FRANCOPA Plateforme française pour le développement des ... · GR O U P E M E N T D ’ IN T É R Ê T SC I E N T I F I Q U E FRANCOPA Plateforme française pour le développement

G R O U P E M E N T D ’ I N T É R Ê T S C I E N T I F I Q U E

F R A N C O P A

Plateforme française pour le développement

des méthodes alternatives en expérimentation animale

RAPPORT A MADAME LA MINISTREDE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

ETAT DES LIEUX DES METHODES ALTERNATIVES DANS LE DOMAINE DE

L’EXPERIMENTATION ANIMALE EN FRANCE

Etat des lieux des méthodes alternatives dans le domaine de l’expérimentation animale en France__________________________________________________________________

Le 30 mars 2010

Actualisé le 30 novembre 2011 – Amendé le 10 février 2012

L

a création du GIS répond à un besoin d’identifier, structurer et valoriser les méthodes alternatives à l’expérimentation animale en France. En effet, il n’existe à ce jour aucune stratégie au niveau national permettant de recenser les laboratoires, les méthodes développées ainsi que les financements dédiés à la recherche, le développement et l’utilisation pratique des méthodes alternatives que ce soit pour répondre à des exigences réglementaires ou non.

Cet état des lieux constitue donc une action prioritaire qui a été prise en charge par le GIS en réponse à la demande de Madame la Ministre et préalablement à la mise en œuvre d’actions d’amélioration.

Le GIS a utilisé plusieurs ressources permettant d’obtenir les informations nécessaires pour l’établissement de ce premier état des lieux :

- L’élaboration d’un questionnaire par le Comité directeur ; - Plusieurs réunions impliquant d’une part l’ensemble des membres des

groupes de travail du GIS qui ont participé à l’exploitation des données et à leur mise en perspective et d’autre part l’ensemble des membres du Comité directeur qui a permis d’orienter la rédaction ;

- L’implication des divers acteurs concernés par ce domaine comme le Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale et les sociétés savantes qui sont citées dans ce rapport.

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COMITÉ DIRECTEUR

Présidente (jusqu’en février 2009)Mme Marie-Hélène TISSIER (AFSSAPS)

Président (à partir de mars 2009)Mr Alain NICOLAS (AFSSAPS)

DirecteurMr Philippe HUBERT (INERIS)

Membres Mme Françoise AUDEBERT (FEBEA)Mr Jean-Pierre CLOT (OPAL)Mr Jean-François FERVEUR remplacé par Magali JACQUIER (CNRS)Mr François LACHAPELLE (INSERM)Mme Catherine LEQUIME (UIC)Mr Jean LESNE remplacé par Mr Philippe JUVIN (AFSSET)Mme Francelyne MARANO remplacée par Marc PALLARDY (SPTC)Mr Jean-Claude NOUËT (LFDA)Mme Claire SIBENALER remplacée par Sonia BENAQUISTA (LEEM)Mr Eric THYBAUD (INERIS)Mme Virginie VALLET-ERDTMANN (MESR)

Depuis la version initiale de ce rapport d’autres organismes ont rejoint le CODIR : le CEA (Christophe JOUBERT) et l’INRA (Hervé JUIN).

L’ANSES ayant regroupé l’AFSSET et l’AFSSA est représenté par le représentant de l’ex AFSSET.

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Participants aux groupes de travailMme Nathalie ALEPEE (L’Oréal)Mr Michel AURRAND-LIONS (INSERM)Mme Fanny BOISLEVE (Yves Rocher)Mr Jean-Michel CHAPSAL (Sanofi-Pasteur)Mme Nancy CLAUDE (Institut de Recherches Internationales SERVIER)Mme Blandine DOORNAERT (RHODIA)Mme Valérie FESSARD (AFSSA)Mme Isabelle GAOU (ARKEMA)Mme Christine GARCIA-MERCIER (SEPPIC)Mr Jean-Marc GIROUX (Groupe NAOS)Mr Christophe JOUBERT (CEA)Mme Nathalie LEDIRAC (CEHTRA)Mr Emmanuel LEMAZURIER (INERIS)Mr Grégory LEMKINE (WATCHFROG)Mr Patrick MAUREL (INSERM)Mme Cécile MICHEL (AFSSET)Mme Nathalie MOULIAN-CEJKA (GENZYME POLYCLONALS)Mr Marc PALLARDY (INSERM)Mme Dominique PARENT-MASSIN (Université de Bretagne)Mr Alexandre PERY (INERIS)Mr Bertrand POIRIER (AFSSAPS)Mme Sonia PRIEUR (AFSSAPS)Mr Patrice RAT (Université Paris-Descartes)Mr Christophe ROUSSELLE (AFSSET)Mr Didier SAUVAIRE (AFSSAPS)Mme Béatrice SCHAACK (CEA)Mme Anne TILLOY (AFSSET)Mr Jacky TISNE-VERSAILLES (Institut de Recherche Pierre Fabre)Mme Sylvie TISSOT (INERIS)

CoordinationMme Isabelle FABRE (AFSSAPS)

SecrétariatMme Florence CHABAUD (AFSSAPS)

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Remerciements

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Nous remercions les Professeurs Robert BAROUKI et André GUILLOUZO ainsi que le Docteur Dominique MASSET et Madame Annick PICHARD pour leur gracieuse contribution à la mise en qualité de ce document.


AVANT-PROPOS : Le GIS et la demande

Un Groupement d’Intérêt Scientifique, GIS nommé « plateforme française pour le développement des méthodes alternatives en expérimentation animale », a été lancé conjointement par le Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche et l’AFSSAPS en novembre 2007 afin de fédérer l’ensemble des acteurs nationaux agissant dans le domaine des méthodes alternatives en expérimentation animale.

En effet, il est apparu indispensable, à l’image des autres pays européens, qu’une structure soit mise en place pour faire connaître à nos concitoyens la réalité de l’expérimentation en biologie animale et humaine et développer des outils innovants afin de la faire évoluer. Les activités du GIS devraient permettre d’aller au devant de questions qui sont posées à la communauté scientifique :

- Pour mieux faire comprendre les enjeux de la science et de la recherche biomédicale et les nécessités des évaluations industrielles dans un souci de sécurité du consommateur, du travailleur ainsi que des animaux,

- Pour susciter le développement et l’utilisation des méthodes susceptibles de réduire le recours aux animaux,

- Pour centraliser les progrès réalisés et assurer leur promotion en valorisant les résultats obtenus.

Ce GIS, est dorénavant intégré dans le réseau des 16 plateformes nationales européennes dédiées aux méthodes alternatives dont les activités sont coordonnées par la plateforme européenne ECOPA. Le GIS, plateforme française s’est structurée autour des 4 piliers que sont la recherche académique, les agences réglementaires, l’industrie et les associations de protection animale, sans oublier les pouvoirs publics, ceci afin de répondre aux recommandations de la plateforme ECOPA.

Ce GIS a clairement annoncé dans son programme de travail promouvoir les méthodes qui appliquent le concept de 3R (remplacer, réduire, raffiner) c'est-à-dire toute méthode qui permet de réduire la souffrance des animaux et d’améliorer leur bien-être (raffiner), de réduire le nombre d’animaux utilisés sans pour autant impacter la sécurité du consommateur, du travailleur et des animaux (réduire) et/ou de s’affranchir de l’expérimentation animale (remplacer).

Par lettre du 25 Août 2008, Madame la Ministre de l’enseignement supérieur et de la recherche a demandé au GIS de lui transmettre un point sur la situation des recherches et développements en cours dans le domaine des méthodes alternatives à l’expérimentation animale. Les moyens humains et financiers engagés doivent également être identifiés et une mise en perspective avec les travaux européens proposée.

En réponse à la lettre de Madame la Ministre de l’enseignement supérieur et de la recherche, le GIS a lancé une enquête complémentaire à celle qui est destinée à recueillir les données statistiques de l’expérimentation animale en France. Le groupe de rédacteurs constitué des experts des Comités techniques du GIS s’est réuni 4 fois pour l’élaboration de ce rapport. La logistique de ces travaux et la synthèse éditoriale ont été réalisées grâce à un support important de la Direction des Laboratoires et des Contrôles de l’AFSSAPS que les membres du GIS remercient ici.

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SOMMAIRE

RESUME..............................................................................................................................11

INTRODUCTION..................................................................................................................17

Pourquoi l’expérimentation animale ?Pourquoi des méthodes alternatives à l’expérimentation animale ?

LES METHODES et LE CADRE DE LEUR DEVELOPPEMENT........................................25

I- LES METHODES ALTERNATIVES EN EXPÉRIMENTATION ANIMALE

1. LA DÉFINITION : LES TROIS R, LE REMPLACEMENT, LA RÉDUCTION ET LE RAFFINEMENT

2. LES MÉTHODES ALTERNATIVES (3R) DISPONIBLES, LEUR PERTINENCE ET LEURS LIMITES

II- LA PLACE DES METHODES ALTERNATIVESDANS LES CADRES LÉGISLATIFS ET RÉGLEMENTAIRES

1. LA DIRECTIVE DU CONSEIL 86/609/CEE DU 24 NOVEMBRE 1986 SUR LA PROTECTION DES ANIMAUX

2. CAS DES PRODUITS CHIMIQUES

3. LE RÈGLEMENT EUROPÉEN 1272/2008 RELATIF À LA CLASSIFICATION, À L’ÉTIQUETAGE ET À L’EMBALLAGE DES SUBSTANCES ET DES MÉLANGES

4. CAS DES PRODUITS COSMÉTIQUES

5. CAS DES PRODUITS DE SANTÉ

6. LES AUTRES RÉGLEMENTATIONS

III- LES ACTEURS DANS LE DOMAINE DES MÉTHODES ALTERNATIVES, DE LEUR CONCEPTION À LEUR UTILISATION

1. LE SECTEUR PUBLIC

2. LES AGENCES FRANÇAISES DE SÉCURITÉ SANITAIRE

3. LES SOCIÉTÉS SAVANTES FRANÇAISES

4. LES ASSOCIATIONS DE PROFESSIONNELS

5. LES ORGANISATIONS DE PROTECTION ANIMALE

6. L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE

7. LES COMMISSIONS EN CHARGE DE L’EXPÉRIMENTATION ANIMALE ET LES COMITÉS D’ETHIQUE

8. LE SECTEUR INDUSTRIEL

9. LA PLACE DES ACTEURS NATIONAUX DANS LES PROGRAMMES DE RECHERCHE EUROPEENS

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ETAT DES LIEUX DES MÉTHODES ALTERNATIVES À L’EXPÉRIMENTATION ANIMALE....74

I- LE STATUT DES METHODES ALTERNATIVES

1. LES MÉTHODES VALIDÉES PAR LES INSTANCES REGLEMENTAIRES

2. LES MÉTHODES VALIDÉES PAS OU PEU UTILISÉES

3. LES MÉTHODES NON RÉGLEMENTAIREMENT VALIDÉES ET UTILISÉES

II- LES RESULTATS DE L’ENQUETE DU GIS

→ Méthodologie de collecte de l’information : Elaboration du questionnaire

→ Description de la population étudiée

1. LES MÉTHODES ALTERNATIVES DANS LES PRATIQUES COURANTES

2. LES PROGRAMMES DE RECHERCHE EN COURS

III- LE CALENDRIER PROSPECTIFDES MÉTHODES EN COURS DE DÉVELOPPEMENT

1. AU NIVEAU NATIONAL

2. CONTRIBUTION AU NIVEAU EUROPÉEN ET INTERNATIONAL

3. STRUCTURATION - VALORISATION DES MÉTHODES ALTERNATIVES

RESULTATS ET PROPOSITIONS......................................................................................93

I- ENSEIGNEMENTS GENERAUX

II- VOIES D’AMELIORATION

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES...............................................................................101

LES ANNEXES........................................................................................................................

1021. LES MÉTHODES RÈGLEMENTAIREMENT VALIDÉES

2. LE QUESTIONNAIRE

3. LES PROGRAMMES EUROPÉENS PCRD DÉDIÉS AUX MÉTHODES ALTERNATIVES

4. LES RÉPONSES DES ACTEURS À L’ENQUÊTE DU GIS

5. LA LISTE DES CROs ET START-UPs INTERROGÉS DANS LE CADRE DE L’ENQUÊTE DU GIS

6. LE GLOSSAIRE

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RESUME

Ce rapport est le résultat d’un travail collectif du GIS « plateforme française pour le développement des méthodes alternatives en expérimentation animale », réalisé à partir d’août 2008, suite à un courrier de Madame la Ministre de l’enseignement supérieur et de la recherche, demandant un état des lieux sur les méthodes alternatives en expérimentation animale.

Le GIS a utilisé plusieurs ressources pour obtenir les informations nécessaires à cet état des lieux, le premier réalisé en France :

- L’envoi d’un questionnaire adressé aux établissements pratiquant des essais sur animaux et adressé également aux institutions de recherche et d’expertise.

- Un travail collectif au sein des deux sous-comités du GIS,- Un recueil d’information auprès de divers acteurs de ce domaine comme le Comité

national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale et les sociétés savantes qui sont citées dans ce rapport.

L’objet du rapport : les méthodes alternatives

Les méthodes considérées sont les méthodes alternatives à l’expérimentation animale telles que définies par Russell & Burch en 1959, lorsqu’a été établie la règle dite des 3R. Il s’agit de méthodes pouvant se substituer à l’utilisation de l’animal (Replacement), mais aussi de celles capables de réduire le nombre d’animaux utilisés (Reduction) ou encore de diminuer la douleur ou la détresse imposée aux animaux tout en retirant un niveau élevé d’information de l’étude (Refinement, traduit en Français par optimisation ou raffinement). Cette définition des 3R est celle retenue par l’ensemble des réglementations européennes.

Les méthodes alternatives disponibles

Le recensement fait apparaître les méthodes suivantes :

▸ Les méthodes de substitution (replacement) sont les méthodes in silico (expression devenue courante pour les calculs effectués sur ordinateur) basées sur la modélisation de données, les méthodes in vitro utilisant des éléments biologiques, les tissus, les cellules, les organites, les molécules, des méthodes de chimie analytique.

▸ Les méthodes de réduction (reduction) sont les méthodes ex vivo (cellules, tissus, organes prélevés d’organismes vivants) ou visant à réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études. La réduction de l’utilisation des animaux peut être obtenue en développant le recours aux techniques « Omics » (mesures, souvent à haut débit, de matériel génétique, de protéines, de métabolites) et aux banques de données, la réduction des effectifs des lots expérimentaux en appliquant des tests statistiques pertinents ou par la mise en œuvre des stratégies de réduction telles que les approches intégratives.

▸ Les méthodes d’optimisation (refinement) sont par exemple l’utilisation d’espèces présumées moins sensibles et l’utilisation de techniques d’exploration non invasives (imagerie du petit animal, RMN in vivo, examen clinique, évaluation comportementale, télémétrie) sachant que ces méthodes sont aussi des méthodes de réduction.

A ce jour, peu de méthodes de substitution peuvent être utilisées en méthode unique. Elles sont le plus souvent utilisées dans des approches intégratives combinant l’ensemble des outils alternatifs disponibles (in vitro, ex vivo, in silico) afin de n’utiliser l’animal qu’en dernier recours lorsque les autres méthodes n’ont pas permis d’apporter les informations suffisantes.

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L’utilisation des méthodes et les contraintes

Il existe deux utilisations majeures des méthodes alternatives qui correspondent aux domaines d’utilisation de l’expérimentation animale, mais qui ne sont pas soumises aux mêmes contraintes :

- La recherche fondamentale développe et utilise les outils alternatifs pour la compréhension du fonctionnement de base des cellules en biologie cellulaire et moléculaire ainsi qu’en complément de l’expérimentation animale pour l’étude des mécanismes biologiques intégrés (étude des pathologies, des comportements, etc.). Par essence, les méthodes alternatives utilisées dans ce domaine sont des outils pour la recherche. Elles n’ont pas à faire l’objet de validations au sens réglementaire mais une validation scientifique voire une normalisation ou une certification peuvent s’avérer nécessaires pour crédibiliser et assurer la reproductibilité des protocoles expérimentaux.- Les études effectuées dans un contexte réglementaire ont pour objet de donner des réponses ciblées à des questions restreintes par exemple toxicité d’une substance ou contrôle d’un lot de vaccin. Dans ce domaine, la validation est très contraignante dans la mesure où une méthode recevable par les autorités réglementaires doit être validée afin d’apporter la preuve de sa pertinence, de sa capacité à détecter les effets observés chez l’animal ou chez l’Homme et de sa reproductibilité. Des « validations réglementaires » sont essentiellement menées au niveau européen par l’ECVAM du centre de recherche commun (JRC) à Ispra pour les substances chimiques, l’EDQM pour le médicament et au niveau international par l’ICCVAM (USA). Le processus de validation tel qu’il a été défini par l’ECVAM doit être amélioré afin d’en réduire la durée et le coût. En effet la durée des études de validation réglementaire (> à 10 ans) ainsi que le coût (200 000 €/étude) sont un frein à l’utilisation pratique des méthodes alternatives. A noter que certaines réglementations (cf. REACh) ont assoupli le processus acceptant dans certaines circonstances des méthodes « reconnues », c'est-à-dire qualifiées sans être validées par ces instances.

Les acteurs

En 1986, l’Europe, a avancé dans le domaine de la protection animale, en publiant une Directive (86/609/CEE) visant à encadrer la protection des animaux utilisés dans un cadre expérimental. L’application de cette Directive s’est accompagnée, au niveau européen, de la création de nombreuses structures dédiées au développement et à la validation des méthodes alternatives : ECVAM en 1991 pour la conduite des études de validation, ECOPA, plateforme européenne assurant la coordination des activités des plateformes nationales en 1999, EPAA créée en 2005, en partenariat entre la CE et l’industrie afin de favoriser la communication et le transfert technologique entre les différents secteurs industriels. En France, la communauté scientifique, devançant le législateur, a mis en place des Comités d’éthique chargés d’évaluer toute étude réalisée sur l’animal. Cette démarche s’est structurée à un niveau national grâce au Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale (CNREEA). Par ailleurs, les enseignements destinés à la pratique éthique sont dispensés dans le cadre des formations réglementaires pour la mise en œuvre d’expérimentation animale, l’approbation de ces formations étant assurée par la Commission nationale de l’expérimentation animale (CNEA).

Actuellement, des collaborations se sont mises en place au niveau international afin d’obtenir une harmonisation des pratiques et des réglementations.

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Dans cette perspective la création en 2007 du GIS « plateforme française pour le développement des méthodes alternatives en expérimentation animale » a permis à la France de rejoindre la plateforme européenne ECOPA.

L’état des lieux en France, les enjeux

Il se dégage des réponses reçues de la part des acteurs nationaux sollicités plusieurs constats qui désignent des axes d’amélioration et de valorisation du savoir-faire national dans le domaine :

− La recherche publique développe de nombreux outils et concepts qui présentent un fort potentiel d’application pour le secteur industriel, cependant le transfert technologique de la recherche fondamentale vers la recherche appliquée n’est pas suffisamment efficace.

− On constate une perception confuse des réglementations par les chercheurs : par exemple ces derniers tendent à confondre l’obligation réglementaire d’utiliser les méthodes alternatives en recherche (Directive 86/609 valable dans tous les domaines de la recherche et en R&D) et cette même obligation liée aux démonstrations dans les réglementations appliquées aux produits (études soutenant par exemple les AMM ou la sécurité des produits).

− Des domaines semblent « orphelins » au sens où l’incitation au développement de méthodes alternatives est faible. Ils doivent être identifiés et des solutions proposées.Ces remarques se situent dans un contexte bien identifié avant cette étude :

− L’expertise nationale dans le domaine de la toxicologie est insuffisante et mal organisée au regard des nouveaux enjeux et réglementations au niveau européen.

− Le transfert de compétences et de données n’est pas fluide. Un accompagnement de ce transfert par les pouvoirs publics est attendu.

− Le passage des acquis de la recherche en amont vers des applications, et le portage de ces derniers par des acteurs industriels classiques ou émergents se fait mal.

Résultats

La synthèse des résultats combine les apports de l’enquête, de l’analyse de la littérature et des apports des experts des Comités.

La grande variété des domaines de recherche concernés (in vitro, ex vivo, in silico, chimie analytique, statistique, etc.) mais aussi imagerie et méthodes non invasives a été déjà décrite. La France est présente sur l’ensemble de ces champs de recherche (un projet européen sur deux, mais seulement 8% des équipes).

Si des méthodes in vitro sont déjà validées réglementairement pour la toxicité, les modèles in silico sont aussi bien avancés. Organes artificiels et imagerie ont des perspectives de court/moyen terme. La généralisation des « Omics » pour des essais reste plus lointaine, tandis qu’une approche intégrative est un horizon de recherche.

Alors que corrosion et irritation ont vu des essais déjà validées réglementairement, repro-toxicité et toxicité à exposition répétée sont des objectifs de recherche plus amont, tandis que des effets comme la cancérogénèse seraient intermédiaires. Ces appréciations peuvent être nuancées selon les Comités (cf. ECHA, EFSA) ou les méthodes.

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Des méthodes substitutives pour la toxicologie et le contrôle sont déjà validées réglementairement, mais elles sont peu nombreuses : 15 pour la toxicité, 6 types de tests pour le contrôle défini par la Pharmacopée européenne. Lors de l’enquête, il est apparu que la liste des méthodes employées est trois fois plus longue car la démonstration réglementaire n’est pas le seul usage. On notera le grand (relativement aux autres méthodes !) usage des méthodes in vitro et dans une moindre mesure in silico pour la substitution. Les apports à la réduction et à l’optimisation sont plus mal connus.

En tout état de cause, les études sur la toxicité et le contrôle ne représentent qu’une minorité des expérimentations. Les acteurs mettant en œuvre ces méthodes sont aussi variés, des instituts de recherche aux « start-ups ».

Parmi les financeurs, l’Europe a bien identifié les méthodes alternatives dans le cadre du PCRD (chiffre estimé à 200 M€ auxquels doivent s’ajouter en 2010, 50 M€ engagés en partage avec le COLIPA). En France, le « fléchage », n’est que rarement possible. L’ANR, notamment via des programmes sur l’imagerie, finance des sujets relevant de méthodes alternatives. L’AFSSET a effectué le recensement ex post des projets qui peuvent relever de ce thème. Le thème n’est cependant explicite que pour le seul financement du « Grenelle de l’Environnement » sur la plateforme en toxicologie et écotoxicologie, dont la première tranche de 5 M€ (sur 15 M€ envisagés en 3 ans) a été débloquée en 2009 via l’INERIS et Antiopes.

Les équipes sont, elles aussi, difficiles à cataloguer sur ces sujets. L’AFSSAPS et l’INERIS, de par leurs actions de recherche finalisée vers les sujets réglementaires ont des équipes ciblées de 6 et 15 chercheurs. Au sein du CEA, de l’INRA, de l’AFSSA, de l’INRS, de l’INSERM et du CNRS, l’enquête a suscité des réponses et a montré de nombreuses activités relevant des « 3R ». Toutefois, ceux qui pratiquent ces activités se reconnaissent difficilement comme acteurs du développement des « 3R », non seulement parce qu’aucun financement n’est dédié à ce thème (Cf enquête au sein du CNRS), mais aussi parce que les objectifs de recherche sont centrés sur la mise au point de nouveaux outils d’investigation du vivant, substitution ou réduction n’étant que des bénéfices supplémentaires. Les chercheurs considèrent avant tout l’intérêt de ces méthodes en tant qu’outils d’investigation et non en tant que méthodes alternatives. Ainsi, au CNRS, via l’enquête interne, des équipes regroupant environ 370 agents et 1,9 M€ ont déclaré pratiquer des « méthodes alternatives », sans dire qu’il s’agit de leur thème de recherche. Il en va de même au sein de l’INSERM, pour les quelques 700 agents que l’on peut déduire de l’enquête interne. Ces chercheurs utilisent des méthodes alternatives, mais les instituts insistent (cf. commentaire sur l’enquête), sur le fait qu’il serait erroné de penser que la création de méthodes alternatives per se est un objectif de recherche reconnu.

Parmi les difficultés rencontrées on note l’absence d’une nomenclature des méthodes permettant aux acteurs de se reconnaître comme acteurs du domaine, particulièrement pour les acteurs amont. On note aussi la difficulté déjà connue du passage de la recherche amont vers des outils opérationnels, et l’enjeu du partenariat public-privé.

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Les recommandations

Le GIS a énoncé des recommandations dans les domaines suivants :

Pour abandonner les expérimentations superflues, le GIS propose de :- promouvoir les règles de dispense envisagées par les réglementations,- accélérer l’optimisation des processus de contrôle,- recourir plus aux simulations dans l’enseignement,- dynamiser les dispositifs d’échange des résultats acquis, avec un état exemplaire.

Pour intégrer les méthodes alternatives dans l’enseignement des sciences de la vie, le GIS propose :- une pédagogie systématique,- des formations spécifiques.

Pour orienter la recherche vers des outils novateurs, le GIS propose de :- mettre comme objectif central le fondement scientifique des approches intégratives

en toxicologie,- identifier les besoins de recherche et développement de méthodes alternatives,- mettre en place des programmes incitatifs dans le domaine des 3R.

Pour construire une infrastructure de recherche finalisée, le GIS propose de :- créer un INFOCENTRE pour faire connaître les actions et partager les résultats entre

les différents secteurs,- mettre en place un système de recherche translationnelle appuyé sur un réseau de

ressources,- créer un centre pour garantir la qualité des méthodes (normalisation, certification

volontaire, etc.),- créer un centre pour organiser la validation réglementaire,- soutenir le développement d’un réseau d’opérateurs au sein des pôles de

compétitivité industriels,- intégrer la démarche aux stratégies nationales de recherche en toxicologie,

écotoxicologie et sciences de la vie.

Pour définir des politiques par domaine et évaluer leur avancement, le GIS propose de :

- cibler et construire des politiques sectorielles en fonction du potentiel de réduction,- affiner et renforcer la connaissance du type d’usage de l’expérimentation animale et

identifier des cibles pour la réduction,- construire une nomenclature permettant d’identifier les méthodes alternatives.

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Conclusions et perspectives

Le présent travail constitue une première analyse sur le sujet. Il est améliorable dans la mesure où méthodologie et outils d’enquête n’étaient pas disponibles, et que leur mise au point est à achever (cf. recommandations). L’approfondissement des calendriers de mise au point est aussi perfectible. En revanche, ce travail a bénéficié d’une participation active de la communauté scientifique. La mobilisation a été bonne pour des raisons éthique, mais aussi parce que ces méthodes sont associées à des avancées importantes dans la compréhension des mécanismes du vivant, qu’il s’agisse de biologie, de thérapie ou de toxicologie. Dans ce dernier domaine la synergie avec le renouveau de la toxicologie est à souligner (cf. actions sur la structuration du champ).

Le GIS entend œuvrer à approfondir cette interaction et à faciliter le passage des développements amont aux applications. Toutefois, le GIS, dans l’esprit des plateformes rassemblées dans ECOPA se doit de rappeler que l’alternative en expérimentation animale ne relève pas uniquement de percées scientifiques, mais que la généralisation des bonnes pratiques et la circulation de l’information ont aussi leur part.

Il s’associera aux moyens qui seront mis en place pour assurer le suivi de la mise en place des méthodes, et suivre les recommandations émises.

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INTRODUCTION

Le présent rapport s’attache aux alternatives en expérimentation animale. Avant d’approfondir ce sujet, il importe de comprendre pourquoi les expérimentations sont utilisées, et pourquoi on peut envisager des alternatives.

Pourquoi l’expérimentation animale ?

L’utilisation de « modèles animaux » fait partie des outils expérimentaux de l’investigation du vivant avec l’étude expérimentale chez l’Homme, les études sur les tissus, cellules et molécules biologiques isolées. Elle se situe aussi aux côtés des approches observationnelles (clinique, épidémiologie) chez l’Homme ou l’animal. Aujourd’hui, elle se place de plus en regard des méthodes de modélisation mathématique du vivant.

Par nature, l’expérimentation animale est centrée sur l’étude de réponses intégrées au sein de l’organisme qui impliquent de nombreuses interactions entre cellules ou tissus, et organes entre eux. Elle est un des éléments de compréhension du vivant, complémentaire des études expérimentales réalisées sur des cellules et des organes isolés ou des observations dont tous les paramètres ne sont pas accessibles (ex. patients humains, etc.).

Une vision statique de l’approche expérimentale serait trompeuse, car celle-ci est en perpétuelle évolution. Ainsi, les développements scientifiques, en particulier les progrès récents de la biologie moléculaire, de l’imagerie et les techniques de « post-génome1 » ou « Omics » conduisent à de nouvelles formes d’investigation sur le vivant. De plus, les modèles animaux eux-mêmes évoluent, notamment avec l’usage d’animaux génétiquement modifiés, pour modéliser des mécanismes physio-pathologiques plus proches de ceux de l’Homme et/ou, pour faciliter l’étude d’une pathologie.

▸ L’expérimentation animale est un outil privilégié de la recherche fondamentale en physiologie animale et humaine et pour l’étude des maladies animales et humaines :

L’expérimentation animale permet d’évaluer la capacité des organismes vivants à répondre à des modifications de leur environnement par des mécanismes intégratifs pouvant évoluer sur du long terme. A ce titre elle reste une composante irremplaçée de la biologie fondamentale. L’expérimentation animale reste également un outil important de la recherche médicale moderne sur de nombreuses pathologies (maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer, maladies infectieuses et développement de vaccins, maladies métaboliques comme le diabète, etc.). Elle sert également à développer les nouvelles techniques chirurgicales (greffes, microchirurgie ou neurochirurgie). Les questions posées par la recherche sont fondamentales pour l’identification des mécanismes biologiques qui permettent aux organismes de s’adapter aux variations des conditions environnementales et aux perturbations internes en situations physiologiques et par voie de conséquence pathologiques.

1 Etude du rôle des gènes, de leurs interactions au sein d’un organisme et du lien entre gènes et phénotype.

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Les agents chimiquesLes agents xénobiotiques sont des molécules, étrangères à un organisme donné et comprennent les produits chimiques, liés à notre mode de vie, les polluants et contaminants mais aussi les agents à but thérapeutique (substances médicamenteuses) ainsi que les produits cosmétiques, biocides et phytosanitaires.

Les agents physiquesIl s’agit des champs électromagnétiques produits par exemple par des antennes ou des radars, des vibrations, du bruit, des rayonnements ionisants et non ionisants.

Les agents biologiquesSont classés dans les agents biologiques les agents présentant un risque infectieux comme les virus, les bactéries, les champignons, les parasites, mais aussi les médicaments biologiques tels que les vaccins, les produits biotechnologiques, les toxines (mycotoxines, phycotoxines), les Organismes Génétiquement Modifiés utilisés en agriculture ou pour les nouvelles thérapies.


Les progrès de la médecine à un moment ou à un autre du processus de la découverte, s’appuient généralement sur les résultats d’expérimentations animales. On peut signaler que plus de 70 prix Nobel de médecine et de physiologie ont récompensé l’acquisition de connaissances obtenues à partir de l’expérimentation animale. Cette expérimentation tient donc une place aujourd’hui très importante dans le processus de la découverte scientifique en biologie et médecine. Des Comités européens comme le SCHER (Scientific Committee on Health and Environmental Risk) n’envisagent pas de s’affranchir complètement de ces modèles dans l’état actuel des connaissances.

▸ Pour prédire le risque lié à l’exposition aux agents xénobiotiques, chimiques physiques ou biologiques :

Aujourd’hui, l’un des grands enjeux de santé publique est la prévention des éventuels effets néfastes liés à une exposition à un ou plusieurs agents chimiques, physiques ou biologiques présents dans notre environnement général, domestique ou professionnel. Cette préoccupation de prévention s’applique ainsi également aux produits destinés à la santé animale ainsi qu’aux produits de traitement des végétaux et ceux issus de l’activité humaine retrouvés dans l’environnement en bout de leur cycle écologique. En toxicologie, l’expérimentation animale vise en premier lieu à prédire les dangers pour savoir si l’on doit autoriser des substances ou pour permettre l’élaboration de mesures de prévention efficaces lors de l’autorisation des substances et de leur condition d’emploi.

Les effets néfastes peuvent aussi concerner les médicaments humains ou vétérinaires, et l’anticipation des dangers sert alors à écarter des molécules inacceptables ou à établir la balance « bénéfice/risque » pour permettre un bon emploi.

Les expérimentations animales occupent aujourd’hui une place centrale dans les démonstrations. Ces études ont pour objectif de renseigner sur :- la nature des effets toxiques résultant de diverses conditions d’exposition

rigoureusement contrôlées (variété de niveaux, des durées, des voies d’exposition, etc.), - les doses ayant induit ces effets toxiques,- la vraisemblance biologique d’un effet suspecté chez l’Homme.

Plus de 50 ans d’études expérimentales de toxicité ont ainsi permis d’améliorer considérablement les connaissances sur les mécanismes d’action d’un grand nombre de substances.

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Aujourd’hui, les études toxicologiques ont recours à un ensemble diversifié de modèles expérimentaux :

- les tests in vivo réalisés directement sur l’animal,- les tests ex vivo effectués sur un tissu ou un organe ou partie d’organe isolé,

- les tests in vitro, ayant généralement recours à l’utilisation de cellules isolées d’origine animale ou humaine, ou d’extraits cellulaires ou de protéines,

- les tests in silico permettant d’analyser, grâce à des logiciels informatiques, les propriétés recherchées ou indésirables d’une substance en fonction de sa structure ou de sa réactivité, - les approches intégratives combinant l’ensemble des tests précités.

Ainsi, bien que des progrès considérables dans la connaissance aient été obtenus depuis 50 ans, des évolutions d’ordres éthique, scientifique et économique questionnent la place centrale de l’expérimentation animale.

▸ Pour la production et le contrôle de la qualité des produits de santé animale et humaine, pour les denrées alimentaires :

Les crises sanitaires qu’ont connues la France et les pays européens dans le domaine des produits de santé et des produits alimentaires montrent la nécessité de mettre en œuvre un contrôle de la production et de la qualité de ces produits destinés à l’Homme et à l’animal. Nous citerons comme exemple, l’affaire du Stalinon entre 1953 et 1958, celles plus proches de l’hormone de croissance (années 1980) et du sang contaminé (1991) dans le domaine du médicament (même si bien d’autres problèmes que celui du contrôle stricto sensu ont joué), la maladie de « la vache folle » et la listeria pour les produits alimentaires. Cas du médicament : L’évaluation de l’approche qualité a suivi l’évolution de la fabrication des médicaments. Ainsi, pour tout médicament, le fabricant doit s’assurer, à toutes les phases de recherche et de développement, de la qualité et de la sécurité de chaque lot de produit destiné à être administré à un patient. Alors que les contrôles de la qualité et la sécurité des médicaments chimiques s’appuient essentiellement sur des essais n’utilisant pas l’animal, (méthodes physico-chimiques, méthodes microbiologiques), il n’en est pas de même pour les médicaments d’origine biologique. En effet, de part la nature biologique du principe actif, les médicaments biologiques (vaccins, sérums, toxines, produits dérivés du sang), présentent une variabilité intrinsèque qui impose souvent la mise en œuvre de contrôles dont les tests d’activité et de sécurité qui sont très consommateurs d’animaux, essentiellement des rongeurs. Cas des produits alimentaires : Une méthode physico-chimique appliquée au dosage des biotoxines lipophiles dans les aliments est en cours de validation au niveau communautaire2. Il s’agit d’une technique séparative chromatographique couplée à la spectrométrie de masse. Cette méthode une fois validée et adoptée viendra compléter les bioessais réalisés sur la souris qui seront toujours nécessaires pour la détection des toxicités atypiques comme cela est le cas pour les biotoxines marines des mollusques bivalves.

A la liste des méthodes possibles en toxicologie on peut ici ajouter des essais sur bactérie et des méthodes de chimie analytique.

▸ Les usages dans l’enseignement :

2 In fine, cette méthode a été validée et adoptée aux niveaux national et communautaire (JO de l’union européenne L6 du 11/01/2011). Elle s’applique aux 4 familles de toxines réglementées ; EU-Harmonized Standard Operating Procedure for determination of lipophilic marine biotoxins in molluscs by LC-MS/MS,

(http://www.aesan.msps.es/CRLMB/docs/docs/metodos_analiticos_de_desarrollo/EU-Harmonised-SOP-LIPO-LCMSMS_Version4.pdf).

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L’expérimentation sur les animaux vertébrés est utilisée en enseignement supérieur lors de la formation des futurs chercheurs et techniciens dans le cadre de leur formation initiale. Une commande a été adressée à la Commission nationale de l’expérimentation animale (CNEA) à ce sujet et fera l’objet d’un rapport dédié à ces aspects. De ce fait, ce sujet ne sera que très peu développé dans le présent rapport.

Par ailleurs, un enseignement sur l’expérimentation animale est donné dans les formations destinées aux acteurs de l’expérimentation animale selon leur niveau d’intervention sur l’animal (chercheur, technicien, zootechnicien) en conformité avec l’arrêté du 19 avril 1988 fixant les conditions d’attribution de l’autorisation de pratiquer des expériences sur les animaux et l’arrêté du 19 avril 1988 fixant les conditions d’agrément, d’aménagement et de fonctionnement des établissements d’expérimentation animale.

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▸

Les statistiques de l’expérimentation animale 3

La dernière enquête publiée par la Commission Européenne (2008) relative à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques permet d’estimer le nombre d’animaux utilisés dans les différents pays de la Communauté Européenne.

En 2008, il a été utilisé 12 millions d’animaux en Europe (dont 2,5 millions en France). Les rongeurs4 représentaient 80% du total (92% en France) dont les souris 59%. Les carnivores représentaient 0,3% du total (0,3% en France) et les primates non humains 0,1% (0,16% en France).

Les trois principaux domaines d’utilisation des animaux sont les études en biologie fondamentale (38%), la recherche et développement en médecine humaine ou vétérinaire (23%) et la production et le Contrôle Qualité des médicaments humains (11%).

Dans plus de la moitié des cas (56,85%), les animaux ont été utilisés pour la production et le Contrôle Qualité afin de répondre simultanément à plusieurs réglementations (européenne, nationale, internationale) et dans un tiers des cas (33,31%) pour répondre à la réglementation européenne uniquement.

Les études de toxicologie et d’évaluation de sécurité représentent 8,7% du nombre total d’animaux utilisés. La moitié des études de toxicologie concerne les médicaments humains, les produits cosmétiques représentent 0,2% (0,0003% du nombre total). Les études de toxicité aiguë et subaiguë représentent 45% des animaux utilisés en toxicologie. Une analyse approfondie des nombres d’animaux utilisés pourrait permettre de définir des priorités en termes de méthodes alternatives, cependant ces statistiques comportent des imprécisions (catégorie ‘autres’ représentant 24% des études de toxicologie) ou un émiettement des données (catégorie ‘étude aiguë et subaiguë’ pour ‘les produits domestiques’ représentant 49 animaux soit 0,01% du total de la catégorie) les rendant peu utilisables dans ce but.

En France, environ 10% du nombre total de rongeurs utilisés ont été euthanasiés comme source de matériel biologique pour les méthodes alternatives (400 000 animaux).

3 Sixième rapport sur les statistiques concernant le nombre d’animaux utilisés à des fins expérimentales et à d’autres fins statistiques dans l’Union Européenne. Commission des communautés européennes. COM (2010) 511.

4 Données incluant les lagomorphes.

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Pourquoi des méthodes alternatives en expérimentation animale ?

