introduction

12

mucociliaire, responsable de l’élimination bactérienne chez les sujets sains, est entravée. La

couche épaisse et visqueuse limite le mouvement ciliaire des cellules de l’épithélium

pulmonaire empêchant l’évacuation des particules et des bactéries vers le nasopharynx. Les

bactéries peuvent alors adhérer au mucus épais des bronches et coloniser le poumon. Chez P.

aeruginosa, le processus d’adhésion à l’hôte fait intervenir des interactions spécifiques de la

bactérie avec les mucines des sécrétions pulmonaires. Le flagelle et les pili de type IV de P.

aeruginosa participent également aux interactions initiales avec la surface de l’épithélium

bronchique, notamment par leur liaison aux récepteurs asialoGM1 (Feldman et al., 1998 ;

Saiman et Prince, 1993 ; Gupta et al., 1994). Il a également été suggéré que le pathogène se

lie préférentiellement au mucus pulmonaire plutôt qu’aux cellules épithéliales (Worlitzsch et

al., 2002 ; Hall-Stoodley et Stoodley, 2009) et que les mucines stimulent l’agrégation et la

formation du biofilm (Landry et al., 2006).

Infection précoce ou transitoire

Lors des stades précoces de l’infection, celle-ci est généralement transitoire et son

éradication est possible par un traitement antibiotique agressif et une réponse importante de la

défense immunitaire de l’hôte (Rosenfeld et al., 2001). A ce stade, les souches isolées des

expectorations des patients atteints de mucoviscidose sont acquises de sources

environnementales. Le succès du traitement de l’infection est lié à la faible densité

bactérienne, au phénotype non mucoïde des souches et à leur faible résistance aux

antibiotiques (Burns et al., 2001). Le patient peut être négatif pour P. aeruginosa pendant

plusieurs années, l’infection chronique étant généralement acquise dans la fin de la vingtaine

(Folkesson et al., 2012).

Infection chronique

Les infections chroniques et persistantes de P. aeruginosa sont associées à un déclin

important de la fonction pulmonaire et du pronostic vital. L’installation de la chronicité de

l’infection est associée à de nombreux changements génétiques et phénotypiques de la

bactérie (Spencer et al., 2003 ; Smith et al., 2006). La plupart de ces changements sont liés à

la colonisation bactérienne dans un environnement « stressant ». Cet environnement stressant

est créé dans les poumons des patients atteints de mucoviscidose, par le stress oxydatif et la

présence d’antibiotiques, auxquels le pathogène doit faire face. Dans ces conditions, une

modification importante de l’expression des gènes apparaît et le taux de mutations des

Figure 7 : Souche mucoïde de P. aeruginosa

La croissance d’une souche de P. aeruginosa de phénotype mucoïde est fortement associée au

diagnostic de la mucoviscidose (Pritt et al., 2007).

Introduction

13

bactéries augmente (Folkesson et al., 2012). Les souches cliniques isolées de patients

chroniquement infectés sont typiquement caractérisées par une croissance lente, une

résistance aux antibiotiques, une perte de la mobilité et une surproduction d’alginate. Ces

changements sont avantageux pour la bactérie (processus adaptatif) et lui permettent de

survivre dans l’environnement pulmonaire des malades.

L’établissement de l’infection chronique est corrélé avec la transition de la bactérie

vers un phénotype mucoïde résultant en la production excessive et constitutive du

polysaccharide extracellulaire alginate (Govan et Deretic, 1996). Cette transition est

également corrélée avec une perte de la mobilité des souches mucoïdes, par perte du flagelle

(Garrett et al., 1999). Les bactéries motiles de l’environnement pénètrent dans la zone

hypoxique du mucus épais et échappent ainsi aux polynucléaires neutrophiles et aux

macrophages alvéolaires. Le micro-environnement anaérobique présent dans le mucus des

patients atteints de mucoviscidose entraîne la production d’alginate dans lequel P. aeruginosa

est intégré. La formation du biofilm commence alors (Worlitzsch et al., 2002). L’organisation

des bactéries sous forme d’un biofilm est un caractère phénotypique particulièrement

important dans la persistance de la colonisation bactérienne par P. aeruginosa chez les

patients atteints de mucoviscidose et chroniquement infectés (Bjarnsholt et al., 2009). Dans ce

mode de vie, les bactéries sont très résistantes aux antibiotiques (Xu et al., 2000) et à

l’éradication par le système immunitaire de l’hôte (Meluleni et al., 1995 ; Leid, 2009).

Les infections à P. aeruginosa et la destruction du tissu pulmonaire sont liées à

l’apparition de bactéries mucoïdes se développant en agrégats (biofilms). L’observation

microscopique de ces structures révèle la présence de leucocytes polynucléaires entourant le

biofilm mucoïde (Bjarnsholt et al., 2009). Les rhamnolipides et la matrice riche en alginate

(Hentzer et al., 2001) des biofilms mucoïdes contribuent à la résistance des bactéries à la

phagocytose. Les biofilms de P. aeruginosa entraînent la nécrose des polynucléaires qui sont

un élément majeur de la première ligne de défense de l'hôte. Cette nécrose est provoquée par

les rhamnolipides dont la production est contrôlée par le système de quorum sensing (QS)

(Jensen et al., 2007 ; Christensen et al., 2008). En accord avec ce modèle, Bjarnsholt et ses

collègues observent de nombreux polynucléaires dans les tissus entourant le biofilm mucoïde

de P. aeruginosa alors qu’aucun polynucléaire n’est détecté à l’intérieur du biofilm

Introduction

14

(Bjarnsholt et al., 2009). P. aeruginosa s’adapte donc au système de défense immunitaire du

tractus respiratoire par la formation de biofilms mucoïdes (Høiby et al., 2011).

Il a été souligné que les lésions tissulaires et la diminution de la fonction pulmonaire

observées dans des stades plus avancés de la colonisation par P. aeruginosa ne sont pas

provoquées par les toxines et enzymes bactériennes mais plutôt par un cycle inflammatoire

prononcé, dominé par les polynucléaires qui entourent le biofilm (Goldstein et Döring, 1986;

Lyczak et al., 2000). Après l’entrée de la bactérie dans l’hôte, une réponse inflammatoire

accrue est observée dans les voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose en

comparaison avec un poumon normal (Dakin et al., 2002). La pathogenèse des dommages

tissulaires est liée à l’inflammation provoquée par les complexes immuns présents dans

l’arbre trachéo-bronchique. Ils activent la voie du complément et donc le chimiotactisme et

l’inflammation. Le recrutement et la présence prolongée des polynucléaires neutrophiles

résultent en des lésions significatives du tissu pulmonaire et en une diminution de la fonction

pulmonaire. Des taux importants de cytokines et autres facteurs pro-inflammatoires (TNF-α,

IL-1, IL-6, IL-8), avec des taux diminués en cytokine anti-inflammatoire IL-10, ont été

détectés à des stades précoces de la colonisation dans les voies respiratoires de l’épithélium

des patients malades (Rosenfeld et al., 2001; Bonfield et al., 1999; Kirchner et al., 1996).

L’inflammation intense est caractérisée par la séquestration des polynucléaires neutrophiles

dans les voies aériennes. Ces polynucléaires neutrophiles libèrent de nombreux composés pro-

inflammatoires et notamment des protéases qui, exprimées à des taux aberrants, peuvent

causer des dégâts. La libération par les polynucléaires neutrophiles d’élastase (Birrer et al.,

1994), de collagénase et d’agents oxydants (radicaux hydroxyles, ion superoxyde) provoque

la dégradation de la matrice extracellulaire et de l’élasticité des bronches et des bronchioles.

Les protéases, et en particulier les sérines protéases comme l’élastase du polynucléaire

neutrophile, peuvent exacerber l’inflammation, dégrader des protéines structurales et

provoquer des dommages tissulaires (bronchiectasies) (Quinn et al., 2010 ; Weldon et al.,

2009 ; Jensen et al., 2010). Le résultat est une augmentation de l’expression d’IL-8 et un

influx additionnel de neutrophiles créant un cycle inflammatoire. La persistance de

l’accumulation des polynucléaires neutrophiles implique également la libération par les

neutrophiles nécrotiques d’ADN et d’actine responsables de l’augmentation de la viscosité du

mucus. L’enrichissement des expectorations en ADN et en actine est impliqué dans la

Figure 8 : La cascade physiopathologique de la mucoviscidose

D’après Boas et McColley (2007).

Introduction

15

pathogenèse de la maladie pulmonaire (Perks et Shute, 2000) en favorisant également la

formation initiale de biofilm à P. aeruginosa (Walker et al., 2005; Parks et al., 2009). L’effet

nuisible des facteurs dérivés des neutrophiles est aggravé par la production de composés

toxiques par P. aeruginosa. L’élastase de P. aeruginosa clive des facteurs antimicrobiens

(lysozyme, surfactant, transferrine). P. aeruginosa échappe à son éradication et atteint des

densités cellulaires importantes (Haase et al., 2004). Récemment, Bomberger et ses collègues

ont mis en évidence une toxine sécrétée par P. aeruginosa, Cif, qui réduit la sécrétion des ions

chlore liée au canal CFTR par les cellules épithéliales des voies aériennes, une force motrice

essentielle à la clairance mucociliaire. En contribuant à l’inhibition de la clairance

mucociliaire, le pathogène échappe à son éradication (Bomberger et al., 2011).

En résumé, un véritable cercle vicieux (obstruction-infection-inflammation) s’installe

dans les poumons, associé à une réponse inflammatoire inefficace et exubérante (Cohen et

Prince, 2012 ; Hänsch, 2012). Le défaut génétique de la protéine CFTR permet la persistance

de P. aeruginosa. La présence bactérienne permanente dans les voies respiratoires provoque

une augmentation de l’inflammation, par stimulation de façon permanente des mécanismes de

défense, qui à son tour mène à une augmentation de la densité bactérienne (Moss, 2009). La

spirale inflammatoire perpétuelle mène progressivement à des lésions pulmonaires

irréversibles. Les voies aériennes se dilatent et l’apparition de bronchiectasies aggrave le

phénomène. Une majorité des personnes malades décèdent d’infections respiratoires.

Figure 9 : Augmentation de l’âge médian de survie au cours des années

chez les patients atteints de mucoviscidose

D’après Davis, 2006.

Introduction

16

I.6 PRISE EN CHARGE ACTUELLE DE LA MUCOVISCIDOSE

Le traitement de la mucoviscidose distingue les tentatives de traitement curatives de la

maladie et les traitements symptomatiques réduisant l’obstruction, l’inflammation ou

l’infection. Bien que des progrès soient réalisés dans le développement de petites molécules

ciblant le défaut de la protéine CFTR, connues sous le nom de modulateurs de CFTR, aucun

agent ciblant les mutations génétiques (thérapie génique) n’est actuellement disponible

(Davies et Alton, 2010 ; Rogan et al., 2011 ; Kotzamanis et al., 2013). Les modulateurs de

CFTR, développés lors de ces dix dernières années, ciblent des génotypes de CFTR

spécifiques sur base du mécanisme de dysfonctionnement de la protéine. Ils sont un exemple

typique de médecine personnalisée où seuls les patients porteurs d’une mutation spécifique

pourront être traités avec le médicament (Derichs, 2013 ; Wilschanski, 2013). Dans cette voie,

le modulateur de CFTR ivacaftor offre des résultats encourageants (Boyle et De Boeck, 2013 ;

Hoffman et Ramsey, 2013).

Actuellement, le traitement proposé est symptomatique et implique une prise en charge

multidisciplinaire. Des progrès liés à l’évolution de l’antibiothérapie et à la prise en charge de

la maladie (nutrition et physiothérapie) ont permis d’augmenter considérablement l’espérance

de vie des patients au cours de ces deux dernières décennies. En 1974, l'âge médian de survie

international prédisait 8 ans. En 2010 il est proche des 40 ans (Cystic Fibrosis Foundation,

2010) et on s’attend à ce que les nouveaux-nés atteints de mucoviscdose au 21ème

siècle vivent

au-delà de 50 ans (Simmonds, 2010).

L’amélioration du diagnostic, par la mise en œuvre de protocoles de laboratoire de

microbiologie standardisés permettant une meilleure isolation et identification des pathogènes

respiratoires, a également contribué à une augmentation de l’âge médian de survie (Zhou et

al., 2006). Des stratégies prophylactiques pour prévenir les infections initiales ou pour

retarder les infections chroniques de P. aeruginosa peuvent également améliorer l’état

clinique du patient (Rajan et Saiman, 2002). Elles consistent en une administration de très

fortes doses d’antibiotiques pour une éradication agressive de la colonisation initiale par des

souches non mucoïdes de P. aeruginosa afin de prévenir la progression vers une infection

chronique impliquant la formation du biofilm (Döring et Høiby, 2004 ; Hansen et al., 2008).

Introduction

17

Les stratégies actuelles de traitement incluent la prise en charge respiratoire avec des

antibiotiques, le drainage bronchique, l’oxygénothérapie, la physiothérapie, la greffe

pulmonaire et la prise en charge de l’atteinte digestive par une adaptation nutritionnelle

(apport d’extraits pancréatiques et régime alimentaire hypercalorique). Le traitement de

l’atteinte des voies respiratoires a pour objectif de contrôler l’infection (antibiothérapie et

agents anti-inflammatoires) et d’aider à la clairance mucociliaire. Pour ce dernier objectif, les

patients ont recours à l’aérosolthérapie (administration de fluidifiants mucolytiques et de

Dnase recombinante (Pulmozyme®)) et à la kinésithérapie respiratoire. Les techniques de

clairance des voies aériennes sont indispensables pour réduire l’épaisseur de la couche de

mucus encombrant les poumons des patients et pour liquéfier et hydrater les sécrétions (Cystic

Fibrosis Foundation, 2010). La kinésithérapie fait ainsi partie du quotidien des patients et a

pour rôle de faciliter l’évacuation des sécrétions visqueuses et épaisses qui obstruent les

bronches. Elle permet également un entretien global de la condition physique du patient. Les

cures antibiotiques sont un aspect fondamental dans le traitement palliatif et symptomatique

des patients atteints de mucoviscidose. Une fois que l’infection chronique est établie, la seule

thérapie efficace est une thérapie d’entretien avec une administration systémique et nébulisée

régulière d’antibiotiques anti-Pseudomonas afin d’améliorer l’état respiratoire et, à long

terme, d’augmenter la survie du patient (Döring et Høiby, 2004). L’analyse microbiologique

quantitative et qualitative des expectorations des patients permet d’évaluer la bactérie

principale en cause et l’importance de la colonisation bactérienne. Des tests de susceptibilité

aux antibiotiques sont entrepris pour caractériser les phénotypes de résistance et aider au

choix de l’antibiothérapie. Les cures antibiotiques consistent en l’administration parentérale

de β-lactames ou l’administration orale de macrolides comme l’azithromycine. Dernièrement,

l’administration d’antibiotiques par inhalation a été recommandée pour accompagner les

traitements oraux ou intraveineux. Le traitement actuel de référence par aérosol pour les

infections pulmonaires chroniques à P. aeruginosa est une administration locale de

tobramycine commercialisée sous le nom TOBI®

(Varaigne et Hubert, 2004) permettant de

minimiser l’exposition systémique et le risque d’ototoxicité et de néphrotoxicité de

l’antibiotique (Wood et Swanson, 2007). Les antibiotiques administrés par aérosol atteignent

principalement la zone de conduction (bronches) des voies respiratoires inférieures de l’arbre

trachéo-bronchique et seules des concentrations faibles du médicament sont détectées dans la

zone respiratoire (alvéoles et bronchioles) des voies respiratoires inférieures. Au contraire,

l’administration intraveineuse ou orale permet d’atteindre des concentrations importantes dans

Introduction

18

la zone respiratoire car l’antibiotique est transporté directement par le sang vers les capillaires

alvéolaires. Comme les deux zones sont infectées par P. aeruginosa, l’utilisation combinée

d’antibiotiques par voie systémique et inhalée est évidente (Høiby, 2011). Des progrès récents

ont permis aux inhalateurs de poudre sèche de délivrer des particules plus petites que les

nébuliseurs traditionnels, ce qui permet une pénétration plus profonde dans les poumons avec

un minimum d'équipement spécialisé (Heijerman et al., 2009 ; Geller et al., 2011). Un

développement particulièrement intéressant dans le traitement des infections impliquant un

biofilm chez les patients atteints de mucoviscidose est l’administation par inhalation d’une co-

formulation de Pulmozyme® avec la ciprofloxacine (Yang et al., 2010) permettant la

dégradation de la matrice du biofilm pour améliorer la délivrance de l’antibiotique. Ce type

d'approche thérapeutique peut être particulièrement utile avec une formulation plus diversifiée

d’enzymes et d’antibiotiques (Ranall et al., 2012).

Cependant l’éradication bactérienne reste actuellement difficile, malgré la prise en

charge précoce de l’infection par une antibiothérapie adaptée. L’action répétée de

l’antibiothérapie est responsable de l’émergence de souches de P. aeruginosa multirésistantes.

II. PSEUDOMONAS AERUGINOSA

II.1 MICROBIOLOGIE GENERALE

Le Pseudomonas aeruginosa ou bacille pyocyanique est une bactérie à Gram négatif

appartenant au genre Pseudomonas et à la famille Pseudomonadaceae. Elle se présente sous

forme de bacilles fins, droits ou légèrement courbés et très mobiles grâce à la présence d’un

flagelle monotriche polaire. P. aeruginosa est caractérisé par une versatilité métabolique lui

permettant d’utiliser une large variété de substrats comme source de carbone (sucres simples

et complexes, alcools, acides aminés). Le pathogène est classé comme aérobie strict avec un

métabolisme oxydatif utilisant l’oxygène comme accepteur final d’électrons. Cependant la

survie de la bactérie est observée dans des conditions anaérobies, expliquée par sa capacité à

métaboliser l’arginine (Vander Wauven et al., 1984) et le pyruvate (Eschbach et al., 2004) ou

par utilisation des nitrates comme accepteur final d’électrons (Filiatrault et al., 2005). P.

aeruginosa est capable de se développer dans un spectre de températures compris entre 4 et

Introduction

19

41 °C ; sa température optimale de croissance se situe entre 30 et 37 °C. Ces différentes

caractéristiques font de ce pathogène un microorganisme ubiquitaire retrouvé dans l’eau, les

sols, les marais, les plantes et les mammifères. La versatilité et l’adaptabilité extraordinaire du

pathogène se marque aussi par son nombre important de gènes. P. aeruginosa possède le plus

large génome bactérien séquencé. Ce génome englobe 6,3 millions de pb (Stover et al., 2000).

De nombreux gènes impliqués dans des fonctions métaboliques permettent à la bactérie de se

développer dans différents environnements, parfois très pauvres en nutriments et en font un

colonisateur redoutable. P. aeruginosa est un pathogène opportuniste capable d’infecter de

nombreux hôtes et particulièrement lors d’une diminution des défenses immunitaires, comme

en cas de brûlures ou de plaies ouvertes. Chez l’homme, P. aeruginosa peut coloniser de

nombreux tissus, notamment le tissu cutané et osseux, et des dispositifs médicaux, tels les

valves cardiaques. Il est aussi responsable d’infections ophtalmiques, du tractus urinaire et des

poumons. C’est également le pathogène le plus fréquemment responsable du décès des

patients atteints de mucoviscidose (Zemanick et al., 2011).

II.2 PATHOGENICITE DE P. AERUGINOSA

L’importante pathogénicité de P. aeruginosa est liée aux nombreux facteurs de

virulence qu’il possède. Ces facteurs de virulence sont impliqués dans les différentes étapes

du processus d'infection, dans l’attachement et la mobilité, et permettent à P. aeruginosa de

coloniser son hôte. On distingue les facteurs de virulence associés à la bactérie et les

nombreux facteurs de virulence sécrétés ou extracellulaires, dont les rôles sont

complémentaires (de Bentzmann et Plésiat, 2011).

II.2.1 Facteurs de virulence cellulaires

P. aeruginosa possède des attributs cellulaires associés à la virulence du pathogène

tels les structures impliquées dans l’adhérence et la mobilité : les flagelles, les pili de type IV

et les lipopolysaccharides (LPS).

Figure 10 : Pseudomonas aeruginosa

La bactérie P. aeruginosa possède de nombreux facteurs de virulence associés à sa

pathogénicité. Le flagelle et les pili de type IV font partie des attributs cellulaires impliqués

dans la pathogénicité de P. aeruginosa. D’après Kwangshin Kim/science photo library (figure

de gauche) et Hurlbert, R.E. (1999) (figure de droite).

Introduction

20

Les lipopolysaccharides

Les LPS sont une composante majeure de la membrane externe des bactéries à Gram

négatif. Ils sont constitués d’un lipide A, une région hydrophobe insérée dans la bicouche

phospholipidique de la membrane externe, d’un noyau oligosaccharidique et de l’antigène O,

une partie polysaccharidique variable faisant surface à la membrane externe. Les LPS de P.

aeruginosa sont un facteur de virulence majeur dans la pathogénicité de la bactérie et jouent

également un rôle clé dans l’initiation de la réponse inflammatoire et dans les interactions

avec les tissus hôtes (Pier, 2007). Les LPS de P. aeruginosa protègent le pathogène de la mort

entraînée par le complément et, durant les infections pulmonaires chroniques, les LPS aident

le pathogène à échapper aux mécanismes de défense de l’hôte (Goldberg et Pler, 1996). Le

lipide A ou endotoxine est responsable d'une stimulation excessive du système immunitaire

pouvant provoquer un choc septique et conduire à la mort (Lynn et Golenbock, 1992 ; Bricha

et al., 2009).

Le flagelle

Le flagelle, polaire chez le P. aeruginosa, permet à la bactérie de se mouvoir en

fonction des variations de l’environnement et ainsi de répondre aux signaux

environnementaux (chimiotaxie). La mobilité de la bactérie est primordiale dans le processus

de colonisation et d’infection. Le flagelle est responsable de la mobilité de type swimming et

swarming du pathogène et intervient, avec les pili de type IV, dans les stades initiaux de la

formation du biofilm (O'Toole et Kolter, 1998a ; Köhler et al., 2000). Le flagelle permet

également à la bactérie d’acquérir les nutriments (Shapiro, 1995). Il est important dans

l’établissement des infections du tractus respiratoire et peut agir dans les interactions initiales

avec la surface de l’épithélium bronchique (Feldman et al., 1998). Le flagelle intervient

notamment dans la liaison de P. aeruginosa aux mucines de la surface des cellules épithéliales

(Lillehoj et al., 2002) et se lie aux récepteurs asialoGM1 des cellules épithéliales (Feldman et

al., 1998).

Les pili de type IV

Chez P. aeruginosa, les pili de type IV ont un rôle dans les interactions cellulaires

entre la bactérie et l’hôte et, par leurs propriétés rétractiles, permettent l’attachement et la

colonisation de P. aeruginosa aux surfaces hôtes. Ils sont impliqués dans la mobilité de type

Introduction

21

twitching qui permet à la bactérie de se déplacer le long d’une surface (Mattick, 2002). Les

pili de P. aeruginosa se lient aux récepteurs asialoGM1 dont l’expression est augmentée à la

surface des cellules épithéliales chez les patients atteints de mucoviscidose (Saiman et Prince,

1993 ; Gupta et al., 1994).

II.2.2 Facteurs de virulence sécrétés

P. aeruginosa est pathogène par les nombreux facteurs de virulence qu’il sécrète : les

toxines (exotoxine A, exoenzymes S, T, Y et U), les enzymes protéolytiques (élastase LasB,

élastase LasA ou staphylolysine, protéase IV et protéase alcaline), les enzymes lipolytiques

(lipase, estérase, phopholipase C), les rhamnolipides et les chélateurs de fer ou sidérophores.

Les toxines

L’exotoxine A est une des protéines les plus cytotoxiques produites par P. aeruginosa

responsable d’infections sévères chez la souris (Miyazaki et al., 1995). L’exotoxine A est

composée d’un domaine A et d’un domaine B ; ce dernier interagit au niveau du LDL

receptor-related protein (LRP) présent à la surface de la cellule hôte. L’interaction induit

l’internalisation du domaine possédant une activité ADP-ribosyltransférase ce qui mène à la

perturbation de la synthèse protéique de la cellule infectée (Iglewski et Kabat, 1975).

L’exotoxine A cible le facteur d’élongation E2 entraînant la mort cellulaire par nécrose

(Iglewski et al., 1977 ; Wick et al., 1990). La toxine détériore également les mécanismes de

défense de l’hôte (Schultz et al., 2001) et est responsable en partie de la destruction du tissu

des voies respiratoires lors d’infections à P. aeruginosa (Baker, 1982).

La virulence de P. aeruginosa implique la sécrétion d’exotoxines via un complexe

protéique, le système de sécrétion de type III (TTSS), qui libère dans la cellule hôte les

exoenzymes ExoS, ExoT, ExoU et ExoY (Berthelot et al., 2003). La synthèse de ces

protéines effectrices est stimulée par le contact de la bactérie avec les cellules eucaryotes,

ainsi que par des signaux environnementaux (Hornef et al., 2000). Les protéines secrétées

sont transloquées dans le cytosol de la cellule hôte (Cornelis, 2006). L’ExoS est un facteur de

virulence essentiel au développement des infections aigües à P. aeruginosa. L’ExoS et l’ExoT

possèdent toutes deux une activité ADP-ribosyltransférase indispensable pour l’induction de

Introduction

22

l’apoptose dans la cellule hôte (Kaufman et al., 2000). L’ExoU possède une activité

phospholipase lui permettant de dégrader les composants de la membrane de la cellule cible

(Sato et al., 2003) et d’induire la perméabilité des cellules mammifères dont les cellules

épithéliales, les macrophages et les fibroblastes (Finck-Barbancon et al., 1997). L’activité

enzymatique de l’ExoY, une adenylate cyclase, provoque l’accumulation d’AMPc dans la

cellule cible qui induit indirectement des changements morphologiques de la cellule (Yahr et

al., 1998).

Les protéases

La présence de protéases dans les expectorations durant les exacerbations infectieuses

chez les patients atteints de mucoviscidose et chroniquement porteurs de P. aeruginosa a été

démontrée (Jaffar-Bandjee et al., 1995). Ces protéases agissent ensemble entraînant des

dommages significatifs des tissus hôtes.

L’élastase LasB de P. aeruginosa est un des facteurs les plus virulents parmi les

toxines sécrétées par la bactérie pendant une infection. Elle endommage la matrice

extracellulaire des voies respiratoires et des tissus conjonctifs en dégradant des composants de

la matrice comme l’élastine pulmonaire. L’élastine confère aux tissus (pulmonaire, vasculaire,

oculaire) des propriétés élastiques nécessaires à leurs fonctions physiologiques. Les lésions

provoquées par l’élastase mènent à des ulcérations des voies respiratoires (de Bentzmann et

al., 2000). L’enzyme perturbe les jonctions serrées des cellules de l’épithélium des alvéoles

pulmonaires (Azghani, 1996). L’élastase LasB cible également des composants du système

immunitaire notamment des composants du complément, des immunoglobulines, des

cytokines, dont le TNF-α, l’IFN-γ et certaines IL (Horvat et al., 1989 ; Theander et al., 1988 ;

Parmely et al., 1990 ; Kevin et al., 2003). Elle dégrade la protéine A du surfactant pulmonaire

(SP-A), un composant important du système immunitaire pulmonaire et de l’opsonisation,

permettant à la bactérie d’échapper à la phagocytose (Kuang et al., 2011).

L’élastase LasA dégrade l’élastine pulmonaire, potentialisant l’activité élastolytique

de l’élastase LasB et entraînant la destruction du tissu pulmonaire (Kessler et al., 1997 ; Peters

et Galloway, 1990). Les élastases LasA et LasB sont impliquées dans l’invasion par P.

aeruginosa des cellules épithéliales (Cowell et al., 2003). La protéase extracellulaire LasA

possède également une activité staphylolytique (Kessler et al., 1993), résultant en un clivage

Introduction

23

des liens des chaînes peptidoglycanes adjacentes de la paroi cellulaire de S. aureus. Cette

activité favorise l’émergence de P. aeruginosa dans les poumons des patients atteints de

mucoviscidose.

La protéase alcaline est responsable de l’évasion du pathogène du système de défense

de l’hôte par blocage de la phagocytose de P. aeruginosa par les neutrophiles humains. Elle

est également capable de supprimer la réponse immunitaire de l’hôte par inactivation de

l’IFN-γ, de TNF-α et d’autres cytokines, et par inhibition de l’activation de composants du

complément (Horvat et Parmely, 1988 ; Parmely et al., 1990 ; Hong et Ghebrehiwet., 1992 ;

Laarman et al., 2012).

La protéase IV est une enzyme impliquée dans la dégradation des protéines du

surfactant pulmonaire. Le surfactant pulmonaire a deux rôles distincts : la réduction de la

tension de surface à l’interface air-liquide et la participation à la défense immunitaire innée de

l’hôte. Par la dégradation du surfactant pulmonaire, la protéase IV inhibe les fonctions

biophysiques du surfactant et la réponse de l’hôte (Malloy et al., 2005).

Phospholipase C

P. aeruginosa sécrète des phospholipases C extracellulaires, dont une phospholipase C

possédant une activité hémolytique, PlcH, et une non hémolytique, PlcN (Ostroff et al., 1990).

Au niveau des poumons, PlcH participe à la dégradation du surfactant pulmonaire, riche en

phosphatidylcholine, favorisant la colonisation bactérienne. L’implication directe de PlcH

dans l’altération de la fonction du poumon de l’hôte a été récemment démontrée (Wargo et al.,

2011).

Les rhamnolipides

Les rhamnolipides sont des glycolipides extracellulaires amphiphiles produits par P.

aeruginosa et utilisés par cette bactérie comme facteur de virulence (Favre-Bonté et al.,

2003). Ils sont composés de rhamnose et d’acides gras hydrophobes. Ils sont produits lors de

la formation du biofilm et sous le contrôle du QS (Pearson et al., 1997). Leur rôle

physiologique consiste au maintien de l’architecture du biofilm et particulièrement des canaux

aqueux traversant la structure (Davey et al., 2003). Ils possèdent un pouvoir détergent sur les

phospholipides du surfactant pulmonaire les rendant ainsi plus accessibles aux phospholipases

Figure 11 : Facteurs de virulence de P. aeruginosa

La pathogénicité de P. aeruginosa est multifactorielle et implique des facteurs cellulaires

associés à la mobilité et à l’adhésion de la bactérie. De nombreux facteurs extracellulaires

sécrétés par la bactérie contribuent à la survie du pathogène et aux lésions tissulaires. Adapté

d’après Van Delden et Iglewski, 1998.

Introduction

24

bactériennes. Ils altèrent la jonction entre les cellules épithéliales des voies respiratoires et

favorisent l’infiltration des épithéliums humains des voies aériennes par P. aeruginosa

(Zulianello et al., 2006). Ils ont également un rôle dans la résistance du biofilm de P.

aeruginosa à la défense de l’hôte. On a mis récemment en évidence une activité

antibactérienne envers S. aureus et K. pneumoniae des rhamnolipides produits par P.

aeruginosa OBP1, une souche isolée à partir de boues de pétrole. Les rhamnolipides altèrent

l’enveloppe bactérienne provoquant des dommages cellulaires et augmentant la perméabilité

membranaire (Bharali et al., 2013). La capacité des bactéries à produire des biosurfactants

avec des propriétés antimicrobiennes pourrait être une stratégie de survie dans un

environnement en compétition.

Autres facteurs de virulence

Le P. aeruginosa est responsable de la production de deux pigments qui diffusent dans

le milieu de culture: la pyocyanine (pigment bleu) et la pyoverdine (pigment jaune-vert).

Cette dernière est un sidérophore permettant la capture et le transport du fer, élément essentiel

à la survie et à la persistance bactérienne à l’intérieur de l’hôte (Takase et al., 2000). L’apport

en fer favorise la production de radicaux toxiques à action bactéricide envers d’autres espèces.

P. aeruginosa favorise ainsi son émergence parmi les autres souches. La pyocyanine est

abondamment sécrétée dans les expectorations des patients atteints de mucoviscidose infectés

par P. aeruginosa. La cytotoxicité de la pyocyanine sur cellules humaines résulte entre autres

de ses propriétés oxydoréductrices. Le pigment oxyde le glutathion réduit qui perd alors son

rôle d’antioxydant cellulaire. Ces altérations entraînent des lésions au niveau des cellules

épithéliales liées au stress oxydatif (O’Malley et al., 2004). La survie de la bactérie est aussi

liée à la répression de la réponse inflammatoire de l’hôte par la pyocyanine. Le pigment

accélère et induit l’apoptose des neutrophiles (Allen et al., 2005).

Figure 12 : Système de QS de type LuxI/LuxR

Les molécules auto-inductrices AHL (cercles bleus) sont produites par la protéine synthase

LuxI et forment un complexe avec la protéine régulatrice LuxR pour activer l’expression de

gènes cibles. Figure A : En présence d’une densité cellulaire faible, la concentration en AHL

intra- et extracellulaire est faible, et l’activation de LuxR minimale. Figure B : En présence

d’une densité bactérienne importante, les AHLs se lient à LuxR et entraînent l’expression des

gènes cibles (Jayaraman et Wood, 2008).

A B

Introduction

25

II.3 LE QUORUM SENSING

Le QS est un mécanisme de communication cellulaire complexe entre les cellules

dépendant de la densité bactérienne. Le système repose généralement sur la synthèse, la

diffusion, la détection et la réponse à de petites molécules signal détectées par la bactérie et

responsables de l’adaptation et de la régulation de nombreuses fonctions physiologiques.

II.3.1 Quorum sensing de type LuxI/LuxR

Le phénomène de QS a été décrit pour la première fois chez la bactérie

bioluminescente V. fischeri. Depuis, il a été identifié chez des espèces bactériennes à Gram

positif et négatif. Le système de QS utilisé chez les bactéries à Gram négatif repose

typiquement sur le système d’homologues de type LuxI/LuxR, utilisant généralement des

auto-inducteurs acylhomosérine lactone (AHL) comme molécules signal. Les AHLs produits

par une bactérie diffèrent par la longueur et la substitution de leurs chaînes d’acide gras

(Favre-Bonté et al., 2003). Ils sont produits en grande quantité et s’accumulent dans

l’environnement quand la densité de la population bactérienne est élevée (Schaber et al.,

2007). En réponse à l’augmentation de la concentration locale des AHL, la bactérie modifie

l’expression de certains gènes.

Dans les systèmes de QS de type LuxI/LuxR, l’homologue LuxI est une synthase

responsable de la production de la molécule auto-inductrice AHL. En présence de

concentrations importantes en AHL, les molécules se lient au facteur de transcription

cytoplasmique LuxR et permettent la liaison du complexe à l’ADN et la transcription des

gènes cibles. Généralement, le complexe AHL/LuxR active également l’expression de luxI

résultant en une amplification du système par auto-induction.

Figure 13 : Structures des molécules auto-inductrices exploitées par les

systèmes de QS de P. aeruginosa

P. aeruginosa possède deux systèmes de QS majeurs impliquant la diffusion des

acylhomosérines lactones 3-oxo-C12-HSL et C4-HSL, pour les systèmes las et rhl

respectivement. Un troisième système de QS chez P. aeruginosa exploite le PQS.

Introduction

26

II.3.2 Quorum sensing chez P. aeruginosa

Le QS est donc un mécanisme d’adaptation et de régulation de la pathogénicité du P.

aeruginosa. L’expression, la production et/ou la sécrétion de nombreux facteurs de virulence

extracellulaires de P. aeruginosa sont contrôlées par le système de signal intercellulaire QS

(Favre-Bonté et al., 2003). Les deux principales molécules d’AHLs connues chez le

pathogène, le N-(3-oxododecanoyl)-L-homosérine lactone (3-oxo-C12-HSL) et le N-butyryl-

L-homosérine lactone (C4-HSL) ont la propriété de diffuser d’une bactérie à l’autre et de

traverser facilement les membranes bactériennes. D’autres molécules d’AHL ont également

été découvertes en très faibles quantités (Ruimy et Andremont, 2004). Un troisième signal

intercellulaire a été mis en évidence chez P. aeruginosa qui n’appartient pas à la classe des

homosérines lactones, mais qui est une quinolone, le Pseudomonas quinolone signal (PQS)

(Pesci et al., 1999).

Trois systèmes de QS sont présents chez P. aeruginosa : deux circuits de QS de type

LuxI/LuxR, le système las (LasI/LasR) et le système rhl (RhlI/RhlR), et un troisième circuit

de type non- LuxI/LuxR appelé le Pseudomonas quinolone signal (PQS) (Rutherford et

Bassler, 2012).

Dans le système las, le gène lasR code pour une protéine régulatrice LasR, homologue

de LuxR, et le gène lasI code pour une enzyme auto-inducteur synthase LasI, homologue de

LuxI, nécessaire à la synthèse d’un type d’AHL: le 3-oxo-C12-HSL. Au cours de la croissance

bactérienne, on observe une augmentation de la synthèse des AHL. Lorsque la quantité de ces

molécules dépasse un seuil donné, témoin d’une densité bactérienne élevée, les AHLs se lient

à la protéine régulatrice et activent la transcription de plusieurs facteurs de virulence et ce de

manière synchrone dans toute la population bactérienne. Cette activation permet donc

d’amplifier et de synchroniser la virulence à l’ensemble de la population bactérienne. Le 3-

oxo-C12-HSL forme un complexe activateur avec la protéine LasR permettant d’amplifier et

de coordonner l’expression de gènes de virulence par activation de leur transcription. La

protéine régulatrice contient deux domaines fonctionnels. Le premier, situé au niveau de la

région N-terminale de la protéine, est la région de liaison à la molécule auto-inductrice. La

portion C-terminale est responsable de la liaison de la protéine aux promoteurs cibles (Choi et

Greenberg, 1991). Après liaison à la molécule signal, LasR se dimérise, se lie à l’ADN et

active la transcription (Kiratisin et al., 2002; Schuster et al., 2004). Le complexe 3-oxo-C12-

Introduction

27

HSL/LasR active notamment la transcription des gènes lasB, lasA, aprA, codant

respectivement pour la synthèse de deux élastases et d’une protéase alcaline, et toxA codant

pour une exotoxine. Le complexe cible également le gène lasI, ce qui induit une amplification

du système par auto-induction (Seed et al., 1995), et le gène rhlI (Pesci et al., 1997).

Récemment, de multiples fonctions de 3-oxo-C12-HSL, en plus de son effet de

régulateur de gènes, ont été suggérées par l’interaction de la molécule auto-inductrice avec

des cellules de l’hôte (Davis et al., 2010). Ces fonctions interviennent dans la persistance du

pathogène dans les poumons de l’hôte et affectent la réponse immunitaire de l’hôte, par

augmentation de la régulation de gènes inflammatoires, exacerbant la maladie et l’infection

liée à P. aeruginosa (Jahoor et al., 2008). Ainsi l’homosérine lactone 3-oxo-C12 stimule la

production d’IL-8 dans les voies aériennes (Smith et al., 2001). Elle modifie la fonction et

induit l’apoptose des mastocytes (Li et al., 2009), des macrophages et des neutrophiles

(Tateda et al., 2003). De plus, la molécule auto-inductrice provoque des perturbations au

niveau des mitochondries et du réticulum endoplasmique des macrophages alvéolaires et des

cellules épithéliales des bronches. Elle active l’apoptose de cellules épithéliales des voies

aériennes (Schwarzer et al., 2012). La molécule 3-oxo-C12-HSL augmente également la

sécrétion des ions chlore et de fluides par la protéine CFTR des cellules épithéliales de l’arbre

trachéo-bronchique. Lors de l’absence ou d’un défaut du canal CFTR, 3-oxo-C12-HSL ne peut

affecter la sécrétion des ions chlore et des fluides et compromet la capacité de l’hôte à

éliminer rapidement la bactérie des voies aériennes (Schwarzer et al., 2010).

Dans le système rhl, l’enzyme auto-inducteur synthase impliquée dans la synthèse du

C4-HSL, est la protéine Rh1I codée par le gène rhlI. Le système rhl comprend également une

protéine régulatrice, RhlR, qui lorsqu’elle est associée au C4-HSL contrôle la transcription des

gènes lasB, lasA, aprA, pyc, rhlI et rhlAB. Ces deux derniers sont impliqués dans la

production des rhamnolipides qui ont un rôle dans la pathogénicité de la bactérie. Le gène pyc

code pour la production de pyocyanine (Ruimy et Andremont, 2004). Parmi les cibles du

complexe C4-HSL/RhlR, le gène rhlI mène à une auto-induction du circuit (Rutherford et

Bassler, 2012).

Un homologue à LasR-RhlR, QscR, pour lequel il n’y a pas de partenaire homologue à

LuxI, a également été mis en évidence chez P. aeruginosa (Lequette et al., 2006 ; Oinuma et

Figure 14 : Les systèmes de QS de P. aeruginosa

Les trois synthases, LasI, RhlI et PqsABCDH, produisent respectivement les molécules auto-

inductrices 3-oxo-C12-HSL, C4-HSL et PQS. Les molécules de signalisation sont détectées par

les facteurs de transcription cytoplasmique, LasR, RhlR et PqsR, respectivement. Chaque

facteur de transcription régule l’expression de sa synthase correspondante ainsi que des cibles

supplémentaires indiquées par les flèches (Rutherford et Bassler, 2012).

Introduction

28

Greenberg, 2011). Bien que cette protéine ne soit pas associée à une auto-inducteur synthase,

il a été montré qu’elle pouvait répondre à des signaux AHL notamment l’AHL générée par

LasI (3-oxo-C12-HSL). La protéine QscR est un régulateur clé d’un sous-ensemble de gènes

contrôlés par le QS (Lequette et al., 2006).

P. aeruginosa utilise un système additionnel, de type non LuxI/LuxR pour contrôler

l’expression des gènes de facteurs de virulence. Le signal a été identifié comme le composé 2-

heptyl-3-hydroxy-4-quinolone et désigné le Pseudomonas quinolone signal (PQS) (Pesci et

al., 1999). PQS est détecté par le régulateur PqsR (Rutherford et Bassler, 2012). La synthèse

de PQS requiert de nombreux gènes (PqsABCDH). La synthèse de PQS est en réalité sous la

dépendance des systèmes LasI/R (effet positif) et RhlI/R (effet négatif) qui contrôlent

l’expression du gène pqsR (Wade et al., 2005). Le signal PQS contrôle l’expression de

multiples gènes impliqués dans la virulence (élastase, rhamnolipides et pyocyanine) et

fonctionne comme régulateur entre les deux premiers systèmes de QS. Le complexe PqsR-

PQS auto-induit la synthèse de PQS et active l’expression de rhlI et rhlR (Diggle et al., 2007).

Les gènes lasB et rhlI sont régulés coopérativement par PQS et C4-HSL (McKnight et al.,

2000).

La hiérarchisation du système QS a souvent positionné le système las au sommet

(Pesci et al., 1997). Cependant hiérarchiser le QS semble beaucoup plus complexe (Dekimpe

et Déziel, 2009). Il a été démontré que le système rhl peut être activé indépendamment du

système las (Diggle et al., 2007). RhlR est en effet capable de surmonter l’absence de las par

l’activation de fonctions spécifiques contrôlées par LasR, incluant la production de 3-oxo-C12-

HSL et de PQS. P. aeruginosa est ainsi capable de contourner un déficit dans un système de

QS en permettant à un autre système de prendre la relève (Dekimpe et Déziel, 2009).

Figure 15 : Maladies infectieuses humaines provoquées par des biofilms bactériens

(1) Sinusite chronique ; (2) Infection de shunt cérébral ; (3) Kératite associée aux lentilles de

contact ; (4) Otite moyenne chronique ; (5) Infection d’implant cochléaire ; (6) Infection de

brûlure ; (7) Infection de cathéter intravasculaire ; (8) Infection de valve artificielle

cardiaque ; (9) Infection de pacemaker ; (10) Infection de matériel électrophysiologique

cardiaque ; (11) Infection de cathéter biliaire ; (12) Infection de cathéter de dialyse

péritonéale ; (13) Infection de prothèse articulaire ; (14) Infection de cathéter urinaire ; (15)

Infection de stent intravasculaire ; (16) Infection pulmonaire chez les patients atteints de

mucoviscidose ; (17) Pneumopathie liée à la ventilation artificielle ; (18) Infection d’implant

mammaire (del Pozo et Patel, 2007).

Introduction

29

III. LE BIOFILM

III.1 LE BIOFILM : UN MODE DE VIE PARTICULIER

La notion de biofilm a été avancée pour la première fois par Costerton, par

l’observation d’agrégats bactériens présents sur les roches d’un courant alpin (Geesey et al.,

1977) et par Høiby qui observe des agglomérats de bactéries dans les expectorations de

patients atteints de mucoviscidose (Høiby, 1977). Ils sont les premiers à percevoir l’impact de

ce comportement bactérien dans les infections (Bjarnsholt et al., 2012).

La formation d’un biofilm est un mode commun de développement bactérien dans la

nature (Ikuma et al., 2013). La présence des biofilms affecte de nombreux aspects de notre vie

et il a été estimé que 99 % de l’ensemble des bactéries dans un environnement naturel existent

sous forme d’un biofilm ou au moins résident sur une surface (Costerton et al., 1987). Le

biofilm consiste en une communauté de microorganismes adhérant entre eux et enrobés par la

sécrétion d’une matrice aux propriétés adhésives et protectrices. L’impact des biofilms est

négatif dans de nombreux domaines et particulièrement pour les biofilms associés aux aspects

médicaux. Les biofilms sont ainsi impliqués dans le développement d’infections chroniques

de différents tissus notamment au niveau du tractus digestif, respiratoire et urinaire. Les

problèmes liés aux implants médicaux sont également une préoccupation importante pour la

santé. Les biofilms se développent à la surface des cathéters et des lentilles de contact. Ils se

forment sur des pacemakers, des valves cardiaques, des prothèses articulaires et autres

implants chirurgicaux. Le Center for Disease Control (CDC) estime que 65 % des infections

nosocomiales sont causées par un biofilm. D’après le United States National Institute of

Health (NIH), 80 % des infections chroniques sont liées à la formation d’un biofilm (Monroe,

2007).

Figure 16 : Biofilm de Pseudomonas aeruginosa

Représentation d’un biofilm de P. aeruginosa au microscope électronique à balayage. Les

bactéries sont colorées en brun, la matrice extracellulaire en bleu-vert. La bactérie est un

pathogène opportuniste fréquemment rencontré dans les infections nosocomiales (Lal et

Berry, 2012). P. aeruginosa colonise les poumons des patients atteints de mucoviscidose sous

la forme de biofilms conférant à la bactérie une grande résistance aux antibiotiques et aux

mécanismes de défense immunitaire de l’hôte (CDC and Prevention's Public Health Image

Library #10043).

Introduction

30

Les unités structurelles de base du biofilm sont les micro-colonies. En fonction de

l’espèce impliquée, la micro-colonie peut être composée entre 10 à 25 % de cellules et entre

75 à 90 % d’une matrice d’exopolysaccharides (Tenke et al., 2006). La matrice renforce la

structure du biofilm, elle fixe les cellules au sein du biofilm, tout en lui conférant une grande

élasticité et procure aux organismes un environnement dense et protecteur, permettant aux

bactéries y résidant d’interagir et de coopérer. La formation de biofilms multi-espèces

participe à la complexité de ce mode de développement. Les biofilms de la plaque dentaire

peuvent ainsi enfermer des centaines d’espèces différentes formant un biofilm extrêmement

complexe à la surface des dents et des gencives (Wall-Manning, 2012).

III.2 LA MATRICE DU BIOFILM DE P. AERUGINOSA

Chez P. aeruginosa, la matrice représente 85 % du volume total du biofilm. Les

bactéries élaborent une matrice gélatineuse composée d’eau, d’exopolysaccharides, de

protéines, de lipides et d’acides nucléiques (ADN extracellulaire) (Jahn et Nielsen, 1998).

Lors du développement et de la croissance du biofilm, les bactéries présentent des

comportements différents. Les bactéries situées plus profondément dans le biofilm cessent de

produire les exopolysaccharides et adoptent un état quasi dormant. Au contraire, les bactéries

situées en périphérie de la structure croissent à plus grande vitesse et sont responsables de la

production d’une grande quantité d’exopolysaccharides.

Trois exopolysaccharides majeurs sécrétés par P. aeruginosa contribuent à

l’architecture du biofilm (Ghafoor et al., 2011). L’alginate, un polymère d’acide

mannuronique et d’acide guluronique (Evans et Linker, 1973), est le composant principal de

la matrice du biofilm formé par P. aeruginosa (Parsek et Tolker-Nielsen, 2008). Il favorise

l’adhérence des bactéries aux cellules épithéliales et aux mucines et les protège du système

immunitaire (Kukavica-Ibrulj, 2007). Le polysaccharide visqueux représente un facteur de

virulence de la bactérie par le caractère mucoïde qu’il lui confère. On observe dans les

infections pulmonaires chroniques de patients atteints de mucoviscidose, une transition de P.

aeruginosa d’un phénotype non mucoïde vers un phénotype mucoïde (surproduction

d’alginate), correspondant à une détérioration clinique significative du patient (Govan et

Deretic, 1996). Des souches déficientes dans la synthèse d’alginate développent un biofilm

avec une proportion plus faible de cellules vivantes, soulignant un rôle de l’alginate dans la

Figure 17 : ADN extracellulaire dans la matrice du biofilm de P. aeruginosa

Les images représentent des sections horizontales d’un biofilm de la souche ATCC PAO1

exprimant la GFP (A), l’ADN extracellulaire rouge marqué par l’agent fluorescent DDAO [7-

hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one)] (B) et une superposition des deux

images (C) (Allesen-Holm et al., 2006).

Introduction

31

viabilité cellulaire au sein du biofilm (Ghafoor et al., 2011). Deux autres polysaccharides ont

une contribution importante dans la matrice du biofilm de P. aeruginosa, le Psl et le Pel

(Lembre et al., 2012). Le Psl est riche en mannose et est produit durant le mode planctonique

où il intervient dans l’étape d’attachement initial des souches et la formation des micro-

colonies. Il contribue également au maintien de la structure du biofilm à des stades de

développement plus avancés en maintenant les cellules sous forme d’agrégats (Ma et al.,

2009). En plus de ses fonctions majeures dans la structure du biofilm, le Psl agit comme un

signal pour stimuler davantage de production de polysaccharide (Irie et al., 2012). Le Pel est

également important pour le maintien de la structure du biofilm mature (Parsek et Tolker-

Nielsen, 2008). Le polysaccharide est riche en glucose et joue un rôle dans la densité

cellulaire du biofilm et/ou de la compacité du biofilm (Ghafoor et al., 2011). Il intervient dans

les interactions entre cellules en fournissant un échafaudage pour la communauté dans les

premiers stades de la formation du biofilm.

L’ADN extracellulaire est également un composant majeur de la matrice du biofilm de

P. aeruginosa dans lequel il a un rôle de connecteur intercellulaire et est requis pour maintenir

l’intégrité du biofilm (Flemming et Wingender, 2010). Chez P. aeruginosa, l’ADN

extracellulaire provient de la lyse d’une population bactérienne, sous le contrôle du QS

(Montanaro et al., 2011). L’adhésion des bactéries ou la formation du biofilm de P.

aeruginosa peut ainsi être inhibée par une DNase (Swartjes et al., 2013 ; Whitchurch et al.,

2002). Des biofilms matures formés par des souches cliniques de P. aeruginosa sont

également dissous après traitement par une DNase corroborant l’importance de l’ADN

extracellulaire dans le biofilm de P. aeruginosa (Nemoto et al., 2003).

III.3 LES ETAPES DE LA FORMATION DU BIOFILM DE P. AERUGINOSA

Ces dernières années, la modélisation de l'infection par biofilm in vitro a conduit à

l'identification des déterminants microbiens qui régissent le développement du biofilm. Le

mécanisme de la formation du biofilm de P. aeruginosa peut être décrit comme un processus

dynamique impliquant 5 stades successifs (Sauer et al., 2002 ; Renner et Weibel, 2011 ; Kim

et al., 2012). Le développement du biofilm est initié par l’attachement réversible de cellules

planctoniques à une surface. La seconde étape est une adhésion irréversible des souches dans

Figure 18 : Modèle des étapes de la formation du biofilm

La première étape correspond à l’attachement réversible puis irréversible des cellules

bactériennes à la surface. Cette étape est suivie d’une multiplication bactérienne accompagnée

de la production de polymères extracellulaires. La production de polymères extracellulaires

s’amplifie et les cellules perdent une partie des appendices de mobilité. Enfin, la maturation

complète du biofilm est atteinte marquée par une architecture complexe. Une surexpression de

la motilité, débutant dans le centre du biofilm, aide à la dispersion. Lors de la phase de

dispersion, les cellules individuelles mobiles s’échappent de la micro-colonie (Sauer, 2003).

Introduction

32

les heures suivantes et ensuite la multiplication des bactéries. Les bactéries commencent à

s’entourer d’une matrice polymérique qu’elles produisent et forment des micro-colonies. Par

une production supplémentaire de substances polymériques, par motilité cellulaire et par

différentiation phénotypique, les bactéries élaborent un biofilm mature, épais et structuré. Une

phase suit où des régions du biofilm se dissolvent et les cellules libérées se dispersent pouvant

ainsi coloniser de nouvelles surfaces. Actuellement nous manquons cependant d'informations

pour savoir si les mécanismes de formation de biofilm identifiés in vitro sont pertinents pour

le développement in vivo (Joo et Otto, 2012).

Adhésion réversible

L’étape initiale de la formation du biofilm est une adhésion réversible des bactéries

planctoniques à une surface naturelle (minérale, végétale, animale) ou artificielle en réponse à

des signaux environnementaux ou nutritionnels (Filloux et Vallet, 2003). A ce stade, P.

aeruginosa est transitoirement fixé au substrat et est capable de se détacher librement (Sauer

et al., 2002). Les bactéries planctoniques s’approchent des surfaces par l’intervention de la

mobilité bactérienne ou sous l’influence des forces physiques comme les forces d’attraction

de van der Waals, les charges électrostatiques de surfaces et des interactions hydrophobes

(Donlan, 2002 ; Kim et al., 2012). Le flagelle de P. aeruginosa s’avère très important dans

l’étape de l’approche au support (O'Toole et Kolter, 1998a). Il confère à la bactérie la capacité

de se déplacer selon une mobilité de type swimming et swarming (Köhler et al., 2000).

L’adhésion initiale des bactéries à la surface fait également intervenir des adhésines dont les

facteurs d’attachement de type fimbriae. Cependant, les étapes initiales de la formation d’un

biofilm in vivo ne sont pas encore claires. Les biofilms peuvent facilement se former sans

attachement initial à une surface solide et de nombreuses infections chroniques se

développent en absence d’une surface (Bjarnsholt et al., 2012).

Adhésion irréversible

Après une adhésion transitoire des bactéries, l’intervention des pili de type IV permet

une adhésion permanente avec la surface ou avec d’autres microorganismes. Les pili de type

IV sont des structures fibrillaires présentes chez certaines bactéries à Gram négatif dont le P.

aeruginosa et sont impliqués dans un type particulier de mobilité associée à la surface, la

mobilité de type twitching, caractérisée par l’extension et la rétraction du pilus. Cette fonction

permet aux pili de type IV l’approche et la colonisation de la surface (O'Toole et Kolter,

Introduction

33

1998a). Ainsi différents organites extracellulaires, le flagelle, les pili de type IV et les

fimbriae, sont essentiels à la formation du biofilm et ce, plus particulièrement dans sa phase

initiale. L’attachement des bactéries déclenche la régulation génétique à induire la formation

du biofilm et est caractérisé par l'expression des substrats extracellulaires polymériques (SEP)

(Renner et Weibel, 2011).

Maturation primaire

Après l’étape de colonisation de la surface, on observe une prolifération des bactéries

qui donne lieu à la formation des micro-colonies. La formation des micro-colonies est un

mécanisme d’agrégation cellulaire qui nécessite une mobilité bactérienne obtenue par les pili

de type IV. Les bactéries secrètent une matrice d’exopolymères dans laquelle elles

s’encapsulent et qui forme une barrière physique entre la communauté et l’environnement

extracellulaire (Renner et Weibel, 2011).

Maturation secondaire

Les micro-colonies se différencient et permettent la maturation du biofilm par les

cellules qui se répliquent et les SEP qui s’accumulent. Ainsi les bactéries se multiplient

imbibées dans une matrice d'exopolysaccharides. Ce stade implique l’intervention du QS

(production de rhamnolipides), la production d’exopolysaccharides ainsi que la répression de

l’expression des différents appendices de mobilité (flagelle et pili de type IV) (Kukavica-

Ibrulj, 2007 ; Ruimy et Andremont, 2004). Les bactéries émettent des signaux moléculaires

propres au QS. Lorsque la concentration de ces signaux atteint une valeur seuil, la

transcription des gènes codant pour les protéines impliquées dans la production de

rhamnolipides et d’exopolysaccharides est activée. La synthèse des exopolysaccharides est

indispensable au « cimentage » de l’adhésion des bactéries aux surfaces et aux autres cellules

bactériennes dans le biofilm en développement (facteurs d’adhésion). Les souches de P.

aeruginosa déficientes en un système de QS fonctionnel sont moins virulentes que les souches

sauvages et forment des biofilms plats, moins stables et indifférenciés (Davies et al., 1998).

Bien que le QS coordonne la différentiation et la maturation des biofilms in vitro, un type

sauvage de P. aeruginosa déficient en système de QS a formé des biofilms similaires in vivo

(Schaber et al., 2007).

Introduction

34

Le rôle de la migration cellulaire dans la formation des biofilms a notamment été

étudié par Parsek et ses collègues. Ils constatent qu’une population bactérienne à grande

mobilité de surface forme un biofilm plat, horizontal et homogène, tandis qu’une population

ayant rapidement cessé de migrer forme un biofilm caractérisé par des agrégats. En réalité,

après l’attachement des bactéries à la surface, la communauté bactérienne se divise en deux

sous-populations: l’une non mobile et l’autre mobile, via son flagelle et ses pili de type IV.

