Gene GreenTK - Centrale Marseille · Année 2015-2016 Décontamination externe des organophosphorés par voie enzymatique 04/04/2016-16/09/2016 Gene&GreenTK Faculté de Médecine

Ecole Centrale Marseille – Parcours GREEN « biotechnoloGie,

ingénieRie, Energie, ENvironnement »

Année 2015-2016

Décontamination externe des organophosphorés par voie enzymatique

04/04/2016-16/09/2016

Gene&GreenTK

Faculté de Médecine La Timone, Marseille,

Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes,

URMITE

POIRIER Laetitia

Soutenance : Lundi 19 Septembre 2016

Directeur : Pr. RAOULT Didier

Encadrants : Pr. CHABRIERE Éric / Dr. DAUDE David

Tuteur Centrale Marseille : Mme. DUPRAT Françoise

Gene&

GreenTK

Décontamination externe des organophosphorés par voie enzymatique (Septembre 2016) Poirier Laetitia

2

Résumé Le travail réalisé dans le cadre de mon Travail de Fin d'Etude s'est axé sur la mise en œuvre d'enzymes

capables de dégrader les agents neurotoxiques de guerre et insecticides organophosphorés. Le

laboratoire URMITE, en collaboration avec la société Gene&GreenTK et la Direction Générale de

l'Armement, a mis au point des formulations de décontamination à base d'enzymes capables de

dégrader ces composés hautement toxiques en seulement quelques minutes. Contrairement aux

méthodes classiques, la solution développée est douce et peut être utilisée pour la décontamination

des personnes, du matériel sensible ou encore la réhabilitation des sites contaminés. Deux enzymes

ont été considérées durant ces travaux: la phosphotriestérase bactérienne de Brevundimonas

diminuta et l'enzyme SsoPox issue de l'archée hyperthermophile Sulfolobus solfataricus

respectivement très efficaces pour dégrader les agents neurotoxiques de guerre et les insecticides. De

plus, l'enzyme SsoPox présente des propriétés de résistante très intéressantes pour des applications

biotechnologiques (température, solvants, stockage, détergents etc.).

Mon sujet a consisté dans un premier temps à optimiser la production de ces enzymes pour accroitre

les rendements et ainsi diminuer les coûts de fabrication. Les protocoles d'expression et les milieux

réactionnels ont notamment été modifiés ce qui a permis d'augmenter jusqu’à un facteur 100 l'activité

des formulations. Un aspect réglementaire lié à la production d'enzymes recombinantes a également

été abordé. En effet, il est nécessaire de démontrer qu'il ne reste aucune trace d'ADN résiduel dans

l'extrait enzymatique final en utilisant une endonucléase* lors de la production. Différents aspects de

la production ont donc été améliorés ce qui va permettre un transfert rapide vers l'échelle pilote puis

pré-industrielle.

Dans le but d'étendre le portefeuille de produits proposé par la société, une autre phase de ce projet

a consisté à réaliser des essais d'immobilisation de l'enzyme SsoPox. Une méthode basée sur la

réticulation de protéines par action du glutaraldéhyde a permis d'incorporer l'enzyme dans des billes

d'alginate. Ceci permet de disposer d'un biocatalyseur solide qui pourra être utilisé pour le traitement

des effluents souillés par des organophosphorés.

Enfin, une dernière étude a permis d’évaluer le spectre d’action de l’enzyme SsoPox par des études en

chromatographie en phase gaz couplée à de la spectrométrie de masse (GC/MS). Une dizaine

d’insecticides ont ainsi pu être dégradés en présence de SsoPox.

Abstract The subject of my internship is focused on the implementation of enzymes able to degrade chemical

organophosphorus warfare agents and pesticides. The URMITE laboratory, in close collaboration with

the start-up Gene&GreenTK and the DGA (« Direction Générale de l’Armement » in French), has

developed enzyme-based decontamination formulations able to degrade quickly (few minutes) these

highly toxic compounds. Conversely to current methods, the solution can be used in a smooth way for

the external decontamination of both human and sensitive material or for the rehabilitation of

contaminated sites. Two enzymes have been studied: the bacterial phosphotriesterase from

Brevundimonas diminuta and SsoPox from the hyperthermophile archaea Sulfolobus solfataricus

which are very efficient for the degradation of chemical warfare agents and insecticides respectively.

Moreover SsoPox is extremely robust (resistance to temperature, solvents, storage, detergent etc.)

which is highly appealing for various biotechnological applications.

My work was first focused on optimising the production of these enzymes to decrease manufacturing

costs and increase competitiveness. The protocols for the expression and the reaction medium were

modified to increase the activity up to 100-fold. A regulatory aspect related to the use of recombinant


3

enzymes was investigated. Indeed, we have to demonstrate that there is no trace of residual DNA in

the final enzymatic solution. In this purpose the use of endonucleases was considered. Thus different

production aspects have been improved and will pave the way for a quick transfer to the pilot and then

the industrial scales.

In order to extend the product portfolio proposed by the society, another aspect of my work was

dedicated to the immobilization of the highly stable enzyme SsoPox. A cross-linking method based on

the reticulation of proteins using glutaraldehyde was considered to incorporate the enzyme inside

alginate beads. This method provides a solid biocatalyst that can be incorporated into filtration devices

for the decontamination of effluents soiled by organophosphorus compounds.

Finally, in order to probe the substrate spectrum of SsoPox, the potential of the enzyme to degrade

various pesticides was considered using a gas chromatography-mass spectrometry method (GC/MS).

In this way, ten pesticides were detected as degraded after 24 hours in contact with SsoPox.

Mots-clés

Phosphotriesterase (PTE)

Phosphotriesterase-like-lactonase (PLL)

Pesticides

Agents neurotoxiques de guerre

Immobilisation enzymatique

Réticulation

GC/MS


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Sommaire

Introduction .............................................................................................................................................6

1. Université Aix-Marseille – URMITE .....................................................................................................7

2. Gene&GreenTK ....................................................................................................................................7

3. Recherches bibliographiques ..............................................................................................................9

3.1 Organophosphorés .........................................................................................................................9

3.1.1 Insecticides ..............................................................................................................................9

3.1.2 Agents neurotoxiques de guerre .......................................................................................... 10

3.2 Méthodes actuelles de décontamination .................................................................................... 11

3.3 Enzymes bioépuratrices............................................................................................................... 12

3.3.1 Phosphotriestérases bactériennes ....................................................................................... 13

3.3.2 « Phosphotriesterase-like-lactonase » SsoPox ..................................................................... 13

3.4 Immobilisation d’enzyme ............................................................................................................ 14

4. Présentation du stage ....................................................................................................................... 17

4.1 Production des PTEs .................................................................................................................... 17

4.2 Immobilisation ............................................................................................................................ 17

4.3 Spectre d’action de SsoPox.......................................................................................................... 18

5. Résultats et discussion ..................................................................................................................... 19

5.1 Production des PTEs .................................................................................................................... 19

5.1.1 Amélioration des rendements de production ...................................................................... 19

5.1.2 Aspect réglementaire : présence d’ADN résiduel ................................................................ 19

5.2 Immobilisation SsoPox ................................................................................................................. 21

5.2.1 Amélioration de la méthode ................................................................................................ 22

5.2.2 Etude de la stabilité .............................................................................................................. 23

5.3 Spectre d’action de SsoPox.......................................................................................................... 24

5.3.1 Dégradation des OPs ............................................................................................................ 24

5.3.2 Cinétiques de dégradation ................................................................................................... 26

6. Conclusion ............................................................................................................................... 27

Définitions .................................................................................................................................. 28

Acronymes .................................................................................................................................. 28

Remerciements ........................................................................................................................... 29

Bibliographie ............................................................................................................................... 30

Tables des illustrations ................................................................................................................ 32


5

Matériel et méthodes .................................................................................................................. 33

Production-Purification des PTEs ...................................................................................................... 33

Gel SDS-Page ..................................................................................................................................... 33

Test d’activité .................................................................................................................................... 34

Electrophorèse sur gel d’agarose ...................................................................................................... 34

« Polymerase Chain Reaction » ........................................................................................................ 34

Immobilisation SsoPox....................................................................................................................... 35

GC/MS................................................................................................................................................ 35

Annexes : Présentation des projets de Gene&GreenTK

Explications des valeurs KM et Kcat

Production des PTEs


6

Introduction

Les organophosphorés (OPs) sont des composés toxiques qui inhibent de façon irréversible

l’acétylcholinestérase (AChE), une enzyme clé dans la transmission du message nerveux1,2. Depuis la

seconde guerre mondiale, de nombreux composés hautement toxiques ont été créés comme le sarin,

soman, VX, tabun, paraoxon, parathion, malathion3. De nombreux OPs ont été développés comme

agents neurotoxiques de guerre (CWNA pour Chemical Warfare Nerve Agent en anglais) constituant

une menace en cas de conflit armé4,5. Ces molécules sont extrêmement toxiques car quelques gouttes

en contact avec la peau d'un individu sont suffisantes pour provoquer sa mort. La décontamination de

ces agents est donc primordiale dans le secteur militaire mais également civil puisque le sarin a, par

exemple, été utilisé à des fins terroristes lors de l'attaque du métro de Tokyo en 1995 par la secte

"Aum Shinrikyo". L’utilisation des OPs concerne également le développement de l’agriculture et la

lutte contre les insectes6,7. L’utilisation massive des pesticides a conduit à d’importantes pollutions et

est responsable de millions d’intoxications ainsi que 200 000 morts par an. En outre, la forte toxicité

des insecticides OPs associée à leur accessibilité relativement aisée font de ces molécules une menace

terroriste extrêmement sérieuse. La recrudescence des attaques terroristes durant ces derniers mois,

à Paris et Bruxelles notamment, montre que le besoin de solutions d'urgence pour la décontamination

des agents neurotoxiques organophosphorés est plus que jamais d'actualité.

Actuellement, les méthodes pour dégrader les organophosphorés sont agressives, couteuses et

présentent des risques pour l’environnement8. Nous traiterons plus en détails ces méthodes dans la

suite du rapport. L'utilisation d'enzymes bioépuratrices constitue une alternative extrêmement

prometteuse pour la décontamination des OPs car leur utilisation est non toxique et respectueuse de

l’environnement.

Parmi ces enzymes bioépuratrices, les phosphotriesterases (PTEs), appartenant à la famille des

aminohydrolases, sont des enzymes qui catalysent l’hydrolyse d’une large gamme de composés avec

des propriétés chimiques différentes comme les esters, les amides, les phosphoesters etc. dont les

dérivés insecticides9, 10. Une sous-famille a récemment été découverte : les « phosphotriesterase-like-

lactonase » (PLLs). Nous allons particulièrement nous attarder sur la PLL hyperthermophile, SsoPox

provenant d’une archée Sulfolobus solfataricus vivant dans les sources d’eau chaude du Vésuve. Cette

enzyme est capable d’hydrolyser les insecticides mais doit être optimisée pour être efficace sur les

CWNAs10. De plus, face à la menace terroriste, une contre-mesure d’urgence basée sur l’utilisation de

PTEs, moins stable que SsoPox mais efficace contre les CWNAs, a été mise en place pour pouvoir agir

rapidement en cas de nécessité 11-13.