▸ L’évolution de la sensibilité sociale, les droits de l’animal, le bien être animal :

La vision anthropomorphique de l’animal n’a cessé d’évoluer depuis le début de l’existence de l’humanité au sens des droits et des devoirs que s’accorde l’espèce humaine vis-à-vis des espèces animales.Au cours de la préhistoire, la relation ancienne et réciproque de prédateur à proie entre l’Homme et l’animal a en effet peu à peu évolué vers un rapport de dominant à dominé, avec la domestication de certaines espèces. Le fondement de ce rapport fut dicté par l’ « utilité » de l’animal pour l’Homme – « utilité » alimentaire et « utilité » comme force de travail. Les rapports entre l’Homme et les animaux évoluent aussi en parallèle des évolutions de la société ; le regard que portent les « citadins » sur les animaux diffère de celui que leur portent les « ruraux ». La déification de quelques espèces animales dans la plupart des civilisations peut en partie expliquer la notion d’animal de compagnie que nous connaissons. Pour d’autres sociologues, l’animal de compagnie peut représenter de nos jours un vestige de notre ruralité ancienne perdue. Ce n’est qu’au début du XIXème siècle que sont apparues les premières réflexions philosophiques sur le bien-être animal et les premières sociétés de protection animale. En France, la première réglementation concernant l’animal est la loi Grammont (1850), proposée à l’assemblée nationale par le député Grammont qui s’offusquait des flagellations que les palefreniers imposaient aux chevaux pour les faire avancer dans le rues étroites de Paris. Cette loi qui édictait « de ne pas faire mal à un animal en public », a été marquante puisqu’elle prévoyait pour la première fois des sanctions pour « les personnes ayant fait subir publiquement des mauvais traitements aux animaux ». Il fallut attendre près d’un siècle pour voir l’adoption d’une loi (loi du 10 juillet 1976) soulignant le fait que les animaux sont des êtres sensibles subissant contraintes et souffrances imposées par l’Homme.

Cette première loi a donné les fondements de la plupart des textes réglementaires ultérieurs, encadrant nos pratiques par rapport aux animaux en général (articles L214-1 et 3 et articles L215-6 et 7 du Code rural) et en particulier ceux concernant l’expérimentation animale qui relèvent aussi de la transposition de la Directive 86/609 du Code rural, Décret 87/848 du 19 octobre 1987 modifié par Décret 2001-464 du 29 mai 2001 et par Décret 2005-264 du 22 mars 2005, insérés dans la partie réglementaire du Code rural (article R214-87 à R 214-130, arrêtés du 19 avril 1988), qui soulignent tous le souhait d’encadrer les pratiques liées à l’expérimentation animale. Ces critères conduisent à éviter l’usage des animaux chaque fois que cela est possible. Lorsque cet usage ne peut être évité et dans les cas où il y a souffrance ou détresse animale, il convient de définir le point limite de souffrance ou détresse animale en se basant sur des principes énoncés et formalisés par W.M.S Russell et R.L. Burch, dans leur ouvrage «The principles of Human Experimental Technique» publié en 1959. Cet ouvrage fait référence à un principe, aujourd’hui connu sous le nom de règle des trois R pour «Replace, Reduce, Refine» : Remplacer, Réduire et Raffiner (cf. chapitre Généralités, les 3R). Les recommandations édictées dans cet ouvrage sont d’abord passées inaperçues avant de servir de base à de nombreux textes réglementaires. Elles permettent aujourd’hui la mise en place d’une réflexion sur l’expérimentation animale et les méthodes alternatives.

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▸ L’extrapolation des résultats des études à l’Homme ou l’animal : une prédictivité imparfaite :

Les études à visée réglementaire, généralement en phase de développement des produits (médicaments, produits phytosanitaires, etc.), sont l’objet de protocoles standardisés et validés dont l’objectif est de permettre l’évaluation des effets par des Comités experts et les agences de sécurité sanitaire à l’échelle nationale et à l’échelle européenne. Ces études permettent aussi le contrôle et la vérification des données obtenues. Dans ce cas, les objectifs sont généralement d’identifier le danger lié à la molécule testée et de participer à l’évaluation du risque pour l’Homme qui sera exposé à cette molécule. Les résultats obtenus doivent donc permettre d’établir une « carte d’identité » du danger de la molécule (identification des organes cibles, pouvoir mutagène et cancérogène, effets sur les fonctions de reproduction) mais aussi de définir une dose sans effet toxique. Cette dose sans effet toxique sera un des éléments d’appréciation du risque encouru par l’Homme exposé au produit et sert de base au calcul des seuils d’exposition réglementaire comme la DJA (dose journalière admissible) dans le cas des produits phytosanitaires. Cette dose sans effet participe aussi à la définition de la posologie d’emploi des médicaments chez l’Homme.

La transposition à l’Homme des résultats obtenus en toxicologie réglementaire chez les animaux d’expérimentation est établie dans un grand nombre de cas. Par exemple, les rhabdomyolyses observées avec la cérivastatine chez les patients traités et qui ont abouti au retrait du médicament du marché avaient été clairement identifiées chez l’animal. Pour autant, elle n’est pas pertinente dans certains autres (par exemple rofecoxib : VIOXX, anticorps monoclonal TGN1412, effets cardiaques du trastuzumab Herceptin®). Cela est dû à diverses raisons qui peuvent d’ailleurs parfois interagir entre elles. A titre d’exemples, certaines espèces sont peu sensibles ou au contraire extrêmement sensibles à certains agents toxiques (ex : tératogènes comme la thalidomide). Il faut aussi mentionner les aspects idiosyncrasiques comme le polymorphisme génétique des enzymes de métabolisation ou le déterminisme génétique des réponses immunitaires qui ne sont pas prévisibles par l’expérimentation animale et sont à l’origine de nombreux retraits du marché de médicaments. Dans d’autres cas, il peut s’agir de différences dans les mécanismes biologiques présents chez l’animal et chez l’Homme. Dans ce dernier cas, la mise en place d’études pertinentes utilisant des cellules humaines et animales permettraient probablement de mieux sélectionner l’espèce animale la plus appropriée.Dès lors les questions de la prédiction du niveau de risque pour l’Homme, et donc de la définition d’un seuil acceptable d’exposition sont posées. La manière actuelle de résoudre cette problématique est de définir un facteur de sécurité qui est le rapport entre la dose sans effet toxique chez l’animal et la dose à laquelle on estime pouvoir exposer l’Homme sans danger.Enfin, il faut souligner qu’en ce qui concerne le médicament humain les essais chez l’animal sont toujours suivis d’une phase d’essai de plus en plus extensive chez l’Homme. Cette précaution n’empêche pas les accidents après cette phase pour plusieurs raisons. Tout d’abord l’extension des populations humaines (7 milliards d’individus), la variabilité génétique extrême de ces populations, l’existence d’isolats génétiques très différenciés et enfin les contextes comportementaux, sanitaires, environnementaux extrêmement variés de ces populations. Il est donc important de rappeler que ce n’est pas la non pertinence des modèles animaux qui conduit aux rares accidents postérieurs à la phase d’essai chez l’homme. La transposition de l’Homme à l’Homme, est, elle aussi une question à poser.

Par ailleurs, la perception du risque est différente pour un médicament d’usage humain ou vétérinaire, pour lequel on peut accepter le risque si le rapport bénéfice/risque est favorable, ou produit cosmétique ou un produit échouant dans l’environnement, pour lequel l’acceptation d’un risque peut être sociologiquement inacceptable.

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▸ L’application de méthodes alternatives : déjà une expérience acquise

Dans le cas des études visant à définir la sécurité d’emploi ou les limites de l’exposition à une molécule donnée, plusieurs types de méthodes alternatives sont déjà utilisables.En ce qui concerne le remplacement, l’application du 7ème amendement de la Directive sur les cosmétiques a conduit à la substitution de plusieurs essais.En ce qui concerne la réduction, des approches visant à réduire le nombre d’animaux sont déjà en évaluation pour une acceptation réglementaire. C’est par exemple le cas du rLLNA (reduced Local Lymph Node Assay) dont la prédictivité est au moins équivalente à celle du LLNA classique avec deux fois moins d’animaux employés. L’utilisation de modèles animaux humanisés doit aussi être développée comme ceux comportant certains Cytochromes P450 humains connus pour jouer un rôle majeur dans la métabolisation des xénobiotiques. Le développement de biomarqueurs spécifiques et de méthodes non-invasives d’exploration devraient permettre une réduction significative du nombre d’animaux dans les études de toxicologie.

Parmi les tests toxicologiques in vitro ou ex vivo développés en remplacement de l’expérimentation animale, les tests de mutagenèse sont depuis longtemps employés comme tests réglementaires et emploient des protocoles standardisés et validés. Le test « patch clamp » hERG (modèle cellulaire pour prédire des effets cardiotoxiques) est un bon exemple de test développé à partir de la recherche fondamentale et appartenant maintenant à une batterie de tests réglementaires recommandés en pharmacologie de sécurité. Pour d’autres tests, les protocoles sont moins bien précisément établis et les résultats des essais dépendent souvent du niveau d’expertise de chaque laboratoire et de la pertinence des modèles cellulaires et des modèles animaux utilisés pour mettre en place les modèles cellulaires. Néanmoins, il faut souligner l’importance de ces approches dans la compréhension des mécanismes d’action toxiques chez l’Homme qui, souvent, aboutissent à une réduction notable du nombre d’études chez l’animal. Dans ce cas, l’acceptabilité réglementaire ne sera pas l’objectif premier pour le développement de ces méthodes car celles-ci ne seront pas employées en substitution à l’animal de laboratoire. Mais leur acceptabilité dans la communauté scientifique doit être un objectif ce qui est déjà le cas pour les tests employés très en amont dans le développement des produits de santé (tests de mutagenèse miniaturisés, Omics, etc.) L’utilisation de plateformes (Imagerie-puces à cellules, etc.) labellisées (IBiSA, etc.) devrait faciliter la standardisation et l’évaluation de la reproductibilité de nouveaux tests développés au sein de différents laboratoires.

Dans le domaine de la recherche appliquée et de la recherche fondamentale, et à la différence des études de sécurité, les protocoles ne font pas l’objet d’une standardisation, certaines de ces études pouvant avoir pour objectif de définir de nouvelles approches complémentaires. Dans ces situations, les évaluations des effets thérapeutiques et des éventuels effets indésirables sont effectuées par des Comités experts ad hoc à partir de l’ensemble des connaissances disponibles. En situation extrême, comme l’utilisation de nouvelles voies thérapeutiques (thérapie cellulaire, thérapie génique, etc.) la prédictivité des études ne peut être établie que de façon rétrospective lorsque le premier essai chez l’Homme a été réalisé. Fréquemment, après ces premiers essais, de nouvelles études sont entreprises tant in vivo chez l’animal qu’in vitro afin d’améliorer les modèles expérimentaux existants.

Dans ce cas, les contraintes sont moins fortes d’un point de vue réglementaire mais devront faire l’objet de consensus dans la communauté scientifique quant à leur extrapolation à la situation humaine.

In fine, l’expérience acquise montre que Remplacement, Réduction et Raffinement ont déjà été possibles.

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LES METHODES et LE CADRE DE LEUR DEVELOPPEMENT

I- LES MÉTHODES ALTERNATIVES « EN » EXPÉRIMENTATION ANIMALE

1. La définition : les Trois R, le remplacement, la réduction et le raffinement

Le bien-être animal ainsi que la douleur5 et la détresse que les animaux utilisés à des fins scientifiques peuvent ressentir sont depuis longtemps une préoccupation du grand public et de la communauté des chercheurs sensibles à ces questions. Ce sont ces préoccupations, combinées à l'utilisation accrue des animaux en recherche fondamentale et appliquée, qui ont motivé W. M. S. Russell et R. L. Burch à examiner comment les décisions devraient être prises quant à une telle utilisation des animaux. Dans leur monographie The Principles of Humane Experimental Technique [les principes d’une technique expérimentale conforme à l’éthique], dont la première parution remonte à 1959, ces auteurs proposent le principe des Trois R. Les Trois R signifient raffinement, réduction et remplacement. Depuis une quarantaine d’années, ce principe des Trois R est largement reconnu comme un principe éthique, même s’il n’est pas le seul, établi dans le cadre de la science faisant appel à l'utilisation d'animaux, et ce, dans de nombreux pays du monde.

Le terme « alternatives » a été inventé en 1978 par l'éminent physiologiste David Smyth dans son ouvrage Alternatives to Animal Experiments [alternatives aux études expérimentales sur les animaux]. Ce mot est utilisé pour décrire toute modification aux procédures scientifiques établies qui a pour résultat le remplacement de l'utilisation des animaux, la réduction du nombre d'animaux utilisés ou le raffinement des techniques qui peuvent réduire la douleur chez les animaux. Par conséquent, le terme de Smyth, « Alternatives », possède le même sens que les « Trois R » de Russell et Burch.

L'éthique de l'expérimentation animale du CCPA (Conseil Canadien de Protection des Animaux) est fondée sur la définition de la notion d'« Alternatives » proposée par Smyth, c'est-à-dire du remplacement, de la réduction et du raffinement. En France, il faut savoir que les deux premiers R, remplacement et réduction, sont inscrits dans la loi du 10 juillet 1976 (article L214-3 du Code rural), le troisième R, raffinement, étant strictement du domaine de l’éthique ; l’éthique de l’expérimentation animale est d’ailleurs complétée par une notion qui n’apparaît pas directement dans le principe des 3R, le bien-fondé scientifique. Enfin, la responsabilité même de l’expérimentateur est mise en avant dans notre pays et l’autorité compétente qu’est le MESR propose même de l’ajouter à la règle des 3R pour devenir le quatrième R : la Responsabilité.

5 La définition de la douleur chez l’Homme a été adoptée par l’IASP (Association internationale pour l’étude de la douleur) et a ensuite été modifiée par des vétérinaires anglais afin de proposer une formulation plus adaptée aux capacités des animaux : « expérience sensorielle et émotionnelle aversive, représentée par la « conscience » que l’animal a de la rupture ou de la menace de rupture de l’intégrité des tissus ».

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Les alternatives de remplacement désignent les méthodes qui évitent ou remplacent l'utilisation des animaux dans un domaine où il est d'usage de les utiliser. Ces alternatives comprennent à la fois les remplacements complets (c'est-à-dire le remplacement des animaux par des systèmes in vitro (cultures cellulaires) ou in silico (comme des programmes informatiques) et les remplacements relatifs (c'est-à-dire le remplacement d'animaux dont la sensibilité est élevée, comme les vertébrés, par un animal dont le potentiel de perception de la douleur est, selon les données scientifiques actuelles, significativement moins élevé, comme chez certains invertébrés).

Les alternatives de réduction désignent toutes les stratégies dont le résultat se traduit soit par une diminution dans le nombre d’animaux utilisés tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions reliées à l'étude, soit par une utilisation qui maximalise les données obtenues sur chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal.

Les alternatives de raffinement (parfois appelé optimisation) désignent les modifications apportées à l'élevage ou aux procédures expérimentales afin de réduire la douleur et la détresse, ainsi que d'améliorer le bien-être des animaux utilisés en science pendant toute leur durée de vie tout en retirant un niveau élevé d’informations pertinentes du protocole.

2. Les méthodes alternatives (3R) disponibles, leur pertinence et leurs limites

LA SUBSTITUTION ou LE REMPLACEMENT

Il existe plusieurs approches alternatives à l’expérimentation animale : les méthodes in vitro et in silico (substitution absolue) et les méthodes ex vivo (substitution relative).La liste des techniques décrites ci-dessous ne prétend pas être exhaustive mais fait un état des lieux des principales approches dans le domaine de la substitution.

▸ Les méthodes dites in vitro et ex vivo sont essentiellement expérimentales :

Le terme ex vivo est attribué aux méthodes qui ont pour système d’essai des tissus d’animaux provenant d’abattoirs, ou des laboratoires (création de banques de tissus ou de sang) ou des tissus humains (« déchets » chirurgicaux par exemple).

Les méthodes in vitro couvrent :- les méthodes physico-chimiques, (ex : le « direct peptide reactivity assay (DPRA) » pour prédire un potentiel sensibilisant), la Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) pour remplacer les bioessais pour le contrôle de la qualité des protéines recombinantes),- les systèmes reconstitués, utilisant des récepteurs ou enzymes purifiés, (ex : les systèmes cytochromes P450 reconstitués),

- les méthodes utilisant des bactéries ou levures (ex : Test d’Ames),- les modèles cellulaires représentatifs de tissus,

- les tissus reconstitués (ex : peau et cornée humaines, épithélium alvéolaire humain),- les méthodes basées sur la réponse immune sur systèmes cellulaires ou sur les propriétés antigéniques d’un médicament.

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Ces méthodes présentent un intérêt particulier dans des études mécanistiques très simples (une question posée concise appelle une réponse simple) ou dans les études de « screening ».

Les méthodes alternatives basées sur des cultures cellulaires (lignées ou cellules isolées à partir d’organes ou de tissu – culture primaire d’un type cellulaire isolé – des co-cultures et des modèles de tissus reconstruits à partir de types cellulaires différents) sont les plus utilisés. Leur intérêt principal est d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines (même si les cellules animales le sont également du fait de leur approvisionnement facile), ce qui permet a priori une extrapolation plus pertinente des résultats à l’Homme. Les modèles tridimensionnels tels que les tissus et les modèles reconstruits, se rapprochent physiologiquement plus du modèle animal in vivo que les cultures cellulaires, du fait de la fidélité d’organisation et du respect des interactions cellulaires. Mais la réalisation des cultures primaires et des modèles reconstruits humains nécessite une certaine technicité qui les rend onéreux. Par ailleurs, les sources d’approvisionnement en tissus humains sont limitées et nécessitent l’accord des Comités d’éthique. Les résultats obtenus doivent être interprétés au regard des variabilités inter-individuelles6 mais l’intérêt est d’avoir accès à des cellules ou tissus cibles humains dont les réponses physiologiques peuvent être différentes de celles de l’animal. Enfin, il existe un grand nombre de types de cellules humaines, généralement bien caractérisées qui assurent une meilleure reproductibilité des résultats ; le coût sera aussi moindre mais la spécificité cellulaire et la dédifférenciation inévitable d’une lignée (les cellules ont perdu certaines caractéristiques de la cellule initiale) restreignent son champ d’application à l’évaluation de paramètres bien définis lors de la mise au point de la méthode. Ainsi, la pertinence du choix du modèle sera à déterminer en fonction de l’utilisation ultérieure.

Coupe histologique d’une peau humaine in vivo (A) et d’un modèle d’épiderme humain reconstruit (in vitro) (SkinEthic Laboratories) (B).

Coloration hematoxyline/eosine (microscope en contraste de phase grossissement 20X). Les organisations histologiques paraissent similaires ce qui pourrait indiquer en apparence un fonctionnement cellulaire fidèle des cellules de l’épiderme reconstruit par rapport à l’épiderme in situ.

Les modèles d’épidermes reconstruits sont utilisés dans de nombreux domaines comme l’évaluation de l’efficacité et de la sécurité des produits cosmétiques et le passage cutané des substances chimiques ou des principes actifs des médicaments à application topique.

6 Cette remarque s’applique de la même façon à l’expérimentation animale.

A : Peau humaine (in vivo) B : Epiderme humain reconstruit (in vitro)

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A

M

Rt


Hépatocytes humains en culture primaire.

Les hépatocytes ont été isolés à partir d'un fragment de pièce de lobectomie prélevée sur un malade présentant une métastase hépatique d'un carcinome colique primaire. Les cellules ont été mises en culture monocouche sur collagène, en présence d'un milieu de culture chimiquement défini permettant le maintien sur plusieurs semaines des marqueurs phénotypiques hépatiques. La photographie présentée (microscope à contraste de phase, grossissement x250) a été prise trois jours après mise en culture. Ce modèle cellulaire est utilisé par exemple, pour l’étude des interactions médicamenteuses ou pour l’étude du métabolisme hépatique des médicaments.

Culture cellulaire CaCo2 observée au MET.

A : Structure et implantation des microvillosités (M) constituant la bordure en brosse (réseau terminal constitué notamment de filaments d’actine (Rt) – Gx20000 ; B : Bordure en brosse (microvillosités : M) - Gx4000.Cette lignée cellulaire dérivée d’un carcinome de colon humain a la capacité de se différencier pour acquérir la morphologie (bordure en brosse du pôle apical) et la fonctionnalité de l’entérocyte (cellule jouant un rôle clé dans l’absorption intestinale). L’une des applications de ce modèle est l’étude de l’absorption intestinale in vitro des principes actifs des médicaments.

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M

B

mp

mpD

Les limites et axes de progrès des méthodes in vitroPar construction, les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique (humoral et tissulaire), et de la difficulté à maintenir in vitro leur différenciation même si de grands progrès ont été réalisés au cours des dernières années. Toutefois, ces outils sont particulièrement utiles comme tests quand un mécanisme général de toxicité a été bien relié à une cible cellulaire, lorsqu’ils sont associés à d’autres méthodes complémentaires, utilisés comme tests de crible. Ils sont très utilisés en amont pour étudier le mécanisme d’action des substances (ex : métabolisme, potentiel sensibilisant, inflammatoire, mécanismes de génotoxicité, etc.).Les progrès viennent actuellement du génie tissulaire qui permet de développer des cultures cellulaires 3D (3 Dimensions) dotées de niveaux de différenciation et d’une organisation tissulaire proche de la situation in vivo, se rapprochant d’organes reconstitués.

Les limites et axes de progrès des méthodes QSARsEn premier lieu, une limitation opérationnelle au développement des QSARs vient d’un déficit concernant des bases de données. Les bases de données en libre accès sont souvent insuffisamment renseignées, hétérogènes en termes de catégories de molécules et de variabilité expérimentale. En outre, les bases de données contiennent proportionnellement plus de molécules toxiques que peu toxiques, car c’est pour les premières que la réalisation de tests de toxicité est indispensable.

Enfin, un modèle QSAR ne peut fournir des prédictions fiables que pour des substances chimiques similaires à celles utilisées lors de sa dérivation.


▸ Les méthodes dites in silico sont des modèles biomathématiques qui utilisent des bases de données constituées issues de résultats expérimentaux obtenus de l’utilisation de modèles in vivo ou in vitro :

• Les modèles QSARs (Quantitative Structure-Activity Relationship). Parmi ces méthodes, on compte les modélisations quantitatives ou qualitatives, de la relation entre structure chimique et activité biologique. Cette approche de modélisation est connue sous le nom de modélisation QSAR. Il existe deux types de modèles QSARs, ceux qui sont purement statistiques (ils mettent en relation les valeurs pour des descripteurs structuraux avec l’effet toxicologique) et ceux fondés sur des règles toxicologiques à partir des connaissances des experts, qui visent la détection de sous-structures moléculaires connues comme étant responsables d’un effet toxique. Il a été estimé que l'utilisation de ces approches pour évaluer la toxicité pourrait réduire de 70% le recours à certains tests sur animaux. Les QSARs peuvent être utilisés pour guider le développement de nouvelles molécules, en prédisant le plus tôt possible leur potentiel toxique qui pourra être éliminé ou réduit grâce à des modifications structurelles ciblées. Un effort particulier est en cours, notamment au niveau de l'OCDE ou de l'US EPA, pour harmoniser et rendre disponibles les bases de données et les modèles associés.

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CERVEAU

COEUR

MOELLE

THYROIDE

SURRENALES

REINS

GRAISSES

MUSCLES

PEAU

AUTRES

OS

PANCREAS

RATE

ESTOMAC

TGI

ESTOMAC LUMEN

TGI LUMEN

FOIE

GONADES

POUMONS

SANG ARTERIELSANG

VEI

NEUX


• Les modèles PBPK (Physiologically Based Pharmaco-Kinetic).Les modèles PBPK sont des modèles toxicocinétiques à fondements physiologiques ayant pour but de décrire l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination des substances chimiques. Comme leur nom l’indique ils ont été initialement développés dans le domaine de la recherche médicale. Ils intègrent des paramètres physiologiques (flux sanguins, volumes d’organes) et des paramètres biochimiques (coefficients de partage entre le sang et les organes, paramètres du métabolisme). Les modèles PBPK peuvent intégrer les sorties de modèles QSARs, ainsi que les résultats expérimentaux observés au niveau de cellules. A court terme ils permettent d’économiser des essais, par exemple quand une équivalence voie à voie peut être établie (ex : inhalation vs ingestion).

• Le couplage QSARs-in vitro-PBPK a pour objectif de fournir une prédiction de qualité équivalente à l’expérimentation in vivo, tout en permettant une analyse fine des éléments intervenant dans la réponse toxique globale. Ce couplage est dépendant des avancées dans les autres domaines.

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Exemple de schéma de modèle PBPK représentant les compartiments physiologiques d'un corps humain et les échanges entre ces compartiments.


• La méthode de « synthèse d’éléments de preuve »Des réglementations permettent d’éviter des essais quand la somme des informations est globalement suffisante. Dans son article intitulé « les essais n’apparaissant pas comme nécessaires du point de vue scientifique » (point 1 de l’annexe XI) REACh stipule que « L'hypothèse/la conclusion qu'une substance possède ou non une propriété dangereuse particulière peut être confirmée valablement par des éléments de preuve provenant de plusieurs sources d'informations indépendantes, alors que les informations provenant de chacune de ces sources, considérées isolément, sont jugées insuffisantes pour permettre de formuler cette hypothèse/conclusion ».Ce mode de démonstration ne repose pas sur une méthodologie scientifique fixée mais sur une méthodologie intégrant les éléments de différentes sources (ex : QSARs, expérimentations in vitro et in vivo, observations cliniques ou épidémiologiques, PBPK). C’est au cas par cas que jugent les experts. Les méthodes en cours de développement sont liées à celles des « integrated testing strategies ou ITS», puisqu’elles permettent d’associer un niveau statistique d’erreur à un état donné des connaissances. A terme cette approche relève du développement de la « vision intégrative » évoquée ci-après.

• La chimie analytique :Depuis une vingtaine d’années, des efforts considérables ont été fournis pour remplacer les essais sur les animaux par des méthodes physico-chimiques dans le domaine des biotechnologies à usage thérapeutique dans le but de déterminer le titre (ou la quantité de principe actif) d’une préparation. C’est par exemple le cas de nombreuses hormones qui sont produites désormais par synthèse chimique ou par technique de biologie moléculaire (protéines recombinantes synthétisées à partir d’ADN complémentaire). Ces techniques présentent plusieurs avantages par rapport aux méthodes de production anciennes généralement préparées à partir de cadavres humains, elles permettent de produire à grande échelle des protéines de synthèse ou recombinantes de plus grande qualité avec un niveau de sécurité bien supérieur qu’auparavant. Ainsi la technique de Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) couplée à un système de détection est désormais utilisée pour le Contrôle de la Qualité des lots de production de produits biotechnologiques et permet de déterminer le titre de la préparation sans avoir recours à une évaluation de la quantité de principe actif par des essais biologiques. On peut citer quelques exemples de remplacement définitif des bioessais sur animaux par la détermination du titre selon une méthode analytique. Ces méthodes ont fait l’objet d’études collaboratives préalables à leur utilisation visant à établir une équivalence entre les Unités Internationales (U.I.) déterminées selon le bioessai et le dosage analytique. Exemple : les monographies de la Pharmacopée européenne relatives aux produits biologiques suivants : la somatotropine (1988), l’insuline (1990), la desmopressine (1990), la calcitonine (2000), l’oxytocine (2000), la tétracostactide (2007).

D’autres méthodes physico-chimiques comme l’électrophorèse capillaire, couplées à des essais sur cellules offrent également une perspective intéressante de remplacement des essais sur animaux pour les glycoprotéines recombinantes comme l’érythropoiétine (working group « glycan mapping » EMEA/EDQM).

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• Les méthodes de regroupement de substances (Read-Across) : Des réglementations, en particulier REACh, acceptent une méthode dite « Regroupement de substances et méthode des références croisées » qui permet de renoncer à des expérimentations nouvelles lorsque les substances ont des éléments « de proximité » suffisants avec des substances connues. Le règlement REACh cite ainsi : « un groupe fonctionnel commun ; les précurseurs communs et/ou la probabilité de produits de dégradation communs résultant des processus physiques et biologiques, donnant naissance à des substances structurellement similaires ; un profil constant de la variation de la puissance des propriétés dans l'ensemble de la catégorie ».Le fondement scientifique est moins bien formalisé à ce jour que celui d’autres méthodes et cette approche ouvre la voie à des discussions. Elle est néanmoins pragmatique et appliquée. Elle mérite certainement un fondement scientifique mieux formalisé.

▸ Les modèles prospectifs de substitution :

• Les cellules souchesLes développements récents sur les cellules souches humaines ouvrent un grand nombre de voies nouvelles dans l’expérimentation in vitro et notamment sur des cellules d’origine humaine. Il existe plusieurs types de cellules souches : cellules souches embryonnaires pluripotentes (Embryonic Stem ou ES, dont le prélèvement, la conservation et l’utilisation sont autorisés dans notre pays depuis Septembre 2004), les progéniteurs adultes et les cellules souches issues de la reprogrammation de cellules somatiques adultes (iPS, induced Pluripotent Stem). Ces cellules ont la capacité de se multiplier de nombreuses fois à condition de les soumettre à des traitements expérimentaux appropriés (facteurs de croissance, cytokines, matrice extracellulaire, etc.) mimant l’ontogenèse du tissu concerné (tissu cardiaque, tissu nerveux, tissu hépatique, etc.). On sait diriger à l’heure actuelle ces divers types de cellules souches in vitro vers une spécification tissulaire particulière et produire ainsi un grand nombre de cellules différentes ayant des propriétés évocatrices des cardiomyocytes, des cellules neurales, des cellules hépatocytaires, etc. Bien que le niveau de différenciation de ces cellules soit encore généralement de type fœtal (et non adulte), il ne fait pas de doute que la maturation de ces cellules et leur différenciation finale seront maîtrisées d’ici quelques années. On pourra ainsi disposer de réserves théoriquement inépuisables de cellules de divers tissus et pourquoi pas dans un avenir plus lointain de cellules de tous les tissus qui constituent l’organisme. Etant issues de lignées spécifiques de cellules ES ou iPS (c’est à dire provenant d’un seul embryon ou d’un seul individu) ces cellules différenciées constitueront des modèles cellulaires phénotypiquement stables permettant des expérimentations reproductibles. La variabilité interindividuelle, qui demeure un problème, pourra être abordée par des études portant sur des cellules issues de cellules ES ou iPS provenant d’embryons ou d’individus différents. Un autre avantage de ces cellules est qu’il sera vraisemblablement possible de réduire (ou supprimer) l’expression de gènes spécifiques par exemple par shRNA, ou au contraire de surexprimer des gènes spécifiques, créant ainsi un équivalent “humain” des animaux transgéniques dans lesquels un (ou plusieurs) gène est invalidé (knock-out) ou surexprimé. Ces possibilités ouvrent d’autres opportunités d’études expérimentales sur des cellules présentant des altérations génétiques conduisant à des maladies spécifiquement humaines. Ce type d’étude permettra d’envisager des approches expérimentales visant à améliorer le diagnostic de la maladie et surtout son traitement thérapeutique. Cependant l’utilisation de ces cellules pose d’autres questions éthiques et un courant d’opinion fort se fait entendre dans plusieurs pays de l’Union européenne pour

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s’opposer à leur utilisation en tant que modèles de substitution à l’expérimentation animale.

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Les limites et axes de progrès communs à tous les tests alternatifs in vitro utilisés Malgré leur potentiel et leurs premières applications, les méthodes in vitro ne peuvent pas complètement remplacer l’expérimentation animale en l’absence d’analyse de paramètres biologiques ou à cause de leur isolement du contexte physiologique (humoral et cellulaire), de leur dédifférenciation rapide (perte de la compétence métabolique) dans certaines conditions et de leur durée de survie souvent limitée à quelques jours mais qui, avec les techniques de culture modernes, peut aller jusqu’à quelques semaines sans dédifférenciation. Par ailleurs, la validation d’une méthode alternative utilisée dans un cadre réglementaire, nécessite de nombreux critères expliquant la difficulté de la mise au point de nouvelles techniques. En effet, une méthode alternative doit être pertinente, c’est-à-dire que le critère observé doit être spécifique de l’effet toxique ou pharmacologique à mettre en évidence. Elle doit être assez robuste pour que toutes les molécules présentant de tels effets soient détectées. Ceci a pour conséquence directe que ces méthodes sont généralement considérées comme trop sensibles car le nombre de faux positifs est non négligeable. Ces méthodes doivent montrer une très bonne reproductibilité intra- et inter-laboratoire ; le modèle choisi doit donc être peu variable ou avec une variabilité n’influençant que faiblement le résultat. Ceci a de nombreuses conséquences en particulier en termes de normalisation des milieux d’origine.


• Les cultures organotypiquesLes cultures organotypiques sont destinées à l’étude de la différenciation, de la multiplication et de la croissance de cellules ou d’organes explantés hors de leur milieu naturel et mis en culture. Les modèles les plus classiques sont les fragments de tissus, les fragments d’organes ou ébauches d’organes. Les progrès dans le domaine des biotechnologies ont permis l’émergence de nouveaux modèles permettant de reconstituer un assemblage cellulaire plus proche d’un tissu ou d’un organe qu’une culture cellulaire classique monotypique (un seul type cellulaire) de conserver les interactions et la signalisation des cellules entre elles. Les modèles les plus aboutis sont les modèles d’épiderme reconstruits à partir de cellules d’épiderme humain (les kératinocytes) maintenant largement utilisés en pharmaco-toxicologie (cf. paragraphe les outils in vitro). Les progrès dans le domaine de l’utilisation des cellules souches offrent de nouvelles perspectives de développement de nouveaux modèles tridimensionnels élargis à tous les organes humains qui seront des outils de choix en alternative à l’utilisation de l’animal.

• Les organes bio-artificielsEn réponse à la simplicité du système statique en boîte de Pétri, qui ne permet pas de reproduire certains phénomènes in vivo, une nouvelle catégorie de tests in vitro est apparue, les systèmes en environnement dynamique. Plusieurs dénominations existent, mais la plus courante est le terme « organes bio-artificiels ». Ces systèmes proposent la mise en culture des cellules au sein d’un système de perfusion (environnement dynamique créé par un fluide circulant). Ils permettent une réorganisation cellulaire proche des conditions d’exposition de l’organe in vivo (par exemple, une culture à 3 dimensions) et un couplage in vitro entre différents organes. Ils possèdent des niveaux d’activité cellulaire supérieurs à ceux mesurés en boîte de culture. Dans le domaine de l’évaluation du risque toxicologique, la mise au point de ces systèmes et du traitement mathématique des données générées est en cours de développement.

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LA RÉDUCTION

• L’outil statistique. Le développement et l’application de méthodes statistiques pertinentes (statistiques non paramétriques) donne des outils puissants pour réduire la taille des lots expérimentaux tout en retirant un nombre important d’informations à partir d’un seul protocole. A ce titre la construction du protocole et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. A ceci s’ajoutent la création et l’exploitation de bases de données permettant d’éviter la répétition inutile de certaines études. Ces démarches sont fortement encouragées dans la Directive 86/609 et dans la réglementation française qui en a découlé.

• L’utilisation d’espèces « moins sensibles ». Cette démarche se fonde sur l’idée qu’il existe une hiérarchie des sensibilités à la contrainte entre espèces. Au-delà de la vision émotionnelle du public qui accorde plus de sensibilité au chien, animal de compagnie qu’au porc, animal-aliment (voire impur), il n’en demeure pas moins vrai qu’il existe un parallélisme relatif entre échelle phylogénétique et sensibilité à la contrainte, malgré certaines exceptions possibles (cas des céphalopodes). La mise en place du réseau EFOR dans le cadre des plateformes IBiSA est une initiative importante dans ce domaine. Ce réseau visant à informer sur l’existence, les potentialités de nouvelles espèces modèles et de faciliter l’accès aux centres disposant des connaissances sur ces espèces, constitue une intéressante initiative de la communauté scientifique à la limite entre le remplacement et la réduction pour faire émerger de nouveaux modèles en accord avec la règle des 3R.

• Le contrôle de la variabilité de réponse. Elle se fonde sur le contrôle et la reproductibilité des éléments environnementaux pouvant induire une variation de réponse. C’est le cas du contrôle des paramètres d’environnement mais également du statut sanitaire et génétique des animaux : des efforts considérables dans ce domaine dans la recherche industrielle et plus récemment en recherche publique ont conduit à la création et la mise en place d’établissements d’expérimentation animale de qualité garantissant la qualité génétique et sanitaire des modèles utilisés. Là aussi le réseau IBiSA ROCAD de normalisation de la qualité et de facilitation de l’échange des modèles murins génétiquement modifiés intègre le principe des 3R.

La notion de stratégie expérimentale - Les expériences peuvent être faites sur une base de crible biologique (des composés sont testés au préalable et leurs effets biologiques évalués a posteriori) ou bien sur une base d’expériences basées sur des hypothèses (les composés sont d’abord testés dans des systèmes in vitro avant d’être testés sur l’animal) - permet de réduire de manière très efficace le nombre d’animaux d’expérimentation, avec l’inconvénient que les modèles in vitro ne reflètent pas forcément l’activité biologique in vivo.

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Etapes d’une expérience de génomique jusqu’à l’identification d’une signature moléculaire(Ensemble de gènes dont la variation est spécifique d’une condition)


Certaines techniques permettent aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Dans ce cas, elles répondent aussi généralement au critère d’optimisation.

• Les « Omics » sont des technologies d’analyse à haut débit visant à explorer au niveau moléculaire les différentes étapes de la voie de biosynthèse des protéines, des gènes aux protéines (génomique-gène, transcriptomique-ARNm, protéomique-protéines) mais aussi des enzymes aux métabolites (métabolomique). Lorsque ces outils sont appliqués à l’échelle cellulaire, on parle de cellulomique. Ces technologies sont de plus en plus utilisées en recherche biomédicale en amont de l’expérimentation animale voire en aval à des fins mécanistiques, sachant que dans tous les cas, du matériel biologique (animal le plus souvent) est utilisé comme source d’information.Dans une optique de réduction, l’application des technologies « Omics » aux fluides (ex. protéomique du plasma ou de l’urine) ou à des biopsies humaines (ex. transcriptomique d’une biopsie hépatique) permettront de diminuer le nombre d’animaux utilisés dans une étude. Dans une optique d’optimisation (raffinement), ceci permettra de rendre l’étude plus informative en comparant l’expression d’un génome entier par exemple à différents temps de prélèvements ou états de l’animal (avant/après traitement ou « knock-out » d’un gène) en s’affranchissant des différences interindividuelles (si le matériel biologique initial provient de pools d’animaux). Enfin, à l’issue des expériences, la création de bases de données publiques (ou payantes) permet une optimisation de l’utilisation de ces résultats coûteux.

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Les limites et axes de progrès des technologies « Omics » La toxicogénomique fait l’objet d’un travail considérable. Cette discipline récente vise à relier la toxicologie et les avancées concernant la connaissance du génome. Il s’agit de mettre en relation des variations dans l’expression des gènes avec l’exposition à différentes concentrations de composés chimiques. A l’heure actuelle, les avancées ont surtout eu lieu dans le domaine des signatures génomiques, à partir des puces à ADN.

L’utilisation étendue voire systématique de ces technologies nécessite tout d’abord :

- D’améliorer leur variabilité expérimentale qui reste élevée,

- Leur analyse statistique reste encore à améliorer,

- La mise en place de bases de données permettant de mutualiser les résultats obtenus et une analyse de ces données plus fiables (une partie de l’analyse s’effectue par « clustering » c'est-à-dire le regroupement de signatures identiques. Afin d’être informatif, le système doit contenir le plus possible de molécules de référence).

Si l’espoir suscité par la toxicogénomique est justifié, il reste encore du chemin à parcourir avant de voir ces techniques participer à l’évaluation des risques environnementaux.


• Les modèles animaux : Modèles pathologiques génétiquement modifiés (transgéniques) : Un animal transgénique est un animal dont le patrimoine génétique (un gène bien précis) a été modifié afin d’étudier le rôle in vivo de la protéine codée par le gène modifié ou bien quand le gène est connu pour être responsable d’une maladie, de reproduire les symptômes d’une maladie humaine pour pouvoir mieux étudier la maladie et in fine la traiter. On parle de souris « knock-out » lorsqu’un gène est invalidé ou altéré et de souris « knock-in » lorsqu’un nouveau gène est ajouté au génome. Quatre-vingt quinze pour cent des animaux transgéniques utilisés à des fins expérimentales sont des souris « knock-out » et à ce jour 10 000 gènes ont été invalidés chez la souris. D’ailleurs Mario R. Capecchi, Martin J. Evans et Olivier Smithies on reçu le prix Nobel de Médecine et de physiologie pour leurs travaux sur les cellules souches et la recombinaison homologue. Les animaux transgéniques permettent d’étudier de manière précise certains mécanismes des maladies humaines et de réduire le nombre d’animaux non OGM qui auraient été utilisés le cas échéant.