Les premières micro-colonies sont formées par des cellules non mobiles qui prolifèrent à des

positions fixes et forment la base du biofilm. La sous-population mobile migre alors, à l’aide

des flagelles et pili de type IV, et colonise la base du biofilm pour former la périphérie de la

structure (Parsek et Tolker-Nielsen, 2008).

Lors de la maturation secondaire, les biofilms atteignent leur épaisseur maximale.

L’architecture du biofilm est variable et peut correspondre à un biofilm plat (une couche

homogène de cellules) ou à un biofilm hautement organisé avec une structure en champignon

contenant des canaux qui semblent essentiels pour fournir des nutriments aux cellules dans les

couches profondes du biofilm (Wimpenny et al., 2000). Cette structure indique qu’en plus des

facteurs d’adhésion (composants de la matrice qui interviennent dans l’agrégation), la

maturation du biofilm requiert des facteurs pertubateurs (par exemple, les rhamnolipides) (Joo

et Otto, 2012).

La structure tridimensionnelle du biofilm est influencée par des conditions physiques,

comme la vitesse du flux du milieu dans lequel le biofilm se développe, et des facteurs

biologiques (sources nutritives, mobilité bactérienne, surfactants) (Karatan et Watnick, 2009).

Dans le but de trouver une nouvelle source de nutriments, les micro-colonies s’organisent en

rangs horizontaux et forment des biofilms minces. La source en carbone du milieu influence

également l’architecture du biofilm. La souche ATCC PAO1 développe un biofilm plat et

compact lorsqu’elle est en présence de citrate et de casaminoacides comme source de carbone,

alors qu’elle forme un biofilm irrégulier avec une structure en champignon lorsque le glucose

est utilisé comme source de carbone (Klausen et al., 2003).

Détachement

Après 9 à 12 jours de formation du biofilm, une phase de dispersion des bactéries à

l’état planctonique est possible en réponse à des perturbations externes comme des forces de

Introduction

35

frottement provenant de l’écoulement d’un fluide (Choi et Morgenroth, 2003). Cette étape

implique la dispersion de cellules individuelles de la matrice du biofilm et le détachement du

film par érosion (Kim et al., 2012). Cependant Sauer et ses collègues suggèrent qu’il pourrait

s’agir d’un processus actif pour lequel le biofilm est programmé, permettant la colonisation de

nouvelles niches par les bactéries libérées. Les bactéries au sein des micro-colonies

s'éloignent en effet activement de la partie intérieure des amas cellulaires (Sauer et al., 2002).

A côté du processus d’une dispersion passive du biofilm par des paramètres hydrodynamiques

(force de frottement), une dispersion active du biofilm existe impliquant un réseau complexe

de signaux et régulateurs qui induisent l’activation concertée de la mobilité (pili de type IV et

rhamnolipides) et de la dégradation de la matrice. Le processus actif permet aux bactéries qui

n’ont plus accès aux nutriments ou souffrent d’une accumulation de déchets d’échapper au

micro-environnement devenu défavorable (Karatan et Watnick, 2009). Lors du mécanisme de

détachement, les bactéries récupèrent leur motilité, produisent des surfactants (Boles et al.,

2005) et sécrètent des protéases qui digèrent la matrice du biofilm, libérant les bactéries qui

peuvent initier la formation de nouvelles colonies à de nouvelles localisations (Monds et

O'Toole 2009 ; Karatan et Watnick, 2009). Ces bactéries individualisées dans le milieu

externe sont facilement phagocytées par les cellules inflammatoires qui entourent la micro-

colonie et sont sensibles aux antibiotiques, tandis qu’elles sont protégées dans le biofilm.

III.4 LES MECANISMES DE RESISTANCE DU BIOFILM DE P.

AERUGINOSA

Le biofilm confère aux bactéries un environnement micro-protecteur les protégeant

des antibiotiques et des mécanismes de défense de l’hôte.

III.4.1 La résistance du biofilm envers les agents antimicrobiens

La résistance conférée par le biofilm est multifactorielle. Différents mécanismes

contribuent à la résistance du biofilm envers les agents antimicrobiens (Høiby et al., 2010b).

La production d’une matrice d’exopolysaccharides, lors du développement des micro-

colonies, a souvent été considérée comme une barrière physique difficile à franchir limitant la

pénétration de certains agents antimicrobiens à travers la structure du biofilm et donc le

Figure 19 : Mécanismes de résistance du biofilm de P. aeruginosa

Les mécanismes de résistance peuvent inclure une pénétration et diffusion limitées de l’agent

antibactérien dans la matrice organique du biofilm. Les bactéries dans le biofilm peuvent

également sécréter des β-lactamases dans le milieu environnant et/ou augmenter l'expression

de pompes à efflux. L'activation des systèmes de QS ainsi que les différents gradients de

concentration en nutriments, oxygène et déchets métaboliques apportent également une

contribution à la tolérance aux antibiotiques. La présence de bactéries persistantes qui sont

résistantes à la destruction par tous les antibiotiques sont aussi responsables d'infections

récalcitrantes (Dufour et al., 2012).

Introduction

36

contact des bactéries avec les agents antimicrobiens (Costerton, 2001). Les polymères

extracellulaires diminuent la vitesse de transport de la molécule vers la bactérie ou

interagissent avec l’agent antimicrobien et inhibent son action. Cependant malgré que l’échec

de certains antibiotiques à pénétrer dans le biofilm ait souvent été avancé comme une

explication pour la résistance des biofilms à la thérapie antimicrobienne (Drenkard, 2003 ;

Donlan et Costerton, 2002), des mesures directes de pénétration des antibiotiques

(daptomycine et nisine) ne supportent pas cette hypothèse (Stewart et al., 2009 ; Davison et

al., 2010).

Costerton et ses collaborateurs ont mis en évidence la présence de niches au niveau du

biofilm où les bactéries existent à l’état dormant et protégé (Costerton, 1999 ; Costerton et al.,

1999). Au sein du biofilm, les micro-colonies sont séparées par un réseau de canaux

permettant, d’une part, d’acheminer l’oxygène et les nutriments à l’intérieur du biofilm et,

d’autre part, d’évacuer les déchets. Ainsi un gradient en nutriments et en oxygène se

développe du sommet à la base du biofilm et affecte la vitesse de croissance et l’activité

métabolique des bactéries. L’accessibilité restreinte aux substances nutritives et à l’oxygène

des bactéries se trouvant à la base du biofilm forme ainsi une sous-population

métaboliquement non active et non multiplicative. Comme la plupart des antibiotiques ciblent

principalement des cellules métaboliquement actives, il a été suggéré que l’hétérogénéité

métabolique des bactéries dans le biofilm mène à des différences de susceptibilité aux agents

antimicrobiens (Aaron et al., 2002 ; Parsek et Tolker-Nielsen, 2008). De plus, les bactéries au

centre du biofilm entrent dans une phase stationnaire-dormante (avec une croissance ralentie

ou une absence de croissance). Les bactéries avec un taux de croissance ralenti diminuent

également la susceptibilité du biofilm aux agents antimicrobiens. Des taux de croissance très

faibles de biofilm de P. aeruginosa ont en effet été mesurés dans les expectorations de

patients atteints de mucoviscidose (Yang et al., 2008).

Les cellules persistantes représentent une petite sous-population de cellules qui entrent

spontanément dans un état-dormant et ne se divisent pas. Ces bactéries persistantes sont très

tolérantes aux antibiotiques : même lorsque les biofilms sont traités pendant des temps

prolongés ou avec des concentrations élevées en agent antimicrobien, une petite fraction de

population persiste (Lewis, 2012). Des souches de P. aeruginosa persistantes ont été

sélectionnées chez des patients atteints de mucoviscidose et suggèrent qu’un lien existe entre

Introduction

37

ces cellules et les infections récalcitrantes chez ces patients (Mulcahy et al., 2010).

Les conditions environnementales fournies par le biofilm induisent également

l’apparition de variants phénotypiques contribuant à la résistance des bactéries envers les

agents thérapeutiques. Dès les premiers stades de l’adhésion des bactéries à un support, celles-

ci sont soumises à des modifications de l’expression des gènes (Costerton et al., 1999). Sauer

et ses collègues observent chez P. aeruginosa une modification de l’expression de

nombreuses protéines lors du passage de la bactérie de l’état planctonique à celui du biofilm

(Sauer et al., 2002). Certains gènes nouvellement activés sont responsables d’une

modification du profil des protéines composant la membrane externe (Tenke et al., 2006).

Hancock et Speert observent chez P. aeruginosa une résistance intrinsèque résultant d’une

perméabilité restreinte de la membrane externe (Hancock et Speert, 2000). La proximité des

bactéries dans la structure leur permet le transfert d’informations génétiques (transfert

horizontal de gènes) au sein du biofilm à des fréquences très élevées avec pour conséquence

un taux de mutation plus important que chez les bactéries isogéniques en mode planctonique

(Molin et Tolker-Nielsen, 2003 ; Driffield et al., 2008). On parle de phénotype hypermutable.

L’augmentation de stress oxydatif dans les biofilms, provoquée par un déséquilibre entre la

production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de facteurs de défense antioxydants est

une cause d’augmentation de la mutabilité dans les biofilms. Le stress oxydatif endogène dans

les biofilms favorise la résistance aux agents antimicrobiens (Boles et Singh, 2008 ; Høiby et

al., 2010b ; Paraje, 2011). Des souches hypermutantes ont en effet été observées dans les

poumons de patients atteints de mucoviscidose et colonisés par P. aeruginosa, et un lien entre

le taux élevé de mutations et l’évolution vers la résistance aux agents antimicrobiens a été

proposé (Oliver et al., 2000). Les bactéries dans le biofilm peuvent ainsi induire

simultanément des modifications au niveau de la régulation de la mobilité, produire des

enzymes contribuant à dégrader les antibiotiques, et surexprimer des pompes à efflux (Høiby

et al., 2010a). L’augmentation de la production de β-lactamases dans les souches cliniques de

P. aeruginosa est un mécanisme majeur de résistance aux antibiotiques β-lactames

(Giwercman et al., 1990). Les systèmes de pompes réalisent un efflux actif (énergie-

dépendant) ayant pour rôle d’expulser les agents antimicrobiens hors de la cellule (Aires et

al., 1999). P. aeruginosa possède plusieurs systèmes de pompes à efflux dont les systèmes

MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM, MexJK-OprM et MexVW-

OprM (Fernandez et Hancock, 2012). Les pompes sont caractérisées par une organisation

Introduction

38

commune composée de 3 parties distinctes: une protéine transporteuse exportant les

substances à travers la membrane interne ; une protéine de fusion membranaire périplasmique

qui lie la pompe cytoplasmique à la protéine de la membrane externe ; une protéine de la

membrane externe facilitant le passage des substance à travers cette membrane externe (Sobel

et al., 2003 ; Nikaido, 1994 ; Zhao et al., 1998 ; Nehme et Poole, 2005). La résistance à la

tobramycine est liée à une surexpression de MexXY-OprM (Islam et al., 2009). Le système de

pompe contribue également à la résistance de P. aeruginosa envers d’autres agents

antimicrobiens tels l’érythromycine, les fluoroquinolones, les β-lactames, la tétracycline, le

chloramphénicol (Li et al., 1994 ; Mine et al., 1999 ; Aeschlimann, 2003 ; Lomovskaya et al.,

2001).

L’augmentation de la densité cellulaire dans la formation des biofilms active le

système du QS. Il a été démontré que le QS détermine la tolérance des biofilms de P.

aeruginosa à la thérapie antibiotique (Høiby et al., 2010b). Les bactéries du biofilm dans

lequel le QS est bloqué, soit par mutation ou par l'administration de médicaments inhibiteurs

de QS, sont sensibles au traitement par la tobramycine et l’H2O2 contrairement aux bactéries

avec un système de QS fonctionnel (Bjarnsholt et al., 2005 ).

III.4.2 La résistance du biofilm envers les défenses de l’hôte

La capacité des bactéries dans un biofilm à résister à la réponse immunitaire de l’hôte

favorise l’installation des infections chroniques et persistantes (Hall-Stoodley et Stoodley,

2009). Les biofilms de P. aeruginosa possèdent de nombreux moyens pour contre-attaquer le

système immunitaire. Les mécanismes incluent la pénétration limitée des polynucléaires

neutrophiles dans le biofilm, l’intervention du QS et la diminution de la capacité des cellules

hôtes à phagocyter les bactéries du biofilm (Leid, 2009 ; Hänsch, 2012).

La phagocytose « frustrée » est un phénomène rencontré lorsque les bactéries se

développent sous forme d’un biofilm. Les macrophages et les neutrophiles sont responsables

de l’engloutissement et de la mort des bactéries, un mécanisme clé dominant la réponse

immunitaire dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose. Ces cellules libèrent

également des radicaux de l’oxygène (anion superoxyde) et des enzymes comme la

lactoferrine et les lysozymes impliqués dans la mort du pathogène. Ce système est très

Figure 20 : Le réseau polysaccharidique d’alginate protège le biofilm de la

phagocytose par les macrophages de l’hôte

L’alginate des biofilms de P. aeruginosa protège les bactéries de la phagocytose par les

macrophages. Les bactéries d’un biofilm pauvre en alginate peuvent être engouffrées et tuées

par les macrophages. Lors de la transition des bactéries du biofilm vers un phénotype

mucoïde, où l’alginate est présent, les macrophages ne sont plus capables de détruire le

microorganisme (Leid, 2009).

Introduction

39

efficace envers les pathogènes en mode planctonique, mais l’est beaucoup moins en présence

d’un biofilm (Leid, 2009). Les polynucléaires neutrophiles sont immobilisés dans la matrice

d’exopolysaccharides de P. aeruginosa, ont un potentiel oxydatif (génération de peroxyde

d’hydrogène) diminué et peu ou pas d’activité antibactérienne (Jesaitis et al., 2003). La

résistance des biofilms à la phagocytose par les polynucléaires neutrophiles et au H2O2 est un

phénomène dépendant du QS (Bjarnsholt et al., 2005).

On observe également la lyse des neutrophiles qui peut entraîner la libération

d’enzymes protéolytiques dégradant les tissus hôtes. Jensen et ses collègues ont montré que

l’effet nécrotique sur les polynucléaires neutrophiles est causé par les rhamnolipides de P.

aeruginosa dont la production dépend du système du QS (Jensen et al., 2007). La synthèse

des rhamnolipides est augmentée en présence de polynucléaires neutrophiles (Alhede et al.,

2009). Les rhamnolipides entourent les bactéries du biofilm et éliminent les polynucléaires

neutrophiles menant à la persistance de la bactérie (van Gennip et al., 2009 ; van Gennip et

al., 2012). Les rhamnolipides contribuent donc à l’invasion du tissu pulmonaire par P.

aeruginosa (Kownatzki et al., 1987).

L’alginate participe également à la résistance des bactéries dans le biofilm au système

immunitaire. Il diminue le chimiotactisme des polynucléaires neutrophiles (Hänsch et al.,

2008), inhibe l’activation du complément et diminue la phagocytose par les macrophages et

les neutrophiles (Leid et al., 2005). L’alginate peut également influencer la production de

cytokines et par exemple augmenter l’expression d’IL-12 et de TNF-α par les lymphocytes T.

La molécule auto-inductrice 3-oxo-C12-HSL du QS, en plus de son effet de régulateur

de gènes, exerce une fonction immunomodulatrice par interaction avec des cellules de l’hôte

(activation des lymphocytes T, induction de l’apoptose des macrophages et neutrophiles, etc)

afin que le pathogène échappe aux défenses de l'hôte (Chhabra et al., 2003 ; Tateda et al.,

2003 ; Cooley et al., 2008) (voir plus haut). L’interaction de 3-oxo-C12-HSL avec les cellules

mammifères n’est cependant pas encore claire et reste sujette à controverse (Hänsch, 2012).

Figure 21 : Nouveaux antibiotiques à usage systémique approuvés

par la Food and Drug Administration (FDA) (Etats-Unis) de 1983 à 2011

D’après Kuehn, 2011.

Introduction

40

IV. LES PEPTIDES ANTIMICROBIENS

IV.1 DES PEPTIDES COMME NOUVELLES STRATEGIES

THERAPEUTIQUES

Lors de ces dernières décennies, une diminution progressive de l'efficacité d'un grand

nombre d'antibiotiques qui avaient été jusqu’alors utilisés avec succès contre plusieurs types

d'infections bactériennes a été observée. L'accumulation rapide de mutations par les bactéries

et l'utilisation continue et parfois inadéquate des antibiotiques ont abouti à l'émergence

croissante de souches multirésistantes à l’échelle mondiale. Le développement de nouvelles

classes d'agents antimicrobiens est donc devenu impératif. Cependant, durant ces dernières

années, seules quelques classes d'antibiotiques sont entrées sur le marché, principalement

actives contre les bactéries à Gram positif (Silva et al., 2013).

La découverte et l'enregistrement de nouveaux composés à usage thérapeutique est

donc primordiale afin d'assurer un contrôle approprié des maladies infectieuses. Parmi ces

composés, les PAM semblent être d'excellents candidats pour le développement de nouveaux

agents antimicrobiens (Marshall et Arenas, 2003). Les PAM sont largement distribués dans la

nature, provenant de sources diverses, et possèdent une diversité de séquence énorme

(Zasloff, 2002). Leur large spectre d’activité et leur faible capacité à induire une résistance en

font des candidats potentiels. Ils peuvent notamment servir de schéma de base pour le

développement de nouveaux composés anti-infectieux, par des modifications physico-

chimiques afin d’optimaliser leurs performances (Jorge et al., 2012).

IV.2 LL-37, UN PEPTIDE ANTIMICROBIEN HUMAIN

Les PAM sont largement distribués dans la nature (environ 1700 peptides d’après une

liste database, http://aps.unmc.edu/AP/), proviennent de sources animales ou végétales et

possèdent une grande diversité de séquence (Zasloff, 2002). Malgré tout ils partagent

certaines caractéristiques communes : une longueur de 10 à 50 résidus, une charge nette

positive (charge de +2 à +9) et une structure amphiphile, où les acides aminés hydrophobes et

Figure 22 : Représentation du traitement typique d'une cathélicidine

D’après Vandamme et al., 2012.

Figure 23 : Structure du gène et de la pré-pro-protéine,

et séquence du peptide LL-37

D’après Seil, 2011.

Introduction

41

cationiques sont spatialement organisés en secteurs séparés, importante pour leur activité

antimicrobienne (Hancock et Lehrer, 1998 ; Zasloff, 2002 ; Yeaman et Yount, 2003). Les

PAM peuvent adopter différentes structures secondaires bien qu’ils soient généralement

classés en deux groupes prédominants : les peptides formant des feuillets-β ou des hélices-α.

Les hommes produisent deux classes de PAM : les défensines et les cathélicidines. Les

cathélicidines sont un groupe de PAM décrits à la fois chez des espèces invertébrées (myxine)

et vertébrées dont les oiseaux, les grenouilles, les poissons, les serpents et les mammifères.

Chez ces derniers, on retrouve des cathélicidines chez la souris, les bovins, le porc et le lapin

(Kosciuczuk et al., 2012). Les cathélicidines partagent une structure similaire comportant un

domaine N-terminal hautement conservé (domaine catheline-like) d’une longueur d’environ

100 acides aminés (pro-région). Cette pro-région possède une activité inhibitrice de la

cystéine protéase cathepsine L, d’où elle tient son nom (cathepsin L inhibitor). Le domaine N-

terminal est précédé sur le flanc N-terminal d’un peptide signal d’une trentaine de résidus

(pré-région). Le peptide signal est clivé lorsqu’il a rempli son rôle de cibler la cathélicidine

vers des granules de stockage ou vers l’extérieur de la cellule. La structure primaire et

secondaire de la partie C-terminale diffère fortement d’une espèce à l’autre ; cette partie est

responsable de l’activité antimicrobienne et immunomodulatrice du peptide. Le peptide C-

terminal est libéré par clivage de la pré-pro région.

Chez l’homme, une seule cathélicidine a été identifée. Il s’agit de la cathélicidine

hCAP18 (Larrick et al., 1995). L’expression de la cathélicidine hCAP18 est codée par le gène

CAMP (Cathelicidin Antimicrobial Peptide). Le gène CAMP (1963 pb) se trouve au niveau du

chromosome 3 et comporte 4 exons. Les 3 premiers exons codent pour la séquence signal et le

domaine catheline-like et l’exon 4 code pour le PAM (Larrick et al., 1996). Le clivage de

hCAP18 libère la partie C-terminale de 37 résidus, le peptide LL-37.

La protéine hCAP18 est exprimée dans de nombreux types cellulaires, notamment des

cellules immunitaires telles les lymphocytes (Agerberth et al., 2000), les monocytes, les

neutrophiles (Sorensen et al., 1997), les cellules dendritiques (Sigurdardottir et al., 2012) et

certains macrophages (Sonawane et al., 2011). Le précurseur (la pré-pro-protéine inactive) est

stocké en grande concentration dans des granules. La sérine protéinase 3 est la seule protéase

dérivée des neutrophiles responsable du clivage de hCAP18 pour libérer le peptide actif

Introduction

42

LL-37. L’enzyme est stockée dans des granules séparés de hCAP18. Le clivage a lieu dans le

compartiment extracellulaire, lors de la dégranulation (Sorensen et al., 2001). La cathélicidine

humaine est également exprimée dans des cellules en contact avec l’environnement : les

cellules épithéliales de la peau (Frohm et al., 1997 ; Kim et al., 2009), du tractus

gastrointestinal (Hase et al., 2002), respiratoire (Bals et al., 1998b), urinaire, génital (Frohm et

al., 1999) et de la surface oculaire. L’expression du LL-37 peut être constitutive ou induite

(van der Does et al., 2012). En général, l’expression est affectée par la présence de médiateurs

de l’inflammation et de produits microbiens (LPS, IL-6 et IL-1α) et varie en fonction du type

cellulaire (Nell et al., 2004 ; Schauber et al., 2006). Les mécanismes précis de l’expression de

hCAP18 ne sont pas encore totalement déterminés, cependant, des études récentes ont

clairement montré l’importance du métabolite actif de la vitamine D3 comme inducteur de

l’expression de LL-37 au niveau des kératinocytes (Wang et al., 2004).

Des procédures alternatives de clivage de la pré-pro-protéine hCAP18 libérant des

composés distincts du peptide LL-37, ont été mises en évidence chez l’homme. Dans le

liquide séminal, hCAP18 est clivée par la gastricsine, une protéase prostatique. Celle-ci libère

un peptide de 38 résidus, ALL-38, lorsque le pH correspond au pH vaginal (Sorensen et al.,

2003). Après sécrétion du peptide LL-37 sur la surface de la peau (Yamasaki et al., 2006) ou

dans la sueur (Murakami et al., 2004), un processus protéolytique par différentes sérines

protéases de la famille des kallikréines génère de nouveaux PAM (KR-20, KS-30, RK-31,

LL-29 et KS-22).

IV.3 MECANISMES D’ACTION ANTIMICROBIENNE DES PAM

Les mécanismes d’action antimicrobienne des PAM ont fait l’objet d’importantes études

lors de ces trois dernières décennies. Malgré l’importance du travail réalisé dans le domaine,

les aspects de l’interaction PAM-bactérie létaux pour la cellule ne sont pas encore clairement

établis. Cependant, des preuves convaincantes suggèrent que de nombreux PAM fonctionnent

en se liant à la surface des membranes et en perturbant l'organisation des lipides de manière

non spécifique (Condé et al., 2012). Les PAM provoquent la formation de pores

transmembranaires et de canaux ioniques qui engendrent, par fuite d’ions, une dissipation du

potentiel de membrane ce qui peut mener à la mort de la cellule bactérienne.

Introduction

43

Une autre possibilité est la lyse osmotique de la cellule provoquée par une augmentation

sélective de la perméabilité à l’eau. Une troisième explication pouvant être responsable de la

mort bactérienne est la déstructuration physique étendue de la structure membranaire

entraînant la perte de métabolites et de protéines. Les cibles intracellulaires des PAM sont

également associées à la mort de la bactérie (Wimley et Hristova, 2011).

IV.3.1 Attraction peptide-membrane

Les propriétés cationiques des PAM contribuent aux attractions électrostatiques

responsables des interactions initiales des peptides avec les membranes bactériennes. Les

groupements phosphates au niveau des LPS chez les bactéries à Gram négatif ou les

groupements anioniques des acides teichoïques chez les bactéries à Gram positif confèrent

une charge globale négative à la membrane bactérienne. Ces charges négatives facilitent les

interactions électrostatiques initiales avec les PAM chargés positivement. Une corrélation

importante entre la charge du peptide et l’attachement à la membrane a ainsi déjà été

démontrée (Vaz Gomes et al., 1993 ; Dathe et al., 2001).

IV.3.2 Liaison peptide-membrane

Dans une seconde étape, les PAM s’associent à la membrane bactérienne par liaison

aux LPS des bactéries à Gram négatif ou aux acides teichoïques des bactéries à Gram positif.

Avant d’atteindre la membrane cytoplasmique, les PAM doivent traverser la paroi externe. Ce

mécanisme est principalement décrit pour les bactéries à Gram négatif. Hancock et ses

collègues proposent une captation auto-induite (self promoted uptake) (Piers et al., 1994 ;

Hancock et al., 1997). Par leur haute affinité pour les LPS, les PAM peuvent déplacer via un

mécanisme de compétition les cations Ca2+

et Mg2+

, importants dans la stabilité de la

membrane microbienne. Les PAM se lient alors aux sites de liaison des cations divalents. La

liaison des PAM aux LPS implique généralement des interactions électrostatiques entre les

acides aminés cationiques du peptide et les groupements de tête des LPS. Le complexe est

stabilisé par des interactions hydrophobes entre les acides aminés hydrophobes du peptide et

les chaînes acyles des LPS. La taille volumineuse des PAM contribue à engendrer une

Figure 24 : Trois modèles types de l’action antimicrobienne des PAM sur les membranes

(A) Le modèle « en douve de tonneaux » (Barrel stave) ; (B) Le modèle « des pores

toroïdaux » (Aggregate channel) ; (C) Le modèle « tapis » (Carpet-like). D’après Park et al.,

2011.

Introduction

44

perturbation de la structure de la membrane externe et sa perméabilisation, permettant le

passage de diverses molécules et favorisant le transport du peptide lui-même à travers la

membrane endommagée (Hancock et Chapple, 1999). Le peptide atteint alors la membrane

cytoplasmique constituée d’une bicouche lipidique.

IV.3.3 Interaction peptide-membrane

Les interactions des PAM avec la membrane cytoplasmique bactérienne ne sont pas

encore complètement définies : plusieurs mécanismes sont proposés. On distingue les

modèles qui impliquent la formation d’un pore transmembranaire et les mécanismes qui

n’engendrent pas de pore.

Le modèle « en douve de tonneaux » (Barrel stave)

Le modèle « en douve de tonneaux » implique la formation de canaux

transmembranaires par des regroupements de peptides. Un tel mécanisme a été décrit pour la

pardaxine (Rapaport et Shai, 1991) et l’alaméthicine (Yang et al., 2001). Les peptides se lient

à la surface membranaire, s’assemblent et s’insèrent dans la membrane pour initier la

formation d’un pore aqueux. Les faces hydrophobes du peptide s’alignent et font face à la

partie lipidique de la membrane alors que les régions hydrophiles du peptide sont impliquées

dans la formation du pore et sont positionnées vers l’intérieur de la région du pore remplie

d’eau. Des peptides additionnels sont progressivement recrutés menant à une augmentation

régulière de la taille du pore, qui est liée à l’étendue de l’agrégation des peptides dans la

membrane. En conséquence, des composés cellulaires essentiels s’échappent au travers du

pore entraînant la mort de la cellule (Oren et Shai, 1998).

Le modèle « des pores toroïdaux » (Aggregate channel)

Après liaison des peptides aux groupements des phospholipides membranaires, les

peptides s’intègrent dans la membrane et forment des agrégats non structurés qui traversent la

membrane. Ils affectent de façon coopérative la courbure locale de la membrane et forcent les

phospholipides membranaires à se plier de manière à constituer un pore dont les parois sont

formées par les parties polaires des peptides insérés dans la membrane et les groupements

Introduction

45

polaires des phospholipides de la membrane. Un pore continu, du sommet à la base de la

bicouche lipidique, est formé par une forte courbure des phospholipides afin de connecter les

deux feuillets de la membrane à la manière d’un trou toroïdal (Brogden, 2005). Ce modèle

implique la formation dynamique de trous transmembranaires pour une courte durée

permettant la fuite de composés intracellulaires et le passage du peptide à travers la membrane

sans provoquer de dépolarisation membranaire importante. Le peptide peut ensuite agir par

exemple sur des cibles intracellulaires (Zhao, 2003). Ce modèle a été décrit pour la première

fois pour les pores induits par la magainine (Ludtke et al., 1996). L’activité de la mellitine sur

la membrane bactérienne suppose également le modèle de pores toroïdaux (Park et al., 2006 ;

Allende et al., 2005).

Le modèle « tapis » (Carpet-like)

Le modèle en tapis a été décrit pour la première fois pour détailler le mécanisme

d’action de la dermaseptine S (Pouny et al., 1992) et n’implique pas la formation de pore.

Dans ce modèle, les peptides ne s’insèrent pas dans la membrane lipidique mais ils s’agrègent

parallèlement à la surface membranaire au niveau des groupements phosphates des lipides,

par des interactions électrostatiques, et forment un tapis. L’orientation parallèle permet un

contact constant des acides aminés chargés positivement avec les groupements phosphates de

la membrane durant le processus de perméabilisation. En présence d’une concentration élevée

en peptides, ceux-ci perméabilisent la membrane par un mécanisme détergent pouvant

éventuellement mener à la formation de micelles. Les peptides exercent des forces

destructrices sur la membrane menant à la perturbation de la courbure des couches de

membranes. Des pores transitoires sont formés. Finalement la bicouche lipidique se désintègre

et forme des micelles (Oren et Shai, 1998). Dans ce modèle, ainsi que dans le modèle « en

douve de tonneaux », la disparition de l’intégrité membranaire s’accompagne d’une

dissipation du potentiel de membrane. La cecropine P1 agit sur les membranes bactériennes

via ce mécanisme (Gazit et al., 1996).

Introduction

46

IV.3.4 Cibles intracellulaires

L’accumulation de certains PAM au sein des cellules bactériennes affectant des

fonctions intracellulaires a été rapportée soulignant l’existence de mécanismes autres que le

dysfonctionnement membranaire. Le peptide Bac7 est responsable d’une diminution

importante de la viabilité bactérienne mais ne perméabilise pas la membrane de la bactérie. La

pleurocidine et la dermaseptine inhibent la synthèse de l'ADN bactérien tandis que la buforine

II et la tachyplésine se lient aux acides nucléiques en général (Yonezawa et al., 1992). Des

PAM riches en proline, comme la drosocine et l’apidaecine, ciblent une protéine bactérienne

(DnaK) pour exercer leur activité antibactérienne (Otvos et al., 2000).

L’activité antibactérienne de certains PAM peut aussi être attribuée à leur double

fonction de perméabilisation de la membrane bactérienne accompagnée d’une action

intracellulaire avec pour cible par exemple la synthèse d’ADN, d’enzymes ou de composants

de la paroi bactérienne (Otvos, 2005 ; Nicolas, 2009 ; Jorge et al., 2012).

IV.3.5 Mécanismes d’action antimicrobienne du LL-37

Le mécanisme d’action par lequel le peptide LL-37 reconnaît et inhibe les bactéries

reste incomplètement élucidé. Les études ont souvent impliqué la liaison du LL-37 aux LPS

comme interaction initiale avec les bactéries à Gram négatif (Yount et Yeaman, 2013 ; Junkes

et al., 2011). Dans ces modèles, le peptide cationique est attiré électrostatiquement à la

surface anionique riche en LPS de la bactérie à Gram négatif avant de s’accumuler à la

surface. Les mécanismes de résistance aux peptides cationiques bien documentés dans les

bactéries à Gram negatif soutiennent cette hypothèse. Dans ces organismes, la résistance aux

PAM est conférée par l'activation de systèmes de régulation à deux composantes, qui

conduisent à l'incorporation accrue aux LPS de sous-unités d’aminoarabinose chargées

positivement (Yeaman et Yount, 2003).

Récemment, une étude démontre l’existence d’une protéine de la membrane externe de P.

aeruginosa, OprI, responsable de la sensibilité de la bactérie aux PAM cationiques avec une

structure en hélice-α, notamment le peptide LL-37. Les auteurs suggèrent que OprI sert de

Introduction

47

récepteur aux peptides et soulignent un nouveau mécanisme antimicrobien pour ces PAM

(Lin et al., 2010).

Différentes études impliquant des techniques de dichroïsme linéaire et circulaire

(Zhang et al., 2010 ; Lee et al., 2011), de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

(FTIR) (Oren et al., 1999) et de spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)

(Henzler Wildman et al., 2003 ; Thennarasu et al., 2010) démontrent la contribution d’une

hélice-α orientée parallèlement au plan de la bicouche lipidique dans l’activité du LL-37. Ces

études suggèrent que le peptide LL-37 agit via un mécanisme de pores toroïdaux en tapis

(toroidal pore carpet-like) (Vandamme et al., 2012). Le peptide LL-37 atteint la membrane

externe sous forme d’oligomère et/ou de monomère et en couvre la surface. Il se lie

parallèlement à la surface avec ses acides aminés chargés positivement en contact avec les

groupements des phospholipides. L’accumulation du peptide et l’atteinte d’une concentration

seuil entraîne une courbure significative de la membrane, le peptide maintenant le contact

avec les phospholipides (Burton et Steel, 2009), jusqu’à la translocation de monomères de la

membrane externe vers le compartiment périplasmique et la surface de la membrane interne.

Le peptide LL-37 est donc responsable de la formation de pores toroïdaux transmembranaires

dans la bicouche lipidique (Henzler Wildman et al., 2003 ; Lee et al., 2011). La biogenèse de

la membrane bactérienne externe serait également perturbée (Sochacki et al., 2011). Des

micelles ou petites vésicules ne sont pas formées en présence du LL-37 ce qui exclut donc un

mécanisme d’action détergent (Henzler Wildman et al., 2003).

Par la suite, le modèle tapis (carpet like) est le plus plausible. La membrane interne est

recouverte et perturbée par le peptide se liant à la surface lipidique (Burton et Steel, 2009 ;

Henzler Wildman et al., 2003 ; Oren et al., 1999) permettant l’accès du peptide aux cibles

intracellulaires comme l’ADN.

Au niveau de l’épithélium bronchique humain, le peptide LL-37 augmente la rigidité

membranaire accompagnée d’une diminution de la perméabilité membranaire ayant pour

conséquence un effet antibactérien indirect par diminution de la captation de P. aeruginosa et

par prévention de son invasion (Byfield et al., 2011).

Introduction

48

Mécanisme antibiofilm du LL-37

La cathélicidine LL-37, active sur des biofilms de P. aeruginosa, semble agir à

l’intérieur des cellules bactériennes, par modulation de l’expression de gènes essentiels au

développement du biofilm (Overhage et al., 2008 ; Dean et al., 2011). En présence de

concentrations sub-inhibitrices de LL-37, les bactéries du biofilm modifient l’expression de

presque 800 gènes, notamment des gènes impliqués dans l’assemblage du flagelle et dans le

QS (Overhage et al., 2008). Un nouveau peptide cationique synthétique de 9 résidus, dérivé

du LL-37, inhibe la formation d’un biofilm de P. aeruginosa par réduction des motilités

swimming et swarming, par stimulation de la motilité twitching et par la suppression de

l’expression de nombreux gènes impliqués dans la formation du biofilm (de la Fuente-Nunez

et al., 2012). Il convient cependant de mentionner que ce peptide (KRFRIRVRV) n'est pas un

fragment du LL-37 (séquence des résidus différente) ce qui rend la comparaison entre les

résultats obtenus avec ce peptide et l’activité du LL-37 moins pertinente. Les propriétés

antibiofilms des PAM peuvent aussi être attribuées à leurs propriétés de fixation de l’ADN

extracellulaire. L’ADN extracellulaire peut être impliqué dans l’attachement des cellules à

une surface et dans l’agrégation cellulaire (Das et al., 2010). La liaison des peptides

cationiques à l’ADN peut ainsi faciliter le détachement ou la désintégration du biofilm (Hale

et Hancock, 2007).

Figure 25 : Les bases de la sélectivité membranaire des PAM

D'après Zasloff, 2002.

Introduction

49

IV.3.6 Sélectivité cellulaire

Les approches pour explorer la spécificité cellulaire du LL-37 et la compréhension

moléculaire de l’interaction des PAM avec les membranes impliquent généralement une

modélisation de la membrane bactérienne et eucaryote (Wimley et Hristova, 2011). L’étude

de la sélectivité cellulaire des PAM est un concept complexe qui nécessite la considération de

divers facteurs dont la charge, la composition et la distribution lipidique et la rigidité (stérols)

de la membrane (Sevcsik et al., 2008 ; Alba et al., 2012). Les LPS (Gram négatif) et les acides

teïchoiques (Gram positif) chargés négativement contribuent à l’interaction favorable du

peptide cationique avec la membrane bactérienne par opposition aux membranes humaines

qui sont généralement non chargées ou composées de lipides zwitterioniques comme la

phosphatidylcholine et les sphingolipides. La présence de cholestérol dans les membranes

eucaryotes, qui a pour fonction de stabiliser la membrane, protège les membranes humaines

de l’attaque par le LL-37 (Sood et Kinnunen, 2008). Le potentiel de membrane (potentiel

transmembranaire) des bactéries est significativement plus négatif (-130 à -150 mV) que celui

de cellules mammifères (-90 à -110 mV) et peut contribuer à une plus grande affinité des

PAM pour ces membranes (Yeaman et Yount, 2003).

Malgré les études sur bicouches lipidiques en faveur d’une préférence du LL-37 pour

les membranes bactériennes (Neville et al., 2006 ; Zhang et al., 2010), la spécificité du LL-37

à distinguer les cellules eucaryotes et bactériennes est relativement faible (Vandamme et al.,

2012). Le peptide LL-37 peut donc aussi être toxique sur les cellules eucaryotes. Cependant

les concentrations cytotoxiques sont généralement plus élevées que les concentrations

requises pour éliminer le pathogène (Kai-Larsen et Agerberth, 2008).

IV.4 DES PEPTIDES QUI CONTOURNENT LA RESISTANCE

BACTERIENNE

Les antibiotiques modernes sont sujets à de sévères et croissants problèmes de

résistance (Falconer et al., 2011 ; Fabbretti et al., 2011). Face à l’apparition de souches

multirésistantes aux antibiotiques conventionnels, les PAM suscitent un intérêt majeur, une de

leur principale force étant de contourner la résistance aux antibiotiques conventionnels.

Malgré quelques moyens mis en jeu par les bactéries pour résister à l’attaque par les PAM, de

Introduction

50

nombreuses études soulignent la difficulté pour la bactérie de développer une résistance à

long terme envers ces derniers.

Leur potentiel à surmonter la résistance bactérienne repose sur le fait qu’ils sont

d’anciens composants des espèces vivantes et leurs voies d’induction dans tous les

organismes sont conservées (Shai, 2002). Vraisemblablement, les bactéries ont été exposées

aux PAM pendant des millions d'années et, à l'exception de quelques espèces comme

Burkholderia spp (Loutet et Valvano, 2011), aucune résistance généralisée n’a été signalée.

Ceci explique que ces peptides sont potentiellement des points de départ rationnels pour la

conception de médicaments (Fjell et al., 2012). Contrairement aux PAM, les antibiotiques

conventionnels n’endommagent pas la membrane bactérienne directement mais pénètrent au

niveau de l’organisme cible et agissent sur des cibles spécifiques, comme l’inhibition de la

synthèse du peptidoglycane membranaire, l’induction d’autolysines intrinsèques, la cassure de

l’ADN suite à l’inhibition de l’ADN gyrase, l’arrêt de la division cellulaire etc. (Hancock et

Rozek, 2002). Dans de telles conditions, la morphologie bactérienne est préservée et les

bactéries sont capables de développer un mécanisme de résistance. Au contraire, la plupart

des PAM interagissent avec le pathogène par un mécanisme non spécifique via des structures

physiologiques fondamentales peu susceptibles de développer une résistance. Ils perturbent,

perméabilisent et infligent des dommages difficiles à réparer au niveau de la membrane de la

cellule cible, une structure hautement conservée à travers les générations. Pour développer

une résistance envers les PAM, la bactérie devrait entreprendre un changement en profondeur

de sa structure membranaire. Ce profond changement serait l’objet d’un trop long processus et

a peu de chances d’apparaître (Lai et Gallo, 2009 ; Vandamme et al., 2012). De plus,

contrairement aux antibiotiques modernes qui ont un nombre très limité de cibles, les PAM

exercent leur pouvoir antimicrobien via de multiples cibles réduisant les chances pour le

pathogène de développer une résistance. Ainsi, une mutation qui supprimerait une cible

d’action, laisserait encore la possibilité au peptide de tuer la bactérie par les autres voies

d’action (Yeung et al., 2011 ; Jorge et al., 2012).

Les études de développement de la résistance bactérienne sont en accord avec ces

observations. Des souches cliniques de P. aeruginosa ont été exposées pendant 30 passages

en présence de PAM ; la CMI pour la plupart des peptides n’était que 2 à 4 fois plus

importante que la CMI initiale suggérant le faible potentiel de développement de résistance

Introduction

51

envers ces PAM et le rôle intéressant des peptides dans le traitement des infections chez les

patients atteints de mucoviscidose (Zhang et al., 2005). Steinberg et ses collègues démontrent

que la résistance de la protégrine-1 est plus difficile à sélectionner que la résistance aux

antibiotiques classiques comme la norfloxacine et la gentamicine (Steinberg et al., 1997).

Navon-Venezia et ses collaborateurs démontrent que l'exposition répétée de bactéries à Gram

positif à différents PAM dérivés de la dermaseptine n'a pas modifié la CMI de manière

significative après plusieurs passages bactériens contrairement aux antibiotiques

commerciaux (Navon-Venezia et al., 2002).

Il faut également souligner que les infections persistantes sont liées à la formation

d’un biofilm dont l’éradication est un procédé plus difficile principalement à cause de la

matrice d’exopolysaccharides entourant les cellules. De plus, les bactéries au sein du biofilm

adoptent un état de croissance lent et deviennent métaboliquement non actives. La plupart des

antibiotiques conventionnels ne seront donc pas actifs sur les cellules du biofilm, leur cible

primaire étant les cellules métaboliquement actives (Chau, 2010). Par leur mécanisme

d’action non spécifique sur la membrane, les PAM sont capables d’agir sur ces cellules

métaboliquement non actives et à croissance lente.

IV.5 DES PEPTIDES MULTIFONCTIONNELS

L’intérêt suscité par les PAM comme nouvelle approche thérapeutique contre les

infections bactériennes est en partie attribué à leur double rôle biologique. Les PAM

possèdent des propriétés antimicrobiennes importantes mais sont également des composés

immunomodulateurs, deux actions complémentaires pour certains PAM.

L’activité antibactérienne des cathélicidines a été établie peu après la découverte de

cette classe. Ces peptides fournissent une protection envers une large variété de pathogènes

comprenant des bactéries à Gram positif et négatif (Bucki et al., 2010 ; Vandamme et al.,

2012). Le peptide LL-37 possède entre autres une activité puissante envers E. coli (Smeianov

et al., 2000), K. pneumoniae (Smeianov et al., 2000), P. aeruginosa (Travis et al., 2000), S.

aureus (Travis et al., 2000), S. typhimurium (Turner et al., 1998), les streptocoques du groupe

A (Döring et al., 2001) et N. gonorrhoeae (Bergman et al., 2005). Contrairement aux

Figure 26 : Propriétés fonctionnelles des PAM

Les PAM peuvent interagir directement avec les bactéries et conduire à la mort cellulaire par

déstabilisation membranaire et fuite cytoplasmique ou par pénétration dans la cellule et action

sur des cibles cytoplasmiques. Parmi les effets létaux intracellulaires des PAM figurent (a) la

liaison des peptides à l'ADN et l'inhibition du métabolisme de l'ADN, (b) l'inhibition de la

synthèse des protéines, (c) l'inhibition de la synthèse de la paroi cellulaire, et (d) l'activation

d’enzymes autolytiques. Les PAM sont également d’importants immunomodulateurs et

promoteurs de la réparation des plaies et de l'angiogenèse contribuant à la résolution de

l'infection ou des dommages et au maintien de l'homéostasie (Alba et al., 2012). Les PAM

sont d’ailleurs également appelés host defence peptides (HDP) pour leurs propriétés de

modulation de la réponse immune.

Introduction

52

antibiotiques conventionnels ciblant uniquement les infections bactériennes et ayant souvent

un spectre restreint, les PAM sont pourvus d’un spectre d’action très large avec des propriétés

antivirales et/ou antifongiques. Ainsi, l’activité antifongique de la cathélicidine LL-37 sur C.

albicans a été démontrée (Lopez-Garcia et al., 2005 ; Wong et al., 2011b). Les fragments du

peptide LL-37 secrétés au niveau de la peau (KR-20, KS-30 et RK-31) constituent un

mécanisme de protection topique également par leurs propriétés antifongiques (Murakami et

al., 2004). En outre, la cathélicidine humaine possède une activité antivirale et cible

notamment le virus influenza (Barlow et al., 2011 ; Tripathi et al., 2012), le virus de la

vaccine (Howell et al., 2004), le HSV (Galdiero et al., 2013) et l’HIV-1 (Wong et al., 2011a).

Ces peptides bioactifs ne se contentent pas d’agir comme agents antimicrobiens

directs, mais représentent également d'importants effecteurs et régulateurs du système

immunitaire qui sont en mesure de moduler profondément la réponse immunitaire. Ainsi on

pense actuellement que les cathélicidines contribuent à la protection envers les infections et à

leur résolution principalement par leur rôle dans l’immunité (Choi et Mookherjee, 2012). Une

diminution de l’expression de la cathélicidine humaine est associée entre autres à une

augmentation de la sensibilité aux infections de la peau et à de fréquentes infections buccales

(Bowdish et al., 2005). Les peptides sont capables de signaler un dommage tissulaire et

cellulaire et de stimuler l’immunité afin de supprimer ou de prévenir une infection. Le peptide

LL-37 exerce un effet chémoattracteur direct par activation d’un récepteur pour le peptide

fMLP, le Formyl Peptide Receptor Like-1 (FPRL-1) induisant le recrutement de cellules

immunitaires comme les monocytes, les neutrophiles, les cellules dendritiques et les

lymphocytes, vers le site de l’infection (Agerberth et al., 2000 ; Niyonsaba et al., 2002 ;

Tjabringa et al., 2006). FPRL-1 est le seul récepteur qui active une migration directe des

cellules immunitaires (Kai-Larsen et Agerberth, 2008). Par son rôle dans le recrutement de

leucocytes, la cathélicidine humaine aide aussi à la phagocytose pour améliorer la clairance

des agents pathogènes. Le peptide LL-37 est aussi responsable de la stimulation et la

modulation de la libération de chémokines par certaines cellules et exerce ainsi un effet

chémoattracteur indirect des leucocytes. Il promeut la synthèse ou la libération d’IL-1β, IL-4,

IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18 et IL-31 (Yoshioka et al., 2008 ; Montreekachon et al., 2011 ;

Niyonsaba et al., 2010). Le LL-37 régule aussi positivement l'expression de récepteurs de

cytokines dans les macrophages (Scott et al., 2002). Le peptide établit des connexions entre la

réponse immunitaire innée et adaptative en influençant l’activation de cellules dendritiques et

la polarisation des lymphocytes T (Davidson et al., 2004).

Introduction

53

Outre son activité antimicrobienne et ses fonctions de régulateur de l’immunité, le

peptide LL-37 contribue au processus de réparation du tissu épithélial endommagé par la

bactérie ou par l’action du système immunitaire (Heilborn et al., 2003). Il a un rôle important

dans le processus de croissance cellulaire et d’angiogenèse. La réparation des dommages

tissulaires peut impliquer la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. Le peptide LL-37 est

impliqué dans l’initiation de l’angiogenèse par recrutement des cellules progénitrices

endothéliales au site endommagé et par induction de leur prolifération (Koczulla et al., 2003 ;

Pfosser et al., 2010). Le peptide induit la réparation de la plaie, la prolifération et la migration

des cellules épithéliales des voies respiratoires, indiquant qu’il est impliqué dans la régulation

de l’homéostasie du tissu des voies aériennes (Shaykhiev et al., 2005).

Les PAM peuvent également avoir une fonction anti-endotoxique suite à la liaison des

peptides aux LPS (Kai-Larsen et Agerberth, 2008). Les LPS, aussi connus comme les

endotoxines, servent de barrière et de couche protectrice entre la bactérie et son

environnement. Les LPS sont considérés comme un facteur de virulence important car ils

stimulent la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires qui induisent la réponse immunitaire

de l'hôte et aboutissent à un choc septique. Le peptide LL-37, ainsi que de nombreux autres

PAM, se lie avec une haute affinité aux LPS et peut donc limiter ses propriétés endotoxiques

ainsi que la cascade de signalisation immunitaire en découlant (Larrick et al., 1994 ; Turner et

al., 1998 ; Rosenfeld et al., 2006).

IV.6 MECANISMES DE RESISTANCE AUX PAM

La résistance bactérienne face aux antibiotiques conventionnels est un phénomène

préoccupant nécessitant le développement de nouveaux agents antibactériens pour combattre

la résistance des souches bactériennes. La compréhension des mécanismes de résistance

envers les PAM peut fournir des indications précieuses dans la recherche de nouveaux

antibiotiques (Vandamme et al., 2012). Les bactéries sont moins susceptibles de développer

une résistance envers les PAM qui utilisent généralement simultanément différents

mécanismes d’actions antimicrobiens contrairement aux antibiotiques conventionnels

(Peschel et Sahl, 2006).

Introduction

54

IV.6.1 Protéases

Un des inconvénients majeurs à l’utilisation des PAM en usage thérapeutique est leur

sensibilité aux protéases et peptidases. De nombreuses enzymes sont décrites. La cathélicidine

LL-37 est sensible à la protéase V8 et à l’auréolysine sécrétées par S. aureus. P. aeruginosa

sécréte une élastase responsable de la dégradation protéolytique du peptide LL-37

(Sieprawska-Lupa et al., 2004). Une métalloprotéase extracellulaire sécrétée par P. mirabilis,

ZapA, dégrade et inactive les fonctions anti-infectieuses de la β-défensine humaine 1 (hBD1)

et du peptide LL-37 (Belas et al., 2004).

IV.6.2 Molécules extracellulaires liant les PAM

Certaines bactéries produisent des molécules extracellulaires capables de se lier aux

PAM et d’inhiber leurs fonctions. S. pyogenes se protège de l’action antimicrobienne du LL-

37 par sécrétion d’une protéine capable de neutraliser le peptide (Frick et al., 2003). S. aureus

produit une exoprotéine, la staphylokinase, pouvant se lier aux α-défensines et inhiber leur

activité bactéricide (Jin et al., 2004). En outre, l'inhibiteur streptococcique du complément

(SIC), produit par certains streptocoques très virulents, interagit avec le peptide LL-37, une

défensine α Human Neutrophil Peptide 1 (HNP-1) et hBD 1-3 conduisant à l'inactivation de

leur activité antibactérienne (Fernie-King et al., 2006).

IV.6.3 Pompes à efflux

Des structures protéiques ont été développées par les bactéries afin d’expulser

activement certains peptides. Le système Sap de S. typhimurium est responsable de la

résistance à la mellitine et à la protamine par transport actif de ces peptides dans le

cytoplasme afin de contourner les propriétés de rupture membranaire des peptides (Parra-

Lopez et al., 1993). Le système d'efflux Mtr de N. gonorrhoeae régule l’activité de la

protégrine-1 et du LL-37 par expulsion de ces derniers à l'extérieur de la membrane (Shafer et

al., 1998).

Introduction

55

IV.6.4 Altération des propriétés de la surface cellulaire

Les interactions préférentielles bactéries-peptides reposent sur les propriétés, la

structure et l’organisation de la membrane de la bactérie. La membrane bactérienne est une

structure hautement conservée au cours des générations et il semble peu concevable que la

composition et l’architecture des membranes, également essentielle au pathogène, puisse

fondamentalement changer (Lai et Gallo, 2009). Cependant les bactéries ont adopté d’autres

stratégies pour se défendre des interactions avec les PAM. La modification des propriétés

électronégatives à la surface des bactéries à Gram positif et négatif engendre une diminution

de la sensibilité des bactéries aux PAM.

Bactéries à Gram positif

Les bactéries à Gram positif contiennent une paroi épaisse riche en peptidoglycane et

en polymères d’acides teichoïques ou lipoteichoïques anioniques, par les groupements

phosphate, conférant une charge nette négative de la surface bactérienne. La diminution de la

charge globale négative à la surface membranaire par incorporation de D-alanine est un

moyen adopté par certaines bactéries pour limiter leur interaction avec les peptides

cationiques. La D-alanine est couplée via un lien ester à la chaîne d’acide teichoïque exposant

le groupement amine chargé positivement. La D-alanylation est le résultat de l’expression de

l’opéron dltABCD comportant 4 gènes (Neuhaus et Baddiley, 2003). Ce mécanisme est

retrouvé chez plusieurs bactéries à Gram positif dont S. pyogenes (Kristian et al., 2005), L.

monocytogenes (Abachin et al., 2002), S. epidermidis et S. aureus où le phosphatidylglycérol

membranaire est substitué par une lysine (Peschel et al., 2001). Récemment Saar-dover et al.

(2012) ont suggéré que la protection conférée par la D-alanylation des acides lipoteichoïques

a pour conséquence une diminution de la flexibilité de la paroi bactérienne liée à une

augmentation de la densité et de la rigidité de la paroi.

Bactéries à Gram négatif

Les bactéries à Gram négatif, dont P. aeruginosa, ont développé un mécanisme de

résistance aux PAM par modification du lipide A des LPS membranaires. Le caractère

anionique du lipide A est altéré par l’addition de 4-aminoarabinose ce qui provoque une

différence structurelle et une diminution des charges négatives de la membrane entravant

l’interaction entre la membrane bactérienne et les PAM (Gooderham et Hancock, 2009). La

Introduction

56

modification dans la structure des LPS chez P. aeruginosa est secondaire à l’activation de

l’opéron arn BCADTEF (McPhee et al., 2006).

IV.7 APPLICATION CLINIQUE DES PAM : OBSTACLES ET AVANCEES

Malgré les nombreux avantages conférés par les PAM, leur usage thérapeutique est

limité et doit contourner des inconvénients majeurs tels leur dégradation protéolytique, leur

coût et leur toxicité systémique inconnue avant de tirer pleinement profit de ces molécules

(Bell, 2011). Différentes pistes sont envisagées pour optimaliser l’usage clinique des PAM.

IV.7.1 Coût de la production

Le développement des PAM à échelle industrielle implique des coûts très élevés liés

principalement aux processus d’extraction, d’isolation et de purification (Jorge et al., 2012 ;

Parachin et al., 2012). La masse moléculaire importante et la structure complexe des PAM

rend leur synthèse chimique également onéreuse (Parachin et al., 2012). La production de 1 g

de PAM peut couter de 50 à 400 US$ alors que la production d’antibiotiques conventionnels

ne dépasse pas 1 US$ (Marr et al., 2006).

Les stratégies proposées pour réduire les coûts de production sont multiples. La

conception et la synthèse de dérivés de plus petite taille et de composition plus simple

semblent une première option à envisager (Wimley et Hristova, 2011). Des procédés de

fabrication utilisant de l’ADN recombinant sont actuellement en développement pour

optimalisation et sont considérés comme très efficaces pour augmenter la production des

PAM (Parachin et al., 2012). Exploiter les propriétés immunomodulatrices des PAM dans un

but thérapeutique permettrait de réduire la dose requise du composé dans le traitement des

infections. Pour réduire la dose, une administration locale des peptides au niveau du site

d’action est également à envisager. L’administration par aérosol permet d’atteindre les

poumons et de combattre les infections pulmonaires persistantes et résistantes à

l’antibiothérapie conventionnelle souvent administrée par voie parentérale (Hancock et Sahl,

2006).

Introduction

57

IV.7.2 Sensibilité aux conditions physiologiques et aux protéases

L’activité des PAM peut être significativement réduite dans des conditions

physiologiques. L’activité du peptide LL-37 diminue en présence de fortes teneurs en sel

(Turner et al., 1998) ou dans un milieu complexe (Bowdish et al., 2005). En présence de NaCl

100 mM, l’activité antimicrobienne du LL-37 sur S. aureus, P. mirabilis et C. albicans est

inhibée alors que le peptide est actif sur ces mêmes espèces dans un milieu pauvre en sel. Le

peptide conserve cependant son activité sur P. aeruginosa, S. typhimurium, E. coli, L.

monocytogenes, S. epidermidis, S. aureus et sur les entérocoques résistants à la vancomycine

(Turner et al., 1998). L’environnement riche en sel des sécrétions broncho-pulmonaires chez

les patients atteints de mucoviscidose (Zabner et al., 1998) pourrait donc inhiber l’efficacité

antimicrobienne des PAM à la surface des voies respiratoires (Goldman et al., 1997 ; Bals et

al., 1998a ; Bals et al., 1998b). Les cations divalents présents dans les expectorations, le

liquide de surface des voies respiratoires et le sérum peuvent également être responsables

d’une diminution de l’efficacité des PAM (Lehrer et al., 1988 ; Turner et al., 1998). Des

facteurs microbiologiques comme certains polysaccharides libérés par des pathogènes

pulmonaires antagonisent l’activité des peptides (Benincasa et al., 2009). Ainsi des complexes

moléculaires peuvent se former entre les exopolysaccharides de P. aeruginosa et la

cathélicidine LL-37 avec pour conséquence une inhibition de l’activité du peptide (Foschiatti

et al., 2009). La présence de composés anioniques dans certains fluides biologiques pouvant

interagir avec les PAM peut être responsable d’une diminution de l’efficacité

antimicrobienne. La présence d’ADN et d’actine-F libérée par les neutrophiles morts et autres

cellules lysées au niveau des expectorations des patients atteints de mucovsicidose, limite

l’utilisation du peptide LL-37. Une concentration importante des PAM, normalement

solubles, se retrouve séquestrée à la surface des filaments polyanioniques aboutissant à la

formation d’agrégats denses et stables qui inhibent l’activité bactéricide du peptide LL-37

(Bucki et al., 2007a). L’action du peptide LL-37 est réduite in vitro dans les fluides en

présence de concentrations importantes de glycosaminoglycans mais aussi en présence

d’héparine dans le plasma. L’interaction peptide-glycosaminoglycans peut être bloquée par

des polymères cationiques comme le DEAE-dextran et le chitosan (Baranska-Rybak et al.,

2006). Dans le plasma, LL-37 se lie à une apolipoprotéine-I, réduisant la concentration libre

du peptide et donc inhibant son activité cytotoxique. L’activité antimicrobienne du peptide est

également entravée (Wang et al., 1998).