Mes travaux de stage se sont articulés principalement autour de la décontamination externe des

organophosphorés par voie enzymatique et s’insèrent plus particulièrement au sein du contrat d’étude

et de recherche intitulé DANUBE (Décontamination des Agents Neurotoxiques par Utilisation de

BioEpurateurs) signé entre la Direction Générale de l’Armement (DGA) et l’Université Aix-Marseille. Ce

projet a pour but de mettre au point des solutions enzymatiques contre les agents neurotoxiques de

guerre. Les principaux objectifs de ce stage ont consisté à réaliser un criblage sur une série de

pesticides pour déterminer le spectre d’action des enzymes et d’améliorer leur production ainsi que

d’étudier leur immobilisation afin d’en diversifier les applications.


7

1. Université Aix-Marseille – URMITE

L’URMITE est une unité de recherche multidisciplinaire dédiée à l’étude des pathogènes émergents et

ré-émergents. La cohérence de l’unité est thématique et les travaux proposés abordent tous les

aspects cliniques, épidémiologiques, écologiques, taxonomiques, diagnostiques et thérapeutiques des

maladies étudiées et va de l’observation de la pathologie humaine à l’étude du génome*, du

transcriptome* et du protéome* de ces microorganismes.

L’URMITE est l’une des unités de la Fondation « Infectiopôle Sud » créé en 2007, qui rassemble des

équipes scientifiques et médicales du Sud de la France pour développer des projets démontrant une

continuité entre recherche fondamentale, recherche clinique et soins innovants, au bénéfice de la

santé de l’homme et du progrès médical. L’infectiopôle sud va devenir l’Institut Hospitalo-Universitaire

(IHU) de Maladies Infectieuses retenu par l’état dans le cadre du programme Investissements d’avenir

dans les mois à venir. En effet, la fondation est appelée à devenir un pôle attractif mondial dans le

domaine des maladies infectieuses.

L’IHU a pour objectif de d’améliorer les moyens de lutte contre les maladies infectieuses, première

cause de mortalité dans le monde avec 17 millions de morts par an, et notamment les trois tueurs

mondiaux connus : le VIH, la tuberculose et le paludisme.

2. Gene&GreenTK

La société Gene&GreenTK isole et optimise des enzymes issues d'organismes vivant dans des

environnements extrêmes pour des applications allant du domaine médical, à l'agroalimentaire en

passant par la Défense et le phytosanitaire.

Issue de la recherche académique, la société a été créée suite aux travaux du Pr. Eric Chabrière de l'IHU

de Marseille qui travaille, depuis près d'une dizaine d'années en collaboration avec la DGA, sur des

problématiques liées à la décontamination des insecticides et agents neurotoxiques de guerre

organophosphorés. L'enzyme SsoPox issue d'une archée vivant dans les sources d'eau chaude du

Vésuve a ainsi été identifiée. Un premier contrat de recherche financé par la DGA a permis d'améliorer

l'efficacité jusqu'à 2000 fois pour la dégradation de certains insecticides OPs.

Suite à ces travaux la société a vu le jour en Juin 2013 afin de développer, de produire et de

commercialiser l’enzyme SsoPox. Un consortium a été mis en place entre la DGA et Gene&GreenTK

sous la forme d'un contrat de recherche pour améliorer l'efficacité de l'enzyme pour la dégradation

des CWNAs. La DGA souhaite ainsi acquérir des technologies de décontamination externe des OPs qui

lui font actuellement défaut.

Grace à son hébergement au sein de l’IHU, Gene&GreenTK dispose d'un accès privilégié à un

équipement de pointe pour mener à bien ses phases de recherche et développement. Elle a reçu de

nombreux soutiens notamment de la part de la DGA qui finance plusieurs projets de recherche de

l'entreprise. En effet, outre la dégradation des organophosphorés, la société développe également des

enzymes capables d'inhiber la virulence bactérienne et a mis en place un consortium avec la DGA et

les laboratoires URGO pour développer un pansement anti-infectieux. En annexe vous trouverez deux

posters présentant la société Gene&GreenTK.


8

En 2013, Gene&GreenTK a été lauréate du Concours National d’Aide à la Création d’Entreprises de

Technologies Innovantes (CNACETI). L'entreprise a également reçu le premier prix des "Tremplins de

l'économie" organisés par le quotidien régional La Provence en 2014. La société a récemment été

lauréate du "Concours national d’aide à la création d’entreprises de technologies innovantes I-Lab

2015" organisé par la Banque Publique d’Investissement. Elle a également obtenu en octobre dernier

un prix spécial lors du "Trophée de l'Intelligence Alimentaire" organisé par l'Agroparc d'Avignon pour

ses travaux sur la décontamination des pesticides. La société accorde par ailleurs une grande

importance à la communication sur ses découvertes. Elle a bénéficié d'une couverture médiatique non

seulement régionale (La Provence, La Marseillaise, France3 Provence-Alpes, Medias du sud) mais

également nationale (Les échos, Outre-mer 1ère, Le Figaro, I-Télé, France Info).


9

3. Recherches bibliographiques 3.1 Organophosphorés

Découverts dans les années 1820 par des chimistes français14, les OPs sont des molécules synthétiques

constituées d’un centre phosphore lié à un atome terminal pouvant être soit un oxygène ou un soufre

(Fig.1).

Figure 1: Formule chimique d'un organophosphoré (LG : groupe partant)

Les OPs sont considérés comme neurotoxiques du fait de leur capacité à inhiber l’AChE. En effet, ces

derniers se fixent de manière covalente à un résidu serine au sein du site actif de l’enzyme, rendant

l’AChE incapable de cliver le neuromédiateur acétylcholine et provoquant l’activation permanente des

récepteurs nicotiniques et muscariniques. Cette activation permanente bloque la transmission

transitoire du message nerveux provoquant des convulsions, des risques cardiaques, une salivation

importante pouvant entrainer la mort de la personne exposée 15. Ces composés sont principalement

dans l'agroalimentaire en tant qu’insecticides ainsi que dans le secteur militaire comme armes

chimiques de guerre.

3.1.1 Insecticides

Les insecticides sont des composés chimiques utilisés pour lutter contre des organismes nuisibles pour

certaines cultures. Cependant, ces derniers sont considérés comme les polluants toxiques les plus

répandus et utilisés dans le monde. Aujourd’hui les OPs représentent environ 40% des ventes de

pesticides dans le monde14. Ces composés sont très divers et les principaux pesticides

organophosphorés sont présentés en figure 28.

Pour illustrer la toxicité de ces composés, prenons l’exemple de deux insecticides, l’éthylparathion et

le diazinon dont les DL50 en ingestion chez le mammifère ont été estimées à 2-10 mg/kg et 80-300

mg/kg, respectivement14. L’utilisation massive de ces insecticides a conduit à d’importantes pollutions

des eaux de ruissèlements, des sols ou encore des aliments et serait responsable de millions

d’intoxications ainsi que 200 000 morts par an. De plus, ces molécules peuvent persister dans les sols

pendant plusieurs mois.

‘


10

Figure 2: Présentation des principaux pesticides organophosphorés

3.1.2 Agents neurotoxiques de guerre

La première production massive d’OPs a été réalisée par des scientifiques allemands pendant la

Seconde Guerre mondiale. Ces OPs sont alors appelés agents G (pour Germany) dont les principaux

agents sont le tabun, le sarin et le soman. Un second type d’OPs est apparu les années suivantes,

appelés agents V (pour Victory, Venomous ou Viscuous) comme le VX développé par les USA ou encore

le RVX par la Russie8. De même que pour les pesticides, les CWNAs sont nombreux, les principaux étant

présentés en figure 3.


11

Figure 3: Présentation des principaux CWNAs organophosphorés

Ces composés sont, pour la plupart, plus toxiques que les pesticides présentés précédemment. En ce

qui concerne les agents G, le sarin et le tabun, les DL50 en ingestion sont respectivement chez les

mammifères de 8,8 mg/kg et 26 mg/kg alors que pour le VX, la DL50 est de 34 µg/kg14. Parmi ces

composés, le sarin est le plus répandu alors que le VX est le plus toxique et le plus stable. Ces composés

ont été mis en œuvres à des fins militaires, par exemple par Sadam Hussein qui a utilisé le tabun contre

les Iraniens. En effet, en 8 ans, 387 attaques chimiques exposèrent 100 000 soldats aux OPs et tuèrent

20 000 hommes14. Face à ces utilisations, un traité de non-prolifération a été signé par de nombreux

pays pour interdire l’utilisation de ces armes chimiques. Il reste toutefois d’importants stocks de ces

agents accumulés durant la seconde guerre mondiale qui nécessitent d’être détruit. Bien que leur

utilisation soit aujourd’hui proscrite, ces composés ont parfois été détournés à des fins terroristes ou

utilisées dans des conflits asymétriques. Le gaz sarin a par exemple été utilisé lors de l’attaque du

métro de Tokyo en 1995 (5 500 victimes dont 12 décès). Bien que le nombre de victimes fût

relativement faible, l’impact psychologique de ce terrorisme fut énorme et mit en évidence la

désorganisation des services de secours non préparés à de telles attaques. L’utilisation de ce type de

composés a été mise en évidence récemment en Syrie.

3.2 Méthodes actuelles de décontamination

Les principales méthodes présentées sont extraites d’une revue publiée en partie par les membres de

l’équipe URMITE dans laquelle les travaux de stage ont été réalisés8.


12

Les méthodes actuelles de décontamination des OPs peuvent être séparées en trois catégories ;

- La décontamination physique basée sur l’absorption, l’élimination de l’agent toxique sans destruction

de celui-ci,

- La décontamination chimique permettant de neutraliser l’agent par réaction chimique,

- La décontamination enzymatique utilisant des enzymes capables d’hydrolyser les pesticides ou les

agents chimiques.

Certaines méthodes permettent de décontaminer le matériel, par exemple une solution d’hypochlorite

de sodium ou d’hydroxyde de sodium mais celles-ci sont agressives et ne peuvent pas être utilisées

pour traiter des victimes. D’autre part, la pénétration des OPs au sein du corps étant rapide, les

méthodes de décontamination pour les personnes doivent être efficaces à l’échelle de l’individu pour

limiter les effets. Différentes technologiques ont été développées comme les gants poudreurs à base

de terre à Foulon (poudre absorbante) utilisés pour la décontamination de liquides toxiques persistants

se trouvant sur la peau et/ou des équipements, ou le RSDL (lingette imbibée d’une solution

décontaminante) utilisé pour le nettoyage de la peau, cependant ces solutions individuelles ne peuvent

pas être utilisées à grande échelle.