• Les stratégies de tests intégrés (ITS) :Le développement de systèmes intégrés complexes est un tournant important dans le développement des méthodes alternatives.L’une des stratégies proposées aujourd’hui pour réduire le nombre d’animaux utilisés est d’effectuer l’évaluation du risque toxique sur les résultats d’une série de tests, dans un ordre croissant de complexité, en commençant par des tests substitutifs. Les stratégies de tests intégrés (ou ITS) font l'objet de développements à l’heure actuelle pour éviter un recours systématique à l’expérimentation animale. Une stratégie de tests intégrés correspond à un enchainement de tests avec une prise de décision du type « arrêt » ou « poursuite » du processus à chaque étape. Cette prise de décision repose sur le résultat du test (positif ou négatif). Il est nécessaire de

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déterminer la stratégie la plus efficace possible, c’est-à-dire capable de détecter une réponse de façon précoce en générant un nombre raisonnable d’erreurs statistiques.

Exemple d’approche intégrative

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Les limites et axes de progrès des ITSLes limites actuelles des ITS résident dans leur caractère général. En effet, les stratégies sont proposées indépendamment des substances testées. En particulier, elles supposent que les taux d’erreurs (faux positifs et faux négatifs) sont entièrement inhérents aux tests. Ceci reste une approximation dans la mesure où les taux d’erreurs obtenus pour des substances très peu toxiques versus des substances très toxiques sont extrêmement faibles en comparaison de ceux obtenus pour des substances à toxicité moyenne. Les travaux futurs devront proposer des méthodes de sélection de stratégies de tests à mettre en place en fonction des informations disponibles quant à la toxicité des molécules, comme, par exemple, des résultats de modèles QSARs.


Exemple d’approche intégrative de type « arrêt » ou « poursuite » pour l’évaluation du potentiel corrosif/irritant d’une substance chimique. Cette ligne directrice de l’OCDE recommande des stratégies séquentielles d’essais qui incluent la mise en œuvre d’essais in vitro ou ex vivo validés et admis pour la corrosion/irritation.

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▸ Une vision intégrée/intégrative :

Le Comité sur l'Evaluation de la Toxicité des Polluants Environnementaux du « National Research Council » américain, a réalisé, à la demande de l'Agence américaine de Protection de l'Environnement (US EPA), un rapport sur sa vision du futur de la toxicologie (cf. figure ci-dessous). Il propose une approche intégrative dans laquelle les perturbations biologiquement significatives de mécanismes clefs d'une toxicité seront évaluées à l'aide du couplage de nouvelles méthodes de modélisation mathématique et un large ensemble de tests in vitro basés sur la biologie humaine (et non animale).

La Figure ci-dessous illustre les principales composantes de la vision du Comité américain : Caractérisation des propriétés chimiques, tests de toxicité, et modélisation des relations dose-réponse et des extrapolations requises. Ces composantes sont liées mais elles impliquent des capacités scientifiques et techniques spécifiques. Certaines évaluations pourront procéder séquentiellement dans l'ordre indiqué ci-dessus — mais une telle séquence ne sera pas forcément nécessaire. Un élément crucial de cette nouvelle vision est la prise en considération du contexte du risque (contexte de prise de décision impliquant la collecte d'informations sur la toxicité) à chaque étape et la possibilité de sortir à tout moment du circuit si une quantité suffisante d'informations a été collectée pour pouvoir prendre une décision. Cette vision met aussi l’accent sur les connaissances mécanistiques de la toxicité et sur l’identification nécessaire des grandes voies de toxicité. L’approche met aussi l'accent sur la production et l'utilisation de données sur les expositions humaines et leurs effets dans la population quand cela est possible, afin de mieux interpréter les résultats des tests. Elle encourage la collecte de telles données par le bio-monitorage, la surveillance, et des études épidémiologiques pour les produits chimiques les plus importants. Finalement, cette vision anticipe le besoin d'une procédure formelle pour l'adoption ou l'abandon de méthodes de tests, au fur et à mesure des avancées scientifiques, ceci afin de garantir une évaluation en temps voulu, efficace et économique de tous les produits chimiques.

Extrait de: “Toxicity testing in the 21st century a vision and a strategy”National Research Council of The National Academies

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L’OPTIMISATION ou LE RAFFINEMENT

▸ La diminution de la douleur

Les stratégies d’optimisation comportent au premier chef toute les démarches visant à contrôler, réduire voire supprimer la douleur et la souffrance chez l’animal. Il est important de souligner la difficulté qu’il y a à identifier la douleur et surtout la souffrance chez l’animal, cela a d’ailleurs fait l’objet d’une commande des ministres chargés de la recherche et de l’agriculture à l’INRA. Il n’en demeure pas moins que l’existence d’une nociception conduisant à une cascade de réponses physiologiques et comportementales chez l’animal oblige à mettre en œuvre des moyens de contrôle de la douleur réelle ou présumée. La mise en œuvre systématique de telles méthodes pour réduire la douleur potentielle chez l’animal est aujourd’hui réglementée et systématique dans les établissements d’expérimentation animale en France et contrôlée par l’inspection vétérinaire. Néanmoins dans certains cas (modèles de pathologies inflammatoires, études sur la douleur), la mise en œuvre de telles méthodes peut être contradictoire avec le projet expérimental.

▸ Les nouvelles approches en expérimentation animale

Les nouvelles approches en expérimentation animale permettent à la fois de réduire la souffrance des animaux et le nombre d’animaux utilisés en combinant différentes méthodes d’exploration non invasives développées en médecine humaine et qui peuvent être appliquées à l’exploration chez l’animal. Certaines de ces méthodes non invasives utilisées depuis longtemps peuvent être intégrées dans la démarche d’optimisation : c’est le cas des méthodes d’examen clinique de l’espèce et de la pathologie étudiée, de l’analyse comportementale de l’électrophysiologie et de la télémétrie. D’autres méthodes plus récentes contribuent fortement à l’optimisation des protocoles.

• L’imagerie du petit animal in vivo a ouvert de nouveaux champs d’investigation in vivo contribuant à l’optimisation des études et à réduire fortement le nombre d’animaux utilisés. Les techniques d’imagerie citées ci-dessous permettent de visualiser la structure d’un organe, son fonctionnement, la présence de molécules spécifiques (récepteurs membranaires par exemple) ou certaines voies biochimiques sans avoir recours à des techniques invasives (une simple anesthésie de l’animal pour l’empêcher de bouger suffit).

Les approches exploratoires couvrent principalement :

- L’imagerie par résonance magnétique (IRM), - La tomographie par émission de positrons (TEP) basée sur l’utilisation de divers

marqueurs isotopes lourds tels que 18F, 13N, 15O,- La scintigraphie ou SPECT, basée sur l’utilisation de radio-nucléotides utilisés

comme traceurs,- L’imagerie anatomique par rayons X pour visualiser les structures osseuses et

parfois certains tissus mous,- Les ultrasons pour visualiser l’anatomie des tissus mous,- La bioluminescence basée sur l’activité d’une enzyme, la luciférine, utilisée sur les

modèles de souris transgéniques.

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• La télémétrie : utilisée pour enregistrer en continu des paramètres physiologiques. Cette technique non invasive s’avère particulièrement efficace notamment dans les études chroniques et sub-chroniques.

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L’imagerie en bioluminescence est basée sur la détection de la lumière émise lors de la catalyse par l’enzyme luciférase de son substrat luciférine. Cette technique offre un procédé de choix pour l’évaluation de nouvelles molécules à visée thérapeutique anticancéreuse. Elle est très complémentaire d’une autre méthode optique, la Fluorescence, qui permet de suivre en temps réel la distribution de molécules thérapeutiques. Bioluminescence et Fluorescence fonctionnent sur le même instrument.Plateforme Imagerie optique du petit animal, IAB, INSERM/UJF U823.

a b

c d

a b

c d

Imagerie par Résonnance Magnétique Nucléaire (IRM)

Sections horizontales (a, b) et coronales (c, d) acquises en IRM de cerveaux du primate microcèbe murin (photo). La méthode d'IRM permet de mettre en évidence, in-vivo, une atrophie cérébrale importante (b, d), entrainant une augmentation de liquide céphalorachidien autour du cerveau (flèches), chez des animaux souffrants de pathologies cérébrales liées au vieillissement.

Marc DHENAIN – CRC.


II. LA PLACE DES MÉTHODES ALTERNATIVES DANS LES CADRES LÉGISLATIFS ET RÉGLEMENTAIRES

Les directives et règlements décrits ci-dessous prennent en compte le besoin de réduire l’utilisation de l’animal en prônant l’utilisation de méthodes alternatives in vitro, in silico. Cependant, le manque de méthodes alternatives validées au sens réglementaire du terme n’est pas sans conséquence sur le fonctionnement des réglementations destinées à assurer la sécurité de l’Homme, de l’animal et la protection de l’environnement.

1. La Directive du Conseil 86/609/CEE du 24 novembre 1986 sur la protection des animaux7

L’expérimentation animale est encadrée en Europe par une Convention européenne de 1986 (STE 123) et par la Directive du Conseil et de la Commission du Parlement européen N°86/609.

Cette Directive, basée sur le concept des « 3R » (remplacer, réduire et raffiner) réglemente 4 grands paramètres de l’expérimentation animale sur les vertébrés :- le type d’expériences réalisées,- les expérimentateurs,- les établissements d’élevage et d’expérimentation,- les animaux utilisés, leurs conditions d’hébergement et de soins.

L’article 7 de la Directive reprend le principe des « 3R » :Le paragraphe 2 précise qu’« il ne sera pas effectué d’expérience s’il existe une possibilité raisonnable et pratique d’avoir recours à une méthode scientifiquement acceptable et n’impliquant pas l’utilisation d’un animal pour obtenir le résultat recherché » (Remplacer).Le paragraphe 3 indique que « le choix des expériences sera guidé par le souci de sélectionner celles qui utilisent le nombre minimal d’animaux et les animaux les moins sensibles du point de vue neurophysiologique, qui causent le moins de douleur, de souffrance, d’angoisse et de dommages durables et pour lesquelles il y a le plus de chances d’obtenir des résultats satisfaisants » (Réduire et Raffiner).L’article 23, paragraphe 1 souligne la responsabilité de la Commission et de ses Etats membres dans l’encouragement des recherches de méthodes alternatives.

La transposition de cette Directive en droit français a donné lieu à plusieurs décrets et arrêtés permettant de réglementer les pratiques en expérimentation animale, et où l'on retrouve ce principe des "3R" : le décret N°87-848 du 18 octobre 1987, modifié par le décret N°2001-464 du 29 mai 2001, ultérieurement codifiés dans les articles R214-87 à R214-122 du Code rural, les arrêtés du 19 avril 1988, le décret 2001-466 du 6 juin 2001 portant publication de la Convention européenne sur la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques.

Il est à noter aussi une référence au principe des "3R" dans la partie législative du Code rural, article L214-3, qui établit qu'il est interdit d'exercer des mauvais traitements aux animaux tenus en captivité et que des décrets en Conseil d'Etat déterminent les mesures propres à assurer la protection de ces animaux, y compris pour les animaux de laboratoire, sachant que les expériences biologiques médicales et scientifiques doivent être limitées aux cas de stricte nécessité. Le non-respect d'une prescription de cet article conduit aux sanctions décrites dans les articles L215-6 et 7.La Directive 86/609 a été remplacée par la Directive 2010/63/UE en date du 22 septembre 2010. Cette Directive est en cours de transcription en droit français, et elle entrera en vigueur le 1er janvier 2013, afin de prendre en compte les dernières avancées scientifiques

7 La Directive 86/609 a été remplacée par la Directive 2010/63/UE en date du 22 septembre 2010. Cette directive entrera en vigueur le 1er janvier 2013

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et les nouvelles connaissances en matière de bien-être animal. L’évolution porte sur 3 points principaux :

• le renforcement de l’éthique pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux,

• la définition des animaux concernée est étendue notamment aux formes larvaires autonomes, aux formes fœtales de mammifères à partir du dernier tiers de leur développement normal et aux céphalopodes vivants,

• Le renforcement de la dynamique du développement des méthodes alternatives avec un point d’entrée pour chaque pays et la création d’un laboratoire européen de référence basé au centre commun de recherches à Ispra.

2. Cas des produits chimiques : La réglementation européenne REACh 1907/2006

Le règlement REACh, vise à améliorer la protection de la santé humaine (travailleurs et consommateurs) et de l’environnement en imposant aux industriels de démontrer la maîtrise des risques liés aux usages de leurs substances. Ce règlement soumet à enregistrement auprès de l’ECHA, l’Agence Européenne des Produits Chimiques, les substances fabriquées ou importées à une tonne ou plus par an. Il prévoit également que certaines substances « extrêmement préoccupantes » soient soumises à autorisation, l’objectif étant à terme de remplacer ces substances.

Un enregistrement nécessite en particulier la soumission d’un dossier technique contenant des informations physico-chimiques, toxicologiques et éco-toxicologiques.

Le règlement propose, sous certaines conditions, des règles générales d’adaptation du régime d’essais standards dont :- l’utilisation de données existantes non issues des essais standards proposés par le

règlement,- l’utilisation d’éléments de preuve,- l’utilisation de résultats obtenus à l’aide des modèles de la relation structure-activité

(QSAR),- l’utilisation de données issues de méthodes in vitro,- le regroupement de substances et méthodes de référence croisées (Read-Across).

Ces utilisations doivent être assorties d’une description suffisante et fiable permettant de juger leur recevabilité.

Afin d’éviter la répétition d’essais inutiles et limiter ainsi l‘utilisation d’animaux, REACh impose aux fabricants et importateurs de partager les données sur les propriétés de leurs substances au sein de Forums d’Echange d’Informations sur les Substances (SIEF).

Enfin, pour les substances à plus de 100 t/an, si des données manquent, les essais correspondants ne doivent pas être effectués mais leur réalisation doit être proposée à l’ECHA qui statuera. En tout état de cause, la réalisation des essais ne sera décidée que si aucune autre solution garantissant une fiabilité et une qualité suffisantes des données n’est possible.

Même si le nombre d’essais qui seront effectivement à réaliser ne peut ainsi aujourd’hui être évalué, le règlement impliquera pour son respect l’utilisation d’animaux.

Aucun essai sur des êtres humains n’est réalisé aux fins de ce règlement, les données cliniques et épidémiologiques existantes peuvent être utilisées.

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3. Le règlement Européen 1272/2008 Relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances et des mélanges

Les fabricants, importateurs et utilisateurs en aval d’une substance identifient les informations pertinentes disponibles afin de déterminer si cette substance comporte un danger physique, un danger pour la santé ou un danger pour l’environnement. Les éléments suivants doivent en particulier être recueillis (Article 6) :- les données obtenues conformément au règlement REACh,- les données basées sur des principes scientifiques fondés reconnus au niveau

international,- les données basées sur des méthodes validées selon les procédures internationales,- les données épidémiologiques humaines, telles que les données professionnelles,

issues d’accidents ou de l’expérience acquise en la matière.

4. Cas des produits cosmétiques :La Directive Cosmétique 76/768/CEE et son 7ème

amendement (2003/15/EC du 27 février 2003)

Le 7ème amendement de cette Directive (2003/15/CEE)8 interdit dans la Communauté Européenne l’utilisation de l’animal pour évaluer la sécurité des produits cosmétiques. Cette interdiction est en vigueur pour les produits finis depuis septembre 2004 et depuis mars 2009 pour les ingrédients. La 7ème modification interdit également la commercialisation des produits cosmétiques dont la formulation finale ou les ingrédients ont été testés sur les animaux après cette date. Pour cette interdiction de commercialisation, un report en 2013 est accordé dans le cas des études de toxicité à applications répétées, pour lesquelles il n’existe pas de méthode validée disponible à ce jour (la toxicité par applications répétées, la repro-toxicité, la toxicocinétique, la sensibilisation). Selon cette même Directive, pour évaluer la sécurité d’un produit cosmétique, les scientifiques doivent évaluer le profil toxicologique général des ingrédients, leur structure chimique et le niveau d’exposition pour les consommateurs. Depuis mars 2009 pour les ingrédients, les études de toxicité aiguë, d’irritation/corrosion de la peau, d’irritation des yeux, de la pénétration percutanée, de photo-toxicité et de mutagénicité/génotoxicité doivent être conduites au travers des méthodes alternatives. Dans le cas des études de toxicité à applications répétées, l’interdiction devrait entrer en vigueur en 2013.

A ce jour, les industriels disposent de méthodes alternatives dans les domaines de l’évaluation de la corrosion cutanée (OCDE TG 430, 431), la photo-toxicité (OCDE TG 432), l’absorption cutanée (OCDE 428) et bientôt de l’irritation cutanée, trois méthodes validées par l’ECVAM (dont 2 françaises) étant en cours d’étude au niveau de l’organisation de coopération et de développement économiques (OCDE). La collaboration entre les industriels et le COLIPA a permis de développer deux méthodes alternatives pour les tests d’irritation oculaire, en cours de validation par l’ECVAM.

8 Le règlement 1223/2009 remplace la Directive Cosmétique. Ce règlement sera applicable dans tous les Etats membres de l’UE au 11 juillet 2013. Pas de modification sur l’interdiction d’expérimenter sur les animaux.

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5. Cas des produits de santé :

• Les médicaments à usage humain

Le secteur pharmaceutique est largement tributaire des essais chez les animaux pour évaluer l’efficacité des médicaments et leur toxicité. L’expérimentation animale est présente dans la phase de recherche et dans la phase de développement préclinique ; cependant, les données obtenues chez l’animal peuvent être utilisées jusqu’à la phase de pharmacovigilance, c’est à dire au sein des plans de gestion de risques des médicaments demandés aux laboratoires depuis 2004. Les études requises préalablement à une première administration chez l’Homme sont de trois types : les études de pharmacologie qui établissent la validité du concept thérapeutique et son applicabilité chez l’Homme, celles de toxicologie qui évaluent la sécurité d’utilisation du produit : ces études permettent d’établir le rapport bénéfice/risque et de prendre la décision de l’administration à l’Homme. Enfin les études de pharmacocinétique et de métabolisme déterminent le devenir du médicament dans l’organisme des animaux (transposable à l’Homme) et aident à choisir la première dose à administrer chez l’Homme. Les approches in vitro sont également largement utilisées lors des études pré-cliniques (test de mutagenèse, identification métabolique et prédiction d’interactions médicamenteuses à partir de modèles hépatiques humains).

Les études chez l’animal ont considérablement évolué ces dernières années: le passage aux Bonnes Pratiques de laboratoire (BPL) et l’harmonisation internationale des programmes de toxicologie (Programme ICH) ont permis d’éviter de reproduire des essais ou de conduire des essais inutiles, tout en assurant une meilleure validation et une meilleure reconnaissance internationale.

A noter la spécificité du médicament immunologique (vaccin) réglementé par la Directive européenne 2204/27/EC nécessitant une double libération de chaque lot par le fabricant et par l’autorité nationale de contrôle avant la mise sur le marché. Par conséquent, les contrôles de ces médicaments (qui incluent de nombreux essais de sécurité et d’efficacité in vivo) sont particulièrement consommateurs d’animaux.

• Les médicaments vétérinaires

Les médicaments vétérinaires sont réglementés par le Code de la santé publique qui transpose la Directive 2001/82 modifiée. Le dossier de demande d’AMM d’un médicament vétérinaire contient les données expérimentales et analytiques prouvant la qualité, la sécurité et l’efficacité du médicament proposé. La partie " sécurité " se décompose en deux sous-parties : " innocuité ", rassemblant les données toxicologiques et " résidus ", présentant la pharmacocinétique des résidus et leurs méthodes d’analyse. La partie " efficacité " expose les essais précliniques (pharmacodynamie, pharmacocinétique, tolérance, résistance) réalisés en laboratoire, et les essais cliniques, réalisés le cas échéant en station expérimentale, puis sur le terrain. Les expérimentations doivent être conduites en conformité avec des codes de bonnes pratiques : BPL et BPC. Ces expérimentations doivent respecter les règles de protection animale décrites dans le Code rural. A noter que le projet de Directive sur l’expérimentation animale (86/609) va modifier de manière conséquente l’approche de l’expérimentation et de son contrôle.

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• Les dispositifs médicaux (DM) et dispositifs médicaux de diagnostic in vitro (DMDIV)

La mise sur le marché des dispositifs médicaux (DM) est réalisée sous la responsabilité de leur fabricant après que soit apposé le marquage CE, témoin de la conformité aux exigences essentielles de santé et de sécurité fixées par les directives européennes.Le marquage CE s’appuie sur les normes harmonisées européennes qui sont détaillées dans l’annexe I de la Directive 93/42/CEE pour les DM et dans la Directive 98/79/CE pour les dispositifs médicaux de diagnostic in vitro (DMDIV). Les DM sont répartis en 4 classes en fonction du niveau de risque qu’ils présentent. Selon le type de DM, les exigences réglementaires sont plus ou moins contraignantes et les différents essais nécessaires ont par conséquent certaines spécificités.La sécurité des DM et DMDIV est encadrée par des normes générales et spécifiques européennes (CEN) et internationales (ISO), relayées au niveau national par l’AFNOR, leur évaluation biologique ayant recours à l’expérimentation animale figure dans la norme ISO 10993 qui comporte 18 parties, dont la partie 2 qui décrit les exigences relatives à la protection des animaux et la partie 5 qui est basée sur l’utilisation de cultures cellulaires pour évaluer la cytotoxicité de nombreux DM.

6. Les autres réglementations

• Les produits phytopharmaceutiques

Les produits phytopharmaceutiques sont utilisés pour protéger les espèces végétales cultivées (ou les produits végétaux) contre les organismes nuisibles ou pour exercer une action sur les processus vitaux des végétaux. On distingue essentiellement trois familles : les herbicides, les fongicides et les insecticides.

L’évaluation des produits phytopharmaceutiques et des substances actives qu’ils contiennent, est régie par la Directive européenne 91/414/CEE. Les informations fournies doivent permettre une évaluation des dangers et des risques liés à l’utilisation du produit concerné, ainsi qu’une évaluation de son efficacité et de sa sélectivité (effet sur les organismes non cibles).Plus particulièrement, l’évaluation toxicologique est destinée à évaluer les risques pour différentes populations humaines : les opérateurs et les travailleurs agricoles directement exposés (personnes qui appliquent les traitements ou qui travaillent sur l’exploitation après traitement), les personnes passant à proximité lors de l’application et les consommateurs. Les études toxicologiques conduites dans ce cadre réglementaire suivent les lignes directrices et les documents guides de l‘OCDE.La Directive 91/414/EEC9 est actuellement en cours de révision. Le Parlementeuropéen a adopté en deuxième lecture le 13 Janvier dernier deux textes législatifs :un règlement relatif à la mise sur le marché des produits phytopharmaceutiques[P6_TA-PROV(2009)0011] et une Directive cadre pour une utilisation durable despesticides [P6_TA-PROV(2009)0010]. Ces textes visent à réduire les risques et lesconséquences de l’utilisation des pesticides pour la sécurité humaine et pourl’environnement. Le projet de règlement prévoit en particulier une diminution desessais sur vertébrés et encourage l’utilisation des méthodes alternatives àl’expérimentation animale.

9 la directive a été abrogée le 11/06/11 et remplacé par le règlement européen CE 11107/2009

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• L’évaluation des produits Biocides Les produits biocides sont destinés à détruire, repousser, ou rendre inoffensifs les organismes jugés nuisibles par l’Homme, en prévenant leur action ou en les détruisant par une action chimique ou biologique. Ils sont régis par la Directive N°98/8 du 26 février 1998 entrée en application en mai 2000 qui définit 23 types de produits biocides répartis en quatre catégories (les désinfectants, les produits de protection, les produits antiparasitaires et les autres produits biocides).Cette Directive a pour conséquence d’harmoniser la réglementation des Etats membres de l’Union européenne, jusqu’alors très inégale, sur l’utilisation de ces produits et de garantir l’unicité du marché.Son objectif principal est d’assurer un niveau de protection élevé de l’Homme, des animaux et de l’environnement en limitant la mise sur le marché aux seuls produits biocides efficaces présentant des risques acceptables et en encourageant la mise sur le marché de substances actives présentant de moins en moins de risque pour l’Homme et l’environnement. Les mesures visent notamment à prévenir les effets à long terme : effets cancérogènes ou toxiques pour la reproduction, effets des substances toxiques, persistantes et bioaccumulables.La Directive généralise l’autorisation de mise sur le marché, au niveau national, de chaque produit biocide. Les substances actives de ces produits doivent, au préalable, avoir été autorisées au niveau européen et inscrites à l’annexe I de la Directive.L’évaluation des risques pour l’Homme et pour l’environnement s’appuie, d’une part sur les données de danger résultant des études requises dans les dossiers remis pour l’inscription des substances actives à l’annexe I et dans ceux de demande d’AMM des produits biocides, et, d’autre part, sur une estimation de l’exposition lors de l’utilisation de ces produits.Les industriels sont incités à partager, notamment pour les études sur vertébrés, les données obtenues sur les substances actives. Il est aussi stipulé dans la Directive 98/8/CE de justifier de la raison menant à répéter des études pour lesquelles des données existent déjà.

• Les additifs alimentaires : Le cadre général des tests nécessaires à l'évaluation de la sécurité d'un nouvel additif alimentaire a été exposé dans un document émis par le "Scientific Committee on Food": SCF/CS/ADD/GEN/26 du 12 juillet 2001.Le panel d'essais à réaliser, en fonction de l'entité considérée, est proche de celui mis en œuvre pour l'étude d'une nouvelle molécule à visée médicamenteuse. Il est recommandé d'adopter les protocoles expérimentaux de l'OCDE, de réaliser les études conformément aux Bonnes Pratiques de Laboratoire (BPL) et de respecter le principe des 3R.Par ailleurs, le Comité scientifique de l’EFSA a publié en juillet 2009 un avis sur les méthodes alternatives en expérimentation animale et leurs utilisations dans le domaine de la sécurité de l’alimentation humaine et animale (The EFSA Journal (2009) 1052, 6-77). Cet avis constitue un examen approfondi des principes directeurs relatifs à l’utilisation d’animaux à des fins expérimentales. Il résume les possibilités de remplacement, de réduction et d’amélioration des essais sur les animaux dans les différents domaines d’activité de l’EFSA.Parallèlement à cet avis « générique », l’EFSA a publié en juillet 2009 un avis scientifique sur le contenu des dossiers de demande d’autorisation des additifs alimentaires (EFSA Journal (2009) 1188, 1-7). Il annonce une nouvelle ligne directrice qui devra être finalisée en Juillet 2011 et réitère ses recommandations de remplacement et réduction des tests sur animaux.

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• Les Organismes Génétiquement Modifiés (Avis du président du CES Biotechnologie de l’AFSSA sollicité)

Au niveau européen, les OGM sont réglementés par la Directive 2009/41/CE (utilisation confinée d’OGM), la Directive 2001/18/CE (dissémination volontaire d’OGM). Ces directives ont été transposées en droit français par la loi du 2008-595 du 25 juin 2008 instaurant, dans son article 3, le Haut Conseil des Biotechnologies chargé de rendre des avis en matière d’évaluation des risques pour l’environnement et la santé publique de toute utilisation d’OGM.

Par ailleurs, les OGM destinés à l’alimentation ou pouvant entrer dans la composition des produits alimentaires à destination des hommes ou des animaux sont régis par le règlement (CE) 1829/2003 qui prévoit une procédure d’évaluation unique réalisée par l’Autorité européenne de sécurité alimentaire (AESA).Toutefois, la procédure d’examen des dossiers prévoit une consultation des Etats-membres. Dans le cas de la France, l’évaluation des risques sanitaires et nutritionnels est du ressort du Comité d’Experts Spécialisés en Biotechnologie de l’AFSSA, laquelle est sollicitée par la DGCCRF.Les dossiers doivent répondre aux exigences de lignes directrices et on trouve, entre autres informations, dans ces dossiers, des études toxicologiques relatives aux risques liés aux protéines exprimées dans la plante génétiquement modifiée (administration unique par voie orale chez le rongeur), aux effets de la plante ou partie de plante consommée (étude per os 90 jours chez le rat) et un test d’alimentarité sur une espèce cible, le plus souvent le poulet. Par ailleurs, sur la base des directives de l'OMS-FAO du Codex Alimentarius et de l'EFSA, l'évaluation du risque d'allergénicité prévoit, pour les protéines transgéniques, la recherche in silico d'homologies de séquences avec des allergènes connus. En cas de doute, une recherche de réactivité croisée entre les IgE de sujets allergiques dirigées contre une protéine identifiée comme présentant un certain degré d'homologie et des IgE dirigées contre la protéine transgénique est réalisée. Par ailleurs la sensibilité des protéines transgéniques à la dégradation protéolytique du milieu digestif (milieu gastrique ou intestinal reconstitué) est évaluée. Au préalable, le risque d'allergénicité de l'organisme donneur du transgène est également pris en compte.

• Les Phycotoxines10

Le règlement CE N° 853/2004 (annexe III, section VII, chapitre V) figurant dans le Paquet Hygiène indique les limites pour les biotoxines marines dans les mollusques bivalves vivants. Il est complété par le règlement CE N°2074/2005 stipulant que le dosage biologique constitue la méthode de référence pour détecter certaines toxines et prévenir la récolte et la commercialisation de coquillages toxiques. En France, des discussions, engagées suite à la problématique des huîtres d’Arcachon, ont abouti, début 2010, au remplacement du test de souris par des méthodes physico-chimiques par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (CL-SM) pour la

10 Le règlement de la Commission européenne concernant ces biotoxines dans les mollusques bivalves correspond au document Règlement (UE) N°15/2011 de la Commission du 10 janvier 2011 modifiant le règlement (CE) N° 2074/2005 en ce qui concerne les méthodes d’analyse reconnues des biotoxines marines chez les mollusques bivalves vivants (Texte présentant de l’intérêt pour l’EEE) (http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2011:006:0003:0006:FR:PDF) avec le rectificatif au Règlement (UE) N°15/2011 de la Commission du 10 janvier 2011 modifiant le règlement (CE) N° 2074/2005 en ce qui concerne les méthodes d’analyse reconnues des biotoxines marines chez les mollusques bivalves vivants « Journal officiel de l’Union européenne » L 6 du 11 janvier 2011

(http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2011:252:0022:0022:FR:PDF).

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détection des toxines lipophiles dans les bivalves, même si ces méthodes ne ciblent que les toxines pour lesquelles un étalon est disponible et qu’elles ne donnent aucune indication sur le niveau de la toxicité globale. Le règlement européen devrait être modifié courant 2010 dans le même sens avec un délai de trois ans pour que la détection par CL-SM soit appliquée dans l’ensemble des pays (cf. la modification du 10 janvier 2011 précédemment citée). Il n’en demeure pas moins que le test biologique sur souris est maintenu comme test de référence pour les toxines paralysantes. Il pourrait également être conservé et intégré dans un système de vigilance, comme c’est le cas en France, dans le but de mettre en évidence la présence de toxines lipophiles émergentes (toxines inconnues, nouveaux analogues de toxines connues etc.). A ce jour, le test maintenu une fois par mois pour vérifier la cohérence avec le test chimique utilisé en routine.

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III- LES ACTEURS DAND LE DOMAINE DES MÉTHODES ALTERNATIVES, DE LEUR CONCEPTION A LEUR UTILISATION

GIS «PLATEFORME FRANÇAISE POUR LE DÉVELOPPEMENT

DES MÉTHODES ALTERNATIVES EN EXPÉRIMENTATION ANIMALE »

La « Plateforme Nationale pour le développement de méthodes alternatives en expérimentation animale », revêt la forme d’un Groupement d’Intérêt Scientifique (GIS), réunissant des représentants d’institutions (étatiques ou autres), des professionnels et des associations : - Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche, - AFSSAPS (Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé), - INERIS (Institut National de l’Environnement et des Risques), - AFSSET (Agence Française de Sécurité Sanitaire de l’Environnement et du Travail),- INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), - CNRS (Centre National de la Recherche Scientifique), - UIC (Union des Industries Chimiques), - FEBEA (Fédération des entreprises de la beauté), - LEEM (les Entreprises du médicament), - OPAL (recherche expérimentale et protection de l’animal de laboratoire), - LFDA (La Fondation Droit Animal, Ethique et Sciences ex Ligue Française des Droits de

l’Animal), - SPTC (Société de Pharmaco-Toxicologie Cellulaire).

Depuis la version initiale de ce rapport d’autres organismes ont rejoint le CODIR : le CEA, l’INRA et l’ANSES issue du regroupement de l’AFSSET et de l’AFSSA.

Cette plateforme, créée en novembre 2007, a pour but de fédérer tous les partenaires, autour de la volonté commune de favoriser la mise en place de méthodes alternatives permettant de réduire ou de supprimer le recours à l’animal de laboratoire notamment dans le développement, l’évaluation et le contrôle des produits de santé et des substances chimiques. La France rejoint ainsi les pays européens disposant d’une plateforme nationale et réunis au sein de la plateforme européenne ECOPA.

1. LE SECTEUR PUBLIC

Les organismes de recherche publique assurent des missions de recherche fondamentale ou translationnelle visant à développer de nouveaux concepts et outils ; ces concepts et outils pouvant déboucher sur des applications dans tous les domaines de la recherche biologique médicale humaine et vétérinaire ainsi que dans le domaine de la production agro-alimentaire de la sécurité de l’environnement des personnes et des animaux. Dans ce contexte ils sont les moteurs de l’émergence de nouveaux outils pouvant contribuer à l’enrichissement des méthodes alternatives.

On peut citer plusieurs exemples :- Le modèle de peau reconstruite de Louis Dubertret a été développé dans le but

d’étudier la différenciation cellulaire cutanée. Cette technique a permis, en 1983, les premières greffes de peau humaine complètement reconstituée comprenant un derme et un épiderme équivalents, sur une dizaine d’enfants souffrant de malformations cutanée géantes. Une autre utilisation a été envisagée avec l’application de ce modèle à l’étude de l’action des médicaments, comme modèle

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d’étude du psoriasis puis comme modèle d’étude de l’irritation pour les produits cosmétiques. D’autres modèles se sont inspirés du modèle de Dubertret pour devenir des modèles alternatifs aujourd’hui réglementaires (irritation/corrosion cutanée : projet de test OCDE).

- Les cultures d’hépatocytes d’origine humaine ou animale ont été développées comme modèle d’étude du fonctionnement hépatique. Ceux-ci sont devenus depuis des modèles très utilisés par l’industrie pharmaceutique, au stade de recherche et de développement d’un candidat médicament, pour étudier la biotransformation, les inductions/inhibitions enzymatiques potentielles pouvant être à la source d’une perte d’efficacité ou à l’origine d’une toxicité médicamenteuse. La lignée d’hépatocytes Hepa-RG d’origine humaine, nouvellement établie, représente une possible alternative aux hépatocytes humains dont l’obtention est limitée et aléatoire.

- De la même manière, les cultures de progéniteurs hématopoïétiques de type monocytaire destinées à l’origine à l’étude de la réponse immune ont été adaptées pour servir de modèle alternatif de prédiction de l’allergie de contact (étude de prévalidation ECVAM en cours).

- Enfin les gonades de rats fœtaux peuvent être mises en culture (culture organotypique) pendant plusieurs jours pour étudier l’effet sur le développement gonadique, de perturbateurs endocriniens, comme le diéthylstilbestrol et les phtalates et leurs métabolites.

La notion d’obligation réglementaire de mettre en œuvre des alternatives en expérimentation animale se fonde dans ce domaine sur les exigences de la Directive 86/609 et de sa transposition en droit français. Par contre il est à noter que dans ce domaine une méthode ne peut obtenir que la validation scientifique des pairs correspondant à un état donné des connaissances et qu’en aucun cas une méthode alternative ne pourrait être imposée en recherche fondamentale. a) Les acteurs nationaux

A l’échelle de la France, le besoin de nouvelles méthodologies, s’affranchissant au maximum de l’animal, en vue d’évaluer la toxicité et l’écotoxicité des agents auxquels nous sommes exposés, est clairement affiché, notamment dans le cadre du Plan National Santé Environnement 1 (PNSE)11. Ce plan a incité au renfort des « capacités d’évaluation des risques sanitaires des substances chimiques dangereuses » (action 20, action prioritaire), et au développement de « nouveaux outils pour mieux évaluer les risques des substances chimiques et biologiques » (action 21), ainsi qu’au renforcement global de la recherche (avec un axe, axe 6 regroupant 5 actions), notamment par une meilleure coordination, et par un « programme inter-organisme de modélisation et d’expérimentation en toxicologie et épidémiologie ». On notera les recommandations du Comité National d’Evaluation de la Recherche sur la « Recherche sur l’animal et santé de l’Homme » qui viennent renforcer encore ces orientations.Il faut noter la mise en place du réseau EFOR (études fonctionnelles sur les animaux modèles) qui comporte un Comité scientifique d'une dizaine de membres (CNRS, INRA INSERM, IFREMER) et qui répertorie les principales espèces modèles utilisées en France (depuis les primates jusqu’aux organismes unicellulaires eucaryotes, levures mise à part), ainsi que le type de recherche effectuée avec ces espèces afin de mieux faire connaître les modèles animaux disponibles et d’en faciliter l’utilisation.

11 Le Plan National Santé Environnement vise à répondre aux interrogations des Français sur les conséquences sanitaires à court et moyen terme de l’exposition à certaines pollutions de leur environnement. Pour la première fois dans l’histoire de la santé environnementale en France, l’ensemble de l’expertise publique française dans ce champ a été réuni au sein d’une commission d’orientation pour bâtir un diagnostic de l’état des risques sanitaires liés à l’environnement dans notre pays. www.sante-sports.gouv.fr

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Divers organismes de recherche publique ou assimilée s’inscrivent dans la mise au point de méthodes alternatives :

• L’INSERM : l’Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale

L’enquête menée par l’INSERM au sein de ses formations de recherche (IFR, CIC, ESPRI, AVENIR, ERI) sur le développement et l’utilisation de méthodes alternatives à l’expérimentation animale apporte des informations décrivant le profil d’utilisation des méthodes alternatives dans les laboratoires de l’institut.131 réponses ont été reçues sur les 488 questionnaires adressés. Parmi les 131 structures qui ont répondu, 82,44% pratiquent l’expérimentation animale et appliquent les stratégies d’optimisation et de réduction.La plupart des modèles de substitution sont utilisés depuis le début des années 1990 et ont permis de diminuer significativement le nombre d’animaux utilisés. Il s’agit des modèles suivants :- les cultures primaires et lignées cellulaires animales et humaines,- les tranches de tissus,- les organes isolés,- les cellules souches animales et humaines,- la génomique, la protéomique,- la modélisation moléculaire,- la modélisation biométrique,- la modélisation informatique.

Les sources de financement sont d’origine diverses :D’origine française : INSERM, ANR ARC, ligue contre le cancer, INERIS, Post-Grenelle. D’origine européenne: FP6, ECVAM NC3R (GB), Netherlands organization for health research and development (Pays-Bas). Le montant des financements obtenus s’échelonnent de 10 à 140k€. Pour les chercheurs de l’INSERM, les méthodes substitutives sont surtout des méthodes originales permettant d’aborder d’autres questions que les méthodes in vivo. Elles sont complémentaires aux essais sur l’animal. La grande majorité d’entre eux (94,44%) considèrent que les méthodes substitutives ne permettront pas de remplacer l’animal.

L’INSERM a joué un rôle moteur dans la formation sur les technologies ouvrant la voie à des méthodes alternatives par la mise en place d’ateliers qui leur ont été entièrement dédiés, pour exemple :- Atelier de formation N°195, 3-5 juin 2009

Nouvelles techniques d'imagerie pour la biologie : super-résolution et superlocalisation

- Atelier de formation N°192, 8-10 mars 2009 Cellules souches pluripotentes humaines

- Atelier de formation N°191, 19-21 octobre 2008 Imagerie du petit animal : méthodes d'imagerie médicale pour l'exploration anatomique, fonctionnelle et moléculaire in vivo

- Atelier de formation N°186, 5-6 juin 2008 Méthodes d'imagerie fonctionnelle in vivo : de la molécule à la cellule

- Atelier de formation N°152, 27-28 mai 2004 Génomique comparative des vertébrés : concepts et outils bioinformatiques.