Introduction

58

Des efforts considérables dans la recherche et la conception d’analogues stables et

résistants aux conditions physiologiques sont entrepris. Des légères modifications de

l’hydrophobicité, l’amphipaticité, la charge et le degré d’hélice-α, peuvent considérablement

modifier l’activité des peptides et leur résistance au sel (Friedrich et al., 1999). Shin et al.

(2002) ont synthétisé un peptide cationique avec une hélice-α possédant des propriétés

antibactériennes, dépourvu de cytotoxicité, résistant à la présence de concentrations élevées

en NaCl, CaCl2 et MgCl2. Murakami et ses collègues ont mis en évidence des fragments

dérivés du LL-37, les peptides KR-20, RK-31 et KS-30, avec une sensibilité moindre aux sels

et une activité antimicrobienne maintenue (Murakami et al., 2004). Les clavanines, un groupe

de PAM riches en histidine et avec une structure en hélice-α, ont une activité antimicrobienne

dans un milieu normal et riche en NaCl (Lee et al., 1997). Récemment, Yu et al. (2011) ont

proposé une stratégie permettant d’améliorer la résistance aux sels des PAM par substitution

des résidus tryptophane ou histidine par des groupements volumineux, tels que la β-

naphthylalanine ou la β-(4,4’-biphényl)alanine.

Un autre inconvénient majeur des PAM est leur labilité métabolique. La sensibilité des

PAM aux protéases procaryotes et eucaryotes est responsable d’une diminution de la

biodisponibilité des molécules et donc de leur profil pharmacocinétique non favorable. In

vivo, des protéases intestinales, des tissus et du sérum sont responsables de la dégradation des

peptides (Park et al., 2011). Différentes stratégies sont développées afin d’optimaliser

l’activité biologique des PAM. La substitution des acides aminés naturels de la série L par des

acides aminés non naturels ou par des acides aminés de la série D et la cyclisation des

peptides, sont des stratégies bien connues pour améliorer la stabilité des peptides.

La substitution d’un acide aminé L par un acide aminé D préserve l’activité antifongique du

peptide [Pro3]TL, un dérivé issu de la peau de grenouille, sans exercer d’effets toxiques sur

les cellules humaines (Grieco et al., 2013). Wang et al. (2010) développent plusieurs PAM par

substitution des acides aminés L par des acides aminés D et démontrent que ces peptides ont

une sélectivité cellulaire favorable, une meilleure stabilité face aux protéases et une activité

anti-inflammatoire améliorée. L’équivalence de l’activité antibactérienne et antibiofilm sur P.

aeruginosa de l’énantiomère D-LL-37 comparée au L-LL-37 a été montrée (Dean et al.,

2011). Les deux peptides réduisent la formation du biofilm et diminuent la biomasse du

biofilm pré-existant. De plus, le dérivé D-LL-37 est résistant à la trypsine suggérant que ce

Introduction

59

peptide est une avancée importante dans le développement de nouveaux traitements pour les

infections à P. aeruginosa (Dean et al., 2011).

La cyclisation des PAM est une approche alternative pour surmonter le clivage protéolytique.

La fixation des extrémités de la molécule qui sont normalement mobiles résulte en des

contraintes conformationnelles qui rendent plus difficile la reconnaissance par les protéases et

favorisent donc la stabilité du peptide. La cyclisation peut parfois aussi améliorer la

spécificité cellulaire (Matsuzaki, 2009 ; Rozek et al., 2003). Dartois et al. (2005) démontrent

l’efficacité in vivo de peptides cycliques et soulignent leur potentiel pour une administration

systémique dans le traitement d’infections résistantes à l’antibiothérapie conventionnelle. Le

remplacement par des acides aminés D et la cyclisation du peptide CATH-2, une cathélicidine

issue du cochon, ont permis d’augmenter sa stabilité dans le sérum humain (résistance à la

protéolyse par la trypsine et par les protéases bactériennes) et de diminuer sa cytotoxicité sans

influencer l’activité antibactérienne du peptide sous des conditions physiologiques (Molhoek

et al., 2011).

La substitution de 4 résidus par du tryptophane du peptide EFK17 (LL16-32) dérivé du LL-37

a pour conséquences une amélioration de ses performances antimicrobiennes et une réduction

de sa sensibilité aux protéases (Strömstedt et al., 2009). La fluorination des acides aminés de

la buforine et de la magainine induit une meilleure stabilité de ces peptides face aux protéases

et maintient une activité antimicrobienne significative (Meng et Kumar, 2007).

Parmi les stratégies envisagées pour contourner certains effets biologiques

indésirables, le développement de molécules peptido-mimétiques a suscité un grand intérêt

(Wipf et al., 2009 ; Chongsiriwatana et al., 2008). Le CSA-13, un composé synthétique de la

famille de céragenines a été synthétisé pour contourner certains inconvénients rencontrés avec

les PAM naturels (Epand et al., 2008).

D’autre part, l’utilisation de formulations appropriées peut contribuer à une diminution

de la susceptibilité des PAM aux protéases. La dégradation du peptide LL-37 par l’élastase de

P. aeruginoa est bloquée par des inhibiteurs de métalloprotéases (par exemple, GM6001) et la

co-administration est une option de traitement à évaluer (Schmidtchen et al., 2002). La

formulation des PAM avec des liposomes est également décrite (voir paragraphe suivant).

Introduction

60

Cependant, malgré le faible temps de demi-vie (t1/2) de nombreux PAM, évalué en

minutes ou en heures, le t1/2 du peptide LL-37 mesuré après injection intraveineuse de 100 µg

de LL-37 est de 3,4 jours dans le sérum de la souris (Bals et al., 1999).

IV.7.3 Profil toxicologique

Les PAM ont attiré une attention considérable pour leur large spectre d'activité

antimicrobienne et pour leur tendance réduite à induire une résistance bactérienne. De

nouvelles préoccupations sur leur cytotoxicité pourraient cependant finalement compromettre

leur développement en tant que médicament.

Diverses approches ont été employées pour optimaliser la séquence initiale des PAM

dans le but d’améliorer les effets antimicrobiens tout en réduisant les effets cytotoxiques

indésirables sur les cellules de mammifères (Hilpert et al., 2006 ; Chou et al., 2008 ; Park et

al., 2009). Récemment, Liu et ses collègues ont synthétisé des peptides hybrides avec feuillet-

β en épingle à cheveux avec une sélectivité cellulaire améliorée pour un grand nombre de

bactéries à Gram positif et négatif (Liu et al., 2013). Des modifications du peptide LL13-31

(IG-19, un dérivé du LL-37) ont permis d’augmenter la sélectivité cellulaire procaryote versus

eucaryote du peptide et sa stabilité face aux protéases : la substitution des acides aminés 4, 10,

14, 15 et 18 de IG-19 par 4 résidus lysines et 1 résidu tryptophane, le remplacement des

résidus-L par des résidus-D et les analogues diastéréomériques ou énantiomériques permettent

une activité antibactérienne sélective, sans toxicité mammalienne et avec une stabilité

augmentée (Nan et al., 2012a ; Nan et al., 2012b).

Les effets cytotoxiques des PAM in vivo peuvent être atténués par liaison avec des

composants retrouvés dans le sérum comme les apolipoprotéines-I (Wang et al., 1998 ;

Sorensen et al., 1999). L’équipe de Sorensen suggère un rôle de réservoir conféré par les

lipoprotéines qui lient la cathélicidine hCAP18 (Sorensen et al., 1999).

L’utilisation de formulations appropriées, comme le développement de liposomes

permettant de piéger puis de libérer les PAM, peut représenter une alternative à l’application

directe de ces substances et donc limiter leur toxicité (Hancock et Sahl, 2006 ; Desai et al.,

2002). Plusieurs groupes mettent en évidence des nanostructures lipidiques comme outil

prometteur d’encapsulation et de libération des peptides (Brandelli, 2012 ; Urban et al., 2012).

Tableau 1 : Peptides antimicrobiens et développement des médicaments

D’après Fjell et al., 2012.

Introduction

61

Afin de contourner la toxicité systémique, l’application topique des PAM est

exploitée. Dans cette approche, des méthodes de délivrance locale des PAM, par

immobilisation et libération des PAM à partir d’implants, sont explorées (Chau, 2010). La

libération locale de PAM à partir de structures nanotubulaires en TiO2 a montré une grande

activité antibactérienne dans les infections péri-implants (Ma et al., 2011). L’administration

locale des PAM dans le tractus respiratoire par aérosol semble particulièrement intéressante

pour le traitement des infections pulmonaires (Hancock et Sahl, 2006). L’administration

locale par inhalation de peptides et de protéines a déjà des applications thérapeutiques comme

la DNase (Pulmozyme®, Genentech, San Francisco, CA, USA) administrée chez les patients

atteints de mucoviscidose pour diminuer la viscosité des expectorations.

IV.7.4 Développement clinique actuel des PAM

Actuellement au moins 15 peptides ou mimétiques sont dans (ou ont complété) les

études cliniques comme agents antimicrobiens ou immunomodulateurs (voir Tableau 1).

L’omiganan, un peptide cationique de défense de l’hôte dérivé de l’indolicidine, est en phase

II des essais cliniques pour son efficacité dans la prévention des infections associées aux

cathéters. Le pexiganan, un analogue synthétique de la magainine dérivée de la peau de

grenouille, a complété la phase III des essais cliniques et cible la prévention des ulcères du

pied diabétique, ainsi que l’iseganan, un dérivé synthétique de la protégrine-1, pour la

prévention de la mucosité buccale chez les patients subissant une radiothérapie. Ces produits

n’ont cependant pas obtenu l’approbation de la New Drug Application (NDA) pour cause de

non capacité à démontrer un avantage par rapport aux traitements existants (Yeung et al.,

2011 ; Ranall et al., 2012 ; Fjell et al., 2012). La plectasine, une défensine fongique, est en

phase préclinique pour son activité envers des bactéries résistantes, comme celles

responsables de pneumonies. Le peptide possède une efficacité importante dans des infections

systémiques (Zaiou, 2007 ; Schneider et al., 2010).

Dans l'ensemble, les peptides qui sont actuellement en études cliniques offrent des

alternatives intéressantes aux traitements standards et soulignent que les PAM synthétiques

sont un domaine actif et prometteur de la recherche scientifique (Fjell et al., 2012).

Figure 27 : CSA-13

Introduction

62

V. LES CERAGENINES

Une des cibles fréquemment étudiées pour le développement de nouveaux

médicaments est la membrane bactérienne. Celle-ci est une cible intéressante étant donné que

les éléments structurels qui la composent sont pour la plupart conservés. Les perturbations et

la perméabilisation provoquées au niveau des membranes bactériennes infligent des

dommages généralement trop difficiles à réparer pour la bactérie. De nombreux agents actifs

au niveau de la membrane bactérienne, dont les PAM, possèdent des caractéristiques

communes : ces agents sont des molécules cationiques et amphiphiles (Chin et al., 2008).

La recherche d’analogues aux PAM a débuté et dans ce but, Li et ses collaborateurs

ont exploré des dérivés de l’acide cholique (Li et al., 1999). La synthèse de dérivés de l’acide

cholique avec des groupements aminoalkyls ajoutés aux groupements hydroxyles a permis

d’aboutir à une classe de composés appelés « céragenines ». Les groupements amines sont

protonés à pH neutre, d’où le nom de Cationic Steroid Antibiotics (CSA) également donné à

ces molécules (Epand et al., 2008). Comme les groupements hydroxyles des acides biliaires

sont orientés sur une face de la molécule, ces composés sont facialement amphiphiles avec un

côté hydrophobe formé par le noyau stérane et les charges positives des groupements amines

formant la face hydrophile de la molécule. De cette manière, les céragenines ressemblent aux

hélices amphiphiles formées par les PAM et possèdent des activités antibactériennes

comparables à celles des PAM (Chin et al., 2007 ; Ding et al., 2002). Le CSA-13 est le plus

actif des dérivés de l’acide cholique.

V.1 PROPRIETES ANTIBACTERIENNES DU CSA-13

La classe des composés céragenines (stéroïdes cationiques) agit par un mécanisme

comparable aux PAM (Ding et al., 2002). Dans des conditions physiologiques, les dérivés de

l’acide cholique portent de multiples charges positives et s’associent préférentiellement aux

membranes bactériennes chargées négativement (Li et al., 1999). Par sa haute affinité pour

ces dernières, le CSA-13 est capable de perturber rapidement l’intégrité de la membrane

ciblée et d’aboutir à la mort cellulaire (Savage et al., 2002). L’efficacité des céragenines est

fortement liée à la composition lipidique de la membrane et à la haute affinité des céragenines

Introduction

63

pour les lipides A, constituants de la membrane externe des bactéries à Gram négatif (Ding et

al., 2004). Cette propriété est à la base de la sélectivité pour les cellules procaryotes versus

eucaryotes et pour les bactéries à Gram négatif versus Gram positif (Ding et al., 2002 ; Epand

et al., 2007).

Par ailleurs, on reconnaît aux agents antibactériens cationiques des fonctions anti-

inflammatoires. Les épisodes inflammatoires répétés caractérisent les poumons de patients

atteints de mucoviscidose et exacerbent l’état pathologique de ces patients. Le CSA-13,

comme le peptide LL-37, fixe les LPS, composants de la membrane bactérienne. Une

conséquence potentiellement bénéfique de cette interaction est la suppression de

l’inflammation provoquée par les composants de la membrane bactérienne (Bucki et al.,

2007b).

V.2 CSA-13 ET MUCOVISCIDOSE

Différentes études ont comparé les avantages du stéroïde cationique CSA-13 par

rapport au peptide cationique antibactérien LL-37 pour leur action bactéricide dans le

traitement des infections chroniques de patients atteints de mucoviscidose.

La présence d’ADN et d’actine-F en grandes concentrations au niveau des

expectorations des patients malades limite l’utilisation du peptide LL-37. Le CSA-13 offre

l’avantage d’être moins sensible à l’inactivation par l’ADN ou l’actine-F. Ce phénomène

s’explique par des différences structurelles entre les deux molécules. Le CSA-13 est une

molécule de taille plus petite que le peptide LL-37, avec une charge nette positive plus faible

et une distribution de la densité de charge différente. Les deux molécules diffèrent également

par leur conformation. L’activité du CSA-13 étant moins compromise par l’ADN et l’actine-

F, la molécule peut interagir avec les charges de la membrane bactérienne.

L’activité antibactérienne du peptide LL-37 est également inhibée par les mucines

salivaires, contrairement au CSA-13 qui conserve la plupart de ses fonctions (Bucki et al.,

2008). Les mucines salivaires sont constituées de chaînes polypeptidiques et glucidiques, qui

Introduction

64

donnent à la salive sa viscosité. La mucoviscidose se caractérise notamment par une

hypersécrétion de mucines salivaires (Carnoy, 1991).

En outre, la nature non peptidique du CSA-13 permet d’accroître sa stabilité envers la

protéolyse par les enzymes des cellules de l’inflammation (Bucki et al., 2007b).

La classe des céragenines offre dès lors un potentiel thérapeutique dans le traitement

des infections par P. aeruginosa des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose.

But du travail

65

BUT DU TRAVAIL

But du travail

66

Le but de ce travail a été d’étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques dirigées

contre les infections pulmonaires à P. aeruginosa impliquant la formation d’un biofilm chez

les patients atteints de mucoviscidose afin de contourner l’émergence de la résistance face aux

antibiotiques conventionnels.

Ce travail nous a dans un premier temps amenés à caractériser plusieurs souches de P.

aeruginosa, comprenant des souches de référence et des souches cliniques isolées des

expectorations de patients atteints de mucoviscidose, notamment pour leur capacité à adhérer

à une surface et à développer un biofilm.

Nous nous sommes ensuite intéressés à l’étude d’un nouvel antibiotique potentiel, le

CSA-13, sur les biofilms formés par les souches cliniques de P. aeruginosa. L’objectif était

d’investiguer l’ensemble des propriétés du composé sur les différents modes de vie de P.

aeruginosa (culture planctonique, formation du biofilm et biofilm préétabli) ainsi que

d’établir l’intérêt d’une co-administration du CSA-13 avec la tobramycine, un antibiotique

utilisé actuellement chez les patients atteints de mucoviscidose. Nous avons également

exploré la toxicité du composé et avons tenté de minimaliser les effets toxiques du CSA-13

par association de la molécule à l’acide pluronique.

Notre travail a aussi consisté à identifier les séquences essentielles à l’effet

antimicrobien et antibiofilm du peptide LL-37, la seule cathélicidine humaine, afin

d’optimaliser les propriétés du peptide dans le combat contre P. aeruginosa. Par utilisation

d’une librairie de fragments dérivés du LL-37, nous avons tenté d’identifier les fragments

peptidiques présentant une efficacité antibactérienne et antibiofilm importante accompagnée

d’une toxicité réduite. Nous nous sommes également intéressés à certaines propriétés des

différents fragments, comme leur structure secondaire ou leur capacité à fixer des LPS,

fonction de leur activité antimicrobienne.

Ce travail devrait donc contribuer au développement de nouvelles thérapeutiques dans

la prévention ou le traitement des infections pulmonaires chez les patients atteints de

mucoviscidose.

Matériel et Méthodes

67

MATERIEL ET

METHODES

Matériel et Méthodes

68

I. MATERIEL

I.1 SOUCHES BACTERIENNES

Le travail s’est porté sur l’étude de différentes souches de P. aeruginosa. Parmi elles,

3 souches de référence : les souches ATCC 15692 PAO1, ATCC 9027 et ATCC 15442. Les

souches cliniques proviennent des expectorations de patients atteints de mucoviscidose ; les

souches P. aeruginosa PYO1, PYO2 sont fournies par le centre de la mucoviscidose de

l’Hôpital Erasme et les souches MC75-450457, MC099-450467 et MC093-450507

proviennent de l’Université de Gent. Quatre de ces souches sont de phénotype mucoïde : les

souches PYO2, MC75-450457, MC099-450467 et MC093-450507. Des cultures bactériennes

sont stockées à -20 °C dans du glycérol. Avant utilisation, les colonies bactériennes sont

étalées sur un milieu Mueller Hinton (MH) solide et incubées à 37 °C pendant 24 h. Après

incubation, l’identification des souches est confirmée à l’aide d’une galerie API 20NE

(bioMérieux Marcy-l’Etoile, France). Les bactéries sont repiquées maximum 3 fois sur gélose

MH.

Les souches de P. aeruginosa PAO1 exprimant la Green Fluorescent Protein (GFP),

PAO1 (pMF230) (Nivens et al., 2001) et la Red Fluorescent Protein (RFP), PAO1 (pMF440)

(non publié) utilisées dans les expériences de microscopie confocale à balayage laser (MCBL)

ont été fournies par le Pr M.J. Franklin (Center for Biofilm Engineering, Montana, Etats-

Unis). Les deux plasmides contiennent un marqueur de résistance à la carbénicilline. La

souche donneuse de E. coli portant le plasmide mobilisable pMF230 (Nivens et al., 2001) et la

souche mobilisatrice de E. coli (helper strain) portant le plasmide conjugatif pRK2013

(Figurski et Helinski, 1979) ont également été fournies par le Pr M.J. Franklin. Le plasmide

de ces 2 souches leur confère une résistance à la kanamycine.

Les souches P. aeruginosa CGMCC 1.860 et A. tumefaciens NTL4(pZLR4) ont été

fournies par le Dr J.J. Zhong (East China University of Science and Technology, Shangai,

Chine) et par le Pr S. Farrand (University of Illinois, Urbana-Champagne, Etats-Unis)

respectivement. Ces 2 souches ont été génétiquement modifiées afin d’être utilisées comme

souches biorapporteurs pour C4-HSL (Yong et Zhong, 2009) et Cn≥6-HSL (Cha et al., 1998)

respectivement.

Matériel et Méthodes

69

La souche E. coli ML-35p provient du laboratoire du Pr R.I. Lehrer (UCLA-Center for

the Health Sciences, Los Angeles, Etats-Unis) et a été créée spécifiquement pour étudier la

perméabilisation de la membrane externe et interne d’une même souche.

Préparation de la suspension bactérienne initiale (SBI)

Les souches de P. aeruginosa sont incubées 18 à 24 heures à 37 °C sur gélose MH de façon à

obtenir des colonies isolées. Après cette incubation, quelques colonies sont prélevées,

transférées dans 10 mL de milieu de culture et incubées sous agitation orbitale à 37 °C

pendant une nuit (Gallenkamp Orbital Incubator, Sanyo, Pocklington, UK). Le lendemain, la

densité optique (DO) 600 nm est ajustée de 0,010 à 1,000 en fonction de la sensibilité de la

manipulation à effectuer.

I.2 AGENTS ANTIBACTERIENS

Préparation de l’association CSA-13 et acide pluronique F-127

Le CSA-13 a été fourni par le Pr P.B. Savage (Brigham Young University, Utah, Etats-Unis).

L’acide pluronique F-127 est un hydrogel thermoréversible formant une solution à faible

température et un gel à température corporelle (lorsque la concentration en acide pluronique

F-127 est supérieure à 15 %). L’acide pluronique F-127 est ajouté à l’eau afin d’atteindre une

concentration de 30 % et le mélange est chauffé à 60 °C (formation d’un gel). Le mélange est

ensuite refroidi à 4 °C afin d’obtenir une solution. Les étapes de chauffage et de

refroidissement sont répétées jusqu’à l’obtention d’une solution homogène. La solution de

CSA-13 est ajoutée à la solution aqueuse d’acide pluronique F-127 à 30 % à 4 °C afin

d’atteindre la concentration désirée en composé stéroïdien.

Peptides

La synthèse du peptide LL-37 et des différents fragments a été réalisée par l’équipe du Pr J.G.

Bolscher (University of Amsterdam and VU University Amsterdam, Amsterdam, Pays-Bas)

comme décrit précédemment (den Hertog et al., 2006).

B

Figure 28 : Formation du biofilm par le BFRT®

Figure A : Absence de biofilm. Lorsque les bactéries ne forment pas de biofilm, les billes

présentes dans le puits sont totalement mobiles et forment un spot au centre du puits après

application d’un champ magnétique. L’indice de formation du biofilm (IFB) est supérieur à 7.

Figure B : Biofilm en développement. Quand un biofilm se développe à la surface du fond du

puits, les particules sont progressivement immobilisées, et sont moins nombreuses à réagir

sous l’influence du champ magnétique. On observe une atténuation du spot. L’IFB est

compris entre 7 et 2. Figure C : Biofilm couvrant toute la surface du puits. En présence d’un

biofilm totalement formé, toutes les particules sont immobilisées. On n’observe plus de spot

suite à l’application du champ magnétique. L’IFB se stabilise autour de 1,5 (BioFilm

Control®, 2010).

A

C

Matériel et Méthodes

70

II. METHODES

II.1 FORMATION DES BIOFILMS

II.1.1 Formation des biofilms par le BFRT®

Principe

La technique de formation du biofilm par la technique du BioFilm Ring Test®

(BFRT®) est réalisée dans une microplaque. Les bactéries sont incubées en présence de billes

magnétisables de la taille des bactéries. L’exposition des billes à un champ magnétique induit

leur agrégation dans le centre du puits et un spot visible se forme. Les billes qui sont piégées

dans le biofilm ne sont pas capables de s’agréger en réponse à un champ magnétique et aucun

spot visible n’est observé. La taille du spot peut être utilisée comme une mesure de la mobilité

des billes (Chavant et al., 2007).

Protocole expérimental

La formation du biofilm est évaluée par la méthode du BFRT®

selon la technique

décrite par Chavant et al. (2007). Après 1 min d’homogénéisation, une solution de billes

magnétiques (Toner) est ajoutée à la SBI préparée dans un milieu BHI (essai test) ou au

milieu BHI (essai contrôle) à une concentration finale de 10 µL/mL. Deux cents µL de ce

mélange sont ajoutés dans les puits d’une microplaque stérile organisée en 12 barrettes Strip

Well MSW002B de polystyrène individuelles de 8 puits. Chaque souche est étudiée en

triplicat. Deux puits servent de contrôle négatif et le mélange BHI-Toner y est ajouté. Les

puits sont ensuite couverts et la plaque transférée dans une atmosphère humide pour une

incubation à 37 °C. Les étapes initiales de la formation du biofilm sont évaluées après 0, 10,

20, 30, 45, 60 et 90 min d’incubation. Cent µL de liquide de contraste sont alors ajoutés aux

différents puits. Cette huile opaque et inerte est non toxique et permet la lecture de la plaque

par un lecteur à plaques spécialement conçu pour le test (BFRT®

). Après avoir scanné une

première image, la plaque est soumise à un champ magnétique pendant 1 min et une seconde

image est scannée. Le programme calcule l’IFB pour chaque puits, en se basant sur la

comparaison des 2 images, selon le logiciel BioFilm Control® Software.

Matériel et Méthodes

71

II.1.2 Formation des biofilms par coloration au cristal violet (CV)

L’étude cinétique de la formation du biofilm s’inspire de la technique décrite par

Stepanovic et al. (2000) et est basée sur la mesure colorimétrique de l’incorporation du CV

par les cellules sessiles. Les barrettes stériles Strip Well MSW002B en polystyrène, fournies

par BioFilm Control®, sont inoculées par 200 µL de la SBI préparée dans un milieu BHI. Un

contrôle négatif est réalisé par ajout dans les puits de 200 µL de BHI stérile. Les barrettes sont

recouvertes et incubées en chambre humide à 37°C. Différents temps d’incubation sont

étudiés (de 1 à 48 h). Le milieu de culture est ensuite aspiré et les puits sont lavés 3 fois à

l’aide de 200 µL d’eau distillée afin d’éliminer les cellules non adhérentes. Après séchage à

l’air pendant 45 min, les cellules adhérentes sont colorées par une solution de CV 0,1 %

(m/V) et le colorant est laissé en contact avec les puits pendant 45 min. Ensuite, l’excès de

colorant est éliminé et les puits sont lavés 3 fois à l’aide de 300 µL d’eau distillée. Le CV est

dissous à l’aide d’une solution d’acide acétique glacial à 33 % et l’absorbance de chaque puits

est lue à 540 nm (Synergy HT; Bio-Tek, Winooski, VT, USA). Les résultats sont exprimés en

ΔDO 540 nm (DO 540 nm échantillon – DO 540 nm contrôle).

II.1.3 Formation des biofilms par dénombrement

La formation du biofilm est réalisée dans les barrettes Strip Well MSW002B fournies

par BioFilm Control® par inoculation des puits avec 200 µL de la SBI. Un contrôle est réalisé

par ajout de milieu BHI stérile uniquement. Les barrettes sont ensuite incubées à 37 °C en

atmosphère humide pendant différents temps (de 10 à 60 min). Après incubation, le milieu est

aspiré et les puits sont rincés à l’aide d’un tampon phosphate de potassium 10 mM (pH 7,5) et

rendu isotonique par ajout de 0,9 % NaCl afin d’éliminer les cellules non attachées (Tré-

Hardy et al., 2008). Du milieu BHI frais est ajouté aux puits. Les barrettes sont scellées et

sonifiées à 25 °C pendant 5 min afin de mettre en suspension les cellules formant le biofilm.

Le dénombrement des bactéries est réalisé en prélevant des aliquots de ces suspensions

bactériennes et en les étalant sur des boîtes de Petri contenant un milieu Tryptic Soy Agar

(TSA) solide. Après incubation pendant 48 h à 32-34 °C, la lecture du nombre d’unité

formant colonie (ufc) est réalisée.

Figure 29 : Principaux rhamnolipides de P. aeruginosa

Matériel et Méthodes

72

II.2 MOTILITE DES SOUCHES

Deux types de motilité de la bactérie sont étudiés selon le protocole décrit par Wilhelm

et al. (2007) : la mobilité de type swimming (nage en milieu liquide) et swarming (essaimage

sur une surface). La motilité de P. aeruginosa est évaluée sur des boîtes d’agar Proteose

Peptone-Glucose-Ammonium Salts (PPGAS). Le contenu en agar varie en fonction de la

motilité étudiée : 0,5 % pour le swarming et 0,3 % pour le swimming. Les boîtes pour le

swarming contiennent 0,05 % de glutamate au lieu du chlorure d’ammonium. Pour l’étude du

swimming, 2 µL de la SBI préparée dans un bouillon Luria Bertani (LB) sont déposés en

surface de l’agar et incubés pendant 1 nuit (16 h) à température ambiante. Pour l’étude du

swarming, 2 µL de la SBI sont déposés en surface de l’agar et incubés pendant 1 nuit (16 h) à

30 °C. Le lendemain, le diamètre de motilité des souches est mesuré à l’aide du ChemDoc

XRS+ et le software Image Lab™ 3.0 (Bio Rad Laboratories, Nazareth, Belgique), et les

résultats sont exprimés en surface (mm²).

II.3 PRODUCTION DE RHAMNOLIPIDES

Principe

Les rhamnolipides contiennent 1 ou 2 molécules de rhamnose liées à 1 ou 2 molécules

d’acide β-hydroxyalcanoïque (principalement en C10). Parmi les méthodes d’analyse des

rhamnolipides, on retrouve les méthodes colorimétriques à l’anthrone, à l’acide phénol-

sulfurique et à l’orcinol. Ces méthodes impliquent l’extraction dans un solvant organique des

rhamnolipides de l’échantillon aqueux, suivie d’une hydrolyse acide pour séparer le rhamnose

(3-deoxy-hexose) de la portion lipidique de la molécule. Le sucre est ensuite quantifié par

spectrophotométrie après réaction avec l’anthrone, le phénol ou l’orcinol (Pinzon et Ju, 2009).

Nous avons réalisé un dosage à l’orcinol afin de quantifier les rhamnolipides dans le

surnageant du milieu de culture.

Protocole expérimental

La SBI est obtenue après 48 h d’incubation à 30 °C de quelques colonies suspendues

dans 20 mL de milieu PPGAS. Le milieu de culture est collecté et les rhamnolipides

quantifiés par le dosage du rhamnose (3-deoxy-hexose) dans le milieu de culture. Le sucre est

dosé par la méthode de coloration à l’orcinol en milieu acide (Wilhelm et al., 2007). Trois

Matériel et Méthodes

73

cent µL de surnageant sont prélevés et extraits 2 fois avec 600 µL de diéthyléther. Les 2

extraits sont rassemblés et évaporés à sec (Speedvac – Eppendorf Concentrator 5301). Le

résidu est dissous dans 100 µL d’eau distillée et mélangé à 100 µL d’orcinol 1,6 % et 800 µL

d’acide sulfurique 60 %. Après chauffage à 80 °C pendant 30 min, l’absorbance est lue à 421

nm. Les absorbances obtenues avec les échantillons sont comparées à une courbe standard

établie avec des concentrations croissantes en rhamnose et les résultats exprimés en

équivalents rhamnose (µg de rhamnose/mL de milieu de culture).

II.4 SENSIBILITE A UN ANTIBIOTIQUE

Les 8 souches de P. aeruginosa sont incubées pendant 24 h à 37 °C dans les puits

d’une microplaque (Nunc MicroWell Plates ; Nalge Nunc International Corp. Rochester, NY)

comme décrit précédemment (Moskowitz et al., 2004). Brièvement, les plaques sont couvertes

d’un couvercle présentant 96 pointes immergées dans les puits et sur lesquelles le biofilm se

développe. Après cette incubation, les pointes du couvercle sont lavées, le couvercle transféré

sur une nouvelle plaque et les pointes sont plongées dans les puits remplis d’un nouveau

milieu, en absence ou en présence de 4 mg/L de tobramycine. Les biofilms jeunes sont

exposés pendant 24 h au composé avant le dénombrement des bactéries afin de déterminer la

quantité d’ufc sur les pointes. Les résultats sont exprimés en diminution logarithmique du

nombre d’ufc/mL.

II.5 ACTIVITE PROTEOLYTIQUE

Principe

La méthode de détermination de l’activité protéolytique est une méthode

colorimétrique utilisant l’azocaséine comme substrat. Cette protéine est composée de caséine

(protéine du lait) et d’un groupement azo. Après contact du substrat avec les protéases,

l’azocaséine est clivée et libère le groupement azo (indicateur coloré). L’ajout d’acide

trichloroacétique (TCA) permet la précipitation de l’azocaséine non hydrolysée. L'absorbance

du groupement azo libéré par protéolyse est lue à 405 nm sur le surnageant et reflète l’activité

protéolytique (Perez Fabiel, 2009).

Matériel et Méthodes

74

Protocole expérimental

L’activité protéolytique des différentes souches de P. aeruginosa est évaluée selon le

protocole décrit par Nicodème et al. (2005). Les souches sont incubées pendant 48 h dans 10

mL de milieu Mineral Salt (MS) supplémenté en lait. Le mélange réactionnel contient 500 µL

de surnageant de culture bactérienne et 100 µL d’une solution d’azocaséine à 30 mg/mL. Un

contrôle négatif est réalisé en parallèle contenant uniquement du milieu MS et l’azocaséine.

Le mélange réactionnel est incubé à 37 °C pendant 3 h. A la fin de l’incubation, la réaction est

arrêtée par ajout de 100 µL de TCA 20 % (m/V) et les échantillons sont maintenus à

température ambiante pendant 10 min. Le mélange réactionnel est centrifugé à 6000 tpm

pendant 10 min. L’absorbance du surnageant est lue à 405 nm à l’aide de notre lecteur à

plaques.

II.6 ACTIVITE ELASTOLYTIQUE

Principe

L’élastine congo rouge (ECR) est un produit insoluble. L’activité enzymatique de

l’élastase permet le clivage du substrat ECR et la libération d’un produit soluble qui peut être

quantifié par mesure de l’absorbance. L’activité optimale de l’élastase est observée à une

température de 37 °C.

Figure 30 : Essai biorapporteur avec la souche A. tumefaciens NTL4(pZLR4)

(production des Cn≥6-HSL)

Adapté d’après Steindler et Venturi, 2007.

Figure 31 : Hydrolyse de X-Gal par la β-Galactosidase

traG traR lacZ

Matériel et Méthodes

75

Protocole expérimental

L’activité de l’élastase des différentes souches de P. aeruginosa est mesurée selon le

protocole décrit par Bosgelmez-Tinaz et Ulusoy (2008). Un petit volume (1,5 mL) de la SBI

est prélevé et centrifugé à 6000 tpm pendant 5 min. Cent µL du surnageant sont ajoutés à 900

µL de tampon ECR (100 mM TRIS-HCl ; 1 mM CaCl2 ; pH 7,5) contenant 20 mg de ECR. Le

mélange est incubé à 37 °C pendant 3 h sous agitation. L’ECR insoluble est éliminé par

centrifugation et la DO du surnageant est lue à 495 nm. Un contrôle négatif par ajout

uniquement de milieu LB est incorporé dans l’expérience.

II.7 PRODUCTION D’AHL

II.7.1 Production des Cn≥6-HSL

II.7.1.2 Etude sur boîte de Petri

Principe

La souche A. tumefaciens NTL4(pZLR4) conçue par Cha et al. (1998) est utilisée

comme souche biorapporteur pour détecter Cn≥6-HSL. Il s’agit d’une souche mutante de A.

tumefaciens dépourvue du plasmide Ti habituellement hébergé par A. tumefaciens et sur

lequel est localisé le gène codant pour TraR, homologue de LuxR et récepteur des HSL. Cette

souche est incapable de synthétiser des HSL car son gène traI a été inactivé. Par contre le

plasmide pZLR4 a été inséré dans la souche. Ce plasmide confère à la bactérie une résistance

à la gentamicine. D’autres gènes sur pZLR4 incluent la fusion traG::lacZ et traR. Le gène

traG a été muté (interrompu) par l’insertion d’un gène lacZ (codant pour la β-galactosidase).

Ce gène (traG::lacZ) requiert l’activateur de transcription TraR et une AHL pour son

expression. Des AHL exogènes peuvent dès lors induire l’expression du gène rapporteur

traG::lacZ et l’activité de la β-galactosidase peut être utilisée comme indicateur de la

présence d’AHL (Szenthe et Page, 2003). La β-galactosidase hydrolyse le dérivé 5-bromo-4-

chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) incolore introduit dans le milieu provoquant

la formation d’un halot d’une coloration bleue visible à l'oeil nu (précipité bleu du dérivé 5,5’-

dibromo-4,4’-dichloroindigo). TraR répond à différentes AHL avec un groupement acyle plus

long que 4 carbones (Cha et al., 1998).

Figure 32 : Hydrolyse de MUG par la β-Galactosidase

Matériel et Méthodes

76

Protocole expérimental

L’étude de la production des AHL par les différentes souches de P. aeruginosa est

réalisée selon le protocole détaillé de Szenthe et Page (2003). La souche biorapporteur A.

tumefaciens NTL4(pZLR4) est cultivée dans un milieu Agrobacterium (AB) contenant 30

mg/L de gentamicine, pendant une nuit à 28 °C et 150 tpm. Après incubation, la suspension

bactérienne est ajustée à une DO 600 nm finale de 0,240 ± 0,005. Dix mL de milieu AB

contenant 40 mg/L du dérivé X-Gal et 1,5 % d’agar sont coulés dans des boîtes de Petri

laissées au repos jusqu’à solidification. Cinq mL de la souche A. tumefaciens NTL4(pZLR4)

incubée une nuit sont ajoutés à 5 mL de milieu AB contenant 1,5 % d’agar. Le mélange est

homogénéisé prudemment (concentration finale en agar 0,75 %). Ce mélange est

immédiatement versé dans la boîte de Petri préalablement préparée et contenant le substrat X-

Gal. Lorsque la couche d’agar est solidifiée, 10 µL de la SBI des différentes cultures de P.

aeruginosa sont piquées dans l’agar. Les boîtes sont ensuite incubées à 28 °C pendant 48 h.

L’activité de la β-galactosidase est détectée par la formation d’un spot de couleur bleue. Ceci

indique une réaction positive avec hydrolyse du substrat X-Gal. La surface du spot est

mesurée par le ChemDoc XRS+ et le software Image Lab™ 3.0.

II.7.1.3 Etude sur microplaque

Principe

L’expérimentation repose sur un principe semblable au précédent. La souche A.

tumefaciens NTL4(pZLR4) permet la détection des AHL produites par P. aeruginosa par

mesure de l’activité de la β-galactosidase. L’activité de l’enzyme est évaluée par simple ajout

d’un substrat fluorogène : le 4-méthy-lumbelliféryl β-D-galactopyranoside (MUG).

L’hydrolyse du substrat par la β-galactosidase produit un dérivé fluorescent, le 4-

méthylumbelliférone (MU).

Protocole expérimental

La production de Cn≥6-HSL est quantifiée selon la technique décrite par Vidal-Aroca et

al. (2006) après extraction des HSL selon le protocole modifié de Nakagami et al. (2011). Les

HSL extraites et concentrées sont mises en présence de la souche biorapporteur A.

tumefaciens NTL4(pZLR4) et l’activité de la β-galactosidase induite par les HSL est dosée.

Les SBI de P. aeruginosa sont centrifugées et 700 µL de surnageant sont prélevés. Dans un

Matériel et Méthodes

77

tube Eppendorf, 700 µL d’acétate d’éthyle sont ajoutés aux 700 µL de surnageant. Les tubes

sont agités pendant 10 min. La phase supérieure est prélevée et une deuxième extraction est

effectuée. Les extraits sont alors réunis et 300 µL de la phase organique sont évaporés à l’aide

du Speedvac. Le résidu est mis en suspension dans 10 µL d’HCl 10 mM. Dans une plaque 96-

puits, 2 µL de chaque échantillon sont mis en présence de 100 µL d’une culture de A.

tumefaciens NTL4(pZLR4) dans du milieu AB pour la quantification des HSL. Un contrôle

est réalisé contenant uniquement la culture de A. tumefaciens NTL4(pZLR4). La plaque est

incubée 18 h à 28 °C. Après incubation, 20 µL de chaque culture sont transférés dans une

nouvelle plaque 96-puits contenant 80 µL de tampon Z (Na2HPO4.7H2O 0,06 M ;

NaH2PO4.H2O 0,04 M ; KCl 0,01 M ; MgSO4 0,001 M ; β-mercaptoéthanol 0,05M ; pH 7,0).

Vingt-cinq µL de 4-méthy-lumbelliféryl β-D-galactopyranoside (MUG) à 1 mg/mL dans du

diméthylsulfoxide (DMSO) sont ajoutés à chaque puits et la fluorescence générée par

l’hydrolyse de MUG (suite à l’action de la β-galactosidase) est quantifiée dans un fluorimètre

à microplaques. Une cinétique de l’augmentation de la fluorescence après ajout du MUG est

réalisée pendant 30 min (λ excitation = 360 nm, λ émission = 460 nm). Les résultats sont

exprimés en vitesse de l’augmentation de la fluorescence.

II.7.1.4 Etude par chromatographie sur couche mince (CCM)

Une CCM permettant de caractériser les Cn≥6-HSL produits par les différentes souches

est réalisée comme décrit par Shaw et al. (1997). La souche A. tumefaciens NTL4(pZLR4) est

cultivée à 28 °C dans un milieu AB minimal liquide contenant 0,4 % de mannitol. Cinq mL

des SBI de P. aeruginosa sont centrifugés et les surnageants extraits deux fois à l’aide de

volumes égaux en acétate d’éthyle HPLC-grade. Les extraits sont rassemblés, séchés sur du

sulfate de magnésium anhydre, filtrés et évaporés à sec sous un flux d’azote. Le résidu est

concentré dans 50 µL d’acétate d’éthyle HPLC-grade. Les AHL présents dans les extraits sont

séparés à l’aide d’une chromatographie sur couche mince C18 en phase inversée (CCM Gel de

silice 60 RP-18 F254S, 10 x 20 cm, Merck, Darmstadt, Germany) à l’aide d’une phase mobile

composée de méthanol/eau (60 : 40, V/V). Les extraits (4 μL) sont appliqués sur la plaque C18

en phase inversée. Des dépôts de standards sont également réalisés (4 µL) : 0,9 nmoles de C6-

HSL, 30 pmoles de C8-HSL, 60 pmoles de 3-oxo-C8-HSL, 300 pmoles de C10-HSL

(Cayman Bio-Connect, Huissen, Pays-Bas) (Shaw et al., 1997). Après migration, la plaque est

séchée à l’air libre. Elle est ensuite transférée dans une boîte en Plexiglas et couverte par la

Figure 33 : Essai biorapporteur avec la souche P. aeruginosa CGMCC 1.860

(production des C4-HSL)

D’après Yong et Zhong, 2009.

Matériel et Méthodes

78

souche biorapporteur préparée dans un milieu AB maintenu à 45 °C contenant 0,4 % de

mannitol, 0,7 % d’agar et 60 mg/L X-Gal. Le mélange d’agar et de la souche biorapporteur

(150 mL) forme une fine pellicule (environ 3 mm) recouvrant la plaque de silice. Après

solidification, la boîte est incubée pendant 48 h à 28 °C. Durant cette incubation, des taches

bleues se développent aux endroits de migration des AHL. Une image digitale de la plaque est

analysée par le ChemDoc XRS+ et le software Image Lab™ 3.0. Les résultats sont représentés

par mesure du Rf pour chaque tache.

II.7.2 Production des C4-HSL

Principe

La production des C4-HSL par les différentes souches de P. aeruginosa est évaluée à

l’aide d’une souche biorapporteur dérivée de la souche P. aeruginosa CGMCC 1.860. Cette

souche a été isolée à partir de déchets de caoutchouc. Elle est capable de dégrader des dérivés

du benzène. En réponse à C4-HSL, elle produit un pigment bleu-vert. La production de C4-

HSL par cette souche est supprimée par introduction d’un plasmide suicide pYC2000∆rhlIR

et donc par délétion d’un fragment du gène rhlIR (rhlI-rhlR

-). Par ailleurs, le récepteur des C4-

HSL, RhlR, est surexprimé par insertion d’un plasmide multi-copies pYC-rhlR au niveau de

∆rhlIR. Ces modifications permettent donc d’obtenir la souche P. aeruginosa CGMCC 1.860

∆rhlIR / pYC-rhlR (rhlI-rhlR

++), une souche qui, en présence de C4-HSL, exprime les gènes

codant pour les enzymes participant à la voie de synthèse d’un pigment bleu-vert dont la

production peut être mesurée par lecture de l’absorbance (Yong et Zhong, 2009).

Protocole expérimental

Préparation des extraits

Les extraits de C4-HSL sont préparés à partir de 5 mL de surnageant des SBI des 8

souches (centrifugation à 3000 tpm pendant 10 min). Les surnageants sont alors extraits 3 fois

avec 5 mL d’acétate d’éthyle. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur du sulfate

de magnésium anhydre, filtrées et évaporées à sec. Les résidus sont dissous dans 1 mL

d’acétonitrile HPLC-grade et le résidu est conservé à -80 °C jusqu’à la réalisation de l’essai

biorapporteur.

Tableau 2 : Amorces utilisées pour séquencer lasI, lasR, rhlI et rhlR

Nom du

gène et n°

GenBank

Séquence amorce (5’-3’) Position dans le

génome

Taille

du gène

lasI Sens : ATGATCGTACAAATTGGTCGGC 1559254-1559275 607 bp

PA1432 Antisens : GTCATGAAACCGCCAGTCG 1559842-1559860

lasR Sens : ATGGCCTTGGTTGACGGTT 1558171-1558189 726 bp

PA1430 Antisens : GCAAGATCAGAGAGTAATAAGACCCA 1558871-1558896

rhlI Sens : ACGGCTGACGACCTCACAC 3889126-3889144 626 bp

PA3476 Antisens : CTTGGTCATGATCGAATTGCTC 3889730-3889751

rhlR Sens : GCTTCAGATGAGACCCAGC 3889922-3889940 731 bp

PA3477 Antisens : CAATGAGGAATGACGGAGGC 3890633-3890652

Matériel et Méthodes

79

Essai biorapporteur

Dix µL de nos échantillons sont pipetés dans le fond d’un tube (10 μL d’acétonitrile

HPLC-grade sont utilisés comme contrôle négatif). Après élimination du solvant par

évaporation, 1 mL de la souche biorapporteur incubée une nuit (DO 600 nm de 0,050 ± 0,005

dans un milieu Pseudomonas Broth (PB) avec ampicilline (100 mg/L) et tétracycline (250

mg/L)) est ajouté au tube test. Après mélange des tubes, ceux-ci sont incubés sous agitation à

30 °C pendant 24 h. Le surnageant (centrifugation à 3000 tpm pendant 10 min) est extrait 2

fois avec 0,5 mL de chloroforme. Les deux extraits de chloroforme sont rassemblés, évaporés

sous flux d’air et dissous dans 500 µL de méthanol. Cent cinquante µL de cette solution sont

transférés dans les puits d’une microplaque UV star (Greiner Bio-One, Wemmel, Begium) et

l’absorbance est mesurée à 299 nm avec un lecteur à plaques. Une courbe dose-réponse de C4-

HSL est réalisée en parallèle par utilisation de dilutions d’un standard préparées dans de

l’acétonitrile HPLC-grade.

II.7.3 Détection et séquençage de 4 gènes du QS

L’ADN génomique est libéré avec un tampon de lyse et extrait à l’aide du GenElute

bacterial genomic DNA kit (Sigma, St Louis, MO) selon les instructions du fournisseur. Pour

déterminer la séquence de lasI, lasR, rhlI et rhlR, les 4 gènes sont amplifiés par utilisation des

oligonucléotides décrits par Schaber et al. (2004). Le protocole suivant est utilisé pour la

PCR : dénaturation à 94 °C pendant 30 sec, fixation des amorces à 50 °C (lasI et lasR) et à 55

°C (rhlI et rhlR) pendant 30 sec et élongation à 72 °C pendant 120 sec. Trente-quatre cycles

sont réalisés. Les produits de la PCR sont examinés par électrophorèse sur un gel d’agarose à

2 %. Après coloration de l’ADN à l’aide de GelRed, l’ADN est visualisé avec la lampe UV

d’un appareil ChemiDoc XRS+. La taille des fragments amplifiés est estimée par comparaison

avec l’échelle du standard GeneRuler 100-bp plus DNA. L’expérience est réalisée 3 fois. Les

produits obtenus après la PCR sont nettoyés par utilisation de la trousse DNA Clean-

Concentrator-5 kit (ZymoResearch, Bruxelles, Belgique) et séquencés par le laboratoire

Eurofins DNA (Ebersberg, Germany). La comparaison des 4 gènes avec les génomes publiés

de différents P. aeruginosa est réalisée par une recherche blast multigénique dans une

bibliothèque de souches de référence. La souche de référence avec le meilleur score pour la

souche étudiée est utilisée comme référence pour cette souche et chaque gène est comparé

avec la séquence trouvée dans le génome de la souche de référence sélectionnée. L’analyse est

Figure 34 : Cellule capillaire

D’après Zetasizer Nano Series, 2004.

Matériel et Méthodes

80

réalisée par utilisation des séquences obtenues avec les 2 amorces (sens et antisens). La

comparaison entre les séquences de la protéine de la souche de référence et de la souche testée

est réalisée par utilisation du logiciel SIM alignment tool (ExPASy, Switzerland).

II.8 POTENTIEL ZETA

Principe

Le principe de la mesure du potentiel zêta des bactéries est basé sur la dispersion

électrophorétique de la lumière. La suspension bactérienne est placée à l’intérieur d’une

cellule capillaire. Un laser est utilisé pour fournir une source de lumière aux particules au sein

de l’échantillon. La lumière incidente passe à travers le centre de la cellule contenant

l’échantillon et la lumière diffusée est détectée à un angle de 17°. La mobilité

électrophorétique des particules est évaluée par la mesure de la fluctuation de l’intensité de la

lumière diffusée. En effet, lorsqu’un champ électrique est appliqué à travers la cellule, les

particules au sein de la suspension vont migrer vers l’électrode de charge opposée avec une

vitesse proportionnelle à l’intensité de leur potentiel zêta. Les particules en mouvement vont

induire une fluctuation de la lumière détectée avec une fréquence dépendante de la vitesse de

la particule. Le détecteur envoie les informations au processeur de signal digital. Cette

information est ensuite traitée par un ordinateur où le logiciel Zetasizer Nano réalise un

spectre des fréquences à partir duquel la mobilité électrophorétique, et donc le potentiel zêta,

est calculé.

Protocole expérimental

Les mesures du potentiel zêta sont réalisées à 25 °C sur un instrument Malvern

Nanosizer ZS (Malvern, Worcestershire, UK). La DO des SBI est ajustée à l’aide d’un

tampon phosphate 10 mM (pH 7,0). La suspension bactérienne est ensuite transférée dans une

cellule capillaire destinée à la mesure du potentiel zêta (Zetasizer Nano Series, Malvern) et

maintenue à 25 °C. La sélection du voltage et de la durée de la mesure est effectuée

automatiquement par la machine. La qualité de la mesure est évaluée en examinant la courbe

représentant la variation de phase au cours du temps. Les mesures sont réalisées trois fois

avec deux dilutions de chaque souche. Trois lots différents de chaque souche sont étudiés.

Matériel et Méthodes

81

II.9 ETUDE SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES

II.9.1 Détermination de la CMI et de la CMB

La détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est effectuée dans des

microplaques par la technique de microdilution de 2 en 2 en bouillon Mueller Hinton Broth

ajusté en ions Ca2+

et Mg2+

(CAMHB), conformément au protocole du CLSI (Clinical and

Laboratory Standards Institute, 2003). Les puits contiennent 100 µL de chaque concentration

de produit à tester par dilution de 2 en 2 à partir du puits initial. Les puits de la microplaque

sont inoculés par 100 µL de la SBI. Deux puits contenant le bouillon de culture sont inclus

dans le test. L’un des puits est inoculé avec le microorganisme testé (témoin positif) et l’autre

contient uniquement 200 µL de CAMHB et sert de témoin négatif afin de valider la stérilité

du milieu. Les résultats sont lus, après une incubation de la microplaque à l’étuve à 35 °C

pendant 24 h, par observation visuelle de l’absence de turbidité en comparaison avec le

contrôle négatif. Afin de déterminer la concentration minimale bactéricide (CMB), les puits

clairs de cette même microplaque sont repiqués à l’aide d’anses stériles de 10 µL, ensuite

étalés sur milieu MH solide et incubés 24 h à 35 °C avant la lecture des résultats.

II.9.2 Essai de viabilité par perméabilisation au 1-N-phénylnaphtylamine

(NPN)

Principe

La molécule de NPN émet une fluorescence importante lorsqu’elle passe d’un

environnement polaire, par exemple le milieu de culture, vers un compartiment hydrophobe,

par exemple la membrane externe de la bactérie. La mesure d’une augmentation de la

fluorescence reflète ainsi la perturbation de la membrane liée à l’insertion du composé dans la

membrane.

Protocole expérimental

L’étude de la perméabilisation membranaire de P. aeruginosa au NPN est basée sur

une technique décrite précédemment (Loh et al., 1984) et est étudiée sur les souches ATCC

PAO1, MC093-450507 et PYO1. Les SBI sont centrifugées à 3000 tpm pendant 10 min et les

Matériel et Méthodes

82

cellules sont suspendues dans un tampon HEPES 5 mM (pH 7,35) contenant 10 mM d’azide

de sodium afin d’atteindre une DO 600 nm de 0,5. Cette nouvelle suspension cellulaire est

laissée au repos pendant 30 à 60 min à température ambiante avant l’ajout des réactifs. Une

solution stock de NPN est préparée par solubilisation du réactif dans de l’acétone. Une

microplaque à fond noir (96F Nunclon Delta Black Microwell SI) est inoculée avec la

suspension de cellules et le NPN est ajouté à une concentration finale de 10 µM. Différentes

concentrations de CSA-13 sont ajoutées aux puits et l’augmentation de l’intensité de la

fluorescence émise par le NPN est suivie pendant 10 min à 30 °C. Les échantillons sont

soumis à une lumière d’excitation dont la longueur d’onde est de 310 nm et la lumière émise

est lue à une longueur d’onde de 460 nm à des intervalles de temps de 15 sec. A la fin de la

mesure, une solution de Triton X-100 à 1 % (V/V) est ajoutée afin d’estimer l’insertion

maximale du NPN dans la membrane bactérienne et les résultats sont calculés en prenant cette

valeur comme référence. Les résultats sont exprimés comme variation de la fluorescence ±

SEM après 10 min d’exposition au CSA-13. Les résultats sont ajustés à l’aide de l’équation

d’une hyperbole à une composante.

II.9.3 Interaction du CSA-119 avec P. aeruginosa

L’interaction membranaire du CSA-13 avec les différentes souches de P. aeruginosa

est étudiée à l’aide du CSA-119, un analogue fluorescent du CSA-13 ou le dérivé dansyl-

CSA-13. Les spectres d’émission et d’excitation du CSA-119 dans un tampon phosphate salin

(PBS) sont enregistrés à l’aide d’un fluorimètre (Photon Technology International,

Birmingham, NJ, Etats-Unis). Un spectre d’émission de la molécule en présence et en absence

de la souche de référence ATCC PAO1 est également réalisé afin de mettre en évidence la

spécificité de l’interaction. L’étude de la sensibilité des 8 souches au CSA-119 est effectuée

par mesure de l’augmentation de la fluorescence liée à l’interaction du CSA-119 avec la

membrane bactérienne. Deux cents µL de la SBI dans un tampon PBS sont transférés dans les

puits d’une plaque 96-puits. La lumière émise à 495 nm après excitation des puits à 345 nm

est mesurée toutes les 40 sec à l’aide de notre lecteur de microplaques. Trois min après le

début de l’essai, 1 à 5 µL de CSA-119 (concentrations finales 1 ; 2 ; 5 et 6 mg/L) sont ajoutés

aux puits et la fluorescence est lue pendant 15 min. La microplaque est agitée avant chaque

mesure. La photodégradation du fluorophore au cours du dosage est estimée à l’aide de puits

Matériel et Méthodes

83

contrôles (puits contenant uniquement la sonde fluorescente et du tampon PBS sans

bactéries).

II.9.4 Essai de viabilité par dénombrement

Cent µL de la SBI de la souche ATCC PAO1 sont déposés dans les puits d’une

microplaque. A chaque puits, 100 µL du produit à tester (CSA-13, association CSA-13/acide

pluronique 5% ou LL-37) sont ajoutés afin d’atteindre un volume final de 200 µL/puits. Un

contrôle négatif, contenant uniquement du milieu de culture, ainsi qu’un contrôle positif,

contenant la suspension bactérienne sans le produit à tester, sont inclus dans l’essai. La plaque

est incubée à 37 °C pendant 3 et 24 h (CSA-13, association CSA-13/acide pluronique 5 %) ou

1 h (LL-37). Un dénombrement bactérien est ensuite réalisé : 10 µL de chaque puits sont

prélevés et dilués. Chaque dilution est étalée sur gélose TSA et incubée pendant 48 h à 32-34

°C. Les colonies sont comptées et les résultats exprimés en ufc/mL.

II.9.5 Essai de viabilité par perméabilisation à l’iodure de propidium (IP)

Principe

L’IP est un agent fluorescent imperméable aux membranes et donc exclu des cellules

vivantes. Le fluorophore est utilisé pour détecter les cellules mortes. Il s’intercale dans les

deux brins de l’ADN et de l’ARN des cellules mortes. Lorsqu’il est lié aux acides nucléiques

sa fluorescence augmente de 20 à 30 fois.