Les méthodes actuelles sont peu efficaces à grande échelle et leur utilisation est généralement limitée

car agressive. Un intérêt particulier pour le développement de nouvelles stratégies de

décontamination est apparu depuis quelques années pour limiter les effets liés aux intoxications des

OPs. La solution de décontamination idéale présenterait une grande efficacité, un large spectre

d’action, une utilisation compatible avec la peau, sans impact environnemental, ni contamination

secondaire et un faible prix. Des techniques alternatives sont en développement comme l’utilisation

de cyclodextrines pour piéger les OPs ou encore des méthodes photochimiques dégradant les OPs par

irradiation. Une attention particulière est portée aux enzymes capables de dégrader ces composés car

elles agissent dans des conditions douces de réaction (milieu aqueux, pH 7.0-8.0), sont non toxiques

et sans impact environnemental.

3.3 Enzymes bioépuratrices

Les enzymes qui catalysent l’hydrolyse des OPs sont issues de différents organismes, comme la

prolidase (OPAA) identifiée dans une souche d’Alteromonas16 et la diisopropylfluorophosphatase

(DFPase) de Loligo vulgaris17. Chez l’Homme, la paraoxonase humaine (HuPON1) hydrolyse aussi les

phosphotriesters et est responsable de la protection naturelle des mammifères contre les

insecticides18–20. D’autres enzymes bactériennes, appelées phosphotriestérases (PTE) sont les enzymes

les plus actives contre les OPs21,22. Des PTEs ont été isolées à partir de différents organismes tels que

Brevundimonas diminuta,23 Flavobacterium sp.,24 ou encore Agrobacterium radiobacter25,26. Ces

enzymes semblent avoir spécifiquement évolué depuis l’utilisation massive d’insecticides

organophosphorés dans les années 50 jusqu'à atteindre la perfection catalytique envers certains

substrats (kcat/KM≈108M-1s-1)27. En annexe, les explications de Kcat et KM sont présentées. Ces enzymes

hautement actives constituent une alternative intéressante pour une bio-décontamination efficace du

matériel, des sols, des aliments, de l’eau et de la peau. Néanmoins leur faible stabilité et leur faible

rendement de production constituent un frein à leur utilisation23.


13

Afin de produire des bio-épurateurs efficaces et résistants, les enzymes issues d'organismes

extrêmophiles sont intéressantes, notamment ceux vivant à hautes températures28,29. Les protéines

issues de tels organismes ont un potentiel industriel direct en raison de leurs propriétés uniques

comme l’activité et la stabilité à températures extrêmes qui sont souvent requises dans les procédés

industriels30,31. Ces enzymes ont généralement une longue durée de vie (plusieurs mois voire années),

ce qui leur permet d'être stockées sans perte d'activité. Elles constituent également des cibles de choix

pour l’ingénierie des protéines car leur grande stabilité leur confère une maniabilité biochimique

particulièrement intéressante32,33.

En recherchant une enzyme thermostable capable de dégrader les OPs, SsoPox a été isolée de l’archée

hyperthermophile Sulfolobus solfataricus28,34,35. SsoPox est une enzyme hyperthermostable

appartenant à la famille des « Phosphotriesterases-Like Lactonases » présentant une activité naturelle

lactonase (hydrolyse des lactones) ainsi qu'une activité de promiscuité phosphotriestérase (hydrolyse

des organophosphorés). Cette enzyme est extrêmement stable et présente un très fort potentiel

biotechnologique pour la décontamination externe des organophosphorés. En effet sa stabilité lui

confère d'une part un large spectre applicatif mais également une tolérance aux mutations pour

l'amélioration de son activité de dégradation des OPs par des techniques d'ingénierie enzymatique.

Finalement, les phosphotriestérases bactériennes étant très performantes et l'enzyme SsoPox

extrêmement robuste, ces dernières sont particulièrement intéressantes pour le développement de

solution de décontamination.

3.3.1 Phosphotriestérases bactériennes

Les phosphotriesterases bactériennes sont codées par les gènes opd (organophosphate degradation

en anglais). Les PTEs sont des métalloprotéines homodimériques de 35kDa en moyenne présentant

une structure en tonneau (α/β)8 (TIM Barrel en anglais). De plus, le site actif est composé d’un centre

bimétallique au niveau de la partie C-terminale du tonneau9. La nature du centre bimétallique peut

varier en fonction des enzymes mais on retrouve particulièrement les cations fer, cobalt et zinc9, 14.

Avec l’utilisation massive des insecticides, les bactéries ont développé naturellement de nouvelles

aptitudes pour dégrader les OPs. Des études d’évolution dirigée en laboratoire ont permis, par la suite,

d’améliorer encore ces activités pour atteindre des efficacités catalytiques exceptionnelles jusqu’à

kcat/KM ~ 108 M-1s-1 pour la dégradation des OPs36.

Les résultats liés à trois enzymes mésophiles, appelées variant 1,2 et 3, précédemment optimisées

pour la dégradation des agents G et V décrits 11, 12, 13 sont présentés dans la suite du rapport.

3.3.2 « Phosphotriesterase-like-lactonase » SsoPox

Les PLLs 9 sont retrouvées chez de nombreux organismes procaryotes (bactéries et archées). Au sein

de cette famille, une enzyme SsoPox de Sulfolobus solfataricus provenant des sources d’eau chaudes

du Vésuve a été étudiée pour son activité phosphotriestérase10. L’activité lactonase est quant à elle

particulièrement intéressante pour des applications médicales puisqu’elle perturbe le quorum sensing

(système de communication bactérien) des bactéries Gram négatif permettant entre autres d’inhiber

leur virulence.


14

Cette enzyme est qualifiée d’hyper-thermostable de par son origine extrêmophile, et elle présente une

grande robustesse ; une température de fusion de 106°C, un temps de demi-vie à 100°C de 60 minutes,

une large gamme de température (-20°C à 100°C), une résistance aux solvants et aux protéases ainsi

qu’une stabilité de stockage de longue durée (une année en solution à température ambiante) 10. Ces

propriétés sont donc très intéressantes pour des applications biotechnologiques, et plus

particulièrement à l’échelle industrielle. Cependant, l’activité naturelle de SsoPox pour la dégradation

des OPs est très faible en comparaison des PTEs.

L’étude des structures cristallographiques de ces deux enzymes a permis de mettre en évidence leur

très grande similarité. Bien que quelques différences soient observables au niveau des boucles 7 et 8,

ces enzymes montrent des topologies très proches (Fig.5). Au niveau du site actif, on retrouve les deux

cations métalliques pontés par une molécule d’eau et une lysine carboxylée 9.

Figure 4: Comparaison structurale des différentes PTEs connues: SsoPox en rouge, PTE de Pseudomonas diminuta en jaune et PTE d’Agrobacterium radiobacter en vert (5A) et vue schématique du site actif de SsoPox (5B)

Ceci suggère qu’il existe un compromis entre activité et stabilité. L’idée a donc consisté à transférer le

site actif hyper-performant des PTEs dans l’architecture robuste de SsoPox. Une quinzaine de résidus

ont été ainsi ciblés et mutés chez SsoPox. Ceci a fait l’objet d’un premier projet avec la DGA à l’issue

duquel des variants toujours stables et améliorés jusqu’à 2000 fois pour la dégradation de certaines

pesticides ont été obtenus et sont désormais opérationnels pour des applications de décontamination.

Suite à ce succès, un second projet (DANUBE) a débuté pour améliorer l’efficacité de SsoPox, cette fois

vers les CWNAs.

3.4 Immobilisation d’enzyme

Les enzymes sont des catalyseurs naturels utilisées depuis plusieurs décennies pour de diverses

applications. Ces dernières sont biocompatibles, biodégradables et les processus enzymatiques sont

respectueux envers l’environnement, plus rentables et plus durables par rapport à certains procédés

chimiques. Cependant, la faible stabilité de la plupart des enzymes a freiné leur potentiel industriel.

De plus, les enzymes sont souvent utilisées en solution (enzyme libre) et ne peuvent pas être

réutilisées. Pour contrer ces problèmes, des techniques d’immobilisation ont été mises en place ces

dernières années. L’immobilisation d’enzyme correspond au confinement de celle-ci au sein d’une

phase (matrice ou support) différente de celle des substrats et des produits. Les polymères inertes

ainsi que des matériaux inorganiques sont généralement utilisés comme supports37.

A B


15

Les principaux objectifs sont l’amélioration de la stabilité ainsi que le recyclage du biocatalyseur mais

aussi la réduction du risque de contamination et les risques d’allergies en fonction du support utilisé.

De manière générale, il existe quatre grands types de méthodes d’immobilisation 38 : les méthodes de

fixations dites faibles comme l’adsorption sur un support, celles utilisant des fixations covalentes,

l’encapsulation au sein d’un support ou encore la réticulation. Le choix de la méthode dépend du

rendement d’immobilisation voulu mais aussi de l’efficacité, de l’activité après immobilisation ainsi

que du chargement de l’enzyme et des propriétés physiques voulues (taille, densité, robustesse). Les

principales caractéristiques des méthodes citées précédemment sont présentées dans le tableau ci-

dessous 38-40.

Tableau 1: Comparaison des méthodes d'immobilisation

Avantages Inconvénients

Méthode par interaction faible

Méthode rapide Peu couteux

Peu agressif pour les enzymes Quantités importantes possibles

Relargage Perte d’activité

Méthode par fixation covalente

Liaison forte et permanente Résistance

Usage multiple

Méthode brutale de fixation Processus couteux

Utilisation de produits chimiques Perte d’activité

Encapsulation Enzyme libre Utilisation de produits chimiques

Réticulation Piège physique sans dénaturation

Relargage limité Facilité d’usage

Limite entre adsorption et fixation covalente

Perte d’activité

En ce qui concerne le projet, l’objectif lié à l’immobilisation de SsoPox est d’obtenir un biocatalyseur

réutilisable sans relargage après immobilisation. L’enzyme immobilisée pourra être utilisée, par

exemple, dans des filtres ou des cartouches de filtration pour le traitement des effluents souillés par

les organophosphorés. Pour cela une méthode alliant réticulation et encapsulation a été utilisée.

L’enzyme a été incorporée dans des billes d’alginate, sucre biodégradable précipitant dans une

solution de chlorure de calcium, et en présence de glutaraldéhyde (appelé agent réticulant). Des CLEAs

« Cross-Linked Enzyme Aggregate » ont ainsi été obtenus 39 - 42. En effet, le glutaraldéhyde réagit avec

des groupements amino préférentiellement des lysines en surface comme présenté sur le schéma ci-

dessous. SsoPox présente 26 lysines en surface pouvant donc réagir suivant ce schéma pour former

des agrégats d’enzymes liées.


16

Figure 5: Présentation d'une méthode de réticulation avec glutaraldéhyde


17

4. Présentation du stage

Les premiers travaux réalisés s’orientent sur deux aspects de la bio-décontamination ; dans un premier

temps la production des PTEs pour la mise au point d’une solution de décontamination des CWNAs,

c’est-à-dire l’optimisation des rendements de production puis l’établissement d’une solution face à

une contrainte réglementaire liée à la présence d’ADN résiduel qui pourrait poser problème par

rapport à la réglementation OGM. Par la suite, des études sur la mise en œuvre de SsoPox vont

permettre d’abord d’évaluer son spectre d’action puis d’envisager son immobilisation afin de réaliser

des filtres pour le traitement des effluents agricoles principalement.