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http://ist.inserm.fr/BASIS/elgis/fqmat/atelier/SDF?AUTS_REC_O=Egal+%E0&AUTS_REC=&TITRE_REC_O=La+locution+exacte&TITRE_REC=&FORM_C=Ou&TEXTE_O=La+locution+exacte&TEXTE=&FORM_C=Ou&DOC_DATE_O=La+locution+exacte&DOC_DATE=&FORM_C=Ou&DOC_NUM_O==&DOC_NUM=192&FORM_C=Ou&FORM_F1L=Nom+de+Monographie&FORM_F1O=La+locution+exacte&FORM_F1I=&FORMFL_OB=Aucun&FORM_SO=Ascend










• Le CNRS et l’INSB : le Centre National de la Recherche Scientifique et l’Institut National des Sciences Biologiques

L’enquête menée par le CNRS au sein de sa structure pour répondre à notre demande a permis de recueillir les réponses de 63 sur 150 unités de l’institut. Les réponses reçues donnent des informations qualitatives sur les méthodes alternatives en expérimentation animale utilisées par les unités qui peuvent être présentées comme il suit :

Bien qu’aucune équipe ne soit dédiée ni aucun budget spécifique ne soit accordé au développement et à la validation des méthodes alternatives, celles-ci ont été mises en place et sont largement utilisées depuis la fin des années 1990 essentiellement en complément de l’expérimentation animale. Il s’agit des modèles suivants :- les cultures et lignées cellulaires animales et humaines,- les tranches de tissus,- les organes isolés,- les cellules souches animales et humaines,- la génomique, la protéomique,- les méthodes in silico ont été mises en place plus récemment (début 2000).

Les moyens humains dédiés à l’expérimentation animale sont supérieurs à ceux consacrés aux méthodes alternatives (566 vs 376), en revanche, les budgets sont légèrement plus importants pour les méthodes alternatives. Le budget consacré à ces méthodes varie de 1000 € à 50 k€ pour 8 laboratoires. Seulement 2 laboratoires consacrent de 150 k€ à 500 k€.

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PROGRAMMES DE RECHERCHE EN COURS SUR LES MÉTHODES ALTERNATIVES Une unité de L’INRA est impliquée dans un projet européen qui travaille sur les

perturbateurs endocriniens sans avoir recours à l’expérimentation animale (F&F, Food and Fecundity),

Actuellement, plusieurs équipes impliquées en physiologie, génomique, protéomique, toxicologie développent des cultures cellulaires et des techniques in silico. Ces équipes sont amenées à comparer des approches conduites in silico, à d’autres conduites sur des cellules, des tissus ou des animaux vivants. A titre d’exemple, les cellules contenues dans le lait de mammifères ou les œufs des oiseaux et des poissons sont faciles à obtenir via des méthodes non invasives chez les espèces d’intérêt agronomique et sont donc de plus en plus utilisées. Des recherches sont donc conduites pour développer des modèles alternatifs très prometteurs. Dans ces équipes, tout comme dans les autres Instituts, de nombreux modèles cellulaires sont aussi utilisés (cellules adipeuses, hépatiques, musculaires, mammaires, etc.).

Dans le cadre d’une meilleure estimation des dangers et des risques sanitaires environnementaux des xénobiotiques plusieurs modèles cellulaires sont utilisés.

Deux équipes de l’INRA participent au programme ANTIOPES dédié à la toxicologie prédictive.


• L‘INRA : l’Institut National de la Recherche Agronomique

Même si les chercheurs de l’INRA ont encore peu développé à ce jour des programmes dédiés dans un but premier à la mise au point de méthodes alternatives, plusieurs projets faisant appel à des méthodes que l’on peut assimiler à des méthodes alternatives ont été mentionnés (modélisation, cultures primaires, digesteur, Omics, etc.).

Les chercheurs de l’INRA sont sensibles au développement des méthodes alternatives à l’expérimentation animale dans la construction et l’évaluation notamment éthique de leur projet de recherche ; le nouveau Bureau de l’Expérimentation Animale de l’Institut œuvre dans ce sens. Cependant les chercheurs de l’INRA sont peu impliqués à ce jour dans des programmes réellement dédiés à la mise au point de méthodes permettant la promotion de la démarche dite 3R. Quelques projets ayant cet objectif ont été identifiés :

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PROGRAMMES DE RECHERCHE EN COURS SUR LES MÉTHODES ALTERNATIVES

Radiotoxicologie des actinides et des cations mis en œuvre dans le Nucléaire L'étude de l'impact pulmonaire d'oxydes d'actinides (notamment des nouveaux combustibles "MOX" PuO2/UO2) est conduite dans une perspective de protection des travailleurs du Nucléaire. Les questions posées sont celles de la dissolution des particules in situ, de la biocinétique des éléments chimiques relargués et de leur décorporation. - Cultures de lignées cellulaires humaines ; modèles d'épithélia pulmonaire et

rénal, modèle de barrière cutanée, modèle de barrière hémato-encéphalique, lignées osseuses.

Toxicologie des nanoparticules Les travaux conduits dans ce domaine s'inscrivent principalement dans l’identification des organes cibles de nanomatériaux préparés au CEA (nanotubes de carbone, nanoparticules métalliques, quantum dots, etc.) et la détermination des cinétiques de distribution/accumulation dans ces organes. Les progrès récents de l'imagerie chez le petit animal ont permis de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés.- Modèles cellulaires pour la classification des particules en fonction de

paramètres physico-chimiques, modèle de barrière hémato-encéphalique.


• Le CEA : le Commissariat à l’Energie Atomique

Le CEA ne développe pas sensu stricto de méthodes alternatives à l’expérimentation animale mais de nombreux programmes de recherche sont susceptibles à terme de permettre, le remplacement de l’animal (criblage cellulaire, ingénierie moléculaire des anticorps, etc.) ou la réduction du nombre d’animaux (transcriptomique, protéomique, etc.). En parallèle, de nouvelles technologies sont développées pour améliorer les conditions de l’expérimentation animale et l’exploitation des données (techniques d’imagerie médicale, etc.) (cf. paragraphe « les nouvelles approches en expérimentation animale).

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Le développement et la validation de modèles in vitro pour l’évaluation :- du potentiel perturbateur endocrinien des substances chimiques. Ces modèles

étant utilisés pour l’évaluation du danger de polluants organiques environnementaux (approche de criblage), pour l'évaluation des effets sur la reproduction chez le poisson (approche intégrée in vitro/in vivo) et, pour l'identification de substances toxiques dans l'environnement (couplage in vitro/fractionnement physico-chimique/analyse chimique),

- de la toxicité générale et du passage transmembranaire des substances chimiques (barrières alvéolo-capillaire au niveau du poumon, hémato-encéphalique au niveau du cerveau, hémato-testiculaire ou hémato-ovarienne au niveau des gonades et hémato-placentaire entre la mère et l’embryon ou le fœtus). Les projets afférents à ces objectifs sont propres à l’INERIS ou effectués en collaboration dans le cadre d’ANR avec l’INSERM, le CEA et des universités.

La modélisation, domaine pour lequel l'INERIS dispose d'une unité dédiée.Il s'agit d'évaluer la dangerosité des substances grâce à des méthodes informatiques (modèles QSARs et PBPK) capables d'exploiter des informations physico-chimiques et les résultats des tests in vitro pour proposer une évaluation du risque sur le vivant. Ces tests in vitro sont des tests cellulaires de complexités diverses (depuis la boite de Pétri, jusqu’aux puces à cellules couplant les cellules de plusieurs organes) au cours desquels les expressions transcriptomiques et métabolomiques peuvent être mesurées en parallèle de mesures plus classiques (viabilité, génotoxicité). L'activité de cette équipe est soutenue par des programmes européens (6ème et 7ème PCRD), nationaux (ANR) et propres à l'INERIS, avec des collaborations internationales (JRC, UFZ) et nationales (Inserm, UTC, CNRS). Ces axes peuvent donner lieu à terme à des logiques « substitutives » pures, mais elles s’inscrivent aussi dans les « Integrated Testing Strategies, ITS », permettant de réduire le nombre d’essais en sélectionnant les séries de tests qui optimisent le gain d’information toxicologique au moindre coût expérimental. Dans le domaine des ITS, il faut citer le programme ANR CANTO qui pilote l’acquisition d’information en optimisant entre tests in vitro, modélisation, et essais animaux.


• L’INERIS : L’Institut National de l’Environnement Industriel et des Risques

L’INERIS est impliqué depuis une vingtaine d’années dans le développement d’outils essentiels au développement de méthodes alternatives, avec trois axes de recherche et deux actions de coordination :

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PROGRAMMES DE RECHERCHE EN COURS SUR LES MÉTHODES ALTERNATIVES (INERIS, suite)

Le développement de tests sur embryon et larve de poisson pour évaluer le potentiel perturbateur endocrinien des molécules organiques. Cette action vise à proposer des tests rapides et sensibles pour le screening du potentiel PE des substances chimiques et s'inscrit dans la démarche d'évaluation intégrée vitro/vivo du risque des PE. Ces tests se basent sur l'analyse de l'expression de gènes cibles endogènes impliqués dans le métabolisme hormonal. Cette démarche consiste aussi à développer des lignées de poissons transgéniques telles que les lignées aromatase B-GFP et sGnRH-GFP permettant d'étudier les effets neuro-endocrines des PE durant les stades précoces du développement chez le poisson zèbre. Ces recherches sont supportées par des programmes propres à l'INERIS (P189), nationaux (PNRPE, ANR) et par le réseau national NEMO du Post-Grenelle.

L’ensemble de ces activité mobilise environ 15 ETP pour un budget annuel de l’ordre de 1,5 M€.

• En outre, l'INERIS participe activement à l'animation du réseau ANTIOPES. Le réseau partenarial ANTIOPES est une fédération de compétences et de moyens regroupant des chercheurs essentiellement issus de la recherche publique (INSERM, CNRS, CEA, INRA, université). L’objectif de ce réseau est la mise en œuvre d’un programme de travail dans le domaine de la toxicologie prédictive et la santé environnementale en réponse à REACh. Ce programme prévoit de développer les méthodes alternatives comme les approches de modélisation chimique prédictive (QSAR) et les biomarqueurs en lien avec les développements "Omics".

• Enfin, le Pôle National Applicatif en Toxicologie et Ecotoxicologie a été créé par le Ministère de l’Ecologie à l’INERIS. Il s’organise autour de la Fondation Universitaire de l’UTC, de l’unité PERITOX de l’UPJV, de l’institut Lasalle Beauvais et du réseau ANTIOPES. Il est soutenu en partie par un financement Post-Grenelle destiné à augmenter les moyens humains en toxicologie et en écotoxicologie. L'une des principales finalités du Pôle est le développement de méthodes alternatives opérationnelles dans le domaine du risque environnemental.


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L’INRS développe des méthodes substitutives dans 3 domaines principaux :

Passage percutané : Un des objectifs de la recherche est de définir un modèle, s’appuyant sur des critères physiques et physico-chimiques, qui permettent de déterminer la variation des flux d’absorption de toxiques. L’intérêt des membranes artificielles hydrophobes (membranes de silicone) comme succédané du stratum corneum qui est considéré comme la principale barrière aux composés hydrophiles est étudié en complément des études in vivo et ex vivo.

Immunotoxicologie : Un programme de recherche est mené sur l’allergie aux produits industriels afin de développer des indicateurs d’effet sensibles et spécifiques en particulier capables de différencier les allergènes responsables d’asthmes professionnels. Un effort particulier a été engagé sur le développement d’un modèle in vitro basé sur l’utilisation de cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse de souris, capable d’identifier des sensibilisants cutanés forts. La pertinence de ce modèle pour étudier les sensibilisants faibles et les sensibilisants respiratoires fera l’objet d’une prochaine étude.

La génotoxicité : Les études sont orientées sur la détection des cancérogènes. Sont ciblées, les fibres et particules présentes en ambiance professionnelle, en particulier les nanoparticules,Les méthodes in vitro sont développées pour étudier les effets pulmonaires. Il s’agit de tests de cytotoxicité, d’étude de l’apoptose, du test des micronoyaux, du test des comètes, la recherche sur le stress oxydant, etc.).


• L’INRS : L’Institut National de Recherche et de Sécurité

L’objectif essentiel des programmes de recherche toxicologique de l’INRS consiste à prévenir les atteintes pour la santé qui résultent de l’exposition aux agents chimiques présents sur les lieux de travail. Impliqué dans des activités d’études et de recherche en toxicologie industrielle, le département Polluants et Santé de l’INRS participe à l’évaluation du risque chimique en milieu professionnel. A ce titre, l’INRS utilise et développe des méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

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La sécurité des produits cosmétiques : L’AFSSAPS s’est dotée d’un laboratoire spécialisé et d’une équipe dédiée au développement et la validation de méthodes in vitro appliquées aux produits cosmétiques, en particulier pour évaluer la tolérance des produits formulés. Cette activité mobilise 4 ETP pour un budget annuel de 625 k€ par an.Depuis 2005, cette équipe a constitué un réseau national dédié à la prédiction des substances allergisantes cutanées avec une application spécifique aux ingrédients cosmétiques. Une dotation de 890 000 euros a été accordée par l’AFSSAPS sur une période de 3 ans. Ce projet multipartenariat a réuni 5 équipes dont 3 issues de la recherche publique (INSERM, CNRS, université) et un laboratoire privé (ressources biologiques) et les laboratoires de l’AFSSAPS. Ce projet a permis de développer plusieurs modèles de substitution au test in vivo :

- Une méthode in silico d’étude de relation structure-activité basée sur l’analyse en RMN 1D et 2D (1 et 2 Dimensions).- Trois modèles cellulaires : les lignées cellulaires continues (THP-1, MUTZ-3), les cellules progéniteurs hématopoïétiques CD34-DC, les monocytes du sang périphériques (Mo-DC). Ce programme a permis d’identifier une nouvelle voie de signalisation cellulaire prédictive de la sensibilisation (Keap1/Nrf2) et d’étudier la pertinence d’associer plusieurs biomarqueurs pour améliorer la capacité de prédiction des modèles cellulaires.

Le Contrôle Qualité des médicaments biologiques :Depuis 1994, les laboratoires de l’AFSSAPS participent au Programme de Standardisation Biologique sous l’égide de l’EDQM dont 16 programmes sur 98 sont axés sur les méthodes 3R. Cette activité mobilise 2 ETP pour un budget annuel d’environ 156 k€ par an.Quelques exemples :

- Programme MAPREC : Méthode de biologie moléculaire alternative au test de neurovirulence chez le singe pour le vaccin polio oral,- Programme Pyrogène : test cellulaires alternatifs au test des pyrogènes chez le lapin,- Développement de méthodes ELISA en remplacement des tests sérologiques pour un grand nombre de vaccins,- Programmes d’étude statistiques de contrôle de la régularité des lots de production de vaccins afin de réduire le contrôle systématique de chaque lot par l’autorité de contrôle.

L’activité en laboratoire de l’AFSSAPS dans le domaine des méthodes alternatives mobilise 6 ETP pour un budget annuel de 781 k€ auquel doivent être ajoutés le financement de 890 k€ sur 3 ans (2006-2008) dédié à la thématique « Allergie de contact » et 1 ETP dédié au secrétariat du GIS « méthodes alternatives ».


2. LES AGENCES FRANÇAISES DE SÉCURITÉ SANITAIRE

• L’AFSSAPS : L’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de SantéL’AFSSAPS agence réglementaire en charge de la sécurité des produits de santé participe depuis plus de 15 ans au développement des méthodes alternatives dans 2 domaines ciblés : la sécurité des produits cosmétiques et le contrôle qualité des médicaments biologiques.

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Développement et validation d’une méthode physico-chimique pour la détection et le dosage des biotoxines marines en remplacement du test sur souris,

Développement de tests cellulaires pour la mesure de ces toxines dans les aliments,

Participation au projet HepaCellTox financé par l’ANR visant à caractériser les capacités de réponses aux pro-mutagènes du modèle d’hépatocytes humains Hepa-RG,

De nouveaux projets d’approche intégrée faisant interagir plusieurs compartiments cellulaires,

Un modèle de toxicocinétique in vitro de la barrière intestinale (cellules CaCo2, modèle d’étude de la barrière intestinale),

Développement de méthodes de diagnostic par PCR pour les maladies animales évitant dans de nombreux cas le recours à l’expérimentation animale,

Développement de la plateforme « puces hautes densités »,

Utilisation d’outil de simulation ou de prédiction des étapes cinétiques (approche in silico).


• L’AFSSA12 : L’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments

L’AFSSA assure l’évaluation des risques sanitaires pour l’Homme, les animaux et les éco-systèmes liés aux aliments et aux produits entrant dans la chaîne de production alimentaire. Dans son domaine d’activité, l’AFSSA participe à plusieurs programmes de développement d’études in vitro.

12 L'Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail (Anses) assure des missions de veille, d'expertise, de recherche et de référence sur un large champ couvrant la santé humaine, la santé et le bien-être animal, et la santé végétale. Établissement public à caractère administratif, l'Anses est placée sous la tutelle des ministères chargés de la santé, de l'agriculture, de l'environnement, du travail et de la consommation. Elle a été créée le 1er juillet 2010 par la fusion de deux agences sanitaires françaises : l'Afssa (Agence française de sécurité sanitaire des aliments) et l'Afsset (Agence française de sécurité sanitaire de l'environnement et du travail). En reprenant leurs missions et moyens respectifs, l'Anses offre une lecture transversale des questions sanitaires en santé humaine, animale et végétale.

Au-delà du rapprochement des moyens et des compétences, cette fusion apporte une véritable valeur ajoutée à l'expertise française. L'Agence appréhende ainsi de manière globale les expositions auxquelles l'Homme peut être soumis à tous les âges et moments de sa vie : travail, domicile, déplacements, loisirs.

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L’AFSSET est aussi promoteur de travaux de recherche par le financement d’un fond qui fait une part non négligeable aux projets utilisant des méthodes alternatives ainsi les projets retenus dans ce cadre sont les suivants : "NanoPIST - Nanoparticules produites intentionnellement : signatures

toxicologiques", "Caractérisation des effets inflammatoires du formaldéhyde dans des cellules

humaines", "Protéine p53 et réponse cellulaire à des nanoparticules : de la physiopathologie

à l’utilisation comme biomarqueur d’exposition à des nanoparticules toxiques": Dr Plastique et/ou Mr EMX ?

"Conséquences toxicologiques de l’exposition pulmonaire aux nanoparticules biodégradables",

"Le poisson médaka (Oryzias latipes), modèle animal pour l’étude de la toxicité et des mécanismes d’action des microcystines",

"Evaluation de l'impact toxicologique de la pollution particulaire (PM2,5) à Dunkerque : études sous influences industrielle, non industrielle et rurale"Evaluation in vitro de la réactivité des particules fines et ultrafines,

"Immunotoxicité des insecticides : identification de marqueurs d'effets biologiques précoces dans les lymphocytes humains".


• L’AFSSET : L’Agence Française de Sécurité Sanitaire de l’Environnement et du Travail

L’AFSSET est un établissement public administratif de l’État, réorganisé par l’ordonnance N° 2005-1087 du 1er septembre 2005 qui a transformé l’AFSSE, établissement initialement créé par la loi N° 2001-398 du 9 mai 2001, en AFSSET, et par le décret N° 2006-676 du 8 juin 2006.

L’AFSSET est placée sous la tutelle conjointe des ministres chargés de l’environnement, de la santé et du travail.Pour deux réglementations européennes dans lesquelles les méthodes alternatives ont une place de plus en plus importante, l’AFSSET est en appui des autorités compétentes :

Dans le cadre du règlement REACh :

- Evaluation, autorisation, restriction et appui scientifique auprès du ministère en charge de l’écologie qui est autorité compétente.

- Classification auprès du Ministère du travail qui est autorité compétente.- Experts dans les Comités de l’agence des produits chimiques (ECHA).

Dans le cadre de la Directive 98/8 dite biocides :

- Evaluation des dossiers substances et produits,- Expertise au niveau communautaire et appui scientifique auprès du ministère en

charge de l’écologie qui est autorité compétente.

Par ailleurs le bulletin de veille de l’AFSSET a une thématique sur les méthodes alternatives qui donne ainsi une meilleure visibilité aux chercheurs.

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b) Les acteurs européens et internationaux

• La Commission Européenne

Le programme de recherche pluriannuel de l'Union soutient le développement de nouveaux essais in vitro. Il finance actuellement plusieurs projets à hauteur de plusieurs millions d’euros. La DG Entreprises et industrie collabore également avec l'industrie pour favoriser le développement de stratégies d'essais intégrés faisant appel à des modèles informatiques.

• ECVAM : European Centre for the Validation of Alternative Methods

En 1991, en réponse à la Directive 86/609, la Commission européenne a créé le centre européen de validation des méthodes alternatives (CEVMA/ECVAM). L'ECVAM a pour objectif de coordonner la validation de méthodes alternatives, de les promouvoir et de les diffuser, d’être un point de convergence des informations sur le développement de méthodes alternatives et de favoriser le dialogue entre législateurs communautaires et nationaux, industriels, scientifiques et ONG.

• EDQM : European Directorate for the Quality of Medicines

L’EDQM émane du Conseil de l’Europe et participe à l’élaboration des monographies de la Pharmacopée européenne. La Commission européenne de Pharmacopée engage depuis plusieurs années des efforts en matière de réduction, remplacement et optimisation de l’expérimentation animale. Ainsi de nombreuses monographies ont été révisées dont certaines ont abouti au remplacement définitif de l’animal (ex : méthodes de dosage physico-chimiques en remplacement des bioessais et l’abandon de la toxicité anormale pour les médicaments biotechnologiques). Depuis 1994, l’EDQM a mis en place un programme de standardisation biologique dont l’un des axes de travail est la validation de méthodes alternatives 3R. A cette fin, des études collaboratives de validation sont organisées avec la participation de tous les partenaires intéressés, notamment les laboratoires nationaux de contrôle et les fabricants. Un congrès entièrement dédié aux méthodes alternatives s’est tenu à Dubrovnik, Croatie en 2008.

• ECOPA : (European COnsensus-Platform for Alternatives)

Le projet ECOPA a été lancé en 2002 par dix pays de l'Union dans le but de faciliter l'échange d'informations scientifiques et de promouvoir la mise au point d'autres méthodes d'expérimentation.ECOPA coordonne à ce jour les activités de 16 plateformes représentées par la recherche publique, l’industrie, les autorités et les associations de protection des animaux. ECOPA a labellisé un grand nombre de projets européens dédiés au développement de méthodes alternatives (cf. Annexe 3).

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• OCDE : Organisation de Coopération et de Développement Economique

Au niveau international, l'OCDE a adopté, pour la première fois en 2004, des méthodes destinées à remplacer les essais sur les animaux et ce dans la continuité des activités de coordination de la recherche et de validation de la Commission.Depuis, l’OCDE, de part ses activités sur les perturbateurs endocriniens, coordonne ses propres travaux de validation en appui avec les organismes de validation tels que l’ECVAM et l’ICCVAM (USA). Par ailleurs, un groupe spécifique de management de la validation (VMG) pour les méthodes dites non animales a été établi pour le suivi de ces activités.L’OCDE affiche la volonté de promotion des 3R notamment par la participation en tant qu’experts contributeurs d’ICAPO (ONG internationale de protection des animaux).

• ICH : International Conference of Harmonisation

Le processus ICH (International Conference of Harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use) qui regroupe les Autorités Pharmacopées et les Entreprises du médicament d’Europe, des Etats-Unis et du Japon a conduit à une harmonisation presque complète du dossier toxicologique. Le principal objectif des réglementations est la protection de la santé publique et du patient. L’harmonisation de la réglementation au niveau international doit répondre à ces objectifs tout en évitant la duplication des études et en rationalisant le type d’essais à réaliser avec, comme conséquence directe, la diminution de l’utilisation de l’animal de laboratoire pour la partie préclinique du dossier. Pour prendre en compte les avancées de la science et des techniques, une revue de certaines lignes directrices a été entreprise en 2008 et l’un des objectifs principaux est de mettre en place, à chaque fois que cela est possible, des mesures visant à la diminution du nombre d’animaux nécessaires.

• Les relations bilatérales avec les États-Unis

En juin 2004, la Commission européenne et la Food and Drug Administration (FDA) sont convenues d'un plan de travail pour la poursuite de leur coopération. L’ECVAM entretient d'étroites relations avec son homologue américain. Cette coopération inclut l'échange précoce d'informations sur la validation de méthodes de substitution afin que les méthodes développées par l'une des parties puissent être acceptées par l'autre.

• Les relations multilatérales au niveau international

Un accord de coopération a été signé en avril 2009 entre l’ECVAM, son équivalent aux Etats-Unis, ICCVAM, son équivalent au Japon, JaCVAM ainsi que le Bureau canadien de la science de la santé environnementale et de la recherche afin de suivre une démarche harmonisée des processus de validation des méthodes alternatives. Cet accord devrait favoriser la diffusion dans le monde de méthodes de substitution à l’expérimentation animale scientifiquement fondées.

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3. LES SOCIÉTÉS SAVANTES FRANÇAISES

• La SPTC : Société de Pharmaco-Toxicologie Cellulaire crée en 1987L'association a pour souci la réduction de l'usage de l'animal de laboratoire.Elle a pour but :- de promouvoir tout modèle in vitro et in silico pouvant être utilisé en pharmacologie

et en toxicologie, - de développer des cultures cellulaires ou toutes autres structures sub-cellulaires ou

moléculaires permettant d'étudier la pharmacologie, la toxicologie ainsi que les modèles informatiques et le fonctionnement habituel normal ou anormal de ces cellules,

- de faciliter les échanges d'informations et les relations entre toutes les personnes, les groupements et les services publics ou privés concernés par cette action,

- de diffuser des informations et des explications techniques et scientifiques auprès des médias et du public,

- d'organiser des groupes de travail ou de réflexion, des congrès, séminaires ou colloques,

- de faciliter la formation de jeunes chercheurs, - de soutenir d'une façon générale toute initiative tendant à des fins similaires.

Elle organise tous les ans un colloque qui présente dans un domaine donné les derniers développements de la recherche en pharmacologie et toxicologie cellulaire. Elle associe toujours les chercheurs du monde académique et du monde industriel. Elle a joué un rôle très actif dans la mise en place du GIS Méthodes alternatives.

4. LES ASSOCIATIONS DE PROFESSIONNELS

Plusieurs associations rassemblent des professionnels pour l’expérimentation animale, dans des buts de communication et de réflexion sur les pratiques de l’expérimentation animale par l’organisation de colloques. Ne sont reprises ici que les associations ou organisations qui promeuvent le développement de méthodes alternatives en expérimentation animale dans un contexte scientifique.

• L’AFSTAL : L’Association Française des Sciences et Techniques de l’Animal de Laboratoire

L’AFSTAL a été fondée en 1972 et représente les différents professionnels de la recherche biomédicale qui contribuent aux progrès de la médecine et à l'amélioration de la santé de l'Homme et des animaux, grâce à l'étude de modèles animaux. L'AFSTAL s'adresse aux techniciens, zootechniciens, étudiants, chercheurs, ingénieurs, vétérinaires et autres personnels scientifiques, techniques, tout en interagissant avec les ministères directement chargés de l’expérimentation animale (MESR et MAAP). Elle aide ses adhérents à améliorer leurs pratiques quotidiennes pour s'assurer que leurs travaux sont mis en œuvre de façon à produire des résultats du meilleur niveau de qualité, tout en garantissant le respect et le bien-être des animaux. L'AFSTAL compte actuellement plus de 500 adhérents et a pour mission : - De promouvoir les échanges et la diffusion des connaissances scientifiques et

techniques actuelles liées à l'animal de laboratoire, - De favoriser la formation des professionnels de l'animal de laboratoire aux Bonnes

Pratiques Animales, c'est-à-dire aux principes et aux méthodes qui respectent en particulier le concept des 3R.

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• Le GIRCOR : Groupe Interprofessionnel de Réflexion et de COmmunication sur la Recherche

Association regroupant les principaux acteurs de la recherche biomédicale publique (CEA, CNRS, INRA, INSERM, Institut Pasteur, Université) et de l’industrie du médicament et de la sécurité. Le GIRCOR a une mission de réflexion et de communication sur l’expérimentation animale. A ce titre il a initié dès 1988 à travers le GRICE (Groupement de Réflexion sur les Comités d’éthique) la mise en place de Comités d’éthique dans les établissements de recherche industrielle. Le GRICE a rédigé un guide pour l’aide à l’évaluation éthique des protocoles qui sert maintenant aux nouveaux Comités adhérant aux principes de la Charte nationale. La création d’une formation des membres évaluateurs des Comités d’éthique (en collaboration avec les 4 écoles vétérinaires françaises et les services de formation permanente de certaines universités) contribue également à la promotion de la démarche éthique en expérimentation animale. A ce titre le GIRCOR, émanation de la communauté scientifique, a devancé le législateur. Plus récemment le GIRCOR a participé à l’édition de la Charte nationale portant sur l’éthique de l’expérimentation animale rédigée par le Comité national de réflexion éthique en expérimentation animale (CNREEA, voir paragraphe 7) et accompagne le MESR dans la promotion active de cette Charte nationale.

• OPAL : Recherche expérimentale et protection de l’animal de laboratoire

Depuis plus de 40 ans, l’OPAL réunit des scientifiques (recherche académique et recherche privée) et des industriels. Elle s’est donné pour missions de promouvoir et de soutenir toutes actions en faveur du respect dû aux animaux de laboratoire visant à :

- Contribuer au développement et à la validation de méthodes alternatives fiables permettant de limiter le recours à l’animal de laboratoire,

- Respecter et améliorer les conditions d’hébergement, d’élevage et d’utilisation d’animaux de laboratoire,

- Améliorer les règles de bonnes pratiques d’expérimentation animale.

Parmi les actions menées par l’OPAL, on peut citer :

- L’organisation de colloques scientifiques en relation avec la règle des 3R, - L’attribution de prix : Prix Amalthée et Prix de Thèse qui récompensent des travaux

de recherche dans le domaine des méthodes alternatives ou complémentaires à l'expérimentation animale ou améliorant les conditions d'expérimentation ou d'environnement des animaux de laboratoire.

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5. LES ORGANISATIONS DE PROTECTION ANIMALE

•Les organisations de protection animale sont représentées au sein de la CNEA-Commission nationale de protection animale, du CNREEA-Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale, et de la plateforme française sur les méthodes alternatives en expérimentation animale. A l’égard de l’expérimentation animale, elles se classent en deux courants principaux. L’un rassemble la majorité de ces organisations (dont les Fondations Brigitte Bardot et 30 Millions d’amis, les associations SPA, One voice, ProAnima, Droits des animaux), qui sont engagés dans la protection de l’animal sur l’ensemble du domaine sociétal, et pas seulement sur l’expérimentation. Vis-à-vis de cette dernière, il existe des positions variées et parfois décalées, considérant souvent de façon extrémistemal comme non fiable voire nocive parce que non transposable à l’Homme, et inutile parce que déjà totalement remplaçable par des méthodes substitutives.

• LFDA : La Fondation Droit Animal, Ethique et Sciences (ex Ligue Française des Droits de l’Animal

Un autre courant est plongé dans la pratique scientifique. Il est représenté par la Fondation LFDA reconnue d'utilité publique, qui est l'un des membres fondateurs de la Plateforme nationale. Depuis plus de trente ans, cette organisation se voue au droit animal, à l’éthique et aux sciences ; elle avance des arguments scientifiques raisonnés à l’égard de l’expérimentation animale, et agit en faveur d’une formation juridique et éthique des expérimentateurs, ainsi que du développement des méthodes alternatives, par la voie de colloques, conférences, et publications à caractère scientifique, éthique et juridique. La Fondation LFDA a créé en 1984 le Prix de biologie Alfred Kastler, qui récompense des chercheurs ayant consacré leurs travaux à ces méthodes. Dans ce courant se situe également l’association OPAL.

6. L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE

Les méthodes alternatives peuvent être prises en compte dans les enseignements supérieurs de deux façons : par l’information les concernant et par leur pratique.Selon leur domaine, certains de ces enseignements utilisent déjà, par exemple, documents audiovisuels et multimédia, simulations informatiques, maquettes anatomiques, imagerie bio-médicale, ainsi qu’initiation à la pratique de la culture cellulaire.Le programme de la « Formation spéciale à l’expérimentation animale » (cf. arrêté du 19 avril 1988 fixant les conditions d’attribution de l’autorisation de pratiquer des expériences sur les animaux) comporte 18 points dont l’enseignement est obligatoire, dont le point 2 : « développement des méthodes de substitution à l’expérimentation animale ». Un certain nombre de Masters professionnels ou recherche intègrent des enseignements sur les méthodes alternatives, dans certains cas dès la première année de M1 mais surtout en M2. Il s’agit essentiellement des spécialités de Master en toxicologie, en particulier dans la région parisienne : - M1 Biologie Cellulaire Physiologie Pathologie Paris Diderot et Paris Descartes. UE

Xénobiotiques et stress (Pr F. Marano), - M1 Médicament Paris Descartes (Pr R .Barouki), - M2 Toxicologie du Médicament Paris Descartes et Paris Sud (Pr P. Beaune), - M2 Toxicologie, Environnement, Santé Paris Diderot Paris Descartes, P12, Agro Paris

Tech (Pr F. Marano), - M2 Toxicologie des produits de santé Paris Descartes et Paris Sud (Pr M. Pallardy).

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7. LES COMMISSIONS EN CHARGE DE L’EXPÉRIMENTATION ANIMALE ET LES COMITÉS D’ÉTHIQUE• CNEA : La Commission Nationale de l'Expérimentation Animale

Cette Commission a été instituée auprès des ministres chargés de la recherche et de l’agriculture, en application du décret N°87-848 du 19 octobre 1987 relatif aux expériences pratiquées sur les animaux vertébrés (codifié ultérieurement dans les articles R. 214-116 et suivants du Code Rural). Elle regroupe des représentants de l’Etat, des représentants des milieux professionnels publics et privés et des représentants des associations de protection animale. Elle a pour mission (article R214-116 du Code rural) de donner un avis sur tout projet de modification de la législation ou de la réglementation relative à l’expérimentation animale et elle peut également être consultée par les ministres chargés de la recherche et de l’agriculture auprès desquelles elle est instituée pour donner des avis et faire toute proposition qu’elle juge utile sur différents items et en particulier la mise en place de méthodes expérimentales permettant d’éviter l’utilisation d’animaux vivants.

• CNREEA : Le Comité National de Réflexion Ethique sur l'Expérimentation Animale

Ce Comité a été créé en 2005 par les ministres chargés de la recherche et de l’agriculture sur proposition de la Commission nationale de l'expérimentation animale (CNEA). Le Comité national tire sa légitimité à la fois du décret fondateur et de sa composition : il est en effet constitué de représentants de la société civile (philosophes, sociologues, juristes), d’associations de protection animale, de représentants des professionnels de l’expérimentation animale, privés et publics, et de l’Etat. Il a pour mission d'émettre des avis sur les questions éthiques soulevées par l'expérimentation animale et d’harmoniser les principes et fonctionnements des différents Comités d’éthique. L’une de ses premières actions a été d’élaborer la Charte nationale portant sur l’éthique de l’expérimentation animale permettant une harmonisation de l’éthique en matière d’expérimentation animale dans notre pays. Elle a été publiée en 2008 et est disponible sur : http://www.enseignementsup-recherche.gouv.fr/cid28541/la-charte-nationale-portant-sur-l-ethique-de-l-experimentation-animale.html.

• Les Comités d’Ethique

Les Comités d’éthique en expérimentation animale sont des instances consultatives dont la mission est de donner des avis sur les projets qui leur sont présentés promouvant ainsi l’ensemble des principes et pratiques éthiques en expérimentation animale. Ils ont d’ores et déjà rédigé au sein du GRICE (voir point 4 ci-dessus) le Guide de l’évaluation éthique des études sur animaux, paru en janvier 2009, et qui a reçu l’approbation des ministères chargés de la recherche et de l’agriculture mais aussi la recommandation du CNREEA. Les Comités d’éthique se réorganisent dans notre pays pour mettre en application la Charte nationale.

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8. LE SECTEUR INDUSTRIEL

Il convient de souligner d’emblée que la plupart des démarches industrielles en terme de développement de méthodes alternatives en expérimentation animale s’inscrivent dans une échelle européenne voire internationale.

a) Les acteurs nationaux

• Les industries :Les industries développent ou améliorent en permanence des tests alternatifs à l’expérimentation animale afin de perfectionner leurs processus de screening ou de mieux appréhender les mécanismes d’actions de leurs molécules d’intérêt. Dans le cadre de la sélection d’actifs, les tests sont parfois miniaturisés pour être implantés sur des plateformes à haut débit (robots). Certaines sociétés françaises de prestation de service se sont spécialisées dans les méthodes alternatives et proposent des catalogues au niveau international. D’autres, à l’origine ne présentant que des expérimentations animales, ont ouvert des services spécifiquement consacrés aux tests alternatifs.

• Les Start-ups :

De jeunes entreprises issues des organismes nationaux (CNRS, INSERM, Universités) émanant de laboratoires privés à l’issue de remaniement de sociétés (rachats, restructuration, etc.) ont également été créées. Elles sont en général de petite taille et se consacrent à des thématiques précises.

• Les organisations professionnelles :

- LEEM (les entreprises du médicament)Les entreprises du médicament représentées par le LEEM réalisent près de 99 % de l'activité du médicament en France. Leur mission est de créer et de développer des médicaments et vaccins nouveaux à usage humain pour l'ensemble des maladies. Le rôle du LEEM consiste à élaborer et à faire respecter l'éthique de la profession, à faciliter les échanges entre ses membres, à défendre leurs intérêts et à resserrer les liens avec les autres professions de santé. Dans ce cadre, les entreprises du médicament contribuent à la recherche et au développement de méthodes alternatives et ont mis en place très précocement le principe des 3R dans leur processus de recherche et de développement de nouveaux médicaments et vaccins.

- FEBEA (Fédération des Entreprises de la BEAuté)La FEBEA promeut les méthodes alternatives auprès de ses adhérents mais aussi dans d’autres secteurs industriels par sa contribution à l’OPAL et au GIS «plateforme française pour le développement des méthodes alternatives en expérimentation animale» en participant aux groupes de travail COLIPA au niveau européen et à l’effort financier du COLIPA.

- UIC (Union des industries chimiques)L’UIC promeut les méthodes alternatives dans le cadre de sa participation au GIS « Plateforme Française pour le développement des méthodes alternatives en expérimentation animale ».

L’un de ses syndicats sectoriels, l’ASPA (Agents de surface et produits auxiliaires) et sa section INGRECOS (Ingrédients cosmétiques), soutient le développement des méthodes alternatives notamment en participant financièrement à divers travaux

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(ERASM, HERA, etc.) par le biais des fédérations européennes auxquelles ce syndicat est rattaché (EFfCI et CESIO).

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b) Les acteurs européens et internationaux

Les industriels français travaillent essentiellement dans un contexte européen et international et participent à de nombreux programmes de recherche dédiés aux méthodes alternatives.

• Les associations d’industriels

- COLIPA (European cosmetics association)Si des industriels prennent l'initiative en développant les technologies nécessaires, le Comité de liaison européen des industries cosmétiques, des produits de toilette et de la parfumerie (COLIPA) coordonne depuis 1992 les efforts de l’industrie dans ce domaine.

Le COLIPA a ainsi mis en place un programme de recherche sur les méthodes de substitution à l’expérimentation animale, en collaboration avec les organismes européens et les institutionnels, visant à soutenir la mise au point, la validation et l’acceptation réglementaire de ces méthodes. Plusieurs méthodes ont déjà été soumises à l’ECVAM pour validation, puis validées.Toujours au plan européen, l’industrie cosmétique, par l’intermédiaire de certaines industries et de certaines associations professionnelles, a rejoint en 2005 l’EPAA (European Partnership for Alternative Approaches to animal testing). Ce partenariat conduit par la Commission européenne, regroupe les compétences et les ressources nécessaires au développement et à l’acceptation réglementaire des méthodes alternatives.Au niveau international, le COLIPA travaille avec l’ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) aux Etats-Unis, mais aussi avec le Canada, le Japon et l’OCDE. Le COLIPA participe également à la promotion des méthodes alternatives au plan international, par exemple au sein de l’ICCR (International Cooperation on Cosmetic Regulation) ou encore par ses contributions au congrès annuel mondial sur les méthodes alternatives.