Protocole expérimental

Différentes concentrations des produits à tester (CSA-13, association CSA-13/acide

pluronique ou peptides) sont ajoutées aux puits d’une microplaque à fond noir. On ajoute dans

chaque puits 100 µL de la SBI contenant l’IP (concentration finale 10 µM) afin d’atteindre un

volume final de 200 µL par puits (milieu de culture pour l’étude du CSA-13 et de l’acide

pluronique F-127 : tampon de phosphate de potassium 1 mM pH 7 ; milieu de culture pour

l’étude des peptides : BBM complémenté de 0,5 % de casaminoacides). L’intensité de la

fluorescence est lue pendant 1 h à l’aide d’un lecteur à microplaque à des longueurs d’onde

d’excitation et d’émission de 540 nm et 590 nm.

Figure 35 : Etude de l’effet du CSA-13 sur la formation d’un biofilm par la

technique de coloration au CV

D’après Stepanovic et al., 2000.

Matériel et Méthodes

84

II.10 ETUDE SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM

La formation du biofilm est réalisée selon la méthode décrite par Stepanovic et al.

(2000) par la technique de coloration au CV.

CSA-13 : Les puits d’une microplaque sont inoculés par 200 µL de la SBI (milieu

BHI), en présence ou en absence de 20 µL de CSA-13 à une concentration finale de 1 mg/L,

et incubés à 37 °C dans une atmosphère humide pendant 24 et 48 h.

Peptides : Les puits d’une microplaque sont inoculés par 90 µL de la SBI (milieu BM2

contenant 0,5 % de casaminoacides). Dix µL des peptides, à différentes concentrations, sont

ajoutés aux bactéries. La microplaque est incubée à 37 °C dans une atmosphère humide

pendant 18 h.

Un contrôle positif (suspension bactérienne sans le produit à tester) et négatif

(uniquement le milieu de culture) sont inclus dans l’expérience. L’évaluation de la formation

de biofilm est réalisée par mesure colorimétrique de l’incorporation du CV par les cellules

ayant adhéré aux puits et de la coloration des autres composants de la matrice. Le milieu des

puits est aspiré et les puits sont lavés 3 fois à l’aide de 200 µL d’eau distillée. Après séchage

des puits pendant 45 min à l’air libre, 200 µL d’une solution à 0,1 % (m/V) de CV sont

ajoutés. Le colorant est laissé pendant 45 min en contact avec les puits avant d’être aspiré. Les

puits sont rincés 3 fois à l’aide de 300 µL d’eau distillée, ensuite le colorant est dissous à

l’aide d’une solution d’acide acétique à 33 %. L’absorbance de chaque puits est lue à 540 nm

à l’aide de notre lecteur de microplaques. Les résultats sont exprimés en ΔDO 540 nm (DO 540 nm

échantillon – DO 540 nm contrôle).

II.11 ETUDE SUR UN BIOFILM PREFORME

II.11.1 Etude par dénombrement sur un biofilm préformé

II.11.1.1 Formation in vitro du biofilm

La formation des biofilms est réalisée selon la technique décrite par Tré-Hardy et al.

(2008). Les puits d’une microplaque Nunc Micro Wells Plates®

(Nunc MicroWell Plates;

Nalge Nunc International Corp. Rochester, NY) sont ensemencés par 100 µL de la SBI

Figure 36 : Formation d’un biofilm sur les pointes d’un couvercle d’une

microplaque

Matériel et Méthodes

85

préparée dans un milieu CAMHB. Un témoin négatif, contenant uniquement du milieu de

culture CAMHB sans ajout de germes, est réalisé de manière à valider la stérilité du milieu.

La microplaque est ensuite recouverte d’un couvercle contenant 96 pointes (Nunc TSP,

Transferable Solid Phase Screening System; Nalge Nunc International) sur lesquelles le

biofilm peut se former. La microplaque contenant l’inoculum et munie de son couvercle est

incubée sous agitation orbitale à 37 °C pendant 24 h à 30 tpm (Unitron; Infors AG,

Bottmingen, Switzerland). Le biofilm formé (biofilm jeune de 24 h) est ensuite exposé aux

agents antibactériens.

La formation de biofilm de 12 jours est étudiée selon un principe identique. Après 24 h

d’incubation, une nouvelle microplaque contenant uniquement 100 µL de milieu CAMHB

dans chaque puits est préparée afin de servir de nouveau milieu pour la formation du biofilm.

Le couvercle de la plaque précédente, sur lequel le biofilm s’est développé, est alors transféré

sur cette nouvelle plaque et incubé sous agitation orbitale à 37 °C pendant 24 h. L’opération

de mise en contact des pointes avec un nouveau milieu est répétée quotidiennement sur une

durée de 12 jours. Après 12 jours de formation, le biofilm qui est « mûr » est exposé aux

agents antibactériens.

II.11.1.2 Effet du CSA-13, seul ou en combinaison avec la tobramycine à 4 mg/L,

sur un biofilm jeune et mature

Après formation d’un biofilm jeune de 24 h, le couvercle de la plaque multipuits est

retiré et les pointes sont immergées dans une nouvelle microplaque contenant différentes

concentrations de CSA-13 seul ou en association avec de la tobramycine à 4 mg/L. Après 24 h

d’incubation à 37 °C, l’activité des agents antibactériens est déterminée.

Après formation d’un biofilm mature de 12 jours, le couvercle de la plaque multipuits

est retiré et les pointes sont immergées 2 fois par jour dans une nouvelle microplaque

contenant différentes concentrations de CSA-13 seul ou en association avec de la tobramycine

à 4 mg/L. L’effet des agents antibactériens est évalué après 1 (administration unique), 2 et 9

jours. L’effet antibactérien est étudié sur 8 souches pour les biofilms jeunes (ATCC PAO1,

ATCC 9027, ATCC 15442, PYO1, PYO2, MC75-450457, MC093-450507, MC099-450467),

Matériel et Méthodes

86

et sur 6 souches pour les biofilms matures (ATCC PAO1, PYO1, PYO2, MC75-450457,

MC093-450507, MC099-450467).

L’activité des agents antibactériens est évaluée par un dénombrement des germes (Tré-

Hardy et al., 2008). Les pointes sont rincées à l’aide d’un tampon phosphate de potassium 10

mM (pH 7,5) isotonique afin d’éliminer les cellules non fixées au biofilm. Après rinçage, le

biofilm est mis en contact avec un nouveau milieu CAMHB. La microplaque est placée dans

un bain à ultrasons à 25 °C pendant 5 min dans le but de décrocher les bactéries présentes au

niveau du biofilm. Un dénombrement des bactéries persistantes, avant et après traitement, est

réalisé. Des aliquots sont prélevés, dilués, et répartis dans des boîtes de Petri. Une gélose TSA

fraîchement préparée est coulée dans les boîtes et, après solidification, celles-ci sont incubées

à 32-34 °C pendant 48 h. La diminution logarithmique en ufc des biofilms traités est calculée

par la formule suivante : diminution logarithmique = log(ufccontrôle positif)−log(ufcx), où x

correspond à la concentration testée de l’agent antimicrobien seul ou en combinaison.

Les courbes dose-réponse du CSA-13 sont ajustées à l’équation : variation des log(ufc)

= variation maximale des log(ufc) * [CSA-13]/ (KD + [CSA-13]) par ajustement de deux

paramètres (variation maximale des ufc/mL et KD) avec une contrainte (diminution maximale

inférieure à 7). La qualité de l’ajustement est évaluée par mesure du coefficient de

détermination (r2) qui est une estimation de la qualité de l’ajustement.

II.11.2 Etude par MCBL sur un biofilm préformé

II.11.2.1 Expression de la GFP

Pour visualiser les souches cliniques de P. aeruginosa à l’aide de la MCBL, un

plasmide (pMF230) exprimant de manière constitutive la GFP est introduit dans chaque

souche de P. aeruginosa par croisement triparental. Le plasmide pMF230 contient le gène

GFPmut2 (Cormack et al., 1996) et un marqueur de résistance à la carbénicilline.

L’appariement triparental est une forme de conjugaison bactérienne où un plasmide conjugatif

présent dans une souche bactérienne aide à transférer un plasmide mobilisable présent dans

une deuxième souche bactérienne vers une troisième.

Matériel et Méthodes

87

Dans notre cas, la conjugaison triparentale fait intervenir les 3 souches bactériennes suivantes:

- une souche receveuse de P. aeruginosa (souche clinique) dans laquelle on souhaite

introduire le plasmide mobilisable (pMF230),

- une souche donneuse de E. coli portant le plasmide mobilisable pMF230 et qui peut

utiliser les fonctions de transfert du plasmide conjugatif (Nivens et al., 2001),

- une souche mobilisatrice de E. coli (helper strain) portant le plasmide conjugatif

pRK2013 codant pour les gènes requis dans la conjugaison et le transfert de l’ADN

(Figurski et Helinski, 1979).

Les cultures bactériennes de E. coli pMF230 et E. coli pRK2013 sont obtenues après

une nuit d’incubation à 37 °C sous agitation dans un milieu LB contenant 300 mg/L de

kanamycine. Deux cent cinquante µL d’une culture bactérienne de la souche clinique de P.

aeruginosa incubée une nuit sont ajoutés dans 25 mL de Tryptic Soy Broth (TSB) et cultivés

pendant 5 h à 42 °C et 150 tpm. Après incubation, une strie de cette suspension bactérienne

est ensemencée sur une boîte de gélose LB. La souche clinique est mise en contact avec une

strie d’une culture bactérienne de E. coli comprenant le plasmide pMF230 et une strie d’une

culture bactérienne de E. coli comprenant le plasmide pRK2013. Les 3 stries se croisent en un

même point sur la gélose. Après une nuit d’incubation de la gélose à 37 °C, quelques colonies

au niveau du croisement des 3 stries sont prélevées et incubées sur une gélose Pseudomonas

agar contenant 150 mg/L de carbénicilline afin de sélectionner les clones de P. aeruginosa

contenant le plasmide pMF230.

II.11.2.2 Etude sur un biofilm préformé dans une microplaque

Les biofilms sont formés dans une plaque 96-puits en polystyrène avec une base

µclear (Greiner Bio-One, France).

CSA-13 : Deux cent cinquante µL de la SBI préparée dans un bouillon TSB sont

ajoutés dans les puits de la microplaque et incubés à 37 ºC et 30 tpm. Après 1 h d’adhésion, le

milieu est renouvelé afin d’éliminer les cellules non adhérentes. Après 24 h de formation du

biofilm, les puits sont rincés et exposés à différentes concentrations de CSA-13 (0, 20, 50 et

100 mg/L) pendant 1 h. Les puits sont ensuite rincés et marqués par 200 µL du kit de

coloration BacLight™ Live/Dead®

(concentration finale en Syto9 et en IP : 30 µM et 120 µM

respectivement) pendant 25 min.

Matériel et Méthodes

88

Peptides : L’effet de 6 peptides (LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31, LL7-31, LL-19) sur

les biofilms préformés par 6 souches de P. aeruginosa (les souches ATCC PAO1, MC099-

450467, MC093-450507, PYO1, PYO2 et MC75-450457) est également étudié par MCBL.

Dans cette expérimentation, les bactéries utilisées expriment la GFP et sont mises en culture

dans un milieu TSB contenant 150 mg/L de carbénicilline pour maintenir le plasmide

pMF230. La SBI est obtenue par dilution de la suspension bactérienne dans un milieu BBM

supplémenté de casaminoacides 0,5 % (m/V). Deux cent cinquante µL de la SBI sont ajoutés

dans les puits de la microplaque et incubés à 37 ºC et 30 tpm. Après 1 h d’adhésion, le milieu

est renouvelé afin d’éliminer les cellules non adhérentes. Après 24 h de formation du biofilm,

les puits sont rincés et traités par différentes concentrations des peptides (0, 20, 50 ou 100

µM) en présence de 10 µM d’IP, pendant 25 min.

Les biofilms sont rincés et observés par MCBL à l’aide d’un Leica SP5 (Leica

Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL). Les biofilms sont scannés à une fréquence de 600 Hz

à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau (63 X/ouverture numérique 1,2). Un faisceau de

laser à Argon à 488 nm et un faisceau laser à diode 561 nm sont utilisés pour l’excitation. La

fluorescence émise est collectée entre 500 nm et 550 nm et entre 570 et 700 nm. Les séries

d’images collectées à l’aide du MCBL sont analysées par le logiciel Imaris software

(Bitplane, Zurich, Switzerland).

De plus, une étude cinétique de l’effet du CSA-13 sur un biofilm préformé dans une

microplaque est réalisée sur la souche ATCC PAO1 exprimant la GFP. Après 24 h de

formation du biofilm, 100 µL d’une solution de CSA-13 (concentration finale 100 mg/L) sont

ajoutés aux puits en présence d’IP (concentration finale 60 µM). Des séries d’images sont

scannées pendant 30 min à intervalle de 5 min à l’aide du microscope confocal. Un contrôle

est réalisé sans ajout de CSA-13.

II.11.2.3 Etude sur un un biofilm préformé dans un réacteur CDC

Principe

Les réacteurs CDC (Biosurface Technologies Inc., Bozeman, MT) sont développés par

le Center for Disease Control and Prevention et acceptés comme méthode standard par The

American Society for Testing and Materials afin de développer de manière reproductible des

Figure 37 : Réacteur CDC

A B C

Figures A et B : Photographies du montage du réacteur CDC. Le bidon contenant le milieu

nutritif stérile est relié au bécher par un tube en silicone. Une pompe péristaltique permet

l’apport du milieu à un flux constant. Un agitateur magnétique entraîne l’application de forces

de frottement à la surface du biofilm formé sur les coupons en verre. L’excès de milieu est

déversé via la goulotte dans le bidon de vidange. Figure C : Représentation schématique d’un

réacteur CDC. Les biofilms se développent à la surface interne des coupons exposés aux

forces de frottement du milieu par agitation magnétique (Williams et al., 2011).

Matériel et Méthodes

89

biofilms de P. aeruginosa (ASTM, 2012). Il s’agit d’une méthode utilisée en routine pour

étudier la formation de biofilms exposés aux frottements et à un apport continu de milieu,

pouvant être adaptée à l’étude de différents microorganismes (Goeres et al., 2005). Les

réacteurs comportent 8 porteurs de coupons en polypropylène suspendus à partir d’un

couvercle. Les supports en polypropylène sont capables de porter 3 coupons chacun d’un

diamètre de 0,9 cm sur lequel le biofilm peut se développer. Le couvercle avec les détenteurs

de coupons est monté dans un récipient en verre d’une capacité de 1 L et muni d’une goulotte

de vidange de façon à ce que le volume final du contenant soit maintenu à environ 350 mL.

Le milieu de culture stérile, maintenu dans un récipient de 20 L, est apporté par un tube en

silicone vers le bécher à l’aide d’une pompe péristaltique. La rotation d’une palette dans le

bécher, par agitation magnétique, permet le mélange constant du milieu et l’application d’une

force de frottement uniforme à la surface du coupon. Le biofilm se développe sur la face

intérieure du coupon exposée aux forces de frottement. L’excès de milieu est déversé par la

goulotte dans un bidon de vidange.

Protocole expérimental

Quelques colonies isolées sont prélevées d’une culture solide et incorporées dans 100

mL de milieu TSB dilué 100 fois (300 mg/L). Pour les souches exprimant la GFP ou la RFP,

150 mg/L de carbénicilline sont ajoutés. La culture est incubée une nuit à 37 ºC et 120 tpm.

Le lendemain, 1 mL de la culture est prélevé et transvasé stérilement dans le réacteur

contenant 500 mL de milieu TSB (300 mg/L) et 150 mg/L de carbénicilline pour les souches

GFP ou RFP. Le réacteur est incubé pendant 24 h à température ambiante et à 120 tpm. Après

24 h, le bidon contenant 20 L de milieu TSB à une concentration finale de 100 mg /L est relié

au réacteur afin de permettre l’apport en débit continu des nutriments. La pompe est

enclenchée pour atteindre un taux de flux de 12 mL/min. Le réacteur est également connecté à

un bidon de vidange permettant d’éviter le débordement et ainsi de maintenir dans le réacteur

un volume constant de 350 mL de bouillon. Après 24 h de formation du biofilm, les coupons

de verre sont soigneusement détachés de leur support et traités.

Biofilm ATCC PAO1-GFP : Les biofilms formés sur la face interne du coupon sont

rincés à l’aide d’eau distillée et exposés à 100 µL du produit à tester (CSA-13 ou

peptides) et 100 µL d’IP (concentration finale 60 µM) pendant 25 min.

Biofilm ATCC 15442 : Les biofilms sont exposés à 100 µL du produit à tester (CSA-

13 ou peptides) pendant 25 min. A la fin du traitement, les coupons sont rincés et

Matériel et Méthodes

90

marqués par 100 µL du kit de coloration BacLight™ Live/Dead®

(concentration finale

en Syto9 et IP : 15 µM et 60 µM respectivement) pendant 25 min.

Biofilm ATCC PAO1-RFP : Les biofilms sont exposés pendant 25 min à 150 µL d’un

analogue fluorescent du CSA-13, le CSA-13 marqué avec 1 % de Bodipy.

Après traitement, les coupons sont rincés et observés à l’aide d’un objectif à immersion dans

l’eau (63x/ouverture numérique 0,9).

II.12 TOXICITE SUR CELLULES EUCARYOTES (HUVEC)

II.12.1 Evaluation de la libération de la lactate déshydrogénase (LDH)

Principe

La LDH est une enzyme cytoplasmique d’environ 135 kDa qui catalyse l’oxydation du

lactate en pyruvate. La réaction s’accompagne de la réduction du NAD+ (accepteur

d’électrons) en NADH et est réversible. L’enzyme intracellulaire est présente dans

pratiquement toutes les cellules eucaryotes. Le pH optimal de la réaction d’oxydation du

lactate en pyruvate est de 8,8 à 9,8 ; celui de la réaction inverse est de 7,4 à 7,8. La

température optimale est comprise entre 30 et 37 °C.

La cytotoxicité d’une molécule peut être évaluée par dosage de l'activité enzymatique

de la LDH dans le surnageant cellulaire d'une suspension de cellules exposées à la molécule.

La présence de la LDH dans le milieu extracellulaire témoigne de la destruction des

membranes plasmiques et donc d’une perturbation de l’intégrité cellulaire. L’essai de la

libération de la LDH s’inspire de la méthode développée par la Scandinavian Society for

Clinical Chemistry and Clinical Physiology (1974). L'activité enzymatique est mesurée par

suivi de la cinétique d’absorbance à 340 nm, pH 7,4 et 30 °C, après ajout dans le milieu

extracellulaire de NADH et de pyruvate. Dans ces conditions l’enzyme réduit le pyruvate en

lactate et la réaction est accompagnée de l’oxydation du NADH en NAD+. Une diminution

d'absorbance au cours du temps indique la consommation de NADH (le NADH absorbe la

lumière à 340 nm) et donc une souffrance cellulaire.

Matériel et Méthodes

91

Protocole expérimental

Les cellules Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) sont cultivées dans

des flasques T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de CO2. Les cellules sont

détachées par 10 % de trypsine-EDTA et incubées dans une plaque 96-puits à une

concentration de 1.106 cellules/mL en présence de 100 µL de milieu Endothelial

Growth Medium (EGM) pendant minimum 12 h. Le lendemain, le milieu est aspiré et 90 µL

de milieu E-Total (NaCl 147 mM ; KCl 2 mM ; HEPES 10 mM ; glucose 12 mM ; MgCl2 1

mM ; CaCl2 2 mM ; pH 7,4) sont ajoutés aux puits. Dix µL de différentes concentrations du

produit à tester (CSA-13, association CSA-13/acide pluronique 3 % ou peptides) sont ajoutés

aux puits. Après 10 min d’incubation à 37 °C, la plaque est centrifugée pendant 10 min à

1200 tpm et 30 µL de surnageant sont collectés et transférés dans une nouvelle microplaque.

Le contenu en LDH du surnageant est dosé selon Métioui et al. (1994). Une solution de

NADH (TRIS 56 mM ; EGTA 5,6 mM ; β-NADH 170 µM) est ajoutée aux puits de la

seconde plaque. Juste avant le début du dosage, une solution de pyruvate à 1,22 mM

(concentration finale) est ajoutée aux puits. L’activité de la LDH est mesurée à 30 °C pendant

20 min en suivant l’absorbance à 340 nm. Les témoins négatifs sont obtenus par utilisation du

surnageant de cellules non traitées (après centrifugation). L’activité maximale de la LDH est

mesurée de la même manière, après cytolyse des HUVEC par sonication. Pour chaque essai,

les résultats sont obtenus par calcul du taux de diminution de l’absorbance provoquée par

l’oxydation du NADH (partie linéaire de la courbe). Chaque valeur est ensuite corrigée par la

soustraction des valeurs du témoin négatif et la libération de la LDH est exprimée comme

pourcentage du contenu cellulaire total.

II.12.2 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium

Principe

Le bromure d’éthidium est une molécule de 394 Da incapable de traverser la

membrane des cellules eucaryotes saines. Lors d’une perturbation de la membrane plasmique,

le dérivé fluorescent entre dans la cellule. Au sein de la cellule, la molécule se lie aux acides

nucléiques doubles brins où, lorsqu’elle est exposée à des rayons de lumière visible, elle émet

un signal fluorescent pouvant être détecté et mesuré. Ainsi, la perméabilisation de la

membrane cellulaire est mise en évidence par mesure de l’augmentation de la fluorescence.

Figure 38 : Réduction du MTT en formazan par la succinate déshydrogénase

mitochondriale

Matériel et Méthodes

92

Protocole expérimental

Les résultats de la toxicité cellulaire du CSA-13 sont affinés par un essai de la

perméabilité de la membrane au bromure d’éthidium (Di Virgilio et al., 1989). Les cellules

HUVEC sont cultivées dans des flasques T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de

CO2. Les cellules sont détachées par 10 % de trypsine-EDTA et incubées à une concentration

de 1.106 cellules/mL dans une plaque 96-puits à fond noir dans leur milieu de culture pendant

minimum 12 h. Dix min avant le début de la lecture, le milieu est aspiré et une solution de

bromure d’éthidium est ajoutée aux puits à une concentration finale de 10 mg/L. L’intensité

de la lumière émise à 590 nm, après excitation à 540 nm, est mesurée à 37 °C et à intervalles

de temps de 15 sec. Cinq min après le début de l’essai, les cellules sont exposées à des

concentrations croissantes en produit à tester (CSA-13, association CSA-13/acide pluronique

3 % ou peptides). L’augmentation de l’intensité de la fluorescence est lue pendant 50 min. Les

cellules sont ensuite perméabilisées par une solution de Triton X-100 à 0,5 % et la lecture

poursuivie afin de mesurer la captation maximale de bromure d’éhidium.

II.12.3 Evaluation de l’activité mitochondriale (test MTT)

Principe

L’ajout d’un sel de tétrazolium, le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-

diphényl tétrazolium (MTT), dans le milieu de culture permet de quantifier l’activité

mitochondriale des cellules et donc d’estimer la viabilité cellulaire. Lors d’une activité

mitochondriale efficace, l’enzyme mitochondriale succinate déshydrogénase réduit le MTT

soluble en cristaux de formazan insolubles en milieu aqueux. La quantification de cristaux de

formazan, par mesure de l’absorbance, est proportionnelle au nombre de cellules

métaboliquement actives.

Protocole expérimental

La toxicité mitochondriale des produits à tester (CSA-13, seul ou en présence d’acide

pluronique F-127 6 % et peptides) est évaluée par un test colorimétrique MTT. Les cellules

HUVEC sont cultivées dans des flasques T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de

CO2. Les cellules sont détachées par 10 % de trypsine-EDTA et incubées une nuit à une

concentration de 1.106 cellules/mL dans une plaque 96-puits dans leur milieu de culture. Le

lendemain, le milieu est écarté et les cellules sont exposées à différentes concentrations de

Matériel et Méthodes

93

produit à tester. Les cellules sont incubées pendant 20 min à 37 °C. Après incubation, le

milieu est écarté et les puits sont remplis par 100 µL d’une solution de MTT à 1 mg/mL. La

plaque est incubée à 37 °C pendant 3 h 30. Les cristaux de formazan formés par les cellules

sont solubilisés à l’aide de DMSO et l’absorbance est lue dans notre lecteur de microplaques à

540 nm. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l’absorbance mesurée dans les

conditions contrôles (absence des produits à tester).

II.12.4 Evaluation du potentiel de membrane mitochondrial

Principe

Le tétraméthylrhodamine éthyl ester (TMRE) est un agent fluorescent s’accumulant au

sein des mitochondries intactes selon le potentiel électrique de la membrane mitochondriale

interne. Le potentiel de membrane mitochondrial est un composant important de la force

promotrice responsable de la synthèse d’ATP par la mitochondrie. Les cellules possédant un

potentiel de membrane mitochondrial négatif et incubées en présence de TMRE accumulent

ce dernier dans leurs mitochondries intactes (Scaduto et Grotyohann, 1999) et une

augmentation de la fluorescence est détectée. En cas de dissipation du potentiel de membrane

mitochondrial, l’accumulation de TMRE dans la mitochondrie est entravée et on observe une

diminution de la fluorescence cellulaire.

Protocole expérimental

La mesure du potentiel de membrane mitochondrial après traitement par le CSA-13,

seul ou en présence du dérivé pluronique F-127, est évaluée sur les cellules HUVEC selon le

protocole décrit par Date et al. (2005). Les cellules HUVEC sont cultivées dans des flasques

T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de CO2. Les cellules sont détachées par 10

% de trypsine-EDTA et incubées une nuit dans une plaque 24-puits à une confluence de 50 à

60 %. Le lendemain, le milieu de culture est aspiré et les cellules adhérentes sont mises en

présence de 1 mL des différentes concentrations en CSA-13, seul ou en association avec le

dérivé pluronique F-127 à 5 %, pendant 1 h à 37 °C. Le CSA-13 et l’acide pluronique F-127

sont dilués dans un tampon PBS à différents pH (pH 6, 7 et 8) afin d’étudier l’influence du pH

sur l’effet du CSA-13. A la fin de l’incubation, le milieu est aspiré et les cellules sont

exposées à 200 nM de TMRE pendant 1 h à 37 °C. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois avec

un tampon PBS. Un mL de Triton X-100 1 % (V/V) est ajouté aux puits afin de lyser les

Matériel et Méthodes

94

cellules. Deux cent µL sont prélevés et mis en plaque 96-puits à fond noir. La fluorescence est

lue à l’aide de notre lecteur de microplaques aux longueurs d’ondes d’excitation et d’émission

de 544 nm et 590 nm respectivement.

II.13 ETUDE DES STRUCTURES SECONDAIRES DES PEPTIDES A

L’AIDE DE LA SPECTROSCOPIE INFRAROUGE A TRANSFORMEE DE

FOURIER A REFLEXION TOTALE ATTENUEE (ATR-FTIR)

II.13.1 Etude des structures secondaires des peptides seuls

Préparation de la solution des peptides

La synthèse des peptides est suivie d’une étape de purification des peptides par

chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) en phase inverse à l’aide d’un

gradient d’acétonitrile contenant 0,1 % d’acide trifluoroacétique (den Hertog et al., 2006).

Des traces de trifluoroacetate (CF3COO- ou TFA) peuvent alors être présentes dans les

peptides (résidu de purification). Il est essentiel de pouvoir éliminer ces traces de TFA car ce

dernier présente une forte bande d’absorption à 1673 cm-1

qui peut chevaucher ou même

masquer la bande de l’amide I du peptide (Zhang et al., 1995). Afin d’éliminer toute trace de

TFA ou d’acétonitrile susceptible d’interférer avec le spectre, les différents peptides subissent

une mise en solution dans 100 µL d’HCl 10 mM suivie d’une congélation et enfin une

lyophilisation (Andrushchenko et al., 2007). L’acide chlorhydrique permet d’éliminer les

contre-ions de TFA- auxquels le peptide est lié à la fin de la synthèse. L’acide chlorhydrique

permet le passage des ions carboxylates en acides carboxyliques (CF3COOH) qui passent en

phase gazeuse et sont éliminés. Ce cycle est opéré 2 fois. Les peptides sont ensuite suspendus

dans 3 à 6 µL d’un tampon HEPES 1 mM à pH 7,3 à une concentration finale de 1 µM.

Enregistrement des spectres en présence d’eau d’hydratation

Un µL de la solution de peptide est étalé sur le cristal de diamant, l’excès d’eau est

rapidement évaporé sous flux d’azote sec et le spectre est analysé comme décrit par Vigano et

al. (2000). Les spectres sont obtenus à l’aide d’un spectrophotomètre Bruker IFS 55 FTIR

(Bruker, Ettlingen, Allemagne), équipé d’un détecteur mercure cadmium tellure (MCT)

refroidi par de l’azote liquide, à une résolution de 2 cm-1

. Les spectres de la vapeur d’eau

résiduelle contribuant au signal sont soustraits.

Matériel et Méthodes

95

Enregistrement des spectres après échange H2O/D2O « deutération »

L’échange hydrogène/deutérium (H/D) est réalisé comme décrit par Vigano et al.

(2000). L’échantillon est soumis à un courant d’azote saturé en vapeur de D2O à température

ambiante. L’échange est observé par la diminution de l’intensité du pic de l’amide II autour

de 1550 cm-1

qui est sensible à l’échange H/D en comparaison avec l’aire du pic de l’amide I

(région 1600-1700 cm-1

) pris comme référence. Des temps de deutération assez courts sont

généralement suffisants pour déplacer les composants non structurés de l’amide I, tandis que

prolonger la deutération, affectant les composants des structures ordonnées, ne modifie pas

significativement la position de leurs constituants (Goormaghtigh et al., 1994a – 1994b).

Enregistrement des spectres après reconstitution dans une solution de D2O

Des expériences similaires sont réalisées après reconstitution des peptides dans une

solution de D2O. Pour ce faire, après lyophilisation des peptides ceux-ci sont solubilisés à

l’aide d’une solution de D2O pendant 1 h afin que l’échange H/D soit pratiquement total à

l'exception des groupes difficilement échangeables. Un µL des peptides saturés en D2O est

déposé sur le cristal de diamant. Les spectres sont obtenus après élimination rapide de l'excès

de D2O sous flux d'azote sec avant d'être soumis à un équilibrage avec de l'azote saturé en

vapeur de D2O à température ambiante.

II.13.2 Etude des structures secondaires des peptides au contact de liposomes

Préparation des liposomes

Les liposomes sont préparés comme suit : 1,4 mg de Lα-Phosphatidylcholine (PC) et

0,6 mg de Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)] (POPG) sont dissous

dans 500 µL de chloroforme et séchés sous un flux léger d’azote. Lorsque l’échantillon est

sec, il est placé sous vide afin d’éliminer toute trace de solvant. Après scellage sous azote,

l’échantillon est conservé à -20 °C. Le jour de la prise des spectres, le mélange de lipides est

dispersé dans un tampon HEPES 1 mM (pH 7,3) à une concentration finale de 2 mg/mL soit

~3 mM (PM ~700 g/mol).

Enregistrement des spectres après reconstitution dans une solution de D2O

Les spectres sont enregistrés après reconstitution des peptides et lipides dans une

solution de D2O. Pour ce faire, après lyophilisation du peptide ou séchage du mélange de

Figure 39 : Liaison de la dansyl-PMB aux LPS et déplacement par la PMB

Représentation schématique du mécanisme de liaison de la dansyl-PMB à des micelles de

LPS. Le faible rendement de fluorescence de la fraction dansyle dans un environnement

polaire est considérablement accru en milieu apolaire, comme lorsqu'elle est liée. La réduction

de la fluorescence lors de l'addition d'un ligand de compétition cationique (comme la PMB)

est secondaire au déplacement de la dansyl-PMB. Ce déplacement peut être interprété pour

décrire l’affinité de liaison à un ligand compétiteur (Soon et al., 2011).

Matériel et Méthodes

96

lipides, le résidu sec est reconstitué dans une solution de D2O pendant 1 h afin que l’échange

H/D soit optimal. Après dépôt sur le cristal de diamant et élimination de l’excès de D2O sous

flux d'azote sec, l’échantillon est soumis à un équilibrage avec de l'azote saturé en vapeur de

D2O à température ambiante et les spectres sont enregistrés.

II.14 FIXATION DES PEPTIDES AUX LPS

Principe

La polymyxine B (PMB) est un antibiotique peptidique cyclique et cationique qui se

lie aux lipides anioniques. La PMB se lie aux LPS, des composants de la membrane externe

des bactéries à Gram négatif. La dansyl-polymyxine B (dansyl-PMB), dont la fluorescence est

faible lorsqu’elle est en solution, devient fortement fluorescente lorsqu’elle se lie aux LPS. La

liaison de la dansyl-PMB aux LPS peut être déplacée par de nombreux antibiotiques

cationiques. Des études de compétition de la liaison de la dansyl-PMB peuvent donc être

réalisées afin d’évaluer la liaison de composés, comme les PAM cationiques, aux LPS.

II.14.1 Synthèse de la dansyl-PMB

La PMB dansylée est synthétisée à partir de sulfate de PMB et de chlorure de dansyle

selon le protocole décrit par Schindler et Teuber (1975). Quarante mg de sulfate de PMB sont

dissous dans 1,2 mL de NaHCO3 0,1 M et 10 mg de chlorure de dansyle dans 0,8 mL

d’acétone. Le sulfate de PMB est ajouté au chlorure de dansyle et le mélange est laissé au

repos pendant 90 min à l’abri de la lumière et à température ambiante. Le dérivé dansyle

réagit avec une amine primaire des résidus d’acide diaminobutyrique de la PMB pour former

un dérivé mono-N-dansylPMB (Schindler et Teuber, 1975). Après incubation, le mélange est

injecté dans une colonne Sephadex G50 (50 x 2,5 cm) équilibrée avec un tampon phosphate

10 mM (pH 7,1) contenant 0,145 M de NaCl. Des fractions de 5 à 6 mL sont collectées. La

dansyl-PMB sort de la colonne dans un pic assez large avant le pic du chlorure de dansyle

n’ayant pas réagi. On peut rechercher la PMB dansylée par maintien d’une lampe à UV sur les

fractions et par observation de la fluorescence. La fluorescence de la PMB dansylée est jaune

tandis que celle du chlorure de dansyle qui n’a pas réagi est bleue-verte. Les fractions

contenant la PMB dansylée sont extraites dans environ un demi-volume de butanol. Le

Matériel et Méthodes

97

butanol est ensuite évaporé à 37 °C. Le résidu de dansyl-PMB est dissous dans 3 mL de

tampon HEPES 5 mM (pH 7,0) et aliquoté à -20 °C. La concentration en dansyl-PMB est

déterminée par dinitrophénylation.

II.14.2 Dosage de la dansyl-PMB par dinitrophénylation

Afin de quantifier la dansyl-PMB synthétisée, celle-ci est dinitrophénylée d’après le

protocole détaillé décrit par Bader et Teuber (1973). Une courbe standard de PMB est

effectuée à partir d’une solution stock à 100 mg/mL. Des dilutions sont effectuées pour

obtenir des solutions de 8 ; 6 ; 4 ; 2 ; 1 ; 0,8 ; 0,6 ; 0,4 ; 0,2 et 0,1 mg/mL. Cinquante µL de

ces solutions sont utilisés auxquels 200 µL d’une solution de borate de sodium décahydraté

(Na2B4O7.10 H2O) 1,0 % et 25 µL d’une solution de 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène 100 mM

sont ajoutés. Le mélange est incubé pendant 1 h à 37 °C. Ensuite 1 mL d’HCl 2 M, puis 1 mL

de butanol sont ajoutés. Les tubes sont vortexés et centrifugés pendant 2 min à 2500 tpm. La

phase butanol est lue à une DO 420 nm.

II.14.3 Effet des peptides sur la fixation de la dansyl-PMB aux LPS

Dans un premier temps, l’augmentation de la fluorescence suite à la liaison de la

dansyl-PMB aux LPS de P. aeruginosa (LPS Pseudomonas aeruginosa ATCC27316, Sigma

catalog ref. 7018) est mesurée à l’aide d’un fluorimètre. La fluorescence est évaluée après

ajout de dansyl-PMB (concentration finale 0,55 µM) à 2 mL de LPS (3 µg/mL) dans un

tampon HEPES 5 mM (pH 7,2) dans une cuvette en polystyrène (Tsubery et al., 2000). La

fluorescence est mesurée à une longueur d’onde d’excitation et d’émission de 360 et 485 nm

respectivement. L’expérience est répétée en présence du tampon uniquement, sans les LPS,

afin de vérifier la spécificité de la fluorescence.

Ensuite, l’effet du peptide LL-37 et de ses fragments sur la fixation aux LPS est

évalué. L’essai est réalisé dans les puits d’une plaque 96-puits à fond noir contenant 180 µL

de tampon HEPES 5 mM (pH 7,2) et 10 µL de LPS (concentration finale 25 µg/mL). Les

différents peptides dérivés du LL-37 (concentration finale 10 µM) sont ajoutés aux puits à

raison de 10 µL par puits. La fluorescence est lue à une longueur d’onde d’excitation et

Figure 40 : Nitrocéfine et ONPG

Figure 41 : Essai de la perméabilisation des membranes de E. coli ML-35p

Adapté d’après Eriksson et al., 2002.

Matériel et Méthodes

98

d’émission de respectivement 360 et 485 nm. Ensuite 10 µL de dansyl-PMB (concentration

finale 13 µM équivalent PMB) sont ajoutés et la fluorescence des puits est mesurée une

deuxième fois. La fixation non-spécifique de la dansyl-PMB est estimée en réalisant le dosage

en présence d'une concentration de PMB 250 fois plus élevée que celle de la dansyl-PMB. On

suppose que dans ces conditions les LPS fixent la PMB plutôt que la dansyl-PMB. Cette

valeur est prise comme « blanc ». La PMB n'est pas ajoutée dans des puits « contrôles ». La

fluorescence mesurée dans ces puits est considérée comme la capacité maximum de fixation

de la dansyl-PMB. Après avoir soustrait le « blanc » de tous les résultats, la fluorescence

mesurée en présence des peptides est exprimée en pourcentage de la fixation dans les

conditions « contrôles » (LPS et dansyl-PMB, absence de PMB ou de peptide).

II.15 PERMEABILISATION DES MEMBRANES DE E. COLI ML-35P

Principe

L’activité des peptides sur la perméabilisation des membranes bactériennes est étudiée

à l’aide de la souche E. coli ML-35p. Cette souche a été créée spécifiquement pour étudier la

perméabilisation de la membrane externe et interne d’une même souche (Lehrer et al., 1988).

Elle est constitutive pour la β-galactosidase cytoplasmique, dépourvue de lactose perméase et

exprime une β-lactamase périplasmique (plasmide pBR322). Deux molécules

chromogéniques incapables de traverser les membranes externe et interne de la bactérie sont

utilisées afin de suivre l’activité de la β-lactamase périplasmique et de la β-galactosidase

cytoplasmique et ainsi de mesurer la perméabilisation des membranes externe et interne

respectivement. Ne pouvant traverser la membrane externe, la nitrocéfine est exclue de

l’espace périplasmique. Lors d’une perméabilisation de la membrane externe, la molécule

peut entrer dans le périplasme et être clivée par la β-lactamase. L’hydrolyse du lien amide

dans l’anneau β-lactame de la nitrocéfine produit un changement de couleur du jaune au

rouge. L’absence de lactose perméase dans la souche E. coli ML-35p entrave l’entrée

d’orthonitrophényl-β-galactoside (ONPG) à travers la membrane interne. S’il y a

perméabilisation de la membrane interne, l’ONPG peut être clivé par la β-galactosidase

cytoplasmique en o-nitrophénol (ONP). Ce clivage produit un changement de couleur (jaune)

qui peut être mesuré par spectrophotométrie (Epand et al., 2010).

Matériel et Méthodes

99

Protocole expérimental

Quelques colonies de la souche E. coli ML-35p sont prélevées et mises en culture dans

un milieu TSB contenant 100 µg/mL d’ampicilline pendant une nuit à 37 °C. Le lendemain, la

suspension est lavée 3 fois dans un tampon phosphate pH 7,4 (tampon phosphate 10 mM et

NaCl 0,1 M). La culture bactérienne est ensuite diluée à une DO 600 nm de 0,100 ± 0,005 dans

un tampon d’incubation (tampon phosphate pH 7,4 contenant 300 μg/mL TSB). Cent µL

d’une solution de peptide (concentration finale 10 µM) et 90 µL de la suspension bactérienne

sont déposés dans les puits d’une microplaque. Afin de mesurer la perméabilisation de la

membrane externe, 10 µL de nitrocéfine (concentration finale 30 µM) ou 10 µL tampon

phosphate (conditions contrôles) sont ajoutés aux puits. L’absorbance des puits, sous agitation

à 37 °C, est lue à 486 nm pendant 100 min, avec des mesures effectuées toutes les 2 min.

L’étude de la perméabilisation de la membrane interne est réalisée par ajout de 10 µL

d’ONPG (concentration finale 2,5 mM) ou 10 µL de DMSO (conditions contrôles) et

l’absorbance est lue à 420 nm dans les mêmes conditions.

II.16 ANALYSES STATISTIQUES

Les comparaisons statistiques de plus de 3 groupes indépendants sont effectuées à

l’aide d’une analyse de variance à 1 voie (ANOVA) suivie d’un post-test de Bonferroni à

comparaisons multiples. La comparaison de l’activité du CSA-13 et de l’association CSA-

13/acide pluronique F-127 est analysée par une ANOVA à deux voies suivie d’un post-test de

Bonferroni à comparaisons multiples. Un test non paramétrique de Mann-Whitney est

effectué pour comparer 2 groupes indépendants (souches mucoïdes versus non mucoïdes ou

souches de référence versus souches cliniques). La recherche d’une corrélation entre la

production d’AHL et les caractéristiques phénotypiques des 8 souches est analysée

statistiquement par réalisation d’une corrélation de Pearson. Toutes les analyses statistiques

sont effectuées par le logiciel GraphPad 4.03 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

* P < 0,05 ; ** P < 0,01 ; *** P < 0,001 ; non significatif P > 0,05.

Caractérisation phénotypique des souches

100

CHAPITRE I

CARACTERISATION

PHENOTYPIQUE

DES SOUCHES

Caractérisation phénotypique des souches

101

I. INTRODUCTION

Les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose sont colonisées par de

nombreux pathogènes, parmi lesquels la bactérie P. aeruginosa est prédominante (Hassett et

al., 2009). Après des épisodes répétés d’infections du tractus respiratoire principalement liées

à P. aeruginosa, les patients commencent à développer une insuffisance pulmonaire associée

à un déclin du statut clinique et un pronostic aggravé qui sont finalement responsables de la

mort des patients atteints de mucoviscidose (Ramsey et al., 1999). Les infections chroniques à

P. aeruginosa affectent 80 à 90 % des patients atteints de mucoviscidose et, une fois ces

infections établies, les associations actuelles d’antibiotiques sont incapables d’éradiquer la

bactérie des voies respiratoires de ces patients (Römling et al., 1994). La chronicité de ces

infections est liée au développement de la bactérie sous un mode de vie particulier, le biofilm

(Bjarnsholt et al., 2009). Les bactéries s’assemblent en communautés complexes et

organisées, entourées par la sécrétion d’une matrice extracellulaire polymérique. Ce mode de

vie confère aux bactéries présentes dans le biofilm un environnement dense et protecteur

augmentant la résistance du pathogène au système immunitaire de l’hôte et aux antibiotiques

conventionnels.

Dans un premier temps, nos travaux se sont concentrés sur la caractérisation de

différentes souches de P. aeruginosa, comprenant 5 souches cliniques isolées des

expectorations de patients atteints de mucoviscidose et 3 souches de référence. Nous avons

exploité la capacité de ces souches à adhérer à une surface et à former un biofilm, une

structure essentielle à la virulence du pathogène. Différentes techniques ont été utilisées et

comparées. Nous nous sommes aussi intéressés à la mobilité des souches, leurs propriétés

protéolytiques, leur sensibilité à la tobramycine et leur production d’AHL.

Figure 42 : Cinétique de l’immobilisation des billes magnétiques dans le BFRT®

Souches non mucoïdes

0 30 60 900

5

10

15

20

25

PAO1

PYO1

ATCC 15442

ATCC 9027

***ns

*** *******

*********

A

Temps (min)

IFB

Souches mucoïdes

0 30 60 900

5

10

15

20

25

MC093

MC099

MC75

PYO2

**

***

B

Temps (min)

IFB

L’adhésion de 4 souches non mucoïdes (figure A) et 4 souches mucoïdes (figure B) est

étudiée à l’aide du BFRT® à différents temps d’incubation. Les résultats sont exprimés en IFB

et sont la moyenne ± SEM de 3 à 5 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3 à

5). * P < 0,05 ; ** P < 0,01 ; *** P < 0,001.

Figure 43 : Adhésion des souches par le BFRT®

ATC

C 1

5442

PYO1

PAO1

ATC

C 9

027

PYO2

MC75

MC09

3

MC09

90

5

10

15

20

25Souches

mucoïdes

Souches

non mucoïdes

Souches de référence

Souches cliniques

n =

3

3 33

3

3

4 4

IFB

Les 8 souches de P. aeruginosa sont incubées pendant 1 h en présence de billes magnétiques.

Les puits sont ensuite exposés à un aimant magnétique et la capacité des billes à former un

spot au centre du puits est estimée par la technique du BFRT®. Les résultats sont exprimés en

IFB. Ils sont la moyenne ± SEM de 3 à 4 expériences indépendantes (n = 3 à 4).

Caractérisation phénotypique des souches

102

II. RESULTATS

II.1 FORMATION DES BIOFILMS

II.1.1 Formation des biofilms par le BFRT®

En l’absence de bactéries dans le puits (contrôle négatif), l’exposition des billes

magnétiques à un champ magnétique provoque l’apparition d’un spot au centre du puits. Ce

spot n’est pas observé dans les puits sans billes (blanc). Ce résultat confirme que le spot et

l’augmentation de l’absorbance qu’il provoque sont secondaires à l’agglutination des billes.

L’IFB est calculé dans les puits contrôles comme décrit par Chavant et al. (2007). Cet IFB

atteint une moyenne de 16,1 ± 0,4 (n = 5). Quand les bactéries sont présentes dans les puits, la

formation du spot après exposition à un champ magnétique varie d’une souche à l’autre et en

fonction du temps d’incubation. La souche ATCC PAO1 provoque le plus rapidement une

diminution de l’IFB : après 30 min l’IFB a déjà diminué de 15 ± 1 à 10 ± 2 et jusqu’à 4 ± 1

après 45 min (n = 4 ; P < 0,001) (figure 42). Après 90 min d’incubation, l’IFB atteint sa

valeur la plus faible (1,49 ± 0,03 ; n = 5 ; P < 0,001) suggérant que les billes sont

complètement bloquées et ne peuvent plus bouger lorsqu’elles sont soumises à un champ

magnétique. Trois autres souches donnent des résultats similaires et provoquent une

diminution significative de l’IFB après 45 min (ATCC 9027) ou 60 min (MC093-450507 et

ATCC 15442) d’incubation. L’IFB ne change pas de manière significative après 90 min pour

les 4 autres souches (MC75-450457, PYO1, PYO2 et MC099-450467).

L’adhérence aux puits est significativement plus importante pour les souches non

mucoïdes que pour les souches mucoïdes (P = 0,0037 après 30 min et P = 0,0009 après 90

min).

L’étude de la mobilisation des billes par le BFRT® permet ainsi de caractériser les

premières étapes du développement du biofilm (l’adhésion des bactéries à une surface) à des

temps très courts. La figure 43 présente les caractéristiques d’adhésion des souches à la

surface des puits (après 60 min, ATCC PAO1 = ATCC 9027 > ATCC 15442 > MC093-

450507 >> MC75-450457 = PYO1 = PYO2 = MC099-450467).

Figure 44 : Cinétique de la formation du biofilm

par la technique de coloration au CV

Souches

non mucoïdes

0 1 2 3 4 5 60.0

0.5

1.0

PAO1

PYO1

ATCC15442

ATCC9027

A

Temps (h)

DO

54

0 n

m

Souches

non mucoïdes

0 12 24 36 480

1

2

3

4

5

PAO1

PYO1

ATCC15442

ATCC9027

B

Temps (h)

DO

54

0 n

m

Souches

mucoïdes

0 1 2 3 4 5 60.0

0.5

1.0

MC093

MC099

MC75

PYO2

C

Temps (h)

DO

54

0 n

m

Souches

mucoïdes

0 12 24 36 480

1

2

3

4

5

MC093

MC099

MC75

PYO2

D

Temps (h)

DO

54

0 n

m

La formation du biofilm par 4 souches non mucoïdes (figures A et B) et 4 souches mucoïdes

(figures C et D) est étudiée par la technique de coloration au CV à différents temps

d’incubation ; entre 0 et 6 h (figures A et C) et jusqu’à 48 h (figures B et D). Les résultats sont

la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3).

Caractérisation phénotypique des souches

103

II.1.2 Formation des biofilms par coloration au CV

Aucune augmentation importante de l’absorbance n’est mesurée avant 4 h de

formation du biofilm (de 0,02 ± 0,01 à 0,10 ± 0,02 ; n = 3 pour ATCC PAO1). Après 6 h

d’incubation, l’absorbance est augmentée de manière importante pour 4 souches (ATCC

15442, ATCC 9027, ATCC PAO1 et MC093-450507). La figure 45 représente la formation

du biofilm par les 8 souches après 6 h. Deux groupes se distinguent après 6 h : les souches

formant « rapidement » un biofilm et celles formant « lentement » un biofilm. La différence

de coloration par le CV entre ces 2 groupes est significative (P = 0,0006). Les souches

adhérant aux puits après 6 h sont les mêmes que celles s’attachant rapidement aux puits du

BFRT®. Après 24 et 48 h de formation de biofilm, l’absorbance augmente pour toutes les

souches, cependant après 48 h l’augmentation est significativement plus importante pour les 4

souches mucoïdes que pour les 4 souches non mucoïdes (P = 0,019). Ceci s’explique par

l’augmentation rapide et soutenue de l’absorbance après 24 h pour les souches mucoïdes

tandis que l’absorbance augmente à une échelle beaucoup plus lente avec les souches non

mucoïdes (figure 44 B et D). La technique de coloration au CV donne ainsi une bonne

estimation de la formation des biofilms à des temps plus longs.

Figure 45 : Formation du biofilm par la technique de coloration au CV

ATC

C 1

5442

PYO1

PAO1

ATC

C 9

027

PYO2

MC75

MC09

3

MC09

90.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Souches

non mucoïdes

Souches

mucoïdesD

O5

40

nm

Les 8 souches de P. aeruginosa sont incubées pendant 6 h dans les puits d’une microplaque.

La formation du biofilm est mesurée par la coloration au CV. Les résultats sont exprimés

comme variation de l’absorbance mesurée à 540 nm. Ils sont la moyenne ± SEM de 3

expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3).

Figure 46 : Cinétique de la formation du biofilm par dénombrement

0 10 20 30 40 50 60 700

***

***

*500

1.000

1.500

2.000

2.500

Temps (min)

No

mb

re d

e b

ac

téri

es

ad

hé

ren

tes

(x 1

03 u

fc/m

L)

Une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1 est incubée dans les puits d’une

microplaque. A différents temps d’incubation le milieu est aspiré et les bactéries attachées au

fond du puits sont comptées par la technique du dénombrement. Les résultats sont exprimés

en nombre de bactéries adhérentes en ufc/mL. Ils sont la moyenne ± SEM de 3 expériences (n

= 3). * P < 0,05 ; *** P < 0,001.

Caractérisation phénotypique des souches

104

II.1.3 Formation des biofilms par dénombrement

L’adhérence de la souche de référence ATCC PAO1 au fond des puits est évaluée par

un dénombrement bactérien. Le nombre de cellules adhérant à la surface augmente de façon

significative après 30 min d’incubation (de 1,2 ± 0,2 % après 10 min à 3,5 ± 0,8 % par rapport

à la SBI prise comme référence ; n = 3 ; P < 0,05). Après 45 et 60 min d’incubation, la

quantité de bactéries adhérentes augmente encore (11 ± 1 % après 45 min et 18 ± 1 % après

60 min ; n = 3 ; P < 0,001).

Figure 47 : Etude de la motilité des 8 souches de P. aeruginosa

Swimming

PAO1

ATC

C 9

027

ATC

C 1

5442

MC09

3

PYO2

MC09

9

PYO1

MC75

0

10

20

30

100

A**

Su

rfa

ce

(m

m²)

Swarming

PAO1

PYO2

MC09

9

ATC

C 1

5442

ATC

C 9

027

PYO1

MC09

3

MC75

0

10

20

30

40

50

100

B *

Su

rfa

ce

(m

m²)

La mobilité de type swimming (figure A) et de type swarming (figure B) des différentes

souches est mesurée comme décrit dans la partie Matériel et Méthodes. Les résultats sont

exprimés en surface (mm2) couverte par les colonies et sont la moyenne ± SEM de 5

expériences (n = 5). * P < 0,05 ; ** P < 0,01.

Figure 48 : Mobilité de type swimming de la souche ATCC PAO1

Caractérisation phénotypique des souches

105

II.2 MOTILITE DES SOUCHES

Deux types de motilité du P. aeruginosa sont investigués.

Le flagelle est l’organe principal pour le mode de motilité swimming du P. aeruginosa.

La mobilité de type swimming est différente au sein des 8 souches : la souche ATCC PAO1 a

la motilité swimming la plus importante et la souche MC75-450456 présente la motilité

swimming la plus faible (ATCC PAO1 >>> ATCC 9027 > ATCC 15442 > MC093-450507 >

PYO2 > MC099-450467 > PYO1 > MC75-450456) (figure 47 A).

Le swarming est un type de mobilité qui ne dépend pas uniquement du flagelle mais

aussi des pili de type IV et des rhamnolipides. Sur les boîtes d’agar, ATCC PAO1 est la seule

souche qui forme les ramifications irrégulières et en expansion caractéristiques de ce mode

particulier de motilité. Les autres souches restent près de leur point d’inoculation. Les souches

sont classées par ordre de taille du spot : ATCC PAO1 >>> PYO2 > MC099-450467 > ATCC

15442 > ATCC 9027 > PYO1 > MC093-450507 > MC75-450457 (figure 47 B).

Figure 49 : Etude de la production de rhamnolipides par les 8 souches de P. aeruginosa

ATC

C 1

5442

PYO1

PAO1

ATC

C 9

027

PYO2

MC75

MC09

3

MC09

9

0

10

20

30

Souches

mucoïdes

Souches

non mucoïdes

n =

3

3

3

3

3

3

2

2

Co

nc

en

tra

tio

n e

n r

ha

mn

os

e

(µg

/mL

)

La capacité des différentes souches à produire et sécréter des rhamnolipides est évaluée par la

mesure de la concentration en rhamnose dans un extrait de diéthyléther du milieu de culture

(méthode à l’orcinol en milieu acide). Les résultats sont exprimés en µg de rhamnose/mL de

milieu de culture. Ils sont la moyenne ± SD de 2 à 3 expériences indépendantes réalisées en

triplicat (n = 2 à 3).

Figure 50 : Sensibilité à la tobramycine

ATC

C 1

5442

PYO1

PAO1

ATC

C 9

027

PYO2

MC75

MC09

3

MC09

90

2

4

6

8Souches

non mucoïdes

Souches

mucoïdes

- L

og

ufc

/mL

Les 8 souches de P. aeruginosa sont incubées pendant 24 h dans les puits d’une microplaque

avec un couvercle. Après cette incubation, les pointes du couvercle sont lavées et le couvercle

transféré sur une nouvelle plaque. Les pointes sont plongées dans les puits avec un nouveau

milieu, en absence ou en présence de 4 mg/L de tobramycine. Après 24 h la quantité d’ufc sur

les pointes est déterminée. Les résultats sont exprimés en variations du nombre d’ufc/mL en

présence de tobramycine. Ils sont la moyenne ± SD de 2 expériences (n = 2).

Caractérisation phénotypique des souches

106

II.3 PRODUCTION DE RHAMNOLIPIDES

Comme le montre la figure 49, la production de rhamnose est très différente parmi les

8 souches. Trois souches (ATCC 9027, ATCC 15442 et MC099-450467) ne produisent pas de

rhamnose. L’hexose est détecté dans le surnageant pour les 5 autres souches. La souche

MC093-450507 est la plus grande productrice de rhamnose (28 ± 2 µg de rhamnose/mL ; n =

2) suivie par la souche ATCC PAO1 (21 ± 3 µg de rhamnose/mL ; n = 3) (MC093-450507 >

ATCC PAO1 > MC75-450456 > PYO2 > PYO1).

II.4 SENSIBILITE A UN ANTIBIOTIQUE

La tobramycine est un antibiotique spécialement actif envers P. aeruginosa. L’effet de

l’antibiotique est évalué à une concentration de 4 mg/L. Les 4 souches non mucoïdes sont très

sensibles au composé (PYO1 > ATCC PAO1 > ATCC 15442 > ATCC 9027). La diminution

des ufc après 24 h de traitement des souches non mucoïdes varie de 3,5 log ufc/mL (ATCC

9027) à 6,1 log ufc/mL (PYO1). Les 4 souches mucoïdes sont beaucoup moins sensibles au

composé. La quantité d’ufc/mL diminue seulement de 2,0 log pour la souche MC75-450457,

la souche mucoïde la plus sensible à la tobramycine. La souche MC093-450507 est

complètement résistante à l’aminoglycoside. La différence de sensibilité à la tobramycine

entre les souches mucoïdes et non mucoïdes est significative (P = 0,03).

Figure 51 : Activité protéolytique dans le milieu de culture

ATC

C 1

5442

PYO1

PAO1

ATC

C 9

027

PYO2

MC75

MC09

3

MC09

90.0

0.1

0.2

0.3

Souches

mucoïdes

Souches

non mucoïdes

DO

40

5 n

m

Le milieu de culture de P. aeruginosa est centrifugé. L’activité des protéases dans le

surnageant est mesurée avec l’azocaséine comme décrit dans le chapitre Matériel et

Méthodes. L’absorbance mesurée à 405 nm est utilisée comme index de l’activité

protéolytique. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3).