4.1 Production des PTEs

Face à la recrudescence des actes terroristes de ces derniers mois, le développement d'une solution

de décontamination des OPs constitue une priorité tant la menace qu'ils représentent est sérieuse. Les

précédents travaux de l’équipe ont permis de démontrer que l’utilisation de l’enzyme SsoPox est une

solution prometteuse. Toutefois, si cette enzyme permet de dégrader efficacement les insecticides,

des optimisations sont encore nécessaires pour accroitre son activité envers les CWNAs. Afin de

pouvoir proposer rapidement une contre mesure d’urgence, des études sur des PTEs sont

actuellement réalisées. En effet même si leur stabilité est plus faible que SsoPox, les PTEs étudiées (V1,

V2 et V3) présentent des capacités d’hydrolyse des OPs importantes avec pour le variant* V3 une

valeur de kcat/KM proche de 105M-1s-1 pour les agents G et une valeur inférieure à 103 M-1s-1 pour les

agents V. Cependant, pour pouvoir utiliser une solution de décontamination à base d'enzyme

recombinante, il est nécessaire de démontrer que le produit ne relève pas de la réglementation OGM.

Pour cela il est notamment nécessaire de démontrer que le produit final (c'est-à-dire l'extrait

enzymatique) ne contient pas de trace de matériel génétique non naturel tel que des gènes de

résistance aux antibiotiques

Deux approches vont être présentées pour justifier le caractère non OGM de la méthode proposée ;

l’une par extraction d’ADN puis électrophorèse sur gel d’agarose, permettant de séparer les acides

nucléiques du matériel génétique (ADN/ARN) sous l’effet d’un champ électrique, et la seconde par PCR

(de l’anglais Polymerase Chain Reaction) permettant de vérifier si il y a amplification du matériel

génétique.

Lors de la lyse chimique, une endonucléase est utilisée, la DNAseI de grade II provenant du pancréas

de bœuf, pour dégrader l’ADN. Cependant, après cette étape de lyse chimique, de l’ADN non dégradé

était encore présent. Il a fallu adapter la méthode de lyse afin d’éliminer toute trace de matériel. Pour

cela, les paramètres étudiés ont été la quantité de DNAseI utilisée et le temps d’incubation des cellules

en présence de DNAseI. En parallèle, des études d’activités ont été réalisées pour connaître l’impact

de l’utilisation de la DNAseI sur l’activité catalytique des PTEs.

4.2 Immobilisation

Pour les premières études, une méthode basée sur la réticulation en présence de glutaraldéhyde et

encapsulation au sein de bille d’alginate a été testée. En effet, cette méthode est relativement facile à

mettre en œuvre et l’obtention de billes par précipitation de l’alginate dans le chlorure de calcium est

immédiate. Cependant l’un des problèmes rencontrés est lié à la perte d’activité de l’enzyme une fois

immobilisée.


18

Différents paramètres ont été étudiés ; la quantité de glutaraldéhyde et celle de l’alginate, la présence

ou non de glutaraldéhyde au niveau de la solution d’enzyme et de la solution de chlorure de calcium

et la quantité d’enzyme immobilisée. Par la suite, des tests de recyclage de billes ont été réalisés pour

estimer la stabilité du biocatalyseur.

4.3 Spectre d’action de SsoPox

Suite à des premières séries de tests d’activités de SsoPox sur certains insecticides, des études

complémentaires en GC/MS ont permis d’évaluer le spectre d’action de l’enzyme et d’ainsi approfondir

les connaissances sur les potentiels produits de dégradation. Par la suite, certaines cinétiques ont pu

être réalisées afin de déterminer les efficacités catalytiques (kcat/KM).


19

5. Résultats et discussion 5.1 Production des PTEs

5.1.1 Amélioration des rendements de production

Deux étapes de production (voir en annexe) ont été étudiées : l’induction ainsi que le tampon d’activité

des PTEs. En ce qui concerne l’induction, les PTEs possédant un centre bimétallique cationique

impliquant soit du fer et/ou du zinc et/ou du cobalt. Une étude avec différents inducteurs a permis

d’améliorer jusqu’à un facteur 45 pour V3 l’activité spécifique. Le fer étant présent dans le milieu, deux

inductions différentes en présence de cobalt ou de zinc ont été étudiées. Seule la PTE V2 a présenté

une meilleure activité spécifique avec une induction au chlorure de zinc et non au cobalt,

contrairement aux deux autres. Avec ces observations, on pourrait penser que les variants V1 et V3

présentent au moins un cation de cobalt et V2 un cation de zinc.

Tableau 2: Optimisation des activités spécifiques (U/mg) lors de la production

PTEs V1 V2 V3

Induction ZnCl2 CoCl2 ZnCl2 CoCl2 ZnCl2 CoCl2

Activité spécifique (U/mg)

8 50 616 34 28 1266

Amélioration - 6x 18x - - 45x

L'effet du pH a également été étudié. En effet un pH légèrement basique facilite l’hydrolyse des

composés, cependant pour des applications cutanées il ne faut pas se placer en milieu trop basique.

Le tampon (50 mM Tris, 300 mM NaCl) à pH 8 est généralement utilisé pour les mesures d'activité,

toutefois nous avons pu démontrer qu'à pH 9 les enzymes sont entre 2,5 et 3,4 fois plus efficaces.

Figure 6: Tests d'activités des PTEs à différents pH

Finalement, l’optimisation de l’étape d’induction et du pH lors des tests d’activités ont permis

d’améliorer les rendements de production de 10 à 100 fois pour V1 et V3, respectivement.

5.1.2 Aspect réglementaire : présence d’ADN résiduel

Pour dégrader l’ADN résiduel lors de la production, les conditions de lyse ont été modifiées. Pour cela

deux paramètres ont été étudiés : la quantité de l’endonucléase utilisée (20µg/ml – 100µg/ml) et le

temps d’incubation à température ambiante (1h – 2h).

Activity of V1 at different pH Activity of V2 at different pH Activity of V3 at different pH


20

Après extraction de l’ADN, une électrophorèse sur gel d’agarose a été réalisée sur les différents lysats.

On remarque alors que des fragments d’ADN sont encore visibles au bout d’une heure d’incubation

alors qu’au bout de deux heures, pour une quantité supérieure à 100µg/ml de DNAseI, il semblerait

que l’ADN soit totalement dégradé.

Figure 7: Gel d'agarose après second traitement DNAseI

Ainsi pour valider ces observations, des PCR de contrôle sur trois gènes : deux gènes de résistances aux

antibiotiques (AmpR pour l’ampicilline et ChloR pour le chloramphénicol) présents sur des plasmides*

et le gène recA de l’ADN génomique de la souche d’expression Escherichia coli, ont été réalisées pour

vérifier qu’aucune amplification de ces gènes ne se produise. Une amplification prouverait la présence

d’ADN résiduel non détecté par électrophorèse.

Pour la PCR présentée ci-dessous, plusieurs concentrations 0,1X, 1X et 5X mettent en évidence que les

trois gènes ne sont pas amplifiés après 2h d’incubation à température ambiante pour une

concentration de 200 µg/ml en DNAseI contrairement aux contrôles non traités par la DNAseI. En effet,

pour les deux témoins sans DNAseI, les trois gènes sont amplifiés alors qu’avec une concentration 5

fois plus importante des lysats de culture, aucune bande n’est visible pour ces trois gènes.

De plus, l’inactivation de la DNAseI est réalisée par chauffage (10 minutes à 80°C) et ce dernier peut

faciliter la dégradation de l’ADN, c’est pour cela qu’un témoin permet de valider l’action de la DNAseI.

Figure 8: Gel d'agarose de la PCR réalisée


21

Les précédents résultats montrent que l’action de la DNAseI permet d’éliminer le matériel génétique

résiduel, cependant, il faut vérifier l’activité enzymatique des PTEs suite aux différents temps

d’incubation en présence de cette endonucléase. En effet, il ne faudrait pas que le traitement pour

éliminer l’ADN impacte négativement l’activité de l’enzyme.

Figure 9: Tests d'activités des PTEs en fonction du temps d'incubation en présence de DNAseI

Sur une période de 48h d’incubation à la DNAseI à température ambiante, l’activité catalytique de

chaque PTE, testée en présence du substrat éthyl-paraoxon, reste relativement égale. Cela permet de

valider que l'action de l'endonucléase n'impacte pas l'activité des PTE même sur des temps longs qui

pourraient être requis à une échelle supérieure.

Face à aux différents résultats obtenus par extraction d’ADN puis électrophorèse et PCR, il est possible

de justifier le caractère non OGM de la solution de décontamination externe proposée avec les trois

PTEs V1, V2 et V3. Ces premières études ont permis d’améliorer le protocole de production, en

particulier l’induction et les conditions de lyse chimique, pour dégrader l’ADN résiduel des enzymes

utilisées.

5.2 Immobilisation SsoPox

L’un des objectifs visés par les différents projets de Gene&GreenTK est l’immobilisation des enzymes

utilisées (PTEs et SsoPox) pour de nombreuses applications. Dans un premier temps l’immobilisation

de SsoPox a été étudiée et sera présentée dans la suite du rapport. La méthode utilisée allie à la fois

une étape de réticulation en présence de glutaraldéhyde et une étape d’encapsulation au sein de billes

d’alginate afin de limiter le relargage.

Figure 10: Immobilisation de SsoPox après réticulation et encapsulation au sein de billes d'alginate

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 2 4 8 24 48

Act

ivit

y %

Time (h)

V1

V2

V3


22

5.2.1 Amélioration de la méthode

Des tests préliminaires ont été réalisés pour mettre au point l'évaluation de l'activité des billes. Le

pourcentage d’activité après immobilisation est déterminé en ramenant la pente obtenue lors de la

mesure cinétique de densité optique (DO) à la pente obtenue pour le contrôle positif, c’est-à-dire la

réaction sans bille, puisque le produit de dégradation du paraoxon absorbe à 405nm. Le relargage de

l'enzyme dans le milieu réactionnel est également mesuré.

Ces premiers tests (données non présentées) permettent d’obtenir une activité maximale d’environ

10% en modifiant certaines quantités utilisées (alginate 1%, glutaraldéhyde 0,5%). Cependant, les billes

réalisées avec 1% d’alginate sont plus fragiles que celles réalisées avec 3%, donnée la plus fréquente

dans la littérature.

De plus, le pourcentage d’activité immobilisée laisserait penser que les 90% restants seraient

relargués, cependant les mesures effectuées mettent en évidence que le relargage ne représente

qu’un très faible taux (<1%). Les hypothèses probables quant à la faible activité après immobilisation

seraient liées au manque d’accessibilité de l’enzyme au sein de la bille lors de la diffusion du substrat.