- EFPIA (European Federation of Pharmaceuticals Industries and Associations)EFPIA est l’un des acteurs majeurs des travaux de l’ICH visant à inscrire le concept des 3R dans les lignes directrices internationales relatives aux médicaments. EFPIA a notamment apporté une large contribution à l’abandon des tests de toxicologie aiguë conduits sur les petits rongeurs, dont la fiabilité est discutée pour tester les nouveaux médicaments avant qu’ils n’entrent en phase I d’essais cliniques chez l’Homme, ce qui représente environ 4% de la totalité des animaux utilisés en Europe.Par ailleurs un partenariat entre EFPIA et la CE a été constitué dans le domaine de l’innovation pharmaceutique, un programme nommé « Innovative Medicines Initiative, IMI » est dédié à la recherche de nouveaux médicaments mais également au développement des méthodes alternatives, que ce soit la recherche de biomarqueurs toxicologiques plus pertinents ou le développement des outils in silico/in vitro appliqués à ces nouveaux médicaments. Le deuxième appel d’offres qui sera lancé en octobre 2009 a choisi de se concentrer sur 5 domaines thérapeutiques (maladies métaboliques, maladies neurodégénératives, maladies inflammatoires, cancers, maladies infectieuses) appréhendés au travers de 5 axes majeurs impliquant les méthodes alternatives dont la pharmacologie prédictive, la toxicologie prédictive, l’identification et la validation des biomarqueurs.

73


- CEFIC : European Chemical Industry CouncilLe CEFIC a une longue tradition d'engagement dans le développement et le soutien de stratégies d'essais intégrés (ITS) pour les substances chimiques. Ces dix dernières années, le CEFIC a soutenu, par l'intermédiaire de son initiative LRI - Long Range Research Initiative (initiative de recherche à long terme) -, plusieurs projets en relation avec les approches alternatives aux essais sur animaux. Il s'agit, par exemple, des modèles prédictifs pour la toxicité pour le développement, d'une base de données de référence pour les facteurs de bioconcentration, d'une stratégie pour prédire une toxicité aiguë pour le poisson, de logiciels pour utiliser des QSARs ; parmi les nouveaux projets approuvés, certains concernent les perturbateurs endocriniens avec, entre autres, l'application des technologies toxicogénomiques en relation avec la reproduction masculine et une évaluation des effets endocriniens sur des organismes aquatiques.

• EPAA : European Partnership for Alternative Approaches

La Conférence sur les alternatives aux essais sur les animaux (« Alternative Approaches to Animal Testing – Europe Goes Alternative »), organisée à Bruxelles le 7 novembre 2005 a annoncé la mise en place d’un partenariat établi sur une base volontaire entre le Commission européenne et 7 secteurs industriels concernés (fabricants de denrées alimentaires, de produits agrochimiques, chimiques, pharmaceutiques et cosmétiques).Ce partenariat a pour objectif de collaborer efficacement sur la base d’un programme d’action définissant des priorités et actions concrètes pour promouvoir les méthodes de substitution aux essais sur les animaux et les faire accepter par les différentes réglementations. Cinq groupes de travail ont été constitués afin d’identifier les obstacles à l’acceptation réglementaire des méthodes et en particulier pour éviter les initiatives faisant double emploi, soutenir le développement et l’utilisation de méthodes innovantes, favoriser le dialogue et la communication entre les parties concernées, s’appuyer sur les bons résultats déjà obtenus par les différents partenaires.

En conclusion de cet aperçu des parties prenantes, il apparaît que, compte tenu du grand nombre d'acteurs impliqués dans la recherche de méthodes alternatives - industrie, milieux universitaires, pouvoirs publics et associations de professionnels et de défense des animaux -, les meilleures chances de succès résident dans la coopération et dans l'établissement de priorités clairement définies. Au regard de cette multiplicité des acteurs, le rôle de coordination des plateformes en Europe et du GIS en France prend toute son importance.

74

Axe de progrès On peut noter l’absence de la plupart des organismes publics de recherche français dans les programmes de recherche européens dédiés à la recherche et au développement des méthodes alternatives, en particulier du CNRS. Les réponses reçues des unités du CNRS dans le cadre de l’enquête mettent en exergue le manque de communication et de diffusion de l’information permettant aux équipes de connaître les financements spécifiques à ce domaine de recherche et de développement.


9. LA PLACE DES ACTEURS NATIONAUX DANS LES PROGRAMMES DE RECHERCHE EUROPÉENS

Vingt-trois programmes de recherche et de développement dédiés aux méthodes alternatives ont été financés par la Commission européenne au travers des 6ème (2002-2006) et 7ème PCRD ((2007-2012). Il faut noter que depuis 20 ans la contribution financière de la CE dans ce domaine est d’environ 200 millions d’euros.La France a participé à 11 programmes parmi les 23 et a été coordinatrice d’un seul d’entre eux (TOXDROP, CEA). La répartition privée/public de la participation des laboratoires français aux programmes européens de recherche et de développement est équilibrée (cf. figure ci-dessous).Bien que la participation des laboratoires français soit relativement importante (8.16%), il convient de noter qu’un seul laboratoire représente à lui seul près de la moitié des participations du secteur privé (4/10). Les laboratoires de recherche publique se répartissent de la façon suivante : INSERM = 5, Université = 5, CEA = 3, INERIS = 1. A noter également qu’une unité de l’INSERM représente à elle seule la plupart des participations de sa structure dans ces programmes européens (4/5).

Les programmes de Recherche et développement européens13 (FP6/FP7) :Participation des laboratoires français de recherche publique et privée

13 Alternative testing strategies AXLR8 - Progress Report 2011

75

LABORATOIRES PRIVES

10,5

LABORATOIRES PUBLICS

13,5

; 0%; 0%; 0%; 0%; 0%; 0%; 0%; 0%; 0%; 0%; 0%; 0%; 0%; 0%

Autres pays de l'U.E.(17 pays)

18%

Pays-Bas 6%

Suède 9%

Belgique 6%

Suisse5%

Allemagne 17%

France 8%

Italie 13%

Espagne 9%GB

9%


ETAT DES LIEUX DES METHODES ALTERNATIVES A L’EXPERIMENTATION ANIMALE

I- LE STATUT DES MÉTHODES ALTERNATIVES

▸ Rappel sur l’utilisation de l’expérimentation animale : (figure ci-dessous)

L’expérimentation animale reste majoritairement utilisée à des fins de recherche fondamentale (35%) et pour la recherche et le développement des produits de santé (24%) ainsi qu’au Contrôle Qualité des produits de santé destinés à l’Homme et à l’animal (22%)14.

14 Enquête sur l’utilisation d’animaux vertébrés à des fins expérimentales en France – Statistiques 2007 – Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche.

76

Production et contrôle qualité en médecine

vétérinaire6%

Diagnostic de maladie1%

Enseignement et Formation

3%

Essais toxicologiques et autres évaluations de la

sécurité6%

Production et contrôle qualité en médecine

humaine et dentisterie 16%

Recherche et développement en médecine humaine,

médecine vétérinaire et dentisterie

24%

Etudes de biologie fondamentale

35%Autres

9%

LES TENDANCES AU REGARD DE L’UTILISATION DES OUTILS DISPONIBLES ET DE LA MISE EN ŒUVRE DES STRATÉGIES DE RAFFINEMENT ET DE RÉDUCTION EN EXPÉRIMENTATION ANIMALE

Sur la base des données recueillies par le Ministère de la recherche et de l’enseignement supérieur et les réponses à l’enquête menée par le GIS, nous pouvons apporter les commentaires suivants :

Une stabilisation de l’utilisation des animaux à des fins expérimentales est observée Alors que sur la période de 1999 à 2007, la production scientifique a doublé tous les 3 ans, de 1990 à 2001, le nombre d’animaux utilisés en France chute de 3,60 à 2,21 millions. Cette forte diminution (39%) peut être attribuée en partie à la mise en application de la Directive 86/609/CEE qui a conduit :

• à un meilleur encadrement de l’expérimentation animale,• au développement de stratégies de réduction, • la mise en œuvre de travaux d’harmonisation au niveau international permettant d’éviter la duplication inutile d’essai (guidelines ICH), • La mise en place des Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF).

Ces données sur l’utilisation de l’animal à des fins expérimentales sont à mettre en perspective avec :

• Une augmentation significative des animaux aux fins de prélèvement de cellules, tissus ou organes, essentiellement destinés au secteur public pour la mise en œuvre de programme de recherche fondamentale (76%).(252 000 en 2001, 337 000 en 2004, 425 000 en 2007).

• Une augmentation significative de l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés (252 000 en 2004, 547 000 en 2007). Il s’agit essentiellement de modèles de souris (510 000 pour le secteur public, 37 000 pour le secteur privé) dont l’utilisation participe à la réduction de l’expérimentation animale.

Les stratégies de réduction de la souffrance des animaux ont été mises en place (« raffinement »)

Les principales stratégies retenues sont :l’usage d’anesthésiques, analgésiques et antalgiques,

- l’application des « points limites » c'est-à-dire euthanasier les animaux avant l’expression de la souffrance, une fois que les observations cliniques ont été observées,- le suivi post-opératoire,- les consignes vétérinaires,- l’utilisation de nombreuses techniques d’imagerie du petit animal (IRM, échographie, RMN, MRT, luciférase, etc.),- l’évaluation clinique et comportementale.

Les stratégies de réduction du nombre d’animaux utilisés ont été mises en place (« réduction »)

Les principales stratégies retenues sont :l’utilisation de méthodes statistiques, la culture cellulaire en amont de l’expérimentation animale,l’optimisation des protocoles,la réduction de la taille des groupes d’animaux dans les études,

- la mise en place de méthodes alternatives (environ 80% des laboratoires de l’INSERM et du CNRS qui ont répondu positivement sur ce point à notre enquête),

la réalisation de plusieurs analyses sur le même animal,la mutualisation des compétences et des outils (plateforme technologique),la modélisation mathématique.


77


▸ Cadre d’utilisation des méthodes alternatives à l’expérimentation animale

Dans le cadre de la recherche fondamentale et appliquée, les méthodes alternatives sont utilisable librement sans contrainte de standardisation. Ces méthodes peuvent être alors scientifiquement reconnues après leur publication et devenir un préalable à leur utilisation réglementaire, dans le processus de développement d’un nouveau médicament par exemple.

En revanche, une méthode alternative destinée à être utilisée dans un contexte réglementaire doit préalablement suivre un processus de validation visant à prouver sa pertinence scientifique selon des critères définis et offrir un niveau de sécurité équivalent à la méthode de référence utilisant l’animal.

▸ Les niveaux de reconnaissance ; de la validation scientifique à la validation réglementaire

Un essai ou une méthode peuvent passer par plusieurs niveaux de reconnaissance et de validation. Le concept peut être validé scientifiquement par les pairs. Une fois un procédé « industrialisé » pour un usage répétitif et mis en qualité, comme les tests de type Calux (réponse pas luminescence à la fixation des substances chimiques sur certains récepteurs) ou LAL (recherche d’endotoxine bactérienne dans un vaccin ou une solution parentérale ou un médicament injectable), il peut faire l’objet d’une norme (cf. normes CEN ou ISO pour des tests in vitro ou des méthodes chimiques) voire d’une certification ou monographie de la Pharmacopée européenne (LAL). En revanche, il n’y a pas aval d’une institution de type réglementaire. C’est à ce type de garanties de qualité que le règlement REACh se réfère quand il parle de méthodes « reconnues » par opposition à « validées ».

▸ Le processus de la validation par les instances réglementaires :

Les principales étapes du remplacement d'un test réglementaire existant par une nouvelle méthode ont été précisément définies par l’ECVAM European Centre for Validation of alternative Methods) (http://ecvam.jrc.it:European).

Les étapes du processus de validation sont :− l'élaboration de la méthode pour le test (généralement précédée d'une recherche

fondamentale), − la pré-validation, − la validation, − la révision par les pairs ou l'évaluation indépendante et, − l'acceptation au niveau réglementaire.

78

Axe de progrès : La nécessité de la mise en œuvre d’une étude de validation n’est pas à remettre en cause pour une méthode destinée à devenir réglementaire, cependant, plusieurs aspects du processus de validation doivent être améliorés si l’on veut aboutir à une utilisation plus efficace des méthodes alternatives. Ce processus de validation est complexe (plusieurs étapes, durée de l’étude (>10 ans)). La durée de ce processus n’est quelquefois pas compatible avec l’évolution de l’innovation et la réalité du marché. Ce processus est également très coûteux (le coût moyen d’une étude de validation est de 200 000 € par étude). Les méthodes ne sont pas toujours très applicables et appliquées.


Processus de validation reconnaissance réglementaire

Nombre d’années à minima

1. Les méthodes validées par les instances réglementaires

Dans le tableau joint en annexe 1 figurent les méthodes alternatives validées et adoptées par les différentes réglementations au niveau international à ce jour.

▸ Les méthodes substitutives applicables aux substances chimiques (tableau 1)

Des méthodes alternatives à l’expérimentation animale, validées 3R et approuvées par l’OCDE existent dans les domaines de la corrosion (3 tests) et de l’irritation cutanée (1 test) de l’irritation oculaire sévère (2 tests), de la photo-toxicité (1 test), pour évaluer les effets mutagènes et génotoxiques (6 tests), pour déterminer l’absorption cutanée (1 test) ainsi que pour évaluer un potentiel reprotoxique (1test). Ces tests de substitution, les seuls à être juridiquement acceptés au niveau communautaire, visent à totalement remplacer l’expérimentation animale pour les essais toxicologiques dans le domaine des substances chimiques et des produits cosmétiques.Ils sont très utilisés en France depuis plus de 10 ans par le secteur cosmétique, les industriels du domaine ayant largement contribué à la conception et à la validation de ces méthodes.Il est important de rappeler que la réglementation européenne appliquée aux produits cosmétiques impose l’interdiction de l’expérimentation animale sur le territoire européen alors que nous ne disposons pas encore de méthodes validées pour toutes les études toxicologiques nécessaires à l’évaluation de la sécurité des produits.

79

5+1+? 2+ 1+

Adoption réglementaireEEC/OCDE

Validation par groupe d’experts

Validationtechnique

Pré-validation

R&DOptimisation


Concernant la commercialisation de produits dont les ingrédients ont fait l’objet d’une expérimentation animale pour les tests de toxicités répétées sur animaux, une dérogation est accordée jusqu’en 2013, sous réserve que les essais soient réalisés hors de l’Union européenne. Il faut en outre rappeler que les pays en dehors de l’UE, non soumis à cette interdiction exigent la réalisation d’essais chez l’animal, y compris pour le produit fini.

Des stratégies de réduction de la souffrance des animaux et du nombre d’animaux utilisés ont été adoptées par l’OCDE pour évaluer une toxicité aiguë, la sensibilisation cutanée, la mutagenèse. Il n’existe pas à ce jour de méthodes ou stratégies alternatives à l’expérimentation animale dans les domaines de la repro-toxicité, des toxicités chroniques, de la cancérogenèse, domaines qui nécessitent la mise en œuvre de tests toxicologiques les plus consommateurs d’animaux (un seul test sur cellules adopté en septembre 2009 pour la détection des perturbateurs endocriniens de type oestrogénique). On notera toutefois le travail sur les essais de repro-toxicité pour limiter le nombre de situations où l’on suit deux générations de descendants.

Tableau 1 : Bilan des méthodes alternatives réglementaires appliquées aux substances chimiques (dont les ingrédients des produits cosmétiques). Ces méthodes font l’objet de Lignes Directrices (Test Guidelines, TG), identifiées par un Code international par l’OCDE.

Propriété étudiée Méthode(s) substitutive(s) Modèle utilisé

Mutagenèse/Génotoxicité

1. Essai de mutation reverse (TG OCDE 471)

2. Essai de mutation génique (TG OCDE 481)

3. Essai d’aberration chromosomique in vitro (TG

OCDE 473)

4. Essai in vitro de mutation génique (TG OCDE 476)

5. Essai in vitro d’échange de chromatides sœurs (TG

OCDE 479)

6. Essai des micronoyaux sur cellules (draft OCDE

487)

1. Bactéries

2. Bactéries

3. Cellules

4. Cellules

5. Cellules

6. Cellules

Reprotoxicité (perturbateur endocrinien)

Essai d’activation transcriptionnelle pour la détection de l’activité oestrogénique agoniste (TG OCDE 455)

Cellules

Corrosion cutanée 1. Essai de résistance électrique transcutanée (TG OCDE 430)

2. Essai sur modèle de peau humaine (TG OCDE 431)

3. Méthode d’essai in vitro sur membrane (TG OCDE 435)

1. Explant de peau de rat

2. Epiderme 3D

3. Membrane acellulaire

Absorption cutanée Méthode in vitro (TG OCDE 428) Explant de peau (humaine et de rat ex-vivo)

Photo-toxicité Essai de photo-toxicité 3T3 NRU (TG OCDE 432) Cellules

Irritation cutanée Essai sur modèle d’épiderme humain en cours d’adoption à l’OCDE

Epiderme 3D

Irritation oculaire Méthode ex vivo – BCOP (TG OECD 437) Cornée bovine

Méthode ex vivo – ICE (TG OECD 438) Œil isolé de poulet

80


▸ Les méthodes substitutives applicables au contrôle des produits de santé humaine et animale (tableau 2)

Les monographies de la Pharmacopée Européenne :

Un programme de standardisation biologique a été mis en place en 1994 par l’EDQM afin d’établir des standards appliqués au Contrôle Qualité des médicaments biologiques (vaccins, sérums, toxines, produits sanguins, produits biotechnologiques). Seize projets sur les 96 mis en œuvre dans le cadre de ce programme sont dédiés aux méthodes 3R, l’objectif final étant de publier les protocoles validés. Ainsi les méthodes suivantes sont l’objet de monographies de la Pharmacopée européenne en remplacement de l’animal :

Méthode substitutive Remplacement de : Produits concernés

Test de recherche d’endotoxines bactériennes (LAL) (2.6.14)*

Test des pyrogènes chez le lapin (2.6.8)

- Vaccins humains

- Produits sanguins

- Produits biotechnologies

- Antibiotiques

- Radiopharmaceutiques

Toxicité générale :

Suppression de tests inutiles si preuve apportée de la régularité de la production

Toxicité anormale chez la souris et le cobaye (2.6.9 et Monographie générale 0062) Test de recherche de substances• Histaminiques (2.6.8)

• Hypotensives (2.6.11)

- Vaccins humains et vétérinaires

- Produits sanguins

- Produits biotechnologies

- Antibiotiques

Tests de sécurité :

Test de toxicité sur culture cellulaire

Suppression de tests inutiles si preuve apportée de la régularité de production

Test d’absence de toxicité et d’irréversibilité de la toxine diphtérique chez le cobaye (Monographie générale 0443)

Test de toxicité spécifique tétanique et diphtérique sur cobaye

Test d’immunogénicité sur souris du vaccin polysaccharidique conjugué Haemophilus influenzae

- Vaccins humains

Tests d’activité* :

1. Quantification des antigènes

2. Test de contrôle d’activité du vaccin antivariolique sur culture cellulaire

1. Test sérologique d’activité du vaccin contre la poliomyélite (inactivé) chez le rat

2. Test de contrôle d’activité du vaccin antivariolique sur œufs

- Vaccins humains

Dosages physico-chimiques (HPLC)

Bioessais chez la souris - Hormones

Dosage de l’Antigène par ELISA dans le vaccin*

Tests sérologiques - Vaccins Hépatites A et B- Vaccin vétérinaire « New Castle Disease »

* Sous réserve de validation par le laboratoire désirant remplacer le test in vivo par le test in vitro

Tableau 2 : Bilan des méthodes alternatives réglementaires appliquées au contrôle de la qualité des médicaments d’origine biologique (Monographies de la Pharmacopée européenne).

81


Il est important de noter que les efforts d’harmonisation des pratiques en expérimentation au niveau européen et international, dans le domaine du médicament (travaux ICH) ainsi que le passage à des méthodes de production présentant moins de sources de risques ont permis de remplacer certains bioessais réalisés sur l’animal par des méthodes physico-chimiques, (ex : les protéines recombinantes). De même, le test de toxicité anormale destiné à identifier le défaut de fabrication d’un produit de santé est abandonné dans la plupart des cas grâce à la mise en place des Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF).

2. Les méthodes validées pas ou peu utilisées (cf. tableau annexe 1)

Certaines méthodes adoptées par les instances réglementaires ou validées sont de manière surprenante peu utilisées. Il s’agit essentiellement de méthodes qui sont destinées aux secteurs industriels (ex : test d’embryotoxicité : Embryonic Stem Cell Test, EST, validé par l’ECVAM). Cet échec a été constaté par les groupes de travail de l’EPAA. Plusieurs causes ont été identifiées :

- L’utilisation pratique de la méthode après la validation scientifique met en évidence une mauvaise prédictivité (taux de faux positifs/faux négatifs). En effet l’analyse rétrospective des résultats obtenus avec la méthode validée peut remettre en cause la pertinence du test,

- Ces méthodes ne sont pas adaptées aux exigences réglementaires, (Il convient dans le futur d’associer les autorités réglementaires en amont de la mise en place de la validation d’une méthode),

- Les méthodes adoptées par l’Europe (ECVAM, Pharmacopée européenne) ne sont pas toujours reconnues au niveau international (ex : vaccins, le test des pyrogènes chez le lapin est toujours exigé par les pays asiatiques).

3. Les méthodes non réglementairement validées et utilisées

Les méthodes qui n’ont pas suivi un processus de validation dans une perspective d’adoption réglementaire mais dont la pertinence scientifique et la robustesse sont suffisamment prouvées sont utilisées de diverses manières :

- méthodes utilisées en recherche fondamentale et appliquée à des études mécanistiques,- méthodes utilisées en association à d’autres méthodes complémentaires afin de couvrir

l’ensemble des effets observés chez l’animal suivi d’une extrapolation à l’Homme,- méthodes utilisées préalablement à celles utilisant l’animal afin de réduire son utilisation

ou de choisir les espèces se rapprochant le plus de l’Homme, par exemple pour l’étude du métabolisme hépatique ou des interactions médicamenteuses15 ou dans le cadre des stratégies intégrées préconisées par le règlement REACh),

15 US. FDA/CDER, Drug Interaction Studies-Study Design, Data Analysis and Implication For Dosing and Labeling- Guidance, September 2006.

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II- LES RÉSULTATS DE L’ENQUÊTE DU GIS (FRANCOPA)

Méthodologie de collecte de l’information : Elaboration du questionnaireUne stratégie a été mise en place afin de recueillir les informations permettant de faire un point de situation sur l’utilisation, la recherche et le développement des méthodes alternatives en expérimentation animale en France. Comme nous l’avons souligné dans la partie introductive de ce rapport, dans l’état actuel de la recherche scientifique, il convient d’inscrire les méthodes alternatives à l’expérimentation animale dans le concept plus large des 3R défini par Russell et Burch en 1959, (cf. 1ère partie).

Ainsi la stratégie de collecte des informations mise en place vise à interroger les secteurs privés et publics sur les pratiques de l’expérimentation animale, sur les moyens mis en œuvre pour diminuer le nombre d’animaux utilisés et enfin, sur l’importance du développement de méthodes alternatives.

A ces fins,

• Un questionnaire a été élaboré par le GIS en février 2009. Celui-ci a été transmis à des laboratoires des secteurs privés (industriels) ou à des organismes de recherche publics et à des organismes réglementaires impliqués dans l’expérimentation animale dans des domaines très variés tels que la chimie, la pharmacie, la cosmétologie ou l’agro-alimentaire. Le choix des destinataires a été effectué à partir d’une liste fournie par le Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche. Il s’agit des laboratoires ayant indiqué, dans l’enquête statistique trisannuelle, utiliser des animaux de laboratoire aux fins de prélèvement de cellules, tissus ou organes, pour mettre en œuvre des études in vitro. (cf. tableau 9 du rapport MESR).

Par ailleurs, ce questionnaire a également été diffusé par les sociétés savantes ou associations les plus impliquées dans domaine afin de recueillir les données des structures privées ou publiques qui mettent en œuvre des méthodes alternatives sans pratiquer les tests sur les animaux que ce soit dans le cadre d’activités de recherche ou d’activités réglementaires (ex : le secteur cosmétique).

Ce questionnaire comprend 3 grandes parties :- pratique de l’expérimentation animale,- utilisation pratique des méthodes alternatives, - programmes de recherche et de développement de méthodes alternatives.

Par ailleurs, les laboratoires des secteurs public et privé susceptibles de mettre en œuvre des programmes de recherche et de développement dédiés aux méthodes alternatives ont été sollicités par le Directeur du GIS par l’intermédiaire des Directeurs Généraux ou des représentants des fédérations membres du Comité Directeur du GIS. Il s’agit des structures suivantes : INSERM, CNRS, INRA, CEA, AFSSAPS, AFSSA, AFSSET, INERIS, INRS, LEEM, FEBEA, UIC.

83


Description de la population étudiée

103 établissements ont répondu au questionnaire. Ceux-ci se répartissent de la manière suivante :

44 parmi les 67 établissements figurant dans la liste provenant du MESR ayant indiqué dans l’enquête statistique trisannuelle, utiliser des animaux de laboratoire aux fins de prélèvement de cellules, tissus ou organes pour la mise en œuvre de tests in vitro.52 réponses émanant d’établissements (ou de scientifiques représentant un établissement) membres des sociétés savantes, les réponses se répartissant de la manière suivante : 22 réponses de membres de la SPTC, 17 réponses de membres de COSMED, 6 réponses de membres de la SFPT, 1 réponse de l’ARET et 6 réponses provenant d’établissements dont l’appartenance n’a pas été indiquée.7 réponses données par les Start-ups ou CROs (Contract Research Organisation) directement sollicités à partir de listes fournies par les experts du GIS. A noter que le nombre de réponses émanant de ce secteur d’activité est de 19, certains établissements appartenant à ce secteur ayant été sollicités au travers du listing du Ministère.

Il faut souligner que l’enquête a permis de déceler quelques laboratoires qui n’étaient pas recensés par le Ministère.

Les 103 laboratoires ont été répartis selon 3 critères :- appartenance public/privé,- secteur d’activité, - domaine d’activité.

84

Agences et Instituts réglementaires

3% Secteur public51%

Secteur industriel28%

CRO

START-UP 18%


31%

Autres14%

Enseignement et formation

18%

R&D de produits et appareils utilisés en

médecine et dentisterie humaine et en médecine

vétérinaire20%

Diagnostic10%

Production et contrôle qualité de produits et appareils utilisés en

médecine et dentisterie humaine

5%

Production et contrôle qualité de produits et appareils utilisés en médecine vétérinaire

2%


Répartition des laboratoires par secteur : public/privé

Le secteur public (laboratoires académiques et réglementaires) et le secteur privé (industries et prestataires de services : CROs, Start-ups) sont représentés de façon équivalente dans notre échantillon.

Répartition par domaine d’activité

On peut noter que la répartition par domaine d’activités des laboratoires qui ont répondu à notre enquête est comparable à celle qui figure dans le rapport du Ministère de la recherche (cf. les statistiques du Ministère). Cependant, le questionnaire n’ayant pas sollicité la totalité des acteurs dans le domaine, les données qui en sont issues doivent être lues comme des orientations générales prises par le tissu scientifique national dans le domaine des méthodes alternatives.

85


1. Les méthodes alternatives dans les pratiques courantes

La plupart des laboratoires interrogés (83%) déclarent avoir mis en place des méthodes alternatives depuis environ 10 ans en grande partie pour des études de biologie fondamentale (27%) ainsi que dans le domaine de la recherche et du développement de produits et appareils utilisés en médecine humaine et en médecine vétérinaire (21%). Il faut noter qu’un pourcentage élevé des méthodes citées dans les réponses (27%) correspond au domaine de la toxicologie réglementaire. Il est important de souligner que de nombreuses PME françaises, le plus souvent issues de la recherche publique sont spécialisées dans le développement et la commercialisation de méthodes alternatives, celles-ci représentent 18% des réponses à l’enquête. Ces CROs ou Start-ups16 partagent leurs activités entre la recherche et le développement de méthodes (par exemple dans le cadre des pôles de compétitivité) et la prestation de service pour répondre aux demandes réglementaires des industriels.

Répartition des laboratoires par domaine d’utilisation des méthodes substitutives à l’expérimentation animale

16 La liste des CROs et Start-ups interrogés est placée en annexe 5.

86


27%

R&D de produits et appareils utilisés en

médecine et dentisterie humaine et en médecine

vétérinaire21%

Toxicologie réglementaire27%

Production et contrôle qualité de produits et appareils utilisés en médecine vétérinaire

2%

Production et contrôle qualité de produits et appareils utilisés en

médecine et dentisterie humaine

5%

Diagnostic6%

Enseignement et formation

12%


Quatre-vingt-un pour cent des laboratoires qui déclarent développer des méthodes alternatives, indiquent utiliser ces méthodes en routine. Il s’agit essentiellement de méthodes basées sur des cultures cellulaires. Ces pratiques permettent de réduire de manière significative le nombre d’animaux utilisés (données qualitatives).

D’après notre enquête, il apparaît de façon surprenante que les méthodes alternatives qui figurent dans les réponses aux questionnaires sont essentiellement utilisées à des fins réglementaires (ligne directrice de l’OCDE).

Nous devons nous interroger sur la signification différente du terme « réglementaire » selon l’appartenance des laboratoires. En effet on constate une perception confuse des réglementations par les chercheurs : en particulier, on observe une confusion entre obligation réglementaire de mettre en œuvre des méthodes alternatives dans le cadre de la Directive 86-609 (valable dans tous les domaines de la recherche et de la R§D), études réglementaires (au sens des études soutenant par exemple les AMM ou la sécurité des produits) et enfin validation de méthodes alternatives s’appliquant aux études réglementaires (ex: ligne directrice de l’OCDE, monographie des Pharmacopées, Guidance ICH).

Un nombre important de ces méthodes (35%) utilisées en routine ou sont en cours de développement et de validation.

Statut des méthodes alternatives utilisées par les laboratoires

Réglementaire51%

Validée14%

En cours de validation

16%

En cours de développement

19%

87


MÉTHODES IN SILICO

MÉTHODE DÉVELOPPÉE/UTILISÉE DOMAINE D’APPLICATION

Méthodes QSARs - Modélisation informatique logiciel ex : DEREK Test de prédiction de la sensibilisation

Modélisation modèles PBPK Toxicologie, ADME

MÉTHODES IN VITRO


Peptide (test de réactivité peptidique) Test de sensibilisation

Cultures primaires et lignées cellulaires commerciales ubiquistes

Approches génomiques et protéomiquesCriblages à haut débit des molécules Etudes sur l’adipogénèse (3T3-L1)Tests de cytotoxicité préalablement aux tests sur animauxEtude de l’apoptose, dosage des cytokines, étude du stress oxydant, test de génotoxicité.

Imagerie - Puces à cellules Miniaturisation de tests cellulairesCriblage et effets de molécules

Cultures d’hépatocytes préparés à partir de foie humain (hépatectomie partielle) et espèces animales (rat, lapin, porc, etc.)

Etude du métabolisme HépatiqueEtude des inductions enzymatiques Etudes inter-espèces

Fractions microsomales hépatiquesEtude du métabolisme HépatiqueEtude des inductions, inhibitions enzymatiques (Cytochrome P450)

Lignée d’hépatocytes Hepa-RG

Etude des inductions enzymatiques et des interactions médicamenteuses Test de cytotoxicité et de génotoxicitéToxicogénomique, Métabonomique

Lignée d’hépatomes Etude du stress cellulaire (Apoptose, NF-Kappa B)

Culture et différenciation de cellules souches en cellules hépatiques Modèle pharmaco-toxicologie hépatique

Cellules CaCo2 Modèle de passage et de métabolisme intestinal

Culture de cellules dendritiques Test de prédiction de la sensibilisation

Modèles d’épiderme reconstruit Test de prédiction de l’irritation cutanéEtude du métabolisme de la peau humaine

Modèles de cornée reconstruite Test de prédiction de l’irritation oculaire

Système de co-culture cellules germinales/ cellules de Sertoli Modèle d’étude de la repro-toxicité

Cardiomyocytes humains Modèle d’étude de la cardiotoxicité

Culture de cellules pulmonaires Etude de la réponse inflammatoire

Lignées de cellules nerveuses Effets neurotrophiques et neuroprotecteurs des neuropeptides

Cultures primaires d’ostéoblastes Etude fondamentale du développement osseux

Culture en fibres creuses Diagnostic – production d’anticorps

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Les modèles alternatifs à l’expérimentation animale en France selon les réponses de l’enquête17. Ne figurent dans ce tableau que les méthodes qui ne sont pas utilisées dans un contexte réglementaire, ces modèles sont majoritairement développés par des laboratoires de recherche publics comme modèle d’étude mécanistique, par les Start-ups ou industries pour la recherche et le développement des produits de santé.

2. Les programmes de recherche en cours

Les programmes de recherche mis en œuvre par les laboratoires publics et privés nationaux figurent dans le paragraphe III « Les acteurs dans le domaine des méthodes alternatives de leur conception à leur utilisation » et dans l’annexe 4 (réponse complète des acteurs).

17 Ce tableau recense uniquement les méthodes qui ont été mentionnées par les laboratoires qui ont répondu à l’enquête du GIS. Un groupe de travail dédié procédera prochainement à un recensement exhaustif des modèles et méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

MÉTHODES EX VIVO


Foie perfusé isolé Etude du métabolisme hépatique

Culture d’explant digestif (slices)Explant de jujénum de rat Etude du passage intestinal

Explant de peau en cellule de Frantz Etude du passage cutané

Modèle de barrière hémato-encéphalique (co-culture de cellules endothéliales de capillaires cérébraux de bœuf et de cellules gliales de rat

Passage barrière hématoencéphaliqueEtudes de toxicité à haut débit

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III- LE CALENDRIER PROSPECTIF DES METHODES EN COURS DE DEVELOPPEMENT

▸ Le développement des méthodes alternatives à l’expérimentation animale dépend du type de recherche concerné :

- La recherche fondamentale a développé des méthodes alternatives consistant à isoler des systèmes – cellulaires ou organotypiques – pour l’analyse de mécanismes plus accessibles que dans un système intégré in vivo.

- La recherche appliquée a développé des méthodes alternatives sur le même principe mais pour l’observation d’un dysfonctionnement du système isolé soumis à des conditions d’exposition représentatives d’une réalité (environnement industriel ou populationnel).

- Une troisième recherche que l’on peut qualifier de pratique ou applicative a développé des méthodes alternatives sur le même principe mais pour la prédiction d’un danger pour l’organisme entier dont le système a été isolé.

▸ Ces trois types de recherche utilisent des méthodes similaires mais avec des approches différentes :

- La recherche fondamentale a une approche mécanistique pour laquelle le système isolé est placé dans des conditions qui amplifient le mécanisme considéré afin de mettre en évidence les interactions moléculaires, géniques, protéiques ou cellulaires sous jacentes.

- La recherche appliquée a une approche observationnelle pour laquelle l’exposition du système isolé est bien contrôlée afin d’observer les dysfonctionnements d’un mécanisme décrit par la recherche fondamentale lors de l’interaction avec des xénobiotiques ou leurs métabolites actifs. Un point important est alors l’extrapolation du dysfonctionnement observé à l’organisme entier.

- La recherche pratique a également une approche observationnelle pour laquelle les dysfonctionnements d’un mécanisme sont associés avec une prédiction du type niveau de danger x associé à une incertitude calculée, permettant une aide à la décision quant au niveau de protection nécessaire vis-à-vis de l’exposition aux xénobiotiques considérés.

▸ Les trois types de recherche sont fortement liés mais avec des critères et des calendriers de développement bien distincts :

- Ainsi la recherche fondamentale est développée en amplifiant un phénomène du système isolé qui n’existe peut-être pas dans l’organisme entier dans son environnement. La recherche fondamentale a également un temps de développement long dépendant de son caractère exploratoire de la molécule au tissu et des moyens technologiques disponibles au temps t.

- La recherche appliquée est mieux connectée avec les attentes de la population puisque supportée par une approche observatoire de l’exposition du système isolé dans des conditions proches d’une réalité. Son temps de développement est plus court car les systèmes utilisés sont souvent finalisés dans le cadre de la recherche fondamentale avec cependant le biais d’avoir un système finalisé par dopage exploratoire.

- La recherche pratique est, quant à elle, basée sur des critères de maîtrise de l’incertitude du résultat obtenu par une approche observatoire d’un système isolé. Son temps de développement est plus long que la recherche appliquée parce que l’utilisation de système issu de la recherche fondamentale nécessite une calibration importante pouvant conduire même à l’abandon du système trop biaisé par le dopage.

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D’autre part, le temps de développement de cette recherche est jugé trop long parce que ses outils doivent servir les directives et réglementations en cours qui ont imposé des délais.

▸ Il semble possible de distinguer 3 temps de développement des méthodes alternatives :

- Le temps de développement de systèmes isolés destinés à la compréhension des mécanismes biologiques et faisant diminuer le nombre d’animaux utilisés pour la recherche fondamentale. Ce temps est long et se compte en dizaine d’années.

- Le temps de développement de systèmes isolés applicables pour la compréhension du dysfonctionnement des mécanismes mis en évidence par la recherche fondamentale dans le cadre d’une exposition maîtrisée et proche d’une réalité. Ce temps est plus court car basé sur les outils de la recherche fondamentale pour autant que leurs critères de développement ne soient pas un biais pour l’application. Ce temps est inférieur à 10 ans.

- Le temps de développement de systèmes isolés capables de prédire un danger et un risque auquel un organisme ou une population est soumis(e) dans des conditions proches d’une réalité pour une aide à la décision. Ce temps peut paraître plus court car basé sur des outils de la recherche fondamentale. Cependant, les besoins de développement pour permettre la maîtrise de l’incertitude associée augmente ce temps à plus de 10 ans pour les systèmes intégrés les plus complexes (cancérogénicité, repro-toxicité, etc.).

Enfin, le temps de développement des systèmes isolés applicables et pratiques doit également être pondéré par le besoin de validation scientifique et réglementaire selon des critères définis qui peut représenter un temps important notamment au niveau réglementaire (cf. paragraphe « les méthodes validées »).

1. Au niveau national

Le développement de systèmes isolés dans le cadre de la recherche fondamentale pour l’alternative à l’expérimentation animale s’est fait selon deux schémas :- des raisons financières puisque dédouané des coûts d’accès à une animalerie,- la compréhension des mécanismes et la prédictivité des outils.Quelque soit le schéma, ces méthodes sont des candidats pour être une méthode alternative. Il est donc important de soutenir le développement de ces systèmes isolés avec une approche exploratoire afin de maintenir un vivier de candidats sans contraintes temporelles.

Actuellement, les meilleurs outils candidats sont d’ores et déjà valorisés dans des « spin offs » et « Start-ups » issus des laboratoires fondamentaux qui développent une recherche appliquée pour la mise à disposition de ces méthodes alternatives. Depuis une petite dizaine d’années ces sociétés ont su valoriser les outils de la recherche fondamentale et il est fort à parier que les prochaines années verront croître leur nombre. La contribution de la recherche fondamentale nationale au développement des méthodes alternatives est donc primordiale puisqu’elle part de la compréhension des mécanismes jusqu’à leur valorisation en passant par l’amélioration de leur prédictivité.

La recherche pratique est une demande forte au niveau industriel car directement en lien avec le règlement REACh notamment. Cette recherche est clairement multidisciplinaire avec des interactions fortes entre la biologie, la chimie, la toxicologie, l’écotoxicologie, les mathématiques notamment pour le développement de la biologie systémique. Les forces en présence au niveau national sont cependant faibles comme de nombreux rapports ont pu le

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constater (PNSE, Comités opérationnels du Grenelle de l’Environnement, etc.) ce qui limite le développement rapide de la recherche pratique dans notre pays. On peut estimer le développement d’outils pour des systèmes biologiques simples assez rapide (5 ans) pour ceux basés sur des approches QSARs (projet ANR CANTO). Une augmentation des forces en présence permettrait d’avancer dans le même temps sur des systèmes biologiques plus complexes comme la repro-toxicité et notamment dans le cadre d’un rapprochement entre laboratoires fondamentaux et appliqués.