Figure 52 : Activité élastolytique dans le milieu de culture

ATC

C 1

5442

PYO1

PAO1

ATC

C 9

027

PYO2

MC75

MC09

3

MC09

9

Contr

ôle0.0

0.1

0.2

0.3

0.4Souches

non mucoïdes

Souches

mucoïdes

DO

49

5 n

m

Le milieu de culture de P. aeruginosa est centrifugé. L’activité des élastases dans le

surnageant est mesurée avec un tampon ECR comme décrit dans le chapitre Matériel et

Méthodes. L’absorbance mesurée à 495 nm est utilisée comme index de l’activité

élastolytique. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3).

Caractérisation phénotypique des souches

107

II.5 ACTIVITE PROTEOLYTIQUE

L’activité protéolytique de P. aeruginosa est étudiée par utilisation de l’azocaséine

comme substrat et par mesure de l’absorbance. L’activité protéolytique diffère au sein des 8

souches étudiées (figure 51). Les 2 souches secrétant la plus grande quantité de protéases sont

les souches mucoïdes MC75-450457 et MC093-450507. Pour trois souches (PYO1, PYO2 et

MC099-450467) aucune activité protéolytique n’est détectée (MC75-450457 > MC093-

450507 = ATCC PAO1 > ATCC 9027 = ATCC 15442 >> PYO2 > MC099-450467 = PYO1).

II.6 ACTIVITE ELASTOLYTIQUE

L’activité élastolytique de P. aeruginosa est étudiée par utilisation de l’ECR comme

substrat et par mesure de l’absorbance. L’activité élastolytique diffère au sein des 8 souches

étudiées (figure 52). Les 2 souches secrétant la plus grande quantité de protéases sont les

souches mucoïdes MC75-450457 et ATCC PAO1. Pour les autres souches pratiquement

aucune activité élastolytique n’est détectée.

Figure 53 : Etude sur boîte de Petri de la production des Cn≥6-HSL

A

ATC

C 1

5442

PYO1

PAO1

ATC

C 9

027

PYO2

MC75

MC09

3

MC09

90

300

600

900

1200

4

4

4

2

4

4

4

4

Souches

mucoïdesSouches

non mucoïdes

n=

Su

rface

(m

m2)

B

Figure A : La souche biorapporteur est coulée sur boîte de Petri contenant le substrat X-Gal.

Cinq µL de chacune des 8 souches sont inoculés sur la couche d’agar et les boîtes de Petri

sont incubées à 28 °C pendant 48 h. La surface bleue autour de chaque spot d’inoculation est

évaluée. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 2 à 4 expériences indépendantes (n = 2 à 4).

Figure B : Photographie des spots indicateurs de la production de Cn≥6-HSL après incubation

de A. tumefaciens NTL4(pZLR4) en présence de P. aeruginosa PYO2 (gauche) et ATCC

15442 (droite).

Caractérisation phénotypique des souches

108

II.7 PRODUCTION D’AHL

II.7.1 Production des Cn≥6-HSL

II.7.1.1 Etude sur boîte de Petri

La synthèse de la libération de Cn≥6-HSL est étudiée à l’aide de la souche

biorapporteur A. tumefaciens NTL4(pZLR4). L’expression de lacZ par la souche

biorapporteur secondairement à l’interaction entre TraR et Cn≥6-HSL varie avec les extraits

des 8 souches. Un spot bleu, lié à la libération de l’anneau indole de X-Gal par la β-

galactosidase, apparaît au point d’inoculation de toutes les souches excepté pour la souche

mucoïde MC099-450467 et la souche non mucoïde ATCC 9027. Ces résultats indiquent que

ces deux souches ne sécrètent pas d’AHL capables d’interagir significativement avec le

facteur de transcription TraR et d’augmenter l’expression de lacZ. La surface formée par

chaque spot autour du point d’inoculation pour les 6 autres souches est estimée et utilisée

comme index de production et de libération d’AHL par ces souches. La production d’AHL

varie au sein des 8 souches étudiées : PYO2 > MC75-450457 > ATCC 15442 > MC093-

450507 > ATCC PAO1 > PYO1 >>> MC099-450467 = ATCC 9027 (figure 53 A).

Une gamme de concentrations est évaluée pour chaque souche indiquant que la

détection des AHL est dose-dépendante. En effet, la taille du spot varie en fonction de la

concentration de P. aeruginosa injectée dans la boîte de Petri (résultats non montrés).

Figure 54 : Etude sur microplaque de la production de Cn≥6-HSL

ATC

C 1

5442

PYO

1

PAO1

ATC

C 9

027

PYO

2

MC75

MC09

3

MC09

90

4000

8000

12000

16000Souches

mucoïdes

Souches

non mucoïdes

Ac

tiv

ité

-ga

lac

tos

ida

se

(u

.a.f

.)

La souche biorapporteur est transférée dans les puits d’une plaque 96-puits. Deux µL d’un

extrait d’acétate d’éthyle du milieu de culture de chaque souche sont ajoutés aux puits. Après

18 h d’incubation à 28 °C, 20 µL du milieu de culture sont transférés dans les puits d’une

nouvelle plaque et incubés en présence de 25 µL d’une solution MUG à 1 mg/mL. La

fluorescence de chaque puits émise à 460 nm après excitation à 360 nm est mesurée toutes les

2 min pendant 30 min. Les résultats sont exprimés en vitesse d’augmentation de la

fluorescence. Ils sont la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat

(n = 3).

Tableau 3 : Chromatographie sur couche mince des Cn≥6-HSL

Chaîne

acyle des

standards

Shaw et

al.

(1997)

Notre

étude

Souches mucoïdes Souches non mucoïdes

PY

O2

MC

75-

450457

MC

099-

450467

MC

093-

450507

PY

O1

AT

CC

PA

O1

AT

CC

9027

AT

CC

15442

C6 0,43 0,42

3-oxo-C8 0,41 0,34 0,33 0,33 0,32 0,33 0,33

C8 0,23 0,24

3-oxo-C10 0,18 N.D. 0,15 0,15 0,18 0,15 0,14

C10 0,09 0,08

3-oxo-C12 0,07 N.D. 0,04 0,05 0,03 0,04 0,04

C12 0,02 N.D.

Le milieu de culture de 8 souches est extrait avec de l’acétate d’éthyle et 4 µL des extraits

sont déposés sur une plaque à phase inverse. La plaque est développée avec une solution de

méthanol/eau et les Cn≥6-HSL sont révélées par la superposition d’une couche d’agar

contenant la souche biorapporteur et le substrat X-Gal. La migration des différentes AHL est

mesurée à l’aide du logiciel Image Lab 3.0 du système ChemiDoc XRS+. La moyenne des

résultats de 2 à 3 expériences indépendantes est présentée dans le tableau (n = 2 à 3). N.D. =

non déterminé.

Caractérisation phénotypique des souches

109

II.7.1.2 Etude sur microplaque

Une expérience similaire, à l’aide d’un essai sur microplaque, est réalisée pour évaluer

la production des Cn≥6-HSL par les différentes souches. Les AHL sont extraits à l’aide

d’acétate d’éthyle et incubés en présence de A. tumefaciens NTL4(pZLR4) pendant 18 h.

L’expression de lacZ varie entre les souches: PYO2 > MC75-45057 > ATCC 15442 >

MC093-450507 > ATCC PAO1 > PYO1 > MC099-450467 = ATCC 9027 (figure 54). Ces

résultats sont en accord avec ceux observés lors des co-cultures dans une couche de soft agar

(essai sur boîte de Petri).

II.7.1.3 Etude par CCM

Une CCM est réalisée afin de séparer les Cn≥6-HSL produites par les souches et les

spots sont détectés par recouvrement à l’aide de la souche biorapporteur A. tumefaciens

NTL4(pZLR4). La migration des AHL produites par P. aeruginosa est comparée avec la

migration des standards. En accord avec Cha et al. (1998), la souche biorapporteur permet la

détection de plusieurs AHL avec des chaînes acyles de 6 à 12 carbones. Aucun spot n’est

observé pour 3 souches (MC099-450467, PYO1 et ATCC 9027). Trois spots sont détectés

dans le milieu de culture des 5 autres souches (PYO2, MC75-45057, ATCC 15442, MC093-

450507 et ATCC PAO1). Ces spots migrent avec un Rf compatible avec 3-oxo-C8-HSL, 3-

oxo-C10-HSL et 3-oxo-C12-HSL.

Figure 55 : Etude de la production des C4-HSL

ATC

C 1

5442

PYO

1

PAO1

ATC

C 9

027

PYO

2

MC07

5

MC09

3

MC09

90.0

0.3

0.6

0.9

1.2 Souches

non mucoïdes

Souches

mucoïdesD

O2

99

nm

Un extrait d’acétate d’éthyle est incubé en présence de la souche biorapporteur P. aeruginosa

CGMCC 1.860 pendant 24 h. Le surnageant est extrait par du chloroforme, le solvant

organique évaporé et le résidu dissous dans 500 µL de méthanol. La DO 299 nm de la solution

méthanolique est mesurée à l’aide d’un lecteur à plaques. Les résultats sont la moyenne ±

SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3).

Caractérisation phénotypique des souches

110

II.7.2 Production des C4-HSL

La production de C4-HSL par les 8 souches de P. aeruginosa est évaluée à l’aide de la

souche biorapporteur P. aeruginosa CGMCC 1.860. Trois souches mucoïdes (PYO2, MC75-

450457 et MC093-450507) et une souche non mucoïde (ATCC PAO1) produisent la quantité

la plus importante de C4-HSL. Les 4 autres souches produisent une quantité intermédiaire

comparable de C4-HSL (figure 55).

II.7.3 Détection et séquençage de 4 gènes du QS

Considérant que des mutations spontanées des gènes du QS, particulièrement lasR,

sont fréquentes (Sandoz et al., 2007), nous avons séquencé les 4 gènes après amplification par

PCR. Pour toutes les souches, le fragment amplifié correspond à l’amplicon attendu pour rhlI

(606 pb) et pour rhlR (727 pb). Pour les 2 autres gènes, lasI et lasR, les amplicons ont les

tailles attendues pour 7 souches. La souche ATCC PAO1 est la seule exception: lasI a la taille

correcte mais 2 fragments sont amplifiés pour lasR. Un de ces fragments a la taille attendue

(726 pb) et le deuxième est plus petit, d’environ 600 pb.

Après leur extraction et leur purification, les fragments amplifiés sont séquencés. Pour

chaque souche une recherche blast est effectuée en utilisant une combinaison des séquences

des 4 gènes. Le meilleur score pour la souche ATCC PAO1 est obtenu avec les souches de

référence suivantes: ATCC PAO1 (4384) > LESB58 (4323) > M18 (4312). Cet ordre est

différent pour les autres souches (LESB58 > M18 > ATCC PAO1) sauf pour la souche PYO1

(LESB58 > ATCC PAO1 > M18). Il faut remarquer que les scores obtenus en comparant les 8

souches étudiées avec les souches LESB58, ATCC PAO1 et M18 ne sont jamais très

différents (moins de 2 %). Les séquences des 4 gènes de toutes les souches (excepté la souche

ATCC PAO1) sont donc comparées au génome de la souche LESB58. Les séquences des

protéines sont comparées à l’aide du logiciel SIM, un logiciel permettant l’alignement de

séquences de protéines (Expasy, Switzerland).

Comme présenté dans le tableau 4, seules des mutations silencieuses sont détectées

dans les gènes lasI, rhlI et rhlR. Les souches MC099-450467 et PYO1 présentent les

mutations de lasR les plus significatives. Dans la souche MC099-450467, la mutation G584A

Figure 56 : Détection de 4 gènes du QS dans le génôme

Après extraction de l’ADN des 8 souches, les gènes lasI et lasR (figure A) et les gènes rhlI et

rhlR (figure B) sont amplifiés. Colonnes 1 et 2 : ATCC PAO1 ; colonnes 3 et 4 : MC099-

450467 ; colonnes 5 et 6 : MC093-450507 ; colonnes 7 et 8 : MC75-450457 ; colonnes 9 et 10

: PYO1 ; colonnes 11 et 12 : PYO2 ; colonnes 13 et 14 : ATCC 9027 ; colonnes 15 et 16 :

ATCC 15442. La taille des amplicons est estimée par comparaison avec le GeneRuler 100-bp

plus DNA ladder de part et d’autre du gel. Les gels sont représentatifs de 3 expériences

indépendantes (n = 3).

A

B

Caractérisation phénotypique des souches

111

introduit un codon STOP prématuré en position 195 ce qui tronque le domaine C-terminal de

la protéine (résidus 195 à 237). Dans la souche PYO1, la délétion de 2 pb provoque une

modification du cadre de lecture ce qui induit des changements majeurs dans la structure

primaire de la protéine (modification de la séquence de la protéine après l’acide aminé R122).

Trois souches ont une mutation ponctuelle modifiant le résidu 208 pour la souche MC093-

450507 (V208M) et modifiant le résidu 212 pour les souches ATCC 9027 et ATCC 15442

(M212T pour ATCC 9027 et M212V pour ATCC 15442).

Deux séquences sont obtenues pour la souche ATCC PAO1. Une de ces séquences est

identique à la séquence du gène lasR de cette souche. La deuxième séquence a une délétion

majeure entre les résidus 49 à 145 ce qui explique la taille plus petite du deuxième amplicon

observé sur le gel effectué après la PCR (628 bp au lieu de 726 bp).

Tableau 4 : Mutations des gènes lasI, lasR, rhlI et rhlR

LasI LasR RhlI RhlR

Souches Gène Protéine Gène Protéine Gène Protéine Gène Protéine

MC099-

450467 T.S. T.S. G584A W195

Stop T.S. T.S.

T147C

T364C

C396T

T.S.

MC093-

450507

G264C

G279A T.S. G622A V208M T.S. T.S.

T364C

C453A T.S.

MC75-

450457

G279A

G264C T.S. T.S. T.S. T.S. T.S.

T364C

C453A T.S.

PYO1 T150C

C441G

C531T

T.S.

G108C

C366del

C367del

Décalage

du cadre

de lecture

T.S. T.S.

T147C

T364C

C591T

T.S.

PYO2

T.S. T.S. T.S. T.S. T.S. T.S.

C258T

C453A

G567C

T.S.

ATCC

9027 T.S. T.S. T635C M212T T207C T.S.

T147C

T364C

C591T

T.S.

ATCC

15442 T.S. T.S. A634G M212V T207C T.S.

T147C

T364C

C591T

T.S.

Les séquences des 4 gènes dans 7 souches de P. aeruginosa sont comparées avec les

séquences de ces gènes chez P. aeruginosa LESB58. T.S. = Type sauvage

Figure 57 : Corrélations entre la production d’AHL et les caractéristiques

phénotypiques

C12-HSL et rhamnolipides

2500 5000 7500 100000

10

20

30

r = 0,291

Production de C12-HSL

Pro

du

cti

on

de

rh

am

no

lip

ide

s

C4-HSL et rhamnolipides

0.2 0.4 0.6 0.80

10

20

30

r = 0,787

Production de C 4-HSL

Pro

du

cti

on

de

rh

am

no

lip

ide

s

C12-HSL et protéases

0 2500 5000 7500 100000.0

0.1

0.2

0.3

r = 0,377

Production de C12-HSL

Ac

tiv

ité

pro

téo

lytiq

ue

C4-HSL et protéases

0.0 0.2 0.4 0.6 0.80.0

0.1

0.2

0.3

r = 0,021

Production de C4-HSL

Ac

tiv

ité

pro

téo

lytiq

ue

C12-HSL et formation du biofilm

0 2500 5000 7500 100000

1

2

3

r = 0,338

Production de C12-HSL

Cri

sta

l v

iole

t

C4-HSL et formation du biofilm

0.0 0.2 0.4 0.6 0.80

1

2

3

r = 0,787

Production de C4-HSL

Cri

sta

l vio

let

C12-HSL et BFRT ®

0 2500 5000 7500 100000

5

10

15

20

r = 0,111

Production de C12-HSL

BF

RT

®

C4-HSL et BFRT ®

0.0 0.2 0.4 0.6 0.80

5

10

15

20

r = 0,172

Production de C4-HSL

BF

RT

®

C12-HSL et sensibilité à la tobramycine

0 2500 5000 7500 100000

2

4

6r = 0,364

Production de C12-HSL

- L

og

(u

fc/m

L)

C4-HSL et sensibilité à la tobramycine

0.0 0.2 0.4 0.6 0.80

2

4

6r = - 0,285

Production de C 4-HSL

- L

og

(u

fc/m

L)

La production de Cn≥6-HSL (figures de gauche) et de C4-HSL (figures de droite) est comparée

à la production de rhamnolipides, l’adhésion, la formation du biofilm, la production de

protéases et la sensibilité à la tobramycine. La corrélation est mentionnée sur chaque

graphique.

Caractérisation phénotypique des souches

112

II.8 CORRELATIONS ENTRE LA PRODUCTION D’AHL ET DES

CARACTERISTIQUES PHENOTYPIQUES

La production de C4-HSL est significativement corrélée à la production de

rhamnolipides (n = 8 ; P = 0,017) ou à la formation du biofilm (n = 8 ; P = 0,017) par les

différentes souches (figure 57). Le coefficient de corrélation (coefficient de Pearson) est

proche de 1 pour ces deux corrélations (r = 0,787). Il n’y a pas d’autre corrélation

significative entre une caractéristique phénotypique des souches et leur production d’AHL.

Pour la clarté des résultats, un tableau récapitulatif de l’ensemble des propriétés des

souches est repris en annexe (annexe 1).

Caractérisation phénotypique des souches

113

III. DISCUSSION

Adhésion et formation du biofilm

Nous avons étudié la cinétique d’adhésion et de formation du biofilm par 8 souches de

P. aeruginosa à l’aide de deux méthodes, la technique du BFRT®

et la technique de coloration

par le CV.

Nos résultats indiquent que la technique du CV détecte le développement du biofilm

des 8 souches mais à des temps différents. Quatre souches développent un biofilm après 6 h.

Les 4 autres souches développent un biofilm après 24 h. Après cette phase initiale,

l’absorbance du CV augmente avec le temps et après 48 h toutes les souches montrent une

forte coloration par le CV. Ces observations sont cohérentes avec la vision actuelle que les

bactéries en général, et P. aeruginosa en particulier, résident de manière prédominante sous la

forme d’un biofilm (Costerton, 2001).

Nous n’avons pas observé de relation entre l’importance du biofilm après 48 h et la

capacité des souches à former un biofilm après 6 h : la souche PYO2 qui a une absorbance

faible après 6 h forme un des biofilms les plus importants après 48 h. A l’opposé, les souches

ATCC 9027 et ATCC 15442 adhèrent fortement à la surface du puits après 6 h mais ne

forment pas de biofilm important après 48 h. Ces résultats confirment également que le

développement d’un biofilm procède par différentes étapes distinctes (O’Toole et al., 2000).

Après 6 h nous n’avons pas observé de relation entre le caractère mucoïde ou non

mucoïde des souches et leur capacité à initier rapidement le développement d’un biofilm :

seule une des 4 souches mucoïdes (MC093-450507) est fortement colorée par le CV après 6

h. Ces résultats sont en accord avec Hay et ses collaborateurs qui ont montré que durant la

phase initiale d’attachement, la souche non mucoïde PAO1 a une adhésion plus importante

que toutes les souches mucoïdes testées (Hay et al., 2009). Après ce stade initial, la vitesse de

formation du biofilm est significativement plus importante pour les souches mucoïdes que

pour les souches non mucoïdes. Ce résultat confirme l’augmentation de la production

d’exopolysaccharides par P. aeruginosa durant la formation du biofilm (Hoyle et al., 1993).

La cinétique d’adhésion des bactéries au fond du puits, étudiée par la technique du

BFRT®, souligne également l’hétérogénéité au sein des 8 souches de P. aeruginosa. Quatre

Caractérisation phénotypique des souches

114

souches immobilisent complètement les billes en moins de 90 min. Les 4 autres souches

n’adhèrent pas aux puits après 90 min. La souche ATCC PAO1 est la souche qui s’est

attachée le plus rapidement au fond du puits et qui peut immobiliser les billes de manière

significative après 45 min seulement. Le dénombrement des bactéries adhérentes de la souche

ATCC PAO1 a révélé que 3 fois plus de bactéries sont attachées au fond du puits après 30

min en comparaison avec le nombre de bactéries attachées après 10 min.

Macé et al. (2008) et Tré-Hardy et al. (2009) ont également suggéré que les cinétiques

de formation du biofilm par P. aeruginosa varient parmi les souches mais que toutes les

souches sont capables de former un biofilm après une incubation plus longue.

Dans ce travail, nous avons comparé la capacité de 8 souches de P. aeruginosa à

adhérer à une surface et à former un biofilm par deux techniques basées sur la culture des

bactéries en microplaque. La technique du CV est une méthode assez laborieuse et la

procédure longue et non standardisée (nombre d’étapes de lavages, conditions de lavage,

durée de coloration, concentration en CV, …). Par ailleurs cette technique ne mesure pas la

viabilité cellulaire dans le biofilm mais la quantité de biomasse car aussi bien les cellules

(vivantes ou non) que la matrice sont colorées par le CV (Pitts et al., 2003). Cette technique a

été décrite pour la première fois par Christensen et al. (1985), améliorée par Stepanovic et al.

(2000) et est actuellement la plus utilisée pour quantifier l’adhésion bactérienne et la

formation de la biomasse. D’après nos résultats, la méthode du BFRT® semble aussi efficace

que le dénombrement classique des bactéries pour étudier l’adhésion des bactéries et la

formation rapide du biofilm. Les deux populations de souches (formant rapidement et

lentement un biofilm) déterminées avec le BFRT® sont similaires au groupe caractérisé par la

technique de coloration au CV après 6 h. La cohérence dans les résultats obtenus avec les

deux méthodes confirme que toutes les deux mesurent la phase initiale réversible de

l’adhésion. Une bonne corrélation entre le BFRT® et le CV a également été avancée par

Crémet et ses collaborateurs dans l’étude de la production du biofilm par différentes souches

cliniques de E. coli (Crémet et al., 2013). La technique du BFRT®

donne des résultats

significatifs plus rapidement que la méthode basée sur la coloration des bactéries et de la

matrice organique par le CV qui n’a pas montré de biofilm avant 4 h. Récemment, Liesse

Iyamba (2012) indique que la méthode du BFRT® est plus efficace et plus indiquée pour une

évaluation rapide de l’adhésion bactérienne par différentes souches de S. aureus en

comparaison avec la technique de coloration au CV qui nécessite des temps d’incubation plus

Caractérisation phénotypique des souches

115

longs pour observer une augmentation significative de l’absorbance. La technique du BFRT®

nous semble dès lors plus sensible que la technique de coloration au CV pour la détection de

l’adhésion des bactéries et des stades initiaux de la formation du biofilm. La différence de

sensibilité des deux méthodes et la meilleure sensibilité du BFRT®

peut être expliquée par

l’absence des étapes de lavage dans cette procédure et par le fait que cette méthode requiert

peu de manipulation. Le BFRT® semble donc être une méthode simple et rapide spécialement

adaptée à la détermination de la capacité de P. aeruginosa à initier la formation du biofilm.

Elle a été utilisée avec succès dans l’étude de la formation des biofilms par des bactéries

(Chavant et al., 2007), des microalgues (Badel et al., 2011) et même pour étudier des

polysaccharides (Badel et al., 2008).

Cependant, pour étudier des biofilms plus importants et à des stades plus avancés, la

technique de coloration au CV est préférée. Malgré les avantages du BFRT®, cette méthode

est rapidement saturée et ne peut donner une estimation précise de biofilms importants. Cette

conclusion rejoint celle de Liesse Iyamba et al. (2011).

En outre, nous rencontrons certains inconvénients lors de l’utilisation de la technique

du BFRT®. L’étude de l’effet d’un composé antimicrobien sur la formation du biofilm par le

BFRT® nécessite un contrôle préalable de l’effet de cet agent sur les billes magnétiques. En

absence d’effet sur la mobilité des billes, le BFRT®

permet l’étude de l’activité de divers

composés sur la formation du biofilm. Nous avons cependant mis en évidence une interaction

entre les billes magnétiques chargées positivement et négativement et le CSA-13 ou les PAM

dérivés du LL-37 rendant l’incorporation de ces composés dans l’étude sur la formation du

biofilm impossible (données non montrées). Ces interactions entre les billes et les peptides ont

été observées même à de très faibles concentrations en LL-37 (inférieures à 1 µM). Les forces

électrostatiques entre les billes chargées et le composé (CSA-13 ou peptide LL-37) ne seraient

pas responsables de cette interaction étant donné que des interférences similaires ont été

notées avec les billes portant des charges opposées. Ces interactions inattendues entre un

composant du milieu de culture et les billes ont été observées précédemment (Liesse Iyamba

et al., 2011). Les auteurs démontrent que l’ajout de la protéinase K dans le milieu du BFRT®

provoque une diminution importante de l’IFB suggérant que la suspension d’enzyme

immobilise les billes ou interfère avec leur sensibilité à l’aimant. Badel et son équipe

constatent que certains milieux de culture peuvent interférer avec la mobilité des billes et que

l’addition d’une très faible concentration de Tween 20 au milieu (0,002 %) inhibe ces

Caractérisation phénotypique des souches

116

interférences (Badel et al., 2011). Badel et al. (2008) démontrent aussi que la pronase bloque

la migration des billes et rend les analyses par le BFRT® difficiles.

Mobilité bactérienne et rhamnolipides

Le swarming est une mobilité de surface affectée non seulement par le flagelle mais

également par les pili de type IV et les rhamnolipides (Köhler et al., 2000). La mobilité de

type swarming et la production de rhamnolipides ne peuvent distinguer la population de

bactéries s’attachant rapidement à la surface du fond du puits des populations adhérant

lentement. La souche ATCC PAO1 a la plus grande mobilité de type swarming. Les autres

souches présentent une mobilité swarming beaucoup moins importante et leur mobilité n’est

pas liée à leur capacité à s’attacher rapidement à une surface ou à former un biofilm. Les

rhamnolipides sont des molécules amphipatiques composées d’un lipide hydrophobe et d’un

sucre hydrophile. Ils sont les constituants principaux des biosurfactants produits par P.

aeruginosa (Soberon-Chavez et al., 2005). Ils favorisent le swarming car ils agissent comme

agents mouillants qui réduisent la tension de surface (Caiazza et al., 2005). Trois souches

(ATCC 9027, ATCC 15442 et MC099-450467) ne produisent pas de rhamnolipides et pour la

souche PYO1 la production de rhamnolipides n’est pas significative. Parmi les 4 autres

souches, la souche MC093-450507 est la productrice de rhamnolipides la plus importante.

Cette séquence n’est pas corrélée avec la capacité des différentes souches à initier le

développement du biofilm. Le swimming est une autre forme de mobilité qui est dépendante

du flagelle (Murray et Kazmierczak, 2006). Excepté pour la souche ATCC PAO1 qui a une

activité très importante, la différence au sein des autres souches est plus faible. Les 4 souches

avec la mobilité de type swimming la plus importante sont les 4 souches avec un BFRT®

positif ou qui forment rapidement un biofilm avec la méthode de CV. Ceci est cohérent avec

la vision actuelle selon laquelle le flagelle est impliqué dans les étapes initiales du

développement du biofilm (O’Toole et Kolter, 1998b). Nos résultats confirment donc

l’importance du flagelle dans la phase d’attachement initial pour la formation du biofilm.

Sensibilité à la tobramycine

Les jeunes biofilms (24 h) formés par les souches non mucoïdes sont significativement

plus affectés par la tobramycine que les biofilms mucoïdes. Après 24 h, la formation des

biofilms par les souches mucoïdes versus non mucoïdes n’est pas significativement différente

par la technique de coloration au CV. Cette différence devient significative après 48 h.

Caractérisation phénotypique des souches

117

Aucune corrélation ne peut être établie entre la sensibilité des souches à la tobramycine et leur

capacité à former un biofilm important après 24 h (CV) ou à adhérer à une surface (BFRT®).

Activité protéolytique et élastolytique

L’activité élastolytique diffère au sein des 8 souches étudiées. Les deux souches

secrétant la plus grande quantité d’élastase sont les souches mucoïdes MC75-450457 et

ATCC PAO1. En accord avec ces résultats, ces deux souches sont également parmi les 3

souches ayant la plus grande activité protéolytique. Pratiquement aucune activité élastolytique

n’est détectée chez les autres souches. Les souches MC093-450507, ATCC 9027 et ATCC

15442 présentent une activité protéolytique importante probablement liée à d’autres protéases

que l’élastase.

Production d’AHL

Las et rhl sont 2 systèmes autoinducteurs majeurs contribuant au QS et exprimés par

P. aeruginosa. LasI et RhlI sont les enzymes qui synthétisent 3-oxo-C12-HSL et C4-HSL

respectivement. Après liaison à leur facteur de transcription respectif (LasR et RhlR), les

AHL activent la transcription de nombreux gènes (plus de 6 % du génome entier pour LasR)

(Schuster et al., 2003). Pour estimer la production de C4-HSL, nous avons utilisé une souche

de P. aeruginosa incapable de produire des C4-HSL par absence de rhlI. Cette souche

surexprime rhlR la rendant très sensible à des C4-HSL exogènes. En réponse à l’activation de

RhlR, cette souche environnementale synthétise un pigment bleu facilement détectable.

Quatre souches produisent des quantités importantes de C4-HSL. Il n’y a pas de différence

évidente entre les souches mucoïdes et non mucoïdes. La souche A. tumefaciens

NTL4(pZLR4) utilisée pour détecter Cn≥6-HSL a été conçue par Cha et ses collaborateurs

(1998). Elle exprime TraR, un facteur de transcription qui, contrairement à LasR et RhlR, est

plutôt non spécifique et répond à différentes AHL avec un groupement acyle plus long que 4

atomes de carbone (Cha et al., 1998). Ces résultats sont confirmés par CCM. L’analyse des

AHL activant TraR révèle 3 bandes distinctes qui migrent avec 3-oxo-C8-HSL, 3-oxo-C10-

HSL et 3-oxo-C12-HSL. Ces 3 AHL sont synthétisées par LasI. Il est largement accepté que

les 2 systèmes du QS de P. aeruginosa sont principalement sensibles à C4-HSL (RhlR) et à

C10- et 3-oxo-C12-HSL (LasR). Le rôle de 3-oxo-C8-HSL ou 3-oxo-C10-HSL reste incertain. Il

a été rapporté récemment que la sensibilité de P. aeruginosa à 3-oxo-C9- ou 3-oxo-C10-HSL

est régulée par la pompe à efflux MexAB-OprM (Minagawa et al., 2012). Cette pompe permet

l’efflux de 3-oxo-AHL avec un acide gras à longue chaîne. Des mutations de cette protéine

Caractérisation phénotypique des souches

118

peuvent contribuer à l’accumulation intracellulaire de 3-oxo-C10-HSL à des concentrations

suffisantes pour activer LasR. Le 3-oxo-C8-HSL qui diffuse hors de la bactérie, pourrait

interagir avec des protéines transcriptionnelles d’autres bactéries à Gram négatif pourvues

d’un régulateur de la transcription sensible à cette molécule et contribuer au développement

de biofilms multi-espèces (Riedel et al., 2001).

Séquençage

Considérant que des mutations spontanées des gènes du QS, particulièrement lasR,

sont fréquentes (Sandoz et al., 2007), nous avons séquencé 4 gènes du système : les gènes

lasI, lasR, rhlI et rhlR. L’analyse des séquences des 4 gènes révèle de fortes analogies avec la

souche P. aeruginosa LESB58. La souche hypervirulente LESB58 a été identifiée pour la

première fois en 1996 chez des patients atteints de mucoviscidose (Cheng et al., 1996). Nos

résultats suggèrent que 7 souches étudiées dans ce travail sont probablement dérivées de la

souche P. aeruginosa LESB58. Trois gènes de ces 7 souches (lasI, rhlI et rhlR) sont très

similaires aux gènes de la souche LESB58. LasR est le seul gène avec des mutations affectant

la structure de la protéine. Ces résultats sont cohérents avec des observations rapportant que

les souches cliniques de P. aeruginosa isolées de patients atteints de mucoviscidose montrent

un grand taux de mutations du gène lasR : après colonisation des poumons de ces patients, 60

% des isolats portent une mutation de lasR (Smith et al., 2006). Dans notre étude, 2 souches

(PYO1 et MC099-450467) ont des mutations provoquant une altération majeure de la protéine

(codon STOP prématuré et expression d’une protéine raccourcie ; décalage du cadre de

lecture et changements dans la structure primaire de la protéine). Ces altérations majeures de

LasR pourraient expliquer la faible quantité d’AHL produites par les souches PYO1 et

MC099-450467 (plus d’amplification du système par auto-induction). Trois autres souches

ont une mutation faux sens dans l’hélice-α impliquée dans la liaison de LasR à l’ADN

(Bottomley et al., 2007). Une de ces mutations (V208M dans la souche MC093-450507)

affecte un résidu conservé mais le rôle de cette valine n’a pas été défini (Bottomley et al.,

2007). Sa substitution par un autre acide aminé hydrophobe ne devrait pas affecter l’activité

de la protéine. Les deux autres mutations concernent la méthionine 212. Cet acide aminé

appartient à une hélice-α interagissant avec l’ADN (Bottomley et al., 2007). Il est substitué

soit par une valine, un autre acide aminé hydrophobe (ATCC 15442), soit par une thréonine,

un résidu polaire (ATCC 9027). Cette mutation peut expliquer la faible quantité d’AHL

observée avec cette souche. Deux gènes lasR sont amplifiés dans la souche de référence

ATCC PAO1. Un de ces gènes a une délétion qui recouvre la majeure partie du fragment

Caractérisation phénotypique des souches

119

amplifié. L’expérience est répétée avec une autre souche ATCC PAO1 obtenue par le Dr O.

Vandeputte (Vandeputte et al., 2011). Seul un amplicon lasR est observé avec cette souche

(données non montrées) confirmant qu’une mutation est apparue dans notre souche ATCC

PAO1 pendant la conservation. Des mutations spontanées de la souche ATCC PAO1

apparaissant après plusieurs passages ont été décrites par Klockgether et al. (2010). Sandoz et

al. (2007) suggèrent que ces mutations apparaissent sous des conditions dans lesquelles les

nutriments sont en abondance et les signaux de QS absents. D’après ces auteurs, une souche

compétente en QS et une souche déficiente en QS, souche « tricheuse », pourraient coexister

dans une population hétérogène.

Corrélations AHL et phénotype

La présence d’AHL dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose et

infectés par P. aeruginosa a été remarquée pour la première fois par Singh et al. (2000). Ces

résultats ont été en partie confirmés par Middleton et ses collaborateurs qui ont détecté et testé

dans les expectorations de certains patients atteints de mucoviscidose des AHL avec des

groupements acyls de 4 à 12 carbones (Middleton et al., 2002). Erickson et ses collègues ont

rapporté que P. aeruginosa synthétise 3-oxo-C12-HSL dans les poumons de patients atteints

de mucoviscidose (Erickson et al., 2002). A partir de tels résultats il a été suggéré que la

formation d’un biofilm par P. aeruginosa, et donc sa pathogénicité, est corrélée avec sa

capacité à libérer des AHL (Høiby et al., 2010b).

Nous avons donc comparé certaines caractéristiques phénotypiques des 8 souches avec

leur capacité à produire des AHL. Nos résultats n’ont pas illustré de corrélation entre la

production de Cn≥6-HSL et l’adhésion des bactéries (BFRT®), leur production de biofilm

(CV), leur sensibilité à la tobramycine, leur sécrétion de protéases ou leur production de

rhamnolipides. Des résultats similaires ont été démontrés par Perez et al. (2013) qui n’ont pas

détecté de lien dans la capacité de souches cliniques et non cliniques de P. aeruginosa à

former un biofilm et à produire des AHL. Nous avons cependant mis en évidence une

corrélation entre la production de C4-HSL et la production de rhamnolipides. Cette corrélation

est secondaire à la régulation de l’opéron rhlAB par le complexe RhlR-C4-HSL (Ochsner et

Reiser, 1995). La production de C4-HSL est aussi corrélée avec la formation d’un biofilm

(CV) mais pas avec l’attachement initial des bactéries sur une surface abiotique (BFRT®), la

sensibilité à la tobramycine ou la sécrétion de protéases.

Caractérisation phénotypique des souches

120

Nos résultats suggèrent dès lors que l’essai de la production des C4-HSL a une certaine

valeur prédictive sur la tendance d’une souche à former un biofilm. En outre, ils illustrent la

variabilité de la production d’AHL et la difficulté de prédiction du comportement des

souches.

Conclusion

Dans la première partie de ce travail, nous soulignons la diversité phénotypique et

génotypique des 8 souches de P. aeruginosa et dès lors la complexité pour l’étude de

traitements potentiels sur ces souches. La capacité d’une souche à adhérer rapidement à une

surface ou à former un biofilm important ne semble pas prédire sa sensibilité à un

antibiotique. Etant donné la difficulté de prédiction du comportement de la souche en fonction

de son phénotype, l’étude de l’activité d’un agent antimicrobien sur une large collection de

souches permettra de s’approcher au mieux de l’effet réel attendu chez le patient.

La suite du travail consistera à évaluer le potentiel de nouveaux agents antimicrobiens

dans le traitement d’infections à P. aeruginosa liées à la formation d’un biofilm, pour

contourner l’émergence de la résistance développée avec les antibiotiques conventionnels.

L’étude de l’activité d’un nouvel antibiotique potentiel (CSA-13) sera réalisée sur les

biofilms formés par les 8 souches de P. aeruginosa afin d’élargir le panel des phénotypes et

génotypes des souches étudiées.

Un screening de l’effet antibactérien et antibiofilm de peptides cationiques dérivés du

LL-37 sera réalisé sur la souche la plus documentée dans la littérature sur la mucoviscidose, la

souche ATCC PAO1. Etant donné ses propriétés d’adhésion très rapide et importante au fond

du puits en comparaison aux autres souches (BFRT®), ainsi que sa capacité à former un

biofilm important (CV), la souche ATCC PAO1 semble être un bon modèle pour l’étude d’un

screening de l’activité d’agents antimicrobiens. Cette souche est également celle dont les

mobilités swimming et swarming sont les plus importantes et qui produit une grande quantité

de rhamnolipides, de protéases (dont l’élastase) et d’AHL, autant de facteurs susceptibles de

contribuer à la virulence du pathogène.

Etude du CSA-13

121

CHAPITRE II

ETUDE DU CSA-13

Etude du CSA-13

122

I. INTRODUCTION

Dans la lutte pour combattre les infections pulmonaires à P. aeruginosa chez les

patients atteints de mucoviscidose et l’apparition de souches multirésistantes, de nouvelles

stratégies thérapeutiques sont développées. L’administration par inhalation des antibiotiques a

permis d’augmenter considérablement la concentration locale des composés dans les

expectorations des patients en comparaison avec l’administration intraveineuse (Flume,

2008). De nouvelles associations d’antibiotiques ont été préconisées pour cibler non

seulement la bactérie mais également le biofilm qu’elle forme (Kaplan, 2010 ; Tré-Hardy et

al., 2009). La combinaison des antibiotiques avec des molécules contribuant au système

immunitaire inné est une autre option thérapeutique envisagée pour combattre les souches

multirésistantes (Rosenthal, 2006). Dans ce but, les PAM ont suscité un grand intérêt

puisqu’ils sont peu susceptibles d’induire une résistance et possèdent un large spectre

d’activité. Ces peptides sont caractérisés par une structure amphipatique et agissent par

déstabilisation de la membrane bactérienne (Guani-Guerra et al., 2010). Cependant,

l’utilisation in vivo des PAM comme agents antibactériens présente des inconvénients qu’il

faut résoudre avant de tirer pleinement profit de ces molécules. Parmi les stratégies explorées

pour contourner la fragilité des PAM rencontrée sous des conditions physiologiques, le

développement de dérivés peptido-mimétiques offre des alternatives potentielles. Les

céragenines sont une famille de molécules dérivées de l’acide cholique auxquelles des

groupements aminoalkyls ont été ajoutés (Epand et al., 2008). Ces molécules ont été

synthétisées dans le but de mimer la structure amphipatique des PAM (Ding et al., 2002).

Contrairement à ces derniers, les céragenines sont résistantes aux protéases et ne sont pas

inactivées par les composants du biofilm (Bucki et al., 2007b).

Dans une deuxième partie de ce travail, nous avons investigué le potentiel d’activité

d’un composé appartenant à la famille des céragenines, le CSA-13, dans l’éradication des

infections liées à P. aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose. Nous avons

exploré l’effet du composé sur les différents aspects de la colonisation bactérienne. L’activité

du CSA-13 sur culture planctonique, sur la formation du biofilm, sur biofilm jeune et sur

biofilm mature a été étudiée sur différentes souches de P. aeruginosa, comprenant des

souches de référence et des souches cliniques. L’intérêt d’administrer une association

Etude du CSA-13

123

d’agents antimicrobiens, le CSA-13 et la tobramycine, pour combattre le biofilm de P.

aeruginosa a été exploré. La MCBL a permis de caractériser l’activité de l’antibiotique

stéroïde cationique dans l’architecture tridimensionnelle du biofilm. Des études in vitro de la

toxicité cellulaire du composé ont également été réalisées et l’atténuation de la toxicité par

association du CSA-13 avec l’acide pluronique F-127 a été investiguée.

Tableau 5 : Détermination de la CMI et de la CMB

Souche Tobramycine CSA-13

CMI CMB CMI CMB

ATCC PAO1 2-4 4 6-12 12

ATCC 9027 1-2 2-4 3 6

ATCC 15442 2 2-4 3 6-12

PYO1 8 8 1 3-6

PYO2 2 2-4 1,5 6-12

MC75-450457 < 1 2 6 12-25

MC099-450467 < 2 16 3 6

MC093-450507 16 62-125 6 6-12

La détermination de la CMI est réalisée par la technique de microdilution de 2 en 2

conformément au protocole du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2003).

Après 24 h d’incubation à 35 °C, les résultats sont lus par observation de l’absence de

turbidité. Les puits clairs de cette même microplaque sont repiqués et après 24 h d’incubation

à 35 °C la CMB est déterminée. Les résultats sont exprimés en mg/L et sont la moyenne de 3

expériences.

Figure 58 : Effet du CSA-13 sur l’insertion membranaire du NPN

PAO1

0 25 50 75 1000

25

50

75

100

CSA-13 (mg/L)

Flu

ore

sc

en

ce

(%

du

ma

xim

um

)

MC093-450507

0 25 50 75 1000

20

40

60

80

100

CSA-13 (mg/L)

Flu

ore

sc

en

ce

(%

du

ma

xim

um

)

PYO1

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

CSA-13 (mg/L)

Flu

ore

sc

en

ce

(%

du

ma

xim

um

)

Des cultures planctoniques de 3 souches de P. aeruginosa sont incubées en présence de NPN

et de différentes concentrations en CSA-13. Les résultats sont exprimés comme variation de la

fluorescence ± SEM après 10 min d’exposition au CSA-13. Les résultats sont ajustés à l’aide

de l’équation d’une hyperbole à une composante et sont la moyenne de 3 expériences

indépendantes réalisées en triplicat (n = 3).

Etude du CSA-13

124

II. RESULTATS

II.1 EFFET DU CSA-13 SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES

II.1.1 Détermination de la CMI et de la CMB

Les cultures planctoniques de 8 souches de P. aeruginosa sont étudiées pour leur

sensibilité au CSA-13 et à la tobramycine. La CMI varie de 1 mg/L pour la souche PYO1 à 12

mg/L pour la souche ATCC PAO1. Les CMB sont légèrement plus élevées (de 2 à 8 fois)

avec la souche MC75-450457 qui est la moins sensible au CSA-13 (CMI de 12 à 25 mg/L).

Le ratio CMI/CMB varie de 1 à 8 suggérant que le CSA-13 est principalement bactéricide.

Sept souches sont de sensibilité égale à la tobramycine (CMI entre 1 et 8 mg/L). La CMB

pour la tobramycine est dans la même gamme de concentrations, très similaire à la CMI pour

chaque souche. Une souche (MC093-450507) est nettement moins sensible à la tobramycine

(CMI à 16 mg/L et CMB à 62-125 mg/L).

II.1.2 Effet du CSA-13 sur la perméabilité au NPN

La perturbation membranaire de 3 souches de P. aeruginosa (ATCC PAO1, PYO1 et

MC093-450405) après exposition à différentes concentrations de CSA-13 est mesurée à l’aide

d’un essai de perméabilité au NPN. Comme le montre la figure 58, des concentrations en

CSA-13 entre 1 et 10 mg/L provoquent une augmentation de la fluorescence reflétant une

perturbation de la membrane bactérienne. La courbe dose-réponse est analysée par ajustement

de la courbe expérimentale à l’équation d’une hyperbole à une composante (r2

= 0,543

(MC093-450405) ; 0,852 (ATCC PAO1) et 0,919 (PYO1)). La concentration mi-maximale de

saturation en CSA-13 pour les 3 souches est de 4,4 ± 0,7 mg/L (n = 3). Cette valeur est très

proche de la CMB des différentes souches et souligne l’importance de l’interaction entre le

CSA-13 et la membrane bactérienne dans l’effet bactéricide du composé. La courbe dose-

réponse du CSA-13 sur l’insertion du NPN est similaire pour les 3 souches, confirmant que

les cultures planctoniques de ces 3 souches sont de manière égale hautement sensibles au

CSA-13.

Figure 59 : Effet du CSA-13 sur la formation d’un biofilm

Souches non mucoïdes

PAO1 PYO1 ATCC 9027 ATCC 154420

1

2

3

4

Contrôle 24h

CSA-13 24h

CSA-13 48h

Contrôle 48h

*

AD

O5

40

nm

Souches mucoïdes

MC093 PYO2 MC099 MC750

1

2

3

4Contrôle 24h

CSA-13 24h

CSA-13 48h

Contrôle 48h

*

*

B

DO

54

0 n

m

L’effet du CSA-13 sur la formation d’un biofilm par 4 souches non mucoïdes (figure A) et 4

souches mucoïdes (figure B) est évalué par la technique de coloration au CV après 24 et 48 h.

Les résultats sont la moyenne ± SEM de 9 valeurs obtenues dans 3 expériences indépendantes

réalisées en triplicat (n = 9). * P < 0,05.

Etude du CSA-13

125

II.2 EFFET DU CSA-13 SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM

II.2.1 Effet d’une faible concentration en CSA-13 sur la formation d’un

biofilm

L’effet du CSA-13 sur la formation du biofilm par les 8 souches bactériennes est

évalué par la technique de coloration au CV après 24 et 48 h d’incubation. La capacité des

souches à former un biofilm est très variable. La formation du biofilm par la souche ATCC

PAO1, une des 2 souches non mucoïdes formant un biofilm important, est significativement

affectée par une administration préventive de 1 mg/L de CSA-13 (figure 59 A). Le composé

stéroïdien permet une diminution de l’absorbance de 3,3 ± 0,4 à 1,5 ± 0,5 unités d’absorbance

(u.a.) (P < 0,05 ; n = 8) après 48 h. Parmi les 4 souches mucoïdes, le CSA-13 inhibe

significativement la formation du biofilm par les souches MC75-450457 et MC099-450467

mais aucun effet apparent n’est observé sur les souches MC093-450507 et PYO2 (figure 59

B). Après 48 h d’incubation, le composé stéroïdien diminue l’absorbance de 2,0 ± 0,5 u.a. (n

= 8) à 0,6 ± 0,3 u.a. (n = 7 ; P < 0,05) pour la souche MC75-450457 et de 1,9 ± 0,7 u.a. (n =

8) à 0,3 ± 0,1 u.a. (n = 9 ; P < 0,05) pour la souche MC099-450467. En conclusion, une

concentration en CSA-13 très faible (jusqu’à 10 fois plus faible que la CMI) inhibe la

biomasse de 3 des 8 souches testées (les souches ATCC PAO1, MC75-450457 et MC099-

450467).

Figure 60 : Spectres de fluorescence du CSA-119

Spectre d'émission

CSA-119

400 450 500 550 6000

50000

100000

150000

200000

250000

A

Longueur d'onde (nm)

Flu

ore

scen

ce (

u.a

.f.)

Spectre d'excitation

CSA-119

250 300 350 400 4500

20000

40000

60000

80000

100000

B

Longueur d'onde (nm)

Flu

ore

scen

ce (

u.a

.f)

Spectre d'émission

PBS et CSA-119

400 450 500 550 6000

200000

400000

600000

C

Longueur d'onde (nm)

Flu

ore

scen

ce (

u.a

.f.)

Spectre d'émission

PAO1 et CSA-119

350 400 450 500 550 6000

200000

400000

600000

D

Longueur d'onde (nm)

Flu

ore

scen

ce (

u.a

.f.)

Figures A et B : Les spectres d’émission (figure A) et d’excitation (figure B) du CSA-119 à

la concentration de 2 mg/L dans un tampon PBS sont obtenus à l’aide d’un fluorimètre.

Figures C et D : Le spectre d’émission du CSA-119 à la concentration de 2 mg/L dans un

tampon PBS est mesuré à l’aide d’un fluorimètre en absence (figure C) ou en présence (figure

D) d’une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1.

Figure 61 : Cinétique de l’interaction entre le CSA-119 et la souche ATCC PAO1

0 200 400 600 800

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

350000 mg/L

1 mg/L

2 mg/L

5 mg/L

6 mg/L

Temps (s)

Flu

ore

sc

en

ce

(u

.a.f

.)

Une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1 est incubée en présence de 5

concentrations de CSA-119 dans un tampon PBS dans des plaques 96-puits. La fluorescence

de chaque puits est mesurée à intervalle de 40 sec. Les résultats sont corrigés en fonction de la

photodégradation de la sonde et sont exprimés comme variation de la fluorescence en fonction

du temps (à chaque temps et chaque concentration en CSA-119, les résultats reflètent la

différence entre la variation de fluorescence mesurée en absence et en présence des bactéries).

Ils sont la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3).

Etude du CSA-13

126

II.2.2 Etude de la cinétique d’interaction du CSA-119 avec 8 souches de

P. aeruginosa

Nous avons démontré que l’administration préventive de CSA-13 à une concentration

de 1 mg/L inhibe la formation de biofilm par les souches MC099-450467, ATCC PAO1 et

MC75-450457. L’interaction entre le CSA-13 et les bactéries est étudiée à l’aide d’un

analogue fluorescent du CSA-13 (greffement du groupement dansyle), le dérivé CSA-119,

dans le but de mettre en évidence une éventuelle corrélation entre la sensibilité au CSA-13 et

les propriétés membranaires des souches. Dans un premier temps, les spectres d’émission et

d’excitation de la molécule (à une concentration de 2 mg/L) ont été établis dans un tampon

PBS (figure 60 A et B). Ceux-ci ont permis d’obtenir les longueurs d’onde d’excitation (345

nm) et d’émission (495 nm) optimales de la sonde fluorescente. La mesure de l’interaction du

CSA-119 avec les souches bactériennes repose sur l’environnement lipophile de l’agent

fluorescent dansyle greffé au CSA-13. La translocation du CSA-119 d’un environnement

polaire (tampon) vers un compartiment hydrophobe (membrane bactérienne) provoque une

augmentation de l’intensité de la lumière émise à 495 nm après excitation à 345 nm (figure 60

C et D).

La souche ATCC PAO1 est ensuite exposée à différentes concentrations de CSA-119

et une cinétique de la fluorescence est enregistrée. Comme le montre la figure 61, la vitesse de

l’augmentation de l’intensité de fluorescence varie en fonction de la concentration en CSA-

119 (concentrations de 1 à 6 mg/L). Une concentration plus importante en CSA-119 induit

une augmentation plus importante de la fluorescence.

Figure 62 : Interaction entre le CSA-119 et les 8 souches de P. aeruginosa

ATC

C 1

5442

PYO1

PAO1

ATC

C 9

027

PYO2

MC75

MC09

3

MC09

90

5000

10000

15000

20000 Souches

non mucoïdes

Souches

mucoïdes

Souches de référence

Souches cliniquesF

luo

res

ce

nc

e (

u.a

.f.)

Les 8 souches de P. aeruginosa sont incubées en présence de 2 mg/L de CSA-119 pendant 12

min. Les résultats sont corrigés en fonction de la photodégradation et sont exprimés comme

variation de la fluorescence en fonction du temps (pour chaque temps et chaque concentration

en CSA-119 les résultats reflètent la différence entre la variation de fluorescence mesurée en

absence et en présence des bactéries). Ils sont la moyenne ± SEM de 3 expériences

indépendantes réalisées en triplicat (n = 3).

Figure 63 : Effet du CSA-13 sur la production de rhamnolipides

MC093-450507 PAO1 MC75-4504570

10

20

30

40

50Contrôle

+ CSA-13 1 mg/L

5

4

6

3

33

n=

Co

nc

en

tra

tio

n e

n r

ha

mn

os

e

(µg

/mL

)

Les souches MC75-450457, MC093-450507 et ATCC PAO1 sont incubées pendant 48 h en

absence ou en présence de CSA-13 à 1 mg/L. La production de rhamnose par les trois souches

est évaluée par la méthode à l’orcinol – acide sulfurique. Les résultats sont exprimés en µg de

rhamnose/mL dans le bouillon de culture. Ils sont la moyenne ± SEM de 3 à 6 expériences

indépendantes réalisées en triplicat.

Etude du CSA-13

127

Afin de comparer la sensibilité membranaire des 8 souches de P. aeruginosa au CSA-

119, la fluorescence lue après un temps arbitraire d’exposition (12 min) à une concentration

arbitraire de CSA-119 (2 mg/L) est représentée (figure 62). L’interaction de la membrane

bactérienne avec le CSA-119 est différente selon les souches ; certaines suspensions

bactériennes présentent une intensité de fluorescence plus élevée corrélée avec une plus

grande sensibilité membranaire au CSA-119 (ATCC PAO1 > MC75-450457 > ATCC 9027 >

ATCC 15442 > PYO1 > MC099-450467 > MC093-450507 > PYO2).

II.2.3 Effet du CSA-13 sur la production de rhamnolipides

Les rhamnolipides sont des surfactants pouvant contribuer à la formation du biofilm.

Nous avons démontré précédemment que 3 souches sur les 8 souches de P. aeruginosa (les

souches MC093-450507, MC75-450457 et ATCC PAO1) produisent une quantité importante

de rhamnolipides (figure 49). Afin d’étudier l’effet d’une longue exposition au CSA-13 sur la

production de rhamnolipides par ces souches, les souches MC093-450507, MC75-450457 et

ATCC PAO1 sont incubées pendant 48 h en présence ou non de 1 mg/L de CSA-13 (figure

63). La quantité de rhamnolipides dans le milieu de culture est évaluée par dosage du sucre en

utilisant la méthode de coloration à l’orcinol en milieu acide. Les souches MC093-450507,

MC75-450457 et ATCC PAO1 produisent respectivement 30 ± 6 (n = 5) ; 20 ± 3 (n = 6) et 26

± 6 (n = 4) µg/mL de rhamnose. Le traitement des 3 souches par le CSA-13 n’a pas démontré

d’effet significatif sur la production de rhamnose.

Figure 64 : Distribution du potentiel zêta des 4 souches mucoïdes de P. aeruginosa

PYO2

-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750

50000

100000

150000

- 41 mV (46 %)

- 18 mV (19 %)

+ 4 mV (35 %)

- 21 22 mV

Potentiel zêta (mV)

Co

mp

tag

e

MC75-450457

-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750

50000

100000

150000

200000

- 56 mV (54 %)

- 40 mV (45 %)

- 50 10 mV

Potentiel zêta (mV)

Co

mp

tag

e

MC093-450507

-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750

50000

100000

150000

200000

- 34 mV (64 %)

- 55 mV (35 %)

- 42 13 mV

Potentiel zêta (mV)

Co

mp

tag

e

MC099-450467

-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750

50000

100000

150000

200000

- 49 8 mV

Potentiel zêta (mV)

Co

mp

tag

e

Figure 65 : Distribution du potentiel zêta de 4 souches non mucoïdes de P. aeruginosa

ATCC 9027

-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750

50000

100000

150000

200000

- 28,5 mV (91 %)

- 49,3 mV (9 %)

- 30 9 mV

Potentiel zêta (mV)

Co

mp

tag

e

ATCC 15442

-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750

100000

200000

300000

- 28 5 mV

Potentiel zêta (mV)

Co

mp

tag

e

PYO1

-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750

50000

100000

150000

200000

- 50 mV (25 %)

- 17,1mV (22 %)

1,68 mV (32 %)

-23 22 mV

Potentiel zêta (mV)

Co

mp

tag

e

PAO1

-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750

50000

100000

150000- 18,8 mV (60 %)

- 52,4 mV (40 %)

- 32 19 mV

Potentiel zêta (mV)

Co

mp

tag

e

La distribution du potentiel zêta des 4 souches mucoïdes (figure 64) et des 4 souches non

mucoïdes (figure 65) de P. aeruginosa en suspension dans un tampon phosphate 10 mM (pH

7,0) est mesurée à l’aide du Zetasizer Malvern Nano ZS. La mesure du potentiel zêta est

réalisée 3 fois pour 2 concentrations de chaque suspension bactérienne et 3 lots différents de

chaque échantillon sont mesurés. Chaque tracé est représentatif de 18 tracés. L’analyse de la

courbe est représentée (moyenne ± SD du potentiel zêta de la population entière et

éventuellement des sous-populations significatives avec le pourcentage respectif de ces sous-

populations).

Etude du CSA-13

128

II.2.4 Etude du potentiel zêta

Le potentiel zêta des 8 souches de P. aeruginosa est étudié à l’aide d’un instrument

Malvern Nanosizer ZS (Malvern, Worcestershire, UK). La distribution du potentiel zêta est

différente au sein des 8 souches de P. aeruginosa (figures 64 et 65). Deux souches (ATCC

15442 et MC099-450467) présentent une distribution unimodale du potentiel zêta avec un pic

étroit reflétant une faible dispersion des résultats pour chaque mesure. La souche ATCC

15442 présente un potentiel zêta de -30,9 ± 0,7 mV (n = 6) et la souche MC099-450467 de -

53 ± 1 mV (n = 6). Cette divergence entre les deux souches est significative (P < 0,001).