En effet, SsoPox présente un grand nombre de lysine au niveau de sa surface favorisant de nombreuses

réactions avec le glutaraldéhyde.

La seconde étude menée concerne la quantité d’enzyme à immobiliser pour essayer d’améliorer les

rendements après immobilisation. Pour cela les conditions précédemment déterminées ont été

réalisée avec des concentrations de 10mg/ml à 30mg/ml d’enzyme. Avec une concentration de

10mg/ml en enzyme, soit trois fois moins d’enzyme utilisée, l’activité enzymatique obtenue après

immobilisation est d’environ 12%. L’intérêt est ici de limiter alors les quantités d’enzyme utilisées. De

plus, pour contrer cette perte d’activité, il serait intéressant de pouvoir réutiliser les billes sur plusieurs

cycles catalytiques.

Figure 11: Criblage en quantité d'enzyme utilisée et utilisation du glutaraldéhyde

Pour finir l’amélioration de la méthode, une étude parallèle liée à l’utilisation du glutaraldéhyde a aussi

été menée. En effet dans le protocole proposé, l’ajout de glutaraldéhyde se fait au niveau de la solution

d’enzyme et d’alginate mais aussi au niveau de la solution de chlorure de calcium. Ici l’objectif est de

limiter l’utilisation de ce composé chimique toxique. Les résultats obtenus permettent de justifier

l’utilisation du glutaraldéhyde au sein de la solution d’enzyme et d’alginate, puisque l’activité reste

stable aux alentours de 8-9% après immobilisation, alors que lorsque le glutaraldéhyde est ajouté à la

solution de chlorure de calcium, celle-ci n’est que de 5%. Cela permet, de plus, de manipuler de plus

faibles quantités de ce composé et donc de limiter les coûts de fabrication.


23

Ainsi après ces études, il a été déterminé que la méthode la plus optimale pour atteindre environ 10%

d’activité enzymatique après immobilisation est 3% d’alginate, 0,5% de glutaraldéhyde au sein de la

solution enzymatique à 10mg/ml.

5.2.2 Etude de la stabilité

Pour déterminer la stabilité et donc le nombre de cycle catalytique réalisable, une méthode de lavage

des billes après premier contact avec l’éthyl-paraoxon a été mise au point afin de réutiliser les billes.

Figure 12: Cycles catalytiques après immobilisation

Au bout de 6 cycles catalytiques, une activité globale de 100% (après addition des rendements de

chaque cycle) est atteinte pour l’enzyme immobilisée par la méthode précédemment décrite. De plus,

le relargage est inférieur à 0,5% ce qui reste acceptable pour cette première méthode.

Cette première méthode d’immobilisation est assez promettant cependant des méthodes

complémentaires doivent être étudiées (polyuréthane, chitosan et cellulose) pour déterminer les

conditions les plus optimales d’immobilisation.

Afin de valider cette méthode, un second lot d’enzyme SsoPox a été étudié. Des résultats similaires

ont été obtenus et une étude supplémentaire à une concentration de 5mg/ml d’enzyme a été réalisée

permettant d’obtenir une activité après immobilisation d’environ 15%. Ces derniers résultats ont été

publiés dans un article, en cours de soumission, traitant des particularités et de l’intérêt

biotechnologique de l’enzyme SsoPox.

Figure 13: Second lot d'enzyme - Cycles catalytiques après immobilisation


24

5.3 Spectre d’action de SsoPox

Une autre partie du stage a consisté à étudier le spectre d’action de l’enzyme SsoPox. Les résultats

présentés ci-après font suite à un premier travail réalisé par des membres de l’équipe du Professeur E.

Chabrière et dont l’article est en cours d’écriture. L’intérêt ici est de développer une méthode

générique permettant de tester tous les OPs. Le variant utilisé est SsoPox-αsD6 qui a préalablement

été caractérisé comme le plus actif sur un large nombre de pesticides.

5.3.1 Dégradation des OPs

Pour détecter les insecticides et leurs produits de dégradation, la spectroscopie de masse a été utilisée.

Douze insecticides utilisées en agriculture (figure 14) ont été testés en présence de l’enzyme, dans un

premier temps à une concentration de 25µM d’enzyme pour 250µM d’OP, sur une durée de 24 heures

de manière à vérifier d’une part qu’il était possible de détecter les insecticides et leurs produits de

dégradation et vérifier d’autre part s’ils étaient dégradés par l’enzyme.

Figure 14: Insecticides testés en présence de SsoPox

Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous. Après dégradation, une base de données permet

de déterminer en fonction du spectre de masse le produit obtenu avec un score d’identité plus ou

moins élevé. Dans notre cas, on considère qu’un score supérieur à 800/1000 est acceptable et permet

d’identifier les produits. Pour chaque insecticide, un contrôle positif de l’OP seul a été réalisé afin de

vérifier que le composé ne se dégrade pas seul, ainsi qu’un contrôle négatif de l’enzyme pour valider

les observations dues aux OPs.


25

Tableau 3: Dégradation des insecticides - 0,9 mg/ml SsoPox 24h

OP Degradation 24h Identity product

(score >800) Degradation (IUPAC name)

Phoxim YES YES Benzonitrile

Phosphamidon YES NO -

Quinalphos YES YES 1H-quinoxalin-2-one

Profenofos YES YES 4-Bromo-2-chlorophenol

Dibrom YES *

Triazophos YES *

Monocrotophos YES *

Pirimiphos methyl YES YES 2-(diethylamino)-5-methyl-1H-pyrimidin-6-one

Dicrotophos Incomplete 96% YES N,N-Dimethyl-3-oxobutanamide

Chlorfenvinphos Incomplete 78% YES 2-Chloro-1-(2,4-dichlorophenyl)ethanone

Fenthion Incomplete 36% YES 3-Methyl-4-(methylsulfanyl)phenol

Dichlorvos YES *

* no MS signal

Certains composés ne présentent pas de produits visibles en spectroscopie de masse après extraction

au chloroforme, il faudrait donc adapter la méthode d’extraction pour pouvoir identifier les produits

de dégradation manquants. Dans notre cas, pour cette première approche, seule la dégradation du

substrat est importante.

Seuls trois composés ne sont pas totalement dégradés au bout de 24h en présence de l’enzyme à

25µM: le dicrotophos, le chlorfenvinphos et le fenthion. Ces composés ont donc été testés une

seconde fois sur une durée de 48h et pour des concentrations d’enzyme de 25µM et 57µM mg/mL

(tableau 4).

Tableau 4: Dégradation incomplète du dicrotophos, chlorfenvinphos et fenthion

OP Time of degradation

(hours) Enzyme (µM) % degradation

Dicrotophos

24 25 96,5

57 100,0

48 25 100,0

57 100,0

Chlorfenvinphos

24 25 78,1

57 84,0

48 25 74,2

57 84,1

Fenthion

24 25 36,0

57 38,5

48 25 30,4

57 36,3


26

Le dicrotophos est donc dégradé totalement contrairement au chlorfenvinphos et au fenthion dont les

dégradations demeurent incomplètes. Des dégradations à 114µM et 170µM d’enzyme ont également

été réalisées mais ces dernières restent incomplètes (95,3% est dégradé au maximum pour le

chlorfenvinphos et 76,4% pour le fenthion). De plus aucune augmentation de dégradation n’a été

observée avec 114µM et 170µM d’enzyme. Cela peut supposer l’existence d’un « plateau » de

dégradation au-delà duquel l’enzyme ne plus peut plus influer (interaction substrat/enzyme, équilibre

atteint ou encore inhibition de l’enzyme par le substrat et/ou des produits)

5.3.2 Cinétiques de dégradation

Afin de déterminer approximativement une valeur de l’efficacité catalytique (kcat/kM) des précédents

OPs, des cinétiques sont actuellement en cours. Comme précédemment, les analyses sont effectuées

par GC/MS après extraction au chloroforme. Les premiers résultats obtenus sont présentés ci-après.

Figure 15: Cinétique de dégradation du phosphamidon et du quinalphos

Les dégradations du phosphamidon et du quinalphos peuvent être considérées comme totales au bout

de 360 secondes et 180 secondes, respectivement. En effet, le temps nécessaire pour dégrader 95%

du substrat de départ est 2520 secondes, soit 42 minutes pour le phosphamidon et 60 secondes pour

le quinalphos. En ce qui concerne les paramètres cinétiques, après modélisation, les valeurs

approchées des kcat/kM sont respectivement pour le phosphamidon et le quinalphos de 4,7.101 M-1.s-1

et 1,3.104 M-1.s-1. La valeur élevée obtenue pour la dégradation du quinalphos permet de conclure

quant à l’efficacité catalytique du variant SsoPox-αsD6 pour ce substrat. En effet plus la valeur de

kcat/kM est élevée, plus l’efficacité catalytique est importante. Les cinétiques de dégradation des autres

composés sont actuellement en cours.

Finalement les différentes études effectuées permettent ainsi d’évaluer le spectre d’action de

l’enzyme SsoPox et celle-ci peut dégrader une quinzaine d’insecticides. Elle n’est donc pas spécifique

à un seul et unique substrat, bien que son efficacité puisse varier selon les molécules, ce qui justifie

une nouvelle fois son fort potentiel biotechnologique pour la dégradation des OPs.


27

6. Conclusion

Au cours de ce stage de fin d’études au sein de l’URMITE en collaboration avec la société

Gene&GreenTK, j’ai pu prendre connaissances des différents objectifs et projets proposés par la DGA,

principalement face à la menace terroriste. L’utilisation d’une enzyme hyper-thermostable pour la

décontamination externe des organophosphorés est une solution innovante proposée par la société.

Des études parallèles sur des phosphotriesterases mésophiles permettent d’obtenir une solution de

décontamination comme contre-mesure d’urgence mais la finalité demeure l’étude de SsoPox qui

devrait présenter une plus grande stabilité de par son origine extrêmophile.

Les premiers travaux réalisés ont permis de justifier le caractère « non OGM » de la solution proposée

par la start-up par l’optimisation de la lyse chimique de l’ADN réalisée lors de la production de

l’enzyme. Le protocole de production des PTEs et de SsoPox étant identiques, ces résultats seront

utilisables pour les différentes applications de la société.

De plus, des premières études d’immobilisation des enzymes ont été menées afin de démontrer

l’intérêt industriel et les possibilités d’applications de cette méthode de décontamination. Une

nouvelle fois, les protocoles mis en œuvres seront utilisables pour les autres applications de

Gene&GreenTK. Ces premiers résultats ont été inclus dans un article scientifique « Harnessing

hyperthermostable enzyme for biotechnological applications », actuellement en révision et pour

lequel je figure parmi les auteurs. D’autres méthodes d’immobilisation pourront être également

étudiées pour déterminer la plus efficace en termes d’activité, de recyclage mais aussi de relargage.

En parallèle, un criblage de l’enzyme SsoPox sur une série de pesticides est en cours afin de déterminer

la dégradation de ces derniers et ainsi avoir une vision globale du spectre d’action de l’enzyme.

