MC BénéGrenoble, 19 Janvier 2010

GC FaureGrenoble 12/12/2011

IMMUNOPHENOTYPAGE EN CYTOMETRIE DE FLUXIdentifier les sous-populations

leucocytairesEvaluer leurs proportionsEvaluer leur nombre absolu

CONTRAINTESSuspension cellulaireSans amasAvec le moins de débris

possibleCellules viables sauf

exceptionVérification des

caractéristiques du cytomètre

Cellules marquéesContraintes des

fluorochromesChoix des combinaisons

Quels échantillons?Sang périphérique

EDTA optimal si <24 heuresCitrate ou héparine possibles

Moelle osseuseAttention à la dilution2 mL maximumAttention à la coagulation

Autres échantillonsLavages broncho-alvéolairesLiquide céphalo-rachidienLiquides d’épanchement, d’ascite, de ponctionCellules éluées de tissus

Lignées cellulaires

Cellules vivantesOn veut rester

en suspension! (EDTA)

• Facteurs nutritionnels

• Prolifération anormale : on a faim!!

• On était bien à 37°!!

Cellules vivantes

• Déchets cellulaires : le vieux sang

• On veut rester en suspension!

• On était bien à 37°!!

• Facteurs nutritionnels

• Prolifération anormale: on a faim!

La suspension cellulaireSang, moelle

Ficoll vs. Lyse…

• Les autres liquidesLBA, LCR, épanchements, ascites, lignées….

– + Lavage– Numération– Ajustement– Cytospin

Ficoll et sélection cellulaire : une vieille énigme!!

Osmolalité 280+15 mOsm (sérum 275-300)

Densité 1.077 + 0.01pH 6-7Cellules normales vs. Cellules fragilesConditions de réalisation du ficoll

Température, Délais de manipulation, Lyse des GR résiduels?

Ficoll is a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide which dissolves readily in aqueous solutions.

In 1968, Bøyum described a method using low viscosity Ficoll™ and sodium metrizoate, of the proper density and osmotic strength, to isolate mononuclear cells (2) 2381 citations mais index h à 5! . Sodium metrizoate has been successfully substituted with sodium diatrizoate by numerous workers (3,4).

Ficoll is a registered trademark owned by GE Healthcare companies.[1]

http://www.scoop.it/t/immunology/p/725527997/ficoll-paque-plus-a-guide-to-isolating-mononuclear-cells-from-whole-blood

Autres méthodes de séparation et d’enrichissementPercoll, Polymorphoprep

Le Percoll par Pertoft et al. comme outil permettant une meilleure séparation par densité1. Il est utilisé pour la séparation de cellules, d'organelles et/ou de virus par centrifugation à densité différentielle. Le Percoll est composé de particules de silicates colloïdales de 15-30 nm de diamètre (23% m/m dans de l'eau) qui sont recouverts de polyvinylpyrrolidone (PVP). Le Percoll est très bien adapté pour la mise en place de gradients de densité puisqu'il possède une faible viscosité comparé à ses alternatives, une faible osmolarité et une non toxicité vis-à-vis des cellules et de leurs constituants.

Gradients discontinus…Cellules adhérentes sur plastique boîte

de PetriRosettes Séparations magnétiques

Lyse et sélection cellulaire : une autre énigme!! Chlorure d’ammoniumRéactifs (10x: impératif pour conservation sinon carbonate

d’ammonium)Chlorure d’Ammonium 82.9 gBicarbonate de Potassium * 10.0 gEDTA 0.37 gEau distillée non désionisée qsp 1.0 liter

Culot cellulaire + 1 ml NH4Cl 1X : maximum 2-3 minutes à température ambiante….

…. Ou jusqu’à 10 minutes….Centrifuger immédiatement à 200 g 5

minutes et enlever complètement le liquide de lyse

Remettre en suspensionNE CONVIENT PAS POUR DES ETUDES

FONCTIONNELLES ULTERIEURES

Autres méthodes de lyseRéactifs hypoosmotiques : eau ou

Zapoglobine Hémolyse complèteAltération des globules blancs si contact prolongé

Acide acétique 3% dans l’eauHémolyse complète70% de perte des globules blancs

Réactifs du commerceComposition mal connueAcide/baseAnhydrase carbonique, plus sélectifAvec ou sans fixation en paraformaldéhyde

Lyse avec ou sans lavageImmunoglobulines, chaînes légèresPréservation de l’ensemble des leucocytes

Les marquagesSurface, Cytoplasme, NoyauQuelques rappels de biologie

cellulaire…

La membraneUne structure moléculaire

complexeAc palmytiqueAzoteAc OléiqueOxygènePhase aqueuse/oxygènePhosphore

H Heller et al. J Phys Chem 1993

La membrane

• Glycosylées• Transmembranai

res• Gpi• Associées• Mobiles….

Une phase fluide et des protéines

Marquages membranaires

CD23

CD20

CD45CD22

Leu13

CD81

CD19

CD21

CD79a/b

sIgM

CD40

•Anticorps vs molécules membranaires

•Une affaire de taille•Une affaire d’accessibilité

•Marquages multiples…•Une affaire de charge•Une relation dynamique…

Patching et capping

Patching et cappping (2)

Récapitulatif

Quelle surface cellulaire?Cellules isolées

• Agrégats

• Exosomes• Microparticul

es• Plaquettes

Les cellules qui se cachent

• Hypergamma protéines de l’inflammation

• On a changé de densité

• On s’est collées au tube

• On est camouflées dans les mucines

• Laissez nous nous réveiller

Fixations non spécifiques?