A noter que des actions nationales permettent de soutenir les recherches pour le développement de méthodes alternatives : ANR, Post-Grenelle. En particulier les actions Post-Grenelle mettent en avant l’augmentation des forces en toxicologie et écotoxicologie et le transfert/valorisation des méthodes vers les industriels. Ces actions sont à renforcer et pérenniser avec un besoin de centralisation et non de dispersion.Des pistes sont données dans le rapport REACh réalisé en commun entre l’ARP ProREACh et l’expertise collective CNRS dont un extrait est donné ci-dessous : « Au terme de cet ouvrage et surtout au terme de 2 ans de travail collaboratif entre experts des différentes disciplines scientifiques, il ressort de nombreuses pistes de recherche qui, nous l’espérons, seront prises en compte par les commanditaires publics de ces travaux pour orienter leurs futurs appels à projets ou choix d’orientations scientifiques. Mais il nous semble important d’insister sur un aspect qui transparaît dans plusieurs contributions et qui est apparu clairement lors des discussions des groupes de travail. Au-delà des besoins particuliers à chacun des domaines scientifiques concernés, il y a un besoin important d’une approche systémique et d’actions transversales.Cette approche systémique n’est pas simple à développer dans un monde ou la transversalité ne fait pas partie du fonctionnement naturel des organisations. Le monde de la recherche n’échappe pas à cette tendance. L’accompagnement de la mise en œuvre du règlement REACh offre une opportunité de développer le dialogue entre les différentes disciplines scientifiques pour une plus grande efficacité sociétale de la recherche. Il s’agit également pour la Recherche d’être en position d’écoute des besoins industriels et de conseil pour les Instances Publiques. Des maillons entre Recherche, Industrie et Instances Publiques sont à construire ou renforcer comme le Pôle national Applicatif en Toxicologie Ecotoxicologie. Une dynamique dans ce sens s’est mise en place à travers l’expertise collective du CNRS et l’Atelier de Réflexion Prospective de l’ANR que nous avons co-animé de manière la plus transversale possible. Nous formons le vœu que cette dynamique perdure pour le plus grand bénéfice de tous notamment en contribuant à l’adhésion des acteurs de la Recherche, de l’Industrie et des Instances Publiques autour du principe de prédiction. Benoit de Guillebon APESA, Emmanuel Lemazurier INERIS, Bernard Sillion CNRS ».

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2. Contribution aux niveaux européen et international

La participation des équipes françaises au développement des méthodes alternatives au niveau européen et international reste faible mais toujours de grande qualité. Les « spin offs » et « Start-ups » sont souvent plus actives en s’engageant dans des programmes de recherche partenariale. Ceci s’explique par le fait que les actions européennes et internationales demandent dans la majorité des cas une approche applicative si ce n’est pratique. Les équipes françaises sont prêtes à entrer dans les programmes européens et internationaux. Ainsi, à l'occasion du 7ème congrès mondial sur les alternatives à l'utilisation des animaux en sciences de la vie, la Commission européenne (CE) a lancé un appel à propositions à hauteur de 25 millions d'euros (publication le 30 juillet 2009) et l’industrie cosmétique européenne, représentée par la COLIPA (l’association européenne de l’industrie cosmétique) s’est engagée à fournir le même montant.C'est donc environ 50 millions d'euros qui serviront à des projets de recherche visant à poser les fondements scientifiques d'essais d'innocuité future, et qui seraient, selon la CE, plus rapides et plus économiques que les expérimentations animales.L'appel à propositions porte plus précisément sur la « toxicité systémique à dose répétée18

». La Commission européenne attend notamment des propositions sur les sujets suivants :- le développement de dispositifs de simulations d'organes,- l'utilisation de cellules cibles d’origine humaine,- la définition de nouveaux seuils d'effet toxicologique et marqueurs intermédiaires, - des techniques de modélisation computationnelle,- l'exploitation d'approches développées en biologie des systèmes,- l'analyse intégrée des données et les services scientifiques.

Il est important de noter que seules les propositions n'impliquant pas d'essais sur les animaux vivants seront admissibles.Pour rappel, c'est le principe des 3R qui détermine l'action de l'UE dans le domaine. Ce principe se retrouve notamment dans plusieurs textes : la Directive sur les animaux utilisés à des fins scientifiques, le règlement REACh ou la Directive Cosmétique. La Commission évalue à 200 millions d'euros sur les 20 dernières années la contribution de l'UE à la recherche sur des méthodes de substitution financée par le PCRD.A noter également que le COLIPA encadre actuellement l’activité de groupes de travail sur la toxicité systémique, l’irritation oculaire, la tolérance cutanée (intégrant l’allergie), la génotoxicité, l’évaluation de la sécurité, et juridique/réglementaire répondant au 7ème

amendement de la Directive Cosmétique Européenne qui vont interdire la commercialisation en Europe de tout produit cosmétique contenant des ingrédients ayant été testés sur animaux. Dans le domaine de la génotoxicité, il œuvre à l’amélioration des tests existants afin d’éliminer les résultats faux positifs et de développer des outils permettant de les infirmer ou de les confirmer. Dans le domaine de l’irritation oculaire, le COLIPA co-sponsorise en collaboration avec l’ECVAM la validation de deux méthodes de tissus reconstruits. Au vue des enjeux des échéances de 2013, le COLIPA a lancé un large programme de recherche lié à la sensibilisation cutanée. En allergie cutanée, les recherches sont axées sur le développement de nouvelles méthodes reposant sur la compréhension des mécanismes cellulaires impliqués dans l’induction de l’allergie. En 2009, trois méthodes ont ainsi été présentées à l’ECVAM et font depuis l’objet d’une étude de prévalidation. L’industrie cosmétique est également associée au partenariat européen EPAA qui rassemble les industries chimiques, pharmaceutiques, cosmétiques ainsi que la Commission avec des efforts très importants sur des programmes de recherches visant à réduire puis supprimer l’utilisation d’animaux.

18 Programme SEURAT (2011-2015) – Towards the Replacement of in vivo Repeated Dose Systemic Toxicity Testing – Rapport 2011; www.seurat-1.eu.

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3. Structuration – Valorisation des méthodes alternatives

Afin de permettre l’émergence des méthodes alternatives utilisables si ce n’est validées, il apparaît clairement qu’il y a un besoin de fédérer les acteurs des différents types de recherche évoqués ci-dessus. Des actions importantes ont d’ores et déjà été mises en place comme le réseau ANTIOPES et le Pôle National Applicatif Toxicologie Ecotoxicologie. Ces actions permettent de mettre en relation les besoins des industriels et les outils de la Recherche fondamentale en les combinant pour proposer des stratégies intégrées. Le Pôle National Applicatif se positionne notamment comme maître d’œuvre dans le cadre de contrats de recherches partenariales avec les industriels.

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RESULTATS ET PROPOSITIONS

I. ENSEIGNEMENTS GENERAUX

Les enseignements portent aussi sur un certain nombre d’autres points qu’il paraît important de souligner ici car ils sont importants pour définir des axes et un calendrier de développement. Le premier constat qui doit guider la réflexion est la grande diversité des usages de l’expérimentation, de sorte que les modes de développements des méthodes 3R doivent être adaptés. Il existe une distorsion entre les efforts déployés et la littérature, les appels à projet, les bilans et les débats dans les domaines de la toxicologie et écotoxicologie, par rapport au nombre d’animaux utilisés de l’ordre de 10 % environ du total. Dans le domaine du contrôle, plus important quantitativement, des efforts importants sont aussi déployés, quoique moins connus du public ou même des scientifiques. En revanche les usages des animaux dans d’autres domaines non spécialisés, la recherche fondamentale sur le vivant et la recherche médicale et l’enseignement (de l’ordre de 60 à 70 % selon la façon de comptabiliser les « contrôles ») font l’objet de nettement moins d’efforts, bien que des méthodes 3R à déployer soient réelles et nombreuses. L’amélioration de la précision, de la rapidité, de la non-invasivité de ces outils contribue simultanément à l’amélioration des connaissances et à la réduction du matériel expérimental utilisé.

Un des défis du développement des méthodes alternatives est de réduire la distorsion entre l’effort (ou du moins, pour être rigoureux, l’effort visible) et l’ampleur du « gisement de réduction » auquel il faut s’attaquer pour réduire globalement l’utilisation de l’expérimentation. S’ajoute une difficulté supplémentaire car il n’est pas facile de recenser ce qui relève des 3R par rapport à l’avancée globale des moyens d’investigation du vivant dès lors qu’on s’écarte de la simple définition de la méthode « substitutive » au bioessai réglementaire (le premier des 3R).

Un autre défi est de réduire les délais de développement et mise en usage des méthodes. Les processus réglementaires sont parfois désignés comme responsables de la lenteur du déploiement. Il faut noter que des règlements comme REACh n’en font pas un point de passage obligé, et que des processus de validation scientifique, de normalisation et de certification ont une grande importance. La question peut être posée autrement, et renvoie alors à un déficit du passage de la recherche fondamentale vers les applications pratiques. Il convient donc de s’intéresser aux conditions matérielles à réunir, avec la mise en commun d’outils, de méthodes, de données de base et de résultats, et à l’articulation à créer entre les différents acteurs des secteurs privés et des secteurs publics pour passer d’un concept à une méthode disponible pour un usage de routine. C’est une logique de recherche translationnelle à mettre en place.

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II. VOIES D’AMELIORATION

Plusieurs axes de progrès ont été identifiés. Les recommandations faites ici visent à accélérer et fluidifier ces processus, dans l’objectif d’intensifier et faciliter l’application la plus rapide possible des 3R, intégrant une notion d’efficacité en termes de « gisement de réduction ».

Savoir désigner les expérimentations superflues

Bien qu’il s’agisse d’un impératif élémentaire, et d’une obligation légale, l’élimination d’expérimentations inutiles demande un savoir-faire complexe et partagé, Il ne suffit pas de « ne pas répéter » une expérimentation. Il faut reconnaître quand l’information pertinente est déjà accessible grâce à des résultats disponibles de nature proche. Il faut admettre que cette information peut être inutile par exemple quand l’exposition à une substance est impossible. Il faut être capable d’avoir des méthodes statistiques qui minimisent les essais et un processus qualité qui rende inutile la répétition des contrôles. Sans qu’il s’agisse d’un développement scientifique en soi, cette démarche est un préalable impératif.

1. Promouvoir les règles de dispense envisagées par les réglementations Lorsqu’un type d’exposition (par exemple inhalation pour un solide) n’est pas envisageable, lorsque la « somme des évidences » est suffisante, lorsque les données sur une substance suffisamment proche sont disponibles, l’industriel qui dépose un dossier peut (et devrait systématiquement) être dispensés d’essais (cf. réglementation REACh).

Cette position doit être la position de la France dans les instances internationales et la pratique dans les parties nationales des processus réglementaires, notamment pour élargir cette possibilité à d’autres réglementations.

Le GIS organisera une journée scientifique sur la dispense (waiving19). Il suscitera des rencontres inter-agences. Il veillera à faire connaître les initiatives européennes aux 4 piliers du GIS.

2. Accélérer l’optimisation des processus de contrôle et des protocoles d’essaiOptimisation des procédures statistiques, renforcement de l’assurance qualité des procédés, mise en œuvre séquentielle des essais dans les lots, font partie des approches développées (voir les bilans des évolutions sur la Pharmacopée, le descriptif des actions de l’AFSSA). Malgré un contexte fortement internationalisé, une action nationale est possible. Elle existe déjà et doit être encouragée. Les possibilités de coupler des essais de toxicités chroniques ou d’y intégrer les essais de toxicité aiguë dans les études des effets à long terme doivent être évaluées et encouragées et des recommandations proposées.Standardiser les modalités d’exposition des animaux (dose, nombre de doses, voies), les souches utilisées. Identifier et standardiser les techniques permettant la mise en place de protocoles optimaux en fonction de la question posée.

Le GIS identifiera de nouvelles approches qui pourraient faire l’objet d’une action de promotion pour permettre aux représentants Français de contribuer à l‘évolution des pratiques internationales.

19 En lien avec le GT sur le sujet au partenariat européen sur les approches alternatives. L’ECHA organise un séminaire le 11 février 2010.

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3. Accroître le recours aux simulations dans l’enseignement Les supports audio-visuels et les simulations informatiques doivent être utilisés quand l’enseignement est destiné à transmettre une connaissance théorique et voire à certaines étapes de l’apprentissage d’une pratique. Le MESR a passé commande à la CNEA (Commission nationale de l’expérimentation animale) d’un état des lieux sur l’utilisation des animaux d’expérimentation dans l’enseignement supérieur. Ce rapport fera une analyse des pratiques en cours et des efforts développés dans l’utilisation de ces simulations.

L’état des lieux réalisé par le ministère en charge de l’enseignement supérieur et de la recherche sera largement diffusé. Le GIS contribuera à sa diffusion, ainsi que celle d’éventuels bilans similaires de la part d’autres pays européens par ses adhérents et membres de commissions.

4. Dynamiser les dispositifs d’échange des résultats acquis, avec un Etat exemplaire Le système d’échanges de données prévu dans certaines réglementations au niveau européen doit servir d’exemple. Un système français doit être renforcé, entre opérateurs français dans l’industrie, et en mobilisant les acteurs de la Recherche. L’incitation à la publication des résultats y compris négatifs20, et une assistance juridique pour maîtriser ces échanges doivent être mise en place. L’Etat doit donner l’exemple par le rapprochement des équipes d’expertise réglementaires en France21 ou à tout le moins par la levée des obstacles à la communication des informations entre systèmes réglementaires.

Une analyse inter-agence sur les plans technique et juridique devra examiner les moyens de transfert des données entre systèmes d’instruction différents, dans le respect des cadres réglementaires européens sur les échanges et la confidentialité. Le GIS contribuera à connaître les vecteurs potentiels d’information sur les résultats négatifs (ex : HAL22 –diffusion informelle d’information, Journal of Negative Results etc.).

20 cf. le « Journal of Negative Results »21 Le GIS note que le rapprochement AFSSA-AFSSET doit permettre de partager les données sur

les réglementations « pesticides » et les biocides quand une substance est instruite en parallèle sous les deux réglementations.

22 HAL : Hyper Articles en Ligne

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Intégrer les méthodes alternatives dans l’enseignement des sciences de la vie

Il est recommandé que la formation des acteurs des sciences de la vie et de la santé soit intensifiée, et elle doit intégrer les méthodes alternatives. Au-delà, deux recommandations sont faites.

Pédagogie systématiqueLa portée et les limites scientifiques du modèle animal, la question de la souffrance et les méthodes alternatives doivent faire partie de la formation initiale des futurs professionnels des sciences de la vie (biologie, pharmacie, art vétérinaire, médecine, physiologie animale, agronomie, etc.), car ils peuvent tous se trouver en position de requérir ou utiliser l’expérimentation animale.

Les concepteurs des programmes d’enseignement devront intégrer ces aspects, et les autorités devront y veiller lors des habilitations.

Formations spécifiques Dans le programme de formation des professionnels de l’expérimentation animale (arrêté du 19 avril 1988), le point spécifique concernant les méthodes alternatives doit être mis à jour régulièrement.Les experts aujourd’hui en charge de la toxicologie et du contrôle devraient aussi suivre un enseignement spécifique23 sur l’expérimentation et les alternatives pour qu’ils jouent un rôle de moteur et non de frein dans le processus des 3R.

Un volet de formation professionnelle continue devra être monté et les agences et les opérateurs du domaine pourront s’appuyer sur cette formation pour renforcer la qualification de leur expertise sur ce point.

Orienter la Recherche vers des outils novateurs

7. Mettre comme objectif central le fondement scientifique des approches intégratives en toxicologie La Recherche doit viser à aller au-delà du remplacement un par un des essais sur animaux et permettre une évaluation globale du mécanisme de toxicité. Elle doit cibler les perturbations biologiquement significatives de mécanismes clefs d'une toxicité avec une démarche expérimentale couplant les nouvelles méthodes de modélisation mathématiques et un large ensemble de tests in vitro basés sur la biologie humaine (et non animale). Le GIS rejoint ici l’approche de long terme proposée par le National Research Council des Etats Unis. A court terme, il faut fournir un fondement scientifique plus solide aux méthodes de « regroupement de substances » (Read-Across), (La proximité entre deux substances peut-être définie soit à partir des structures soit à partir d’expériences mécanistiques in vitro ou ex vivo) et de « synthèse d’éléments de preuve » très efficaces pour la réduction, mais aujourd’hui objets de controverses. Ces avancées doivent s’appuyer sur les recherches sur les stratégies de tests intégrés (ITS) qui permettent de mettre en œuvre de manière séquentielle les outils disponibles pour évaluer l’efficacité ou la sécurité des substances et n’utiliser l’expérimentation animale qu’en dernier recours.

23 Notamment pour mieux comprendre et analyser la portée des nouvelles méthodes (approches intégratives par exemple) pouvant être utilisées dans l’évaluation de la sécurité.

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8. Identifier les besoins de recherche et développement de méthodes alternatives Le recensement initié ici des méthodes disponibles en France ou à l’étranger, des concepts qui pourraient être développés et des besoins doit être poursuivi et donner lieu à un bilan annuel.Un accent doit être mis sur les domaines orphelins pour lesquels il n’y a pas encore de méthode validée ou même en développement comme certains domaines de toxicologie et écotoxicologie (perturbateurs endocriniens, expositions répétées), et ceux ciblés par les travaux de recherche pour la Commission européenne (ex : Predictomics, ReProtect). Les domaines de recherche plus amont, où la demande est mal exprimée ou peu formalisée ne doivent pas être omis.Un accent doit être mis sur les domaines d’excellence où les perspectives de recherche nationales peuvent être mieux valorisées.

Le GIS suggère une démarche de type atelier de réflexion prospective (ARP) permettant de structurer et financer une première action de ce type. Elle profitera d’une synergie avec les travaux d’ECOPA.

9. Mettre en place des programmes incitatifs dans le domaine des 3R Des programmes incitatifs, en particulier auprès de l’ANR, devront mieux soutenir les avancées sur les 3R. Il s’agit notamment des domaines suivants : soutien au développement des méthodes non invasives chez l’animal avec notamment les développements en imagerie (en couplant les imageries humaines et animales), mais aussi les marqueurs, transposabilité des modèles animaux à l’Homme (modèles pathologiques, humanisés, etc.), modèles in vitro cellulaires et modèles d’organes et organes bio-artificiels, biomarqueurs (cf. marqueurs d’effet précoces), modèles prédictifs in silico, méthodes analytiques et bioanalytiques, sans omettre les simulations à visée d’enseignement et surtout la compréhension de la douleur animale et de ses modes de réduction.

L’application de la règle des 3R devra figurer parmi les critères d’évaluation des projets en biologie et santé, dans le cadre de l’ANR et dans les autres cadres de financement de la Recherche. Le GIS propose aussi d’ouvrir des ARP sur les sujets des alternatives.

Construire une infrastructure de recherche finalisée

Les laboratoires de recherche développent des modèles susceptibles de remplacer ou de réduire l’expérimentation animale, parfois dans ce but, plus souvent comme des méthodes originales permettant d’aborder d’autres questions que les études in vivo. Il faut structurer la Recherche pour faciliter cette démarche, mais aussi construire une dynamique de transfert de ces méthodes vers une application industrielle et réglementaire. Ceci requiert d’aborder la question de la valorisation de la recherche appliquée, des cloisonnements entre recherches publique et privée, mais aussi entre disciplines (toxicologie, médecine, etc.) et entre secteurs industriels (pharmacie, chimie, etc.). Les propositions ci-après sont faites au moment où se déroulent les discussions sur les laboratoires de référence nationaux et le rôle d’un laboratoire européen associé. Ces propositions devront éventuellement être ajustées une fois la nouvelle Directive remplaçant la Directive 86/609 adoptée.

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10. Créer un INFOCENTRE pour faire connaître les actions et partager les résultats entre les différents secteurs Un site internet interactif dédié doit offrir des possibilités d’échange (forum), « une newsletter », des liens utiles, la liste des questions fréquentes et des réponses. Il doit mettre à disposition les résultats, y compris négatifs, sur les différentes substances. Il doit identifier et faire connaître les méthodes alternatives disponibles y compris en dehors des domaines de la toxicologie et du contrôle, de même que les acteurs impliqués, les outils d’enseignement etc.Il doit faire connaître les organismes européens (ex : ECVAM, EPAA, ECOPA), dédiés aux méthodes alternatives, et les programmes mis en œuvre sur ce sujet. Cet Infocentre pourrait de plus aider les Comités d'éthique dans leur évaluation du respect de la règle des 3R.

Il sera en lien avec celui d’ECOPA, mais devra néanmoins s’appuyer sur une infrastructure opérationnelle dotée de moyens propres.

11. Mettre en place un système de recherche translationnelle appuyé sur un réseau de ressources La chaîne passant de l’identification du concept, sa validation, la mise au point de protocoles et procédés, le transfert à des développeurs et à des opérateurs pionniers (Start-ups) doit être structurée. Elle doit s’appuyer sur la mise en partage de ressources : bases de données sur les QSARs, Omics, plateforme de calcul, plateforme d’analyse haut débit, moyens d’essais in vitro et in vivo. Elle doit rassembler des partenaires industriels, la recherche amont et la recherche appliquée.Elle doit se structurer à partir de réseaux de recherche autour de cette finalité, d’un pôle applicatif rassemblant des équipements, et de systèmes de fondations pour assurer le développement de l’innovation.

Les instances de structuration de la recherche en santé et en santé environnement devront veiller à l’efficacité de ce système.

12. Créer un centre pour garantir la qualité des méthodes (normalisation, certification volontaire, etc.)La France doit disposer d’une structure permettant aux développeurs de procédés et d’outils, qu’il s’agisse de toxicologie, de contrôle, d’investigation ou de toute autre application, d’obtenir un label de qualité pour que ces méthodes soient reconnues au niveau international sous l’angle de la pertinence scientifique mais aussi de l’assurance qualité. Ce point de passage est un atout dans certaines logiques réglementaires (cf. REACh), même s’il ne suffit pas toujours. Mais il l’est aussi pour l’utilisation dans les publications scientifiques ou toute autre application. Le centre doit disposer ou mettre en réseau des moyens d’essai. Il procède par l’organisation d’inter-comparaisons, in vitro, mais aussi in silico, ou en imagerie. Il s’inscrira dans les réseaux européens et non-européens.

Le développement du pôle applicatif sur la toxicologie et l’écotoxicologie prédictive devra être soutenu, ainsi que les réseaux de recherche sur le sujet.

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13. Structurer le pilotage de la validation réglementaire Pour organiser la « validation réglementaire » de méthodes, la coordination des représentations de la France au sein des différents systèmes réglementaires devra être structurée en fonction du contour final du système européen.Le GIS note que la fusion de la démarche réglementaire et de la démarche précédente n’est pas forcément opportune, notamment parce que la participation des industriels n’est peut être pas la même dans les deux cas. La distinction des deux démarches permet aussi de lever la confusion sur la notion de validation.

Les autorités en charge des diverses réglementations devront mettre en place une coordination et pourront s’appuyer sur le GIS pour construire le dialogue avec les 4 partenaires du GIS.

14. Soutenir le développement d’un réseau d’opérateurs au sein des pôles de compétitivité industriels La France doit développer l’évaluation toxicologique à haut débit, comme cela se fait dans d’autres pays européens, et en particulier en ce qui concerne l’automatisation des nouvelles approches toxicologiques (QSARs, Omics) est indispensable pour répondre aux nouvelles exigences réglementaires. La mise en place d’un maillage de mini plateformes automatisées permettra de répondre à la demande des petites et moyennes structures qui actuellement sont tentées de faire appel aux prestataires étrangers mieux organisés.

Les opérateurs des pôles de compétitivité seront en charge de cette intégration.

15. Intégrer la démarche aux stratégies nationales de recherche Le besoin de méthodes 3R doit être intégré dans la conception de la stratégie nationale sur la toxicologie et l’écotoxicologie24 que pilote aujourd’hui le ministère en charge de la Recherche en application des recommandations dans le domaine (Programme National Santé Environnement, Comité Opérationnel « Recherche » du Grenelle de l’Environnement, loi Grenelle 1). Les propositions en cours (pôles applicatifs, renforcement de l’enseignement, structuration régionale et structuration des plateformes et plateaux techniques) fournissent un cadre avec lequel le GIS estime que ses propositions doivent s’articuler. Ces méthodes, y compris celles qui ne relèvent pas de la toxicologie, doivent aussi être intégrées à la stratégie du domaine de la santé, par exemple en lien avec le développement de l’alliance nationale pour les sciences de la vie et de la santé et à la structuration associée au grand emprunt.

24 cf. Rapport du groupe de travail sur la stratégie nationale en toxicologie et écotoxicologie.

101


Définir des politiques par domaine et évaluer leur avancement

16. Cibler et construire des politiques sectorielles en fonction du potentiel de réduction Des plans d’action doivent être définis en fonction du potentiel de réduction du recours à l’expérimentation animale, dans le cadre d’une définition précise des secteurs d’utilisation. Il pourra s’avérer nécessaire d’affiner les définitions des secteurs tels que définis à ce jour dans les protocoles d’enquête.Ces stratégies et objectifs, fonction des spécificités de chacun des secteurs reposent sur :

- Le recensement des utilisations d’animaux selon ces secteurs ;- Le recueil de l’information sur le développement des méthodes alternatives par secteur.

Les autorités en charge de l’expérimentation animale seront les pilotes de cette action.

17. Construire une nomenclature des méthodes alternatives pour permettre leur recensement.Des définitions claires et partagées doivent permettre de repérer les méthodes alternatives, alors que leur recensement est aujourd’hui très difficile, notamment quand il s’agit de catégoriser les recherches amont qui ont un potentiel pour le développement des méthodes 3R. Elles sont assez aisées en ce qui concerne les méthodes de remplacement pour le contrôle et la toxicologie-écotoxicologie. Elles doivent être étendues aux méthodes de réduction et raffinement dans ces domaines. Elles doivent être définies pour les domaines de la recherche et de l’enseignement.

Un travail dans le cadre d’ECOPA est envisagé, et la plateforme française pourra y jouer un rôle majeur.

18. Mieux connaître les usages de l’expérimentation animale afin d’identifier des cibles pour sa réduction L’enquête sur les pratiques doit être renforcée. L’exercice mené pour ce rapport ayant montré les limites actuelles. Elle doit être plus précise pour mettre au point des politiques sectorielles évoquées ci-avant. Elle doit fournir une connaissance fine des pratiques en expérimentation animale et en méthodes alternatives en France et identifier les acteurs majeurs du domaine. Des voies d’amélioration sont à suivre : - Etablir un questionnaire capturant la variété des situations d’un domaine

extrêmement vaste,- Garantir l’anonymat des réponses, - S’adapter à la multitude et la diversité des structures publiques concernées.

Le pilotage serait réalisé par le Ministère de la recherche en lien avec le Ministère de l’agriculture.

102


CONCLUSIONS et PERSPECTIVES

Le présent travail constitue une première analyse sur le sujet. Le GIS s’est réjoui de la participation active des acteurs impliqués et notamment de la mobilisation d’instituts de recherche, d’EPICS et d’agences.Le sujet ne saurait pour autant être clos, car de nombreux points n’ont pas été abordés. Le rapport ne traite pas au fond de la pertinence de telle ou telle méthode, étude laissée aux futurs centres envisagés en Europe. Autre faiblesse, le GIS n’a pas pu avancer sa réflexion au point de donner des horizons temporels pour la mise au point des différentes méthodes, alors que ceux-ci peuvent aller de quelques années à des décennies selon les sujets. L’intérêt suscité par le sujet auprès des scientifiques rencontrés, qui fait suite au succès de la mise en place du GIS, montre une réelle mobilisation sur ces sujets. Cette mobilisation vient certainement d’une montée des préoccupations éthiques au sein de la communauté scientifique. Elle vient aussi du fait que le développement de ces méthodes s’appuie et suscite des avancées importantes dans la compréhension des mécanismes du vivant, avancées elles-mêmes rendues possibles par les nouveaux outils d’investigation disponibles aujourd’hui.

La présente analyse montre à quel point le développement des méthodes s’intègre dans le développement des connaissances sur le vivant. En particulier dans le domaine de la toxicologie, les méthodes alternatives génèrent des impératifs de développement de connaissance, et cette problématique constitue un moteur important pour dynamiser les recherches dans ce domaine. La préoccupation entre en synergie de façon remarquable avec la démarche de structuration de la toxicologie et de l’écotoxicologie. La bonne coïncidence des efforts de structuration doit être soulignée.

Cette même coïncidence s’observe avec la dynamique mise en place dans le domaine des sciences de la santé.

Ainsi, on ne saurait plus aujourd’hui considérer le développement de ces méthodes comme une démarche isolée du reste de la démarche de développement des connaissances, qu’il s’agisse de toxicologie, de biologie, de thérapie.

Le GIS entend accompagner cette démarche globale et œuvrer à approfondir cette interaction entre développement scientifique et applications en termes de méthodes alternatives, et à faciliter le passage des développements amont aux applications. Toutefois, le GIS, dans l’esprit des plateformes rassemblées dans ECOPA n’est pas uniquement un lieu d’échange scientifique. Il se doit de rappeler que l’alternative en expérimentation animale ne relève pas uniquement de percées scientifiques, mais que la généralisation des bonnes pratiques et la circulation de l’information ont aussi leur part.

Il entend dans l’avenir s’associer aux moyens qui seront mis en place pour assurer le suivi de la mise en place des méthodes et des recommandations émises.

Bien évidemment, après avoir souligné les limites du travail effectué et avoir fourni des éléments pour son amélioration, le GIS juge souhaitable d’actualiser le bilan réalisé.

103


LES ANNEXES

1. LES MÉTHODES RÉGLEMENTAIREMENT VALIDÉES AU 31 DECEMBRE 2009

2. LE QUESTIONNAIRE

3. LES PROGRAMMES EUROPÉENS PCRD DÉDIÉS AUX MÉTHODES ALTERNATIVES

4. LES RÉPONSES DES ACTEURS À L’ENQUÊTE DU GIS

5. LA LISTE DES CROS ET START-UPS INTERROGES DANS LE CADRE DE L’ENQUÊTE DU GIS

6. LE GLOSSAIRE

104


ANNEXE 1

LES MÉTHODES RÈGLEMENTAIREMENT VALIDÉEShttp://ecvam.jrc.it/

http://iccvam.niehs.nih.gov/

105


106


107


108


109


110


111


112


113


114


115


116


117


118


ANNEXE 2

LE QUESTIONNAIRE

119


QUESTIONNAIRE ÉLABORÉ POUR L’ENQUÊTE DU GIS

120


121


122


ANNEXE 3

LES PROGRAMMES EUROPEENS PCRD DÉDIES AUX MÉTHODES ALTERNATIVES

123


ALTERNATIVE TESTING STRATEGIESPROGRESS REPORT 2009

REPLACING, REDUCING AND REFINING USE OF ANIMALS IN RESEARCH

EUROPEAN COMMISSIONDIRECTORATE-GENERAL FOR RESEARCH

HEALTH BIOTECHNOLOGY

▸ CELL-BASED TECHNOLOGIES

ReProTectDevelopment of a novel approach in hazard and risk assessment of reproductive toxicity by a combination and application of in vitro, tissue and sensor technologies

VITROCELLOMICSReducing animal experimentation in preclinical predictive drug testing by human hepatic in vitromodels derived from embryonic stem cells

MEMTRANSMembrane transporters: in vitro models for the study of their role in drug fate

EXERADevelopment of 3D in vitro models of estrogen-reporter mouse tissues for the pharmaco-toxicological analysis of nuclear receptors-interacting compounds (NR-ICs)

INVITROHEARTReducing animal experimentation in drug testing by human cardiomyocyte in vitro models derived from embryonic stem cells

LIINTOPOptimisation of liver and intestine in vitro models for pharmaco-kinetics and pharmacodynamics studies

ARTEMISIn vitro neural tissue system for replacement of transgenic animals with memory/learning deficiencies

ESNATSEmbryonic stem cell-based novel alternative testing strategies

Integrated testing strategies

ACuteToxOptimisation and pre-validation of an in vitro test strategy for predicting human acute toxicity

▸ - BIOINFORMATICS AND COMPUTATIONAL BIOLOGY

PredictomicsShort-term in vitro assays for long-term toxicity

Sens-it-ivNovel testing strategies for in vitro assessment of allergens

124


CarcinoGENOMICSDevelopment of a high throughput genomics-based test for assessing genotoxic and carcinogenic properties of chemical compounds in vitro

PREDICT-IVProfiling the toxicity of new drugs: a non animal-based approach integrating toxico dynamics and biokinetics

▸ COMPUTATIONAL MODELLING AND ESTIMATION TECHNIQUES

OpenToxPromotion, development, acceptance and implementation of QSARs (quantitative structure activity Relationships) for toxicology

▸ HIGH THROUGHPUT TECHNIQUES

TOXDROPInnovative ‘cell-on-chip’ technology to screen chemicals for toxicity, using cultured cells withintiny ‘nanodrops’ of culture fluid

COMICSComet assay and cell array for fast and efficient genotoxicity testing

NanoTESTDevelopment of methodology for alternative testing strategies for the assessment of the toxicological profile of nanoparticles used in medical diagnostics

▸ FORUMS AND WORSHOPS

CONAMConsensus networking on alternatives within Europe

SCARLETStructure-activity relationships: experts’ workshop in mutagenicity and carcinogenicity

ForInViToxForum for researchers and regulators to meet manufacturers of toxicology test methods

InViToPharmaWorkshop on the need for in vitro toxicity tests within the pharmaceutical industry

▸ DEFINING THE STATE OF THE ART OF 3R

START-UPScientific and technological issues in 3Rs alternatives research in the process of drug development and Union politics

▸ TRANSITION TO A TOXICITY PATHWAY-BASED PARADIGM

AXLR8Accelerating the transition to a toxicity pathway-based paradigm for chemical safety assessment through internationally co-ordinated research and technology development

FP7-HEALTH-2010-Alternative-TestingA possible strategy for the replacement of animals in repeated dose systemic toxicity testing.

125


ANNEXE 4

LES REPONSES DES ACTEURS A L’ENQUÊTE DU GIS (FRANCOPA)

- INSERM- CNRS- INRA- CEA- AFSSAPS- INERIS- INRS- AFSSA - AFSSET

126


ENQUETE SUR LES METHODES ALTERNATIVES/SUBSTITUTIVESréalisée par François Lachapelle*, chef de mission

à la demande de André Syrota

Il y a eu 498 questionnaires adressés aux formations de recherches, IFR, CIC, ESPRI, AVENIR, ERI et 131 réponses soit 26,30 %.

Institut thématique de rattachement :

29 29 19 17 15 12 11 8

0

5

10

15

20

25

30 Neurosciences, neurologie, psychiatrie

Circulation, métabolisme, nutrition

Technologie pour la santé

Immunologie, hématologie, pneumologie

Génétique et développement

Maladies infectieuses

Cancer

Santé publique

Finalité de la recherche :

104 42 16 11 90

20

40

60

80

100

120Recherche fondamentale

Recherche et développement deproduits et appareils utilisés enmédecine humaineEnseignement / Formation

Diagnostic

Essais toxicologiques et autresévaluations de sécurité

127

INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ ET DE LA RECHERCHE MÉDICALE - INSERM

Nb de réponses

Nb de réponses


A. Pratique de l’expérimentation animale

Sur les 131 réponses reçues, 108 formations de recherche (tout confondu) pratique l'expérimentation animale soit 82,44 %.

• Espèce(s) utiliséesSo

uris

90

Rat

s 53

Lapi

ns 1

0

Prim

ates

9

Ham

ster

s 4

Pois

sons

3

Porc

3

c.el

egan

s 2

Cob

aye

1

Ger

bille

1

Cha

ts 1

Ovi

ns, c

aprin

s 1

Bre

bis

1

Rat

s du

Nil

1

01020

3040

5060

708090

• Stratégie(s) mise(s) en place permettant de réduire la souffrance des animaux (refinement) : 76,85 % de réponses positives

Principales stratégies retenues (nombres de réponses)

Anesthésie (59)analgésie/antalgique (30)points limites (12)euthanasie (11) Comité d'éthique (8)

Diverses stratégiessuivi post-opératoire (4)consignes vétérinaires (2)imagerie(2)suivi clinique (2)Evaluation cliniques et comportementales (2)sensibilité à la douleur avant expérience (1)Ne pas refaire ce qui est déjà fait (1)pre/peroperatoire (1)limitation des adjuvants (1)Pompe osmotique (1)formation et sensibilisation personnel sur éthique (1)Vecteurs viraux (1)Réduction de jeûne (1)Biopsie pour génotypage oreille (1)Enrichissement du milieu et entrainement à coopération (primates) (1)

128

Nb de réponses


• Stratégie(s) mise(s) en place permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés (reduction) : 65,74 % de réponses positives

Principales stratégies retenues (nombres de réponses)

Méthodes statistiques (adaptées non paramétrées, multifonctionnelles, analyse …) (21)culture cellulaire (12)Imagerie (9)optimisation des protocoles (6)Réduction taille des groupes (6)

Diverses stratégiesMéthodes alternatives (2)Plusieurs analyses sur le même animal : (2)Concertations avec expérimentateur pour meilleur technique (2)Réutilisation de souris transgéniques (1)CE (1)modèle animaux : (1)KO : (1)

• modèle in vitro de progression tumorale (1)mesures hémodynamiques invasives et non invasives (1)Mutualisation (1) bioinformatique (1) Euthanasie (1) mise à disposition des tissus (1)microscopie intravitale (1)Réalisation d'expérience pilotes pour calculer le nb optimal d'animaux à utiliser dans chaque test (1)Préférence matériel humain (1)Conception de recherche à l'aide du département de biométrie (1)

• Discussion avec AFSSAPS, l'EMEA, FDA (1) ponction moelle osseuse pour suivi greffe (1) Gestion élevage lors de la purification fond génétique (1)Reproduction ciblée et organisation des études phénotypiques (1)biomateriaux (1)Télémétrie (1)analyse comportementale (1) Fetal gonadal essay FEGA (1) modélisation mathématique (1)coût (1)

129


• Moyens consacrés à l’expérimentation animale :

14,8

9%36

,17%

19,1

5%14

,89%

4,26

%

4,26

%4,

26%

2,13

%

44,4

4%30

,16%

6,35

%4,

76%

3,17

%1,

59%

3,17

%

27,7

8%

30,5

7%13

,89%

6,94

%

11,1

1%5,

56%

13,8

9%

2,77

%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

Budget annuel Budget équipem ent Budget fonctionnem ent

jusqu'à 10 k€ de 11 à 30 k€ de 31 à 50 k€ de 51 à 70 k€de 71 à 90 k€ de 91 à 120 k€ de 121 à 160 k€ de 161 à 500 k€

• Nombre de personnes impliquées :

moins de 5 personnes

de 5 à 10 personnes

de 11à 15 personnes

de16 à 20 personnes

et plus de 20 personnes

33,68 % 34,74 % 12,63 % 8,42 % 10,53 %

130


B. Méthodes alternatives utilisées dans votre formation de recherche (replacement) :

a) Méthodes pouvant être considérées comme substitutives

• Méthodes mises en place

SeulesNb réponses %

En remplacementNb réponses %

En complémentNb réponses %

Totaux

In Vitro

Cultures primaires animalesCultures primaires humainesLignées cellulaires animalesLignées cellulaires humainesCellules souches animalesCellules souches humainesTranches de tissusOrganes isolés

86

1613141835

116

17,30 %

3,22 %2,62 %2,82 %3,62 %0,60 %1,01 %2,21 %1,21 %

63

148

12134642

12,68 %

2,82 %1,61 %2,41 %2,62 %0,80 %1,21 %0,80 %0,40 %

257

553058521682414

51,72 %

11,07 % 6,04 %11,67 %10,46 % 3,22 % 1,61 % 4,83 % 2,82 %

81,69%

17,10 %10,26 %16,90 %16,70 % 4,63 % 3,82 % 7,85 % 4,43 %

In Silico

Modélisation moléculaireModélisation biométrieModélisation bioinformatique

13

10

3

26,16 %

2,01 %/

0,60 %

4

112

0,80 %

0,20 %0,20 %0,40 %

15

915

30,18 %

1,81 % 0,20 % 1,01 %

6,43 %

4,02 % 0,40 % 2,01 %

Ex vivo

GénomiqueProtéomique

20

119

4,02 %

2,21 %1,81 %

4

13

0,80 %

0,20 %0,60 %

35

2213

7,04 %

4,43 % 2,61 %

11,87 %

6,84 % 5,03 %

• Date de mises en place de ces méthodes :

avant 1990 de 1990 à 1999 de 2000 à 2004 de 2005 à 2009In vitro 9,97 % 24,74 % 23,02 % 27,15 %

In silico / 0,34 % 2,06 % 3,09 %

Ex vivo / 1,37 % 1,72 % 6,53 %

Totaux 9,97 % 26,45 % 26,80 % 36,77 %

131


• Budget annuel pour ces méthodes

39,2

2%37

,25%

11,7

6%3,

92%

3,92

%

1,96

%

1,96

%

100,

00%

33,3

3%60

,00%

6,67

%

0%5%

10%15%20%25%30%35%40%45%50%55%60%65%70%75%80%85%90%95%

100%

In vitro In silico Ex vivo


• Ces méthodes ont permis de diminuer le nombre d'animaux utilisés

Oui Non

48,15 % 51,85 %

Estimation de la réduction d'animaux


sur une année

Nombre de réponses

100 3

200 2

300 1

450 1

10 % 5

15 % 2

20 % 5

30 % 7

40 % 2

10 à 90 % 3évaluation en cours 6

• Cette ou ces méthodes étai(en)t :

132


Réglementaires Validées par l'ECVAM En cours de validation

En développement

56,62 % 3,61 % 12,05 % 27,72 %

• Sacrifice d’animaux pour les méthodes substitutives :

Nombre d'animaux sacrifiés par an pour ces

méthodes

Nombre de réponses

10 3

20 4

40 3

50 5

60 2

100 8

150 2

200 3

250 2

300 4

400 2

500 4

750 1

1000 1Non évalué 1

133


• Moyens consacrés aux méthodes substitutives

34,4

8%

31,0

3%

10,3

4%17

,24%

3,45

%

3,45

%

43,2

4%29

,73%

18,9

2%

4,76

%

2,70

%

42,5

0%

35,0

0%10

,00%

5,00

%

2,50

% 5,00

%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

Budget annuel Budget équipem ent Budget fonctionnem ent








49,18 % 26,23 % 6,56 % 8,20 % 9,84 %

b) Méthodes pouvant être considérées comme alternatives

• Méthodes mises en place

Utilisation d’espèces à sensibilité

réduite

Evaluation clinique sur

les animaux

Evaluations comportementales

Mesures télémétriques

Imagerie in vivo*

Imagerie interventionnelle

9,09 % 27,27 % 16,78 % 9,79 % 32,17 % 4,90 %

* Type d'imagerie (nb réponses) : IRM (7), night owl (4), échographie (3), RMN (3), MRT, luciferase, élastrométrie, imageur IVIS, biospace, imager, NIRF, X-Ray computer Termography, radio, scanneur, bioluminescence, photon imager biospace

A ces méthodes a été rajoutée l'épidémiologie avec 1 réponse

• Ces méthodes ont permis de diminuer le nombre d'animaux utilisés

Oui Non56,25% 43,75 %


134



sur une année

Nombre de réponses

50 2

200 1

10 % et moins 6

11 à 20 % 9

30 % 4

50 % 2Arrêt des manipulations car

non concluantes 1

• Cette ou ces méthodes étai(en)t :

Réglementaires Validées par l'ECVAM En cours de validation

En développement

47,89 % 2,82 % 16,90 % 32,39 %

• Moyens consacrés aux méthodes alternatives

38,8

9%

27,7

8%

5,56

%

16,6

7%5,

56%

5,56

%

23,8

1%

33,3

4%

9,52

% 14,2

9%

14,2

9%

4,76

%

58,3

3%

25,0

0%12

,50%

4,17

%

0%5%

10%15%20%25%30%35%40%45%50%55%60%

Budget annuel Budget équipement Budget fonctionnem ent








49,18 % 26,23 % 6,56 % 8,20 % 9,84 %

C. Implication dans le développement des méthodes alternatives

135


Oui Non Sans réponse

• Avant de recevoir ce questionnaire aviez-vous déjà entendu parler de méthodes alternatives en expérimentation animale ?