A la fin de ce stage, un sujet de thèse m’a été proposé pour mettre au point un nouveau modèle animal,

par l’intermédiaire de la planaire, un ver aquatique, et ainsi évaluer la toxicité et la perturbation du

développement du ver en présence de neurotoxiques organophosphorés. Les perspectives de ce stage

sont multiples et la possibilité de continuer mes travaux actuels en thèse est une opportunité pour

approfondir un sujet prometteur en termes d’avancées face à l’utilisation de neurotoxiques

organophosphorés.


28

Définitions43, 44

*Endonucléase ou enzyme de restriction : enzyme permettant la reconnaissance et le clivage de

l’ADN au niveau de certaines séquences, spécifiques ou non, pour générer des fragments plus courts.

*Génome : ensemble du matériel génétique d’un organisme

*Plasmide : Petite molécule d’ADN circulaire ayant sa propre réplication distincte des chromosomes

des cellules bactériennes

*Protéome : ensemble des protéines produites par une cellule

*Transcriptome : ensemble des molécules d’ARN issues de la transcription de l’ADN d’une cellule

*Variant ou mutant : protéine ayant subi une ou plusieurs mutations

Acronymes

ADN: Acide DésoxyriboNucléique

AHL : Acyl Homoserine Lactone

ARN: Acide RiboNucléique

CWNA : Chemical Warfare Nerve Agents

DGA : Direction Générale de l’Armement

DL50 : Dose Létale médiane, causant la mort de 50% d’un groupe donné

DO : Densité Optique

GC/MS : Chromatographie en phase gaz (GC) couplée à la spectrométrie de masse (MS)

IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry

OGM : Organisme Génétiquement Modifié

o.n : over-night

OPs : Organophosphorés

OPH : Hydrolase organiphosphate

PCR : Polymerase Chain Reaction

PLL : « Phosphotriesterase-Like-Lactonase »

PTE : Phosphotriestérase

https://iupac.org/


29

Remerciements

Mes premiers remerciements sont pour Monsieur Éric Chabrière, Fondateur et Responsable

Coordination Scientifique et Stratégique de Gene&GreenTK ainsi que Monsieur David Daudé,

Responsable Technique de la société, pour m’avoir offert l’opportunité de découvrir et d’évoluer au

sein de leur équipe de recherche mais aussi pour leur accompagnement, leur aide et leur conseil durant

ces premiers mois de stage.

Je remercie par la suite le Professeur Didier Raoult, Directeur du laboratoire URMITE, pour avoir la

possibilité d’accéder à un équipement de pointe pour mener à bien les différents travaux de

recherches.

Je tiens également à remercier l’ensemble de l’équipe Gene&GreenTK ainsi que le personnel de la

plateforme, ingénieurs, doctorants et stagiaires pour leur accueil, leur partage ainsi que les moments

passés ensemble.

Enfin je joins à ces remerciements, les différents stagiaires rencontrés durant cette période pour leur

bonne humeur et leur conseil ainsi que ma tutrice école Madame Françoise Duprat pour son

accompagnement durant cette période de stage.


30

Bibliographie 1. Sussman, J. L. et al. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: a

prototypic acetylcholine-binding protein. Science 253, 872–879 (1991). 2. Gupta, R. C. Handbook of Toxicology of Chemical Warfare Agents. (Academic Press, 2009). 3. Costa, L. G. Current issues in organophosphate toxicology. Clin. Chim. Acta 366, 1–13 (2006). 4. Munro, N. Toxicity of the Organophosphate Chemical Warfare Agents GA, GB, and VX:

Implications for Public Protection. Environ. Health Perspect. 102, 18–37 (1994). 5. Delfino, R. T., Ribeiro, T. S. & Figueroa-Villar, J. D. Organophosphorus compounds as chemical

warfare agents: a review. J. Braz. Chem. Soc. 20, 407–428 (2009). 6. Gultekin, F., Ozturk, M. & Akdogan, M. The effect of organophosphate insecticide chlorpyrifos-

ethyl on lipid peroxidation and antioxidant enzymes (in vitro). Arch. Toxicol. 74, 533–538 (2000). 7. Rosenstock, L., Keifer, M., Daniell, W. E., McConnell, R. & Claypoole, K. Chronic central nervous

system effects of acute organophosphate pesticide intoxication. The Lancet 338, 223–227 (1991). 8. Jacquet P, Daudé D, Bzdrenga J et al. Current and emerging strategies for organophosphate

decontamination: special focus on hyperstable enzymes. Environ Sci Pollut Res(2016). 9. Elias M, Dupuy J, Merone L et al. Structural Basis for Natural Lactonase and Promiscuous

Phosphotriesterase Activities. J. Mol. Biol. 379, 1017–1028 (2008). 10. Hiblot J, Gotthard G, Chabriere E, Elias M. Characterisation of the organophosphate hydrolase

catalytic activity of SsoPox. Scientific Reports 2, 779 (2012). 11. Tsai PC, Fox N, Bigley AN et al. Enzymes for the Homeland Defense: Optimizing Phosphotriesterase

for the Hydrolysis of Organophosphate Nerve Agents. Biochemistry 51, 6463−6475 (2012). 12. Bigley AN, Mabanglo MF, Harvey SP et al. Variants of Phosphotriesterase for the Enhanced

Detoxification of the Chemical Warfare Agent VR. Biochemistry 54, 5502−5512 (2015). 13. Cherny I, Greisen PJ, Ashani Y et al. Engineering V‑Type Nerve Agents Detoxifying Enzymes Using

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31

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30. Cherry, J. R. & Fidantsef, A. L. Directed evolution of industrial enzymes: an update. Curr. Opin. Biotechnol. 14, 438–443 (2003).

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32

Table des illustrations

Figure 1: Formule chimique d'un organophosphoré (LG : groupe partant) ............................................ 9

Figure 2: Présentation des principaux pesticides organophosphorés .................................................. 10

Figure 3: Présentation des principaux CWNAs organophosphorés ...................................................... 11

Figure 4: Comparaison structurale des différentes PTEs connues: SsoPox en rouge, PTE de

Pseudomonas diminuta en jaune et PTE d’Agrobacterium radiobacter en vert (5A) et vue

schématique du site actif de SsoPox (5B).............................................................................................. 14

Figure 5: Présentation d'une méthode de réticulation avec glutaraldéhyde ....................................... 16

Figure 6: Tests d'activités des PTEs à différents pH .............................................................................. 19

Figure 7: Gel d'agarose après second traitement DNAseI .................................................................... 20

Figure 8: Gel d'agarose de la PCR réalisée ............................................................................................ 20

Figure 9: Tests d'activités des PTEs en fonction du temps d'incubation en présence de DNAseI ........ 21

Figure 10: Immobilisation de SsoPox après réticulation et encapsulation au sein de billes d'alginate 21

Figure 11: Criblage en quantité d'enzyme utilisée et utilisation du glutaraldéhyde ............................ 22

Figure 12: Cycles catalytiques après immobilisation ............................................................................ 23

Figure 13: Second lot d'enzyme - Cycles catalytiques après immobilisation ........................................ 23

Figure 14: Insecticides testés en présence de SsoPox........................................................................... 24

Figure 15: Cinétique de dégradation du phosphamidon et du quinalphos .......................................... 26

Tableau 1: Comparaison des méthodes d'immobilisation .................................................................... 15

Tableau 2: Optimisation des activités spécifiques (U/mg) lors de la production ................................. 19

Tableau 3: Dégradation des insecticides - 0,9 mg/ml SsoPox 24h ........................................................ 25

Tableau 4: Dégradation incomplète du dicrotophos, chlorfenvinphos et fenthion ............................. 25

Tableau 5: Rapport m/z (masse/charge) utilisé pour chaque OPs étudiés en GC/MS .......................... 36


33

Matériel et méthodes Production-Purification des PTEs

Basée sur la production de SsoPox 10, celle des PTEs a été adaptée de la manière suivante. Le gène

codant pour chaque PTE a été optimisé pour l’expression au sein d’E.coli, synthétisé par GeneArt

(Allemagne) et par la suite il a été inséré dans le plasmide pET22b en utilisant les enzymes de restriction

NdeI et NotI. La production de la protéine a été réalisée au sein d’E.coli BL21 (DE3)-pGro7/GroEL dans

2 litres de milieu ZYP (Tryptone 10 g/L, Extrait de levure 5 g/L, (NH4)2SO4 66 g/L, KH2PO4 136 g/L,

Na2HPO4 142 g/L, Glycérol 250 g (p/v), Glucose 25 g, α-lactose 100g, 100µg/ml ampicilline et 34 µg/ml

chloramphénicol) inoculée en pré-culture sur une nuit avec un ratio 1/100. La croissance se déroule à

37°C jusqu’à atteindre une DO600nm=0,8. L’induction est réalisée par ajout de L-arabinose 0,2% au milieu

ZYP pour chaque PTE ainsi que CoCl2 0,2mM pour les PTEs V3 et V1 et ZnCl2 0,1 mM pour la PTE V2 et

un changement de température de 16°C pendant 20 heures. Les cellules sont ensuite récoltées par

centrifugation (6420g, 30 min, 4°C), puis re-suspendues dans le tampon de lyse (Tris 50 mM pH 8, NaCl

300 mM, DNAseI 10 µg/mL, lysozyme 0,25 mg/mL, PMSF 0,1 mM) pendant 4 heures à température

ambiante et enfin stockées à -80°C sur la nuit. Les cellules subissent une sonication (3 étapes de 30

secondes) pour la lyse mécanique (Amplitude 45, time 00:30, pulse on 00:01, pulse off 00:01). Les

débris cellulaires sont finalement éliminés par centrifugation (11000 rpm, 20 min, 4°C). Avant de passer

à l’étape de purification, une filtration à 0,8 µm est nécessaire. La purification se fait par

chromatographie d’affinité Strep-Tag (StrepTrapTM HP 5ml). Le lavage ainsi que l’équilibration de la

colonne se fait avec le tampon PTE (50 mM Tris, 300 mM NaCl pH 8) alors que l’élution de l’échantillon

se fait avec le tampon 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 2.5 mM desthiobiotin, pH 8 pour un débit de 2ml/min.

Gel SDS-Page

La préparation des gels est réalisée de la manière suivante :

Préparation du Resolving Gel/ Gel de séparation (10 %)

2 gels 6 gels

diH20 6,3 mL 19 mL

30 % Acrylamide 5,3 mL 16 mL

1,5 M Tris pH 8,8 4 mL 12 mL

10% SDS 160 µL 480 µL

10 % APS 160 µL 480 µL

TEMED 16 µL 48 µL

Volume total 16 mL 48 mL


34

Préparation du Stacking gel ou gel de concentration

2 gels 6 gels

diH20 6 mL 17,9 mL

30 % Acrylamide 1,3 mL 4 mL

1,5 M Tris pH 8,8 2,5 mL 7,5 mL

10% SDS 100 µL 300 µL

10 % APS 100 µL 300 µL

TEMED 10 µL 30 µL

Volume total 10 mL 30 mL

La migration se fait dans le tampon TGS (Tris-Glycine-SDS), à 220V pendant 30-40 minutes. La

coloration du gel se fait par l’intermédiaire du bleu de Coomassie (15 minutes) puis la décoloration

dure une heure dans une solution d’éthanol 40%, acide acétique 10% et eau. L’observation et la

détermination de la pureté du gel sur fait par le logiciel ImageLab.