Récepteurs FcLymphocytes B FR+?????Ratio F/P des fluorochromesSaturation en anticorpsBactéries

Cellules fixéesAprès le marquage

Paraformaldéhyde Neutralisation virale Conservation du marquage

Avant le marquagePrélèvements

anatomopathologiquesCertains épitopes n’y

survivent pas Cellules en suspension :

cytoplasme

Le cytoplasmePas une mer

intérieure!!!....• …. Un vrai

labyrinthe plein de pièges– Membranes des

organelles– Accessibilité– Fixations non

spécifiques

La perméabilisationQuels perméabilisants?

SaponineDigitonineParaformaldéhydeFormolTriton

• Attention on change de taille!!

Perméabilisants du commerce

Fix & PermPerméafixIntrastainE-biosciences…

Et le noyau???AnticorpsIntercalants

Mortes ou vives?Taille/Structure

Nécrose : diminution SS et FS

Apoptose : d’abord FS

Membrane Exclusion de colorants :

IP Inclusion de colorant :

FDA (fluorescein diacetate)

Exposition de la P.sérine : Annexine V

Cytosquelette F-Actine avec la

phalloïdine-FITC

Organites intracellulaires

Rh123 et mitochondries vivantes (charge et potentiel transmembranaire)

Acridine orange et lysosomes (pompe à protons)

Immunofluorescence indirecte ou directe

Première incubationLavageDeuxième incubation+Lavage Incubation des cellules

avec l’anticorps ou le mélange d’anticorpsPas de lavage nécessaireMarquages concomitants

membranaires et intracellulairesMarquage membranaire + lavagePerméabilisationMarquage intracellulaire

Au totalPenser à ses cellules

Elles sont vivantesElles sont pleines de ressources

Les observer est magique!

Amélioration des techniques de cytométrieUtilisation de CD45Marquages multicouleurs

3 couleurs, 4 couleurs, 5 couleurs, 6 couleurs, 8 couleurs, 10 couleurs et plus….

Choix des anticorps, des fluorochromes, des combinaisons

Stratégies de fenêtrageRecherche des combinaisons les plus

sensibles, les plus stables

Les nouveaux fluorochromesAugmentation de la gamme de PMTAugmentation de la gamme de

longueur d’ondeAvec l’utilisation de plusieurs lasersPar mise à profit de l’effet tandem

Sensibilité accrue à la lumièreFlacons noirsManipulations extemporanées et rapidesIncubation dans le noir (+ 4°C)Lecture immédiate ou protection ++

contre la lumière

Attention aux tandemsCertains sont fragiles

LumièreTempérature

Dans un système à plusieurs lasers le receveur peut être excité directement par un autre laser

ExemplePE-Cyanine 5Excitation respective à 488 m et … nmNormalement

Réglages des PMT et compensationsUn équilibre subtilPenser à jouer sur les PMT quand des compensations

semblent « impossibles »Dans les combinaisons complexes, ce n’est pas

toujours le fluorochrome qu’on croit qui « bave » : afficher TOUTES les combinaisons possibles Eh oui, en 5 couleurs ça fait 10 biparamétriques, en 6

couleurs 15 et en 10 couleurs 45!!Attention aux compensations avec des billes

fluorescentes Elles ne se comportent pas comme des cellules Elles ne sont pas co-marquées

Les suspensions cellulaires sont très pléiomorphes Auto-fluorescence différente Récepteurs Fc sur certaines cellules Un bon réglage doit porter sur toutes les sous

populations présentes dans l’échantillon

Règle d’or d’une bonne compensation

Les cellules négatives ont la même MFI sur un axe donnéElles sont préférentiellement dans la première décade

Bad!!!

Bad!!

Analytique : post acquisitionGénérer les histogrammes d’intérêtGarder quelques histogrammes « de

base » pour contrôleS’assurer de la chronologie des

fenêtrages en cascadeUtiliser des codes couleur itératifsJongler avec les modes d’affichagePour les analyses fréquentes utiliser

toujours la même stratégie/le même protocole

Multimarquages…….standardisation nécessaire

Cartographie des suspensions cellulaires en hématologie : le scattergramme SSC/CD45

Stetler Stevenson

Wood

Stachursky

Xu Cherian

GTLLF

Stratégie GTLLF : d’abord les cellules maturesIdentification positive des cellules

matures de la moelle osseuseCode couleurCD45 bright : lymphocytesCD14/CD11b : monocytesCD16/CD11b : granulocytes (NK, B)Le reste : «  bermudesbermudes  »

CD45

SSC

FSC

SSC

CD14

SSC

CD16

SSC

CD45

CD11b

Analyse

Analyse

Marquages complexes : retour à la cartographie

Détermination systématique de seuils de positivitéBackgatingCrossgatingWalkgating

CD45

SS

C

FLn

SS

C

CD45

SS

C

Stratégie

FLx

FL

y

CD45

SS

C

CD45

SS

C

CD45

SS

C

FLx

FL

y

Granulober

FLx

FL

y

Gating CD11b+ Gating CD117+Granulober

CD11b/CD117/CD34

FLx

FL

y

CD45

SS

C

CD45

SS

C

CD45

SS

C

FLx

FL

y

FLx

FL

y

CD45

SS

C

FLn

SS

C

CD45

SS

C

Stratégie

CD45

SS

C

CD45

SS

C

FL1

FL

2

CD45

SS

C

FL1

FL

3

FL2

FL

3

FL3+ FL2+ FL1+

FLn+

Granulober

Gating CD13 Gating CD34Gating CD33

Crossgating

CD45

SS

C

CD45

SS

C

FL1

FL

2

CD45

SS

C

FL1

FL

3

FL2

FL

3FL3+ FL2+ FL1+

II.12

Walkgating

Walkgating