• Connaissez-vous des sources de financement* spécifiques destinées à soutenir la mise au point, le développement, la validation de telles méthodes ?

• Avez-vous déjà obtenu des financements** dans le cadre spécifique du développement et de la validation de méthodes alternatives ?

88,88 %

9,26 %

7,41 %

5,56 %

86,11 %

88,89 %

5,56 %

4,63 %

3,70 %

* Sources de financement: Réseau d'Excellence Biosimulation: a new tool for drug development (FP6) ; NC3Rs ; Netherlands organization for health research and development : programs alternatives to animal experiment ; INSERM ; ANR ; ECVAM ; Post- Grenelle (INERIS).

** organisme : CNRS : imagerie du petit animal ; INSERM ; ANR ; ligue contre le cancer, ARC : développement de méthodes IRM ; ECVAM ; INERIS ; Université ; IFR ; Post- Grenelle Environnement (GIS/INERIS) Montant des financements obtenus : de 10 à 140 k€

Montant des financements obtenus pour soutenir les recherches sur l’animal : de 18 à 100 k€

136


D. Opinion sur les méthodes alternatives Pensez-vous que les méthodes alternatives que vous utilisez :

Oui Non Sans réponse

• sont des méthodes originales permettant d'aborder d'autres questions que les études in vivo

• sont des méthodes complémentaires aux études in vivo

• se suffisent à elle-même et permettent de remplacer les études sur l'animal

• finiront par se substituer totalement aux études sur l'animal dans votre domaine

62,04 %

88,89 %

2,78 %

/

24,07 %

3,70 %

94,44 %

96,30 %

13,89 %

7,41 %

2,78

3,70 %

137


E. Commentaire sur l’interprétation des statistiques

138


139


Etats des lieux sur les méthodes alternatives en expérimentation animale au CNRS

Septembre 2009Magali Jacquier

Suite au courrier du 14 avril 2009, le CNRS et l’Institut des Sciences Biologiques (INSB) en particulier a donc réalisé une enquête auprès des Directeurs d’unités, afin de recueillir des informations qualitatives sur les méthodes alternatives en expérimentation animale utilisées dans les différentes unités. Un questionnaire a été élaboré de façon à procéder à un état des lieux des équipes impliquées, des méthodes développées et couramment utilisées ainsi que des budgets consacrés.

A. Contenu du questionnaire et résumé quantitatif La première partie du questionnaire permettait de recueillir des informations sur les méthodes de raffinement utilisées dans les laboratoires, selon les espèces, et les moyens consacrés à l’expérimentation animale en termes d’équipement, de fonctionnement et de personnels impliqués. La deuxième partie s’articulait autour des méthodes in vitro, ex vivo ou in silico permettant un remplacement relatif ou absolu de l’animal, leurs spécificités d’utilisation, le budget annuel consacré et leur date de mise en application. La troisième partie portait spécifiquement sur le développement de nouvelles méthodes alternatives par les équipes de recherche. Enfin, la dernière partie permettait un sondage d’opinion vis-à-vis de ces méthodes alternatives quant à leur originalité, leur complémentarité du modèle animal et leur utilisation sur le long terme. Vous trouverez une copie du questionnaire envoyé, à la fin de ce document.

Le questionnaire a été envoyé à toutes les unités de l’Institut, soit environ 150 unités de recherche. Le nombre de réponses obtenues est de 63 réponses, dont 52 questionnaires totalement ou partiellement renseignés. La quasi-totalité des réponses concernent des laboratoires de recherche fondamentale (48/52). Tous les questionnaires remplis (sauf un) concernaient des unités ou des équipes ayant recours à l’expérimentation animale.

B. La règle des 3R : le raffinement La majorité du modèle animal utilisé est constitué à 90% par les rongeurs, puis les lagomorphes et les amphibiens. Seuls 4 laboratoires travaillent sur le modèle primate non humain. 90% des laboratoires ayant répondu ont mis en place des mesures de raffinement pour améliorer le bien-être des animaux, que ce soit par la mise en place systématique d’anesthésie, d’analgésie, de point limite ou d’enrichissement des milieux de vie des animaux. La notion de soumission des protocoles à des Comités d’éthique revient également fréquemment. Plus de 70% des laboratoires (37/52) ont mis en place des stratégies de réduction du nombre d’animaux utilisés par une optimalisation statistique des protocoles et des

LE CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - CNRS

140


échantillons biologiques, des collaborations renforcées entre les différentes équipes, ou une rationalisation des besoins de production lors des élevages. Les budgets annuels consacrés à l’expérimentation animale présentent de grandes disparités selon la taille de la structure (de 2000 € à 200 000 €). Le nombre de personnes impliquées varie également de 1 à 100 équivalent temps plein.

141


C. Remplacement relatif ou absolu du modèle animal A la question ‘avez-vous mis en places des méthodes alternatives ?’, 42/52 soit 81% des laboratoires ont répondu positivement. Les principales méthodes in vitro ou ex vivo utilisées sont :

♦ les cultures cellulaires animales ou humaines (30/52 soit 57% des laboratoires) ♦ les lignées cellulaires animales ou humaines (31/52 soit 59% des laboratoires),♦ les tranches de tissus (10/52 soit 19% des laboratoires), ♦ les organes isolés (14/52 soit 26% des laboratoires), ♦ les cellules souches humaines ou animales (10/52 soit 19% des laboratoires), ♦ la protéomique (12/52 soit 23%)♦ la génomique (16/52 soit 30% des laboratoires).

Plusieurs de ces méthodes peuvent être employées dans chaque laboratoire. Ces méthodes alternatives sont utilisées par les équipes de recherche en complément de l’expérimentation animale. En effet, pour chacune de ces méthodes, les laboratoires, ont précisé si elles étaient utilisées seules, en remplacement ou en complément. Pour 84% des laboratoires, ces méthodes sont utilisées en complément ou seules pour 36%. Enfin, elles ne sont utilisées en remplacement que pour 13% des laboratoires interrogés. En général, la mise en place de ces méthodes alternatives date de la fin des années 1990 ou depuis le début des années 2000.

Au niveau des méthodes in silico, on retrouve essentiellement la modélisation bioinformatique et moléculaire (9 laboratoires sur 52), avec une mise en place plus récente (après le début des années 2000). Pour les laboratoires interrogés, ces méthodes sont essentiellement réglementaires. Aucun laboratoire n’a connaissance de la validation de ces méthodes par l’ECVAM.

Selon les 37 laboratoires ayant répondu à la question ‘ces méthodes ont-elles permis de diminuer le nombre d’animaux utilisés ?’, une majorité répond négativement (22 laboratoires contre 15 laboratoires pour lesquels cela a permis une réduction du nombre d’animaux). Le nombre d’animaux (rongeurs essentiellement) utilisés par an pour ces méthodes varie alors de 50 à plusieurs milliers (19 réponses sur 52).

Une trentaine de laboratoires (35/52 soit 67%) ont répondu aux questions concernant les méthodes permettant un remplacement relatif du modèle animal. Ces méthodes sont essentiellement l’imagerie (13/52), des évaluations comportementales (10/52), l’utilisation d’une espèce ‘moins sensible’ comme les invertébrés (7 laboratoires sur 52) ou des études télémétriques (5/52).Pour moitié des laboratoires, ces méthodes ont permis de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Ces méthodes sont soit réglementaires soit en développement. Le budget consacré à ces méthodes varie de 1000 € à 50 k€ pour 8 laboratoires. Pour seulement deux laboratoires, le budget est de 150 k€ à 500 k€. Le personnel impliqué est en général inférieur à 10 personnes.

Le tableau ci-dessous résume les données obtenues pour les moyens humaines et financiers dédiés à l’expérimentation animale ou aux méthodes alternatives.

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Expérimentation animale

Méthodes alternatives

Nombre de réponses 44 35écart budget annuel 2000 € à 200 000€ 500 € à 300 000€TOTAL 1 802 700€ 1 949 000€Total personnes impliquées 566 376

Lorsqu’on compare les moyens humains dédiés à l’expérimentation animale et ceux dédiés aux méthodes alternatives, on constate qu’un plus grand nombre de personnel est dédié à l’expérimentation animale par rapport aux méthodes alternatives. En revanche, pour l’ensemble des réponses obtenues, les budgets, essentiellement pour le fonctionnement, sont légèrement plus importants pour les méthodes alternatives.

D. Implications des équipes dans développement de méthodes alternatives

Plus de 80% des directeurs interrogés connaissaient les méthodes alternatives avant l’envoi de ce questionnaire. En revanche, aucun directeur ne connait ou ne bénéficie de sources de financement spécifiques destinés à soutenir la mise au point, le développement, ou la validation de méthodes alternatives. D'autre-part, certaines unités bénéficient d’un financement spécifique pour soutenir leurs recherches sur l’animal (de 15 k€ à 200 k€).

E. Méthodes alternatives : vers une suppression du modèle animal ? Pour la quasi-totalité des laboratoires ayant répondu à ce questionnaire, les méthodes alternatives qu’ils utilisent sont des méthodes originales permettant d’aborder d’autres questions que les études in vivo. Pour 84% des laboratoires, ces méthodes sont complémentaires des études in vivo et ne se suffisent pas à elles mêmes ni ne permettent de remplacer les études sur l’animal. Enfin, tous les laboratoires interrogés de l’INSB (à l’exception d’un seul laboratoire) ne pensent pas que les méthodes alternatives finiront par se substituer aux études sur l’animal dans leur domaine.

ConclusionCe questionnaire a permis de recueillir des informations permettant essentiellement une analyse qualitative et permettant de dégager des tendances au sein de l’INSB. Il ne s’agit pas d’une enquête quantitative sur un échantillon représentatif.

♦ La majorité des laboratoires utilisant l’expérimentation animale ont mis en place des mesures de raffinement et accorde une place cruciale à l’éthique.♦ Il apparaît clairement à travers ce questionnaire, que les méthodes alternatives utilisées (culture cellulaires animales ou lignées cellulaires) sont complémentaires de l’expérimentation animale.♦ La part du budget consacré aux méthodes alternatives est très fluctuante et dépend de la taille de la structure et de la problématique de

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recherche. Les équipes de neurosciences par exemple travaillent essentiellement sur le modèle animal dans son ensemble et ne peuvent s’en passer. ♦ On constate qu’un plus grand nombre de personnel est dédié à l’expérimentation animale par rapport aux méthodes alternatives. En revanche, pour l’ensemble des réponses obtenues, les budgets sont légèrement plus importants pour les méthodes alternatives.♦ Aucune équipe ni budget spécifique n’est dédié au développement ni à la validation des méthodes alternatives pour les laboratoires de l’INSB.♦ Un effort de communication et de diffusion de l’information doit être envisagé afin que les équipes soient informées des possibilités de financement spécifiques au développement et à la validation des méthodes alternatives.

Pour toute information complémentaire, vous pouvez contacter Magali Jacquier, chargée de mission pour l’expérimentation animale à l’INSB.

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ENQUETE SUR LES METHODES ALTERNATIVES EN EXPERIMENTATION ANIMALE AU CNRS 2009

Nom Prénom Code unité : Equipes impliquées :

Institut de rattachement et domaines scientifiques: INSB :Biologie de la cellule, relation hôte-

pathogène, immunologieBiologie intégrative, animale et

végétaleGénétique, génomique et expression

des gènes

Neurosciences, cognitionStructure biologique

enzymologie, pharmacologie

INEEEvolution, biodiversité, écologie,

paléontologieSurfaces continentales et interfaces

Interactions hommes et milieuxDéveloppement durable

INCChimie organique et supramoléculaire,

chimie du vivant et pour le vivantChimie moléculaire et réactivité, chimie

physique et analytique, chimie théorique Matériaux, Polymères, matière molle

Type de recherche : Recherche fondamentale Recherche médicale humaine Essais toxicologiques et autres évaluations de sécurité Diagnostic Enseignement/formation

Autre

A. Avez-vous recours à l’expérimentation animale ? Oui Non

• Quelle(s) espèce(s) utilisez-vous ?Souris Rats Hamster cobayeLapins Chiens Chats autres (à préciser)

Primates Poissons Amphibiens

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• Avez-vous mis en place une stratégie permettant :− de réduire la souffrance des animaux (raffinement) ? Oui Non

Si oui laquelle (anesthésie, analgésie, enrichissement, point limite, etc.)

− de réduire le nombre d'animaux utilisés (réduction) ? Oui NonSi oui laquelle

• Moyens consacrés à l’expérimentation animale :Budget annuel : Equipement

Fonctionnement

Nombre de personnes impliquées :

B. Avez-vous mis en place des méthodes alternatives (remplacement relatif ou absolu) ? :

a. Méthodes pouvant être considérées comme substitutives

• Utilisez-vous en routine une de ces méthodes ?

Seules En remplacement

Encomplément

Date mise en place

Budgetannuel

In Vitro/Ex vivoCultures primaires animalesCultures primaires humainesLignées cellulaires animalesLignées cellulaires humainesCellules souches animalesCellules souches humainesTranches de tissus

Organes isolés

Génomique

Protéomique

autre

autre

In Silico Modélisation moléculaireModélisation biométrieModélisation bioinformatiqueAutre autre

• Ces méthodes ont-elles permis de diminuer le nombre d'animaux utilisés ? Oui NonSi oui, à combien estimez-vous cette réduction sur une année ?

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• Cette ou ces méthodes sont-elles :Réglementaire(s) en cours de validation Validée(s) par l'ECVAM* en développement

• Quel est le nombre d'animaux utilisés par an pour ces méthodes ?

• Moyens consacrés aux méthodes substitutivesBudget annuel : Equipement

Fonctionnement Nombre de personnes impliquées :

b. Méthodes permettant un remplacement relatif

• Avez-vous mis en place une de ces méthodes ?Utilisation d’espèces à sensibilité réduite (à préciser) Evaluations comportementales Enregistrements télémétriques Imagerie fonctionnelle (précisez) Autres

• Ces méthodes ont-elles permis de diminuer le nombre d'animaux utilisés ? Oui NonSi oui, à combien estimez-vous cette réduction sur une année ?

• Cette ou ces méthodes sont-elles :Réglementaire(s) en cours de validation Validée(s) par l'ECVAM en développement

• Moyens consacrés à ces méthodes alternativesBudget annuel : Equipement

Fonctionnement Nombre de personnes impliquées :

C. Travaillez-vous sur le développement de méthodes alternatives ?

• Avant de recevoir ce questionnaire aviez-vous déjà entendu parler des méthodes alternatives en expérimentation animale ? Oui Non

*ECVAM: European Centre for Validation of Alternative Methods

• Connaissez-vous des sources de financement spécifiques destinées à soutenir la mise au point, le développement, la validation de telles méthodes ? Oui Non

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Si oui lesquelles ?

• Bénéficiez-vous d’un financement dans le cadre spécifique du développement et de la validation de méthodes alternatives ? Oui Non

Dans quel domaine ?

Quel est le modèle développé ?

A quelle échéance pensez-vous pouvoir les utiliser en routine ?

Quel est l'organisme financeur ?

Quel est le montant des financements obtenus ?

• Quel est le montant des financements obtenus pour soutenir vos recherches sur l’animal ?

D. Que pensez-vous des méthodes alternatives ? Pensez-vous que les méthodes alternatives que vous utilisez :

• Sont des méthodes originales permettant d’aborder d’autres questions que les études in vivo

Oui Non ?

• Sont des méthodes complémentaires aux études in vivo

Oui Non ?

• Se suffisent à elle-même et permettent de remplacer les études sur l’animal

Oui Non ?

• Finiront par se substituer totalement aux études sur l’animal dans votre domaine

Oui Non ?

Remarques :

Merci !

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Hervé Juin, Pierre Leneindre et Patrick Herpin

Les chercheurs de l’INRA sont sensibles au développement des méthodes alternatives à l’expérimentation animale dans la construction et l’évaluation notamment éthique de leur projet de recherche ; le nouveau Bureau de l’Expérimentation Animale de l’Institut œuvre dans ce sens. Cependant les chercheurs de l’INRA sont peu impliqués à ce jour dans des programmes réellement dédiés à la mise au point de méthodes permettant la promotion de la démarche dite 3R.

Quelques projets ayant cet objectif ont été identifiés [vl] :

o Une unité de l’INRA est impliquée dans un projet européen qui travaille sur les perturbateurs endocriniens sans avoir recours à l’expérimentation animale (F&F, Food and Fecundity),

o Du fait que l’INRA développe tout spécifiquement des recherches sur les animaux de ferme, des recherches de méthodes alternatives ont été conduites dans ce domaine. Ainsi l’INRA a développé et promu l’utilisation de digesteurs artificiels simulant le fonctionnement du rumen ce qui a permis de réduire sensiblement le recours à des expérimentations lourdes, sur des animaux appareillés avec des fistules à différents niveaux de leur tube digestif.

o Actuellement, plusieurs équipes impliquées en physiologie, génomique, protéomique, toxicologie développent des cultures cellulaires et des techniques in silico. Ces équipes sont amenées à comparer des approches conduites in silico, à d’autres conduites sur des cellules, des tissus ou des animaux vivants. A titre d’exemple, les cellules contenues dans le lait de mammifères ou les œufs des oiseaux et des poissons sont faciles à obtenir via des méthodes non invasives chez les espèces d’intérêt agronomique et sont donc de plus en plus utilisées. Des recherches sont donc conduites pour développer des modèles alternatifs très prometteurs. Dans ces équipes, tout comme dans les autres Instituts, de nombreux modèles cellulaires sont aussi utilisés (cellules adipeuses, hépatiques, musculaires, mammaires,…).

o Un groupe transversal dédié à la modélisation fonctionne au sein de l’Institut depuis plusieurs années. Il mobilise des scientifiques de nombreuses équipes, biologistes, biométriciens et informaticiens. Il a pour objectif de promouvoir cette approche qui permet entre autres de valoriser les données issues des structures d’expérimentation de l’INRA et de pratiquer une expérimentation virtuelle afin de mieux cibler les questions à élucider en utilisant des modèles animaux.

o Dans le cadre d’une meilleure estimation des dangers et des risques sanitaires environnementaux des xénobiotiques plusieurs modèles cellulaires sont utilisés : il s’agit :

− D’un modèle cutané (primo-culture de kératinocytes), − De modèles hépatiques (primo-cultures d’hépatocytes, lignée cellulaire

HepG2), − D’un modèle intestinal (lignée cellulaire CaCo2),

L’INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE - INRA

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− Deux équipes de l’INRA participent au programme ANTIOPES dédié à la toxicologie prédictive.

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Etat des lieux surles méthodes alternatives en expérimentation animale

Christophe Joubert, Rémy Maximilien, Eric Quéméneur Direction des Sciences du Vivant, CEA

Résumé

Afin de produire de nouvelles connaissances dans les domaines d'activités de l'Etablissement (Energies non émettrices de gaz à effet de serre, Technologies pour l'Information et la Santé, Défense et Sécurité Globale), le CEA exploite des établissements d’expérimentation animale. Les études d'impact et les démonstrations de sûreté biologique ne nécessitent désormais plus de grandes campagnes d'expérimentation animale, de sorte que celle-ci se trouve aujourd’hui essentiellement restreinte aux secteurs pour lesquels l'état de l'art ne révèle aucune donnée acquise dans un contexte physiologique, e.g. étude de la toxicité de nouveaux composés nucléaires, biocinétique et toxicité des nanoparticules, etc. Au-delà de ces thèmes de toxicologie, ce document évoque également les programmes d'imagerie fonctionnelle qui font évidemment appel à des modèles animaux pour l'exploration des fonctions supérieures ou l’étude de pathologies à long terme (neurosciences, cancérologie, neurovirologie, etc.). Dans tous les cas pour lesquels aucune approche substitutive pertinente ou validée n’est disponible ou envisageable sur le court terme, le CEA mène des expérimentations en garantissant le respect d’un haut standard éthique, en s’appuyant sur l’esprit du principe des 3R.

Parallèlement, des développements technologiques sont conduits en vue de réduire le recours aux modèles animaux. A titre d'exemple, on peut citer les techniques de criblage cellulaire, en amont et en parallèle du développement préclinique de médicaments, ou l'ingénierie moléculaire des anticorps en complément des immunotechnologies traditionnelles. Un effort particulier est consacré au développement des techniques globales (transcriptomique, protéomique, etc.) qui permettent d'augmenter les données acquises sur un modèle animal et diminue donc en retour l'expérimentation.

Activités de recherche en cours nécessitant le recours à l'expérimentation animale

Le CEA conduit de programmes de recherche dans les domaines des technologies de la santé. Les programmes développés en biologie s’articulent autour de plusieurs domaines comprenant l’étude de sujets majeurs en santé publique (cancer, maladies neuro-dégénératives, maladies infectieuses), le développement de nouvelles technologies et de nouveaux outils en biologie (« omics »), de la chimie (spéciation, analyses in situ, imagerie isotopique…) en tirant profit des progrès de la modélisation et de la bio-informatique pour traiter ces données complexes, extrapoler les effets des fortes aux faibles expositions, identifier des "signatures" moléculaires d'exposition ou d'effets et définir à terme, des marqueurs biochimiques pertinents, évaluer les risques induits par le développement de nouvelles technologies (nano matériaux, nouveaux combustibles, etc.).

Les chercheurs du CEA utilisent les modèles les plus performants incluant les modèles animaux lorsque cela s’avère nécessaire. Le CEA est aussi fortement impliqué dans les approches permettant d’intégrer la démarche scientifique de la cellule jusqu’à l’organisme entier. Les méthodes alternatives en expérimentation animale, fortement développées au sein des unités de recherche, se basent sur les principes de Russell et Burch (1959) plus connus sous le nom de règle des 3R : remplacer, réduire, raffiner.

LE COMMISSARIAT À L’ÉNERGIE ATOMIQUE - CEA

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REMPLACER

Le CEA ne développe pas sensu stricto des méthodes substitutives à l’expérimentation animale mais de nombreux programmes de recherche susceptibles de conduire à terme au remplacement des modèles animaux.

REDUIRE

Des modèles ont été élaborés pour comparer les réponses de différents organismes de la chaîne trophique, des bactéries à l’Homme en incluant les végétaux. L'étude des mécanismes et des effets aux faibles doses de polluants ou d'expositions combinées permettant de révéler d'éventuelles interactions défavorables (antagonismes, compétitions, synergies) représentent des défis majeurs, conceptuellement et expérimentalement.

RAFFINER

Le développement des outils d’imagerie permet non seulement d’ouvrir de nouveaux champs recherche notamment dans le domaine de l’étude et de la compréhension du cerveau avec des applications dans de nombreuses pathologies comme les maladies neuro-dégénératives. Ces outils permettent de limiter fortement le nombre d’animaux utilisés en évitant le recours aux euthanasies nécessaires pour « voir le cerveau ». L’imagerie médicale permet aussi de limiter l’utilisation de techniques plus invasives comme l’implantation d’électrodes et elle constitue aussi un raffinement en limitant la contrainte chez les animaux.Les actions du CEA dans ce domaine concernent notamment, la validation de la mise en place de protocoles anti-douleur compatibles avec l’exploration des fonctions, et le développement et l’utilisation de techniques non invasives d’exploration du vivant notamment du suivi toxicocinétique de xénobiotiques ou de médicaments ou de la progression de pathologies

EXEMPLES DE CHAMPS D’APPLICATION

1. Radiotoxicologie des actinides et des cations mis en œuvre dans le Nucléaire

L'étude de l'impact pulmonaire d'oxydes d'actinides (notamment des nouveaux combustibles "MOX" PuO2/UO2) est conduite dans une perspective de protection des travailleurs du Nucléaire. Les questions posées sont celles de la dissolution des particules in situ, de la biocinétique des éléments chimiques relargués et de leur décorporation.

Equipe engagée : Laboratoire de Radiotoxicologie, CEA Bruyères-le-ChâtelModèles étudiés : rongeurs (une centaine par an)Support institutionnel et financier : CEA, partenariat industrielPerspectives en matière de substitutionCultures de lignées cellulaires humaines ; modèles d'épithélia pulmonaire et rénal, Dans d'autres laboratoires du CEA : modèle de barrière cutanée, hémato-encéphalique, lignées osseuses

2. Toxicologie des nanoparticules

Les travaux conduits dans ce domaine s'inscrivent principalement dans l’identification des organes cibles de nanomatériaux préparés au CEA (nanotubes de carbone, nanoparticules métalliques, quantum dots, etc.) et la détermination des cinétiques de distribution/accumulation dans ces organes. Les progrès récents de l'imagerie chez le petit animal ont permis de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés.

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Equipes engagées : Laboratoire de Radiotoxicologie, CEA Bruyères-le-ChâtelSIMOPRO, Institut de Biologie et Technologie de Saclay

Support institutionnel et financier : CEA, partenariat industriel ArevaModèles étudiés : rongeurs (quelques dizaines par an)Perspectives en matière de substitution : modèles cellulaires pour la classification des particules en fonction de paramètres physico-chimiques, modèle de barrière hémato-encéphalique

3. Immunotechnologies

Le CEA reste un des leaders nationaux dans le domaine des anticorps monoclonaux et de la conception de kits d'immuno-analyse. Le recours aux modèles animaux fait partie de la stratégie expérimentale, en amont et en aval des phases de fusions cellulaires et de sélection des hybridomes. Le CEA dispose également d'équipes reconnues dans le domaine de la modulation antigénique (épitopes T et réduction/accroissement du potentiel immunogène B). La première validation est systématiquement effectuée sur un modèle cellulaire et l'efficacité biologique doit être ensuite démontrée in vivo. Le modèle rongeur n'est pas idéal mais est encore accepté.

Equipes engagées : Service de Pharmacologie et Immunologie, CEA SaclayService de Biochimie et Toxicologie Nucléaire, CEA MarcouleSIMOPRO, CEA Saclay

Support institutionnel et financier : CEA, nombreux contrats de recherche et de prestationsModèles étudiés : rongeurs (plusieurs centaines par an)Perspectives en matière de substitutionPeu de perspectives envisageables. Les unités concernées sont toutefois fortement engagées dans l'usage des méthodes recombinantes et ont une veille sur l'évolution des performances des techniques de production des mAbs en bioréacteurs.

4. Imagerie fonctionnelle

La proximité entre cliniciens, physiciens et technologues a permis au CEA de mettre en place un parc de ressources quasi-unique au plan international. Différentes approches (IRM, PET, tomographie X, etc.), parfois utilisées de façon multi-modale, sont mises au service de programmes collaboratifs divers, allant des neurosciences fondamentales aux troubles neurodégénératifs et de la différentiation à la cancérogénèse. L'expérimentation animale est un complément précieux à l'analyse de cohortes médicales.

Equipes engagées : Service hospitalier Frédéric Joliot, CEA OrsayMIRCen, CEA Fontenay-aux-RosesNeuroSpin/SaclayLaboratoire TIRO/SBTN, CEA-Université de Nice

Support institutionnel et financier : CEA, nombreux contrats de recherche et de prestationsModèles étudiés : rongeurs, primatesPerspectives en matière de substitutionLa complexité des fonctions étudiées ne peut être reproduite dans des modèles cellulaires, même complexes. Il n'est donc pas possible d'envisager d'autres approches expérimentales que l'étude sur animaux. Néanmoins, le principe de base qui contribue au respect de l'animal est que son état de santé est un facteur prépondérant pour l'obtention de données valides sur les plans biologique et physiologique. Ce secteur est donc particulièrement vigilant aux conditions de vie des animaux, notamment des primates.

153


5. Physiopathologie des maladies infectieuses

Le savoir faire dans l'étude des agents pathogènes non conventionnels, neurotropes notamment (prions), sa maîtrise des installations sécurisés (L3) et le fort couplage entre biologie et imagerie fonctionnelle, font du CEA un Etablissement reconnu dans le domaine des maladies infectieuses. Les programmes en cours concernent les infections virales (arbovirus, virus neurotropes et immunotropes) et les nouvelles solutions thérapeutiques (thérapies génique et cellulaire, nouvelles stratégies thérapeutiques vaccinales).

Equipes engagées : Institut Maladies Emergentes et Thérapies Innovantes, CEA Fontenay-aux-RosesSupport institutionnel et financier : CEA, nombreux contrats de recherche et de prestationsModèles étudiés : rongeurs, primatesPerspectives en matière de substitution : Modèles cellulaires dès que possible.

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Isabelle Fabre, Dominique Masset, Sonia Prieur, Didier Sauvaire

L’AFSSAPS, agence réglementaire en charge de la sécurité des produits de santé participe depuis plus de 15 ans au développement des méthodes alternatives à l’expérimentation animale dans 2 domaines ciblés qui relèvent de ses missions de santé publique :

- La sécurité des produits cosmétiques :

L’AFSSAPS s’est dotée d’un laboratoire spécialisé et d’une équipe de 4 personnes dédiée au développement à la validation de méthodes in vitro appliquées aux produits cosmétiques, les premiers travaux ont porté sur l’évaluation de la tolérance des produits cosmétiques formulés. Cette activité mobilise 4 ETP pour un budget annuel de 625 k€ par an.

Depuis 2005, l’AFSSAPS a constitué un réseau national dédié à la prédiction des substances allergisantes cutanées avec une application spécifique aux ingrédients cosmétiques. Une dotation de 890 000 euros a été accordée par l’AFSSAPS sur une période de 3 ans pour la mise en œuvre de ce projet, associant 4 équipes aux laboratoires de l’AFSSAPS dont 3 laboratoires publics (INSERM, CNRS, université) et un laboratoire privé (ressources biologiques)25. Ce programme de recherche devrait se prolonger dans les années futures dans le cadre des travaux du GIS. En effet, la sensibilisation retardée ou immédiate, problème de santé publique en constante augmentation, est l’une des cibles prioritaires du GIS.

- Le Contrôle Qualité des médicaments biologiques :

Depuis 1994, les laboratoires de l’AFSSAPS participent au Programme de Standardisation Biologique (BSP) mis en œuvre par l’EDQM dont 16 programmes sur 98 ont pour objet de développer des méthodes 3R. Cette activité mobilise 2 ETP pour un budget annuel d’environ 156 k€ par an.

25 - Philippe Azam, Jean-Luc Peiffer, Delphine Chamousset, Marie-Hélène Tissier, Pierre-Antoine Bonnet, Laurence Vian, Isabelle Fabre, Jean-Claude Ourlin. The cytokine-dependent MUTZ-3 cell line as an in vitro model for the screening of contact sensitizers. 2006, Toxicology and Applied Toxicology 212, 14-23.

- Nadège Ade, Fanny Léon, Marc Pallardy, Jean-Luc Peiffer, Saadia Kerdine, Marie-Hélène Tissier, Pierre-Antoine Bonnet, Isabelle Fabre, Jean-Claude Ourlin. HMOX1 and NQO1 genes are up-regulated in response to contact sensitizers in dendritic cells and THP-1 cell line: role of the Keap1/Nrf2 pathway, 2009, Toxicological sciences 107(2), 451-460

L’AGENCE FRANÇAISE DE SÉCURITÉ SANITAIRE DES PRODUITS DE SANTÉ - AFSSAPS

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Les laboratoires de l’AFSSAPS participent activement depuis le début de ce programme aux études collaboratives de validation de méthodes appliquées au Contrôle Qualité des vaccins :

Type de vaccin Méthode développée : Nature de l’alternative (3R)

Vaccin Poliomyélite inactivé

Méthode ELISA de quantification antigénique Remplacement : appliqué

Vaccins tétanique et diphtérique

Méthode ELISA de quantification antigénique

Remplacement : appliqué pour le Tétanos1826 et en développement pour la diphtérie.

Vaccin coquelucheux à germes entiers Test de toxicité sur cellules Remplacement : appliqué

Vaccin diphtérique Test sérologique sur souris (technique sur cellules)

Raffinement : méthode en cours de validation

Vaccins tétanique, diphtérique, coquelucheux à germes entiers

Test sérologique sur cobayes ou souris (technique ELISA ou possibilité d’appliquer la méthodologie LUMINIEX™)

Raffinement : méthodes en cours de développement.

D’autre part, et en complément des données du tableau ci-dessus, les laboratoires de l’AFSSAPS initient également des études de développement de méthodes alternatives à l’expérimentation animale appliquées au Contrôle Qualité des vaccins pour les méthodes suivantes : - Vaccin hépatite A : méthode ELISA de détermination du contenu antigénique

en remplacement du test d’immunogénicité sur souris27.- Vaccin hépatite B : méthode ELISA de détermination du contenu antigénique

en remplacement du test d’immunogénicité sur souris (en cours).- Dosage des immunoglobulines anti-rabique : remplacement du test officiel in

vivo (NIH) par un test ELISA (en cours).

- Le GIS - Plateforme française pour le développement des méthodes alternatives en expérimentation animale »

Cette structure abritée par l’AFSSAPS est une initiative conjointe de l’AFSSAPS et du Ministère de la recherche. Cette plateforme, créée le 16 novembre 2007 réunit 12 partenaires nationaux représentant les autorités réglementaires, la recherche publique, l’industrie dans les domaines de la chimie, des produits de santé, ainsi que les associations veillant au bien-être de l’animal de laboratoire. Elle a entre autre comme objectif de constituer une interface avec les institutions européennes en relation avec ECOPA. Le programme de travail du GIS a été établi sur la base de la potentialité de réduction de l’expérimentation animale et sur les contraintes réglementaires au niveau de l’Union Européenne.

L’activité en laboratoire de l’AFSSAPS dans le domaine des méthodes alternatives mobilise 6 ETP pour un budget annuel de 781 k€ auquel doivent être ajoutés le

1

26 S.Prieur, S.Broc, M.Gal, B.Poirier, F.Fuchs, Development of an in vitro potency test for tetanus vaccines , Development in Biologicals Basel 2002, vol 111, 37-46

27 B. Poirier, P. Variot, P. Delourme, Jacques Maurin, S. Morgeaux. « Would an in vitro ELISA test be a suitable alternative potency method to the in vivo immunogenicity assay commonly used in the context of international Hepatitis A vaccines batch release?”. Vaccine (In Press)

156


financement de 890 k€ sur 3 ans (2006-2008) dédié à la thématique « Allergie de contact » et 1 ETP dédié au secrétariat du GIS « méthodes alternatives ».

- Le groupe de travail innovation non clinique (GTINC) :

Le groupe de travail sur l’Innovation Non Clinique de la Sécurité des Produits de Santé a été crée le 22 juillet 2004. Sa présidence est assurée actuellement par le Professeur Jean-Roger Claude et ses membres sont des universitaires ou membres des grands organismes de recherche publics : INSERM, INRA, CNRS et CEA.Ce groupe a pour première mission d’étudier et de valider les aspects méthodologiques et techniques des nouvelles approches utilisées en toxicologie en vue de les valider et de définir leurs règles de bon usage pour leur éventuelle utilisation sur un plan réglementaire. A la demande du Directeur Général, le groupe de travail peut également donner un avis dans l’évaluation de certains dossiers.

1. La thématique « Omics »

La thématique « Omics » a été la première à être traitée par le groupe de travail. Les membres du groupe ont ainsi été choisis pour leurs compétences dans le domaine de la protéomique ou de la transcriptomique au sein des grands organismes de recherche français.

Dans un premier temps, un état des lieux des connaissances actuelles concernant l’analyse du protéome et l’analyse du transcriptome a été réalisée.

Le groupe a ensuite élaboré en s’appuyant sur l’expérience de responsables de plateformes du secteur académique et de l’industrie une série de recommandations flexibles pour les laboratoires qui souhaiteraient déposer de façon volontaire des données de génomique sous la forme d’un document intitulé « Guide pour une soumission volontaire de données de génomique ». Ce document a également fait l’objet d’une traduction en anglais (document intitulé « Aid to Voluntary Submission of Genomics Data »). Ces deux documents doivent être mis en ligne sur le site internet de l’AFSSAPS et faire l’objet d’une communication auprès des grands organismes de recherche (CNRS, INSERM, CEA) ainsi que de l’industrie et de l’EMEA.

Le but de ces documents est d’encourager les soumissions volontaires de données de génomique, en donnant aux laboratoires une série de recommandations pour encadrer ce dépôt. Il ne s’agit pas d’exigences réglementaires. Au regard de l’analyse des données soumises par les industriels, l’objectif dans le futur sera d’établir une ligne directrice pertinente sur la base de l’expérience pratique.

2. Thématique nanoparticules

Suite à la saisine de la DGS sur les nanoparticules, le groupe de réflexion s’est penché également sur cette thématique depuis le début de l’année 2006. Le champ couvert par les nanotechnologies étant assez vaste, il a été décidé de travailler dans un premier temps sur 2 aspects des nanotechnologies : l’imagerie et la vectorisation. Concernant la thématique imagerie, les laboratoires Guerbet spécialisés dans l’imagerie médicale ont été auditionnés.

Pour l’aspect vectorisation, le Professeur Patrick Couvreur de la Faculté de Pharmacie de Châtenay-Malabry a été auditionné.