Test d’activité

Les tests d’activité ont été réalisés selon le protocole proposé par 10; l’activité phosphotriesterase a

été évaluée avec le substrat ethyl-paraoxon (1mM). Les cinétiques ont été effectuées en triplicat dans

des plaques 96 puits de 200µL en utilisant 98µL de tampon PTE (Tris 50 mM pH 8, NaCl 300 mM) ou

SsoPox (HEPES 50 mM pH 8, NaCl 150 mM), 2µL d’enzyme et 100µL d’ethyl-paraoxon à 2mM. La

réaction est suivie par mesure de la densité optique à 405nm pendant 10 minutes à 25°C par le logiciel

GEN5.1.

Electrophorèse sur gel d’agarose

L’électrophorèse est réalisée sur gel d’agarose 0,8% puis la migration est effectuée dans le tampon TBE

(« Tris, Borate, EDTA ») à 0,5X pendant 20 minutes à 100 volts. Pour chaque puit, 3µl de tampon de

charge et 2µl d’échantillon ont été mélangé avant de déposer 4µl pour les petits puits et 5µl pour les

plus grands. L’ADN de chaque échantillon est préalablement obtenu par l’intermédiaire d’un kit

d’extraction provenant de Néo Biotech « Gel Extraction / PCR and DNA Fragment Purification Kit » et

permettant d’extraire et de purifier des fragments d’ADN compris entre 50bp et 40kb. Seule la dernière

étape d’élution a été modifiée par rapport au protocole proposé ; au lieu d’utiliser le tampon d’élution

fourni, l’élution a été réalisée avec de l’eau préalablement chauffée à 70°C.

« Polymerase Chain Reaction »

La PCR est réalisée avec un kit ReadyMix (25 µl Ready Mix, 1µl d’extrait pour l’ADN, 1µl amorce sens

10µM, 1µl amorce anti-sens 10µM et 25µl d’eau ultra pure). Les amorces utilisées sont les suivantes :

Organismes ciblés

Séquences ciblées

Nom amorce Nombre bases/amorce

Séquences (5'-3')

E.coli AmpR pET22_AmpR_fwd 20pb ATG CTT AAT CAG TGA GGC AC E.coli AmpR pET22_AmpR_rev 20pb GAG TAT TCA ACA TTT CCG TG E.coli ChloR pGro7_ChloR_fwd 20pb ATG GCA ATG AAA GAC GGT GA E.coli ChloR pGro7_ChloR_rev 20pb AAA AAA ATT ACG CCC CGC CC E.coli recA BL21_recA_fwd 20pb ATG GCT ATC GAC GAA AAC AA E.coli recA BL21_recA_rev 20pb TCG TTA GTT TCT GCT ACG CC


35

Le programme PCR utilisé est le suivant : 5 minutes à 95°C / 20 cycles de 95°C 1 minute ; 50°C 45

secondes ; 72°C 1minute 30 secondes / 10 minutes à 72°C.

Immobilisation SsoPox

Le protocole d’immobilisation est basé sur les données trouvées dans la littérature 39-42. Dans un

eppendorf de 2ml, une solution de 30mg/ml d’enzyme SsoPox est réalisée. Cette dernière est

mélangée avec une solution d’alginate 3%. Dans un bécher contenant 40 ml de CaCl2 (0,2M) ainsi que

dans la solution précédemment préparée, le glutaraldéhyde est ajouté pour avoir une concentration

finale de 0,5% volumique. A l’aide d’une seringue 1ml et d’une seringue 35g, la solution de SsoPox est

versée avec un faible goutte à goutte dans le CaCl2 qui par précipitation de l’alginate permet d’obtenir

des billes. Les billes sont ensuite placées sous agitation pendant une heure puis sont laver avec des

filtres en nylon (Φ=100µm) au tampon SsoPox (HEPES 50 mM pH 8, NaCl 150 mM) pendant 30 minutes

pour éliminer les traces du glutaraldéhyde. Comme contrôle négatif des billes vides ont été réalisées

et aucune activité n’a été détectée.

En ce qui concerne la mesure d’activité phosphotriesterase, la méthode précédente a été ajustée pour

utiliser les billes. Brièvement, les billes ont été additionnées à une solution d’éthyl-paraoxon 1mM

(5mL) dans le tampon d’activité complémenté avec du CaCl2 (0,2 M). Après 3 minutes de réaction sous

agitation manuelle, 200µL de la solution ont été transférés dans une plaque 96 puits et la DO405nm a été

mesurée pendant 10 minutes. Pour le recyclage, après chaque cycle, les billes ont été lavées deux

pendant 10 minutes avec 30 mL de tampon HEPES complémenté avec du CaCl2 puis récupérées avec

des filtres nylon 100µm. Pour déterminer le rendement, un contrôle positif a été réalisé avec 30mg/ml

d’enzyme resuspendues dans 1mL d’eau et diluée 1/10° avec du tampon complémenté. Par la suite,

1mL de la solution diluée a été ajoutée à 4mL d’une solution éthyl-paraoxon (concentration finale

1mM).

GC/MS

L’analyse des pesticides organophosphorés par GC/MS a été réalisée avec l’aide de Nicholas Armstrong

ingénieur de la plateforme protéomique. L’appareil utilisé est un Clarus 500, SQ8S avec le logiciel

Turbomass 6.1.

Une fois le milieu réactionnel préparé, 100µL ont été prélevés afin d’être extrait avec 100µL de

chloroforme. La phase la plus dense (80µL) est ensuite récoltée dans un vial et a été analysée. Afin de

qualifier l’analyse, des contrôles ont été effectués avant chaque utilisation : méthanol, chloroforme et

diméthoate (étalon pour le contrôle qualité de l’appareil). La colonne utilisée est une ELITE 5MS (30m

DI 0,25mm) et le gaz vecteur est l’hélium. L’injecteur est à 220°C et la méthode utilisée est la suivante :

durée 12 minutes, split 10mL/min, débit hélium 2mL/min, four 80 à 280°C avec une augmentation de

30°C/min. Les masses utilisées pour traiter les résultats de spectroscopie de masse sont les suivantes :


36

Tableau 5: Rapport m/z (masse/charge) utilisé pour chaque OPs étudiés en GC/MS

OPs Mass substrate (m/z)

Mass product (m/z)

Phoxim 109 / 135 103

Phosphamidon 127 100

Quinalphos 146 / 157 118 / 146

Profenofos 97 / 139 / 208 206 / 208

Dibrom 109 -

Triazophos 161 / 162 -

Monocrotophos 127 -

Pirimiphos methyl 125 / 276 / 290 83 / 152

Dicrotophos 127 83 /127

Chlofenvinphos 267 / 269 173 / 175

Fenthion 278 154

Dichlorvos 109 -

Glyphosate - -

Afin de déterminer les paramètres cinétiques, on considère raisonnablement que KM >> [S], soit une

réaction du premier ordre. Les pourcentages des aires du substrat sont tracés en fonction du temps.

Les courbes sont alors modélisées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 6 en utilisant une régression non

linéaire avec une équation du type One phase decay :

𝐴𝑖 = 𝐴0(1 − 𝑒−𝑘𝑡)

Où 𝐴0 correspond à 100% du substrat; 𝑘 est la constante du premier ordre ; 𝐴𝑖 est le % du substrat au

temps t. 𝑘 est déterminé en utilisant le modèle et l'efficacité catalytique de l'enzyme (𝑘cat

𝐾M⁄ ) est

déterminée en utilisant la relation suivante :

𝑘cat𝐾M

⁄ = 𝑘[𝐸]⁄

Où [𝐸] est la concentration totale de l'enzyme dans l'échantillon.

VesuBACT Enzyme Anti-virulence

PRINCIPE : Bloquer la communication bactérienne pour inhiber la virulence

PRODUITS :

AVANTAGES :

VesuBACT Enzyme Anti-virulence

CARACTERISTIQUES TECHNIQUES

• Résistance à la température (>100°C)

• Actif de -18°C à +100°C

• Tolérance aux solvants (toluène, chloroforme…)

• Peu sensible aux protéases

• Stockage longue durée (plusieurs mois)

• Synergie avec les détergents (SDS, DOC…)

INNOCUITE

• Pas d’impact environnemental

• Biodégradable

• Non-toxique (DL50 chez le rat >2g/kg par voie

orale)

• Limite les phénomènes de résistance

Santé humaine Pansements anti-infectieux

Solution auriculaire (otites)

Sondes, cathéters

Aérosol (mucoviscidose)

Bloque la virulence sans tuer les bactéries

Limite les phénomènes de résistance (alternative aux antibiotiques)

Santé vétérinaire Solution auriculaire (otites)

Compléments alimentaires

Filtres aquaculture

Agriculture Solution antibactérienne écologique

(feu bactérien…)

Antifouling Peintures marines

Filtres pour traitement des eaux

VesuBACT

Les bactéries sécrètent des

molécules ( ) pour communiquer

entre elles afin de se synchroniser

pour déclencher la virulence

Elles sécrètent un biofilm ( ) et

des facteurs de virulence ( )

pour se protéger du système

immunitaire ( ) ainsi que des

traitements ( )

La technologie VesuBACT

détruit les signaux moléculaires

de communication

Les bactéries restent non

virulentes, inoffensives et ne

forment pas de biofilm

VIRULENCE

PROTECTION

PRESENTATION :

Soutiens financiers acquis :

- Incubateur IMPULSE

- 2 Contrats de recherche avec la Direction Générale de l’Armement (DGA) : 1.6 M€

- Concours I-Lab 2015 (BPI) : 275 k€

Effectif : L’entreprise compte 6 personnes à son effectif au mois de novembre 2015

APPLICATIONS:

TECHNOLOGIE :

Des enzymes ultraperformantes et résistantes

issues du Vésuve:

Bioremédiation des pesticides organophosphorés

Décontamination des agents neurotoxiques de guerre

Inhibition de la communication et la virulence bactériennes

- Une alternative écologiques aux antibiotiques

- Pas de phénomène de résistance

« Une nouvelle ère dans la lutte contre les bactéries »

Applications :

STRATEGIE DE DEVELOPPEMENT : Contrats amonts :

- URGO : Laboratoire pharmaceutique

- TEXINOV : Entreprise secteur textile

Stratégie pour guider et accélérer le développement des produits et la mise sur le

marché sans investissement de la part de la start-up

Structure légère :

- Pas d’appel de fond initial

- Autonomie minimale de 7 ans

- Réactivité et liberté d’action

- Hébergement au sein de l’IHU : environnement d’excellence

Motivation du personnel :

-10% des parts de l’entreprise sont détenus par le personnel

3 innovations

•Innovation scientifique : Développement de solutions écologiques pour des problématiques environnementales et médicales majeures • Innovation stratégique : Société sans investisseur pouvant se positionner sur des marchés importants grâce à un réseau de collaborations performant • Innovation sociale : 10% des parts de l’entreprise sont réservés au personnel

Solfatare Vésuve

Archéobactérie :

Sulfolobus solfataricus

Enzyme SsoPox

Gene&GreenTK « Catalyseur d’innovation »

Décontamination des organophosphorés Inhibition de la virulence bactérienne et du biofilm

VesuTOX

VesuBACT

Défense - Prévention bioterrorisme

- Destruction des stocks

- Décontamination externe

- Prise en charge des personnes

- Nettoyage du matériel

- Réhabilitation des sites

Phytosanitaire - Nettoyage des aliments

- Traitement des effluents

- Réhabilitation des sols



Santé - Infection nosocomiales

- Pied diabétique

- Blessures, brûlures du soldat

- Mucoviscidose

- Otites

Feu bactérien - Protection des cultures

- Traitement écologique

Anti-fouling - Coques de bateaux

- Procédés industriels

Vétérinaire - Otite du chien

- Aquaculture

Articles scientifiques :

Brevets :

Chabrière, E., and Elias, M. (2008). Mutated Hyperthermophilic Phosphotriesterases and uses therof.