Quatre autres souches (MC75-450457, MC093-450507, ATCC PAO1 et ATCC 9027) ont une

distribution plus étendue du potentiel avec l’apparition d’un deuxième pic. La souche ATCC

PAO1 présente clairement une distribution bimodale (-57 ± 1 mV ; 18 ± 3 % pour le premier

pic et -25,6 ± 0,9 mV ; 80 ± 3 % pour le deuxième pic). La moyenne du potentiel zêta pour

ces 4 souches varie de -49,7 ± 0,9 mV (n = 6) pour MC093-450507 à -30,8 ± 0,3 mV (n = 6)

pour ATCC PAO1. Enfin, les deux dernières souches, PYO1 et PYO2, ont un potentiel zêta

moyen aux alentours de -20 mV. Ces dernières souches présentent une large dispersion du

potentiel zêta allant de +15 à -65 mV.

Figure 66 : Potentiel zêta moyen des 8 souches de P. aeruginosa

ATC

C 1

5442

PYO1

PAO1

ATC

C 9

027

PYO2

MC75

MC09

3

MC09

90

10

20

30

40

50

60

Souches de référence

Souches cliniques

Souches

non mucoïdes

Souches

mucoïdesP

ote

nti

el zê

ta (

- m

V)

Le potentiel zêta moyen des 8 souches de P. aeruginosa en suspension dans un tampon

phosphate 10 mM (pH 7,0) est mesuré à l’aide du Zetasizer Malvern Nano ZS. Les résultats

sont la moyenne ± SEM des 6 essais réalisés en triplicat pour chaque souche (n = 6).

Etude du CSA-13

129

La moyenne du potentiel zêta des 4 souches mucoïdes est de -40 ± 7 mV et de -30 ± 3

mV pour les souches non mucoïdes. Cette différence entre les 2 potentiels est significative (P

= 0,0013). Il n’y a pas de différence significative (P = 0,2635) entre le potentiel zêta des 3

souches de référence (ATCC 15442, ATCC 9027 et ATCC PAO1 : -32,1 ± 0,5 mV) et celui

des 5 souches cliniques (PYO1, PYO2, MC75-450457, MC099-450467 et MC093-450507 : -

37 ± 8 mV).

Tableau 6 : Effet du CSA-13 et de la tobramycine sur un biofilm jeune

PYO1 PYO2 MC75-450457 ATCC 9027

Moy SD Moy SD Moy SD Moy SD

CSA 5 -0,1 0,3 0,1 0,1 -0,2 0,5 0,1 0,1

CSA 20 6,1* 0,1 1,2 0,1 -0,9 0,1 -0,7 0,1

CSA 50 6,1* 0,1 2,2 0,3 5,6* 0,1 -0,7 0,1

CSA 100 6,1* 0,1 6,3* 0,1 5,6* 0,1 2,9 0,1

CSA 200 6,1* 0,1 6,3* 0,1 5,6* 0,1 4,5* 0,1

TOB 4 6,1* 0,1 0,8 0,2 2,0 0,7 3,5 0,2

TOB 4 / CSA 5 6,1* 0,1 0,6 0,1 0,9 0,3 3,9 0,3

TOB 4 / CSA 20 6,1* 0,1 1,0 0,6 5,6* 0,1 3,5 0,2

TOB 4 / CSA 50 6,1* 0,1 6,3* 0,1 5,6* 0,1 3,3 0,1

TOB 4 / CSA 100 6,1* 0,1 6,3* 0,1 5,6* 0,1 3,8 0,1

TOB 4 / CSA 200 6,1* 0,1 6,3* 0,1 5,6* 0,1 4,5* 0,1

MC099-450467 MC093-450507 ATCC 15442 ATCC PAO1

Moy SD Moy SD Moy SD Moy SD

CSA 5 -0,4 0,1 0,6 0,0 -0,4 0,1 0,2 0,1

CSA 20 4,6 0,1 0,3 0,5 -0,6 0,3 1,1 0,7

CSA 50 6,3* 0,1 1,2 0,3 -0,4 0,1 1,8 0,2

CSA 100 6,3* 0,1 1,3 0,2 1,1 0,1 6,0* 0,1

CSA 200 6,3* 0,1 1,8 0,1 5,2* 0,1 6,0* 0,1

TOB 4 1,6 0,1 0,1 0,1 3,8 0,3 5,0 0,1

TOB 4 / CSA 5 2,8 0,1 -0,1 0,3 3,3 0,2 3,2 0,1

TOB 4 / CSA 20 6,3* 0,1 0,4 0,5 5,2* 0,1 2,0 0,1

TOB 4 / CSA 50 6,3* 0,1 1,4 0,1 5,2* 0,1 6,0* 0,1

TOB 4 / CSA 100 6,3* 0,1 2,8 0,1 5,2* 0,1 6,0* 0,1

TOB 4 / CSA 200 6,3* 0,1 6,1* 0,1 5,2* 0,1 6,0* 0,1

Les résultats sont présentés en diminution logarithmique du nombre d’ufc/mL. Ils sont la

moyenne de 2 expériences (n = 2). Nombres en gras = synergie entre la tobramycine et le

CSA-13 ; nombres en italique = inhibition entre la tobramycine et le CSA-13 ; * = limite de

détection atteinte.

Etude du CSA-13

130

II.3 EFFET DU CSA-13 SUR UN BIOFILM PREFORME

II.3.1 Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé – étude par

dénombrement

II.3.1.1 Effet du CSA-13, seul ou en combinaison avec la tobramycine à 4 mg/L, sur

un biofilm jeune

L’activité du CSA-13 seul ou lors d’une co-administration avec la tobramycine est

étudiée sur des biofilms de 24 h par un dénombrement bactérien. Les résultats sont ajustés

avec l’équation d’une hyperbole à une composante (r2

= 0,986 pour le CSA-13 seul et r2

=

0,970 pour le CSA-13 en co-administration avec la tobramycine) (figure 67). Le CSA-13 à

des concentrations plus élevées que 5 mg/L diminue le nombre d’ufc/mL de manière dose-

dépendante. La concentration mi-maximale de CSA-13, réduisant de 50 % le nombre de

bactéries vivantes dans le biofilm, atteint en moyenne 88 mg/L pour les 8 souches. A une

concentration maximale (100 à 200 mg/L), le composé réduit le nombre d’ufc/mL de 5 log.

L’analyse des résultats obtenus pour chaque souche révèle que la différence de sensibilité au

CSA-13 entre les souches est plus importante au sein du biofilm qu’en culture planctonique.

Comme présenté dans le tableau 6, 50 mg/L de CSA-13 détruisent la totalité du biofilm jeune

formé par les souches PYO1, MC75-450457 et MC099-450467. Le CSA-13 à 100 mg/L

permet l’éradication de l’entièreté du biofilm formé par 5 souches (PYO1, PYO2, ATCC

PAO1, MC75-450457 et MC099-450467). Parmi ces 5 souches, PYO1 est la plus sensible. En

effet, à une faible concentration de 20 mg/L, le CSA-13 permet l’éradication complète du

biofilm PYO1. MC093-450507 est la souche la plus résistante : à 200 mg/L la diminution

logarithmique du nombre d’ufc/mL est inférieure à 2. A 200 mg/L, les 7 autres souches sont

très sensibles au CSA-13 et la limite de détection est atteinte pour ces 7 souches.

La tobramycine à 4 mg/L diminue le nombre d’ufc/mL de seulement 3 log (moyenne

pour les 8 souches). On observe une très grande hétérogénéité de la sensibilité des 8 souches à

la tobramycine : PYO1 est très sensible à l’aminoglycoside (diminution de plus de 6 log) alors

que les souches PYO2 et MC093-450507 ne répondent pas à l’antibiotique.

Figure 67 : Effet du CSA-13 et de la tobramycine sur un biofilm jeune

0 50 100 150 200

0

1

2

3

4

5

6

CSA-13

Tobramycine 4 mg/L + CSA-13

CSA-13 (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

Les biofilms sont formés sur les pointes d’un couvercle après exposition pendant 24 h à 8

souches de P. aeruginosa. Les biofilms sont ensuite mis en contact pendant 24 h avec

différentes concentrations en CSA-13 seul (triangles fermés) ou en association avec la

tobramycine à 4 mg/L (cercles ouverts). Les résultats sont exprimés en variations

logarithmiques du nombre d’ufc/mL mesuré avant et après exposition au traitement. Ce sont

les moyennes ± SEM des résultats obtenus avec les 8 souches (n = 8). Les résultats sont

ajustés avec l’équation d’une hyperbole à une composante.

Etude du CSA-13

131

L’addition de faibles concentrations en CSA-13 potentialise l’effet de la tobramycine.

Cet effet est démontré par la diminution importante de la concentration mi-maximale de

l’antibiotique stéroïde cationique (moins de 10 mg/L) (figure 67). Une synergie d’action entre

la tobramycine et le CSA-13 est observée pour 5 souches (PYO2, MC075-450457, MC099-

450467, MC093-450507 et ATCC 15442) : la diminution logarithmique observée avec une

co-administration est plus importante que l’addition des effets des composés utilisés

séparément (tableau 6). Seule la souche ATCC PAO1 montre une activité antagoniste entre la

tobramycine et le CSA-13. Des faibles concentrations en CSA-13 (5 et 20 mg/L) inhibent

l’effet bactéricide de l’aminoglycoside. Cependant, la co-administration de la tobramycine

avec des concentrations plus élevées en CSA-13 entraîne une diminution logarithmique de 6

et plus aucune bactérie viable n’est détectable.

Figure 68 : Effet du CSA-13 sur un biofilm mature

Effet du CSA-13 seul

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10CSA-13 5 mg/L

CSA-13 20 mg/L

CSA-13 100 mg/L

CSA-13 200 mg/L

CSA-13 50 mg/L

A

Temps (jours)

- L

og

(u

fc/m

L)

Interaction entre la tobramycine et le CSA-13

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8Tob 4 mg/L

Tob + CSA 5 mg/L

Tob + CSA 20 mg/L

Tob + CSA 50 mg/L

B

Temps (jours)

- L

og

(u

fc/m

L)

Les biofilms sont formés sur les pointes d’un couvercle après exposition pendant 12 jours à 6

souches de P. aeruginosa. Figure A : Les biofilms sont exposés pendant 1, 2 ou 9 jours à

différentes concentrations en CSA-13 seul. Figure B : Les biofilms sont exposés pendant 1, 2

ou 9 jours à différentes concentrations en CSA-13 en association avec la tobramycine à 4

mg/L. Les résultats sont exprimés en variations logarithmiques du nombre d’ufc/mL mesuré

avant et après exposition au traitement. Ce sont les moyennes ± SEM des résultats obtenus

avec les 6 souches (n = 6).

Etude du CSA-13

132

II.3.1.2 Effet du CSA-13, seul ou en combinaison avec la tobramycine à 4 mg/L, sur

un biofilm mature

L’expérience est répétée sur des biofilms de 12 jours qui sont beaucoup plus organisés

que les biofilms jeunes. Six souches sont testées dans ce modèle. Après 1 jour, le CSA-13 est

moins efficace dans les biofilms matures que dans les biofilms jeunes. En effet, la diminution

logarithmique du nombre d’ufc/mL à des concentrations élevées en CSA-13 (200 mg/L) est

en moyenne de 2,9 log dans les biofilms matures versus 5,2 log dans les biofilms jeunes. La

sensibilité au CSA-13 est très différente au sein des 6 souches (MC099-450467 > PYO1 >

MC093-450507 > PYO2 > ATCC PAO1 = MC75-450457). MC099-450467 est la seule

souche complètement éradiquée par le CSA-13 à une concentration de 100 mg/L (figure 69).

La réponse des différentes souches au CSA-13 est fortement améliorée après les 24 h

suivantes de traitement. Après 2 jours d’administration du CSA-13, 2 fois par jour, la réponse

maximale au composé (200 mg/L) atteint en moyenne une diminution logaritmique de 4,8.

Après 2 jours de traitement, seule la souche MC093-450507 ne répond pas au CSA-13 et le

biofilm formé par 4 souches est complètement éradiqué par l’administration du stéroïde à une

concentration de 50 (PYO1 et MC099-450467) à 100 mg/L (ATCC PAO1 et PYO2) (figure

70).

L’exposition du biofilm au CSA-13 pendant 9 jours améliore la réponse au composé

antimicrobien pour toutes les souches et la diminution logarithmique moyenne maximale

atteint 5,6 (à 200 mg/L de CSA-13). A cette concentration, l’entièreté du biofilm est détruite

pour toutes les souches, excepté la souche MC093-450507 (figure 71).

L’efficacité de la tobramycine est fortement diminuée dans les biofilms matures. En

effet, après 1 jour, l’administration de 4 mg/L diminue le nombre d’ufc/mL de seulement 1

log (figure 68 B). En réalité, la souche ATCC PAO1 est la seule souche avec une diminution

logarithmique significative du nombre d’ufc/mL (3,6 log). Cependant même cette souche

devient progressivement résistante à la tobramycine et après 9 jours, l’antibiotique n’a plus

d’effet significatif sur aucune des 6 souches testées.

Après 1 jour d’une co-administration de CSA-13 et de tobramycine, on observe un

déplacement vers la gauche de la courbe dose-réponse (données non montrées) ce qui corrèle

Figure 69 : Effet du CSA-13 sur un biofilm mature après 1 jour

PYO1

0 5 20 50 100 200

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

PYO2

0 5 20 50 100 200

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

MC75-450457

0 5 20 50 1000

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

MC099-450467

0 5 20 50 100 200

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

MC093-450507

0 5 20 50 100 200-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

PAO1

0 5 20 50 100 200

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

Les biofilms sont formés sur les pointes d’un couvercle après exposition pendant 12 jours à 6

souches de P. aeruginosa. Les biofilms sont ensuite exposés à différentes concentrations en

CSA-13 seul ou en association avec la tobramycine à 4 mg/L pendant 24 h (administration

unique). Les résultats sont exprimés en variations logarithmiques du nombre d’ufc/mL mesuré

avant et après exposition au traitement. Ce sont les moyennes ± SD de 2 expériences (n = 2).

Etude du CSA-13

133

avec une forte potentialisation d’activité entre les 2 composés sur 4 des 6 souches testées

(PYO1, MC099-450467, MC093-450507 et ATCC PAO1). L’efficacité de l’administration

d’une association des molécules diminue avec le temps aux concentrations en CSA-13 de 5 et

20 mg/L (figure 68 B). Cette diminution d’efficacité est en corrélation avec la résistance

observée par l’administration de la tobramycine seule. La réponse à une co-administration de

tobramycine et de CSA-13 à 50 mg/L n’a pas changé entre le 1er

jour et le 9ème

jour de

traitement (figure 68 B), suggérant qu’à ces concentrations le CSA-13 prévient la résistance à

la tobramycine. Après 9 jours, la souche MC093-450507 est la seule souche qui ne répond pas

à l’association CSA-13 et tobramycine (diminution d’ufc/mL < 1 log). En culture

planctonique, la souche MC093-450507 est la moins sensible à la tobramycine. Après 9 jours

de traitement, une activité synergique par utilisation d’une co-administration de CSA-

13/tobramycine se dégage pour 3 souches (ATCC PAO1, PYO2 et MC75-450457).

Figure 70 : Effet du CSA-13 sur un biofilm mature après 2 jours

PYO1

0 5 20 50 100 200

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

PYO2

0 5 20 50 100 200

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

MC75-450457

0 5 20 50 100 2000

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

MC099-450467

0 5 20 50 100 200

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

MC093-450507

0 5 20 50 100 200-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

PAO1

0 5 20 50 100 200

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

Les biofilms sont formés sur les pointes d’un couvercle après exposition pendant 12 jours à 6

souches de P. aeruginosa. Les biofilms sont ensuite exposés à différentes concentrations en

CSA-13 seul ou en association avec la tobramycine à 4 mg/L, 2 fois par jour pendant 2 jours.

Les résultats sont exprimés en variations logarithmiques du nombre d’ufc/mL mesuré avant et

après exposition au traitement. Ce sont les moyennes ± SD de 2 expériences (n = 2).

Etude du CSA-13

134

Figure 71 : Effet du CSA-13 sur un biofilm mature après 9 jours

PYO1

0 5 20 50 100 200

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

PYO2

0 5 20 50 100 200

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

MC75-450457

0 5 20 50 100 200

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

MC099-450467

0 5 20 50 100 200

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

MC093-450507

0 5 20 50 100 200

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

PAO1

0 5 20 50 100 200

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

+ TOBCSA-13

[CSA-13] (mg/L)

- L

og

(u

fc/m

L)

Les biofilms sont formés sur les pointes d’un couvercle après exposition pendant 12 jours à 6

souches de P. aeruginosa. Les biofilms sont ensuite exposés à différentes concentrations en

CSA-13 seul ou en association avec la tobramycine à 4 mg/L, 2 fois par jour pendant 9 jours.

Les résultats sont exprimés en variations logarithmiques du nombre d’ufc/mL mesuré avant et

après exposition au traitement. Ce sont les moyennes ± SD de 2 expériences (n = 2).

Figure 72 : Effet du CSA-13 sur un biofilm ATCC PAO1

Un biofilm de 24 h de la souche ATCC PAO1, développé dans les puits d’une microplaque à

base µclear, est exposé à des concentrations croissantes de CSA-13 (0, 20, 50 et 100 mg/L).

Après traitement, le biofilm est marqué par le kit de coloration BacLight™ Live/Dead®. Les

cellules vivantes apparaissent vertes et les cellules endommagées apparaissent rouges. Les

images représentent une section horizontale dans le plan xy et sont les plus représentatives de

2 expériences indépendantes. Les barres blanches indiquent une distance de 20 µm.

Figure 73 : Etude cinétique de l’effet du CSA-13 sur un biofilm

ATCC PAO1-GFP marqué par l’IP

Un biofilm de 24 h de la souche ATCC PAO1-GFP, développé dans les puits d’une

microplaque à base µclear est exposé à (A) 100 mg/L de CSA-13 et (B) 0 mg/L de CSA-13

(conditions contrôles) en présence de 60 µM d’IP. Des séries d’images sont scannées pendant

30 min à intervalle de 5 min par MCBL. Les cellules vivantes apparaissent vertes par

expression de la GFP et les cellules endommagées apparaissent rouges par perméabilisation à

l’IP. Les images représentent une section horizontale dans le plan xy et sont les plus

représentatives de 2 expériences indépendantes. Les barres blanches représentent une distance

de 20 µm.

Etude du CSA-13

135

II.3.2 Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé – étude par MCBL

II.3.2.1 Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé dans une microplaque

Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé dans une microplaque

L’effet du CSA-13 sur un biofilm jeune de ATCC PAO1 est également observé par

MCBL après marquage des cellules par le kit de coloration BacLight™ Live/Dead®. Les

cellules bactériennes développent un biofilm uniforme et lisse dans les puits d’une

microplaque. Comme le montre la figure 72, l’ensemble des cellules du biofilm développé

dans des conditions contrôles (en absence du composé stéroïdien) apparaît vert par coloration

au Syto9 et confirme que les cellules au sein du biofilm contrôle sont imperméables à l’IP.

Lorsque le biofilm est exposé à des concentrations croissantes en CSA-13, les cellules

apparaissent rouges par perméabilisation à l’IP. L’effet du CSA-13 est dose-dépendant. A 20

mg/L, le composé provoque l’apparition de petites taches rouges dispersées de manière

homogène dans le biofilm. A 50 mg/L, une grande surface du biofilm apparaît rouge

soulignant qu’une vaste majorité des cellules sont devenues perméables à l’IP. Une

concentration plus importante (100 mg/L) perméabilise la totalité des cellules présentes dans

le biofilm et l’entièreté de la surface apparaît rouge. Ces résultats confirment l’efficacité du

CSA-13 sur les bactéries au sein du biofilm et sont concordants avec les expériences de

dénombrement bactérien réalisées sur des biofilms de la souche ATCC PAO1.

Etude cinétique de l’effet du CSA-13 sur un biofilm préformé dans une microplaque

L’activité du CSA-13 à 100 mg/L sur un biofilm préformé par la souche ATCC PAO1

exprimant la GFP est suivie au cours du temps (figure 73). Le biofilm de 24 h développé dans

des conditions contrôles (en absence du composé stéroïdien) apparaît vert par expression de la

GFP et confirme que les cellules au sein du biofilm contrôle sont imperméables à l’IP. L’effet

du CSA-13 apparaît très rapidement : après 10 min d’exposition au composé, une

augmentation significative de la captation de l’IP est observée. Après 20 min, une grande

majorité des cellules bactériennes est endommagée. Après 30 min, toutes les cellules sont

rouges confirmant la rapidité d’action du dérivé stéroïdien.

Figure 74 : Effet du CSA-13 sur un biofilm ATCC PAO1-GFP

Le CSA-13 à (A) 0, (B) 100 et (C) 200 mg/L est exposé pendant 25 min sur un biofilm

préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Les cellules vivantes apparaissent vertes

par expression de la GFP et les cellules endommagées apparaissent rouges par

perméabilisation à l’IP. Les images de MCBL représentent une section horizontale du biofilm

et deux sections dans les plans xz et yz (colonne de gauche). La colonne de droite représente

une vue tridimensionnelle du sommet du biofilm. La barre d’échelle correspond à 30 µm. Les

images micrographiques sont les plus représentatives de 2 expériences.

Etude du CSA-13

136

II.3.2.2 Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé dans un réacteur CDC

Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé ATCC PAO1 dans un réacteur CDC

Le biofilm développé dans les puits d’une microplaque est plutôt plat et lisse et la

plupart des bactéries facilement accessibles au CSA-13. Afin de développer un biofilm plus

structuré et robuste, les expériences suivantes sont réalisées sur des biofilms formés sous un

flux constant de milieu et de forces de frottements. Les coupons du réacteur CDC sont

perfusés de manière continue pendant 24 h avant d’être exposés au CSA-13 dans des

conditions statiques et examinés par MCBL. L’architecture du biofilm développé dans ces

conditions est beaucoup plus complexe (figure 74). Les bactéries exprimant la GFP sont

observées non seulement à la surface du coupon mais également dans des extensions

verticales donnant une architecture tridimensionnelle au biofilm. En absence de traitement

(conditions contrôles), les cellules sont imperméables à l’IP et apparaissent vertes. Après une

courte exposition au CSA-13, le composé affecte la viabilité de l’ensemble des bactéries

indépendamment de leur localisation dans le biofilm. Les bactéries localisées à la surface du

biofilm et facilement accessibles au CSA-13 ainsi que les cellules cachées à la base de

l’extension verticale sont affectées de manière similaire au CSA-13. Dès lors, la matrice

extracellulaire du biofilm ne bloque pas la pénétration du CSA-13 dans les profondeurs du

biofilm. Lorsque le biofilm est exposé à 100 mg/L de CSA-13, sa structure n’est pas affectée

et les extensions ascendantes des colonies bactériennes peuvent encore être observées.

Augmenter la concentration à 200 mg/L n’a pas modifié les résultats. Le composé augmente

la perméabilité de la bactérie à l’IP sans modifier l’architecture tridimensionnelle du biofilm.

Ces résultats suggèrent que le CSA-13 est bactéricide envers les bactéries englobées dans le

biofilm complexe, mais après une courte exposition au CSA-13 dans des conditions statiques,

le composé ne peut éradiquer le biofilm.

Figure 75 : Effet du CSA-13 sur un biofilm ATCC 15442

Le CSA-13 à (A) 0, (B) 100 et (C) 200 mg/L est exposé pendant 25 min sur un biofilm

préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Après traitement, le biofilm est rincé et

marqué par le kit BacLight™ Live/Dead®. Les images de MCBL montrent une section

horizontale du biofilm et deux sections dans les plans xz et yz (colonne de gauche). La

colonne de droite représente une vue tridimensionnelle du sommet du biofilm. Les barres

blanches indiquent une distance de 30 µm. Les images micrographiques sont les plus

représentatives de 2 expériences.

Figure 76 : Effet du CSA-13 marqué au Bodipy sur un biofilm ATCC PAO1-RFP

Le CSA-13 marqué au Bodipy à (A) 100 et (B) 200 mg/L est exposé pendant 25 min sur

biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Les cellules vivantes apparaissent

rouges, par expression de la RFP, et les cellules qui lient le CSA-13 fluorescent apparaissent

vertes. (I) Images représentant une vue tridimensionnelle du sommet du biofilm reconstituées

à partir d’images prises dans le plan xy, xz et yz. (II) Déconvolution de l’image pour le

colorant vert (CSA-13 marqué au Bodipy). (III) Déconvolution de l’image pour le colorant

rouge (RFP). Les images micrographiques sont les plus représentatives de 2 expériences.

Etude du CSA-13

137

Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé ATCC 15442 dans un réacteur CDC

L’expérience est répétée sur un biofilm formé par la souche ATCC 15442. La bactérie

utilisée dans cet essai n’exprime pas de protéine fluorescente. Le kit de coloration BacLight™

Live/Dead® est utilisé pour marquer les cellules vivantes (Syto9) et les cellules mortes (IP). A

100 mg/L, le CSA-13 affecte l’intégrité de la majorité des cellules des micro-colonies

localisées à la surface du biofilm (figure 75). Certaines cellules localisées en profondeur dans

le biofilm restent vertes et ne sont pas affectées par 100 mg/L de CSA-13. Doubler la

concentration en CSA-13 affecte l’intégrité de l’entièreté du biofilm.

Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé ATCC PAO1 dans un réacteur CDC par

utilisation d’un analogue fluorescent du CSA-13

La formation du biofilm ATCC PAO1 exprimant la RFP est réalisée dans un réacteur

CDC et l’accessibilité à l’intérieur du biofilm d’un analogue fluorescent du CSA-13, le CSA-

13 marqué par 1 % de Bodipy, est étudiée. Comme le dérivé Bodipy et la GFP ont des

spectres de fluorescence comparables, ces expériences sont réalisées avec des bactéries

exprimant la RFP plutôt que la GFP. Le composé fluorescent (100 mg/L et 200 mg/L) colore

l’ensemble des cellules du biofilm, confirmant que la matrice extracellulaire ne limite pas

l’accès du CSA-13 aux parties internes du biofilm (figure 76). La séparation des images

(collection de la fluorescence verte (II) ou collection de la fluorescence rouge (III)) permet de

mettre en évidence que le CSA-13 recouvre pratiquement la totalité du biofilm et semble

atteindre toutes les cellules le composant.

Figure 77 : Effet du CSA-13 sur la perméabilité des membranes plasmiques des HUVEC

-0.264

0

20

40

60

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Captation du BrEt

Libération de la LDH

***

*

[CSA-13] (Log mg/L)

Ré

po

ns

e a

u C

SA

-13

(%

ma

xim

um

)

Les cellules HUVEC sont incubées à 37 °C en présence de différentes concentrations en

CSA-13 et l’insertion du bromure d’éthidium (carrés ouverts, trait pointillé) ou la libération

de la LDH (triangles fermés, trait plein) est estimée après 10 min. Les résultats sont exprimés

en pourcentage de l’insertion/la libération maximale et sont la moyenne ± SEM de 4

expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 4). * P < 0,05 ; *** P < 0,001.

Etude du CSA-13

138

II.4 TOXICITE DU CSA-13 SUR CELLULES EUCARYOTES

II.4.1 Evaluation de la libération de la LDH

Les cellules HUVEC sont incubées à 37 °C en présence de concentrations croissantes

en CSA-13 et la libération de la LDH est mesurée. L’exposition des cellules HUVEC au

CSA-13 à 50 et 100 mg/L pendant 10 min à 37 °C induit la libération de respectivement 25 ±

3 % et 52 ± 5 % (n = 4) de leur contenu en LDH (figure 77). La libération de la LDH à 100

mg/L est significativement plus élevée que celle du contrôle (P < 0,001 quand on compare à

l’incubation en absence de CSA-13). A des concentrations plus faibles, le CSA-13 n’a pas

d’effet significatif sur la libération de la LDH par les cellules.

II.4.2 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium

Les cellules HUVEC sont incubées à 37 °C en présence de concentrations croissantes

en CSA-13 et la captation de bromure d’éthidium est mesurée. La fluorescence du bromure

d’éthidium augmente de 5,7 ± 0,3 % en absence de CSA-13 à 31 ± 11 % en présence de 50

mg/L de CSA-13 et à 39 ± 8 % en présence de 100 mg/L de CSA-13 (n = 4 ; P < 0,05) (figure

77). Ces observations sont en accord avec les résultats obtenus après la mesure de la libération

de la LDH des HUVEC : à 100 mg/L, le CSA-13 perméabilise la membrane des cellules

eucaryotes HUVEC.

Figure 78 : Effet du CSA-13 sur la viabilité de P. aeruginosa

3 heures

0 20 40 60 80 100

10 3

10 4

10 5

10 6

10 7

10 8

10 9

CSA-13CSA-13 avec acide pluronique F-127

0

[CSA-13] (mg/L)

No

mb

re d

e b

ac

téri

es

(u

fc/m

L)

24 heures

0 20 40 60 80 100

102

103

104

105

106

107

108

109

101 0

CSA-13CSA-13 avec acide pluronique F-127

0

[CSA-13] (mg/L)

No

mb

re d

e b

ac

téri

es

(u

fc/m

L)

Une suspension bactérienne de ATCC PAO1 est incubée pendant 3 et 24 h avec des

concentrations croissantes en CSA-13 en absence (triangles fermés, trait plein) ou en présence

(cercles ouverts, trait pointillé) d’acide pluronique F-127 à 5 %. A la fin de l’incubation un

aliquot de bactéries est dilué et cultivé pendant 48 h sur des boîtes de gélose TSA. Les ufc

sont comptées. Après correction du facteur de dilution, le nombre d’ufc est indiqué en

fonction de la concentration en CSA-13. Les données sont présentées comme la moyenne ±

SD de 2 expériences indépendantes réalisées en duplicat (n = 2).

Figure 79 : Cinétiques de l’effet de l’acide pluronique sur la captation d’IP

par P. aeruginosa en réponse au CSA-13

Cinétiques sans acide pluronique F-127

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 20000

10000

20000

30000

40000Contrôle

CSA-13 50 mg/L

CSA-13 100 mg/L

CSA-13 10 mg/L

A

Temps (s)

Ca

pta

tio

n d

'IP

(u

.a.f

.)

Cinétiques avec acide pluronique F-127

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 20000

10000

20000

30000

40000

Contrôle

CSA-13 50 mg/L

CSA-13 10 mg/L

CSA-13 100 mg/L

B

Temps (s)

Cap

tati

on

d'IP

(u

.a.f

.)

Les bactéries sont incubées pendant 1 h en présence de 6 µM d’IP et de concentrations

croissantes en CSA-13, en absence (figure A) ou en présence (figure B) de 5 % d’acide

pluronique F-127. Pour la clarté des graphiques, un point sur six a été représenté. Les résultats

sont la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en duplicat (n = 3).

Etude du CSA-13

139

II.5 EFFET DE L’ASSOCIATION CSA-13 ET ACIDE PLURONIQUE F-127

II.5.1 Activité antibactérienne de l’association CSA-13 et acide

pluronique F-127

II.5.1.1 Essai de viabilité par dénombrement

Une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1 est incubée dans une

microplaque pendant 3 et 24 h. La viabilité des bactéries exposées au CSA-13, en présence ou

en absence d’acide pluronique à 5 %, est investiguée par réalisation d’un dénombrement

bactérien. L’activité du CSA-13 est dose-dépendante. Après 24 h d’incubation, l’effet du

CSA-13 sur les bactéries est plus important qu’après 3 h d’incubation (figure 78). En effet, la

limite de détection est atteinte à une concentration de 50 mg/L après 3 h d’incubation, cette

même efficacité étant observée après 24 h d’incubation à une concentration plus faible de 20

mg/L. Après 3 h d’incubation, le CSA-13 à 5 mg/L permet de diminuer de 1,9 log le nombre

de cellules vivantes. L’association du CSA-13 avec le dérivé pluronique diminue légèrement

l’activité antimicrobienne du CSA-13 mais à une concentration de 50 mg/L plus aucune

bactérie viable n’est détectée. Après 3 h de contact, la concentration de 20 mg/L de CSA-13

diminue le nombre d’ufc de 4,8 log en absence et 2,0 log en présence du dérivé pluronique.

Après 24 h d’incubation, cette même dose en CSA-13 diminue le nombre d’ufc de plus de 7

log en absence et de 3,5 log en présence du dérivé pluronique.

II.5.1.2 Essai de viabilité par perméabilisation à l’IP

L’effet antimicrobien de l’association du CSA-13 et de l’acide pluronique F-127 est

évalué par un essai de la perméabilité membranaire de ATCC PAO1 à l’IP. La fluorescence

des bactéries incubées à 37 °C en absence du stéroïde cationique n’a pas changé pendant la

durée de l’expérience (60 min) confirmant que l’IP n’est pas perméable aux cellules vivantes

(figure 79 A). Le CSA-13, à des concentrations comprises entre 0 et 10 mg/L, provoque une

augmentation importante de la captation de l’IP pendant les dix premières minutes

d’exposition (figure 79 A). Lors de l’exposition de la souche ATCC PAO1 à des

concentrations plus importantes, cette captation diminue légèrement. La présence de 5 %

Figure 80 : Effet de l’acide pluronique sur la captation d’IP

par P. aeruginosa en réponse au CSA-13 (après 1 h)

0 20 40 60 80 1000

10000

20000

30000

40000

CSA-13

CSA-13 avec acide pluronique F-127

[CSA-13] (mg/L)

Cap

tatio

n d

'IP (

u.a

.f.)

Les bactéries sont incubées pendant 60 min en présence de 6 µM d’IP et de concentrations

croissantes en CSA-13, en absence (triangles fermés, trait continu) ou en présence (cercles

ouverts, trait pointillé) de 5 % d’acide pluronique F-127. Les résultats sont la moyenne ±

SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en duplicat (n = 3).

Figure 81 : Effet de l’acide pluronique sur la libération de la LDH

par les HUVEC en réponse au CSA-13

0 20 40 60 80 100

0

10

20

30

40

50

60

CSA-13

CSA-13 avec acide pluronique F-127

***

[CSA-13] (mg/L)

Lib

éra

tio

n d

e l

a L

DH

(%

du

to

tal)

Les cellules HUVEC sont incubées à 37 °C pendant 10 min avec des concentrations

croissantes en CSA-13 en absence (triangles fermés, trait plein) ou en présence (cercles

ouverts, trait pointillé) d’acide pluronique F-127 à 3 %. La LDH libérée dans le milieu à la fin

de l’incubation est dosée comme décrit dans Matériel et Méthodes. Les résultats sont

exprimés en pourcentage de l’activité maximale de la LDH dans les cellules. Les résultats

sont la moyenne ± SEM de 3 à 4 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3 à 4).

*** P < 0,001.

Etude du CSA-13

140

d’acide pluronique dans le milieu n’a pas d’effet significatif sur la fluorescence basale des

cellules (figure 79 B). Après 60 min d’exposition des bactéries au CSA-13, l’acide pluronique

F-127 n’affecte pas significativement la réponse au CSA-13 (figure 80). Dès lors, dans ces

conditions expérimentales, l’efficacité antibactérienne du CSA-13 est maintenue en présence

de 5 % d’acide pluronique F-127.

II.5.2 Toxicité de l’association CSA-13 et acide pluronique F-127 sur

cellules eucaryotes

II.5.2.1 Evaluation de la libération de la LDH

La libération de la LDH dans le milieu extracellulaire, reflétant une perméabilisation

membranaire des HUVEC, est mesurée en présence de concentrations croissantes en CSA-13.

La libération de l’enzyme augmente de manière dose-dépendante lors de l’exposition des

HUVEC à des concentrations en composé stéroïdien supérieures à 5 mg/L (figure 81). En

présence d’une dose de 100 mg/L, la moitié de la LDH cellulaire est libérée dans le milieu (52

± 5 %, n = 4) après 10 min d’incubation. L’association du CSA-13 à 3 % d’acide pluronique

permet une atténuation importante de l’effet sur la perméabilisation membranaire provoquée

par le composé. L’acide pluronique permet une diminution significative de la libération de la

LDH extracellulaire à 100 mg/L de CSA-13 de 52 ± 5 % (n = 4) en absence du dérivé à 22 ± 2

% (n = 3) en présence du dérivé pluronique (P < 0,001).

II.5.2.2 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium

Les HUVEC sont mises en présence de concentrations croissantes en CSA-13 pendant

50 min à 37 °C et la fluorescence est détectée. Les résultats sont la vitesse de captation du

bromure d’éthidium, calculée sur base de la pente de la courbe de régression, calculée elle-

même sur base des mesures prises pendant les premières minutes de l’essai. En condition

contrôle, la vitesse de captation du bromure d’éthidium est faible et est en moyenne de 0,07 ±

0,06 unités arbitraires de fluorescence (u.a.f.)/sec (n = 3) (figure 82 A). Le CSA-13 provoque

une augmentation de la vitesse de captation du bromure d’éthidium par les HUVEC. A 100

mg/L de CSA-13, la vitesse de captation du bromure d’éthidium atteint 2,8 ± 0,7 a.f.u/sec (n =

4) après 10 min (figure 83). L’addition de 3 % d’acide pluronique au milieu augmente la

Figure 82 : Cinétiques de l’effet de l’acide pluronique sur la captation de bromure

d’éthidium par les HUVEC en réponse au CSA-13

Cinétiques sans acide pluronique F-127

0 500 1000 1500 2000 2500 30002000

2500

3000

3500

4000

4500

5000Contrôle

CSA-13 50 mg/L

CSA-13 100 mg/L

CSA-13 20 mg/L

CSA-13 30 mg/L

CSA-13

A

Temps (s)

Cap

tatio

n d

u B

rEt

(u.a

.f.)

Cinétiques avec acide pluronique F-127

0 500 1000 1500 2000 2500 30002000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

Contrôle

CSA-13 20 mg/L

CSA-13 50 mg/L

CSA-13 100 mg/L

CSA-13 30 mg/L

CSA-13

B

Temps (s)

Cap

tatio

n d

u B

rEt

(u.a

.f.)

Les cellules HUVEC sont incubées à 37 °C en présence de 10 mg/L de bromure d’éthidium

dans des conditions contrôles (figure A) ou en présence de 3 % d’acide pluronique F-127

(figure B). Cinq min après le début de l’essai, les cellules sont exposées à différentes

concentrations en CSA-13 et la fluorescence est mesurée pendant 50 min. Pour la clarté des

graphiques, un point sur 6 est représenté. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 3 à 4

expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3 à 4).

Figure 83 : Effet de l’acide pluronique sur la captation de bromure d’éthidium

par les HUVEC en réponse au CSA-13

0 20 40 60 80 100

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

CSA-13 avec acide pluronique F-127

CSA-13

*

**

[CSA-13] (mg/L)

Va

ria

tio

n d

e la

ca

pta

tio

n d

u B

rEt

(u.a

.f./s

ec

)

La vitesse de captation du bromure d’éthidium est mesurée entre 5 min (juste avant l’addition

du CSA-13) et 15 min (c.à.d. pendant 10 min après ajout de CSA-13). L’augmentation de la

vitesse de captation du bromure d’éthidium (u.a.f./sec) est représentée en fonction de la

concentration en CSA-13. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 3 à 4 expériences

indépendantes réalisées en triplicat (n = 3 à 4). * P < 0,05 ; ** P < 0,01.

Etude du CSA-13

141

captation basale du bromure d’éthidium (0,5 ± 0,8 (n = 3) u.a.f./sec) (figure 82 B). Comme le

montre la figure 83, l’ajout du dérivé pluronique à 3 % inhibe significativement la captation

du bromure d’éthidium en réponse à 50 et 100 mg/L de CSA-13 (de 2,8 ± 0,7 u.a.f./sec (n = 4)

pour 100 mg/L de CSA-13 seul à 0,5 ± 0,2 u.a.f./sec (n = 3) pour 100 mg/L de CSA-13 en

présence de 3 % d’acide pluronique F-127 ; P < 0,01).

Figure 84 : Effet de l’acide pluronique sur l’activité mitochondriale

des HUVEC en réponse au CSA-13

0 25 50 75 1000

25

50

75

100

125 CSA-13

CSA-13 avec pluronique F-127

[CSA-13] (mg/L)

Ab

so

rba

nc

e (

% d

u c

on

trô

le)

Les HUVEC sont incubées à 37 °C pendant 20 min avec des concentrations croissantes en

CSA-13 en absence (triangles fermés, trait plein) ou en présence (cercles ouverts, trait

pointillé) d’acide pluronique F-127 à 6 %. A la fin de l’incubation, le milieu est éliminé et une

solution de MTT est ajoutée à chaque puits. L’absorbance mesurée à 540 nm est utilisée pour

estimer la production de formazan durant la réaction. Les résultats sont exprimés en

pourcentage de l’absorbance mesurée dans les conditions contrôles et sont la moyenne ± SEM

de 3 à 4 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3 à 4).

Figure 85 : Effet de l’acide pluronique sur la captation du TMRE

par les HUVEC en réponse au CSA-13

pH 6

0 20 40 60 80 1000

25

50

75

100 CSA-13

CSA-13 avec acide pluronique F-127

[CSA-13] (mg/L)

Flu

ore

scen

ce (

% d

u c

on

trô

le)

pH 8

0 20 40 60 80 1000

25

50

75

100CSA-13

CSA-13 avec acide pluronique F-127

[CSA-13] (mg/L)

Flu

ore

scen

ce (

% d

u c

on

trô

le)

pH 7

0 20 40 60 80 1000

25

50

75

100CSA-13

CSA-13 avec acide pluronique F-127

[CSA-13] (mg/L)

Flu

ore

scen

ce (

% d

u c

on

trô

le)

Les HUVEC sont incubées pendant 1 h à 37 °C dans un tampon phosphate à pH 6, 7 et 8. Les

cellules endothéliales sont exposées à différentes concentrations en CSA-13 en absence

(triangles fermés, trait plein) ou en présence (cercles ouverts, trait pointillé) d’acide

pluronique F-127 à 5 %. Après élimination du milieu, les cellules sont incubées pendant 1 h

en présence de TMRE. A la fin de cette seconde incubation la fluorescence des cellules est

estimée comme décrit dans Matériel et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentage

de la fluorescence mesurée dans les cellules incubées pendant 1 h dans des conditions

contrôles avant exposition au TMRE. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 3 expériences

indépendantes réalisées en duplicat (n = 3).

Etude du CSA-13

142

II.5.2.3 Evaluation de l’activité mitochondriale

L’activité mitochondriale des HUVEC après exposition au CSA-13, seul ou en

association avec l’acide pluronique F-127, est estimée par un test colorimétrique MTT. La

courbe de la figure 84 représente l’absorbance du formazan formé chez les cellules actives.

Des concentrations faibles en CSA-13 n’ont pas d’effet sur la capacité métabolique des

HUVEC. Une concentration de 50 mg/L en composé stéroïdien diminue significativement

l’absorbance jusqu’à 40 ± 12 % par rapport au contrôle (n = 3 ; P < 0,01). L’absorbance

diminue avec l’augmentation des concentrations en CSA-13 et à 100 mg/L l’absorbance

atteint 25 ± 5 % (n = 4 ; P < 0,001). L’addition de 6 % d’acide pluronique au milieu (sans

CSA-13) n’a pas d’effet sur l’absorbance du formazan réduit (de 0,33 ± 0,06 ; n = 4 en

absence à 0,321 ± 0,009 ; n = 4 en présence d’acide pluronique F-127). Un déplacement léger,

mais non significatif, de la courbe dose-réponse du CSA-13 est observé en présence du dérivé

pluronique vers des concentrations plus élevées sans affecter l’effet maximal du CSA-13. A

100 mg/L de CSA-13, l’ajout d’acide pluronique ne modifie pas la toxicité mitochondriale du

produit.

II.5.2.4 Evaluation du potentiel de membrane mitochondrial

De faibles concentrations en CSA-13 (à partir de 5 mg/L) provoquent une diminution

importante de la fluorescence associée aux cellules (figure 85). La présence du composé

stéroïdien à une concentration de 5 et 50 mg/L diminue la fluorescence de 60 et 85 %

respectivement (pH 7). Ces résultats suggèrent que le CSA-13 détériore les mitochondries des

HUVEC. L’addition de 5 % d’acide pluronique F-127 au milieu n’a pas d’influence

significative sur la fluorescence de base (de 47436 ± 6130 u.a.f. (n = 3) en absence à 47271 ±

8822 u.a.f. (n = 3) en présence d’acide pluronique F-127, P > 0,05) et n’a pas d’influence

significative sur l’effet néfaste du CSA-13 sur le potentiel mitochondrial (pH 7). L’étude de

l’effet du CSA-13 sur le potentiel mitochondrial des HUVEC est effectuée à 3 pH différents.

Les courbes de l’intensité de la fluorescence en fonction de la concentration en CSA-13 sont

semblables aux différents pH étudiés. La dissipation du potentiel de membrane mitochondrial

par le CSA-13 (seul ou en présence d’acide pluronique) n’est pas affectée par une incubation

des HUVEC à pH 6 et 8 plutôt que à pH 7.

Etude du CSA-13

143

III. DISCUSSION

Effet du CSA-13 sur des cultures planctoniques

Nous avons confirmé l’activité antibactérienne du CSA-13 sur des cultures

planctoniques de P. aeruginosa, y compris sur des souches cliniques isolées de patients

atteints de mucoviscidose. Des faibles concentrations de l’agent stéroïdien ont une importante

activité inhibitrice et bactéricide sur les souches. L’étude de l’interaction membranaire de P.

aeruginosa avec un agent fluorescent (NPN) souligne l’importance de l’interaction entre le

CSA-13 et la membrane bactérienne dans l’effet bactéricide du composé.

Effet du CSA-13 sur la formation d’un biofilm

L’éradication des infections liées à P. aeruginosa chez les patients atteints de

mucoviscidose implique des stratégies de traitement préventives. L’activité du CSA-13 sur la

formation du biofilm par 8 souches de P. aeruginosa a été évaluée par la méthode de

coloration au CV. Nous avons démontré dans cette étude qu’une très faible concentration en

CSA-13, 1 mg/L, inhibe la formation du biofilm par 3 des 8 souches étudiées (la souche non

mucoïde ATCC PAO1 et deux souches mucoïdes MC75-450457 et MC099-450467).

Potentiel zêta

Nous avons exploré quelques propriétés des 8 souches bactériennes afin de souligner

une éventuelle corrélation entre celles-ci et l’activité du CSA-13 sur la bactérie. L’activité

antibactérienne des céragenines est généralement expliquée par l’interaction de ces composés

avec les membranes bactériennes (Epand et al., 2010). Les LPS sont des composants de la

membrane des bactéries à Gram négatif spécialement ciblées par les céragenines (Ding et al.,

2004). Comme les LPS sont des contributeurs majeurs au potentiel de membrane des bactéries

à Gram négatif (Buchanan et al., 2009), nous avons estimé les charges sur la membrane de la

bactérie par mesure du potentiel zêta des 8 souches (Wilson et al., 2001).

La mesure de potentiel zêta est variable au sein des souches mais également au sein

d’une même souche, comme rapporté précédemment (Habash et al., 1997). Pour certaines

souches, la distribution du potentiel zêta est bimodale (van der Mei et Busscher, 2001). Une

large distribution du potentiel zêta peut être attribuée à la présence de petits agrégats de

bactéries dans la suspension (Klodzinska et al., 2010), le nombre de pics dans le profil du

potentiel zêta augmentant avec la formation d’agrégats de cellules bactériennes. D’autre part,

Etude du CSA-13

144

on observe des pics différents pour les cellules vivantes et mortes. Habash et ses collègues

mettent en évidence un changement du potentiel zêta en fonction de l’activité métabolique des

bactéries (Habash et al., 1997). Une population bactérienne métaboliquement plus active

contiendrait une plus grande proportion de bactéries chargées plus négativement qu’une

suspension de bactéries métaboliquement non actives. Ils décrivent également le potentiel zêta

comme étant fonction de la phase de croissance bactérienne. Herzberg et ses collaborateurs

constatent également l’influence des conditions de croissance des bactéries sur le potentiel

zêta des souches (Herzberg et al., 2009). Cependant, d’après Soni et al. (2008), les différents

niveaux de nutrition et l’état physiologique de la bactérie n’affectent pas le potentiel zêta pour

Pseudomonas sp. Flemming et ses collaborateurs observent que la longue chaîne B des

polysaccharides des LPS augmente le potentiel zêta en masquant la charge du core (Flemming

et al., 1998).

En comparant le potentiel d’une souche et de son variant mucoïde, Herzberg et al.

(2009) constatent un potentiel zêta plus négatif chez le variant mucoïde. Nos résultats

marquent également une différence significative du potentiel zêta entre les 4 souches

mucoïdes et les 4 souches non mucoïdes.

Trois souches sur les 8 souches étudiées sont sensibles à une administration préventive

de CSA-13 à 1 mg/L. Parmi ces 3 souches, les souches MC75-450457 et MC099-450467

présentent un potentiel zêta très négatif. La troisième souche qui est sensible au composé, la

souche ATCC PAO1, a un potentiel plus élevé suggérant qu’il n’y a pas de corrélation entre

les charges de la membrane et l’interaction avec le stéroïde cationique. Cependant, il existe

parfois une hétérogénéité dans la distribution du potentiel zêta, même au sein d’une unique

souche, et l’existence de sous-populations doit être prise en compte afin d’éviter des

conclusions hâtives (van der Mei et Busscher, 2001). La souche ATCC PAO1 est clairement

hétérogène avec une distribution bimodale du potentiel zêta. Une de ses 2 sous-populations a

un potentiel moyen de -56 mV, qui est l’un des potentiels les plus bas des 8 souches étudiées.

Nous pouvons donc conclure que la population entière ou une sous-population des 3 souches

sensibles au CSA-13 possède un potentiel zêta inférieur à -50 mV établissant une corrélation

entre la sensibilité au composé et les interactions électrostatiques entre la bactérie et le

composé. Ceci est en accord avec les résultats de Bruinsma et ses collègues qui décrivent que

la sensibilité de P. aeruginosa à une solution de protection de polyquaternium-1 pour lentilles

Etude du CSA-13

145

de contact est liée aux charges des bactéries : les bactéries chargées le plus négativement sont

les plus sensibles à la solution (Bruinsma et al., 2006).

Interaction avec le CSA-119

Dans une autre tentative pour corréler la sensibilité au CSA-13 aux propriétés des

membranes bactériennes, l’interaction des bactéries avec le CSA-119, un analogue fluorescent

du CSA-13, a été investiguée. La liaison de l’agent fluorescent aux souches bactériennes est

dose-dépendante et rapide pour les 8 souches. Parmi les 3 souches sensibles à une faible

concentration en CSA-13 avec la technique de coloration au CV, les souches ATCC PAO1 et

MC75-450457 sont celles présentant la plus grande affinité de liaison pour le CSA-119. Ce

sont également les souches ayant le potentiel zêta, pour la population entière ou pour une

sous-population, le plus négatif. Cependant, aucune corrélation ne peut être établie entre la

sensibilité de la souche MC099-450467 au CSA-13 et la liaison au CSA-119. En effet, cette

souche se trouve parmi les 3 souches sensibles à une faible concentration en CSA-13. Par

contre elle lie faiblement le CSA-119. L’explication peut se trouver au niveau des propriétés

du groupement dansyle ajouté au CSA-13 afin de le rendre fluorescent. Dans le CSA-119, le

groupement dansyle greffé au noyau stéroïde du CSA-13 est un groupement hydrophobe. Dès

lors, il est possible que de nouvelles interactions hydrophobes entre le CSA-119 et la

membrane bactérienne apparaissent rendant difficile toute comparaison avec l’interaction

qu’on observerait avec le CSA-13 seul.

Production des rhamnolipides

L’effet du CSA-13 à 1 mg/L sur l’inhibition de la formation d’un biofilm ne survient

qu’après une latence de plusieurs heures (24 ou 48 h) et pourrait dès lors être induit par une

modulation de l’expression de gènes impliqués dans la formation du biofilm. Overhage et ses

collègues soulignent une diminution de la régulation de composants clés des deux systèmes

majeurs de QS chez P. aeruginosa, les systèmes las et rhl, en présence de très faibles

concentrations en LL-37 (Overhage et al., 2008). Ainsi l’expression des gènes rhlB et rhlA

codant pour une rhamnosyltransférase impliquée dans la synthèse des rhamnolipides (Ochsner

et al., 1995) est diminuée en présence du PAM. Nous avons démontré précédemment que la

production de rhamnolipides par les 3 souches sensibles au CSA-13 était très différente : les

souches ATCC PAO1 et MC75-450457 produisent de grandes quantités de rhamnolipides. La

présence de rhamnolipides n’a pu être détectée dans le milieu de culture de la souche MC099-

450467 (voir chapitre « Caractérisation phénotypique des souches »). Dans ce travail nous

Etude du CSA-13

146

avons investigué l’effet d’une longue exposition à une faible concentration de CSA-13 sur la

synthèse de rhamnolipides. Cette étude n’a pas mis en évidence une différence de production

du surfactant. Le dérivé stéroïde cationique n’affecte donc pas la production de rhamnolipides

et l’opéron rhlAB régulant la synthèse des rhamnolipides (Lequette et Greenberg, 2005) n’est

pas une cible intracellulaire du CSA-13. Ainsi l’inhibition de la formation du biofilm par le

CSA-13 n’est pas médiée par une diminution de la production de rhamnolipides.

Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé

Jusqu’à présent nous avons exploré les propriétés antimicrobiennes du CSA-13 et son

activité préventive sur la formation d’un biofilm. Dans la mesure où la prise en charge des

infections chroniques comme les infections pulmonaires à P. aeruginosa chez les patients

atteints de mucoviscidose nécessite parfois l’éradication d’un biofilm dans lequel se nichent

les bactéries, il est essentiel d’investiguer les effets du CSA-13 sur des biofilms préétablis,

jeunes et matures. Nous avons aussi étudié son activité en association avec la tobramycine, le

traitement de référence pour le traitement par aérosol des infections pulmonaires à P.

aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose.

Plusieurs facteurs peuvent expliquer la persistance des infections à P. aeruginosa

formant un biofilm. Premièrement, l’accès des antibiotiques vers le centre du biofilm peut être

limité. Deuxièmement, les antibiotiques peuvent être inactivés par des composants du biofilm.

Finalement, la croissance de la bactérie dans un biofilm favorise l’émergence de souches

résistantes après exposition des bactéries à des concentrations sub-inhibitrices de

l’antibiotique dans un biofilm (Nair et al., 2013). Nous avons illustré cet effet par la

tobramycine. Les 8 souches étudiées dans ce travail présentent une CMI comprise entre 1 et

10 mg/L. La sensibilité des souches à 4 mg/L de tobramycine est diminuée dans les biofilms

jeunes et est pratiquement absente dans les biofilms matures. La seule souche sensible à

l’aminoglycoside, la souche ATCC PAO1, développe une résistance avec le temps et après 9

jours plus aucune souche ne répond à l’antibiotique. Ces résultats confirment que la résistance

des bactéries à l’antibiotique n’est pas induite par l’aminoglycoside mais est une conséquence

de la formation d’un biofilm. Il faut souligner que la concentration en tobramycine utilisée

dans cette étude est proche de la CMI des différentes souches mais bien inférieure à la

concentration pouvant être atteinte dans les voies respiratoires des patients traités par aérosol

de tobramycine (Flume, 2008).

Etude du CSA-13

147

Etude par dénombrement sur un biofilm jeune

Le CSA-13 administré seul possède déjà une activité bactéricide importante sur les

biofilms jeunes sur 7 des 8 souches étudiées : il détruit l’entièreté du biofilm formé par ces 7

souches. Cette activité bactéricide est dose-dépendante et comprise entre 20 mg/L (pour la

souche PYO1) et 200 mg/L. Les concentrations actives sur un biofilm sont plus importantes

que celles actives sur les mêmes souches en culture planctonique. Ces observations sont

conformes avec la vision actuelle que la formation d’un biofilm augmente la résistance aux

agents antimicrobiens (Stewart et Costerton, 2001).

Un bénéfice évident à utiliser le CSA-13 en association avec la tobramycine sur

biofilm jeune s’est dégagé : des synergies d'action sont observées pour 5 souches. La souche

MC093-450507 est particulièrement intéressante ; elle est résistante à la fois à une

administration de la tobramycine seule ou du CSA-13 seul, même à une concentration de 200

mg/L. Mais à ces mêmes concentrations utilisées en association, une activité synergique se

dégage et aucune bactérie viable n'est détectée après 24 h. La souche ATCC PAO1 montre un

effet antagoniste de l'association lorsque le CSA-13 est utilisé à une concentration inférieure à

50 mg/L. Ces résultats sont concordants avec les résultats de Chin et al. (2008). Ces auteurs

ont testé l’interaction entre le CSA-13 et la tobramycine dans 4 souches de P. aeruginosa

multirésistantes. Après 24 h, ils n’ont pas observé d’interaction entre le CSA-13 et la

tobramycine chez 2 souches, une synergie chez une souche et un antagonisme pour la

dernière. De faibles concentrations en CSA-13 diminuaient l’efficacité de la tobramycine chez

ATCC PAO1. L’hypothèse suivante pourrait expliquer la sensibilité plus faible à la

tobramycine de la souche ATCC PAO1 exposée à de faibles concentrations en CSA-13. La

résistance de P. aeruginosa envers les peptides cationiques antimicrobiens implique

généralement l’addition de 4-aminoarabinose au lipide A des LPS. Cette différence

structurelle diminue les charges négatives de la membrane externe et entrave l’interaction

entre la membrane et les peptides cationiques. La modification dans la structure des LPS est

secondaire à l’activation de l’opéron arn BCADTEF qui est contrôlé par deux systèmes

senseurs agissant en cascade, les systèmes à deux composantes PhoP/Q et PmrA/B (Gunn,

2001). L’exposition de ATCC PAO1 à de faibles concentrations de polyamines active

l’opéron oprH-phoPQ qui provoque l’incorporation d’aminoarabinose aux LPS et explique

pourquoi les polyamines induisent une résistance aux agents antimicrobiens cationiques

(Kwon et Lu, 2006). Les polyamines augmentent également la résistance de la bactérie aux

aminoglycosides par un mécanisme qui reste non déterminé (Kwon et Lu, 2006). Le CSA-13

Etude du CSA-13

148

qui possède plusieurs groupements amines (Epand et al., 2008) pourrait se comporter comme

une polyamine. La diminution de la perméabilité de la membrane externe est généralement le

mécanisme de résistance le plus commun des aminoglycosides dans des souches cliniques de

patients atteints de mucoviscidose (MacLeod et al., 2000). Dela Vega et Delcour (1996) ont

démontré que les polyamines diminuent la perméabilité de la membrane bactérienne externe

et nous avons confirmé l’interaction du CSA-13 avec la membrane bactérienne. Il est donc

concevable que l’interaction initiale entre le CSA-13 et la membrane externe et

l’incorporation d’un aminoarabinose au lipide A qui s’ensuit induisent la résistance de la

bactérie à la tobramycine.