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Le GTINC travaille actuellement sur les thématiques suivantes : les utilisations des méthodes d’imagerie dans le développement préclinique des médicaments, et la protéomique.

158


Philippe Hubert, Emmanuel Lemazurier, Alexandre Pery

L'INERIS est impliquée depuis une vingtaine d’années dans le développement d’outils essentiels au développement de méthodes alternatives, avec trois axes de recherche et deux actions de coordination :

1) Le développement et la validation de modèles in vitro pour l’évaluation :- du potentiel perturbateur endocrinien des substances chimiques. Ces modèles

étant utilisés pour l’évaluation du danger de polluants organiques environnementaux (approche de criblage), pour l'évaluation des effets sur la reproduction chez le poisson (approche intégrée in vitro/in vivo) et, pour l'identification de substances toxiques dans l'environnement (couplage in vitro/fractionnement physico-chimique/analyse chimique),

- de la toxicité générale et du passage transmembranaire des substances chimiques (barrières alvéolo-capillaire au niveau du poumon, hémato-encéphalique au niveau du cerveau, hémato-testiculaire ou hémato-ovarienne au niveau des gonades et hémato-placentaire entre la mère et l’embryon ou le fœtus). Les projets afférents à ces objectifs sont propres à l’INERIS ou effectués en collaboration dans le cadre d’ANR avec l’INSERM, le CEA et des universités.

.

2) La modélisation, domaine pour lequel l'INERIS dispose d'une unité de 6 chercheurs. Il s'agit d'évaluer la dangerosité des substances grâce à des méthodes informatiques (modèles PBPK et QSARs) capables d'exploiter des informations physico-chimiques et les résultats des tests in vitro pour proposer une évaluation du risque sur le vivant Ces tests in vitro sont des tests cellulaires de complexités diverses (depuis la boite de Pétri, jusqu’aux puces à cellules couplant les cellules de plusieurs organes) au cours desquels les expressions transcriptomiques et métabolomiques peuvent être mesurées en parallèle de mesures plus classiques (viabilité, génotoxicité). L'activité de cette équipe est soutenue par des programmes européens (6ème et 7ème PCRD), nationaux (ANR) et propres à l'INERIS, avec des collaborations internationales (JRC, UFZ) et nationales (INSERM, UTC, CNRS).

Ces axes peuvent donner lieu à terme à des approches « substitutives » pures, mais elles s’inscrivent aussi dans les « integrated testing strategies » (ITS), permettant de réduire le nombre d’essais en sélectionnant les séries de tests qui optimisent le gain d’information toxicologique au moindre coût expérimental. Dans le domaine des ITS, il faut citer le programme ANR CANTO qui « pilote » l’acquisition d’information en optimisant entre tests in vitro, modélisation, et essais animaux.

3) Le développement de tests sur embryon et larve de poisson pour évaluer le potentiel perturbateur endocrinien des molécules organiques. Cette action vise à proposer des tests rapides et sensibles pour le screening du potentiel PE des substances chimiques et s'inscrit dans la démarche d'évaluation intégrée vitro/vivo du risque des PE. Ces tests se basent sur l'analyse de l'expression de gènes cibles endogènes impliqués dans le métabolisme hormonal. Cette démarche consiste aussi à développer des lignées de poissons transgéniques telles que les lignées aromatase B-GFP et sGnRH-GFP permettant d'étudier les effets neuro-endocrines des PE durant les stades précoces du développement chez le poisson zèbre. Ces recherches sont supportées par des programmes propres à l'INERIS (P189), nationaux (PNRPE, ANR) et par le réseau national NEMO du Post-Grenelle.

L’INSTITUT NATIONAL DE L’ENVIRONNEMENT INDUSTRIEL ET DES RISQUES (INÉRIS)

159


L’ensemble de ces activités mobilise environ 15 ETP pour un budget annuel de l’ordre de 1,5 M€.

En outre, l'INERIS participe activement à l'animation du réseau ANTIOPES. Le réseau partenarial ANTIOPES est une fédération de compétences et de moyens regroupant des chercheurs essentiellement issus de la recherche publique (INSERM, CNRS, CEA, INRA, université). L’objectif de ce réseau est la mise en œuvre d’un programme de travail dans le domaine de la toxicologie prédictive et de la santé environnementale en réponse à REACh. Ce programme prévoit de développer les méthodes alternatives comme les approches de modélisation chimique prédictive (QSAR) et les biomarqueurs en lien avec les développements "Omics".

Enfin, le Pôle National Applicatif en Toxicologie et Ecotoxicologie a été créé par le Ministère de l’Ecologie à l’INERIS. Il s’organise autour de la Fondation Universitaire de l’UTC, de l’unité PERITOX et de l’UPJV, de l’Institut Lasalle Beauvais et du réseau ANTIOPES. Il est soutenu en partie par un financement Post-Grenelle destiné à augmenter les moyens humains en toxicologie et en écotoxicologie. L'une des principales finalités du Pôle est le développement de méthodes alternatives opérationnelles dans le domaine du risque environnemental.

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Binet - Brondeau – 28 octobre 2009

Actions de l’Institut National de Recherche et de Sécurité en faveur du développement et de l’usage de méthodes alternatives à l’expérimentation animale

L’objectif essentiel des programmes de recherche toxicologique de l’INRS consiste à prévenir les atteintes pour la santé qui résultent de l'exposition aux agents chimiques présents sur les lieux de travail. Impliqué dans des activités d’études et de recherche en toxicologie industrielle, le département Polluants et Santé de l’INRS participe à l’évaluation du risque chimique en milieu professionnel. Il apporte des connaissances mises à disposition de la communauté scientifique et décisionnelle, nationale et internationale. Les activités de recherche sont menées à l’intérieur du département ou en partenariat avec d’autres départements de l’INRS ou avec des équipes externes par l’utilisation de méthodes alternatives ou la contribution à la mise au point de telles méthodes dans les domaines des effets cancérogènes, mutagènes, immunotoxiques et le passage percutané.

Dans le monde professionnel, la voie cutanée est la deuxième voie d’exposition à des composés toxiques et pour certaines molécules non volatiles le passage percutané est prépondérant. Nos actions dans ce domaine visent à apporter une meilleure connaissance des risques liés à une exposition dermique, à développer des indicateurs de toxicité cutanée et à modéliser l’absorption percutanée des toxiques industriels. Depuis le 1er juin 2007, le règlement REACh (Registration, Evaluation and Autorisation of Chemicals) est entré en vigueur. Au regard du nombre de molécules à étudier (5000), il est difficilement envisageable de systématiquement mettre en œuvre des méthodes expérimentales in vivo pour déterminer le flux de passage percutané. Les méthodes in vivo sont coûteuses en animaux, en réactifs et en temps. Nous utilisons des méthodes in vivo ou ex vivo chez le rat ou ex vivo chez l’Homme pour estimer le flux d’absorption de toxiques industriels. Ces méthodes ex vivo permettent d’étudier plusieurs modalités sur des peaux d’un même rat réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Un des objectifs de nos recherches est de définir un modèle, s’appuyant sur des critères physiques et physico-chimiques, qui permette de déterminer la variation des flux d’absorption de toxiques. En effet, les estimations des flux d’absorption à l’aide d’algorithmes sont parfois très éloignées des données expérimentales, en particulier avec des solvants amphiphiles. Nous travaillons aussi sur une recherche de corrélation entre les flux in vivo et les flux ex vivo en étudiant la variation des flux d’absorption ex vivo de molécules lipophiles, voire hydrophiles, en fonction de l’épaisseur des échantillons de peau afin de modéliser la variation de ces flux en prenant en compte les caractéristiques des molécules. Nous envisageons d'étudier l'intérêt de membranes artificielles hydrophobes (membrane de silicone) comme succédané du stratum corneum qui est considéré comme la principale barrière aux composés hydrophiles. Nous espérons obtenir ainsi une meilleure connaissance des mécanismes de transfert de molécules à travers la peau et la possibilité d’étendre cette modélisation à l’estimation de l’intensité du passage percutané d’autres molécules présentant des propriétés physico-chimiques comparables.

Le laboratoire d’immunotoxicité mène des travaux sur l’allergie aux produits industriels, en développant des indicateurs d’effet sensibles et spécifiques. Il cherche en particulier à différencier les allergènes responsables d’asthmes professionnels. En effet, l’identification des substances chimiques de l’environnement industriel susceptibles de provoquer des allergies de type cutané ou respiratoire représente un défi important en hygiène du travail. A présent, seuls des tests d’identification basés sur une expérimentation animale lourde ont été validés. Un effort particulier a été engagé sur le développement de modèles in vitro sur cellules dendritiques afin de réduire l’utilisation d’animaux. Ce laboratoire a mis au point un

L’INSTITUT NATIONAL DE RECHERCHE ET DE SECURITE (INRS)

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modèle original basé sur l’utilisation de cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse de souris. Ce modèle, capable d’identifier des sensibilisants cutanés forts, semble prometteur. C’est pourquoi, nos travaux actuels visent à élargir la gamme des allergènes testés à des sensibilisants cutanés plus faibles ainsi qu’à des sensibilisants respiratoires. Le panel de paramètres analysés après incubation des cellules dendritiques avec les sensibilisants sera également étendu : expression de marqueurs membranaires, expression d’interleukines, induction de prolifération lymphocytaire T. Les résultats permettront d’évaluer l’intérêt de ce modèle in vitro pour l’identification d’allergènes chimiques et pourraient conduire dans le futur, après comparaisons inter-laboratoires, à un test stabilisé et validé.

Le laboratoire de génotoxicité réalise des études orientées sur la détection des cancérogènes. Les études sont actuellement centrées :

1) sur les fibres et particules présentes en ambiance professionnelle (depuis quelques années sur les nanoparticules) et,

2) sur les effets pulmonaires in vivo. In vitro, nous utilisons des méthodes d’investigation réglementaires ou non (cytotoxicité, apoptose, test des micronoyaux, test des comètes, recherche de stress oxydant, etc.). In vivo, nous réduisons le nombre d’animaux en maximalisant le nombre d’essais par animal : réponse inflammatoire (lavage broncho-alvéolaire), prolifération et mort cellulaire (immunohistochimie), expression de cytokines pro-inflammatoires, marqueurs de stress oxydant, génotoxicité (tests des comètes et des micronoyaux dans différents organes cibles), expression de gènes impliqués dans la réponse inflammatoire et le stress oxydant par RT-PCR quantitative, etc.

L’INRS adapte constamment ses installations expérimentales et les conditions d’hébergement des animaux.

L’INRS participe à la future Action Conjointe européenne « NanoGenotox » dont un des objectifs est d’évaluer la pertinence de l’utilisation de techniques in vitro d’évaluation de la génotoxicité des nanoparticules comme alternatives à l’expérimentation animale dans ce domaine (2010-2012).

Enfin, l’INRS est membre du Comité régional d’éthique pour l’expérimentation animale Nancy-Lorraine-Nord-Est dont la mission est d’émettre un avis éthique motivé sur les protocoles expérimentaux proposés par les expérimentateurs relevant de chaque organisme signataire.

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Valérie Fessard

L’action de l’Agence française de sécurité sanitaire des aliments en faveur dudéveloppement et de l’usage de méthodes alternatives à l’expérimentation

animale et perspectives d’évolution dans ce domaine »

L’Agence française de sécurité sanitaire des aliments (AFSSA) a pour mission de contribuer à la protection de la santé publique et de la santé et du bien-être des animaux. Dans cet objectif elle assure l’évaluation des risques sanitaires pour l’Homme, les animaux et les écosystèmes (faune et flore sauvages et milieux, dans le cadre de l’évaluation des produits phytosanitaires, notamment) liés aux aliments et à des produits entrant la chaîne de production alimentaire, qu’ils soient susceptibles d’être introduits volontairement (additifs, auxiliaires technologiques, médicaments vétérinaires) ou non (bactéries, virus, résidus de contaminants chimiques, etc.). Elle assure également le contrôle et le développement du dispositif national de détection et de mesure des dangers biologiques et chimiques dans les aliments et chez les animaux, par l’activité de référence de ses laboratoires. L’Agence conduit également des études et recherches permettant de caractériser les contaminants, leurs effets, leur diffusion et leur action et de développer des outils de prévention des maladies. En raison d’exigences scientifiques ou réglementaires, l’AFSSA doit appuyer ses avis et travaux sur des expérimentations animales. Néanmoins, cette nécessité est systématiquement pesée au regard du souci de l’Agence d’assurer la protection des animaux, qui sont des êtres vivants et sensibles, etc. Les laboratoires de l’AFSSA mènent leurs travaux en n’ayant recours à l’expérimentation animale que lorsqu’aucune autre alternative n’est envisageable. En outre, ils participent eux-mêmes au développement de méthodes alternatives à cette expérimentation. Cette politique vise à réduire autant que faire se peut l’expérimentation animale en considérant les limites de toute extrapolation de démarches de l’ex vivo à l’in vivo. Par ailleurs, l’AFSSA ayant pour mission de contribuer à la protection du bien être des animaux, elle s’appuie sur un vivier de scientifiques ayant les compétences nécessaires pour apprécier les conditions d’expérimentation et garantir au mieux le bien être de ces animaux en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés lors des expérimentations indispensables.

Dans le cadre de l’audition de l’AFSSA par l’Office parlementaire d’évaluation des choix scientifiques et technologiques sur les « principes applicables en Europe à l’expérimentation animale et les méthodes alternatives à celle-ci », l’Agence a recensé ses actions et fait le point sur sa situation actuelle et les perspectives d’évolution dans ce domaine.

1- Les approches utilisées pour les études in vivo conduites par l’Agence

Les études de génotoxicité in vivo sont réalisées tout en limitant le nombre d’animaux de diverses façons :

- Quand cela est possible, les tests sont effectués conjointement sur les mêmes animaux (par ex : test des comètes et test du micronoyau).

- Plusieurs organes sont prélevés sur chacun des animaux des études.

- Plusieurs produits sont testés en même temps d’où un seul lot de témoins négatifs et de témoins positifs, lorsque cela n’interfère pas sur la qualité des résultats de l’expérimentation.

L’AGENCE FRANÇAISE DE SÉCURITÉ SANITAIRE DES ALIMENTS (AFSSA)

163


- Les témoins positifs ne sont réalisés que lorsqu’ils sont nécessaires (dans certains cas les lames positives d’une étude précédente sont utilisées et codées au moment de la lecture des lames).

L’AFSSA assure la modernisation de ses installations expérimentales en veillant à garantir l’excellence des conditions d’hébergement des animaux et le niveau de biosécurité des installations.

2- Le développement par l’Agence d’études in vitro

- La réglementation communautaire prévoit que la méthode de référence pour la détection des biotoxines marines dans les coquillages est un bioessai réalisé sur des souris. A ce jour, il n’existe aucune autre méthode alternative validée équivalente à ce test. Cependant l’Agence a travaillé activement à la mise au point une méthode d’analyse physico-chimique permettant la détection et le dosage des biotoxines lipophiles réglementées et conduit des travaux de recherche sur des tests cellulaires pour la mesure de ces toxines dans les aliments (tests immunochimiques, techniques séparatives chromatographiques, couplage spectrométrie de masse, etc.). L’Agence participe activement au processus de validation communautaire de la méthode d’analyse physico-chimique et s’est préparée à la mise en œuvre systématique de ce test si elle est acceptée par les responsables des Etats membres. Il convient cependant de noter que les bioessais devront cependant probablement toujours être mis en œuvre à des fins de surveillance et de vigilance, car ils permettent de détecter des toxicités atypiques, comme l’illustrent les résultats des contrôles réalisés sur des huîtres du bassin d’Arcachon

- L’Agence participe au projet HepaCellTox financé par l’Agence nationale de la recherche (ANR) visant à caractériser les capacités de réponse aux pro-mutagènes du modèle cellulaire d’hépatocytes humain Hepa-RG devrait permettre in fine de réduire l’expérimentation animale en toxicologie génétique en diminuant le nombre de faux-positifs in vitro. En effet, les modèles utilisés actuellement sont dépourvus d’enzymes de métabolisation et nécessitent l’ajout d’extraits de foie de rat, système métabolique assez éloigné du métabolisme humain.

- De nouveaux projets se concrétisent avec une vision plus intégrée en faisant interagir plusieurs compartiments cellulaires. Ainsi, un modèle mimant à la fois la barrière intestinale avec des cellules Caco-2 cultivées sur des inserts et le flux sanguin avec des cellules de type lymphoblastique est en cours de développement.

- Un modèle de toxicocinétique in vitro de la barrière intestinale (cellules Caco2) est actuellement développé pour apporter des connaissances sur les mécanismes mis en jeu pour le passage de cette barrière par divers composés. Ces études ont pour but de disposer de données pour la réalisation de modèles in silico qui pourront permettre d’appréhender les effets in vivo tout en limitant l’expérimentation animale.

- En matière d’influenza aviaire, la caractérisation des niveaux de pathogénicité des virus influenza (et maladie de Newcastle) étaient conduits jusque très récemment par inoculation d’animaux dans les épreuves dites « ipic et ipiv » soit indices de pathogénicité par voie intracérébrale ou intraveineuse. Ces essais restent les épreuves de références pour la déclaration de la pathogénicité des virus à l’OIE mais l’AFSSA a développé des méthodes de séquençage qui permettent plus rapidement et sans utiliser de modèles animaux de déterminer le caractère hautement pathogène ou faiblement pathogène d’un virus.

- D’une manière générale, le développement par les laboratoires AFSSA de diagnostic par PCR de nombreuses maladies animales évite le recours dans de nombreux cas à l’expérimentation animale sur ces espèces cibles. De plus, quand ces PCR se

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substituent à des tests ELISA, elles permettent d’éviter la préparation des sérums de référence sur lapins ou tout au moins de diminuer leur fréquence. De même, l’utilisation de méthodes de typage moléculaire en lieu et place des méthodes de sérotypage évite la préparation des sérums de sérotypage sur lapins par exemple. Par exemple, le développement par l’Agence de techniques complètes de typage des types toxiniques de clostridium botulinum par PCR devrait permettre à terme d’éviter de nombreux essais sur souris. De même, le criblage de substances bioactives susceptibles d’inhiber le portage asymptomatique de Campylobacter et Salmonella chez les volailles est systématiquement effectué in vitro à l’aide de technique de microtitration avant le passage des molécules ainsi sélectionnées sur modèles animaux.

- Le développement de la plateforme « puces hautes densités » pour une application commune à l’ensemble des entités de l’AFSSA devrait permettre lors de l’étude de l’interaction Hôte Pathogène de diminuer le nombre d’animaux utilisés dans les expérimentations, voire dans certains cas de développer des modèles entièrement sur culture cellulaire. Ce type de modèle existe déjà pour des virus tels que le PCV2 (maladie d’amaigrissement du porcelet) ou la peste porcine classique. Des modèles de toxicologie utilisant les puces hautes densités sont actuellement en cours de développement. Même si l’on ne peut envisager que ces méthodes se substituent totalement aux essais sur animaux, notamment espèce cible, ils contribueront significativement à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans les expérimentations.

- L’utilisation d’outils de simulation et de prédiction des étapes cinétiques (ADME pour Absorption, Distribution, Métabolisme et Elimination) et d’effet pharmacologique (ADME-P) et toxicologique (ADME-T) est importante comme alternative aux expérimentations animales à des fins de réduction des coûts associés aux expérimentations animales et pour répondre aux questions éthiques posées par les étapes de développement de nouvelles molécules pharmaceutiques et l’évaluation de risque des produits chimiques. Il est donc nécessaire de développer ces approches in silico, de s’assurer de leur exactitude et de développer les connaissances en chimie théorique, et en biologie fondamentale sous tendant ce domaine scientifique. Le recours à la modélisation mathématique pour l’évaluation ADME est très développé dans le domaine pharmaceutique notamment vétérinaire (problématique des résidus) avec de nombreux outils disponibles. L’AFSSA a développé des compétences dans l’utilisation de ces outils pour analyser les études pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de médicaments vétérinaires notamment antibiotiques ainsi que leur application à l’étude des propriétés toxicocinétiques de contaminants. Le règlement REACh mentionne le recours aux techniques QSARs (Quantitative Structure-Activity Relationship) pour la toxicologie prédictive et son utilisation dans l’analyse des 30 000 substances utilisées aujourd’hui. Les enjeux du développement des outils de modélisation ADME associés avec les techniques QSARs supposent la capacité de modéliser et de prédire les processus ADME, les effets pharmacodynamiques (vis-à-vis de récepteurs clés) et des processus toxiques qui peuvent eux mêmes modifier les processus ADME. Le recours aux modélisations biocinétiques (ou PBPK pour Physiologically based pharmaco-kinetics) se développe dans le domaine pharmaceutique notamment dans la stratégie de « screening » des molécules. Les informations issues de ces simulations sont très utiles mais sont dépendantes des données d’entrée dans le modèle tant en description biologique des différentes espèces animales que des paramètres physico-chimiques décrivant les molécules et les macromolécules responsables de leur biotransformation.

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3- La place de l’expérimentation animale dans la constitution et l’évaluation des dossiers d’autorisation de mise sur le marché et l’évaluation des risques, alimentaires (dossiers évalués par l’AFSSA et/ou l’Autorité européenne de sécurité des aliments AESA)

S’il est à noter le développement croissant de méthodologies in vitro et d’outils de modélisation, leurs applications pour l’évaluation de substances bien définies (chimiques ou biologiques) sont essentiellement ciblées sur des approches prédictives ou de « screening ».

L’évaluation des ces substances, lorsque leur mise sur le marché est encadrée par des dispositions réglementaires, est subordonnée à la mise en œuvre de batteries de tests toxicologiques et toxicocinétiques chez l’animal de laboratoire, validés selon des protocoles OCDE : toxicité aigüe, génotoxicité, toxicité subchronique, toxicité chronique, étude de cancérologie, toxicité de la reproduction et du développement, neurotoxicité, etc.

Ainsi peut être citée l‘évaluation avant leur mise sur le marché des médicaments vétérinaires et des produits phytosanitaires dont l’AFSSA a la responsabilité.

Pour les aliments, de nombreuses réglementations communautaires sectorielles prévoient des études toxicologiques chez l’animal pour l’évaluation avant autorisation. Entrent dans ce cadre :- l’évaluation des additifs pour alimentation humaine,- l’évaluation des nouveaux aliments pour alimentation humaine,- l’évaluation des OGM,- l’évaluation des enzymes pour alimentation humaine,- l’évaluation des additifs pour alimentation animale,- l’évaluation des matériaux au contact des aliments.

Enfin pour conduire ses évaluations de risques pour l’Homme liés à l’exposition par voie alimentaire aux résidus de contaminants de l’environnement, l’AFSSA doit disposer d’études de toxicologie expérimentale par voie orale, réalisées sur la substance incriminée, et complétées le cas échéant par des données d’épidémiologie humaine, pour définir des valeurs toxicologiques de référence.

Le Comité scientifique de l’AESA a souligné dans un avis récent l’importance du développement de méthodologies alternatives et recommandé l’instauration d’un dialogue entre la Commission et les instances d’évaluation sur les meilleures façons d’aborder l’introduction de nouvelles méthodes validées dans les lignes directrices existantes. Il conclut que si les études de toxicité aigüe et de génotoxicité peuvent en partie être réalisées par des tests in vitro, il est prématuré de pouvoir envisager à court terme la substitution par des études in vitro des autres études toxicologiques chez l’animal.

4- Les perspectives d’évolution de ces approches alternatives à l’expérimentation animales dans les prochaines années

Elles sont de plusieurs types :- La construction de nouveaux modèles intégrant les données descriptives issues des

modèles in vitro, de la chimie et de la biochimie structurale et de la modélisation des niveaux cellulaires, d’organes et organisme entier pour la prédiction d’effet (Structural Clinical Biology).

- La standardisation des approches in silico et la validation de leur capacité prédictive.

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- Les modalités d’intégration de ces démarches dans les processus d’évaluation de risques (définition des incertitudes, responsabilité des modélisateurs) au niveau européen et international.

- La construction des bases de données et leurs accès dans un processus d’accroissement continu des connaissances.

- Le développement des compétences dans la communauté scientifique nationale (expertise), européenne et internationale et donc le développement de compétences internes pour suivre et accompagner ces évolutions.

5- Infectiologie : santé animale et sécurité des aliments

L’utilisation des modèles animaux est souvent essentielle à la compréhension des phénomènes de physiopathogénie en jeu au regard notamment des relations hôtes/pathogènes. L’approche expérimentale et, tout particulièrement, sur espèces cibles est la seule qui permette d’acquérir la connaissance nécessaire à l’amélioration de la sécurité sanitaire tant sur le plan de la santé animale que de la sécurité des aliments. Il n’est pas possible de substituer cette approche par des techniques « in vitro ». Par ailleurs, le développement de ces modèles expérimentaux est indispensable aux premières étapes d’évaluation de l’efficacité de nouveaux vaccins ou de nouvelles molécules grâce notamment à la pharmacodynamique ; ce développement de modèles est indispensable à l’obtention de matériels biologiques de référence pour garantir la qualité des réactifs et outils de diagnostic ou de détection développés par un laboratoire de recherche ou un industriel. Toute limitation excessive de telles expérimentations animales aurait des conséquences désastreuses sur la santé des animaux d’élevages et, donc, sur la maîtrise de la sécurité sanitaire. En revanche, sur le plan général, des milliers d’animaux sont utilisés par les industriels, chaque année et à l’échelle européenne, pour le contrôle d’innocuité de chaque lot de produits biologiques avant commercialisation. Ces contrôles sont souvent réalisés sur un tout petit nombre d’animaux ôtant ainsi au test une réelle signification sur le plan statistique, alors même que les processus de fabrication des vaccins se sont considérablement améliorés et garantissent une bonne reproductibilité de la qualité des lots fabriqués. L’utilité de tels tests qui sont les plus gros consommateurs d’animaux est souvent sujette à caution.

167


Philippe Juvin, Jean Lesne

L’Agence française de sécurité sanitaire de l’environnement et du travail est un établissement public administratif de l’État, réorganisé par l’ordonnance N° 2005-1087 du 1er septembre 2005 qui a transformé l’Afsse, établissement initialement créé par la loi N° 2001-398 du 9 mai 2001, en Afsset, et par le décret N° 2006-676 du 8 juin 2006.

L’Afsset est placée sous la tutelle conjointe des ministres chargés de l’environnement, de la santé et du travail.Pour deux réglementations européennes dans lesquelles les méthodes alternatives ont une place de plus en plus importante, l’Afsset est en appui des autorités compétentes :

Dans le cadre du règlement REACh :

Evaluation, autorisation, restriction et appui scientifique auprès du ministère en charge de l’écologie qui est autorité compétente.

Classification auprès du Ministère du travail qui est autorité compétente. Experts dans les Comités de l’agence des produits chimiques (ECHA).

Dans le cadre de la Directive 98/8 dite biocides :

Evaluation des dossiers substances et produits Expertise au niveau communautaire et appui scientifique auprès du ministère en

charge de l’écologie qui est autorité compétente.

L’Afsset est aussi promoteur de travaux de recherche par le financement d’un fond qui fait une part non négligeable aux projets utilisant des méthodes alternatives ainsi les projets retenus dans ce cadre sont les suivants :"NanoPIST - Nanoparticules produites intentionnellement : signatures toxicologiques","Caractérisation des effets inflammatoires du formaldéhyde dans des cellules humaines","Protéine p53 et réponse cellulaire à des nanoparticules : de la physiopathologie à l’utilisation comme biomarqueur d’exposition à des nanoparticules toxiques",Le AhR: Dr Plastique et/ou Mr EMX "Conséquences toxicologiques de l’exposition pulmonaire aux nanoparticules biodégradables","Le poisson médaka (Oryzias latipes), modèle animal pour l’étude de la toxicité et des mécanismes d’action des microcystines","Evaluation de l'impact toxicologique de la pollution particulaire (PM2,5) à Dunkerque : études sous influences industrielle, non industrielle et rurale",Evaluation in vitro de la réactivité des particules fines et ultrafines,"Immunotoxicité des insecticides : identification de marqueurs d'effets biologiques précoces dans les lymphocytes humains",

Par ailleurs le bulletin de veille de l’Afsset a une thématique sur les méthodes alternatives qui donne ainsi une meilleure visibilité aux chercheurs.

L’AGENCE FRANÇAISE DE SÉCURITÉ SANITAIRE DE L’ENVIRONNEMENT ET DU TRAVAIL (AFSSET)

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ANNEXE 5

LA LISTE DES CROs ET START-UPs INTERROGES

DANS LE CADRE DE L’ENQUÊTE DU GIS (FRANCOPA)

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Liste des CROs (Contract Research Organisation) français réalisant des études in vitro

Cette liste n’est pas exhaustive. Il conviendra ultérieurement, dans le cadre des activités du GIS de mettre en œuvre un travail de recensement de ces PME.

SOCIÉTÉ COORDONNÉES

ADME Bioanalyses 75 Chemin de Sommières30310 VERGEZE

ALBHADES ProvenceZA les Roubines BP 51 04700 ORAISON

AVOGRADO Parc de Génibrat31470 FONTENILLES

BAYER HEALTHCARE355 Rue DostoîevskiBP15306906 SOPHIA Antipolis

BIOalternatives 1bis, rue des plantes86160 GENÇAY

BIO-HCParc d’activités de Magellan14 rue Claude Chappe33600 PESSAC

BIOMATECHZI de l’Islon115 rue Pasteur38760 CHASSE/RHONE

BIOPREDICParc d’affaire de la BretècheBât B135760 SAINT-GREGOIRE

Biopredic International 8 rue Jean Pecker35000 RENNES

BIOPROJET-BIOTECH4 rue du Chesnay BeauregardBP 9620535762 SAINT GREGOIRE CEDEX

BIOTEC CENTRE 10 avenue Claude Guillemin45071 ORLEANS Cedex

CellvaxGenopole Pepiniere Entreprise4 rue Pierre Fontaine91058 Evry

CEPHALON 19 avenue du Pr Cadiot94704 MAISONS-ALFORT

CERB Chemin de Montifault18800 Baugy

CITCIT Safety and Health Research Laboratories BP 563 27005 EVREUX

Evic France48, rue Jean-Duvert33290 Blanquefort France

Genosafe1, rue de l’Internationale BP 4006491002 Evry Cedex

170


I.E.C.Institut d'Expertise Clinique88 Bd des Belges69006 LYON

Labo de tox alimentaireUniversité de Bretagne Occidentale

EA 3880 UFR Sciences et Techniques6 avenue le GORGEUCS9383729238 Brest Cedex 3

MDS-Pharma Lyon 1-3 Avenue du Bosquet95560 Baillet en France

OroxcellParc Biocitech102 avenue Gaston Roussel93230 Romainville

Oxincell 104 rue de la Galéra 34090 Montpellier

PORSOLT ET PARTNERS Pharmacology 9 Bis rue Henri Martin92100 BOULOGNE BILLANCOURT

RD-Biotech 3, rue Henri Baigue25000 Besançon

Vigicell SAS 7 rue Guy Moquet – BP 894801 Villejuif Cedex

WATCH FROGPépinière Genopole Entreprises4 rue Pierre Fontaine91000 EVRY

Xenoblis Parc d'Affaires de la Bretèche Bâtiment B1 35760 Saint Grégoire

171


ANNEXE 6

LE GLOSSAIRE

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GLOSSAIRE

3R : Replace, Reduce, Refine

ADME : Absorption Distribution Métabolisme et Elimination

ADME-P : Absorption Distribution Métabolisme et Elimination Pharmacologique

ADME-T : Absorption Distribution Métabolisme et Elimination Toxicologique

ADN : Acide DésoxyriboNucléique

AESA : Autorité Européenne de Sécurité Alimentaire

AFNOR : Agence Française de NORmalisation

AFSSA : Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments

AFSSAPS : Agence Française de Sécurité SAnitaire des Produits de Santé

AFSSET : Agence Française de Sécurité Sanitaire de l’Environnement et du Travail

AFSTAL : Association Française des Sciences et Techniques de l’Animal de Laboratoire

AMM : Autorisation de Mise sur le Marché

ANR : Agence Nationale de la Recherche

ANR ARC : Agence Nationale de la Recherche contre le cancer

ANR CANTO : Agence Nationale de Recherche Chimie ANalyse décisionnelle TOxicité

ANTIOPES : Réseau national français pour le développement des outils prédictifs pour la toxicologie environnementale

APESA : Centre Technologique en Environnement et Maîtrise des Risques

ARC : Association pour la Recherche sur le Cancer

ARET : Association pour la Recherche en ToxicologieARN messager ou ARNm

: Acide RiboNucléique messager

ARP Pro-REACh : Atelier de Réflexion Prospective sur les Programmes de REACh

(Registration, Evaluation, Autorisation of Chemicals)ASPA : Agents de Surface et Produits Auxiliaires

AVENIR : Formations de Recherche de l’INSERM

BCOP : Bovine Cornea Opacity and Permeability

BPC : Bonnes Pratiques Cliniques

BPF : Bonnes Pratiques de Fabrication

BPL : Bonnes Pratiques de Laboratoire

BSP Programme de standardisation biologique

CCPA : Conseil Canadien de Protection des Animaux

CD34-DC : Modèle in vitro de cellules dendritiques obtenues par différenciation de progéniteurs hématopoïétiques CD34+

CE : Communauté Européenne

CEA : Commissariat à l’Energie Atomique

CEFIC : European Chemical Industry CouncilCellules CaCo2 : Modèle de passage et de métabolisme intestinal

CEN : Comité Européen de Normalisation

CES : Comité d’Experts Spécialisés

173


CESIO : Comité Européen des agents de Surface et de leurs Intermédiaires Organiques

CIC : Formations de recherche de l’INSERM

CLHP : Chromatographie Liquide à Haute Performance

CL-SM : Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse

CNEA : Commission Nationale de l’Expérimentation Animale

CNREEA : Comité National de Réflexion Ethique sur l’Expérimentation Animale

CNRS : Centre National de la Recherche Scientifique

COLIPA : European cosmetic association

COSMED : Association des PME-PMI de la filière cosmétique

CRO : Contract Research Organisation

DGCCRF : Direction Générale de la Concurrence de la Consommation et de la Répression des Fraudes

DGS : Direction Générale de la Santé

DM : Dispositifs Médicaux

DMDIV : Dispositifs Médicaux de Diagnostic In Vitro

DPRA : Direct Peptide Reactivity Assay

ECHA : European CHemicals Agency

ECOPA : European COnsensus Platform for Alternatives

ECVAM ou CEVMA : European Centre for the Validation of Alternative Methods

ou Centre européen pour la validation des méthodes alternativesEDQM ou DEQM : European Directorate for the Quality of Medicines and healthcare ou

Direction Européenne de la Qualité du MédicamentEFfCI : European Federation for Cosmetic ingredients

EFOR : Etudes Fonctionnelles sur les animaux modèles

EFPIA : European Federation of Pharmaceuticals Industries and Associations

EFSA : : European Food Safety Authority

ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

EMEA : European Medicines Evaluation Agency

EPAA : European Partnership for Alternative Approaches to animal testing

ERASM : Environmental Risk Assessment Steering Management committee

ERI : Formations de Recherche de l’INSERM

ES : Embryonic Stem ESPRI : Formations de Recherche de l’INSERM

EST : Embryonic Stem cell Test

F&F : Food and Fecundity

FEBEA : Fédération des Entreprises de la BEAuté

FEGA : Fetal gonadal essay

FP6 : Les programmes de Recherche et développement européens

GIRCOR : Groupe Interprofessionnel de Réflexion et de COmmunication sur la Recherche

GIS : Groupement d’Intérêt Scientifique

GIS IBiSA : Groupement d’Intérêt Scientifique Infrastrutures en Biologie Santé et Agronomie

174


GRICE : Groupement de Réflexion Interprofessionnel sur les Comités d’Ethique

GTINC : Groupe de Travail Innovation Non Clinique

HepaCellTox : Contrat ANR-SEST

Hepa-RG, : Human Hepatocyte Cell Ligne

HERA : Human and Environmental Risk Assessment

hERG : Modèle cellulaire pour prédire des effets cardiotoxiques

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

IASP : Association internationale pour l’étude de la douleur

IBiSA ROCAD : Réseau Opérationnel de Centres pour faciliter l'Accès et la Distribution des modèles souris

ICAPO : International Council on Animal Protection at OECD programmes

ICCR : International Cooperation on Cosmetic Regulation

ICCVAM : Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods

ICH : International Conference of Harmonisation

IFR : Formations de Recherche de l’INSERM

IFREMER : Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la MER

IgE : Immunoglobuline E

IMI : Innovative Medicines Initiative

INC : INstitut de la Chimie

INEE : INstitut Ecologie et Environnement (CNRS)

INERIS : Institut National de l’Environnement industriel et des RISques

INGRECOS : INGREdients COSmétiques

INRA : Institut National de la Recherche Agronomique

INRS : Institut National de Recherche et de Sécurité

INSB : Institut National des Sciences Biologiques

INSERM : Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale

iPS : Induced Pluripotent Stem

IRM : Imagerie par Résonance Magnétique

ISO : International organization for standardization

ITS : Integrated Testing Strategies

JaCVAM : Japanese Center for the Validation of Alternative Methods

JRC : Joint Research Centre

LAL : Limulus Amebocyte Lysate

LEEM : Les entreprises du médicament

LFDA : La Fondation Droit Animal, Ethique et Sciences(ex Ligue Française des Droits de l’Animal)

LLNA : Local Lymph Node Assay

LRI : Long Range Research Initiative

MAAP : Ministère de l’Alimentation de l’Agriculture et de la Pêche

mAbs : Monoclonal AntiBodieS

MAPREC : Mutant Analysis by PCR and Restriction Enzyme Cleavage

175


MESR : Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche

MET : Microscopie Electronique à Transmission

Mo-DC : Modèle in vitro de cellules dendritiques obtenues par différenciation de monocytes du sang circulant

MRT : Magnetic Resonance Tomography

MUTZ-3 : Lignées cellulaires humaines de type monocytaire

NC3R : National Center Replace Reduce Refine UK

NIRF : Near InfraRed Fluorophores

NRU : Neutral Red UptakeOCDE ou OECD : Organisation de Coopération et de Développement Economiques

ou Organisation for Economic Co-operation and Development’s

OCDE TG : Organisation de Coopération et de Développement Economiques (Test Guidelines)

OGM : Organismes Génétiquement Modifiés

OIE : Organisation mondiale de la santé animale

Omics :néologisme anglais qui désigne un domaine d'étude en biologie se terminant par le suffixe «-omique », tel que la génomique, la transcriptomique, la protéomique ou la métabolomique

OMS-FAO : Organisation Mondiale de la Santé - Food and Agriculture Organization of the United Nations

ONG : Organisation Non Gouvernementale

OPAL : Recherche expérimentale et protection de l’animal de laboratoire

PBPK : Physiologically Based Pharmaco-Kinetic

PCR : Polymerase Chain Reaction

PCRD : Programme Cadre de Recherche et Développement de l’Union Européenne

PME : Petites et Moyennes Entreprises

PNSE : Plan National Santé Environnement

QSAR : Quantitative Structure-Activity Relationship

R&D : Recherche et Développement

REACh : Registration, Evaluation, Autorisation of Chemicals

rLLNA : Reduced Local Lymph Node Assay

RMN : Résonance Magnétique Nucléaire

RMN 1 et 2D : Résonance Magnétique Nucléaire 1 et 2 dimensions

SCF : Scientific Committee on Food

SCHER : Scientific Committee on Health and Environmental Risk

SFPT : Société française de Pharmacologie et de Toxicologie

SIEF : Substance Information Exchange Forum

SPA : Société Protectrice des Animaux

SPECT : Single Photon Emission Compucted Tomography

SPTC : Société de Pharmaco-Toxicologie Cellulaire

TEP : La Tomographie par Emission de Positrons

THP-1 : Lignées cellulaires humaines de type monocytaire

U.I. : Unités Internationales

UFZ : Helmholtz Centre for Environmental Research - (Germany)

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UIC : Union des Industries Chimiques

UPJV : Université de Picardie Jules Verne

US EPA : United States Environmental Protection Agency

UTC : Université de Technologie de Compiègne

VMG : Validation Management Group

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Documents

FRANCOPA Plateforme française pour le développement des ... · GR O U P E M E N T D ’ IN T É R Ê T SC I E N T I F I Q U E FRANCOPA Plateforme française pour le développement