Chabriere, E., Elias, M., Hiblot, J., and Raoult, D. (2014). Sulfolobal Phosphotriesterase-Like (pll) Lactonases Activity Having Enhanced Properties and the Uses Thereof.

Chabriere, E., Elias, M., Hiblot, J., and Raoult, D. (2015). Vulcanisaetal Phosphotriesterase-Like Lactonases (pll) Having Enhanced Properties and the Uses Thereof.

Adresse :

Gene&GreenTK

Faculté de Médecine de Marseille

Laboratoire URMITE

27 Boulevard Jean Moulin

13385 Marseille Cedex 5

Contact :

Dr. David Daudé

Responsable Technique

[email protected]

(+33)626784214

Bzdrenga, Janek, Julien Hiblot, Guillaume Gotthard, Charlotte Champion, Mikael Elias, and Eric Chabriere. “SacPox from the Thermoacidophilic Crenarchaeon Sulfolobus Acidocaldarius Is a Proficient Lactonase.” BMC Research Notes 7 (2014): 333. doi:10.1186/1756-0500-7-333. Elias, Mikael, Jérôme Dupuy, Luigia Merone, Luigi Mandrich, Elena Porzio, Sébastien Moniot, Daniel Rochu, et al. “Structural Basis for Natural Lactonase and Promiscuous Phosphotriesterase Activities.” Journal of Molecular Biology 379, no. 5 (juin 2008): 1017–28. doi:10.1016/j.jmb.2008.04.022. Hiblot, Julien, Guillaume Gotthard, Mikael Elias, and Eric Chabriere. “Differential Active Site Loop Conformations Mediate Promiscuous Activities in the Lactonase SsoPox.” PloS One 8, no. 9 (2013): e75272. doi:10.1371/journal.pone.0075272. Hraiech, Sami, Julien Hiblot, John Lafleur, Hubert Lepidi, Laurent Papazian, Jean-Marc Rolain, Didier Raoult, et al. “Inhaled Lactonase Reduces Pseudomonas Aeruginosa Quorum Sensing and Mortality in Rat Pneumonia.” PLoS ONE 9, no. 10 (October 28, 2014): e107125. doi:10.1371/journal.pone.0107125.

mailto:[email protected]



VesuTOX Décontamination des Agents Neurotoxiques

PRESENTATION :

Soutiens financiers acquis :

- Incubateur IMPULSE

- 2 Contrats de recherche avec la Direction Générale de l’Armement (DGA) : 1.6 M€

- Concours I-Lab 2015 (BPI) : 275 k€

Effectif : L’entreprise compte 6 personnes à son effectif au mois de novembre 2015

APPLICATIONS:

TECHNOLOGIE :

Des enzymes ultraperformantes et résistantes

issues du Vésuve:

Bioremédiation des pesticides organophosphorés

Décontamination des agents neurotoxiques de guerre

Inhibition de la communication et la virulence bactériennes

- Une alternative écologiques aux antibiotiques

- Pas de phénomène de résistance

« Une nouvelle ère dans la lutte contre les bactéries »

Applications :

STRATEGIE DE DEVELOPPEMENT : Contrats amonts :

- URGO : Laboratoire pharmaceutique

- TEXINOV : Entreprise secteur textile

Stratégie pour guider et accélérer le développement des produits et la mise sur le

marché sans investissement de la part de la start-up

Structure légère :

- Pas d’appel de fond initial

- Autonomie minimale de 7 ans

- Réactivité et liberté d’action

- Hébergement au sein de l’IHU : environnement d’excellence

Motivation du personnel :

-10% des parts de l’entreprise sont détenus par le personnel

3 innovations

•Innovation scientifique : Développement de solutions écologiques pour des problématiques environnementales et médicales majeures • Innovation stratégique : Société sans investisseur pouvant se positionner sur des marchés importants grâce à un réseau de collaborations performant • Innovation sociale : 10% des parts de l’entreprise sont réservés au personnel

Solfatare Vésuve

Archéobactérie :

Sulfolobus solfataricus

Enzyme SsoPox

Gene&GreenTK « Catalyseur d’innovation »

Décontamination des organophosphorés Inhibition de la virulence bactérienne et du biofilm

VesuTOX

VesuBACT

Défense - Prévention bioterrorisme

- Destruction des stocks

- Décontamination externe



- Réhabilitation des sites

Phytosanitaire - Nettoyage des aliments

- Traitement des effluents

- Réhabilitation des sols



Santé - Infection nosocomiales

- Pied diabétique

- Blessures, brûlures du soldat

- Mucoviscidose

- Otites

Feu bactérien - Protection des cultures

- Traitement écologique

Anti-fouling - Coques de bateaux

- Procédés industriels

Vétérinaire - Otite du chien

- Aquaculture

SPECTRE LARGE :

PRODUITS :

AVANTAGES :

VesuTOX Décontamination des Agents Neurotoxiques

Pes

tici

des

An

alo

gue

s d

e C

WA

s

Traitement des personnes et du matériel

Prévention bioterrorismeTraitement des aliments

Décontamination des sols Traitement des stocks de CWAPréventions IED

Traitement des soldats

Décontamination des eaux de ruissellement

VesuTOX

Décontamination en quelques minutes

CARACTERISTIQUES TECHNIQUES

• Résistance à la température (>100°C)

• Tolérance aux solvants (toluène, chloroforme…)

• Peu sensible aux protéases

• Stockage longue durée (plusieurs mois)

• Synergie avec les détergents (SDS, DOC…)

INNOCUITE

• Pas d’impact environnemental

• Biodégradable

• Non-toxique (DL50 chez le rat >2g/kg par voie

orale)

Articles scientifiques :

Brevets :

Elias, M., Dupuy, J., Merone, L., Lecomte, C., Rossi, M., Masson, P., Manco, G., and Chabriere, E. (2007). Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the hyperthermophilic Sulfolobus solfataricus phosphotriesterase. Acta Crystallograph. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 63, 553–555.

Elias, M., Dupuy, J., Merone, L., Mandrich, L., Porzio, E., Moniot, S., Rochu, D., Lecomte, C., Rossi, M., Masson, P., et al. (2008). Structural Basis for Natural Lactonase and Promiscuous Phosphotriesterase Activities. J. Mol. Biol. 379, 1017–1028.

Hiblot, J., Gotthard, G., Chabriere, E., and Elias, M. (2012). Characterisation of the organophosphate hydrolase catalytic activity of SsoPox. Sci. Rep. 2.

Hiblot, J., Gotthard, G., Elias, M., and Chabriere, E. (2013). Differential Active Site Loop Conformations Mediate Promiscuous Activities in the Lactonase SsoPox. PLoS ONE 8, e75272.

Vecchio, P.D., Elias, M., Merone, L., Graziano, G., Dupuy, J., Mandrich, L., Carullo, P., Fournier, B., Rochu, D., Rossi, M., et al. (2009). Structural determinants of the high thermal stability of SsoPox from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. Extremophiles 13, 461–470.

Chabrière, E., and Elias, M. (2008). Mutated Hyperthermophilic Phosphotriesterases and uses therof.

Chabriere, E., Elias, M., Hiblot, J., and Raoult, D. (2014). Sulfolobal Phosphotriesterase-Like (pll) Lactonases Activity Having Enhanced Properties and the Uses Thereof.

Chabriere, E., Elias, M., Hiblot, J., and Raoult, D. (2015). Vulcanisaetal Phosphotriesterase-Like Lactonases (pll) Having Enhanced Properties and the Uses Thereof.

Adresse :

Gene&GreenTK

Faculté de Médecine de Marseille

Laboratoire URMITE

27 Boulevard Jean Moulin

13385 Marseille Cedex 5

Contact :

Dr. David Daudé

Responsable Technique

[email protected]

(+33)626784214




Annexe : Cinétique Michélienne

Avec E : Enzyme / ES : Complexe enzyme-substrat / P : Produit k1 = constante d'association de E + S k-1 = constante de dissociation du complexe ES k2 = constante de réaction de ES en E + P k-2 = constate d'association de E + P

La vitesse de réaction est caractérisée par la vitesse d'apparition du produit : 𝑉 =𝑑[𝑃]

𝑑𝑡

Hypothèses : - La concentration en produit [P] étant nulle ou faible, on peut négliger V= k-2 [E][S].

- On estime que l'équilibre des concentrations entre [E], [S] et [ES] se met en place très rapidement.

Or, une fois à cet équilibre atteint, la concentration en complexe [ES] reste constante tant que [P]

reste négligeable. En terme cinétique cela se traduit par l’approximation des états-quasi-

stationnaire :

𝑑[𝐸𝑆]

𝑑𝑡= 0

Résolution :

-

-

-

Pour simplifier, on pose

Km est un produit de constantes, c'est donc également une constante, et sa dimension est celle d'une concentration. Km est appelée "constante de Michaelis" et représente l’affinité de l’enzyme pour son substrat.

-

Equation de Michaelis- Menten :

Constante catalytique Kcat La grandeur Kcat correspond au nombre de moles de P formées par seconde et par mole d’enzyme. Si l’enzyme possède plusieurs sites catalytiques, l’unité change et s’exprime par mole de sites.

𝐾𝑐𝑎𝑡 =𝑉𝑚𝑎𝑥

𝑚𝑜𝑙𝑒 𝑑′𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒=

𝑉𝑚𝑎𝑥

|𝐸𝑡]

Le rapport Kcat/Km est souvent donné comme mesure de l'efficacité catalytique.

Annexe : Production des PTEs

Documents

Gene GreenTK - Centrale Marseille · Année 2015-2016 Décontamination externe des organophosphorés par voie enzymatique 04/04/2016-16/09/2016 Gene&GreenTK Faculté de Médecine