Etude par dénombrement sur un biofilm mature

L’importance d’étudier l’activité des agents antimicrobiens sur des modèles de

biofilms matures se rapprochant plus des conditions in vivo rencontrées chez les patients

atteints de mucoviscidose a été démontrée (Tré-Hardy et al., 2009). Les expériences sont donc

poursuivies sur des biofilms matures âgés de 12 jours, en référence au cycle de formation du

biofilm. L’activité du CSA-13 sur des biofilms matures est dose-dépendante. L’activité du

composé augmente également au cours du temps soulignant que les bactéries n’ont pas

développé de résistance au composé. Après 1 jour de traitement, le CSA-13 est moins efficace

dans les biofilms matures que dans les biofilms jeunes et la sensibilité au CSA-13 est très

différente au sein des 6 souches. Après 2 jours de traitement, seule la souche MC093-450507

ne répond pas au CSA-13 et après 9 jours de traitement, toutes les souches sont sensibles au

CSA-13.

Dans les biofilms matures, l’intérêt d’une co-administration est également avancé et

après 1 jour d’administration de la combinaison de la tobramycine avec le CSA-13, 4 sur 6

souches sont affectées par une synergie d’action. Cependant l’efficacité de l’administration de

l’association des molécules diminue avec le temps aux concentrations en CSA-13 de 5 et 20

mg/L, en corrélation avec la résistance observée par l’administration de la tobramycine seule.

La réponse à une co-administration de la tobramycine et du CSA-13 à 50 mg/L ne change pas

entre le 1er

jour et le 9ème

jour de traitement, suggérant qu’à ces concentrations le CSA-13

prévient la résistance à la tobramycine.

L’efficacité du CSA-13 sur l’inhibition de l’adhésion des bactéries, la première étape

de la formation d’un biofilm, a été rapportée précédemment (Isogai et al., 2009). L’efficacité

Etude du CSA-13

149

du CSA-13 sur P. aeruginosa, sur culture planctonique et sur biofilm jeune a également été

démontrée (Bucki et al., 2007b; Chin et al., 2008). Nos résultats non seulement confirment ces

observations mais aussi démontrent clairement l’efficacité du composé sur un biofilm mature.

Dans ce modèle, le CSA-13 prouve être un composé antibactérien très prometteur pour

l’éradication de certaines souches devenues résistantes à la tobramycine. Le composé est

même capable de prévenir la résistance à l’aminoglycoside.

Etude par MCBL

La MCBL est une technique non invasive permettant la visualisation directe et dans

l’espace de l’action d’un agent antimicrobien. La MCBL permet d'analyser un échantillon

d'épaisseur biologique, par exemple un biofilm microbien, par traitement des images, couche

par couche, dans les directions x, y et z. A l’aide de la microscopie confocale et de 2

méthodes différentes de développement d’un biofilm (microplaque et réacteur CDC), nous

avons clairement confirmé que le CSA-13 est actif envers les bactéries au sein d’un biofilm.

Lors d’un court temps d’exposition au CSA-13, les bactéries englobées dans le biofilm formé

à la surface d’une microplaque sont perméables à l’IP et apparaissent rouges. Les images

microscopiques montrent également que les biofilms développés à la surface des puits, sans

apport constant de milieu, sont pourvus d’une architecture plate et ne reproduisent pas la

géométrie des biofilms complexes rencontrés in vivo. Les biofilms formés sous un stress de

frottement constant (perfusion du milieu de culture et mélange par agitation magnétique) sont

plus robustes et se développent non seulement à la surface du support mais aussi via des

extensions verticales. Les biofilms croissant dans ces conditions, à l’aide d’un réacteur CDC,

sont très différents des biofilms formés à la surface des puits et présentent une architecture

beaucoup plus complexe et robuste. Les biofilms formés dans les réacteurs CDC ont été

extensivement étudiés et validés comme de bon modèles pour les biofilms in vivo (Hadi et al.,

2010 ; ASTM, 2012). Nous avons démontré que le CSA-13 est aussi efficace sur ces biofilms

que sur les biofilms plats développés en microplaques. Ce résultat suggère que la matrice

extracellulaire complexe n’interfère pas avec l’activité antimicrobienne du composé qui a un

accès total à l’ensemble des bactéries du biofilm. Ces observations sont en accord avec

d’autres mesures d’une pénétration adéquate des antibiotiques dans le biofilm (Davison et al.,

2010 ; Stewart et al., 2009). Cette conclusion est confortée par l’analogue fluorescent du

CSA-13 qui interagit avec les bactéries au travers du biofilm. Des concentrations plus

importantes en CSA-13 sont nécessaires pour observer le même effet sur le biofilm entier

formé par la souche ATCC 15442. Cette observation s’accorde avec les résultats précédents

Etude du CSA-13

150

soulignant que cette souche est moins sensible au CSA-13 que la souche ATCC PAO1. Nos

résultats sont en accord avec ceux de Pollard et al. (2009). Par dénombrement bactérien, ces

auteurs ont étudié l’effet du CSA-13 sur des biofilms préétablis formés par P. aeruginosa

dans un réacteur CDC. Après une exposition à long terme (72 h), le composé a démontré son

activité bactéricide.

Les expérimentations basées sur l’étude du biofilm par MCBL démontrent que le CSA-13 est

antimicrobien sur les cellules piégées dans le biofilm mais que, après un court temps

d’exposition et dans des conditions statiques, le composé ne modifie pas la structure du

biofilm. Ceci rappelle les résultats de Hadi et ses collaborateurs ayant rapporté que le biofilm

formé dans un réacteur CDC était affecté différemment par l’hydroxyde de sodium, qui tue les

bactéries et détruit le biofilm, et par le Tween20, qui tue les bactéries sans affecter le biofilm

(Hadi et al., 2010). Il est cependant légitime de penser que les cellules endommagées dans le

biofilm contribuent à la déstabilisation de la structure globale du biofilm et que les conditions

rencontrées in vivo (par exemple, la clairance mucocilliaire) peuvent mener à une destruction

complète du biofilm déjà affaibli. La destruction du biofilm par un composé comme la N-

acétylcystéine (Zhao et Liu, 2010) ou la DNAse (Fuxman et al., 2010) est secondaire à l’effet

sur la matrice, et non sur la bactérie. Considérant que l’élimination du biofilm et la mort des

bactéries sont des processus distincts, une co-administration pourrait être nécessaire pour

démanteler intégralement l’architecture du biofilm. Les enzymes antibiofilms, comme

l’alginate lyase, constituent également une nouvelle stratégie émergente de lutte contre le

biofilm microbien (Ranall et al., 2012 ; Thallinger et al., 2013 ) et pourraient renforcer l’effet

du CSA-13 sur l’éradication entière du biofilm. Malgré tout, nos résultats démontrent que

l’accès du CSA-13 à l’intérieur du biofilm de P. aeruginosa n’est pas entravé et que le CSA-

13 tue efficacement les cellules bien installées dans les biofilms établis.

Etude de la toxicité du CSA-13 sur cellules eucaryotes

Nous avons confirmé le potentiel du CSA-13 dans l’éradication des biofilms de P.

aeruginosa. La toxicité du stéroïde vis-à-vis de cellules eucaryotes semble primordiale à

investiguer.

Il apparaît que les concentrations de CSA-13 actives sur les bactéries du biofilm (10-

100 mg/L) sont dans la même gamme des concentrations perméabilisant la membrane des

HUVEC (100 mg/L lorsqu’on considère la libération de la LDH et la perméabilité au bromure

d’éthidium). La toxicité des composés antimicrobiens cationiques en général, et du CSA-13

Etude du CSA-13

151

en particulier, a toujours été une préoccupation et un frein à l’usage clinique de ces composés.

Leszcynska et ses collègues rapportent qu’à 100 mg/L, le CSA-13 provoque la libération de

50 % de l’hémoglobine de globules rouges humains et la libération de 20 % du contenu en

LDH de cellules humaines d’adénocarcinome gastrique (Leszcynska et al., 2009). Ding et ses

collaborateurs démontrent que la sélectivité cellulaire des dérivés de l’acide cholique est liée à

la longueur de la chaîne du groupement cationique attaché en C24 (Ding et al., 2002). Ces

résultats ouvrent de nouvelles voies dans la conception de dérivés avec une activité

bactéricide importante et avec une toxicité réduite sur cellules eucaryotes (Savage et al.,

2002).

Effet de l’association du CSA-13 avec l’acide pluronique F-127

Les céragenines non seulement interagissent avec la membrane bactérienne, mais nous

avons démontré qu’à des concentrations élevées le CSA-13 perméabilise également la

membrane plasmique des cellules eucaryotes. Leszczynska et ses collègues rapportent une

augmentation de la libération de l’hémoglobine des globules rouges en présence de fortes

concentrations en CSA-13, mais l’association du stéroïde avec le pluronique F-127 inhibe

significativement l’activité hémolytique du CSA-13 (Leszczynska et al., 2011). Ces auteurs

suggèrent qu’une application combinée de CSA-13 et d’acide pluronique peut avoir un effet

bénéfique sur la toxicité du composé stéroïde sans pour autant modifier l’effet antimicrobien

du CSA-13. Le protocole suivi par l’équipe de Leszczynska se limite à l’étude de l’activité

perméabilisante du CSA-13 au niveau de la membrane plasmique de globules rouges. Les

céragenines, qui perturbent l’intégrité des membranes bactériennes, peuvent avoir des effets

délétères sur les mitochondries (Voronina et al., 2004). L’acide pluronique F-127 à lui seul

peut également affecter le métabolisme cellulaire au niveau mitochondrial (Alakhova et al.,

2010). Il semble donc essentiel de reconsidérer les effets d’une combinaison de l’acide

pluronique F-127 avec le CSA-13 sur des cellules pourvues d’un noyau et avec un

métabolisme aussi bien aérobie qu’anaérobie. Dans cette étude nous avons donc examiné

l’interaction de l’acide pluronique F-127 avec le CSA-13 sur P. aeruginosa et sur cellules

eucaryotes (HUVEC).

L’acide pluronique F-127 est un surfactant non-ionique composé de copolymères de

polyoxyethylène-polyoxypropylène à une concentration de 20 à 30 %. Ils forment des

agrégats multimoléculaires résultant en un corps hydrophobe central avec des chaînes

hydrophiles de polyoxyethylène dirigées vers le milieu externe, lorsque la concentration

Etude du CSA-13

152

micellaire critique est atteinte. C’est un hydrogel thermoreversible, qui est plus soluble à

faible température et qui forme un gel à température corporelle. Le pluronique F-127 est

utilisé comme véhicule dans différentes préparations pharmaceutiques (administration orale,

topique, oculaire,…) pour ses bonnes capacités de solubilisation et sa faible toxicité (Escobar-

Chavez et al., 2006). Les concentrations en acide pluronique F-127 utilisées dans ce travail

sont de ~5 %. L’analyse de la toxicité du composé, réalisée par Khattak et ses collègues, n’a

démontré aucune diminution de la viabilité cellulaire pour des concentrations en acide

pluronique égales à 5 % (Khattak et al., 2005). Des concentrations plus importantes, à partir

de 10 % de pluronique F-127, diminuent la viabilité et la prolifération cellulaire.

Activité antibactérienne

Dans un premier temps, nous avons investigué l’activité antibactérienne du CSA-13 en

présence d’acide pluronique F-127. Les propriétés antimicrobiennes du CSA-13, évaluées par

dénombrement bactérien, sont (faiblement) diminuées en présence de 5 % du dérivé

pluronique. Cette diminution de l’activité antibactérienne du CSA-13 combiné à 5 % d’acide

pluronique n’a pas été retrouvée par Leszczynska et al. (2011). Le temps court d’incubation (1

h) étudié par ces auteurs pourrait expliquer cette différence. Le choix du temps d’incubation

étudié dépend en général de la durée pendant laquelle le composé est présent et disponible

dans un organisme vivant. A l’heure actuelle, aucune donnée sur la demi-vie in vivo du CSA-

13 n’est rapportée dans la littérature, mais nous pouvons raisonnablement penser qu’elle est

probablement comprise entre 1 h (temps d’incubation étudié par Leszczynska et ses

collaborateurs) et 24 h (temps d’incubation nécessaire pour observer l’effet inhibiteur du

dérivé pluronique sur l’activité du CSA-13). Dès lors, les données observées après 3 h

d’incubation apparaissent plus pertinentes et, à ce temps, l’inhibition observée par 5 %

d’acide pluronique était plutôt marginale. En accord avec ces observations, la comparaison de

l’efficacité du CSA-13 sur P. aeruginosa, seul ou en présence d’acide pluronique, par mesure

de la captation d’IP, n’a pas montré de différence significative après 1 h d’incubation.

Toxicité sur cellules eucaryotes

Nous avons ensuite évalué l’effet de l’association sur la toxicité des cellules

endothéliales. En associant le CSA-13 à l’acide pluronique F-127, on observe une réduction

significative de la libération de la LDH ainsi que de la captation du bromure d’éthidium par

les HUVEC aux concentrations en CSA-13 toxiques (100 mg/L). Cette association semble

donc protéger les cellules de la toxicité membranaire du CSA-13. Cependant, le dérivé

Etude du CSA-13

153

stéroïdien affecte également l’intégrité des mitochondries des HUVEC. Le CSA-13 inhibe la

réduction du tétrazole par les HUVEC (test MTT), suggérant que les mitochondries ont perdu

leur capacité à transférer des électrons. Ces résultats sont confirmés par des mesures de la

captation du TMRE, un dérivé fluorescent s’accumulant dans la mitochondrie selon le

potentiel électrique de la membrane mitochondriale interne (Scaduto et Grotyohann, 1999).

L’exposition des cellules eucaryotes au CSA-13 provoque une diminution de la fluorescence

corrélée à une diminution de la captation mitochondriale du TMRE. L’ajout d’acide

pluronique ne modifie pas l’effet observé sur la mitochondrie en présence de fortes

concentrations en stéroïde. Nos résultats suggèrent donc que le CSA-13 a accès au

compartiment intracellulaire. Nous avons émis l’hypothèse que la forme non-ionique du CSA-

13 diffuserait de manière passive à travers la membrane plasmique selon son gradient de

concentration. Une fois le cytoplasme atteint, le CSA-13 se protonerait, ce qui maintiendrait

un gradient de la forme non ionique. Les pKas des divers groupements amines de la molécule

sont inconnus mais les amines secondaires se dissocient généralement à un pH autour de 10.

D’après l’équation de Henderson-Hasselbach, une augmentation du pH de 6 à 8 devrait

augmenter 100 fois la concentration de la forme neutre du composé (Hallifax et Houston,

2006). Cependant nos résultats montrent que, malgré une augmentation de la forme non

ionique du CSA-13, l’effet du composé sur la mitochondrie n’a pas changé. Ces résultats ne

sont donc pas en accord avec le modèle de diffusion de la forme neutre du CSA-13 et

suggèrent une accumulation du composé dans le cytosol par un mécanisme de transport. La

structure du CSA-13 dérive des acides choliques. Les sels biliaires, dérivés de l’acide

cholique, traversent les membranes plasmiques par diffusion (transport passif) mais également

par transport actif (Dawson et al., 2009). La synthèse de médicaments combinant l’acide

cholique et une molécule active a été proposée afin de faciliter la captation cellulaire de ces

pro-drogues par les nombreux transporteurs des sels biliaires (Sievänen, 2007). Il est donc

concevable que des types similaires de transporteurs puissent également transporter le CSA-

13 à travers la membrane plasmique. Une fois entré dans le compartiment intracellulaire, le

composé peut facilement interagir avec les membranes mitochondriales. Ce modèle s’accorde

avec les résultats de Trainor et al. (2011) qui ont montré que la résistance de H. pylori au

CSA-13 implique HefC, une pompe à efflux capable de transporter les sels biliaires et les

céragenines.

En conclusion, ainsi que le montre le dosage de la captation de bromure d’éthidium et

de la libération de la LDH, une concentration faible (3 %) en dérivé pluronique permet une

Etude du CSA-13

154

inhibition de la perméabilisation de la membrane plasmique des cellules eucaryotes par le

CSA-13. Cependant l’acide pluronique F-127, même à une concentration de 6 %, n’inhibe pas

l’effet délétère du CSA-13 sur la fonction mitochondriale. Braff et ses collaborateurs ont

également mis en évidence une différence dans les résultats mesurant la perméabilité

membranaire et ceux évaluant la fonction mitochondriale des kératinocytes. Ainsi le LL-37 à

la concentration de 10 µM n’affecte pas la perméabilité membranaire des kératinocytes

(LDH) mais diminue la réduction du tetrazolium (test MTT) (Braff et al., 2005). Dès lors,

l’étude de la toxicité in vitro de dérivés synthétiques à hautes concentrations ne devrait pas se

focaliser uniquement sur l’intégrité de la membrane plasmique des cellules eucaryotes mais

également sur la fonction mitochondriale. Nous pouvons ainsi conclure que le CSA-13 affecte

non seulement l’intégrité des membranes plasmiques de cellules eucaryotes mais exerce

également des effets délétères sur leurs mitochondries. L’ajout de l’acide pluronique F-127 ne

peut que soulager une partie de ces effets toxiques et ne peut donc être proposé comme agent

dispersant neutralisant la toxicité du stéroïde cationique.

Ces résultats sont basés sur des expériences réalisées in vitro et il n’est pas clairement

établi comment l’interaction du CSA-13 avec les mitochondries va avoir un impact sur la

toxicité des cellules eucaryotes in vivo. De futures expérimentations in vivo sont nécessaires

pour déterminer si les effets potentiels adverses du CSA-13 sur les mitochondries diminuent

la fenêtre thérapeutique dans laquelle le composé antimicrobien peut être utilisé.

Conclusion et perspectives

Dans cette partie de notre travail, nous avons confirmé le potentiel bactéricide du

CSA-13 sur des cultures planctoniques de 8 souches de P. aeruginosa, comprenant des

souches de référence et des souches cliniques isolées de patients atteints de mucoviscidose.

Nous avons démontré qu’une concentration très faible et non cytotoxique de CSA-13 (10 fois

inférieure à la CMI), inhibe la formation d’un biofilm, de 3 sur les 8 souches testées, via des

interactions électrostatiques. Une concentration plus importante, de 20 à 200 mg/L, de CSA-

13 éradique l’entièreté du biofilm âgé de 24 h pour 7 des 8 souches étudiées. Six souches ont

été évaluées dans un biofilm mature et toutes ont répondu au composé avec des

concentrations croissantes ou un temps d’exposition du composé au biofilm plus important.

Aucune résistance au CSA-13 n’est apparue durant le traitement. L’usage de la MCBL a

confirmé la rapidité et l’efficacité d’action du composé stéroïdien sur un biofilm robuste et

complexe de P. aeruginosa par visualisation dans le temps et dans l’espace de l’effet du CSA-

Etude du CSA-13

155

13 sur le biofilm. Ces résultats soulignent la sensibilité au CSA-13 de 7 sur les 8 souches, soit

à un stade initial de la formation du biofilm, soit après maturation du biofilm. Ces résultats

corroborent le potentiel important comme agents thérapeutiques, envers tous les stades de

formation et de développement du biofilm, de composés à structure amphiphile comme le

CSA-13, avec une face cationique favorisant les interactions avec les membranes bactériennes

chargées négativement et leur face hydrophobe qui contribue à la perturbation de ces

membranes.

Un bénéfice évident à administrer une combinaison de CSA-13 et de tobramycine s’est

dégagé dans cette étude aussi bien sur un biofilm jeune que mature. Dans certaines conditions,

le CSA-13 semble même prévenir la résistance à la tobramycine.

La conception d’expériences in vivo sera cependant indispensable pour confirmer

l’intérêt du CSA-13 ou d’une co-administration de CSA-13 et de la tobramycine dans le

traitement des infections à P. aeruginosa chez des patients atteints de mucoviscidose.

Nos études in vitro sur cellules eucaryotes ont mis en évidence une toxicité

membranaire provoquée par le CSA-13 lors de l’administration de concentrations

importantes. L’association du CSA-13 avec l’acide pluronique F-127 a permis de

significativement réduire la toxicité du composé sur les membranes. Cependant, l’association

n’a pas soulagé les effets délétères exercés par le CSA-13 sur l’activité mitochondriale. Les

études devront donc se poursuivre afin d’affiner notre compréhension du mécanisme d’action

des céragenines et de décéler des dérivés moins toxiques. L’évaluation de l’activité in vivo du

composé devrait nous éclairer quant à la fenêtre thérapeutique utilisable en clinique.

En conclusion, les stéroïdes cationiques antimicrobiens dérivés de l’acide cholique

offrent de nouvelles perspectives pour le traitement de souches résistantes de P. aeruginosa se

développant dans un biofilm. Une faible concentration non cytotoxique de CSA-13 peut être

bénéfique pour la prévention de la formation d’un biofilm. L’activité antibactérienne de ces

composés n’est pas affectée par l’ADN et l’actine-F qui sont présents en concentrations

importantes ou par la composition ionique des fluides respiratoires dans la mucoviscidose. Ils

sont donc un modèle de composés prometteurs pour le traitement d’infections chroniques

provoquées par ce pathogène et qui sont si fréquentes et délétères pour les patients atteints de

mucoviscidose.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

156

CHAPITRE III

ETUDE DU PEPTIDE LL-37 ET DE

SES DERIVES

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

157

I. INTRODUCTION

La hausse fulgurante de la résistance bactérienne et le faible développement de

nouveaux antibiotiques sont une réelle menace pour la santé publique (Kuehn, 2011). La

recherche de nouvelles molécules antibactériennes est donc devenue une priorité. Les PAM

sont un attrait majeur dans la recherche de nouvelles stratégies anti-infectieuses. Par leur

mécanisme d’action non spécifique, ils contournent la résistance bactérienne. De plus, les

PAM possèdent une activité antimicrobienne très large. De nombreuses approches sont

envisagées et explorées afin d’optimaliser le potentiel thérapeutique des PAM pour le

traitement des infections liées à des souches multirésistantes.

Les cathélicidines sont un groupe de PAM retrouvés chez différentes espèces

mammifères. Chez l’homme, une seule cathélicidine, la protéine hCAP18/LL-37 a été

identifiée. Nous voulons explorer son potentiel thérapeutique dans les infections pulmonaires

persistantes chez les patients atteints de mucoviscidose colonisés de manière prédominante

par P. aeruginosa. Les infections à P. aeruginosa présentent en effet un problème majeur car

cette bactérie développe rapidement une résistance à l’antibiothérapie. Dans ce travail, nous

exploitons l’activité anti-Pseudomonas de fragments dérivés de la cathélicidine humaine LL-

37 par utilisation d’une librairie de 13 peptides aux propriétés physico-chimiques distinctes.

Ces fragments possèdent en effet de légères différences d’hydrophobicité, d’amphipaticité, de

charge ou de degré d’hélice-α susceptibles de modifier considérablement l’activité

antimicrobienne des peptides et leur toxicité (Friedrich et al., 1999). Un screening de l’effet

antibactérien et antibiofilm des peptides dérivés du LL-37 a été réalisé sur la souche la plus

documentée dans la littérature sur la mucoviscidose, la souche ATCC PAO1. Nous avons

également exploré quelques propriétés des peptides comme leur capacité à former une hélice-

α ou leur liaison aux LPS.

Tableau 7 : Séquences et caractéristiques du LL-37 et de ses fragments dérivés

Séquences des acides aminés PMa

Index de

Boman HRMb H Moy

c Charge

Hyd

Moyd Hydro

e Agadir

1 7 13 19 25 31 37

LL-37 LL-37

LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES 4494 2,99 0,59 3,74 6 -1,84 35 % 5,10

LL-31 LL-31 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNL 3824 2,81 0,70 4,43 6 -1,47 38 % 3,72

LL-25 LL-25 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIK 3065 2,79 0,62 3,91 6 -1,99 36 % 1,19

LL-19 LL-19 LLGDFFRKSKEKIGKEFKR 2327 3,03 0,60 3,77 4 -2,38 31 % 0,92

LL-13 LL-13 LLGDFFRKSKEKI 1581 2,21 0,62 3,90 2 -1,14 38 % 0,84

LL7-31 RK-25 RKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNL 3131 3,81 0,75 4,72 7 -2,98 32 % 4,06

LL13-31 IG-19 IGKEFKRIVQRIKDFLRNL 2374 2,82 0,88 5,54 4 -1,16 42 % 4,33

LL7-25 RK-19 RKSKEKIGKEFKRIVQRIK 2372 4,09 0,65 4,08 7 -4,13 26 % 0,73

LL13-25 IG-13 IGKEFKRIVQRIK 1615 2,77 0,79 4,97 4 -2,01 38 % 0,71

LL7-37 RK-31 RKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES 3801 3,83 0,62 3,90 7 -3,12 29 % 5,68

LL13-37 IG-25 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES 3044 3,08 0,69 4,33 4 -1,78 36 % 5,87

LL19-37 RI-19 RIVQRIKDFLRNLVPRTES 2341 3,58 0,65 4,11 3 -1,73 36 % 2,08

LL25-37 KD-13 KDFLRNLVPRTES 1575 3,59 0,55 3,50 1 -2,18 30 % 0,09

aPM = poids moléculaire

bHRM = moment hydrophobe relatif moyen

cH moyen = moment hydrophobe moyen

dHydrophobicité moyenne

eHydro = acides aminés hydrophobes

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

158

II. RESULTATS

II.1 SEQUENCES ET CARACTERISTIQUES DES PEPTIDES

Les peptides étudiés dans ce travail et présentés dans le tableau 7 comprennent environ

70 % d’acides aminés hydrophiles avec une proportion importante de résidus basiques. Ils

sont cationiques. A pH neutre, la charge positive est de +1 à +7 en fonction des peptides. Le

moment hydrophobe moyen, le moment hydrophobe relatif moyen et l’hydrophobicité

moyenne sont calculés avec le programme HydroMCalc de Tossi et ses collaborateurs en

utilisant l’échelle d’hydrophobicité de Eisenberg (Tossi et al., 2002). L’hydrophobicité

moyenne correspond à l’hydrophobicité totale (somme des indices d’hydrophobicité de tous

les résidus) divisée par le nombre de résidus. Le moment hydrophobe est une mesure de

l’amphipaticité de l’hélice. Il est la somme vectorielle de tous les indices d’hydrophobicité

divisée par le nombre de résidus. Le moment hydrophobe relatif moyen d’un peptide est son

moment hydrophobe relatif à celui d’un peptide parfaitement amphipatique. Une valeur de 0,5

indique que le peptide présente environ 50 % de l’amphipaticité maximale possible (Tossi et

al., 2002). Le moment hydrophobe relatif moyen est très similaire parmi les peptides (de 0,5 à

0,9) indiquant qu’ils ont une amphipaticité très importante. Les peptides ont également un

potentiel de liaison aux protéines comparable avec un index de Boman variant entre 2 et 4

(Boman, 2003). L’index Agadir est une mesure de la tendance des peptides à former une

hélice-α (Lacroix et al., 1998). Cet index varie fortement au sein des différents fragments (de

moins de 1 à plus de 5 pour les peptides LL-37, LL7-37 et LL13-37). La suppression de 6 à

12 acides aminés du domaine C-terminal (LL-25) mais non du domaine N-terminal (LL13-37)

diminue fortement la tendance des peptides à former une hélice-α. En accord avec ces

résultats, le fragment intermédiaire LL13-31 a un score Agadir compatible avec la formation

d’une hélice-α.

A partir de ce tableau nous pouvons conclure que la plupart des fragments possèdent

les propriétés cationiques et amphiphiles du peptide initial LL-37 et que le plus petit peptide

formant une hélice-α s’étend du résidu 13 au résidu 31.

Tableau 8 : Détermination de la CMI et de la CMB des peptides

La détermination de la CMI est réalisée par la technique de microdilution de 2 en 2

conformément au protocole du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2003).

Après 24 h d’incubation à 35 °C, les résultats sont lus par observation de l’absence de

turbidité. Les puits clairs de cette même microplaque sont repiqués et après 24 h d’incubation

à 35 °C la CMB est déterminée. Les résultats sont exprimés en µM.

Figure 86 : Cinétique de l’effet du LL-37 sur la perméabilité à l’IP

0 10 20 30 40 50 600

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000 0 µM

1 µM

5 µM

10 µM

2,5 µM

Temps (min)

Ca

pta

tio

n d

'IP

(u

.a.f

.)

Une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1 est incubée en présence de différentes

concentrations de LL-37 et en présence d’IP pendant 1 h. La fluorescence est lue toutes les

min. Les résultats sont exprimés en u.a.f. et sont la moyenne ± SEM de 3 essais indépendants

réalisés en duplicat (n = 3). Pour la clarté du graphique, un point sur trois est représenté.

CMI

(µM)

CMB

(µM)

LL-37 25 >100

LL-31 50 >100

LL-25 >100 >100

LL-19 >100 >100

LL-13 >100 >100

LL7-31 100 >100

LL13-31 100 >100

LL7-25 >100 >100

LL13-25 >100 >100

LL7-37 50 >100

LL13-37 >100 >100

LL 19-37 >100 >100

LL 25-37 >100 >100

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

159

II.2 EFFET DES PEPTIDES SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES

II.2.1 Determination de la CMI et de la CMB

Le peptide LL-37 est le plus actif (CMI : 25 µM). ATCC PAO1 est sensible de manière

égale aux fragments LL-31 et LL7-37 (CMI : 50 µM). La souche est légèrement moins

sensible au LL7-31 et LL13-31 (CMI : 100 µM). Les autres fragments peptidiques présentent

une CMI > 100 µM. Ces résultats suggèrent la contribution de la partie centrale du peptide

(LL13-31) à l’activité inhibitrice des peptides sur la croissance bactérienne. L’activité

bactéricide requiert des concentrations > 100 µM pour tous les peptides étudiés.

II.2.2 Effet des peptides sur la perméabilité à l’IP

La fluorescence de l’IP est stable durant l’incubation des bactéries en absence de

peptides (0 µM) (figure 86). Ce résultat confirme l’intégrité des membranes bactériennes

incubées en conditions contrôles. Lorsque les bactéries sont exposées à 10 µM de LL-37,

celles-ci deviennent perméables à l’ion et la fluorescence augmente durant les 40 premières

min.

L’effet des peptides dérivés du LL-37 sur l’entrée d’IP dans la bactérie est étudié à

différentes concentrations (0 à 10 µM). Comme le montre la figure 87, le peptide LL-37

présente l’activité antimicrobienne la plus importante et induit la perméabilisation de la

membrane à une faible concentration de 2,5 µM (n = 3 ; P < 0,001). A 5 µM, les fragments

LL-31 et LL7-37 perméabilisent également de manière significative la membrane (n = 3 ; P <

0,001). L’activité de la cathélicidine LL-37 augmente fortement à 10 µM. A cette même

concentration, la suppression de 6 acides aminés au niveau de l’extrémité N-terminale (LL7-

37) provoque une diminution de l’activité de ~50 % par rapport au peptide initial (figure 87

C). La suppression des 6 acides aminés suivants (LL13-37) abolit l’activité antimicrobienne.

Après suppression de 6 acides aminés au niveau de l’extrémité C-terminale (LL-31), le

peptide conserve une activité significative de perméabilisation (figure 87 A). De plus petits

fragments (LL-25, LL-19, LL-13, LL13-37, LL19-37 et LL25-37) n’ont pas d’effet

significatif sur la variation de la fluorescence. Lorsque la délétion de résidus est réalisée de

Figure 87 : Effet des peptides sur la perméabilité à l’IP

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000LL-37

LL-31

LL-25

LL-19

LL-13

A

-1 0 1

***

***

***

***

***

Concentration en peptide (Log µM)

Cap

tatio

n d

'IP (

u.a

.f.)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

B

-1 0 1

LL-31

LL7-31

LL-25

LL13-31

LL7-25

LL13-25

***

***

Concentration en peptide (Log µM)

Cap

tatio

n d

'IP (

u.a

.f.)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

C

-1 0 1

LL-37

LL7-37

LL13-37

LL19-37

LL25-37

***

***

***

***

***

Concentration en peptide (Log µM)

Cap

tatio

n d

'IP (

u.a

.f.)

Une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1 est incubée à 37 °C pendant 1 h en

présence de 10 µM d’IP et en absence (conditions contrôles) ou en présence de différentes

concentrations des fragments N-terminaux (figure A), des fragments intermédiaires (figure B)

ou des fragments C-terminaux (figure C). Pour comparaison, les fragments LL-31 et LL-25

sont représentés dans la figure B. Les résultats sont la variation de fluorescence provoquée par

les peptides après 1 h et sont exprimés en u.a.f. Ils sont la moyenne ± SEM de 2 à 4 essais

indépendants réalisés en duplicat (n = 2 à 4). *** P < 0,001.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

160

part et d’autre du peptide, la fluorescence diminue de ~40 à 50 % pour les peptides LL7-31 et

LL13-31 mais l’effet des fragments est toujours significatif. En conclusion, 5 peptides (LL-

37, LL-31, LL7-37, LL7-31 et LL13-31) ont une activité antibactérienne significative sur

ATCC PAO1 à la concentration de 10 µM (n = 3 ; P < 0,001). Ces résultats confirment aussi

que la partie centrale du peptide (LL13-31) est la partie dont l’activité antimicrobienne est la

plus importante.

Figure 88 : Relation semi-logarithmique

entre la perméabilité à l’IP et la mort bactérienne

0 0,1 0,5 1 2,5 5 100

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0

2

4

6

8

Dénombrement

Captation d'IP

LL-37 (µM)

Ca

pta

tio

n d

'IP

(u

.a.f

.)- L

og

(ufc

/mL

)

Une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1 est incubée à 37 °C pendant 1 h en

présence de différentes concentrations (0 à 10 µM) de la cathélicidine LL-37. L’effet du

peptide sur la membrane bactérienne est évalué par un essai de perméabilité à l’IP (colonnes

avec damier) et par réalisation en parallèle d’un dénombrement bactérien des cellules vivantes

(colonnes hachurées). Les résultats sont exprimés en u.a.f. (n = 3) et en variation

logarithmique du nombre d’ufc/mL (n = 2).

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

161

II.2.3 Relation entre perméabilité membranaire et mort cellulaire

La perméabilité membranaire peut être un phénomène transitoire, les dommages

membranaires pouvant être réparés (Davey et Hexley, 2011). Dès lors l’utilisation des termes

« IP-positif » et « mort cellulaire » de manière synonyme peut être erronée. Afin de confirmer

la mort cellulaire, un dénombrement bactérien est réalisé en parallèle à l’essai de

perméabilisation à l’IP. Des concentrations inférieures à 2,5 µM de la cathélicidine LL-37

n’ont pas significativement augmenté la perméabilité à l’IP. A 2,5 ; 5 et 10 µM, le peptide

augmente significativement la captation d’IP. En présence de 2,5 µM de LL-37, le nombre de

bactéries vivantes, exprimé en log ufc/mL, diminue de 7,9 à 5,4 et diminue jusqu’à 3,6 en

présence de 5 µM de LL-37. La limite de détection est atteinte à 10 µM de LL-37. Ces

résultats confirment la toxicité du LL-37 sur les bactéries.

Figure 89 : Effet des peptides à 10 µM sur la formation d’un biofilm

LL-37LL-31

LL-25LL-19

LL-130

20

40

60

80

100

120 Fragments N-terminauxA

**

***

*****

Fo

rmatio

n d

u b

iofilm

(%

)

LL7-31

LL13-31

LL7-25

LL13-250

20

40

60

80

100

120 Fragments intermédiairesB

***

Fo

rmatio

n d

u b

iofilm

(%

)

LL-37

LL7-37

LL13-37

LL19-370

20

40

60

80

100

120 Fragments C-terminauxC

*****

**

Fo

rmatio

n d

u b

iofilm

(%

)

L’effet des fragments N-terminaux (figure A), des fragments intermédiaires (figure B) et des

fragments C-terminaux (figure C) à la concentration de 10 µM sur la prévention de la

formation d’un biofilm de 18 h est évalué par la technique de coloration au CV. La masse de

biofilm résiduel est estimée par mesure de la DO 590 nm. Les résultats sont exprimés en

pourcentage de formation du biofilm avec un pourcentage maximal correspondant aux puits

contrôles (pas de peptide ajouté aux bactéries, trait pointillé). Les résultats sont la moyenne ±

SEM de 9 valeurs obtenues dans 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 9). * P

< 0,05 ; ** P < 0,01 ; *** P < 0,001.

Figure 90 : Effet de 6 peptides à différentes concentrations sur la formation d’un biofilm

0 2 4 6 8 100

20

40

60

80

100

120LL-37LL7-37 Contrôle

LL13-37

Concentration en peptide (µM)

Fo

rmatio

n d

u b

iofilm

(%

)

0 2 4 6 8 100

20

40

60

80

100

120LL-31LL7-31

LL-19Contrôle

Concentration en peptide (µM)

Fo

rmatio

n d

u b

iofilm

(%

)

ns******

*******

***

*******

Plusieurs dilutions des peptides LL-37, LL7-31, LL7-37 et LL13-37 (concentrations finales

1 ; 2,5 ; 5 et 10 µM) sont incubées pendant 18 h dans les puits d’une microplaque contenant

une suspension bactérienne de P. aeruginosa ATCC PAO1. La masse de biofilm résiduel est

évaluée par la technique de coloration au CV. Les résultats sont exprimés en pourcentage de

formation de biofilm avec un pourcentage maximal correspondant aux puits contrôles (pas de

peptide ajouté aux bactéries, trait pointillé). Les résultats sont la moyenne ± SEM de 9 valeurs

obtenues dans 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 9).

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

162

II.3 EFFET DES PEPTIDES SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM

La capacité des peptides à inhiber la formation d’un biofilm de 18 h est évaluée par la

technique de coloration au CV. Un contrôle est effectué par incubation du peptide LL-37

(concentration finale 10 µM) pendant une nuit dans les puits d’une microplaque en

polystyrène. Le lendemain, les puits sont rincés et le développement du biofilm est comparé

avec les puits contrôles (pas de pré-incubation avec le peptide). Il n’y a pas de différence

significative dans la formation du biofilm confirmant que le peptide ne se lie pas à la surface

du puits.

Huit parmi les 13 peptides (les peptides LL-37, LL-31, LL-25, LL-19, LL7-31, LL7-

25, LL7-37 et LL13-37) inhibent de manière significative la formation d’un biofilm ATCC

PAO1 (figure 89). Le peptide initial LL-37 provoque une inhibition de ~60 % de la formation

du biofilm (n = 9 ; P < 0,01). Les peptides LL-31 et LL7-37 sont les plus efficaces et

induisent une réduction de ~70 % de la biomasse (n = 9 ; P < 0,001).

L’activité de 6 peptides (LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31, LL7-31 et LL-19) est

ensuite investiguée par mesure du pourcentage de biofilm résiduel après incubation avec

différentes concentrations des fragments (figure 90). Les peptides LL-37, LL7-37 et LL-31

inhibent significativement le pourcentage de formation de biomasse à une faible concentration

de 5 µM (n = 9 ; P < 0,001). A cette concentration, les autres peptides n’ont pas d’effet

significatif sur l’inhibition de la formation du biofilm. L’administration préventive de plus

faibles concentrations (< 5 µM) n’a pas d’activité significative sur la formation du biofilm.

Un dénombrement des cellules vivantes après 18 h d’incubation de P. aeruginosa

ATCC PAO1 avec 4 peptides (10 µM) est réalisé. Il n’y a pas de différence significative dans

le nombre de bactéries viables parmi les bactéries incubées dans les conditions contrôles et

celles exposées aux fragments (contrôle: 10,1 log ufc/mL ; LL-37: 9,8 log ufc/mL ; LL7-37:

10,1 log ufc/mL ; LL13-37: 9,7 log ufc/mL ; LL-31: 9,9 log ufc/mL). A partir de ces résultats,

on peut conclure que la capacité des peptides à diminuer la biomasse n’est pas liée à la mort

cellulaire et à une diminution de leur nombre, mais probablement à une diminution de la

matrice organique.

Figure 91 : Effet de 6 peptides sur un biofilm ATCC PAO1-GFP

Un biofilm de 24 h de la souche PAO1-GFP, développé dans les puits d’une microplaque à

base µclear, est exposé à des concentrations croissantes de peptide en présence de 10 µM d’IP

pendant 25 min. Après traitement, le biofilm est rincé et observé par MCBL. Les cellules

vivantes apparaissent vertes par expression de la GFP et les cellules endommagées

apparaissent rouges par perméabilisation à l’IP. Les images représentent une section

horizontale dans les plans xy et sont les plus représentatives de 2 expériences indépendantes.

Les barres blanches représentent une distance de 20 µm.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

163

II.4 EFFET DES PEPTIDES SUR UN BIOFILM PREFORME – ETUDE PAR

MCBL

II.4.1 Effet des peptides sur un biofilm préformé dans une microplaque

Dans un premier temps, l’effet de 6 peptides à différentes concentrations est étudié sur

un biofilm préformé dans une microplaque par la souche ATCC PAO1 exprimant la GFP

(pMF230) (figure 91). Les bactéries incubées dans des conditions contrôles sont vertes avec

très peu de petits spots rouges. Ces résultats confirment que les bactéries incubées en

conditions contrôles sont imperméables à l’IP. La plupart des bactéries exposées à 100 µM de

LL-37 virent au rouge. L’effet du LL-37 est dose-dépendant dans la gamme de concentrations

de 20 à 100 µM. Un plus petit peptide, le fragment LL7-37 est très efficace et même plus

efficace que le peptide initial LL-37. A 20 µM, il provoque l’augmentation de la captation

d’IP par une fraction considérable de la surface du biofilm. Les deux fragments LL-31 et

LL7-31 ont une activité similaire au LL7-37. Ces trois fragments sont les plus efficaces dans

la perméabilisation de la membrane bactérienne au sein du biofilm. Le fragment LL13-37 est

moins actif que le peptide initial LL-37 (LL7-37 = LL-31 = LL7-31 > LL-37 > LL13-37)

mais à la concentration de 100 µM il induit la perméabilisation de la totalité du biofilm au

fond du puits. Par contre, le fragment LL-19 se distingue des 5 autres peptides étudiés : il n’a

qu’un effet marginal et provoque une très faible augmentation de la captation d’IP à 100 µM.

En conclusion, ces résultats établissent que le peptide LL-37 et certains de ses

fragments ont une activité bactéricide même au sein d’un biofilm ATCC PAO1 mais à des

concentrations plus élevées que celles actives sur culture planctonique (test de

perméabilisation à l’IP).

Tableau 9 : Effet de 6 peptides sur les biofilms préformés de 5 souches cliniques

MC099-450467 PYO2

0 µM 20 µM 50 µM 100 µM 0 µM 20 µM 50 µM 100 µM

LL-37 - + + ++ LL-37 - - + ++

LL7-37 - - + ++ LL7-37 - - + ++

LL13-37 - - - + LL13-37 - - - -

LL-31 - + + ++ LL-31 - - - ++

LL7-31 - + + ++ LL7-31 - - + ++

LL-19 - - - - LL-19 - - - ++

MC093-450507 MC75-450457

0 µM 20 µM 50 µM 100 µM 0 µM 20 µM 50 µM 100 µM

LL-37 - + + ++ LL-37 - - - ++

LL7-37 - + + ++ LL7-37 - - + ++

LL13-37 - - - - LL13-37 - - - ++

LL-31 - + + + LL-31 - - - ++

LL7-31 - - - + LL7-31 - + + ++

LL-19 - - - - LL-19 - - - -

PYO1

0 µM 20 µM 50 µM 100 µM

LL-37 - - + ++

LL7-37 - + + ++

LL13-37 - - - ++

LL-31 - + + ++

LL7-31 - + + ++

LL-19 - - - -

Des biofilms de 24 h de 5 souches cliniques exprimant la GFP (les souches PYO1, PYO2,

MC75-450457, MC099-450467 et MC093-450507) développés dans les puits d’une

microplaque à base µclear sont exposés à des concentrations croissantes de peptide en

présence de 10 µM d’IP pendant 25 min. Après traitement, les biofilms sont rincés et observés

par MCBL. Les cellules vivantes apparaissent vertes par expression de la GFP et sont

représentées par un signe (-). Les cellules endommagées apparaissent rouges par

perméabilisation à l’IP : lorsqu’une partie du biofilm est endommagée on note un signe (+) ;

lorsque l’entièreté du biofilm est endommagée on note un signe (++).

- Aucune perméabilisation à l'IP

+ Perméabilisation à l'IP d'une

partie du biofilm

++ Perméabilisation à l'IP de

l'entièreté du biofilm

- Aucune perméabilisation à

l'IP

+ Perméabilisation à l'IP d'une

partie du biofilm

++ Perméabilisation à l'IP de

l'entièreté du biofilm

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

164

L’expérience est répétée sur 5 souches cliniques de P. aeruginosa exprimant la

GFP (pMF230) : les souches PYO1, PYO2, MC75-450457, MC099-450467 et MC093-

450507 (tableau 9).

Le peptide LL-37 affecte les bactéries du biofilm MC099-450467 et MC093-450507

à une faible concentration de 20 µM. A 50 µM, il provoque l’augmentation de la captation de

l’agent fluorescent également pour les souches PYO1 et PYO2 et à 100 µM le biofilm des 5

souches cliniques de P. aeruginosa est totalement affecté par le peptide.

De manière générale, le peptide LL7-37 possède une activité similaire au peptide

initial LL-37. Il endommage les bactéries du biofilm MC093-450507 et PYO1 à une faible

concentration de 20 µM. Toutes les souches sont sensibles à 50 µM de LL7-37 et une

proportion importante de la surface du biofilm est atteinte. Une concentration plus importante

de 100 µM perméabilise l’ensemble des cellules du biofilm formé par les 5 souches.

Le fragment LL13-37 est efficace sur 3 des 5 souches cliniques (MC099-450467,

PYO1 et MC75-450457) à une concentration importante de 100 µM.

Une faible concentration du peptide LL-31 (20 µM) endommage le biofilm formé par

3 des 5 souches cliniques (PYO1, MC099-450467 et MC093-450507). A 100 µM, le fragment

perméabilise la totalité du biofilm formé par les 5 souches.

Une faible concentration du peptide LL7-31 (20 µM) endommage le biofilm formé

par 3 des 5 souches cliniques (MC099-450467, PYO1 et MC75-450457). Le peptide est très

actif et à 100 µM toutes les souches sont sensibles au fragment et la captation d’IP augmente

fortement.

Aucune activité n’est observée avec le peptide LL-19, excepté sur la souche PYO2 à

une concentration importante de 100 µM.

Figure 92 : Effet des peptides LL-37 et LL7-37 sur un biofilm ATCC PAO1-GFP

Les peptides LL-37 et LL7-37 (concentration finale 50 μM) sont déposés pendant 25 min sur

un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Les cellules vivantes

apparaissent vertes par expression de la GFP et les cellules endommagées apparaissent rouges

par perméabilisation à l’IP. Les images de MCBL montrent une section horizontale du biofilm

et 2 sections dans les plans xz et yz (colonne de gauche). La colonne de droite représente une

vue tridimensionnelle du sommet du biofilm. Les images micrographiques sont les plus

représentatives de 2 expériences. La barre d’échelle représente 30 µm.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

165

En conclusion, l’étude de l’effet des peptides à l’aide de la MCBL sur des biofilms

formés dans les puits d’une microplaque a permis de réaliser un screening de l’effet de

différentes concentrations sur différentes souches. Une distinction dans l’importance de l’effet

entre les 6 peptides peut être établie. Le peptide original LL-37 et les dérivés LL7-37, LL7-31

et LL-31 ont une activité comparable. A une concentration de 20 µM, ces peptides

endommagent la membrane bactérienne et l’entrée d’IP au sein de la cellule est observée.

Cependant l’ensemble des bactéries du biofilm n’est pas perméable à l’IP. La proportion du

biofilm sensible aux peptides est nettement plus importante à une concentration en peptide de

50 µM, et, à 100 µM, la totalité du tapis cellulaire du puits est endommagée. Le fragment

LL13-37 est nettement moins actif que le peptide initial. La partie N-terminale du peptide, le

fragment LL-19, n’a aucune activité sur le biofilm formé par les 5 souches et ce même aux

concentrations élevées.

II.4.2 Effet des peptides sur un biofilm préformé dans un réacteur CDC

Effet des peptides sur un biofilm ATCC PAO1 préformé dans un réacteur CDC

L’effet des 6 peptides à 50 µM est évalué sur un biofilm préformé par la souche ATCC

PAO1 (figures 92, 93 et 94). Les biofilms sont développés sur les coupons de verre d’un

réacteur CDC avec des bactéries exprimant la GFP. Les bactéries incubées dans des

conditions contrôles apparaissent vertes confirmant que les bactéries incubées en conditions

contrôles sont imperméables à l’IP. Quatre peptides (LL-37, LL7-37, LL-31 et LL7-31) ont

une activité comparable sur la perméabilisation des bactéries au sein d’un biofilm dont la

structure est robuste et complexe (figures 92 et 93). Les peptides endommagent fortement la

surface du biofilm sans atteindre la base de la structure. Ces résultats soulignent que des

fragments dérivés du peptide initial ont une activité antibactérienne sur les cellules sessiles

d’un biofilm épais avec une structure tridimensionnelle complexe. Le fragment LL13-37

présente une activité plus faible sur la dégradation du biofilm (figure 94). L’effet du LL-19 est

pratiquement inexistant (figure 94). Ces résultats sont comparables avec ceux observés sur les

biofilms formés en microplaque.

Figure 93 : Effet des peptides LL-31 et LL7-31 sur un biofilm ATCC PAO1-GFP

Les peptides LL-31 et LL7-31 (concentration finale 50 μM) sont déposés pendant 25 min sur

un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Les cellules vivantes

apparaissent vertes par expression de la GFP et les cellules endommagées apparaissent rouges

par perméabilisation à l’IP. Les images de MCBL montrent une section horizontale du biofilm

et 2 sections dans les plans xz et yz (colonne de gauche). La colonne de droite représente une

vue tridimensionnelle du sommet du biofilm. Les images micrographiques sont les plus

représentatives de 2 expériences. La barre d’échelle correspond à 30 µm.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

166

Figure 94 : Effet des peptides LL13-37 et LL-19 sur un biofilm ATCC PAO1-GFP

Les peptides LL13-37 et LL-19 (concentration finale 50 μM) sont exposés pendant 25 min sur

un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Les cellules vivantes

apparaissent vertes par expression de la GFP et les cellules endommagées apparaissent rouges

par perméabilisation à l’IP. Les images de MCBL montrent une section horizontale du biofilm

et 2 sections dans les plans xz et yz (colonne de gauche). La colonne de droite représente une

vue tridimensionnelle du sommet du biofilm. Les images micrographiques sont les plus

représentatives de 2 expériences. La barre d’échelle représente 30 µm.

Figure 95 : Effet des peptides LL7-37 et du LL-37 sur un biofilm ATCC PAO1-GFP

Les peptides LL7-37 et LL-37 à (A) 0, (B) 25, (C) 50 et (D) 100 μM sont exposés pendant 25

min sur un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Les cellules vivantes

apparaissent vertes par expression de la GFP et les cellules endommagées apparaissent rouges

par perméabilisation à l’IP. Pour chaque peptide, les images de MCBL montrent une section

horizontale du biofilm et 2 sections dans les plans xz et yz (colonne de gauche). La colonne

de droite représente une vue tridimensionnelle du sommet du biofilm. Les images

micrographiques sont les plus représentatives de 2 expériences. Les barres blanches indiquent

une distance de 30 µm.

LL7-37 LL-37

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

167

L’activité de différentes concentrations du peptide LL7-37, un des fragments les plus

actifs sur les biofilms, est étudiée et comparée à l’activité du peptide LL-37 (figure 95). L’IP

n’a pas coloré le biofilm dans les conditions contrôles (0 µM). Les concentrations actives de

peptide sur un biofilm développé dans un réacteur CDC sont dans la même gamme que celles

actives sur un biofilm développé dans une microplaque. A de plus faibles concentrations, les

peptides LL-37 et LL7-37 augmentent non seulement la perméabilité à l’IP de certaines

bactéries mais endommagent également la couche supérieure du biofilm. Une concentration

importante des peptides (100 µM) perméabilise la membrane bactérienne de l’entièreté de la

microcolonie et perturbe l’intégrité de la surface du biofilm.

Figure 96 : Effet des peptides LL-37 et LL7-37 sur un biofilm ATCC 15442

Les peptides LL-37 et LL7-37 (concentration finale 100 μM) sont exposés pendant 25 min sur

un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Après traitement, le biofilm est

rincé et marqué par le kit BacLight™ Live/Dead®. Les cellules vivantes apparaissent vertes,

par marquage par l’indicateur fluorescent Syto9 spécifique des cellules vivantes, et les

cellules endommagées apparaissent rouges par perméabilisation à l’IP. Les images de MCBL

montrent une section horizontale du biofilm et 2 sections dans les plans xz et yz (colonne de

gauche). La colonne de droite représente une vue tridimensionnelle du sommet du biofilm.

Les images micrographiques sont les plus représentatives de 2 expériences. La barre d’échelle

correspond à 30 µm.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

168

Effet des peptides sur un biofilm ATCC 15442 préformé dans un réacteur CDC

L’effet des 6 peptides (LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31, LL7-31 et LL-19) à 100 µM

est également évalué sur un biofilm préformé par la souche de référence ATCC 15442

(figures 96, 97 et 98). Les biofilms sont développés dans un réacteur CDC et marqués par le

kit BacLight™ Live/Dead®

après traitement. Les biofilms incubés dans des conditions

contrôles (absence de peptide) apparaissent verts confirmant qu’ils sont imperméables à l’IP.

Le traitement du biofilm par le peptide initial LL-37 endommage l’ensemble des cellules

bactériennes du biofilm qui apparaissent rouges par perméabilité à l’IP (figure 96). Le peptide

LL7-37 semble également très actif sur la base du biofilm (forte coloration rouge) mais les

cellules en surface du biofilm restent imperméables au fragment (figure 96). Les fragments

LL-31 et LL7-31 perméabilisent un volume important du biofilm et atteignent aussi bien la

surface que la base de la structure du biofilm. Cependant toutes les cellules ne sont pas

endommagées par les fragments et des cellules de coloration verte sont toujours présentes

(figure 97). Le fragment LL13-37 montre également une légère activité de perméabilisation

de la membrane bactérienne, principalement au niveau de la périphérie du biofilm (figure 98).

La moitié N-terminale, le fragment LL-19, n’a aucune activité sur les cellules du biofilm

(figure 98).

De manière générale, les biofilms formés par la souche ATCC 15442 sont plus

résistants au traitement par les différents peptides en comparaison aux biofilms formés par la

souche ATCC PAO1 : une concentration plus importante (100 µM) est nécessaire pour

observer une activité de perméabilisation des cellules au sein du biofilm.

Figure 97 : Effet des peptides LL-31 et LL7-31 sur un biofilm ATCC 15442

Les peptides LL-31 et LL7-31 (concentration finale 100 μM) sont exposés pendant 25 min sur

un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Après traitement, le biofilm est

rincé et marqué par le kit BacLight™ Live/Dead®. Les cellules vivantes apparaissent vertes,

par marquage par l’indicateur fluorescent Syto9 spécifique des cellules vivantes, et les

cellules endommagées apparaissent rouges par perméabilisation à l’IP. Les images de MCBL

montrent une section horizontale du biofilm et 2 sections dans les plans xz et yz (colonne de

gauche). La colonne de droite représente une vue tridimensionnelle du sommet du biofilm.

Les images micrographiques sont les plus représentatives de 2 expériences. La barre d’échelle

correspond à 30 µm.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

169

Figure 98 : Effet des peptides LL13-37 et LL-19 sur un biofilm ATCC 15442

Les peptides LL13-37 et LL-19 (concentration finale 100 μM) sont exposés pendant 25 min

sur un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Après traitement, le

biofilm est rincé et marqué par le kit BacLight™ Live/Dead®. Les cellules vivantes

apparaissent vertes, par marquage par l’indicateur fluorescent Syto9 spécifique des cellules

vivantes, et les cellules endommagées apparaissent rouges par perméabilisation à l’IP. Les

images de MCBL montrent une section horizontale du biofilm et 2 sections dans les plans xz

et yz (colonne de gauche). La colonne de droite représente une vue tridimensionnelle du

sommet du biofilm. Les images micrographiques sont les plus représentatives de 2

expériences. La barre d’échelle correspond à 30 µm.

Figure 99 : Spectre ATR-FTIR des peptides en présence d’eau d’hydratation

1800 1700 1600 1500 14000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

1

2

3

4

5

Avidine (A)

Myoglobine (M)

1 = LL-37

2 = LL-13

3 = LL13-25

4 = LL13-31

5 = LL13-37

A

M

A

Nombre d'onde (cm-1)

Ab

so

rba

nc

e r

ela

tiv

e

1800 1700 1600 1500 14000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

1

2

3

4

5

Myoglobine (M)

1 = LL-37

2 = LL7-37

3 = LL-31

4 = LL7-31

5 = LL-19

Avidine (A)

A

M

B

Nombre d'onde (cm-1)

Ab

so

rba

nc

e r

ela

tiv

e

Les spectres des peptides LL-37, LL13-31, LL13-37, LL-13 et LL13-25 (figure A) et les

spectres des peptides LL-37, LL7-37, LL-31, LL7-31 et LL-19 (figure B) en présence d’eau

d’hydratation sont comparés aux spectres de l’avidine (A), structure de référence des feuillets-

β, et de la myoglobine (M), structure de référence d’une hélice-α.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

170

II.5 ETUDE DES STRUCTURES SECONDAIRES DES PEPTIDES A L’AIDE

DE LA SPECTROSCOPIE INFRAROUGE A TRANSFORMEE DE FOURIER

A REFLEXION TOTALE ATTENUEE (ATR-FTIR)

II.5.1 Etude des structures secondaires des peptides seuls

En présence d’eau d’hydratation

La structure de 9 peptides (LL-37, LL13-31, LL-13, LL13-25, LL7-37, LL13-37, LL-

31, LL7-31 et LL-19), choisis pour leurs différences d’efficacité sur P. aeruginosa, est

analysée par spectroscopie ATR-FTIR. Les spectres sont enregistrés à partir des peptides

préparés dans un tampon aqueux. Le spectre des peptides est comparé avec le spectre de la

myoglobine, une protéine avec un haut contenu en hélices-α et l’avidine, un peptide avec une

structure secondaire en feuillets-β (figure 99).

Sur les 9 peptides étudiés, le spectre de 6 peptides (LL-37, LL13-31, LL13-37, LL7-

37, LL-31 et LL7-31) présente un pic majeur étroit et symétrique dans la région de l’amide I,

vers 1653-1655 cm-1

, qui est aussi la région du pic majeur de l’amide I du spectre de la

myoglobine et qui se trouve dans la région où la plupart des protéines à hélices-α ont leur

maximum de l’amide I (Goormaghtigh et al., 2006 ; Oberg et al., 2003). Ce résultat suggère

que ces 6 peptides forment une hélice-α dans un tampon aqueux.

Trois autres peptides, les fragments LL-13, LL13-25 et LL-19, ont un pic majeur plus

large et non symétrique, légèrement décalé vers des nombres d’onde plus faibles, dans la

région de 1646 cm-1

(LL-13), 1632 cm-1

(LL13-25) et 1647 cm

-1 (LL-19). Dès lors, les spectres

des fragments LL-13, LL13-25 et LL-19 suggèrent que des structures autres que l’hélice-α

(random et feuillet-β) peuvent contribuer au pic.

Figure 100 : Spectre ATR-FTIR des peptides après échange H2O/D2O « deutération »

1800 1700 1600 1500 14000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.51 = LL-37

2 = LL-13

3 = LL13-25

5 = LL13-37

1

2

3

45 4 = LL13-31

A

Nombre d'onde (cm-1)

Ab

so

rba

nc

e r

ela

tiv

e

1800 1700 1600 1500 14000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

1

2

3

4

1 = LL7-37

2 = LL-31

3 = LL7-31

4 = LL-19

B

Nombre d'onde (cm-1)

Ab

so

rba

nc

e r

ela

tiv

e

Figure A : Spectres des peptides LL-37, LL13-31, LL13-37, LL-13 et LL13-25 après échange

H2O/D2O « deutération ». Figure B : Spectres des peptides LL7-37, LL-31, LL7-31 et LL-19

après reconstitution dans une solution de D2O.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

171

Après échange H2O/D2O « deutération »

Ces résultats sont confirmés après deutération des peptides (figure 100). Une structure

secondaire en hélice-α ou une structure désordonnée peuvent contribuer à la vibration de

l’amide I à des nombres d’onde pratiquement identiques pouvant compliquer la différentiation

des deux structures lors de l’analyse du spectre IR. Cependant l’échange H/D permet cette

différentiation car l’absorption de la structure désordonnée est décalée de manière beaucoup

plus importante que la structure en hélice-α. En effet, au sein d’une hélice-α, le lien

hydrogène entre l’atome d’azote d’un groupe amine d’un résidu n impliqué dans un lien

amide n et l’atome d’oxygène d’une fonction carboxylique impliquée dans un lien amide n+4

retarde l’échange entre l’hydrogène et le deutérium. Par contre, on a observé que dans le

random (séquence de la protéine dépourvue de structure secondaire) les atomes d’hydrogène

(proton amide) sont relativement accessibles et plus facilement échangeables avec du

deutérium (par exemple de Jongh et al., 1997). L’échange H/D est observé par la diminution

de l’aire du pic amide II (vibration N-H) autour de 1550 cm-1

qui est sensible à l’échange H/D

comparé à l’aire du pic amide I (vibration C=O) de 1600-1700 cm-1

pris comme référence.

Après échange de l’H du groupement amine par du D, le pic amide II se décale vers 1440 cm-

1. Après deutération, le pic majeur de la région de l’amide I de 6 peptides (LL-37, LL13-31,

LL13-37, LL7-37, LL-31 et LL7-31) est légèrement déplacé vers des nombres d’onde plus

faibles mais est toujours situé dans la bande de l’hélice-α confirmant que ces peptides

adoptent une structure secondaire en hélice-α. Ce décalage différencie une hélice-α d’une

conformation en random car la composante de l’hélice-α subit seulement un décalage modéré

de faible fréquence après deutération en comparaison avec la structure random

(Goormaghtigh et al., 1994a). Deux pics sont apparus à 1636 cm-1

et 1620 cm-1

pour le

peptide LL13-25. Le spectre de ce peptide après deutération suggère que ce fragment adopte

une structure secondaire autre que l’hélice-α, probablement des feuillets-β parallèles. Après

deutération des peptides LL-13 et LL-19, un pic majeur est apparu à 1616 cm-1

et un second

pic est apparu à 1684 cm-1

(LL-13) et 1685 cm-1

(LL-19). L’apparition d’une composante

additionnelle dans les nombres d’onde élevés (1685 cm-1

) est caractéristique d’un feuillet-β

antiparallèle, les feuillets-β parallèles n’ayant pas de composante dans les nombres d’onde

élevés (Barth, 2007 ; Arrondo et al., 1993). Par ailleurs, il est généralement établi que la

bande de l’amide I d’une structure secondaire β agrégée est dominée par une large

composante vers 1615-1620 cm-1

et une composante mineure vers 1675-1695 cm-1

(Morgera

et al., 2009 ; Barth et Zscherp, 2002 ; Tamm et Tatulian, 1997). Dès lors les spectres

Figure 101 : Spectre ATR-FTIR de 6 peptides au contact de liposomes

après reconstitution dans une solution de D2O

1800 1700 1600 1500 14000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

1

2

3

4

5

6 4 = LL7-31

2 = LL7-37

3 = LL-31

1 = LL-37

5 = LL13-37

6 = LL-19

Nombre d'onde (cm-1)

Ab

so

rba

nc

e r

ela

tiv

e

Spectres des peptides LL-37, LL7-37, LL-31, LL7-31, LL13-37 et LL-19 en présence de

lipides après reconstitution dans une solution de D2O.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

172

suggèrent que les peptides LL-13 et LL-19 ne forment pas une hélice-α mais forment une

autre structure secondaire, probablement un agrégat de feuillets-β antiparallèles.

II.5.2 Etude des structures secondaires des peptides au contact de liposomes

La structure secondaire de 6 peptides (LL-37, LL7-37, LL-31, LL7-31, LL13-37 et

LL-19) au contact d’une bicouche lipidique est analysée par ATR-FTIR (figure 101).

L’apparition d’un pic vers 1735 cm-1

correspond à l’étirement du groupement C=O des

chaînes acyles des lipides et confirme la présence de lipides dans le mélange. Le ratio lipides :

protéines peut être évalué à partir du ratio de la bande de lipide autour de 1735 cm-1

et de la

bande de la protéine autour de 1650 cm-1

(Goormaghtigh et al., 1994a). Dans cette expérience,

le ratio est de 1 : 2. La bande de vibration du C=O des lipides à 1735 cm-1

est absente pour les

peptides purs et aucune absorption n’apparaît dans la région de l’amide I (1600-1700 cm-1

)

pour le lipide pur (données non montrées). Le spectre des peptides LL-37, LL7-37, LL13-37,

LL-31 et LL7-31 présente un pic majeur étroit de l’amide I dans la région de l’hélice-α (1645

à 1651 cm-1

) confirmant que ces peptides adoptent une structure secondaire en hélice-α même

au contact d’une bicouche lipidique. Deux pics sont apparus pour le fragment LL-19, à 1648

et 1618 cm-1

, suggérant que ce peptide ne forme pas d’hélice-α mais une autre structure

secondaire, probablement un feuillet-β.

Figure 102 : Synthèse de la dansyl-PMB

Le mélange réactionnel entre le sulfate de PMB et le chlorure de dansyle est injecté dans une

colonne Sephadex G50 équilibrée avec un tampon phosphate. Des fractions de 5 à 6 mL sont

collectées. Les fractions récoltées sont exposées à une lampe UV. Le tube de gauche de

fluorescence jaune correspond à la dansyl-PMB et le tube de droite de fluorescence bleue-

verte correspond au chlorure de dansyle.

Figure 103 : Essai de dinitrophénylation de la dansyl-PMB

0 5 100

1

2

3

4

y = 0,2982 x + 0,0017

Concentration PMB (mg/mL)

Ab

so

rban

ce 4

20 n

m

Une courbe standard de la PMB est réalisée à partir de différentes concentrations en

antibiotique. L’absorbance est mesurée en fonction de la concentration.

Dansyl-PMB

Chlorure de dansyle

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

173

II.6 FIXATION DES PEPTIDES AUX LPS

Les LPS sont présents sur la membrane des bactéries à Gram négatif. Ces lipides sont

chargés négativement et facilitent les attractions électrostatiques initiales entre les PAM

cationiques et la membrane bactérienne. La PMB est un peptide antibiotique cationique qui se

lie aux LPS. Cette interaction peut être mesurée par utilisation d’un agent fluorescent, la

dansyl-PMB, qui émet de la lumière dans un environnement hydrophobe, par exemple après

interaction avec les LPS.

II.6.1 Synthèse de la dansyl-PMB

La fluorescence des fractions collectées est observée et permet la différenciation entre

la PMB dansylée et le chlorure de dansyle n’ayant pas réagi. Lorsque les tubes sont placés

sous une lampe UV, la fluorescence jaune est indicatrice de la dansyl-PMB (figure 102). On a

ainsi pu séparer le produit de réaction entre le sulfate de PMB et le chlorure de dansyle.

II.6.2 Dosage de la dansyl-PMB par dinitrophénylation

La dansyl-PMB synthétisée est dosée par dinitrophénylation. Une courbe étalon est

obtenue par dinitrophénylation de concentrations croissantes de PMB et mesure de

l’absorbance à 420 nm. Une droite de régression est établie et permet d’évaluer la

concentration en équivalents PMB de la solution de dansyl-PMB (figure 103). La régression

linéaire permet de calculer une concentration de 3,8 mg/mL de PMB dans la solution de

dansyl-PMB, ce qui correspond à 2,7 mM équivalent PMB (masse molaire de la PMB =

1385,61 g/mol).

Figure 104 : Fluorescence de la dansyl-PMB

0 200 400 600 8000

100000

200000

300000

400000

A

dansyl-PMB

Temps (s)

Flu

ore

scen

ce (

u.a

.f.)

0 200 400 600 8000

100000

200000

300000

400000

B dansyl-PMB

Temps (s)

Flu

ore

scen

ce (

u.a

.f.)

La fluorescence de la dansyl-PMB est étudiée dans un tampon HEPES 5 mM (pH 7,2) en

absence de LPS (figure A) et en présence de LPS à une concentration finale de 3 µg/mL

(figure B) à l’aide d’un fluorimètre.

Figure 105 : Effet des peptides sur la fixation aux LPS

Fragments N-terminaux

Contr

ôle

LL-37

LL-31

LL-25

LL-19

LL-13

0

25

50

75

100

125

**

***

A

Fix

atio

n d

e la

da

ns

yl-P

MB

(%

du

to

tal)

Fragments intermédiaires

LL-37

LL7-31

LL13-3

1

LL7-25

LL13-2

5

0

25

50

75

100

125

** *** **

B

Fix

atio

n d

e la

da

ns

yl-P

MB

(%

du

to

tal)

Fragments C-terminaux

LL-37

LL7-37

LL13-3

7

LL19-3

7

LL25-3

7

0

25

50

75

100

125

** ****

***

C

Fix

atio

n d

e la

da

ns

yl-P

MB

(%

du

to

tal)

Les LPS de P. aeruginosa sont incubés en présence de 10 µM de fragments N-terminaux

(figure A), fragments intermédiaires (figure B) ou fragments C-terminaux (figure C) et de 13

µM équivalent PMB de dansyl-PMB. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle

et sont la moyenne ± SEM de 4 expériences indépendantes réalisées en duplicat (n = 4). ** P

< 0,01 ; *** P < 0,001.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

174

II.6.3 Effet des peptides sur la fixation de la dansyl-PMB aux LPS

L’augmentation de la fluorescence suite à la liaison de la dansyl-PMB aux LPS est

mesurée à l’aide d’un fluorimètre. Un contrôle est effectué en absence des LPS (figure 104

A). L’incubation de 0,55 µM de dansyl-PMB en présence des LPS de P. aeruginosa provoque

une augmentation de la fluorescence plus importante qu’en absence des LPS (figure 104 B)

confirmant que l’augmentation de la fluorescence observée est consécutive à la liaison de la

dansyl-PMB aux LPS.

A 10 µM, le peptide LL-37 déplace la dansyl-PMB et se fixe aux LPS (figure 105). La

fluorescence en présence du peptide diminue de manière significative par rapport au contrôle

et atteint 52 ± 4 % (n = 4 ; P < 0,01). Six fragments (LL-31, LL7-31, LL13-31, LL7-37,

LL13-37, LL19-37) se fixent de manière significative aux LPS et une diminution importante

de la fluorescence, correspondant au déplacement de la dansyl-PMB, est détectée. La

suppression jusqu’à 18 acides aminés au niveau N-terminal (LL19-37) ou de 6 acides aminés

au niveau C-terminal (LL-31) du peptide n’a pas modifié l’interaction avec les LPS. Ainsi, la

partie centrale du peptide initial (résidus 19 à 31) semble intervenir dans la fixation aux LPS.

Figure 106 : Perméabilisation de la membrane interne et externe de E. coli ML-35p

LL-37

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100

20

40

60

80

100

Nitrocéfine

ONPG

Temps (min)

Activ

ité e

nzym

atiq

ue (

% d

u t

ota

l)

LL7-37

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100

20

40

60

80

100

Nitrocéfine

ONPG

Temps (min)

Activ

ité e

nzym

atiq

ue (

% d

u t

ota

l)

LL-31

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100

20

40

60

80

100

Nitrocéfine

ONPG

Temps (min)

Activ

ité e

nzym

atiq

ue (

% d

u t

ota

l)

LL13-37

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100

20

40

60

80

100

Nitrocéfine

ONPG

Temps (min)

Activ

ité e

nzym

atiq

ue (

% d

u t

ota

l)

LL7-31

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100

20

40

60

80

100

Nitrocéfine

ONPG

Temps (min)

Activ

ité e

nzym

atiq

ue (

% d

u t

ota

l)

LL-19

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100

20

40

60

80

100

Nitrocéfine

ONPG

Temps (min)

Activ

ité e

nzym

atiq

ue (

% d

u t

ota

l)

L’activité de 6 peptides sur la perméabilisation de la membrane externe (en rose) et

cytoplasmique (en bleu) est étudiée par mesure de l’activité enzymatique de la β-lactamase et

de la β-galactosidase comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats sont

exprimés en pourcentage de l’activité totale de l’enzyme et sont la moyenne ± SEM de 3 à 4

expériences indépendantes réalisées en duplicat (n = 3 à 4).

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

175

II.7 EFFET DES PEPTIDES SUR LA PERMEABILISATION DES

MEMBRANES DE E. COLI ML-35P

La souche E. coli ML-35p a été conçue spécifiquement pour étudier la

perméabilisation de la membrane externe et interne sur une même souche (Lehrer et al.,

1988). Cinq peptides (LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31 et LL7-31) sur les 6 étudiés

perméabilisent efficacement la membrane externe à la nitrocéfine (figure 106, courbe rose).

Les courbes des cinétiques d’entrée de la nitrocéfine sont cependant différentes pour ces 5

peptides. Afin de quantifier la différence, les t1/2 sont calculés pour chaque peptide. Le t1/2

correspond au temps nécessaire pour que 50 % du substrat (nitrocéfine) soit consommé. Le

peptide LL-37 est le plus actif avec un t1/2 de 35 ± 2 min (LL-37 > LL13-37 t1/2 37 ± 1 min >

LL-31 t1/2 40 ± 2 min > LL7-31 t1/2 49 ± 2 min > LL7-37 t1/2 52 ± 2 min) (n = 3 ; P < 0,001).

Les 5 peptides ayant une activité sur l’entrée de la nitrocéfine perméabilisent

également efficacement la membrane interne (figure 106, courbe bleue). L’activité des 5

peptides sur l’entrée d’ONPG est comparable (pas de différence significative du t1/2 pour les 5

peptides). Le t1/2 est atteint entre 15 min (LL7-31) et 29 min (LL-37) plus tard que le t1/2 de

l’entrée de la nitrocéfine. La perméabilisation des membranes externes et internes médiée par

les peptides est donc couplée dans le temps.

Enfin, le fragment LL-19 se distingue des 5 autres peptides et ne présente aucune

efficacité sur l’entrée de nitrocéfine ou d’ONPG dans la cellule.

Figure 107 : Effet des peptides sur la captation du bromure d’éthidium par les HUVEC

LL-37

0 20 40 60 800

20

40

60

80

100

100 M

0 M

5 M

10 M

30 M

50 M

20 M

Temps (min)

Cap

tatio

n d

u B

rEt

(% m

axim

um

)

LL-31

0 20 40 60 800

20

40

60

80

100

100 M

0 M

5 M

10 M

30 M

50 M

20 M

Temps (min)

Cap

tatio

n d

u B

rEt

(% m

axim

um

)

LL7-37

0 20 40 60 800

20

40

60

80

100

100 M

0 M

5 M

10 M

30 M

50 M

20 M

Temps (min)

Cap

tatio

n d

u B

rEt

(% m

axim

um

)

LL7-31

0 20 40 60 800

20

40

60

80

100

100 M

0 M

5 M

10 M

30 M

50 M

20 M

Temps (min)

Cap

tatio

n d

u B

rEt

(% m

axim

um

)

LL13-37

0 20 40 60 800

20

40

60

80

100

100 M

0 M

5 M

10 M

30 M

50 M

20 M

Temps (min)

Cap

tatio

n d

u B

rEt

(% m

axim

um

)

LL13-31

0 20 40 60 800

20

40

60

80

100

100 M

0 M

5 M

10 M

30 M

50 M

20 M

Temps (min)

Cap

tatio

n d

u B

rEt

(% m

axim

um

)

LL13-25

0 20 40 60 800

20

40

60

80

100

100 M

0 M

5 M

10 M

30 M

50 M

20 M

Temps (min)

Cap

tatio

n d

u B

rEt

(% m

axim

um

)

LL-19

0 20 40 60 800

20

40

60

80

100

100 M

0 M

5 M

10 M

30 M

50 M

20 M

Temps (min)

Cap

tatio

n d

u B

rEt

(% m

axim

um

)

Les HUVEC sont incubées à 37 °C en présence de bromure d’éthidium (concentration finale

10 mg/L) et de différentes concentrations du peptide LL-37 ou de certains de ses fragments.

La captation du bromure d’éthidium par les HUVEC est suivie par mesure de la fluorescence

à 590 nm après excitation à 540 nm pendant 1 h. A la fin de l’expérience, 10 µL de Triton X-

100 sont ajoutés (concentration finale 0,5 % (m/V)) aux puits afin de déterminer le taux

maximal de captation du bromure d’éthidium. Les résultats sont exprimés en pourcentage du

taux maximal de captation et sont la moyenne ± SEM de 3 essais indépendants réalisés en

triplicat (n = 3).

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

176

II.8 TOXICITE DES PEPTIDES SUR CELLULES EUCARYOTES

II.8.1 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium

Les HUVEC sont incubées en présence de bromure d’éthidium et la fluorescence est

mesurée pendant 1 h (figure 107). Les cellules sont incubées pendant 10 min en absence des

peptides (taux basal de la captation du bromure d’éthidium) avant d’être exposées à

différentes concentrations des différents peptides. Le peptide LL-37 à 20 µM provoque une

augmentation linéaire de la fluorescence et, après une heure d’incubation, la captation du

bromure d’éthidium augmente de 8 ± 2 % en absence à 22 ± 1 % en présence du peptide (n =

3). La captation de l’indicateur fluorescent augmente après 10-20 min d’exposition à des

concentrations plus élevées du peptide. En présence de 100 µM de LL-37, la captation du

fluorophore augmente à 54 ± 3 % (n = 3). Cette réponse n’est pas affectée par la suppression

de 6 acides aminés au niveau du domaine C-terminal (LL-31). Par contre, la suppression des 6

premiers acides aminés du domaine N-terminal du peptide (LL7-37 et LL7-31) abolit la

captation du bromure d’éthidium qui est restaurée lorsque les 6 acides aminés suivants (LL13-

37 et particulièrement LL13-31) sont supprimés. Des fragments plus courts (LL-19 et LL13-

25) n’ont pas d’effet sur la captation du bromure d’éthidium.

Au vu de ces résultats nous pouvons conclure que l’extrémité N- terminale du LL-37

contribue à sa toxicité envers les cellules eucaryotes. Il apparaît également que des fragments

plus petits (LL7-37, LL7-31, LL13-25 et LL-19) dérivés du peptide initial LL-37 ont une

toxicité réduite sur les cellules endothéliales même à une concentration importante de 100

µM.

Figure 108 : Effet des peptides sur la libération de la LDH par les HUVEC

0 20 40 60 80 100

0

50

100

LL-37LL7-37LL13-37LL-19

Concentration (µM)

Lib

éra

tio

n d

e la

LD

H (

% d

u t

ota

l)

0 20 40 60 80 100

0

50

100

LL-31LL7-31LL13-31LL13-25

Concentration (µM)

Lib

éra

tio

n d

e la

LD

H (

% d

u t

ota

l)

Les HUVEC sont incubées à 37 °C pendant 20 min en présence de différentes concentrations

du peptide LL-37 et de certains de ses dérivés. Après centrifugation, la LDH présente dans le

surnageant est dosée. L’activité totale de la LDH est évaluée après la lyse des HUVEC. Les

résultats sont exprimés en pourcentage de l’activité totale de la LDH durant l’incubation avec

les peptides. Ils sont la moyenne ± SD de 2 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n

= 2).

Figure 109 : Effet des peptides sur l’activité mitochondriale des HUVEC

0 20 40 60 80 1000

25

50

75

100

125

150

175

LL-37LL7-37LL-31LL7-31

Concentration (µM)

Ab

so

rba

nc

e (%

du

co

ntr

ôle

)

0 20 40 60 80 1000

25

50

75

100

125

150

LL13-37LL-19LL13-31LL13-25

Concentration (µM)

Ab

so

rba

nc

e (%

du

co

ntr

ôle

)

Les HUVEC sont incubées pendant 20 min en présence de différentes concentrations des

fragments dérivés du LL-37. Après élimination du milieu, l’activité mitochondriale est

estimée par le test MTT. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l’absorbance mesurée

dans les HUVEC incubées en absence des peptides et sont la moyenne ± SD de 2 expériences

indépendantes réalisées en triplicat (n = 2).

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

177

II.8.2 Evaluation de la libération de la LDH

L’effet du peptide original et de 7 fragments sur la libération par les HUVEC de

l’enzyme cytosolique LDH est testé (figure 108). Des concentrations en peptide LL-37 plus

élevées que 10 µM induisent la libération de la LDH qui atteint 50 % de la LDH totale à 100

µM. Des résultats similaires sont obtenus avec les fragments LL-31 et LL13-31. Les 5 autres

fragments (LL7-37, LL13-37, LL-19, LL7-31, LL13-25) n’ont pas d’effet sur la libération de

la LDH par les HUVEC.

II.8.3 Evaluation de l’activité mitochondriale

L’effet des fragments dérivés du LL-37 sur l’intégrité des mitochondries des HUVEC

est examiné par le test MTT (figure 109). A toutes les concentrations évaluées, l’absorbance

mesurée après incubation en présence des peptides est similaire à l’absorbance mesurée en

leur absence suggérant que la capacité des mitochondries à transférer les électrons est

maintenue en présence des peptides. Nous pouvons conclure que les peptides n’ont pas d’effet

délétère sur la mitochondrie.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

178

III. DISCUSSION

Effet des peptides sur des cultures planctoniques

Nous avons confirmé que la cathélicidine humaine LL-37 est très active sur des

cultures planctoniques de P. aeruginosa et, après un temps court (1 h), elle perméabilise de

manière importante la membrane bactérienne et entraîne la mort cellulaire. Cinq fragments

dérivés du peptide initial (LL-31, LL-25, LL7-31, LL13-31 et LL7-37) ont également une

activité antimicrobienne significative sur la souche ATCC PAO1 : nous avons mis en

évidence une diminution de la viabilité cellulaire après 1 h d’exposition à 10 µM de ces

peptides. Nos résultats suggèrent que la partie centrale (résidus 13 à 31) est nécessaire à

l’activité antibactérienne. Ce fragment (LL13-31) est aussi le plus petit fragment dérivé du

LL-37 avec une activité bactéricide sur B. thailandis (Kanthawong et al., 2010).

Les valeurs de CMI sont plus importantes que les concentrations perméabilisant la

membrane bactérienne à l’IP. Le milieu plus complexe utilisé pour effectuer la CMI

(possibilité d’interaction et d’inhibition de l’activité peptidique) peut expliquer cette

différence. Par ailleurs, la concentration de la suspension bactérienne est différente dans ces

deux protocoles.

Effet des peptides sur la formation d’un biofilm

Nous avons démontré que le peptide LL-37, mais aussi des fragments dérivés du LL-

37, bloquent la formation d’un biofilm de P. aeruginosa mesurée par la technique de CV.

L’inhibition du biofilm par le peptide LL-37 a déjà été décrite précédemment par Kapoor et

al. (2011) et par Dean et al. (2011) qui ont démontré une réduction de 43 % de la formation du

biofilm sur des cultures ATCC PAO1 traitées par le LL-37. Overhage et ses collègues ont

démontré que le peptide LL-37 modifie l’expression de presque 800 gènes et bloque la

formation d’un biofilm ATCC PAO1 (Overhage et al., 2008). L’activité antibiofilm du

peptide LL-37 a également été décrite pour S. epidermidis (Hell et al., 2010) et F. novicida

(Amer et al., 2010).

Nous constatons que la diminution de la coloration par le CV n’est pas secondaire à la

diminution du nombre de cellules. Considérant que le CV colore non seulement les cellules

mais également la matrice organique du biofilm, la diminution de la coloration en présence de

LL-37 est probablement liée à une diminution de la biomasse de la matrice extracellulaire.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

179

Nous avons démontré que 7 des 12 fragments dérivés du LL-37 inhibent également la

formation du biofilm de P. aeruginosa. Les peptides LL7-37 et LL-31 sont les plus efficaces

et provoquent une diminution importante du pourcentage de la formation de biomasse à une

concentration très faible de 5 µM. Bien que nos résultats suggèrent qu’un fragment assez long

du peptide original soit nécessaire à l’activité antibiofilm, de la Fuente-Nunez et ses collègues

ont montré qu’un nonapeptide dérivé du fragment LL-37 avait une activité antibiofilm très

importante. Il faut cependant mentionner que le peptide actif (KRFRIRVRV) n’est pas un

fragment direct du LL-37 ce qui rend la comparaison des résultats moins pertinente (de la

Fuente-Nunez et al., 2012).

Effet des peptides sur un biofilm préformé

L’effet de 6 peptides sur des biofilms préformés dans une microplaque est étudié par

MCBL avec des bactéries exprimant la GFP. Nivens et ses collaborateurs ont comparé la

production de biofilm par des souches de P. aeruginosa exprimant la GFP et les mêmes

souches n’exprimant pas la GFP et ont démontré que l’expression de la protéine fluorescente

n’a pas d’effet significatif sur la formation du biofilm de P. aeruginosa (Nivens et al., 2001).

Par MCBL, nous avons montré que la cathélicidine LL-37 affecte également les

bactéries de P. aeruginosa ATCC PAO1 au sein d’un biofilm préformé. Le peptide induit

l’augmentation de la captation d’IP par les cellules mortes de manière dose-dépendante. Un

début d’activité est observé à 20 µM et l’ensemble du biofilm est atteint à 100 µM. L’effet

d’une faible concentration (~1 µM) du peptide LL-37 sur un biofilm préétabli de P.

aeruginosa a été démontré par Overhage et ses collaborateurs qui ont observé in vitro

l’activité du peptide sur la réduction de l’épaisseur du biofilm formé dans des chambres en

flux. Ces mêmes auteurs ont montré que l’effet du peptide LL-37 sur la formation du biofilm

et sur la réduction du biofilm préétabli est le résultat de plusieurs actions : une diminution de

l’adhésion des cellules bactériennes sur une surface, la stimulation de la motilité twitching, et

la sous-expression de gènes liés au QS (Overhage et al., 2008). Récemment, Dean et ses

collègues ont observé par la technique de coloration des puits au CV que le peptide LL-37

(~0,25 µM) dégrade de manière significative le biofilm préformé de P. aeruginosa (Dean et

al., 2011). Les différences de concentrations actives sur le biofilm entre les études peuvent

être liées aux conditions expérimentales variables (milieu, technique, etc.).

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

180

Dans notre étude nous avons mis en évidence que des fragments peptidiques plus

petits dérivés du peptide original LL-37 ont également une activité sur les cellules sessiles du

biofilm. Nous démontrons plus particulièrement que les peptides LL7-37, LL-31 et LL7-31,

induisent l’augmentation de la perméabilité à l’IP des membranes bactériennes du biofilm

ATCC PAO1. La suppression de 6 résidus supplémentaires au niveau N-terminal (LL13-37)

atténue l’effet du peptide. La partie N-terminale, le fragment LL-19, n’a montré aucune

activité de perméabilisation des cellules bactériennes du biofilm et ce, même à une

concentration élevée de 100 µM.

L’étude sur les biofilms préformés dans une microplaque est approfondie par

utilisation de 5 souches cliniques de P. aeruginosa pour comparer l’effet des différents

peptides. Le plasmide pMF230 est inséré dans les souches PYO1, PYO2, MC75-450457,

MC099-450467 et MC093-450507 afin que celles-ci expriment de manière constitutive la

GFP et puissent être visualisées par MCBL. Les expériences réalisées sur les différentes

souches confirment que le peptide LL-37 et les dérivés LL7-37, LL7-31 et LL-31, ont une

activité comparable. A une concentration de 20 µM, ces peptides endommagent la membrane

bactérienne et l’entrée d’IP au sein de la cellule est observée pour une majorité des souches

étudiées. Cependant, l’ensemble des bactéries du biofilm n’est pas atteint à cette

concentration. La proportion du biofilm sensible au peptide est nettement plus importante à

une concentration de 50 µM et, à 100 µM, la totalité du tapis cellulaire du puits est

endommagée chez toutes les souches étudiées. Le fragment LL13-37 est nettement moins

actif que le dérivé original. La partie N-terminale du peptide, le fragment LL-19, ne montre

aucune activité sur le biofilm formé par les 5 souches.

Par la suite, l’étude de l’activité des 6 peptides sur un biofilm robuste et complexe des

souches ATCC PAO1 et ATCC 15442, développé dans un réacteur CDC avec un flux continu

de milieu et des forces de frottement, est effectuée. Les 5 peptides actifs sur un biofilm plat

développé dans les puits d’une microplaque (LL-37, LL7-37, LL7-31, LL-31 et LL13-37)

perméabilisent considérablement la surface du biofilm ATCC PAO1 à 50 µM. L’efficacité de

différentes concentrations du fragment LL7-37 est comparée à celle du peptide original. Le

peptide LL7-37 permet non seulement de diminuer la hauteur du biofilm mais promeut

également sa désagrégation. A 100 µM, l’entièreté de l’architecture complexe du biofilm est

atteinte. L’activité des peptides sur les biofilms plats ou développés via des extensions

verticales et horizontales est donc similaire.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

181

Bien que les fragments LL7-37, LL7-31 et LL-31 soient actifs sur le biofilm ATCC

15442 développé à l’aide du réacteur CDC, le peptide original LL-37 présente l’activité la

plus importante sur cette souche.

En conclusion, cette étude est la première démontrant la destruction du biofilm de P.

aeruginosa par utilisation d’une librairie de fragments dérivés du LL-37, confirmant les

potentialités de ces peptides pour le développement de nouvelles stratégies anti-infectieuses et

donc antibiofilms. De ces expériences, 3 fragments sortent du lot (les peptides LL7-37, LL7-

31 et LL-31) pour leurs propriétés destructrices sur le biofilm.

Récemment, Kanthawong et ses collègues ont étudié l’effet de fragments dérivés du

LL-37 sur des biofilms de B. pseudomallei développés en microplaque. Le fragment LL-31,

déjà à 20 µM, était le plus efficace sur la diminution du nombre de cellules vivantes au sein

du biofilm de B. pseudomallei (Kanthawong et al., 2012).

Etude de la structure secondaire des peptides

Neuf peptides sont choisis pour leur propriétés antibactériennes et antibiofilms

différentes afin d’effectuer des analyses ATR-FTIR et de déterminer leur structure secondaire.

Des études de dichroïsme linéaire et circulaire (Zhang et al., 2010 ; Lee et al., 2011), de

spectroscopie FTIR (Oren et al., 1999 ; Tossi et al., 1994) et de spectroscopie RMN (Porcelli

et al., 2008 ; Li et al., 2006 ; Wang, 2008) ont établi que le peptide LL-37 appartient au

groupe des PAM avec une hélice-α intimement associée aux activités du peptide. Nos spectres

confirment la structure en hélice-α de la cathélicidine humaine. Nos analyses indiquent que

les peptides LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31, LL7-31 et LL13-31 forment une hélice-α en

présence d’eau d’hydratation et après deutération. Ces 6 peptides sont également actifs sur P.

aeruginosa (en culture planctonique, sur la formation du biofilm ou sur biofilm préformé).

Les fragments LL-13, LL13-25 et LL-19 adoptent une structure secondaire différente de

l’hélice-α. Ils n’ont pas non plus d’activité sur P. aeruginosa, suggérant qu’une structure

secondaire sous forme d’hélice-α contribue à l’efficacité de ces peptides sur la bactérie.

Nous avons élargi l’investigation par l’analyse de la structure secondaire de 6 peptides

(LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31, LL7-31 et LL-19) en présence d’une bicouche lipidique

dans le but de mimer la membrane bactérienne rencontrée par les peptides. Les structures

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

182

secondaires observées précédemment sont maintenues au contact de la bicouche lipidique.

Seul le fragment LL-19 présente une structure secondaire différente d’une hélice-α.

Le score Agadir, index de la tendance des peptides à former une hélice-α, différencie

également le fragment LL-19 des 5 autres peptides (de moins de 1 pour LL-19 à 4-5 pour les

autres peptides). Ces résultats sont en accord avec ceux de Sigurdardottir et al. (2006) qui ont

démontré la différence importante du score Agadir entre le fragment N-terminal et le peptide

initial.

En accord avec la vision actuelle que l’activité antibactérienne des PAM dépend de

leur structure secondaire, il apparaît de nos différentes expérimentations que l’adoption par les

peptides d’une structure secondaire sous forme d’hélice-α contribue à leur activité sur P.

aeruginosa.

Etude de la fixation des peptides aux LPS

La haute affinité de liaison du peptide LL-37 aux LPS a déjà été démontrée

(Rosenfeld, 2006 ; Yount et Yeaman, 2013). Par mesure du déplacement de la dansyl-PMB,

nous confirmons la fixation du peptide LL-37 aux LPS de P. aeruginosa. Six fragments (LL-

31, LL7-31, LL13-31, LL7-37, LL13-37, LL19-37) se fixent également de manière

significative aux LPS. Tous ces peptides, à l’exception du LL19-37, sont aussi les peptides

actifs sur P. aeruginosa et perméabilisent la membrane bactérienne des cellules sessiles dans

le biofilm. Les autres fragments étudiés ne se lient pas aux LPS et ne possèdent pas non plus

d’activité anti-Pseudomonas significative. En accord avec les études impliquant la liaison des

PAM aux LPS dans les étapes initiales de l’action antimicrobienne (Yount et Yeaman, 2013 ;

Junkes et al., 2011), nous soulignons par ce travail que l’activité antibactérienne et même

antibiofilm des fragments dérivés du LL-37 suppose leur fixation aux LPS. Il découle aussi de

nos résultats que la partie centrale du fragment initial (résidus 19 à 31) est nécessaire à la

fixation aux LPS.

La propriété des fragments à se fixer aux LPS pourrait également limiter les effets

endotoxiques qui découlent de l’activation d’une cascade immunitaire initiée par les LPS

(Kai-Larsen et Agerberth, 2008) et renforcer ainsi l’efficacité de ces fragments dans le

traitement de l’infection.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

183

Etude de la perméabilisation de la membrane interne et externe

La souche E. coli ML-35p a été conçue spécifiquement pour étudier la

perméabilisation de la membrane externe et interne sur une même souche (Lehrer et al.,

1988). Nos résultats obtenus à l’aide de cette souche sont en accord avec Turner et al. (1998)

et Krahulec et al. (2010) quant à la capacité du LL-37 à perméabiliser la membrane à la fois

externe et interne, comme en témoigne l'augmentation au cours du temps de la perméabilité

des substrats de la β-lactamase et de la β-galactosidase. Dans cette étude, nous démontrons

que les fragments LL7-37, LL13-37, LL-31 et LL7-31 perméabilisent également efficacement

la membrane externe à la nitrocéfine. Les courbes des cinétiques d’entrée de la nitrocéfine

sont cependant différentes pour les 5 peptides et le calcul des t1/2 différencie l’efficacité de

perméabilisation des peptides (LL-37 > LL13-37 > LL-31 > LL7-31 > LL7-37). Les 5

peptides actifs sur la membrane externe perméabilisent aussi efficacement la membrane

cytoplasmique à l’ONPG avec un délai des t1/2 de 15 à 29 min après perméabilisation de la

membrane externe. Les courbes des cinétiques d’entrée de l’ONPG sont similaires pour les 5

peptides suggérant qu’ils perméabilisent facilement et efficacement la membrane interne. Les

peptides LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31 et LL7-31 sont aussi ceux ayant une activité

antimicrobienne et antibiofilm importante sur P. aeruginosa. Le fragment LL-19, dépourvu de

toxicité sur P. aeruginosa, n’a pas non plus perméabilisé les membranes externes et internes

de E. coli ML-35p. Ces résultats suggèrent que l’activité antimicrobienne des peptides peut

impliquer une action sur les membranes externe et interne et induire éventuellement la perte

de composés essentiels de la cellule.

Etude de la toxicité des peptides sur cellules eucaryotes

La sélectivité des PAM pour les membranes procaryotes versus eucaryotes reste un

point de discussion : certains peptides désintègrent non seulement les membranes bactériennes

mais peuvent également être toxiques pour les membranes plasmiques des cellules eucaryotes.

Cet effet secondaire constitue un inconvénient majeur dans le développement de ces peptides

pour un usage thérapeutique. Nos résultats confirment la toxicité cellulaire du peptide initial ;

la cathélicidine augmente la perméabilité membranaire des HUVEC au bromure d’éthidium et

à la LDH. La littérature rapporte également des propriétés de pénétration cellulaire pour le

peptide LL-37 ; son activité dans le transfert d’ADN extracellulaire vers le compartiment

nucléaire a été démontrée (Sandgren et al., 2004). Nous avons évalué la toxicité intracellulaire

du composé par mesure de l’activité des déshydrogénases mitochondriales des HUVEC (test

MTT) mais n’avons pas mis en évidence de diminution de la viabilité cellulaire. Ce résultat

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

184

était inattendu considérant que le peptide LL-37 affecte l’activité des déshydrogénases

mitochondriales de kératinocytes (Braff et al., 2005). La toxicité peut différer parmi les

différentes lignées cellulaires : Wong et ses collègues ont récemment démontré que la

cathélicidine LL-37 n’a pas de toxicité sur les mitochondries des monocytes (Wong et al.,

2011b).

L’étude de la toxicité des dérivés du LL-37 a souligné des résultats très intéressants.

Ainsi, supprimer les 6 premiers résidus du domaine N-terminal de la molécule permet

d’atténuer fortement la toxicité du peptide : LL7-37 et LL7-31 sont beaucoup moins toxiques

que LL-37 et LL-31. Ces fragments n’ont pas d’effet sur la perméabilisation de la membrane

eucaryote et n’affectent pas l’activité mitochondriale de la cellule. Par contre, la toxicité

membranaire est restaurée lorsque les 6 acides aminés suivants (LL13-37 et LL13-31) sont

supprimés. Des fragments plus courts (LL-19 et LL13-25) n’ont pas d’effet sur la captation du

bromure d’éthidium ou la libération de la LDH.

Nos résultats suggèrent donc que la partie N-terminale du peptide LL-37 contribue à sa

toxicité. Ces résultats sont concordants avec l’étude de Oren et ses collègues qui établissent

que la partie N-terminale du LL-37 est responsable de son activité hémolytique (Oren et al.,

1999). En accord avec nos résultats, Thennarasu et son équipe observent que le fragment

LL7-27 dérivé du peptide LL-37 présente une activité puissante contre les bactéries mais pas

contre les érythrocytes (Thennarasu et al., 2010).

Conclusion et perspectives

Il apparaît de cette étude approfondie de l’activité des différents peptides dérivés du

LL-37 sur cultures planctoniques de P. aeruginosa, sur la formation du biofilm par cette

souche, ou sur un biofilm préétabli, qu’il y a un potentiel évident à utiliser des fragments

peptidiques dérivés du LL-37 dans la lutte contre les infections à P. aeruginosa. Comme

soutenu par plusieurs groupes, de petits changements au niveau de la charge, de l’hélicité et

de l’hydrophobicité ont un impact important sur l’activité du peptide (Braff et al., 2005 ; Nell

et al., 2006). Etant donné leurs propriétés antibactérienne et antibiofilm importantes, les

peptides LL7-37 et LL7-31 semblent particulièrement intéressants à exploiter. Ils sont

efficaces sur des cultures planctoniques de P. aeruginosa, inhibent la formation du biofilm et

endommagent les cellules bactériennes au sein d’un biofilm plat ou à architecture complexe.

Ces deux fragments ne présentent pas de toxicité cellulaire in vitro confirmant qu’ils sont les

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

185

plus prometteurs de ceux décrits dans ce travail pour traiter les infections chroniques et

persistantes impliquant la formation d’un biofilm chez les patients atteints de mucoviscidose.

Nos travaux soulignent également l’importance de la structure secondaire en hélice-α

ainsi que la fixation aux LPS dans le mode d’action de ces peptides sur P. aeruginosa. Les

peptides à activité anti-Pseudomonas perméabilisent la membrane externe et interne de E. coli

ML-35p et agissent donc probablement via plusieurs mécanismes.

En outre, on reconnaît aux PAM de nombreuses fonctions de régulateurs et effecteurs

de l’immunité. Ces propriétés non explorées dans ce travail renforcent le potentiel de ces

peptides comme agents anti-infectieux. Les propriétés de réparation des plaies et

d’angiogenèse reconnues pour le peptide LL-37 devront également être approfondies sur les

fragments dérivés et pourraient offrir de nouvelles voies pour le traitement des infections.

L’étude d’une activité synergique par une co-administration du peptide LL7-31 ou

LL7-37 avec un antibiotique conventionnel est à explorer pour améliorer l’efficacité du

traitement thérapeutique et prophylactique. La combinaison d’agents antimicrobiens permet

d’en diminuer les doses et ainsi de réduire la toxicité et les chances de sélection de résistances

(Barriere, 1992 ; Steenbergen et al., 2009). Ainsi la littérature rapporte des données

encourageantes soulignant un bénéfice évident à utiliser une co-administration

PAM/antibiotique. Park et al. (2004) mettent en avant des effets synergiques par combinaison

du chloramphénicol avec des peptides dérivés du HP(2-20). Des PAM à hélice-α, la

magainine II et la cécropine A, combinés à la rifampicine ont significativement réduit le

nombre de bactéries vivantes de souches de P. aeruginosa multirésistantes, aussi bien in vitro

que in vivo. Ces résultats suggèrent que l’action de perméabilisation de la membrane par les

PAM permet à la rifampicine d’atteindre son site d’action intracellulaire (Cirioni et al., 2008).

Une approche alternative pourrait consister en une co-administration de deux PAM. En effet,

la combinaison du peptide LL-37 et de la protégrine 1, deux PAM isolés de mammifères,

exerce une activité synergique sur cultures planctoniques de P. aeruginosa (Yan et Hancock,

2001). Malheureusement, la plupart des études de synergies ont été réalisées sur cultures

planctoniques or l’étude de l’activité antibactérienne sur biofilm est indispensable et devra

faire l’objet de recherches futures.

Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés

186

Les peptides LL7-31 et LL7-37 constituent une avancée également par leur plus petite

taille qui permet de diminuer leurs coûts de production de ces peptides. Des modifications

chimiques (substitution, remplacement des acides aminés L par des acides aminés D,

cyclisation) de ces peptides sont des options à envisager dans le futur pour maintenir une

stabilité envers les protéases ou éviter d’autres inconvénients rencontrés sous des conditions

physiologiques. L’administration par inhalation et des formulations adaptées devront être

développées pour optimaliser l’efficacité in vivo des peptides.

Conclusion générale et perspectives

187

CONCLUSION

GENERALE

ET PERSPECTIVES

Conclusion générale et perspectives

188

Les infections à P. aeruginosa impliquant la formation de biofilms sont une

préoccupation majeure chez les patients atteints de mucoviscidose. Les mutations rapides et

fréquentes liées à l’administration d’antibiotiques posent un défi pour le développement de

stratégies de lutte antibactérienne. De plus, le développement d'antibiotiques n'a pas suivi le

rythme de la prévalence croissante de résistance aux médicaments. Aujourd’hui, de nombreux

laboratoires dans le monde se préoccupent de la complexité structurelle et fonctionnelle du

biofilm, de sa résistance aux antibiotiques et aux défenses de l’hôte et du caractère persistant

qu’il confère aux infections chez ces patients. Face à l’émergence de plus en plus importante

de la résistance bactérienne, l’urgence de développer de nouveaux agents dirigés contre les

infections et les biofilms nécessite de poursuivre la recherche dans l’espoir d’augmenter

l’espérance et la qualité de vie des patients atteints de mucoviscidose.

Le contrôle des biofilms peut être atteint par trois moyens : par réduction de la

population bactérienne planctonique, par prévention de la formation du biofilm et par

éradication du biofilm établi. Les études existantes de stratégies de contrôle des biofilms

impliquent principalement des stratégies prophylactiques. Dans cette thèse, nous avons

exploré l’efficacité de nouveaux agents antibactériens sur l’ensemble des étapes du biofilm, y

compris sur les biofilms matures à structure robuste et complexe.

Durant ces dernières années, l’intérêt des PAM comme agents anti-infectieux s’est

renforcé et est apparu de plus en plus évident. Leur faible capacité à induire une résistance et

leur haut pouvoir antimicrobien en font d’excellents candidats thérapeutiques. Les résultats

obtenus au cours de notre travail confirment la possibilité d'optimaliser les propriétés et

l’efficacité des PAM par des manipulations de séquences qui modulent les fonctions des

peptides. Ainsi, de plus petits fragments dérivés de la cathélicidine humaine LL-37,

notamment les peptides LL7-31 et LL7-37, offrent un réel espoir dans le développement de

nouveaux composés à action antimicrobienne et antibiofilm importante avec une toxicité

réduite. Nous avons démontré dans cette étude que ces petits fragments sont actifs sur des

cultures planctoniques de P. aeruginosa, qu’ils sont capables de prévenir la formation d’un

biofilm et qu’ils agissent sur un biofilm épais avec une architecture tridimensionnelle. Ces

peptides pourront aussi servir de modèle pour le développement de nouveaux antibiotiques.

Conclusion générale et perspectives

189

Les dérivés peptido-mimétiques ont également fait l’objet d’études comme alternatives

de traitement aux antibiotiques conventionnels. Nous avons souligné dans ce travail que la

céragenine CSA-13 possède un large spectre d’activités anti-Pseudomonas et que le composé

est efficace aux différents stades de développement du biofilm. Plus précisément, considérant

les propriétés de perméabilisation de la membrane bactérienne conférées par le CSA-13, sa

résistance à la dégradation, son effet préventif sur l’adhésion bactérienne aux surfaces, sa

capacité à diffuser dans un biofilm et à détruire un biofilm mature, le CSA-13 est un candidat

potentiel pour traiter non seulement les infections aiguës causées par des bactéries

planctoniques de P. aeruginosa mais également les infections chroniques impliquant des

biofilms. Un intérêt évident à utiliser une co-administration de CSA-13 avec la tobramycine

s’est également dégagé de cette étude. Cependant, la toxicité du CSA-13 sur cellules

eucaryotes est un point à approfondir et à améliorer.

Ce travail offre donc de réelles perspectives pour le traitement des infections à P.

aeruginosa impliquant la formation d’un biofilm. Différentes pistes restent à explorer comme

par exemple l’association des peptides dérivés de la cathélicidine avec d’autres agents

antibiofilms ou antibiotiques pour combattre le pathogène. En outre, le développement de

nouveaux médicaments à base de dérivés peptidiques nécessite une meilleure compréhension

de leurs mécanismes d’action, complexes et multiples. L’ensemble des données générées dans

ce travail par l’expérimentation in vitro servira à exploiter des modèles in vivo dans l’espoir

d’aboutir à de nouvelles thérapeutiques efficaces dans la lutte contre les pathogènes

respiratoires chez les patients atteints de mucoviscidose.

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Annexes

206

ANNEXES

Annexes

207

Annexe 1 : Tableau récapitulatif « Caractérisation phénotypique des souches »

Souche

P.aeruginosa Origine Propriété

Adhésion

1 h

(BFRT)

Formation

du biofilm

48 h (CV)

Motilité Rhamno.

a

Sensibilité

à ATB Protéase

b Elastase

c

Production

de

C6-HSL

Production

de

C4-HSL Swimming Swarming

ATCC 15442 Souche de

référence

Non

mucoïde +++ + ++ ++ - ++ + - +++ +

PYO1 Souche

clinique

Non

mucoïde - + + + + +++ - - + +

ATCC PAO1 Souche de

référence

Non

mucoïde +++ ++ +++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ +++

ATCC 9027 Souche de

référence

Non

mucoïde +++ + ++ ++ - ++ + - - +

PYO2 Souche

clinique Mucoïde - +++ + ++ ++ + - - +++ ++

MC75-450457 Souche

clinique Mucoïde - ++ + + ++ + +++ +++ +++ ++

MC093-

450507 Souche

clinique Mucoïde +++ +++ ++ + +++ - ++ - ++ ++

MC099-

450467 Souche

clinique Mucoïde - + + ++ - + - - - +

a Rhamnolipides

b Activité protéolytique

c Activité élastolytique

Annexes

208

Annexe 2 : Composition des milieux de culture

Milieu AB (Agrobacterium)

K2HPO4 : 1,2 g/L

NaH2PO4 : 0,4 g/L

NH4Cl : 0,4 g/L

MgSO4.2H2O : 0,12 g/L

KCl : 0,06 g/L

CaCl2.2H2O : 0,004 g/L

FeSO4.7H2O : 0,001 g/L

Milieu BBM (Bouillon Biofilm Modifié)

MgSO4.2H2O : 0,2 g/L

FeSO4.7H2O : 0,0005 g/L

Na2HPO4 : 1,25 g/L

KH2PO4 : 0,5 g/L

(NH4)2SO4 : 0,1 g/L

Glucose : 0,05 g/L

Bouillon BHI (Brain Heart Infusion)

(Difco)

Infusion de cervelle de veau : 12,5 g/L

Infusion de cœur de bœuf : 5 g/L

Protéose-peptone : 10 g/L

Glucose : 2 g/L

NaCl : 5 g/L

Na2HPO4 : 2,5 g/L

Milieu BM2 (Biofilm Modifié 2)

Na2HPO4 : 1,25 g/L

KH2PO4 : 0,5 g/L

MgSO4.2H2O : 0,2 g/L

FeSO4.7H2O : 0,0005 g/L

(NH4)2SO4 : 0,1 g/L

Glucose : 5 g/L

Bouillon CAMHB (Mueller Hinton

Broth ajusté en ions Ca2+

et Mg2+

)

(Difco)

Infusion déshydratée de bœuf : 300 g/L

Hydrolysat acide de caséine

(casaminoacides) : 17,5 g/L

Amidon : 1,5 g/L

MgCl2.6H2O : 10 - 12,5 mg/L

CaCl2.2H2O : 20 - 25 mg/L

Milieu EGM (Endothelial Growth

Medium) (Lonza)

EBM (Endothelial Basal Medium)

hEGF : 0,5 mL

Hydrocortisone : 0,5 mL

GA-1000 (Gentamicine, Amphotéricine B)

: 0,5 mL

Extrait du cerveau de bovin : 2 mL

Sérum bovin foetal : 10 mL

Acide ascorbique

Milieu LB (Luria Bertani) (Sigma)

Tryptone : 10 g/L

Extrait de levures : 5 g/L

NaCl : 10 g/L

Bouillon MH (Mueller Hinton) (Difco)

Infusion déshydratée de bœuf : 300 g/L

Hydrolysat acide de caséine

(casaminoacides) : 17,5 g/L

Amidon : 1,5 g/L

Milieu solide MH (Mueller Hinton)

(Oxoid)

Infusion déshydratée de bœuf : 300 g/L

Hydrolysat acide de caséine

(casaminoacides) : 17,5 g/L

Amidon : 1,5 g/L

Agar : 17 g/L

Milieu MS (Mineral Salt) supplémenté

en lait

K2HPO4 : 7 g/L

KH2PO4 : 2 g/L

MgSO4.7H2O : 0,2 g/L

(NH4)2SO4 : 1 g/L

Glycérol : 4 g/L

Lait écrémé : 20 mL/L

Milieu PB (Pseudomonas broth)

Peptone : 20 g/L

MgCl2.6H2O : 1,4 g/L

K2SO4 : 10 g/L

Milieu PPGAS (Proteose Peptone-

Glucose-Ammonium Salts)

NH4Cl : 1 g/L

KCl : 1,5 g/L

TRIS-HCl : 19 g/L

MgSO4.7H2O : 0,4 g/L

Glucose : 5 g/L

Peptone : 10 g/L

Milieu Pseudomonas Agar (Difco)

Peptone : 20 g/L

MgCl2.6H2O : 1,4 g/L

K2SO4 : 10 g/L

Glycérol : 10 g/L

Agar : 15 g/L

Milieu TSA (Tryptic Soy Agar) (Oxoid)

Digestion pancréatique de caséine : 15 g/L

Digestion enzymatique de farine de soja : 5

g/L

NaCl : 5 g/L

Agar : 15 g/L

Milieu TSB (Tryptic Soy Broth) (Difco)

Digestion pancréatique de caséine : 17 g/L

Digestion enzymatique de farine de soja : 3

g/L

NaCl : 5 g/L

K2HPO4 : 2,5 g/L

Dextrose : 2,5 g/L

Annexes

209

Annexe 3 : Liste des publications

Seil, M., Kabré, E., Nagant, C., Vandenbranden, M., Fontanils, U., Marino, A., Pochet,

S. et Dehaye, J.P. (2009) Regulation by CRAMP of the responses of murine peritoneal

macrophages to extracellular ATP. Biochimica et Biophysica Acta. 1798: 569-578.

Seil, M., Nagant, C., Dehaye, J.P., Vandenbranden, M. et Lensink, M.F. (2010) Spotlight

on human LL-37, an antimicrobial peptide with promising cell-penetrating properties.

Pharmaceuticals. 3: 3435-3460.

Tré-Hardy, M., Nagant, C., El Manssouri, N., Vanderbist, F., Traore, H., Vaneechoutte,

M. et Dehaye, J.P. (2010) Efficacy of the combination of tobramycin and a macrolide

in an in vitro mature biofilm model of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents

Chemother. 54: 4409-4415.

Nagant, C., Tré-Hardy, M., El-Ouaaliti, M., Savage, P.B., Devleeschouwer, M. et

Dehaye, J.P. (2010) Interaction between tobramycin and CSA-13 on clinical isolates of

Pseudomonas aeruginosa in a model of young and mature biofilms. Appl. Microbiol.

Biotechnol. 88: 251-263.

Nagant, C., Tré-Hardy, M., Devleeschouwer, M. et Dehaye, J.P. (2010) Study of the initial

phase of biofilm formation using a biofomic approach. J. Microbiol. Methods. 82: 243-

248.

Nagant, C., Feng, Y., Lucas, B., Braeckmans, K., Savage, P.B. et Dehaye, J.P. (2011)

Effect of a low concentration of a cationic steroid antibiotic (CSA-13) on the formation

of a biofilm by Pseudomonas aeruginosa. J. Appl. Microb. 111: 763-772.

Nagant, C., Savage, P.B. et Dehaye, J.P. (2012) Effect of pluronic acid F-127 on the toxicity

towards eukaryotic cells of CSA-13, a cationic steroid analogue of antimicrobial

peptides. J. Appl. Microb. 112: 1173-1183.

Nagant, C., Pitts, B., Nazmi, K., Vandenbranden, M., Bolscher, J.G., Stewart, P.S. et

Dehaye, J.P. (2012) Identification of peptides derived from the human antimicrobial

peptide LL-37 active against the biofilms formed by Pseudomonas aeruginosa using a

library of truncated fragments. Antimicrob. Agents Chemother. 56: 5698-5708.

Liesse lyamba, J.M., Seil, M., Nagant, C., Dulanto, S.A., Deplano, A., El Khattabi, C.,

Takaisi Kikuni, N.B. et Dehaye, J.P. (2013) Inhibition by EGTA of the formation of a

biofilm by clinical strains of Staphylococcus aureus. J. Basic Microbiol. Sous presse.

Nagant, C., Pitts, B., Stewart, P.S., Feng, Y., Savage, P.B. et Dehaye, J.P. (2013) Study of

the effect of antimicrobial peptide mimic, CSA-13, on an established biofilm formed by

Pseudomonas aeruginosa. MicrobiologyOpen. 2: 318-325.

Nagant, C., Seil, M., Nachtergael, A., Dulanto, S.A. et Dehaye, J.P. (2013) Contribution of

the production of quormones to some phenotypic characteristics of Pseudomonas

aeruginosa clinical strains. J. Med. Microbiol. Sous presse.